产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染危险因素、耐药机制及分子流行病学研究论文

2021年1月18日14:14:33产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染危险因素、耐药机制及分子流行病学研究论文已关闭评论

产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染危险因素、耐药机制及分子流行病学研究论文

摘要

目的:

  1. 回顾性研究产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染可能的危险因素。
  2. 研究产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌可能的耐药机制。
  3. 研究产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌分子流行病学。

方法:

  1. 菌株来源:收集2016年6月—2017年12月南昌大学一附医院就诊患者 分离的KP,同一患者重复分离的菌株只留取患者首次分离的菌株。菌株鉴定 和药敏试验采VITEK-2生物分析仪自动鉴定。使用拉丝试验确定高黏液表型特 征,使用纸片法试验确认ESBL表型。
  2. 电脑住院系统收集上述细菌感染病人的资料,分别按1:1的比例各收集 产ESBL酶hvKP、非产ESBL酶hvKP感染的患者的病历资料,比较患者性别、 年龄、血糖、基础疾病、感染前抗菌药物使用情况、侵入性操作及有无手术或 重大创伤情况等等,通过上述资料分析感染产ESBL酶hvKP的独立危险因素。
  3. 耐药机制:采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验 检测产ESBLs菌株中具有耐药基因blaTEM、blaSHV和blaCTX-M的菌株分布 情况。
  4. 通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型及MLST分型,参考文献设计引物, 采用聚合酶链式反应(PCR)及测序技术,采用BioNumerics软件 对PFGE图像和ML S T结果进行处理和分析。明确产ESBL高毒力肺炎 克雷伯菌分子流行病学。

结果:

  1. 从临床分离的1263株肺炎克雷伯菌中筛出高毒力肺炎克雷伯菌株124株, 其中K1荚膜血清型阳性85株,K2荚膜血清型阳性39株。在124株高毒力肺 炎克雷伯菌中,表型试验显示45株为ESBL阳性hvKP菌株,79株为ESBL阴性hvKP菌株。总体非产ESBL酶hvKP菌感染的患者较产ESBL酶hvKP 菌感染患者比例多。
  1. 患糖尿病、侵入性操作、使用碳青霉烯类及哇诺酮类抗菌药物、住院超 14天是产ESBL-HvKP感染的独立危险因素。
  2. 耐药基因检测显示,22株携带blaTEM基因,13株携带blaSHV基因,10 株携带有blaCTX-M基因。产ESBL酶hvKP菌对头抱他噪、头抱嗥月亏、头抱西 丁、哌拉西林/他呼巴坦、头抱毗月亏、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、左氧氟 沙星、环丙沙星、氨节西林/舒巴坦的耐药率显著高于非产ESBL酶hvKP菌株。
  3. MLST分型结果显示,产ESBL酶hvKP菌株共45株,其中K1荚膜血清 型阳性28株,K2荚膜血清型阳性17株。K1荚膜血清型阳性菌株均为ST23型, 而17株K2型产ESBL酶hvKP菌株中10株为ST65型,5株ST86型,2株ST14 型。而携带ESBL基因的产ESBL酶hvKP则主要为ST23型、ST65型。

结论:

1、 首先要重视糖尿病患者是否感染产ESBL酶hvKP菌;其次要关注引流、 深静脉置管等侵入性操作的规范性及引流时间和碳青霉烯类、哇诺酮类抗菌药 物的合理使用。减量缩短住院时间以减少感染机会。

2、 江西地区高毒力肺炎克雷伯菌中ESBL基因的主要型别为blaSHV-l> blaCTX-M-2和blaTEM-1,具有较严重的耐药性。

3、 ST分型上ST23型、ST65型占重要比例,PFGE带型表现出高度的同源 性,体现出医院感染的预防措施及减少传播的体系至关重要。

关键词:高毒力肺炎克雷伯菌;超广谱卩・内酰胺酶(ESBL);危险因素;耐药; 分子流行病学;

Abstract

Objective:

  1. To retrospectively study the possible risk factors of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae infection.
  2. To study the possible resistance mechanism of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae.
  3. Molecular epidemiology of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniaeo Method:
  4. Source of strains: KP isolated from patients in the First Affiliated Hospital of Nanchang University from June 2016 to December 2017 was collected. Only the first strains isolated from the same patient were retained. Strain identification and drug susceptibility test were automatically identified by VITEK-2 biological analyzer. High viscous phenotype was determined by drawing test and ESBL phenotype was confirmed by disc test.
  5. The data of patients with bacterial infection were collected by computer in-patient system. The medical records of ESBL-producing hvKP and non-ESBL-producing hvKP were collected according to the ratio of 1:1. The patientsfgender9age, blood sugar, basic diseases, use of antibiotics before infection, invasive operation and operation or major trauma were compared. The independent risk factors of ESBL-producing hvKP infection were analyzed according to the above data.
  6. Resistance mechanism: Polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the distribution of blaTEM, blaSHV and blaCTX-M in ESBLs-producing strains. Plasmid conjugation transfer test was used to understand the transmission mode of drug resistance genes.
  7. Primers were designed by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) typing and MLST typing. Polymerase chain reaction (PCR) and sequencing techniques were used to process and analyze PF GE images and MLST results using BioNumerics software. Molecular epidemiology of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae.

Results:

  1. 124 highly virulent Klebsiella pneumoniae strains were screened out from 1263 clinical isolates, of which 85 were positive for KI capsular serotype and 39 were positive for K2 capsular serotype. Among 124 strains of highly virulent Klebsiella pneumoniae, 45 were ESBL-positive hvKP strains and 79 were ESBL-negative hvKP strains. Overall, the proportion of patients infected by non- ESBL-producing hvKP bacteria was higher than that infected by ESBL-produc- ing hvKP bacteria.
  2. Diabetes mellitus, invasive manipulation, use of carbapenems and quinolones, and hospitalization for more than 14 days were independent risk factors for ESBLs-HvKP infection.
  3. Drug resistance gene detection showed that 22 strains carried blaTEM gene, 13 strains carried blaSHV gene and 10 strains carried blaCTX-M gene. The resistance rates of ESBL-producing strains to ceftazidime, cefotaxime, cefoxitin, piperacillin/tazobactam, cefepime, ertapenem, imipenem, meropenem, levofloxacin, ciprofloxacin and ampicillin/sulbactam were significantly higher than those of non- ESBL-producing strains.
  4. The results of MLST typing showed that there were 45 ESBL-producing hvKP strains, of which 28 were positive for KI capsular serotype and 17 were positive for K2 capsular serotype. The positive strains of KI capsular serotype were all ST23, while 10 of 17 K 2 ESBL-producing hvKP strains were ST65, 5 ST86 and 2 ST 14. The main ESBL-producing enzymes hvKP carrying ESBL gene were ST23 and ST65.

Conclusion:

  1. First of all, we should pay attention to whether diabetic patients are infected with ESBL-producing hvKP bacteria. Secondly, we should pay attention to the aseptic consciousness of invasive operations such as drainage, drainage time and rational use of carbapenems and quinolones. Reduce the length of hospital stay to reduce the chance of infection.
  2. The main types of ESBLs gene in Klebsiella pneumoniae with moderate and high virulence in Jiangxi are blaSHV-1, blaCTX-M-2 and blaTEM-1, which have serious drug resistance.
  3. ST23 and ST65 are the main types of ST. PFGE bands show a high degree of homology, suggesting that it is very important to strengthen the prevention measures of nosocomial infection and the control of transmission.

