胆固醇在高脂高胆固醇诱导NASH发生发展过程中的动态作用研究论文

2021年2月22日14:21:11胆固醇在高脂高胆固醇诱导NASH发生发展过程中的动态作用研究论文已关闭评论

胆固醇在高脂高胆固醇诱导NASH发生发展过程中的动态作用研究论文
摘要

目的:

探讨胆固醇在高脂高胆固醇诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发生发展过程 中的动态作用。

方法:

动物水平:100只SD大鼠被随机分为正常饲料(CON)饲喂组、20%脂肪(HFC0) 饲喂组、20%脂肪+1%胆固醇(HFC1)饲喂组、20%脂肪+2%胆固醇(HFC2)饲喂组 和20%脂肪+5%胆固醇(HFC5)饲喂组,每组20只。分别在饲喂第4周、第6周、 第8周和第12周后,每组处死5只大鼠,收集其腹主动脉血浆和肝脏标本;细胞水 平:将人源正常肝细胞(HL-力02)采用油酸(OA)和低密度脂蛋白-胆固醇(LDL- C)诱导并随机分为CON组、OA组和OA+LDL-C组,细胞培养5天后构建NASH 模型;收集的动物血浆和培养基用于检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST) 的活性;收集动物肝脏和细胞后检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的含量;苏 木素-伊红(HE)染色法用来观察肝脏的脂肪变性、气球样变性及炎症反应;马松 (Masson)三色法染色观察肝脏的纤维组织沉积;肝细胞内脂滴的数量和大小、胆固 醇的分布和含量分别用油红O (Oil red o)染色法和菲律宾菌素(Filipin)染色法观 察;活性形式的固醇调节元件结合蛋白-2(n-SREBP-2)、低密度脂蛋白受体(LDLR) 及3-瓮基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)的表达用Western blot法检测。

结果:

动物水平:第12周后,HFC2组、HFC5组血浆ALT、AST和肝脏TC、TG含 量较CON组明显升高(PV0.05),肝细胞内脂肪变性明显,出现了明显的气球样变 性和纤维化病变,HFC2组、HFC5组大鼠NASH诱导成功;Western blot显示,第4 周末至第8周末,HFC2组、HFC5组较CON组LDLR含量明显增加(&0.05) , 12 周末,HFC5组较CON组LDLR含量明显减少(P<0.05);第4周末至第8周末, 各组n-SREBP-2的蛋白表达量无显著差异,第12周后,与CON组相比,HFC2组和

HFC5组n-SREBP-2蛋白含量明显增加(P<0.05);第4周末、第6周末和第12周 末,各组HMGCR含量无明显差异,第8周末,与CON组相比,HFC5组HMGCR 蛋白表达明显减少(PvO.05)-

细胞水平:OA+LDL-C组较CON组、OA组细胞内胆固醇含量和脂滴含量明显 增加,脂滴体积明显增大、n-SREBP-2、HMGCR含量明显增加(Pv0.05) ; OA组、 OA+LDL-C组较CON组LDLR含量明显减少(Pv0.05)。

结论:

  • 胆固醇的摄入量和摄入时间的长短与NASH肝损伤成正相关;
  • 高脂高胆固醇诱导NASH发生发展过程中,胆固醇可诱导肝细胞高 表达LDLR促使胆固醇进入肝脏增加,同时HMGCR调控的内源性胆固醇的合 成被抑制;
  • 随着肝内胆固醇堆积增多,肝细胞LDLR表达减少,使肝内胆固醇 相对不足,反馈性调节n-SREBP-2和HMGCR表达升高,从而使肝脏胆固醇代 谢稳态被打破,促进了 NASH的发生发展。

本课题为“中国肝炎防治基金会天晴肝病研究基金科研课题 (TQGB20120013) ” “山西医科大学汾阳学院院级科研项目(2018C07) ”。

关键词:胆固醇;非酒精性脂肪性肝炎;SREBP-2 ; HMGCR ; LDLR

Study on the dynamic role of cholesterol in the occurrence and
development of NASH induced by high fat and high cholesterol

Abstract

Objective:

To investigate the dynamic role of cholesterol in the occurrence and development of non - alcoholic steatohepatitis (NASH) induced by high fat and high cholesterol.

Methods:

Animal level: There were 100 SD rats randomly divided into the normal diet (CON)group, 20% fet (HFCO) group, 20% fet+1% cholesterol (HFC1) group, 20% fet+2% cholesterol (HFC2) group and 20% fat +5% cholesterol (HFC5) group, with 20 rats in each group. After 4, 6, 8 and 12weeks of feeding, 5 rats were sacrificed in each group, and their abdominal aortic plasma and liver specimens were collected. Cell level: Normal human liver cells (HL-7702) were induced by oleic acid (OA) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) to construct the NASH model. The experiment was divided into CON group, OA group and OA+ LDL-C group, culture media and cells were collected after 5 days of cell induction. The collected animal plasma and medium were used to detect the activity of ALT and AST, the contents of total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) were detected after liver and cells were collected. Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the steatosis, balloon-like degeneration and inflammatory response of the liver. The fibrous tissue deposition of liver was observed by Masson trichrome staining. The number and size of lipid droplets and the distribution and content of cholesterol in hepatocytes were observed by Oil red O staining and Filipin staining respectively. The protein expression levels of n- SREBP-2, LDLR and HMGCR were detected by Western blot.

Results:

Animal level: After 12 weeks, plasma ALT, AST, liver TC and TG in HFC2 group and HFC5 group were significantly higher than those in CON group (P<0.05), hepatic steatosis, balloon like degeneration and fibrosis were obvious in HFC2 group and HFC5 group, and NASH induction was successful in HFC2 group and HFC5 group; On weekends from 4 to

8, LDLR content of HFC2 group and HFC5 group increased significantly compared with CON group (P < 0.05), at the end of the 12th week, LDLR content in HFC5 group was significantly lower than that in CON group (P < 0.05). There was no significant difference in the expression of n-SREBP-2 in each group at the weekend of 4 to the weekend of 8, at the weekend of 12, the content of n-SREBP-2 in HFC2 group and HFC5 group increased significantly compared with CON group (P < 0.05). There was no significant difference in HMGCR protein expression in each group at the weekends of 4, 6 and 12, and the HMGCR content in HFC5 group was significantly decreased compared with CON group at the weekend of 8 (P < 0.05).

Cell level: Compared with the CON group and the OA group, the intracellular cholesterol and lipid droplet contents in the OA+ LDL-C group increased significantly, the lipid droplet volume increased significantly, and the contents of n-SREBP-2 and HMGCR increased significantly(P<0.05), the content of LDLR in OA group and OA+ LDL-C group was significantly lower than that in CON group (P<0.05).

Conclusion:

  • Cholesterol intake and duration were positively associated with NASH liver injury.
  • During the occurrence and development of NASH induced by high fat and high cholesterol, cholesterol can increase the expression of LDLR in liver cells, promote cholesterol to enter the liver, and inhibit the synthesis of endogenous cholesterol regulated by HMGCR.
  • With the increase of cholesterol accumulation in liver, LDLR expression in liver cells decreased, making intrahepatic cholesterol relatively insufficient, the feedback regulated the increase of n-SREBP-2 and HMGCR expression, thereby breaking the liver cholesterol metabolism homeostasis and promoting the occurrence and development of NASH.