Keywords: Klebsiella pneumoniae with high virulence; Extended-spectrum beta- Lactamases (ESBL); Risk factors; Drug resistance; Molecular epidemiology;

中英文缩略词表

英文缩写 英文全称 中文全称
KP Klebsiella pneumoniae 肺炎克雷伯菌
HvKP Hypervirulent Klebsiella pneumoniae 高毒力肺炎克雷伯菌
ESBL Extended Spectrum Beta-Lactamases 超广谱卩■内酰胺酶
  ESBL+hvKP 产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌
  ESBL-hvKP 非产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌
  Clinical and Laboratory Standards Institute 临床实验室标准化委员会
DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核昔酸
EDTA ethylenediamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸
FBS Fetal blood serum 胎牛血清
  Luria-Bertani Medium LB培养基
MLST multi-locus sequence typing 多位点序列分型
PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液
PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
PFGE Pulse field gel electrophoresis 脉冲场凝胶电泳
r/min Revolutions per minute 每分转数
  Tris-acetic acid Tris乙酸

1章引言

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)是临床常见肠杆菌科细菌之一, 自然界的泥土、水和农林产品中广泛存在该菌,是一种潜在致病菌。人体的皮 肤、呼吸道和消化道广泛寄存着该细菌,当人体抵抗力下降时,免疫力低下, 常引起机体出现多种感染,如肺炎、肝脓肿、败血症等等。将肺炎克雷伯菌分 为普通肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumoniae, cKP)和高毒力肺炎克雷伯 菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKP)是根据细菌毒力和致病特点来分 类的。我国台湾地区于1986年首次报道了 hvKP,此后在东南亚地区有逐渐增 多的报道,南非、澳大利亚、欧洲和美国等也有报道⑴。在血琼脂平板上生长, h v KP菌株可表现出高黏液性,研究[2 3】发现,h v KP表现为高毒力主要 是携带有黏液表型调节基因和气杆菌素。依据细菌抗原性不同以及荚膜多糖结 构的异常,肺炎克雷伯菌可分为至少82个荚膜血清型⑷,其中,KI、K2、K5、 K20、K57和K54血清型与人类及动物的各种侵袭性感染密切相关,为高毒力荚 膜血清型肺炎克雷伯菌炉7】。h v KP侵袭的宿主大部分为年轻健康的患者,且 容易并发脓毒血症,导致坏死性筋膜炎、骨髓炎、化脓性肝脓肿、眼内炎等严 重的侵袭性疾病⑻。同时多脏器感染也因其可继发迁徙性播散而存在,临床致残 率及致死率高,预后差,近年来一直成为研究的热点[9_10]o感染hvKP有幸救活 者,难免患有严重的并发症,失明和神经系统后遗症等就是比较常见的并发症 [11]

超广谱卩■内酰胺酶(ESBL)是以灭活多种抗生素为特征的卩■内酰胺酶,其 中包含窄谱和广谱头抱菌素,单环类抗生素以及抗革兰阴性杆菌青霉素等抗生 素,是一种质粒介导的酶。产ESBL是细菌产生多重耐药的常见表型机制,具体 耐药根因可以从基因层面分析。有些耐药性是因细菌之间传播的细菌抗性基因 引起,例如携带多种药物抗性基因的质粒,对肠杆菌科细菌之间的传播具有抗 药性。有文献结果表明,在细菌质粒上携带有耐药基因,可在相同或不同菌株 中相互传播,增加了细菌感染几率,给临床治疗造成严重影响[12][31]O青霉素的 出现使得许多致死性的感染疾患成功治愈,为人类的健康做出了巨大贡献。随 着科研技术水平的不断发展,人类先后研制了许多弘内酰胺类抗生素,治疗效 果也显著提高。但物极必反,因新的抗生素的大量应用甚至滥用,一个更为凸 显的问题也随之出现,那就是细菌的耐药问题。这其中大量不合理的使用甚至 滥用第三代头抱菌素尤为明显,使细菌在强大的选择压力和诱导下产生了超广 谱卩■内酰胺酶〔⑶。德国在1983年首次发现ESBL,自此之后,产ESBL菌流行 及暴发感染在世界各地均有报道Ml。细菌的多重耐药性随着产ESBLs菌株的大 量出现也变的日益严重,患者的致残致死率不断增加,临床所面临的感染性疾 病治疗能力也不断要接受挑战。截止到2009年底"I,导致对卩■内酰胺类抗生素 耐药的卩■内酰胺酶的种类已超过890种,其中的超广谱卩■内酰胺酶可使其携带 菌株产生多重耐药,并可通过质粒广泛传播。最终可引起抗感染失败,甚至出 现感染流行及爆发,严重影响人类的健康。这其中肺炎克雷伯菌是最常见的产 ESBL菌株,常引起医院感染暴发流行,给医院管理及疾病诊治带来非常棘手的 困难。

现阶段,无论是人类还是动物界,抗生素的使用过于频繁,抗生素耐药性 问题越发严重。特别是头抱类抗生素的大量应用及滥用,产超广谱卩■内酰胺酶 (ESBL)也相继出现增多的情况,导致产ESBL的耐药菌谱出现交叉耐药问题。 卩■内酰胺类抗生素是治疗肺炎克雷伯菌感染的有效药物,考虑到该类抗生素抗菌 性能强,抗菌范围广谱,且副作用及毒性作用低,故临床使用多,使用时间长。 随着大剂量抗生素的使用以及细菌对抗该类药物的活性不断演变,肺炎克雷伯 菌对抗生素的耐药状况日趋严重,由耐药菌株引起的医院感染率明显增高,对 于临床工作压力日益加大,患者医源性费用不断增大而治疗效果不佳,对于医 患关系及医院管理的负面影响极大。也是近年来人们探讨肺炎克雷伯菌对卩■内 酰胺类抗生素耐药机制的研究热点[⑹。目前耐药基因水平研究不断提升,已知 的耐药基因在世界范围内大量传播,甚至多个耐药基因存在于一个质粒上,也 可携带多种不同的抗生素耐药基因。这些耐药基因在同种菌之间或基因不同菌 属之间的转移传播,最终可传播扩散大量的耐药基因从而引起更多的健康问题。 细菌耐药引发的医院感染爆发流行,感染性疾病治疗效果不佳,住院费用高, 治疗时间长,严重影响了人类健康,已经成为21世纪我们不得不面临的公共卫 生问题。

高毒力肺炎克雷伯菌通常体外表现出对多种抗生素的敏感,然而随着各种 广谱抗生素的广泛应用,产ESBL耐药高毒力肺炎克雷伯菌也逐渐受到关注。针 对产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌进行危险因素的调查,找出影响此类细菌感染的 主要危险因素,掌握了解高毒力肺炎克雷伯菌的耐药流行趋势及耐药基因的携 带分布情况,并从分子流行病学角度探究高毒力高耐药肺炎克雷伯菌的传播可 能性及相关机制,将有助于完善对其有效的监测及控制。从分子水平提高认识, 为医院的感染控制提供理论基础,不断加强认识,减轻并发症及缩短住院时间, 提高治疗效果,大大减少了国家资源浪费情况。为此,我们收集南昌大学第一 附属医院住院患者分离的肺炎克雷伯菌,采用PCR筛选出高毒力肺炎克雷伯菌, 通过表型试验及PCR测序确认hvKP菌携带耐药基因情况,并通过MLST探究 耐药hvKP菌的分子流行病学机制,有助于指导临床合理用药及更有效地控制耐 药hvKP菌感染,防止其播散和暴发流行。

目前国内外单纯针对产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌进行危险因素的系统调 查,耐药机制研究及相关分子流行病学的研究等项目的课题论文基本缺乏,基 于以上现状,本研究对南昌大学一附医院2016年6月至2017年12月分离的产 ESBL高毒力肺炎克雷伯菌进行回顾性危险因素分析,探讨耐药机制及分子流行 病学等,旨在为抗感染治疗合理选用抗生素,预防和控制产ESBLs耐药菌的出 现和播散,研制新型、高效的卩■内酰胺类抗生素以及流行病学研究提供实验依据 和指导。

2章产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染的危险因素分析

目前专门针对产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染的危险因素相关研究及文 献,国内、国外基本在该方面是缺失的。本章回顾性分析病历资料,病例对照 研究,全面深层次去探讨产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染的危险因素,以提高 在临床诊治过程中对产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌的预防和处置能力。

2.1材料和方法

2.1.1材料

  • 菌株的选择及认定:收集2016年6月—2017年12月南昌大学一附医 院就诊患者分离的KP,若同一位患者多次分离出相同的菌株,只留取首次分 离的菌株为标准。采用VITEK-2生物分析仪自动鉴定菌株和药敏试验。使用拉 丝试验确定高黏液表型特征,使用纸片法试验确认ESBL表型。
  • 病例组和对照组的选择:按1:1的比例各收集产ESBL酶hvKP、非产 ESBL酶hvKP感染的患者的病历资料,将上述45例产ESBL酶hvKP感染的患 者记为病例组A组。对照组B组为45例非产ESBL酶hvKP感染的患者。

2.1.2试验办法

2.1收集病例资料,查找相关因素:通过电子病例系统查询相应资料,内容 如下:姓名、年龄、住院超14天、感染期间白细胞、中性粒细胞数,是否患糖 尿病等基础疾病;有无侵入性操作如中央静脉置管等,是否有外伤手术;哇诺 酮类、碳青霉烯类等抗生素的使用情况。相关内容详见表2.1。

2.2统计学分析:采用spss22.0软件包对数据进行统计分析,分析比较组间 差异采用单因素方差,描述计数资料分布情况采用频数和构成比,采用卡方检 验比较分类资料组间差异。采用无序多分类logistic回归分析探索影响分型的独 立影响因素。采用双侧检验,P<0.05认为差异具有统计学意义。

2.2结果

2.2.1单因素分析显示

(1) 二组之间患者性别、年龄等基本资料无统计学差异(表2.1);

(2) 产ESBL酶hvKP (A组)与非产ESBL酶hvKP (B组)相比较,在患 有糖尿病(P=0.042)、住院超14天(P-0.036)、侵入性操作如引流(P=0.019)、 使用碳青霉烯类抗菌药物(P=0.033)、使用哇诺酮类抗菌药物(P-0.034)这些 因素有统计学差异(表2.1)o

2・2・2多因素分析显示

ESBL阳性hvKP感染的独立危险因素:患有糖尿病(P=0.045, OR=3.134)> 住院超 14 天(P=0.026, OR=2.830)> 侵入性操作如引流(P=0.033, OR=2.547)> 使用碳青霉烯类抗菌药物(P=0.017, OR = 3.603 )>使用哇诺酮类抗菌药物 (P=0.039, OR=3.610)(表 2.2);

表2.1A、B二组病例病历资料比对分析

项目 A组

(n=45)

B组

(n=45)

P

AVSB

性别 男 28 (62.22%) 男 25 (55.56%) 0.520
(%) 女 17 (37.78%) 女 20 (44.44%)
年龄(岁) 56.72±11.37 57.09±13.54 0.889
住院时间超14 (天) 23.18±10.52 17.32±15.23 0.036
感染前入住ICU (%) 16 (35.56) 13 (28.89) 0.499
转科或转院病人(%) 6 (13.33) 4 (8.89) 0.502
白细胞(X1O9/L) 9.98±6.38 10.82±4.45 0.471
中性粒细胞(X1O9/L) 7.25±5.32 8.36±4.61 0.293
糖化血清蛋白(mmol/1) 2.68±1.56 2.3U1.93 0.320
肿瘤疾病(%) 25 (55.56) 23 (51.11) 0.673
肺部疾病(%) 5 (11.11) 7 (15.56) 0.535
肝胆疾病(%) 9 (20.00) 6 (13.33) 0.396
烧伤(%) 1 (2.22) 2 (4.44) 0.557
神经系统疾病%) 7 (15.56) 8 (17.78) 0.777

续表2.1

肾脏疾病(%) 1 (2.22) 4 (8.89) 0.167
心脑血管疾病(%) 11 (24.44) 13 (28.89) 0.634
血液系统疾病(%) 2 (4.44) 1 (2.22) 0.557
糖尿病(%) 19 (42.22) 10 (22.22) 0.042
中央静脉插管(%) 20 (44.45) 10 (22.22) 0.025
气管内插管(%) 19 (42.22) 8 (17.78) 0.011
气管切开(%) 17 (37.78) 8 (17.78) 0.020
尿管(%) 23 (51.11) 13 (28.89) 0.031
胃管(%) 15 (33.33) 25 (55.56) 0.034
引流(%) 25 (55.56) 14 (31.11) 0.019
机械通气(%) 14 (31.11) 24 (53.33) 0.033
手术或重大创伤(%) 28 (62.22) 18 (40.00) 0.035
哇诺酮类(%) 25 (55.56) 15 (33.33) 0.034
碳青霉烯类(%) 31 (68.89) 21 (46.67) 0.033
糖肽类(%) 7 (15.56) 6 (13.33) 0.764
卩内酰胺类(%) 35 (77.78) 30 (66.67) 0.239
酶抑制剂类(%) 25 (55.56) 25 (55.56) 1.000
氨基糖昔类(%) 4 (8.89) 3 (6.67) 0.694

表2.2产ESBL酶hvKP感染的独立危险因素分析

危险因素 P OR OR 的 95%CI
下限 上限
糖尿病 0.045 3.134 1.018 9.811
侵入性操作如引流 0.033 2.547 1.048 7.484
使用碳青霉烯类 0.017 3.603 1.338 9.538
使用哇诺酮类 0.039 2.610 1.025 6.431
住院超14天 0.026 2.830 1.216 7.304

2.3讨论

系统研究产ESBL酶hvKP感染的危险因素,对于医院感染管理该类菌株, 提供合理有效的预防治疗措施及策略,有积极长远的影响。

在本章中我们选择分离产ESBL酶hvKP、非产ESBL酶hvKP的病例,按1: 1进行配对,查阅病例资料,经单因素分析,产ESBL酶hvKP、非产ESBL酶 hvKP在患糖尿病,住院超14天,血糖高,糖化血红蛋白高以及胆道疾病、侵 入性操作,使用碳青霉烯类药物,使用哇诺酮类药物等等这些因素有差异,对 其进一步进行多因素logistic回归分析提示以上因素中患糖尿病,住院超14天, 侵入性操作含引流,使用碳青霉烯类药物,使用哇诺酮类药物是感染产ESBL 酶hvKP的独立危险因素。

本研究提示糖尿病为感染产ESBL酶hvKP的独立危险因素(P=0.045, OR = 3.134),有研究[17-18]提示高血糖可抑制中性粒细胞的黏附、趋化、吞噬和杀 菌等功能,患者免疫力下降,抵抗力差,感染的机会和风险也相应增加,有明 确的相关性。通过药物或胰岛素的有效治疗,患者血糖水平接近6-10mmol/L, 感染的发生率明显下降,死亡率也得到明显改善。早期发现感染、及时治疗感 染对于降低糖尿病患者院内感染有重要意义,完善相关标本的微生物检查,如 果检测出肺炎克雷伯菌,应高度怀疑是否为产ESBL酶hvKP,为经验性选择抗 生素提供依据。治疗方案的选择首先是控制血糖,并通过药敏试验的结果选择 合适的抗生素以减少耐药性的产生。最终为临床有效控制感染提供基础理论支 持。

通过分析总结表明侵入性操作如引流是产ESBL酶hvKP的独立危险因素 (P=0.033, OR=2.547),人体的天然保护屏障■黏膜的完整性常因引流、穿刺等 侵入性操作而破坏,感染的侵入门户因此而形成,细菌不仅可引起局部感染, 甚至局部的菌落繁殖可通过血流引起全身各脏器的感染。而所有侵入性操作中, 气管插管、气管切开及呼吸机辅助通气对于感染产ESBL酶hvKP尤为明显。同 时住院时间长容易增加感染的出现概率。由此可见,对于重症住院患者,侵入 性操作前需要更多方面的评估,确实不可避免需要执行相关操作,则要严格按 照无菌操作规程,常规消毒,定期跟换,定时维护,及时评估病情尽早拔除管 道,如此感染的发生得以尽量避免。同时若病情允许,安排患者尽量早出院, 减少感染机会,以减少长时间住院所增加的感染机会和风险。