Key words: Cholesterol; NASH; SREBP-2; HMGCR; LDLR

常用缩写词中英文对照表
英文缩写 英文名称 中文名称
NAFLD non-alcoholic fatty liver disease 非酒精性脂肪性肝病
NASFL nonalcoholic simple fatty liver 非酒精性单纯性脂肪肝
NASH non-alcoholic steatohepatitis 非酒精性脂肪性肝炎
LDL-C low-density lipoproteins-cholesterol 低密度脂蛋白■胆固醇
HE hematein eosin 苏木素■伊红
OA oleic acid 油酸
SREBP-2 sterol regulatory element binding protein 2 固醇调节元件结合蛋白・2
n-SREBP2 nuclear SREBP2 细胞核SREBP-2
SRE sterol regulatory element 固醇调节元件
LDLR low-density lipoproteins receptors 低密度脂蛋白受体
HMGCR 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase 3■轻基3■甲基戊二酰辅酶A还 原酶
MS metabolic syndrome 代谢综合征
SCAP SREBP- cleavage activating protein SREBP-2裂解激活蛋白
COPII coatomer II 包被蛋白2
SP1/2 site 1/2 protease 位点1/2蛋白酶
INSIG insulin-induced gene 胰岛素诱导基因
PAQR3 adiponectin Q receptor 3 脂联素Q受体3
SSD sterol sensing domain 當醇感应域
NPC1L1 Niemann-Pick type Cl-like 1 尼曼■皮克型cl样1蛋白
2-0G 2-oxoglutarate 2 ■氧戊二酸盐
ROS reactive oxygen species 活性氧
SRECA sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+ ATPase 肌间质网Ca2+ATP酶
UPR unfolded protein response 未折叠蛋白反应
SR-A scavenger receptor A 清道夫受体A
TLR toll-like receptor toll样受体
KCs Kupffer cells 枯否细胞
HSC hepatic stellate cell 肝星状细胞
TNF-a tumor necrosis factor-a 肿瘤坏死因子"
AMPK adenosine monophosphate activated protein kinase AMP依赖的蛋白激酶
SM squalene monooxygenase 角鲨烯单氧酶

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD )已成为了影响全 人类的公共健康问题,并且正迅速成为终末期肝病和肝移植的主要原因⑴2】。非酒精 性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是一种严重的NAFLD的进展形 式⑵,特征是肝细胞出现脂肪变性,损伤,以及不同程度的炎症和纤维化⑶,其病死 率高,若不加以干预治疗,将会不可逆地进一步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌⑷。 目前,对于NASH的治疗除了干预其生活方式⑸(包括合理规划饮食结构和积极体育 锻炼外血7]),并没有特异性药物可供选择⑻。尽管科学家们对NAFLD和NASH的研 究已有30多年历史,但导致进行性NASH发生发展的机制仍不清楚。NASH发病原 因的假说有最初的“二次打击学说”〔’io],也有脂质的脂毒性作用假说[⑴。临床发现 NASH患者肝脏中的游离胆固醇含量是明显升高的[I%且饮食胆固醇的大量摄入促 进了非酒精性脂肪性肝病相关的肝硬化病程[⑼。此外,也有证据表明过量的膳食胆固 醇会导致多种动物模型实验性NASH的发生[⑷⑹。提示胆固醇在肝内积累并且其稳 态的改变在NASH发生发展过程中起到了重要的致病作用"I。2016年美国公共卫生 及月艮务部(U.S. Department of Agriculture and the Department of Health and Human Services)再次正式推出最新健康饮食指南中不再建议限制每日胆固醇的摄入量,而 在此之前建议成人每日的胆固醇摄入不应该超过300毫克:18], 2019年欧洲血脂管理 指南又明确指出LDL-C是“坏胆固醇”,它的摄入应该越低越好,并将绝对值降至 1.4mmol/L (V55mg/dl) [2018 版V1.8mmol/L (<70mg/dl)]以下 口叫 胆固醇广泛存 在于生物体内,并且是多种生物膜的组成成份,它的存在决定了生物膜具有多样的生 物功能[20]。此外,胆固醇也是胆汁酸和类固醇激素及VD3的重要合成原料⑵打以上 指南给我们造成困惑,胆固醇是否能吃、量该如何把控等问题有待明确。固醇调节元 件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins, SREBPs)是关键的脂质调控转 录因子。其中,固醇调节元件结合蛋白・2 (sterol regulatory element binding protein 2, SREBP-2)负责调控胆固醇的代谢稳态[22-23],它的活性形式n-SREBP-2直接调控的下 游基因分别是3■疑基3■甲基戊二酰辅酶A还原酶G.hydroxydmethylglutaryLCoA reductase, HMGCR)和低密度脂蛋白受体(low・density lipoproteins receptors, LDLR) Bl, HMGCR和LDLR是控制胆固醇稳态的关键点㈤。其中,HMGCR是肝脏内源性 胆固醇合成的限速酶[旳,主要通过负反馈调节机制进行调节[27】。细胞中外源胆固醇的 摄取主要依赖细胞膜表面的LDLR,它可以结合载脂蛋白低密度脂蛋白(low- density lipoproteins, LDL)携带的胆固醇并将其以胞吞的形式转运至细胞内曲,研究表明 NAFLD与SREBP-2成熟,HMGCR增加有关胁叫但动态观察高脂高胆固醇膳食条 件下外源性胆固醇如何作用于肝脏并干扰与其代谢相关的蛋白表达尚未见报道。本实 验通过建立高脂高胆固醇诱导的NASH模型,在动物水平和细胞水平初步探讨胆固 醇在高脂高胆固醇诱导NASH发生发展过程中的动态作用,从而为NASH的临床防 治提供新思路。

X材料与方法

1.1实验对象

100只6周龄左右的雄性SD大鼠,清洁级别,体重为180〜200g,从山西医科 大学实验动物中心购买,生产许可证号和使用许可证号:SCXK(晋)2015・0001; HL- 7702细胞系由清华大学医学院医学系统生物学研究中心惠赠。

1 ■ 2主要试剂

谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性测定试剂盒、总胆固醇(TC)以 及甘油三酯(TG)含量测定试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司);马松染色试剂盒 (北京索莱宝科技有限公司);菲律宾菌素购自Sigma (F-9765);兔抗鼠SREBP-2、 HMGCR多克隆抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司);兔源LDLR抗体(武汉三 鹰);GAPDH抗体(上海斯信生物科技有限公司);BCA蛋白定量试剂盒,辣根过氧 化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、ECL化学发光液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、增强型RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(PMSF)、 胎牛血清、1640培养基、(武汉博士德生物科技有限公司);预染蛋白marker购自 Thermo;胎牛血清、1640培养基(武汉博士德生物工程有限公司人OA (罗恩试剂); LDL (北京协生生物)。

1 ■ 3实验仪器及设备

1.4主要试剂的配制

1.4. 1 Western blot相关试剂的配制

1.4.1.1电泳缓冲液

称取甘氨酸18.77g>Tris3.03g>SDS l.OOg于烧杯中,加入蒸憾水定容至lOOOmL, 置于磁力搅拌器上搅拌至试剂充分溶解。

1.4.1.2转膜缓冲液

称取甘氨酸14.4g> Tris 3.0g> SDS 0.2g于烧杯中,加蒸憾水至800mL,于磁力 搅拌器上充分溶解,使用前按比例添加甲醇。

1.4.1.3 10XTBS 溶液

配制总体积为1000ml的TBS溶液,称取Trisl2.1g> NaCl 87.7g于烧杯,加入蒸 馆水定容至1000ml后,边搅拌边滴加浓盐酸,用PH试纸测定溶液PH值,并将溶液 的PH值调至7.5左右,常温下储存。1XTBST溶液:量取100ml的TBS溶液、900ml 的蒸憾水和lml的Tween-20,混匀后配制成体积约为1000ml的TBST溶液,常温下 储存。

1.4.1.4 5%脫脂牛奶

现用现配,称取2.0g脫脂奶粉至装有40ml TBST的离心管中,置于脱色摇床上 摇晃混匀后使用。

1.4.2动物切片及染色相关试剂的配制

  • 4%多聚甲醛的配制

500ml PBS溶液中加入40g多聚甲醛粉末,在60°C水浴锅中逐渐滴加NAOH溶 液并震荡,直至溶液澄清,冷却后继续添加PBS溶液定容至1000mlo

  • 1%盐酸酒精溶液的配制

浓盐酸和酒精的体积比为1: 99,即99ml 75%的酒精中滴入lml浓盐酸。

1.4.2.3油红O母液的配制

称取0.5g油红O粉末溶于少量异丙醇,继续添加异丙醇至溶液体积为100ml, 锡箔纸包裹完整后置于4°C冰箱保存。用蒸馆水按2:3的比例稀释油红O母液,使用 前用三层滤纸过滤,得到油红O工作液。

1-4.3细胞培养相关试剂的配制

1.4.3.1油酸储存液(10mM)的配制

制备20%无脂肪酸・BSA溶液:取0.6g d-BSA溶于3ml PBS溶液中。制备 O.lmol/L NaOH溶液:称取0.04g NaOH粉末溶于10ml去离子水。制备20mM OA 溶液:取19.04(iL OA溶液加入3ml NaOH溶液中,置于75度水浴中进行充分皂 化,最终至无色透明澄清,配制成20mM油酸钠皂化液。将保温的OA溶液迅速加 入BSA溶液,得到20mM OA+20% d-BSA溶液,室温冷却后为淡黄色澄清液体。 在超净工作台上用细菌滤器过滤储存液,可长期储存于4°C冰箱。油酸工作液

(200piM)的配制:用完全培养基将油酸储存液稀释50倍即可得到油酸工作液。 1.4.3.2细胞完全培养液的配制

配制总体积为50ml的完全培养液,1640基础培养基45ml, 0.5ml的青■链霉素抗 生素、5ml的胎牛血清,充分混匀并于4°C冰箱储存,现配现用。

1.4.3.3细胞冻存液的配制

冻存管中冻存液的配制体积为lml,取0.1ml的二甲基亚砚(DMSO)和0.9ml的 胎牛血清(FBS),混合均匀后使用,现配现用。

2实验方法

2.1动物实验分组及样本采集

将100只雄性SD大鼠随机分为25只鼠笼饲养,每笼饲养4只,在标准环境下 用正常饲料适应性喂养1周后,将其分为正常饮食(CON 1〜5)组、20%脂肪(HFC0 6〜10)组、20%脂肪+1%胆固醇(HFC1 11〜15)组、20%脂肪+ 2%胆固醇(HFC2 16〜20)组和20%脂肪+5%胆固醇(HFC5 21〜25)组,每日饮食和饮水不间断,饲 养温度维持在25°C左右,每周更换垫料、称量体重。

大鼠在饲喂第4周后、第6周后、第8周后和第12周后,从各组的不同鼠笼中 随机挑选出1只大鼠,即每组处理共计5只大鼠,处理方法如下:处理前一天大鼠禁 食24h,自由饮水;处理当天将大鼠称重并用乙醸麻醉,固定于手术台上并沿着腹正 中线依次剪开皮肤及皮下组织,用添加有1%肝素的生理盐水溶液润洗离心管和注射 器,充分暴露腹腔后行腹主动脉采血,将血液存放于离心管中,常温下4000g转速离 心lOmin,留取上清即为血浆,可用来检测血浆中ALT、AST的含量;随后用生理盐 水冲洗肝脏表面的血迹并用滤纸吸干,称量肝脏重量,统一将肝右叶组织切成小块并 置于4%的多聚甲醛溶液中,固定好的肝脏可以用于后续的脱水和染色,液氮速冻肝 左叶及其它部位组织,保存于-80 °C冰箱。

  1. 2细胞实验分组

从液氮中取出HL-7702细胞于37°C水温下快速解冻,在37°C、含5% CCh孵育 条件下,将其培养在添加有10%胎牛血清的1640完全培养基中24h,次日更换培养 基,之后根据培养基的颜色及时换液,细胞长满后用胰蛋白酶消化细胞后计数,将其 以每孔2xl05个细胞的密度接种于6孔板中,细胞贴壁后,继续用无血清的培养基培 养24h,细胞随机分为对照组(使用1640完全培养基培养细胞)、OA组(1640完全 培养基中含有200(iM油酸)、OA+LDL-C组(1640完全培养基含有200(iM油酸和 50(ig/mlLDL-C),按以上操作步骤再铺3个板,细胞培养5天后,收集以上各组细 胞的培养液以检测细胞外基质的ALT、AST含量;第1〜4个6孔板的细胞分别用来 做油红O染色、菲律宾菌素染色、RIPA裂解法提取蛋白、提取细胞内的TC、TG, 在显微镜下观察细胞内脂滴的形态和大小;荧光显微镜下观察细胞内游离胆固醇的分 布及含量;蛋白质免疫印迹;TC、TG的含量检测。以上实验至少独立重复三次。

2.3检测项目及方法

  1. 1生化指标检测
  • 血浆及培养基中ALT、AST活性的检测:检测前30min提前打开酶标仪预热, 在505nm波长处用蒸馆水调零。将部分待测样本煮沸lOmin作为对照样本,每个测 定的样本均需要设一个对照的样本,然后按照试剂盒说明书中的步骤操作,并测定每 个样本的吸光度。
  • 肝组织及肝细胞内TC、TG含量的检测:将组织质量(Q为1,试剂一体积 (mL)为5〜10的比例混合匀浆,全程需在冰上操作,用4°C低温离心机以8000g的

转速离心lOmin,吸取上清至干净的EP管内,即为TC待测液;细胞计数,大概收 集400-500万个细胞并加lmL试剂一,在强度为20%的超声波破碎下,以工作2s, 休息Is的频率破碎细胞lmin,即可得到肝细胞TC待测液。提前在37°C环境中预热 TC工作液。在500mn波长处用蒸馆水调零,所用测定孔中加入150|iLTC工作液, 对照孔中依次加入50piLTC标准品并混匀;待测孔依次加入50)liLTC并混匀,静置 24h,使用前30min打开酶标仪预热,在500nm波长处测定各孔的吸光度。

  1. 3. 2 HE染色和Masson染色

取出在多聚甲醛溶液中固定的肝组织,将其边缘修剪整齐并置于包埋盒中,流水 冲洗lh,沥干水分后置于组织脱水机中脱水,随后用组织包埋机包埋、组织切片机切 片、二甲苯和梯度酒精脱蜡。

①HE染色:将所有切片置于染色架上,置于苏木素染液中5min左右,以染液 浸透切片上的组织为准,流水下冲洗2min洗去多余染料,置于1%盐酸酒精溶液中数 秒以洗去细胞核外多余的染料,自来水冲洗7min左右回蓝,入伊红溶液10s-30s,再 经过二道95%乙醇I、II,调色各10s,入二道无水乙醇I、II,脫水各2min,入 二道二甲苯I、II,透明各2min,中性树胶圭寸片,镜检;