肺炎克雷伯菌突出特点是在体内有很大的变异能力,由此可对抗很多的抗 菌药物,在多种抗生素联合作用下,肺炎克雷伯菌长期处于大量抗菌药物包围 的环境之下,通过不断的自身变异以适应周围的环境,最终能够存活的细菌对 抗抗菌药物的能力将大增,耐药性不断增加。而且,大量抗生素的联合使用, 更容易导致机体内环境的改变,引起菌群失调,内环境稳态失衡更增加感染的 发生率。本次研究通过归纳总结分析可知,使用碳青霉烯类抗菌药物和哇诺酮 类抗菌药物也是感染产ESBL酶hvKP的独立危险因素。因此,建议在临床抗感 染治疗过程中,减量在抗生素使用前完善微生物检查,在培养结果回报前经验 性使用抗生素时需按剂量、按当地细菌谱合理选用,勿超剂量或滥用抗生素。 如果确实需要多种抗生素联合用药,择减量减少联合使用时间,以减少多重耐 药菌的感染机会。

总结以上研究结果,产ESBL酶hvKP感染的独立危险因素为住院超14天、 侵入性操作如引流、糖尿病、使用碳青霉烯类药物、使用哇诺酮类药物。本研 究结果提示以上危险因素是产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染独立危险因素,但 由此同时,我们也应考虑到机体一旦感染产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌后,相应 的容易导致以上危险因素在机体治疗过程中难以避免,因而形成恶性循环,最 终引起机体病情恶化,治愈率低,死亡率明显增加。因此,在临床诊疗过程中, 对于任何具备上述一种或多种感染危险因素的病患,如果出现了相关感染,应 警惕是否为产ESBL酶hvKP感染,及时完善细菌培养,做好相关处置措施,加 强手卫生及相关操作的规范性,合理选择抗生素使用剂量及时间。

3章产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌耐药机制

随着抗生素的长期大剂量不规范使用,大量耐药细菌随之不断增加,其中 高毒力肺炎克雷伯菌的耐药性也呈逐年上升趋势,而产ESBL是高毒力肺炎克雷 伯菌耐药的主要表型机制,目前尚无关于其基因学特征的系统性研究。本部分 筛选出产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌的主要耐药基因,采用聚合酶链式反应 (PCR)方法,以明确其耐药机制,为临床预防和用药提供实验基础。确定高黏 液表型特征使用拉丝试验,所有菌株均采用Vitek-2 Compact全自动微生物分析 系统进行鉴定和药敏分析,通过以上实验进一步了解产ESBL高毒力肺炎克雷伯 菌的微生物学特征。

3.1材料

3.1.1菌株来源

第二章所描述的菌株来源同样适合本章节研究。质控菌株为肺炎克雷伯菌 ATCC700603和大肠埃希菌ATCC25922,均购买于卫生部临床检验中心。

3・1・2主要试剂

小牛血清

50xTAE缓冲液

PCR反应试剂

PCR引物

DL2000 marker

琼脂糖

5%绵羊血平板

3.1.3主要仪器

高压锅

PCR仪

电泳仪

凝胶成像仪

微量移液器

高速低温离心机 血培养鉴定仪

Vitek Densichek 比浊仪

3.1.4主要溶液的配制

3.1.4.1菌株保存液

甘油与去离子水按照1:1的体积混合,121°C高压灭菌20mim待其冷却后, 按照蒸憾水:甘油:新生牛血清=1:1:2的体积加入新生牛血清,充分混匀,用 1.5ml灭菌EP管分装后置于4°C保存。

  • 50xTAE 缓冲液

将Trisl21g和18.6g Na2EDTA.2H2O加入至1L烧杯中,再加入双蒸憾水约 300ml,充分搅拌混匀,加入28.55ml冰醋酸后,用双蒸/留水定容至500ml,再 次搅拌,室温保存。

  • lxTAE 缓冲液

取一定体积的50xTAE缓冲液将其稀释50倍即可。

  • 1%琼脂糖凝胶

称量lg琼脂糖粉末将其溶在lOOmllxTAE缓冲液中,微波炉加热至其完全 溶解,室温冷却后加入0.5U1EB后将其倾倒于制胶模具中。

3.1.4.5电泳缓冲液

本实验所用电泳液为lxTAE缓冲液。

3.2方法

3.2.1黏液丝试验

将细菌接种在5%绵羊血平板上,37°C培养16h后,用细菌接种环轻柔向上 挑起平板上的肺炎克雷伯菌菌落,重复牵拉两次或两次以上,如果挑起的黏液 丝长度大于或等于5 mm,判为黏液丝试验阳性,反之则结果判读为黏液丝试验 阴性。

322对产ESBL肺炎克雷伯菌进行表型确证试验

推荐的纸片进行ESBLs确证试验,选取对三代头抱菌素(头抱曲松、头抱 嗥月亏)耐药作为ESBL初筛标准,并记录ESBL阳性菌株分离率。将受试菌配成 0. 5麦氏浊度菌液,用无菌棉棒挑取涂于MH琼脂上,贴上头抱他噪,头抱他 噪/克拉维酸,头抱嗟月亏,头抱嗥月引克拉维酸纸片在有待测菌的琼脂培养基上, 置于35 °C, 16〜18 h后观察结果,二组中任何一组药物,加克拉维酸与不 加克拉维酸的抑菌圈相比,增加5 mm以上者,即判断为ESBL菌株

3.2.3 PCR扩增及测序

引物:参考文献设计相关引物[19][32],引物由上海生工公司合成,各基因引 物序列见表3.1。

模板提取及PCR扩增条件:使用煮沸法提取临床各种标本中分离出的肺炎 克雷伯菌菌株DNA, PCR的反应体系为25piL:正反引物各0.5yL, DNA模 板3piL, mix反应液12.5yL,加蒸憾水使反应总体系为25",用无菌去离子 水作为阴性对照。反应条件:预变性95°C 5min; 95°C 45s, 56°C 90s, 72°C 90s, 30个循环;延伸72°C lOmino

1.2%的琼脂糖制备:量取100 mL 0.5x TAE缓冲液,称取1.2g琼脂糖, 将琼脂糖加入上述TAE缓冲液中,微波炉加热溶解,冷却至60°C时10(11 golden View。倒入配套胶槽中冷却凝固。

电泳:5此上述PCR扩增产物加样进行电泳,电泳参数:恒定电压100V, 电流200 mA ,电泳时间20min。待电泳结束,将凝胶块放在Gel Doc XR+ 凝胶成像仪中拍照、存图。

测序及比对:将在预期位置出现阳性条带的菌株PCR产物送上上海生工股 份有限公司进行产物纯化及测序,测序结果在BLAST官网进行比对。

3.2.4ESBL的高毒力肺炎克雷伯菌普通PCR鉴定

将上述步骤得到的PCR模板(高毒力肺炎克雷伯菌DNA)进行扩增,12.5uL 扩增体系:TaqMix: 6.25ul,上游引物:0.25ul,下游引物:0.25ul,模板:1.5ul, ddH20: 4.25ul; PCR的反应条件:95°C预变性5min,后94°C变性40s, 52°C退火 复性30s, 72°C延伸lmin进行30个循环,最后72°C延伸lOmin。

移液枪吸取6.5U1PCR扩增产物后加入1 %琼脂糖凝胶上样孔中,120 V,电 泳25 min,电泳液为lxTAE缓冲液,电泳结束后在凝胶成像仪上观察结果,记 录结果。

表3.1产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌PCR扩增相关基因引物

基因 序列(5F)
bla TEM F:TCGGGGAAATGTGCG

R:TGCTTAATCAGTGAGGCACC

  SHV F:TCGGCCTTCACTCAAGGAATG

R:TCCCGCAGATAAATCACCA

  OXA-10 F:GTCTTTCGAG1ACGGCATTA

R:ATTTTCT1AGCGGCAACTTAC

  VEB F:CGACTTCCATTTCCCGATGC

R:GGACTCTGCAACAAA1ACGC

  PER F:TGACGATCTGGAACCTTT

R:AACTGCATAACCTACTCC

  CTX-M-1 组 F:CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTTG

R:GGCCCATGGTTAAAAAATCACTGC

  CTX-M-2 组 F:CTCAGAGCATTCGCCGCTCA

R:CCGCCGCAGCCAGAA1ATCC

  CTX-M-8 组 F:ACTTCAGCCACACGGATTCA

R:AAGTGGAGCGACAGAGC

  CTX-M-9 组 F:GAGAGTGCAACGGATGATGT

R:GATGATTCTCGCCGCTGAAG

K分型 K1 F:GGTGCTCTTTACATCATTGC

R:GCAATGGCCATTTGCGTTAG

  K2 F:GCATCCTCGGTTTTCTGG

R:GGTGTGGCGGGCTTCGTG

3.2.5药敏试验

药敏试验采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定及药敏系统检测,采用纸 片扩散法测定试验菌株对抗菌药物的敏感性,抗菌药物纸片分别为:头抱嗟月亏 (CTX)、头抱毗月亏(FEP)、头抱西丁(FOX)、亚胺培南(IPM)、头抱他噪(CAZ)、 氨曲南(ATM)、美罗培南(MEM)和厄他培南(ERT)及ESBLs表型鉴定纸 片头抱嗥月亏/克拉维酸(CTX/CA)、头抱他噪/克拉维酸(CAZ/CA)。参照CLSI 标准进行实验操作和结果判断。

3.3结果

3.3.1黏液丝试验

从临床分离的1263株肺炎克雷伯菌中筛出高毒力肺炎克雷伯菌株124株, 其中K1荚膜血清型阳性85株,K2荚膜血清型阳性39株。

3.3.2对产ESBL肺炎克雷伯菌进行表型确证试验

在124株高毒力肺炎克雷伯菌中,表型试验显示45株为ESBL阳性hvKP 菌株,79株为ESBL阴性hvKP菌株。总体非产ESBL酶hvKP菌感染的患者较 产ESBL酶hvKP菌感染患者比例多。

3.3.3 ESBLs基因检测结果

部分菌株bla-TEM基因检测结果

部分菌株blaSHV-1基因检测结果

部分菌株blaCTX-M-1基因检测结果

经过表型试验确定出的产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌株45株均携带ESBL 基因,其中blaTEM基因阳性22株,占48.9%; blaSHV基因阳性13株,占28.9 %,其中7株为blaSHV-1型,6株为blaSHV-12型,其中一株同时携带blaSHV-1 型和blaSHV-12型ESBL基因。bla CTX - M基因阳性10株,占22.2%。

此外,我们还发现部分ESBL相关基因可共存于同一菌株中,如表3.3所示, 我们发现blaCTX-M-1和blaTEM共存于一株K1型菌株中,另外还发现

blaSHV-12+blaCTX-M-2 、 blaCTX-M-8+blaSHV-1+blaTEM 、 blaCTX-M-2+blaSHV-l+blaTEM> blaCTX-M-9+blaSHV-12+blaTEM> blaCTX-M-2+blaSHV-1 +blaSHV-12共存的菌株各一株,且均为K2荚膜血清分 型,这或表明K2型hvKP菌在获得性耐药上更具优势。

表3.3 ESBL阳性hvKP菌株ESBL相关基因的基因型分布

TEM-1 15 7 48.89%
CTX-M-2 5 2 15.56%
SHV-1 4 3 15.56%
SHV-12 3 1 &89%
CTX-M-1+TEM 1 0 2.23%
SHV-12+CTX-M-2 0 1 2.23%
CTX-M-8+SHV-1+TEM 0 1 2.23%
CTX-M-9+SHV-12+TEM 0 1 2.23%
CTX-M-2+SHV-1+SHV-12 0 1 2.23%
合计 28 17 100.00%

hvKP 菌株数(N=45)基因型

百分率(%)

K1 型(N=28)

K2 型(N=17)

3.3.4药敏试验

产ESBL hvKP菌株和非产ESBL hvKP菌株对抗菌药物的耐药率的比较

抗菌药物 组别,耐药株数(%) P值
ESBL+hvKP (N=45) ESBL-hvKP (N=45)
氨节西林 100% 100% /
头抱西丁 38.13% 11.33% <0.05
头抱曲松 100.00% 13.33% <0.05
头抱他咗 64.22% 6.22% <0.05
头抱毗月亏 93.30% 12.48% <0.05
头鞄嗟月亏 100.00% 11.96% <0.05

续表

氨节西林/舒巴坦 96.65% 34.25% <0.05
哌拉西林/他哩巴坦 34.78% 5.48% <0.05
亚胺培南 17.39% 2.74% <0.05
美罗培南 17.39% 2.74% <0.05
厄他培南 21.74% 4.11% <0.05
氨曲南 65.22% &22% <0.05
庆大霉素 17.39% 12.33% >0.05
歩布霉素 13.04% 10.96% >0.05
阿米卡星 13.04% 9.59% >0.05
环丙沙星 65.22% 21.92% <0.05
左氧氟沙星 52.17% 9.59% <0.05

所有菌株对氨节西林天然耐药,药敏结果显示,产ESBL酶hvKP菌对头抱 他噪、头抱嗥月亏、头抱西丁、哌拉西林/他卩坐巴坦、头抱毗月亏、厄他培南、亚胺 培南、美罗培南、左氧氟沙星、环丙沙星、氨节西林/舒巴坦的耐药率显著高于 不产ESBL酶hvKP菌株(PV0.05),然而在阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的耐 药率上差异无显著意义(P>0.05)。

3.4讨论

肺炎克雷伯菌是临床最常见的肠杆菌属细菌,其可引起血流感染、尿路感 染、腹腔感染、肺部感染等多种感染,是造成院内感染最常见的病原体㈤]。自 20世纪80年代,从我国台湾地区首次分离到可引起肝脓肿等社区获得性感染的 肺炎克雷伯菌,其往往表现出多发性脓肿、迁徙性感染,被定义为高毒力肺炎 克雷伯菌。高毒力肺炎克雷伯菌的出现给临床感染带来了新的挑战,其改变了 对经典肺炎克雷伯菌感染的诊治及流行。然而高毒力肺炎克雷伯菌在体外常表 现出对除了氨节西林外的其他抗生素高度敏感,故仍对其有相应的治疗对策0】。 但随着耐药的广泛流行,尤其是在各种抗生素滥用的情况下,抗生素耐药已经 成为影响临床感染治疗效果的重要因素。而此时,高毒力肺炎克雷伯菌也无法 幸免©I,尤其是在质粒介导的耐药上,高毒力和多重耐药在肺炎克雷伯菌中的 聚集,或将直接导致高毒力高耐药的新型“超级细菌叩勺形成㈡]。