②Masson染色:将脱好蜡的切片放入配置好的Weigert铁苏木素染液中大约 7min,分化:酸性乙醇溶液10s,流水冲洗,反蓝:蓝化液4min,流水水洗,蒸馆水 水洗1 min,染色:丽春红品红7min,弱酸溶液洗lmin,磷钳酸溶液洗lmin,弱酸工 作液再洗lmin,染色:苯胺蓝溶液lmin-2min,置于弱酸溶液中lmin,脱水:95% 乙醇1次,无水乙醇3次,每次各5s-10s,透明:二甲苯3次,# lmin-2min,中性 树胶封片,长期保存或镜下观察。

  1. 3油红0染色和菲律宾菌素染色
  • 油红O染色:吸弃细胞上层培养基并用PBS溶液清洗;用4%多聚甲醛溶液 固定30min;弃去固定液后用PBS溶液清洗至少3次;每孔加入5mL的油红O工 作液,以完全覆盖6孔板底部为准,室温染色30min后弃去油红O染液,并用60% 的异丙醇溶液清洗多余染料;在苏木素染液中复染细胞核lmin,流水冲洗至切片颜 色变蓝,加入少量PBS溶液,显微镜下观察。
  • 菲律宾菌素染色:细胞诱导结束后弃去培养基,加入PBS溶液轻轻摇晃清洗, 重复3次;每孔加入5ml4%的多聚甲醛溶液,固定30min,固定结束后弃掉固定液, 再次用PBS溶液清洗残余的固定液;每孔加入1.5mg/ml的甘氨酸,培养lOmin后弃 去甘氨酸并用PBS洗去残留;加入菲律宾染液后将6孔板包裹锡箔纸,置于黑暗环 境中染色,2h后弃去染液,加入少量PBS溶液,荧光显微镜下观察。
  1. 3. 4 Western blot法检测相关蛋白的表达
  • 提取蛋白:按组织净重每lg加入10ml RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制剂 PMSF)的比例,全程在冰上用超声粉碎仪提取组织总蛋白。肉眼观察组织块消失、 溶液浑浊时停止破碎,将其插入冰上静置30min,在4°C低温离心机10000g的转速下 离心lOmin,得到的上清液就是肝组织总蛋白;细胞总蛋白的提取:用PBS清洗细胞 后,每孔加入50piL的RIPA裂解液,其余步骤同上。
  • 蛋白定量:采用BCA法将标准品用生理盐水稀释为不同浓度梯度的蛋白标 准品,稀释后的浓度依次为 2000、1500、750、500、250、125、25、0(ig/mlo 在 96 孔 板中加入25此的不同浓度梯度的标准蛋白,再加入200(iLBCA工作液,轻轻混合; 在其它孔中加入25此的样品蛋白,加入200(iLBCA工作液,轻轻吹打混合;在37°C 恒温箱中充分反应,30min后取出,室温放置lOmin,调节波长至562nm处,测定各 孔的吸光度值,将标准品的浓度与其对应的吸光度值绘成标准曲线,利用标准曲线得 到的公式来计算待测样品的浓度。统一调整蛋白浓度后在待测样品中加入5Xloading buffer使其工作浓度为1 X , 100°C金属浴中煮蛋白5min使之完全变性。煮沸变性的 蛋白样品分装后储存于-20 °C冰箱保存。
  • 电泳:将各孔的蛋白上样量统一调至动物蛋白40憾,细胞蛋白30|Ligo在浓缩 胶中的电压为80V,当漠酚蓝指示剂到达分离胶后将电压上调至120V,当漠酚蓝刚 跑出分离胶进入电泳液时关闭电源。
  • 转膜:配制好的转膜缓冲液中按比例加入甲醇,将转膜夹及切好的NC膜放 入转膜液中浸泡,按照黑色负极、海绵、3层滤纸、目的凝胶、NC膜、3层滤纸、海 绵、白色正极的顺序铺放,轻轻赶走气泡。将安装好的转膜夹放入槽内,倒满转膜液, 调整电源恒流300mA, 2ho
  • 封闭:室温下封闭NC膜2h,封闭液为含5%脫脂奶粉的TBST溶液。
  • 抗体孵育:根据marker的指示裁剪想要的目的条带,分别加入各条带对应的 一抗后于4°C条件下孵育过夜,次日用TBST洗去多余的一抗溶液,每次lOmin,共 洗3次。在室温下孵育二抗2h后用TBST洗去多余的二抗,每次lOmin,共洗3次。
  • 显色:在Image Lab中用化学发光法获取条带图片,Image J软件进行图像的 灰度值分析并统计。
  1. 4统计学分析

采用SPSS 25.0软件统计分析实验结果,实验结果用均数土标准差(mean ± SD) 的方式表示。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行多组之间的比较,采用 LSD检验进行组间两两比较,以PvO.05为差异有统计学意义。

3结果

  1. 1动物实验结果
  2. 1血浆ALT、AST和肝脏TC、TG的含量变化

大鼠饲喂12周后,HFCO组大鼠血浆中的ALT含量较CON组明显升高(FvO.OOl),

HFC1组、HFC2组和HFC5组大鼠血浆中的ALT含量也显著增加(P<0.0001); HFCO 组、HFC1组和HFC2组大鼠血浆中的AST含量较CON组明显升高(P<0.01),与 CON组相比,HFC5组大鼠血浆中的AST含量明显升高(尸<0.001);与CON组相 比,HFC1组、HFC2组和HFC5组大鼠肝组织中的TC含量明显升高(P<0.0001); 与CON组相比,HFCO组、HFC1组肝脏TG含量明显升高(P<0.01), HFC2组、 HFC5组肝脏TG含量也显著增加(FV0.001)(表1)。

  表1 血浆ALT、AST及肝脏TC、 TG的含量
组别 谷丙转氨酶

nmol/(min.ml)

谷草转氨酶

nmol/(min-ml)

肝脏总胆固醇

(mg/g)

肝脏甘油三酯

(mg/g)

CON 162.90+ 1.56 51.52 + 0.84 7.83 ± 0.03 31.14+1.16
HFCO 186.21 ±0.91*** 56.29 ± 0.66** 9.55 ± 0.74 45.10 ±2.51**
HFC1 200.60 ± 1.45**** 56.32 ±0.34** 14.14 ±0.16**** 45.41 ± 2.97**
HFC2 252.10 ±3.41**** 57.68 ±0.66** 19.32 ±0.61**** 49.58 ± 1.00***
HFC5 274.80 ± 1.68**** 60.81 ±0.61*** 21.90 ±0.14**** 46.76 ±0.75***

注:与正常组比较,** K0. 01, ***/K0. 001, **** K0. 0001 o

3.1.2造模12周后肝脏病理学改变

肝脏HE染色结果所示,CON组肝细胞形态正常,胞质均匀,肝小叶结构规 则;HFC0组、HFC1组表现为散在的肝细胞浆内脂滴空泡的形成;HFC2组、HFC5 组大脂滴为主的脂肪变性肝细胞和气球样变性肝细胞增多,肝细胞肿胀,胞质疏松 化(图1A) o

肝脏Masson染色结果显示,HFC2组肝细胞周围有散在分布的细丝状淡蓝色纤 维出现,HFC5组可见分布较广、较粗的蓝色胶原纤维沉积(图IB) o

注:A.苏木素-伊红染色(100X) ; B.马松三色法染色(200X)
图1 HE和Masson染色观察肝脏病理学改变

  1. 1.3 Western blot 检测结果

Western blot (如图2)显示,4周末,HFC2组、HFC5组较CON组LDLR含 量明显增加(P<0.05) ; 6周末和8周末,与CON组和HFC0组相比,HFC1组、 HFC2组、HFC5组LDLR的蛋白表达明显增加(P<0.05) ; 12周后,与CON组相 比,HFC5组LDLR的蛋白含量明显减少(Pv0.05)。

第4周、第6周、第8周后,高脂组、所有高脂高胆固醇组相较于CON组n- SREBP-2蛋白表达无显著性差异;12周末,HFC0组、HFC2组、HFC5组较CON 组n-SREBP-2含量明显增加(Pv0.05) , HFC1组、HFC2组、HFC5组较HFC0组 n-SREBP-2含量明显减少(Pv0.05)。

第4周、第6周、第12周后,高脂组、所有高脂高胆固醇组HMGCR蛋白表 达相较于CON组无明显差异,8周末,HFC5组较CON组HMGCR蛋白表达量明 显减少(P<0.05) o

脏相关蛋白的表达J|冃况

注:大鼠在不同饮食条件下饲喂第4周(A)、第6周(B)、第8周(C)以及第12周(D) 后的相关蛋白表达*只0.05,与对照组比较;#只0.05,与HFC0组比较。

  1. 2细胞实验结果
  2. 2. 1油红O染色

由染色结果(图3)所示,与CON组相比,OA组和OA+LDL-C组肝细胞内脂

滴含量明显增多;与OA组相比,OA+LDL-C组肝细胞内小脂滴融合为大脂滴,脂滴 数量也略多于OA组。

CON OA OA+LDL-C

图3油红0染色观察不同处理因素对HL-7702细胞内脂滴含量的影响(400 X )

  1. 2. 2菲律宾菌素染色

由染色结果(图4)所示,与CON组相比,OA组菲律宾菌素染色后肝细胞内无 荧光亮点变化;OA+LDL-C组较CON组和OA组细胞质内散在分布的蓝色荧光亮点 的数量明显增加。

CON OA OA+LDL-C

图4 HL-7702细胞造模5天后菲律宾菌素染色(400 X )

3.2.3培养基中ALT、AST和细胞内TC、TG含量变化

结果所示,相较于CON组,OA组、OA+LDL-C组培养介质中的ALT含量明显 升高(P<0.05); OA+LDL-C组较CON组AST含量显著升高(P<0.05);与OA组相 比,OA+LDL-C组培养基中的ALT、AST含量无明显差异;与CON组和OA组相 比,OA+LDL-C组肝细胞内的TC含量明显升高(P<0.001);三个组间细胞内的TG 含量变化不大,无明显统计学意义(图5)。

注:*R0. 05, *** K0. 001,与对照组比较;### K0. 001与0A组比较。图5培养基中的ALT、AST和细胞内TC、TG的含量

  1. 2. 4 Western blot 检测结果

结果(图6)所示,OA+LDL-C组较CON组、OA组n-SREBP-2蛋白表达量

明显增加(P<0.05); OA+LDL-C组较CON组、OA组HMGCR的蛋白含量明显升高

(P<0.05); OA组、OA+LDL-C组较CON组LDLR蛋白含量明显减少(尸<0.05)。

图6 Western b丨ot法检测不同处理因素对细胞内n-SREBP-2、HMGCR、LDLR含量的影响

注:*KQ. 05,与对照组比较;# ZK0.05,与0A组比较。

4讨论

  1. 1高脂高胆固醇饮食诱导大鼠建立NASH模型

非酒精性脂肪性肝病已经发展为全球常见的代谢相关性疾病卩i],不但是不可逆 性肝病发生发展的重要病因,而且还显著增加了2型糖尿病、动脉粥样硬化以及结直 肠肿瘤的发病风险,成为了日益严峻的公共健康问题[辺。目前,NAFLD已经影响了 全球多达四分之一的人口阳,我国NAFLD患者占全国各类肝病患者总数的49.3%, NAFLD已经超过慢性乙型肝炎成为第一大肝病卩4]。非酒精性脂肪性肝病疾病谱分为 单纯性脂肪肝(Nonalcoholic simple fatty liver, NASFL)、NASH、脂肪性肝纤维化及肝 硬化等厲切]。单纯性脂肪性肝病属于良性病程,有望通过调整饮食结构和增强体育锻 炼而治愈與],而NASH的疾病特点除了肝细胞脂肪变性外,还伴有肝细胞的损伤、 炎症和纤维化卩刃,其进展为终末期肝病、诱发2型糖尿病和心血管疾病等并发症的风 险显著增大[40-41]o目前,对NASH发病机制的了解大多基于推测水平,所以在对其治 疗上能采取的措施非常有限[⑴。

研究发现,在NASH发生发展过程中,甘油三酯并没有对肝细胞的损伤和炎症 起到决定性的破坏作用[松43],而胆固醇代谢在NASH的发生发展中尤为重要屮],即 胆固醇在肝细胞内的堆积较甘油三酯更具有细胞毒性[仔46]。使用他汀类药物降低胆固 醇的同时也能有效改善NASH患者的肝脏脂变、炎症和纤维化[47-48]。本研究借鉴了 陈中强[49]等人的方法,验证了高脂高胆固醇饮食尤其是胆固醇占比更大的饮食较单 一高脂饮食更能成功诱导动物和细胞NASH的发生,进一步证实了胆固醇在NASH 发生发展中起到了重要作用。由此可得,饮食中含有一定比例的胆固醇时并不会对机 体造成损害,但是当胆固醇的浓度增加并超过一定的范围后,其对肝脏的损害作用逐 渐增强。

  1. 2胆固醇对大鼠NASH发生发展的动态作用

Malhotra等网发现肠道SREBP-2的过度激活能促进饮食诱导的NASH的发生, Min等a】发现NASH病人体内SREBP-2成熟、HMGCR表达增加、LDLR表达减少。 动物水平上发现,在高脂高胆固醇诱导NASH发生发展的动态过程中发现,高脂高 胆固醇组的LDLR含量随着时间的变化先升高后降低,说明为了处理和平衡血液中 升高的胆固醇水平,胆固醇在早期能诱导肝脏来高表达LDLR,这可以避免血脂的急 剧升高;但是当细胞内的胆固醇含量升高到一定程度后抑制了 LDLR的表达,这可能 与胆固醇摄入过多引起的细胞膜功能障碍有关,也可能与LDLR在溶酶体中破坏增 多导致其向细胞膜的循环利用减少有关,具体机制有待进一步研究;早期所有高脂组 较CON组mSREBP・2含量一直处于较低水平,这可能是内质网上的胆固醇含量增多 后抑制了 SCAP-SREBP-2复合物与COPII的结合,从而抑制了 SREBP-2的水解激活, 也可能是由于高尔基体对SREBP-2的酶切水解作用减弱a】;饲喂第8周结束的时候, HFC5组较CON组HMGCR的蛋白表达水平降低,这表明当外源性胆固醇摄入过多 的时候HMGCR调控的内源性胆固醇的合成会明显减少,这是一种明显的负反馈调 节机制,而目前的观点也认为为血浆胆固醇大部分来自肝脏的合成,从外界摄入的胆 固醇吸收较少,而且当摄入胆固醇过多,肝细胞会减少胆固醇的合成也5\在饲喂第 12周末结束的时候,HFC0组、HFC2组、HFC5组较CON组n-SREBP-2蛋白表达 量增加,然而HMGCR蛋白含量虽然有升高趋势,但是没有明显的统计学意义,这可 能与造模时间较短有关,同时,我们在细胞诱导5天后的NASH模型中验证了 HMGCR 升高的这一结果,进一步验证了我们的猜测。在今后的实验中应该延长饲喂时间,以 便进一步地深入研究。