超广谱卩内酰胺酶是肠杆菌科细菌最常见的卩内酰胺酶,其常常是导致肠 杆菌科细菌卩内酰胺类抗生素耐药的重要原因。超广谱卩内酰胺酶根据同源性 可分为TEM型、SHV型和CTX-M型等,其中前两型最多见,世界范围流行, 其对头抱他噪的水解活性较强,而CTX-M型酶对头抱嗟月亏具有高度水解活性, 对头抱他噪的水解作用很小,其在南美、东欧和东亚地区比较流行〔刑。我国以 CTX-M型为主,而在本试验中,我们却发现hvKP菌株中主要为TEM和SHV 型ESBL,这与以往的经典肺炎克雷伯菌报道不一致,或许与高毒力肺炎克雷伯 菌独特的耐药发展特点有关。此外我们还发现hvKP菌株中同常常存在多种卩内 酰胺酶共存的情况,且多集中在K2型高毒力肺炎克雷伯菌中,这或许与K2型 菌株的毒力相对较低有关[鉤,这也表明K2型高毒力肺炎克雷伯菌或将成为高毒 力肺炎克雷伯菌发展多重耐药的重要突破口,也我们监测高毒力高耐药肺炎克 雷伯菌形成和发展提供了重要依据。

综上所述,产ESBL酶的hvKP菌株的出现或给我们敲响了对高毒力肺炎克 雷伯菌滥用抗生素治疗警钟,其中部分ESBL基因可通过质粒介导传播、且集中 在流行的克隆株上,也给我们的院感控制敲响了警钟。加强对产ESBL酶hvKP 菌株监测及相关研究,为未来控制高毒力高耐药肺炎克雷伯菌这一“超级细菌" 的传播提供理论依据。

4章产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌分子流行病学

目前,广泛应用于细菌的溯源分析的是分子分型技术,这其中包含多位点 序列分析及脉冲场凝胶电泳等技术。PFGE分型技术重复性好、分辨力高,被认 为是细菌分型的“金标准J MLST技术由于操作简单、可重复性好、已经实现全 球数据比对和综合分析等优势,也成为临床微生物科研常用的一种分型技术。

4.1多位点序列分析(MLST)

对所筛选出来的产ESBL菌株均进行多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)O ST 分型参照网(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/ Kpneumoniae.html)的方案,对 gapA> infBmdhpgiphoErpoB> tonB 进行 PCR扩增、测序,根据序列结果在网站上查询序列型(sequence type, ST)O

4.1.1引物设计与合成

从 PUBMLST 网站(http://pubmlst.org/koxytoca/infd/K_oxytoca_primers.pdf) 上查询肺炎克雷伯菌多位点序列分型7对管家基因,引物参照相关文献〔旳,引 物由上海生工公司合成引物相关信息见表4.1

DNA提取、PCR反应体系及扩增条件、琼脂糖凝胶的配制及电泳条件产物 纯化及测序同第一部分。

表4.1MLST7对管家基因引物序列
引物名称 引物序列 片段大小(bp)
rpoB F : Vic3 5,-GGCGAAATGGCWGAGAACCA-3,

R : Vic2 5!- GAGTCTTCGAAGTTGTAACC-3!

501
gapA F : 173 5,-TGAAATATGACTCCACTCACGG-3,

R: 181 5,-CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT-3,

450
mdh F : 130 5!- CCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3!

R : 867 5,-CCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-3,

477
Pgi F : 1R 5,-GAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC-3,

R : IF 5,-CGCGCCACGCTTlAlAGCGGTTAAT-3,

432
phoE F : 604.1 5,-ACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG-3,

R : 604.2 5LTGATCAGAACTGG1AGGTGAT-3'

420
infB F 5,-CTCGCTGCTGGACTATATTCG-3,

R 5!- CGCTTTCAGCTCAAGAACTTC-3

318
tonB F 5,-CTTTATACCTCGGTACATCAGGTT-3,

R 5,-ATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG-3,

414

4.1.2结果分析

7对管 家基因的测序 结果在PUBMLST网站(http://bigsdb.pasteur. fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db= pubmlst klebsiella seqde^ public&page= batchSeq- uenc-eQuery)上比对得出七对管家基因的亚型,再将其输入到PUBMLST网站 (http://bigsdb.pasteur.fr/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef_public &page=batchProfiles)中得到每株菌株的序列分型号(ST)。

4.2脉冲场凝胶电泳(PFGE) [27]

  • 样品的制备:用低熔点琼脂糖包埋细菌,做成琼脂糖胶块;
  • DNA的释放:用细胞裂解液和蛋白酶K消化,使得DNA被释放 到细胞外。
  • DNA的消化:大片段的DNA用限制性内切酶消化;
  • 上样和电泳:制备好的样品按照设计好的程序电泳;
  • 染色和结果分析:电泳的结果通过染色后被读取,通过相关软件进 行数据的分析。

4.3结果 4.3.1 MLST分型结果

产ESBL酶hvKP菌株共45株,其中K1荚膜血清型阳性28株,K2荚膜血 清型阳性17株。K1荚膜血清型阳性菌株均为ST23型,而17株K2型产ESBL 酶hvKP菌株中10株为ST65型,5株ST86型,2株ST14型。而携带ESBL基 因的产ESBL酶hvKP则主要为ST23型、ST65型。

4.3.2 PFGE结果M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

图1部分PFGE电泳结果图

45株产ESBL酶hvKP菌株经PFGE得到电泳图谱,部分结果见图1。经 NTSYS (2.1)软件分析得出聚类图。将具有85%以上相同条带(相关系数>0.85) 的菌株归入同一带型,45株产ESBL酶hvKP菌株被分为6个型别:A型[71.1% (32/45) ]、C 型[20.0% (9/45) ], B 型、D 型、E 型、F 型各 1 株。A 型、C 型为主要型别。其中A型进一步分为三个亚型,A1型[31.1% (14/45) ]、A2 型[35.6% (16/45) ] A3 型[4.5% (2/39)]。

4.4讨论

与之前的研究一致[2&2刃,本研究中K1-KP的MLST分型主要以ST23型为主, K2-KP主要以ST65型为主,在分子流行病学上,我们也发现虽然hvKP菌株的 流行相对集中,以MLST分型结果看,K1型hvKP菌株主要集中在ST23型, 但也存在少部分ST700型。相反,K2型hvKP菌株则略显多态性网,主要包括 ST65型、ST86型及ST14型。而在耐药基因携带上,我们发现所有ESBL基因 阳性菌株主要集中在ST23型、ST65型及ST14型。本研究结果显示本院分离出 的产ESBL酶hvKP菌株的PFGE带型表现出高度的相似性,提示本院各科室间 产ESBL酶hvKP菌株或存在克隆性传播,由此可见,医院感染措施的加强和严 格控制感染传播意义重大,医务工作中必须加强手卫生,严格遵守无菌操作流 程、强化消毒隔离制度等等,最终将医院感染的发生率降到最低。

5章结论与展望

5.1结论

1、 首先要重视糖尿病患者是否感染产ESBL酶hvKP菌;其次要关注气管 插管、引流等侵入性操作的规范性及引流时间和碳青霉烯类、哇诺酮类抗菌药 物的合理使用。减量缩短住院时间以减少感染机会。

2、 江西地区高毒力肺炎克雷伯菌中ESBL基因的主要型别为blaSHV-l> blaCTX-M-2和blaTEM-1,具有较严重的耐药性。

3、 ST分型上以ST23型、ST65型为主,PFGE带型表现出高度的同源性, 提示我们加强医院感染预防措施和传播的控制至关重要。

5.2展望

1、 产ESBL高毒力肺炎克雷伯菌感染分布未做进一步统计,其具体部位的 感染危险因素的差异有待进一步研究。

2、 本研究虽然统计分析出了伴有糖尿病等基础疾病的患者更易感染产 ESBL高毒力肺炎克雷伯菌,然而机制尚不完全清楚,可待进一步研究。

3、 本研究发现产ESBL酶hvKP菌株主要的血清型为K1和K2型,对于其 它血清型(如K57等)的细菌微生物学特征、感染危险因素及分子流行病学有 待进一步研究。