  1. 3低密度脂蛋白-胆固醇诱导HL-7702致细胞NASH的作用

我们发现,细胞诱导第5天后,添加有LDL-C的细胞培养组培养介质中的ALT、 AST含量升高,肝细胞内的胆固醇含量也明显升高,这说明OA+LDL-C组肝细胞炎 症明显,且这种炎症反应与肝细胞内增加的胆固醇含量密切相关。细胞诱导5天后的 实验结果与动物水平饲喂12周后的结果相对应,是动物实验在细胞水平的进一步补 充。OA+LDL-C组相较于CON组、OA组n-SREBP-2> HMGCR蛋白表达水平明显 升高,说明在成功诱导HL-7702细胞发生NASH后,mSREBP・2、HMGCR介导的内 源性胆固醇在NASH的发生发展过程中占据主要地位。油红O染色发现,OA+LDL- C组肝细胞内的脂滴融合,体积增大,但是各实验组肝细胞内甘油三酯的含量却没有 显著性差异,我们猜想可能是细胞内的甘油三酯在提取过程中受到了不同因素的破坏, 或者是脂质含量太低导致的检测结果误差增加,在今后的实验中我们将进一步改进。 与动物水平有一点不同,细胞水平诱导5天结束后,OA+LDL-C组的HMGCR的蛋 白表达明显增多,说明用OA和LDL-C诱导细胞5天发生NASH的时间是足够的, 而用高脂高胆固醇诱导大鼠NASH时可以适当延长造模时间,并且添加5%胆固醇的 高脂高胆固醇组结果更加明显,在今后的实验过程中可以以此为造模的最佳浓度。

综上所述,本研究发现肝脏在饮食中胆固醇的诱导下,高表达了细胞膜表面的低 密度脂蛋白受体,从而将饮食摄入的胆固醇转运进来,在负反馈调节存在的情况下, 自身内源性胆固醇的合成受抑制,肝脏的这种自我调节机制在高脂高胆固醇饮食的早 期能维持肝内胆固醇浓度的动态平衡,从而保护肝脏胆固醇稳态不受破坏;随着肝内 胆固醇含量的进一步增加,肝细胞LDLR表达减少,此时由LDLR介导的胆固醇的 摄入减少使肝内胆固醇相对不足,促使n-SREBP-2和HMGCR表达升高来应对肝内 胆固醇含量相对不足的情况,最终结果就是打破了肝脏胆固醇代谢稳态,加剧了胆固 醇在肝脏的堆积,进一步促进了 NASH的发生发展。

5结论

5.1动物实验

高脂高胆固醇饮食较单一的高脂饮食更能成功诱导大鼠NASH的发生,胆固醇 的摄入量和摄入时间的长短与NASH肝损伤成正相关。

在高脂高胆固醇饮食诱导NASH的发生发展过程中,肝细胞在胆固醇诱导下可 以高表达LDLR促使胆固醇进入肝脏增加,同时HMGCR调控的内源性胆固醇的合 成被抑制。

随着肝内胆固醇堆积增多,肝细胞LDLR表达减少,使肝内胆固醇相对不足, 反馈性调节n-SREBP-2和HMGCR表达升高,肝脏胆固醇代谢稳态被打破,进一步 加剧了 NASH的发生发展。

  1. 2细胞实验

OA与LDL共同作用可诱导HL-7702细胞向NASH发展。

HL-7702细胞NASH模型诱导成功后发现,胆固醇诱导肝细胞内LDLR蛋白表 达减少,n-SREBP-2> HMGCR蛋白表达增加,进一步补充完善了动物实验结果,说 明随着肝内胆固醇堆积增多,肝细胞LDLR表达减少并反馈性调节n-SREBP-2和 HMGCR表达升高,从而打破肝脏胆固醇代谢稳态,促进NASH的发生发展。

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综述

胆固醇合成代谢与细胞毒性作用

自从首次从人类胆结石中分离出胆固醇以来,其生理和病理的重要性就不容 忽视。最近新出现的实验和人类证据表明,胆固醇是一种重要的脂毒性分子,游 离胆固醇在肝脏的积累、胆固醇稳态改变都与非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)的发病机制有关⑴。据报道,胆固醇在许多不同的动物模 型中均能促进NASH的发生发展⑵。细胞内胆固醇的合成、吸收、转运和酯化是 一个不断变化的动态平衡,这些环节的协调运行可以保证细胞内胆固醇水平的稳 定。鉴于胆固醇在不同生理环境中有着重要的功能,其代谢紊乱可以导致多种人 类疾病⑶。因此,本文主要综述了细胞内胆固醇在生物合成、吸收这两个部分如 何执行和调节的最新进展,并且综述了肝损伤过程中胆固醇对细胞亚结构的破坏 与损伤的细胞机制。

关键词:胆固醇;SREBP-2; HMGCR; LDLR; SM;细胞毒性

近年来,高脂高热量饮食结构的改变和运动量明显不足的生活方式使肥胖、 2型糖尿病等代谢综合征(metabolic syndrome, MS)的发病率逐年增加,并且逐 渐成为影响全球人类健康的头号杀手,NAFLD就是MS的肝脏表现⑷。NAFLD 影响了大约30%的普通成年人,其在MS患者中的发病率更高⑸,影响了大约70% -80%的糖尿病和肥胖患者⑹,与此同时,心血管疾病的风险在NAFLD患者中也 逐年增加⑸⑺。NALFD的疾病谱分为非酒精性单纯性脂肪ff (Nonalcoholic simple fatty liver, NASFL)、NASH、脂肪性肝纤维化、肝硬化等⑻。其中,NASFL被认 为具有良好的肝脏预后[9】,其肝脏损害和结局可以逆转,而NASH是肝移植和患 者死亡的主要原因[10'11]o然而到目前为止,NASFL向NASH进展的发病机制仍 不明确,有越来越多的证据表明,肝内胆固醇的积累与NASH的发生发展密切相 关。有学者发现单纯性脂肪肝可由单一的高脂饮食所致,其进一步转变为NASH 风险极低,与此同时,单纯的高胆固醇饮食对肝脏的损害也较轻,但一旦同时采 用高脂高胆固醇饮食就很容易诱发NASH,这是因为饮食中脂肪能帮助胆固醇吸 收[⑵。当肝脏自身合成胆固醇增加或从外周血液以循环脂蛋白的形式摄取的胆固

醇增加,再或者细胞内的胆固醇流出减少时,胆固醇就会大量堆积在肝内。那么 在NASH发生发展过程中胆固醇起到的重要致病作用是什么,机制为何仍不清 楚。因此,围绕NASFL向NASH转归这一关键科学问题开展系列工作,了解 参与胆固醇合成代谢的基因、蛋白及其复杂的相互作用以及胆固醇堆积对细胞损 伤的具体机制,可能是预防和治疗NAFLD的新方法,也将是今后需重点解决的 问题。本文重点综述了细胞内胆固醇来源的蛋白调控途径及胆固醇堆积对细胞的 毒性损伤作用。

1胆固醇生物合成的调控

胆固醇在人体中无处不在并且几乎可以在所有细胞中合成,而肝脏是合成胆 固醇含量最多的场所〔⑶。固醇调节元件结合蛋白2 (sterol regulatory element binding protein 2, SREBP-2)、3-轻基 3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶(3-hydTOxy-3- methyl-glutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)、角 鲨烯单加氧酶 (squalene monooxygenase, SM)是胆固醇合成过程中的三个关键参与者。

  • SREBP2的调控

在内质网合成的SREBP-2蛋白前体与SREBP-2裂解激活蛋白(SREBP- cleavage activating protein, SCAP)相连,SREBP-2-SCAP 复合物经过包被蛋白 2 (coatomer II, COPII)的包被从内质网转运到高尔基体上,SREBP-2在高尔基体 位点 1 蛋白酶(site 1 protease, SP1)和位点 2 蛋白酶(site 2 protease, SP2)的水 解激活下进入细胞核,转化为具有活性形式的细胞核SREBP-2 (nuclear SREBP- 2,n-SREBP2) , n-SREBP-2在细胞核中与靶基因启动子中的固醇调节元件(sterol regulatory element, SRE)结合并上调它们的转录冋。SCAP可以感知内质网上的 胆固醇波动并做出反应,促进SREBP-2离开内质网向高尔基体的移动,具体指的 是SCAP在开象和闭象之间来回切换去调节其与COPII的结合[⑸,具体调节机制 如下:

  • SREBP-2转录和表达受到细胞内胆固醇含量的调控

当内质网膜上的胆固醇含量不足时,胰岛素诱导基因(insulin-induced gene,

INSIG)蛋白不再与连接有SREBP-2的SCAP结合,使SCAP-SREBP-2复合物被 顺利分选到COPII囊泡中,在囊泡的包裹及运输下,SREBP-2移动到高尔基体中 并被水解激活⑶。在當醇消耗的情况下,INSIG的降解有助于SCAP-INSIG复合 物的快速解离和SREBP-2通路的激活。在SREBP-2激活的整个过程中,除了保 证SCAP-SREBP-2复合物从内质网的顺利离开外,内质网到高尔基体的正确定位 以及高尔基体对SCAP-SREBP-2复合物的钏定也是至关重要的。COPII囊泡内的 复合体向高尔基体的顺序迁移也受到了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT的正向调控, 在高尔基体上的跨膜蛋白黄体酮和脂联素Q受体3 (adiponectin Q receptor 3, PAQR3)在胆固醇消耗的条件下转录激活,与SCAP-SREBP-2复合物相互作用并 使其停留在高尔基体内。

内质网膜上堆积增多的胆固醇与SCAP紧密结合,使INSIG蛋白与SCAP上 的當醇感应域(sterol sensing domain, SSD)相互作用,结果是阻止了 COPII与SCAP 的结合,并导致SCAP-SREBP-2复合物停留在内质网中。氧當醇,如25-轻基胆 固醇,是胆固醇代谢产物之一,其触发SCAP-SREBP-2复合物在内质网的滞留的 能力强于胆固醇。当INSIG发生突变后,将无法与25-瓮基胆固醇结合,也就不 再能抑制SREBP2的蛋白水解过程。

  • n-SREBP-2的翻译后修饰

SREBP2的表达和转录活性可以通过乙酰化作用增强,其N端可以被组蛋白 乙酰转移酶P300及其相关蛋白CBP结合并乙酰化,同时,增加细胞核中n- SREBP2丰度也可以通过抑制SREBP-2的去乙酰化,即消除或抑制去乙酰化酶 SIRT1的活性来实现。SIRT1介导的SREBP-2的去乙酰化意义重大,饥饿条件下 SIRT1激活,SREBP-2转录表达减少,该过程可以停止营养不足条件下耗能的胆 固醇生物合成过程。

除了乙酰化作用,n-SREBP-2还可以被ERKs和MPK磷酸化,从而增加和 减少转录活性,亦可以通过泛素化修饰,来降低其转录活性。

  • HMGCR的调控

SCAP和HMGCR均受INSIG的结合和调控,参与形成SCAP和INSIG复合 物的关键残基包括SCAP上的部分位点以及INSIG上的部分位点,HMGCR与 INSIG的结合依赖于HMGCR的YIYF序列的存在。对于SCAP来说,INSIG的 结合改变了 SCAP的构象,使SCAP上负责与COPII结合的序列不再暴露,与 SREBP2结合的SCAP复合物向高尔基体的转运被阻断;HMGCR在INSIG连接 的E3泛素化连接酶驱动下发生泛素化并降解。当羊毛當醇和轻固醇在细胞内堆 积时,诱导INSIG与HMGCR结合,促发了 HMGCR的泛素化和随后相关的的 蛋白酶体降解。

HMGCR可以在磷酸化和去磷酸化之间相互转化,磷酸化可以消除HMGCR 的活性。在肝脏中,HMGCR主要通过AMP依赖的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)磷酸化,抑制 AMPK 的活性可以 激活HMGCR的表达并且增加胆固醇的合成。

1.3 SM的调控

胆固醇生物合成途径中除HMGCR外的另一限速酶是角鲨烯单氧酶(SM),过 量的胆固醇会加速SM的降解[⑹,SM与HMGCR —样,SM在转录和翻译后水 平都受到控制"I。SM前100个氨基酸组成的区域,被称为SMN100,是迄今发 现的最短的胆固醇反应域,它能够使SM感知内质网膜中多余的胆固醇[⑻并且 是SM降解过程所必需的。SM N端的两亲螺旋结构在内质网低胆固醇水平时与 细胞膜连接;但在过量胆固醇的作用下,SM经历胆固醇依赖的蛋白酶体降解, SM与细胞膜分解,与E3泛素连接酶MARCH6结合[⑻,SM丝氨酸残基两侧的 两亲螺旋被泛素化后有效降解,然而,SMN100的胆固醇调节所需要的泛素化位 点是未知的。

2细胞对胆固醇的摄取的调控

除了生物合成外,饮食和随后从血液中摄取的胆固醇在胆固醇稳态中起着关 键作用。低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)和尼曼-皮克 型cl样1蛋白(Niemann-Pick type Cl-like 1, NPC1L1)均能够介导细胞外来源 的胆固醇摄取。在肠细胞和肝细胞内,LDLR定位于基底外侧膜,负责从血液中获 取LDLs的形式的胆固醇,而肠腔和胆小管腔里未酯化胆固醇则由NPC1L1接收。 不管来源和途径如何,被吸收的胆固醇最终到达内质网进行感应、运输或酯化。

  1. 1 NPC1L1介导的胆固醇的摄取

肠上皮细胞不但可以吸收饮食来源的游离胆固醇,也可以吸收胆汁来源的游 离胆固醇,这种吸收是由NPC1L1介导的。

NPC1L1在小肠吸收胆固醇的过程中起到了关键的作用el,在肠上皮细胞和 人的肝细胞胆小管膜上特异性表达,能与多种脂质转运体共同影响着胆固醇的代 谢[20]。3个大的胞外结构域,13个跨膜段和一个短的胞质C端构成了 NPC1L1的 分子结构Bl, N端可以选择性的与胆固醇或者氧化當醇结合,C端是一个有内吞 作用的YVNxxF信号序列,其中,x为任意氨基酸,该信号序列可以结合内吞作 用适配器NUMB来调节NPC1L1的内化QI。NPC1L1的N端结构域负责与肠腔 或胆汁中的胆固醇结合,结合了胆固醇的NPC1L1构象发生改变,NPC1L1携带 胆固醇通过内吞作用进入细胞。