首先要感谢我的导师张伟教授,她在临床及科研工作中对我严格要求、耐 心指导,其次要感谢刘洋老师在本研究的选题、实验、论文写作及修改过程中 给予的无私帮助。

感谢南大一附院邓琼老师在统计分析方面给予的大力支持,感谢同实验组 的杜芳玲同学在标本采集等环节给予的支持和帮助,感谢本院儿科主治医师刘 媛在统计资料时给予的指导和帮助,同时也感谢以上各位同学在学习和生活中 给予我的热心帮助。感谢南昌大学第一附属医院微生物室全体老师对我的帮助 和关心。

最后,感谢我的父母和家人一路上给予我物质与精神上的支持,让我专注、 顺利地完成学业。

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综述

ESBLs高毒力肺炎克雷伯菌研究进展

谢斌云综述张伟教授审校

关键词:肺炎克雷伯菌;高毒力;耐药性;产ESBLs细菌;危险因素

肺炎克雷伯菌根据毒力及致病特点分为经典肺炎克雷伯菌(cKP)和高毒力 肺炎克雷伯菌(hvKP) o 1986年在中国台湾地区首次报道高毒力肺炎克雷伯菌, 后越来越多在东南亚地区报道,南非、澳大利亚、欧洲和美国等也有报道⑴。研 究⑵⑶发现,hvKP携带黏液表型调节基因和气杆菌素,因此表现为高毒力。该 菌常侵袭年轻健康的宿主且易并发脓毒血症,严重的侵袭性疾病,如化脓性肝 脓肿,脑膜炎,重症肺炎、眼内炎,坏死性筋膜炎等⑷。相对于易引起医院感染 的“普通诩市炎克雷伯菌,HVKP感染严重且易继发性迁移,可导致多器官感染⑸ 临床死亡率高。感染hvKP有幸救活者,难免患有严重的并发症,比如较常见的 是失明和神经系统后遗症等⑹。虽然大多数高致病性肺炎克雷伯菌株对抗生素 敏感,但有些菌株同时具有高毒性和抗药性,越来越多研究报道碳青霉烯抗性 和高毒力的肺炎克雷伯菌菌株出现。多药耐药和高毒力在同一种菌株的结合有 可能导致下一次临床危机。

超广谱卩■内酰胺酶(ESBLs)是以灭活窄谱和广谱头抱菌素、单环类抗生素 及抗革兰阴性杆菌青霉素等抗生素为特征的卩■内酰胺酶,是一种质粒介导的酶。 产ESBLs是细菌产生多重耐药的常见表型机制,可以从基因层面分析其具体耐 药根因。由细菌之间传播的细菌抗性基因引起的耐药性,例如携带多种药物抗 性基因的质粒,对肠杆菌科细菌之间的传播具有抗药性。有研究发现此菌耐药 基因在质粒上,可造成不同、相同细菌间传播,导致感染几率增加,给临床治 疗造成严重影响[7][36]O

本文针对产ESBLs高毒力肺炎克雷伯菌菌株流行现状,感染风险因素,抗 生素耐药机制和分子流行病学、毒力机制等方面进行综述,以便为高毒力肺炎 克雷伯菌临床预防和治疗提供理论指导。

1、流行现状

在20世纪80年代,台湾的病例报告描述了由hvKP引起的社区获得性肝 脓肿在具有严重伴随终末器官表现的健康患者中,如脑膜炎和眼内炎⑻。自台 湾首次报告以来,在许多亚洲、欧洲和美洲国家观察到hvKP的零星传播。虽 然在欧洲和美洲报告了几例hvKP,但hvKP的流行主要发生在亚洲国家,包括 台湾、中国、韩国和伊朗。例如,在中国,22.8% (84/369)与各种侵袭性感染 相关的肺炎克雷伯菌临床分离株被鉴定为hvKP⑼。同样有另一份报告显示, 导致化脓性肝脓肿的病原体中有90.9%是高毒力肺炎克雷伯菌[⑼。在韩国,肺炎 克雷伯菌菌株血流感染中分离的菌株中具有42.2%的高粘液表型特征⑴]。在台 湾,88.8%社区获得性肝外脓肿中,分离的肺炎克雷伯菌菌株具有高粘液表型[⑵。 41.5%社区获得性肺炎感染肺炎克雷伯菌株是由高毒力肺炎克雷伯菌3引起的。 这些国家和地区HVKP相关疾病的频率持续增加。在1996至2004年间,在台 湾观察到由hvKP引起的肝脓肿的年发病率几乎增加了 60%[14]o在韩国,由高毒 力肺炎克雷伯氏菌引起的肝脓肿率在20世纪70年代增加了 3.3%,并在2000年 代中期上升到78.2% [15]o在伊朗进行的一项研究显示,从各种患者收集的肺炎 克雷伯菌分离物中有60.95 %为高粘液粘蛋白阳性[⑹。虽然高毒力肺炎克雷伯菌 在亚洲占主导地位的原因尚不清楚,有研究表明亚洲人可能比其他种族群体更 容易感染hvKP,特定的hvKP克隆的扩散可能是亚洲高优势的主要因素。在世 界其他地区,高毒力肺炎克雷伯菌的患病率并不高。从其他地区的研究大多是 病例报告,但有几个研究分析各种HVKP菌株。例如,西班牙的一项研究显示, 从各种感染部位收集的5.4%的肺炎克雷伯菌菌株具有高粘液性表型口。在加拿 大,从社区获得性菌血症患者收集的&2%的肺炎克雷伯菌株中存在高粘液表型 [18]o在巴西,在6.7%的临床K.pneumoniae分离株[19]中观察到高粘液表型。 在阿尔及利亚进行的一项研究显示,从各种患者获得的肺炎克雷伯菌分离物中 9.2%为高粘液阳性㈤]。这些结果支持了 HVKP的流行性传播主要是在亚洲国家 的理论。

2、 感染危险因素

年龄大于60岁老年患者感染率明显增高,考虑为老年患者基础疾病多,免 疫力低,抵抗力差,病情严重等相关。产生ESBLs的肺炎克雷伯菌在重症监护 室的检出率远远高于其他临床及医技科室,这可能与重症监护室患者病情重, 抗生素使用率及送检率菌明显高于其他部门,高检测率和高比例的抗菌药物有 助于ESBLs的快速生产。两周以上住院的高感染率被认为与在住院期间通过医 务人员的操作和医务人员的手向患者施用ESBLs肺炎克雷伯氏菌引起的感染有 关。产ESBLs肺炎克雷伯菌感染的独立危险因素就区域和环境不同而各有差异, 其中“侵入性手术''是被广泛认同的独立危险因素,可能与以下因素相关:1各 种侵入性操作通常会破坏患者的正常生理屏障,使得多重耐药的革兰氏阴性细 菌更容易受到侵袭。同时,细菌在身体不同部位之间的传播可引起内源性感染。 2侵入性程序增加了细菌获得ESBLs基因的机会。“住院屮14天“在很多研究 中也被认为是产ESBLs肺炎克雷伯菌感染的独立危险因素,亚洲及欧美等国家 和地区也有相关报道。然而,与匹兹堡在美国的报告不同,它表明独立危险因 素存在区域差异,并且存在许多影响产ESBLs的肺炎克雷伯菌血行、肝脓肿及 呼吸道感染的风险因素。特别是针对独立危险因素的“侵入性手术"和“住院超 14天叩勺患者,医院管理者及医务人员均应采取合理有效的预防措施,最大程度 的将产ESBLs的肺炎克雷伯菌感染率降至最低。

3、 耐药性分析

与耐药性cKP菌株的高流行率相比,hvKP菌株中抗生素耐药性的流行率很 低0]。hvKP菌株低抗生素耐药性,目前的原因仍没完全明确。然而,世界各 地越来越多地报告了耐药性hvKP菌株的报告,其中大多数在hvKP流行的国家。

亚洲抗生素耐药HVKP

除了对氨节青霉素具有内在抗性之外,大多数hvKP菌株很少对抗生素具有 抗性,并且通常对常用的抗微生物剂敏感。然而,随着携带各种抗生素抗性基 因的移动遗传元件的全球传播,包括肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC), NDM 和苯呼西林酶・48 ( OXA-48)型碳青霉烯酶0],耐抗生素的hvKP分离物已经 开始出现。类似地,2016年的一份报告显示,来自几种侵袭性感染的hvKP分 离物中有12.6%产生ESBL,其中大多数携带blaCTX_M基因[22]O中国的一些 研究表明,hvKP的出现已经获得了广泛的抗生素耐药性,包括碳青霉烯耐药性。 2015年,33名肺炎克雷伯菌患者对碳青霉烯类耐药,在4例中,发现了对碳青 霉烯类抗生素具有抗性的hvKP菌株㈡】。从这4名患者中鉴定出7种对碳青霉 烯类耐药的hvKP菌株,并且在7种hvKP菌株中的6种中检测到blaKPC_2基 因。在中国,很多研究报道对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌中hvKP的流行率 非常高,从7.4%到15 %不等01。基因组分析表明,ST11碳青霉烯类耐药hvKP 菌株的出现是由于ST11碳青霉烯类耐药cKP菌株获得了 pLVPK样质粒[羽。因 此,需要进一步的研究来验证移动遗传元件在CKP和HVKP菌株之间的传递。 无论如何,研究结果提醒研究人员和临床医师注意具有获得性碳青霉烯耐药性 的hvKP菌株的出现和全球传播的潜力。

欧洲和美国抗生素耐药HVKP

在欧洲和美国报道了少数耐药的HVKP病例。在法国,在阿尔及利亚出生 的一名患者中鉴定出产ESBL( blaCTX_ M_3)的hvKP菌株,该患者交替在法 国和阿尔及利亚居住数年而没有前往任何其他国家[旳。该菌株为ST6克隆,具 有K2血清型。2014年在巴西,检测到耐多粘菌素B和产生KPC-2的hvKP [27]; 该菌株为ST11克隆。意大利的一项研究显示,从一名52岁患有肝脓肿的白种 人患者身上检测到了产生KPC-3的hvKP分离物 曲。该菌株的序列类型为ST512 (ST258的单基因座变异体)。意大利最常见的碳青霉烯酶为KPC型酶(占碳 青霉烯酶生产者的89.5%) o其次是VIM-1 (9.2)和OXA-48 (1.3) [21]o这 些结果暗示了在CKP和HVKP菌株之间直接遗传移动遗传元件的可能性。

碳青霉烯耐药HVKP的治疗方案缺乏,虽然除氨节西林外,大多数hvKP 菌株对抗菌药物敏感,而且相当数量的hvKP感染患者年轻,没有其他疾病, 但hvKP感染的死亡率很高,在3%至42%之间。社区获得性菌血症和坏死性筋 膜炎的病例死亡率分别为55%和47%[29]o此外,hvKP感染的幸存者经常遭受 灾难性的发病率,例如视力丧失或神经后遗症。通过耐碳青霉烯类HVKP菌株 的出现,HVKP感染的管理变得更加困难。34例对碳青霉烯类抗生素耐药的 hvKPs患者[28]中,10例死亡,11例患者的所有治疗由于缺乏有效的抗生素而 停止。耐火的碳青霉烯抗性HVKPS使该菌株成为下一代全球“超级细菌”。

耐药基因种类各异,其中TEM型、OXA型、CTX-M型及SHV型是 ESBLs主要的四种耐药基因。不同基因型表现的抗生素耐药种类有区别:TEM 型主要表现为对头抱菌素类抗生素耐药;对青霉素类高度耐药的基因型为OXA 型,对头抱嗥月亏表现为耐药性的是CTX-M型,而SHV型主要表现为对头抱他 噪呈现耐药性[辺。由ESBLs菌株引起的感染的优选药物是碳青霉烯抗生素。然 而,目前大量碳青霉烯类抗生素的过度应用,对碳青霉烯类抗生素呈现耐药的 KP菌的检出率逐年增多。势必会对临床治疗带来困难,所以必须引起高度重视, 严格执行防控措施。

4、 分子流行病学

K1和K2型是hvKP最主要的荚膜型别,ST23、ST65和ST86是hvKP主 要的ST型另I」。尽管hvKP对抗生素的耐药率低于cKP,但aLLS基因可用于 鉴定K1型hvKP。然而,耐药性可以通过KPC-2基因传播,并且应该保护获得 性抗性的可能性。

5、 毒力机制

K1和K2毒株毒力增强的原因是多方面的。首先,K1和K2菌株缺乏宿主 因子识别的甘露糖残基重复序列,其次K1和K2菌株的表面具有宿主特异性单 糖唾液酸,已知其模仿宿主细胞,从而允许逃避宿主免疫细胞。再者,与其他K 血清型相比,K1和K2菌株具有更多样化的O血清型,这可能有助于K1和K2 菌株逃避宿主免疫系统。因此,大量研究表明K1/K2血清型的存在与hvKP株 的高毒力有一定关系,与其他高毒力相关因子的结合可增强肺炎克雷伯菌的毒 力。st23 hvKP克隆与K1型与细菌性肝脓肿有关,而与K2型st65蓝色hvKP克 隆与各种侵袭性感染相关[辺。此外,基因组比较发现的致病岛不同的变体 (kphpl208)与cc23具体相关〔3习。RmpA (粘液表型A基因的调节剂)激活胶 囊生产,导致高粘液粘稠表型并增加毒性⑴回]。在HKP菌株中报告了三个rmpA 基因:位于毒力质粒(pLVPK)中的两个大质粒携带基因(p-rmpA和p・nnpA2)和一 个染色体基因(c-rmpA)o在肺炎克雷伯菌CG43中,p-rmpA和p-rmpA2都有助 于提高荚膜产量卩习,而在NTUH-K2044(ST23, K1血清型)中,第一个基因组测 序的hvKP仅是p-rmpA,而不是p-rmpA2或ormpA,有助于增加荚膜表达。因 此,需要进一步研究其他菌株以阐明每个RMPA在高毒力中的作用。许多结果 揭示了 RmpA与高毒力之间的密切关系,来自不同地理来源的30个hvKP分离 物的全基因组测序显示,所有hvKP均为rmpA阳性〔辺。然而,最近的研究显示, 一些rmpA阳性的肺炎克雷伯菌缺乏高粘液粘附性和低毒力是由于在缺乏 c-rmpA的情况下rmpA和rmpA2基因同时突变造成的列。MagA基因是2004 年从侵袭性肝脓肿分离的肺炎克雷伯菌菌株中发现的超囊型表型所需的基因 [35]o最近的研究表明,在具有K1血清型的hvKP菌株中发现magA比非K1菌 株中更普遍⑴]。这些结果表明MAGA基因是肺炎克雷伯菌荚膜血清型K1的致 病因子。

6结语

尽管过去30年对hvKP进行了大量的临床、生理和病原学研究,但对hvKP 的认识仍存在很大差距。HVKP的确切定义是一个有争议的问题。虽然粘液吸 取试验通常被认为是用于确定hvKP的方法,但是许多用于粘液吸取试验阳性的 肺炎克雷伯菌分离物没有显示出剧毒性。一些毒力因子,如K1/K2血清型、 RmpA和气杆菌素,似乎与hvKP的超毒力密切相关。因此,HVKP的确切表 型和基因型定义需要牢固确立。区域的差异导致细菌环境的改变,产生ESBLs 的肺炎克雷伯菌感染的独立危险因素也因而有所改变。需对不同区域独立危险 因素进一步明确才能有相应防范措施。hvKP耐药机制仍不完全明确,近期hvKP 临床分离株的流行病学分析表明,在不久的将来,具有广泛耐药性的hvKP菌株 有可能在全球传播。为有效控制hvKP,需要开发有效的hvKP诊断工具,进一 步研究其耐药机制,新型抗菌剂的研制也是必不可少的。

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