  1. 2 LDLR介导的胆固醇的摄取

LDLR是一种细胞表面糖蛋白,并且在大多数细胞的质膜上表达,包括肠细 胞和肝细胞的基底外侧表面。细胞表面的LDLR与携带胆固醇的低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL)颗粒结合。LDLR 表达的蛋白除了受 SREBP-2 调 控激活外,甲状腺激素也可与LDLR启动子直接结合诱导LDLR表达閃,而LDLR 的降解受到了前蛋白转化酶枯草素/kexin 9型(pro-protein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)和诱导降解 LDLR (inducible degrader of LDLR, IDOL)的影响[24]O 120KD的LDLR前体沿分泌途径转运时发生糖基化,转化为 在大多数细胞类型的细胞膜中都存在的160KD的成熟蛋白。血液中的LDL被细 胞表面的LDLR捕获后,LDL和LDLR复合物内化在网格蛋白包被的凹坑中, 从而进入细胞中。

3胆固醇的细胞毒性作用

细胞内的细胞器对胆固醇和脂质稳态的控制十分精细,胆固醇在细胞器之间 的转运对于胆固醇平衡的稳定至关重要©I。当细胞膜上胆固醇的浓度过高时,内 质网和线粒体膜上的胆固醇含量反而会减少,这一现象,在Niemann-Pick Cl, Npcl nmfl64点突变小鼠体内也得到了证实,这些突变小鼠体内的线粒体数量不 但减少,还存在形态上的异常[26卯,也有研究发现,NASH的发生与线粒体功能 受损密切相关[2^29]。当细胞器发生功能障碍时,细胞内游离胆固醇的积累可以通 过破坏线粒体和内质网膜的完整性,触发线粒体氧化损伤和内质网应激从而直接 损伤肝细胞,除此之外,胆固醇也可以转化为其他有毒氧當醇的生成,间接诱导 细胞功能障碍。枯否细胞(Kupffer cells, KCs)和肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)也可能受到氧化的低密度脂蛋白颗粒的激活,使肝脏出现炎症和纤维化。 NASH的发展被认为依赖于内质网压力和线粒体功能障碍[迥。

  1. 1游离胆固醇对线粒体的损伤作用

线粒体膜上的2-氧戊二酸盐(2-oxoglutarate, 2-OG)跨膜蛋白载体能将细胞 质中从头合成的谷胱甘肽(GSH)运输到线粒体中,线粒体谷胱甘肽(mGSH) 对于细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成控制至关重要[31_32]O线 粒体膜上胆固醇含量的变化以及膜的流动性的改变可以影响2-OG的生物活性, 线粒体膜上增多的游离胆固醇会使细胞膜的流动性减弱,2-OG对GSH的运输减 弱,mGSH抑制ROS生成以及脂质的过氧化的能力减弱,肝细胞在肿瘤坏死因 子(tumornecrosis factor-a,TNF-a)的刺激下发生炎症反应、凋亡和坏死,诱发了 NASH的形成⑴。

3.2胆固醇在内质网应激中的作用

内质网是分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、折叠、成熟及翻译后修饰的重要场所 [33'34],同时,内质网在胆固醇的生物合成控制上也发挥了重要作用,内质网膜上 增多的胆固醇含量会使游离胆固醇和磷脂的比例发生变化,内质网膜变得僵硬并 且会抑制膜上酶的构象变化。在这些内质网酶中,肌间质网C/+ATP酶 (sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+ ATPase, SRECA)是敏感的并且可以感受到内 质网膜上微量的胆固醇变化,当SRECA构象发生改变时,内质网上正常的高钙 离子水平降低,严重影响了内质网的折叠能力厲],内质网应激、未折叠蛋白反应 (unfolded protein response, UPR)以及细胞凋亡增加。内质网应激是非酒精性脂 肪肝发展为非酒精性脂肪性肝炎的重要机制之一 [36],除此以外,内质网应激也是 包括NAFLD、肥胖在内的代谢性疾病的重要致病原因厲】。

3.3胆固醇激活了枯否细胞和肝星状细胞

肝脏中游离胆固醇的积累会激活非实质细胞,包括KCs、HSC和巨噬细胞, 从而导致持续的炎症和纤维化卩8】。现已证实胆固醇水平过高在喂食高脂高胆固醇 饮食的小鼠中能激活KCs,在这些小鼠中,FC累积进入KCs,使其激活并促进 了 NASH发展,KCs吞噬功能受到破坏后也可以加快肝脏的炎症和坏死㈤],由于 KCs无法合成胆固醇,KCs摄取胆固醇的方式主要是通过清道夫受体簇分化蛋白 (CD) 36和清道夫受体A (scavenger receptor A, SR-A)内化从富含胆固醇的脂 蛋白中获取。

在NASH中,肝纤维化均伴随着肝星状细胞的激活。高胆固醇饮食引发的肝 纤维化是通过将游离胆固醇堆积在肝星状细胞中引发的so】,游离胆固醇对肝纤维 化的触发是通过toll样受体(toll-likereceptor, TLR)-4依赖途径直接激活了 HSCs。 并已经在饮食诱导和自发的细胞内胆固醇积累的动物模型中得到了很好的证明 [41]

目前,越来越多的证据表明胆固醇与NASH的发生密切相关,胆固醇稳态的 改变对细胞的毒性作用也得到了越来越多的证据支持,胆固醇与心血管疾病、 NASH之外的一系列疾病也有着密切关系,如阿尔茨海默病[任43]和癌症[44]。他汀 类药物作为降低胆固醇的常用药物,已经广泛应用于心血管疾病和高胆固醇血症 的预防和治疗[Q,然而他汀类药物也会出现不少副作用,严重情况下可致人死亡 [46],且HMGCR蛋白代偿增加会限制他汀类药物的降胆固醇效果,联合用药可以 很好的控制血浆胆固醇的水平,最常用的药物有肠道胆固醇吸收抑制剂依泽替米 贝(ezetimibe)和PCSK9抑制剂仔佝,可以改善服用他汀类药物的高脂血症患者 的心血管疾病结局。但是不可否认的是,胆固醇在参与人体生命活动中必不可少, 关于胆固醇摄入量的控制以及胆固醇相关疾病的有效治疗方案有待进一步研究。

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致谢

在校三年的求学生涯匆匆结束,在这段时光里,我收获了很多也成长了许多,在 此,谨向三年里给予我帮助的老师,同学,和家人表示由衷的感谢。

首先,我要感谢我的导师一一宋维芳老师,本论文的课题设计、实验安排和撰写 修改都是在我导师的指导下完成的。老师在工作上严谨认真、一丝不苟,在生活中朴 实无华、平易近人,她不但悉心指导我的学习与实验,在生活中对我也是关怀备至。 她教会了我很多待人接物和为人处世的道理,是我今后工作和生活中的榜样。

其次要感谢实验室所有辛勤工作的老师们:吴惠文,王明亮,宋彬妤,刘晓梁, 付慧,王浩玉,是他们耐心指导、默默奉献,为我们提供了良好的学习条件,非常感 谢老师们。

我还要感谢陪伴在我身边的同学们:吉紫阳,张晓荣,闫方艳等,谢谢他们在生 活上给与的帮助,也谢谢他们在我学习中提出的意见和建议。

感谢我的师妹师弟们:张文慧、侯明粟、王博文、陈星旭、邓宜芳在实验上和生 活中给予我的帮助。

最后,我也要感谢我的父母,是他们默默无闻的陪在我身边,感谢他们的支持与 理解!

本课题承蒙“中国肝炎防治基金会天晴肝病研究基金科研课题 (NO.TQGB20120013)”; “山西医科大学汾阳学院院级科研项目(NO.2018C07)”资 助,特此致谢。