MiR-424在子宫内膜癌中的作用和机制研究论文

2021年1月12日14:55:40MiR-424在子宫内膜癌中的作用和机制研究论文已关闭评论

MiR-424在子宫内膜癌中的作用和机制研究论文

中文摘要

目的:miRNA是一种在转录水平上与mRNA互补配对结合抑制靶基因或蛋白 表达的小RNA,参与多重疾病包括肿瘤的发生发展,本研究旨在探索究miR・424 在子宫内膜癌中发挥的作用和机制,为EC的治疗和miR424・target network提供 新的研究思路。

方法:将miR・424mimics和miR・424・ASO (反义寡核昔酸链)转染入EC的两种 细胞系(HEC亠A和Ishikawa)中构建miR・424过表达和敲降模型,转染体系 为50nM,转染载体为Lipofectamine3000□实验分为4组:Control组,miR・424 mimics组,miR・424・ASO组和ASO-NC组。1. transwell侵袭实验检测过表达 和敲降miR・424后EC细胞侵袭能力的变化,划痕愈合实验检测EC细胞过表达 和敲降miR・424后细胞划痕愈合率的影响,观察转移能力的变化情况。2. Western blot实验检测细胞总蛋白E-cadherin和Vimentin的表达量,免疫荧光实验实现 E-cadherin蛋白相对强度定量和定位。3.为验证E2F6的3TJTR与miR・424之间 存在互补配对结合,用双荧光素酶基因报告检测实验验证E2F6是miR・424的靶 点:将 mut E2F6 3TJTR 和 E2F6 3TJTR 质粒与 miR・424 mimics 或 ASO-miR-424 或ASO-NC转入EC细胞系中,分组为:Control组,miR-424 + E2F6 3fUTR组/ mutE2F6 3'UTR 组,ASO-424 + E2F6 3'UTR 组/mut E2F6 3TJTR 组,ASO-NC + E2F6 3TJTR组/ mut E2F6 3TJTR 组,使 用荧光 检测试 剂盒和Promega Dual-Luciferase system检测各组荧光素酶反应强度。4. RT-qPCR实验和Western Blot实验,RT-qPCR检测EC细胞中高表达与敲降miR・424后E2F6 mRNA表达 量的变化,Western Blot实验检测检测EC细胞中高表达与敲降miR・424后E2F6 蛋白表达量的变化。5.为进一步探索E2F6与miR・424之间的相互作用,在过表 达miR・424的EC细胞中转染质粒pcDNA3.1-E2F6和空载体质粒pcDNA3.1实现 E2F6的过表达。6.为了探索E2F6是否减弱miR・424在EC中发挥的效应,使 用Transwell侵袭实验和划痕愈合实验检测EC细胞侵袭和转移能力的变化。

结果:在体外实验中:Transwell侵袭实验实验显示:与对照组相比,过表达 miR-424明显抑制EC细胞的迁移和侵袭(P<0.05),在EC细胞系中敲降miR・424 的表达后,EC细胞的迁移和侵袭能力加强(PV0.05)。划痕愈合实验显示:实验 组miR-424 mimics的划痕愈合率明显低于对照组(P<0.05), ASO-miR-424组的 划痕愈合率明显高于对照组(户<0.05)。WB实验结果显示:miR・424 mimics组 E-cadherin蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05), vimentin蛋白表达量明显低于 对照组(PV0.05),而ASO-miR-424组与之相反(卩<0.05)。免疫荧光实验的结 果显示:E-cadherin蛋白定位于EC细胞膜周围。双荧光素酶基因报告结果表明: miR-424 mimics + E2F6 3,UTR组的荧光素酶强度明显低于对照组(P<0.05), ASO-424 + E2F6 3TJTR荧光素酶强度明显高于对照组(户<0.05)。miR-424 + mut E2F6 3TJTR组与对照组的荧光素酶强度无明显差异oASO-424 + mut E2F6 3TJTR 与对照组相比,荧光素酶强度无明显差异。表明:E2F6是miR・424的靶点。 RT-qPCR实验表明实验组miR・424 mimics中E2F6的mRNA表达量明显低于对 照组(PV0.05), ASO-424组E2F6的mRNA表达量明显高于对照组(户<0.05)。 WB实验结果表明:miR・424 mimics中E2F6蛋白的表达量明显低于对照组

(P<0.05), ASO-424组E2F6的蛋白表达量明显高于对照组(户<0.05)。为反向 验证E2F6对miR・424的影响,在转染miR・424 mimics的EC细胞中转入质粒 pcDNA3.1-E2F6和空载体质粒pcDNA3.1,结果表明:实验组miR-424 mimics + pcDNA3.1-E2F6中EC细胞的侵袭能力与划痕愈合能力明显高于对照组(P<0.05), miR-424 mimics + pcDNA3.1组的细胞侵袭能力与划痕愈合能力明显低于对照组(P<0.05)o

结论:本研究表明miR・424作为一种抑癌miRNA通过靶向调节E2F6抑制EC 的迁移、侵袭和EMT过程。在子宫内膜癌中miR・424的靶基因E2F6削弱miR・424 的抑癌效应。

关键词:子宫内膜癌;miR・424;E2F6;上皮间充质转化

The mechanism and effect of miR-424 in endometria cancer

Abstract

Objective: miRNA, a small noncoding RNA that regulates target gene or protein expression by combining with mRNA on transcription level, involved in progresses of so many diseases including tumors. Study will explore the role of miR-424 in endometrial cancer, so that the study shall lay the groundwork for target treatment and miR-424-target network in EC.

Methods: The model of uregulated expression miR-424 and knockdown miR-424 was established through instantaneously transfected miR-424mimics and miR-424-ASO into two EC cell lines HEC-l-A and Ishikawa, and the transfected system is 50nM and transfected vector is Lipofectamine3000. The experiment was divided into 4 groups: Control group, miR-424 mimics group, miR-424-ASO group and ASO-NC group. 1. Transwell invasive assay detected the changes of ability of invasion when EC cells were ransfected by miR-424 mimics and miR-424-ASO and ASO-NC after 48 hours. And Wound healing assay detected the ability of migration in 24h and 48 hours then evaluted the rate of wound healing of EC cells were upregulated and downregulated by mimics and ASO-miRNA. 2. Western Blot assay detected the total cell protein expression of E-cadherin and Vimentin that was marker of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) . And Immunofluorescence assay detected cell protein expression and verified the location of E-cdherin through staining. 3. Dual luciferase reporter assay verified the fact that 3r UTR of E2F6 could be complementary paired by miR-424. The previously designed mut E2F6 3'UTR or E2F6 3'UTR plasmid and miR-424 mimics or ASO-miR-424 or ASO-NC and helper transfection reagent were transfected into EC cells. The experiment groups were: Control, miR-424 + wild E2F6 3'UTR group/mut E2F6 3'UTR group, ASO-424 + wild E2F6 3'UTR group/mut E2F6 3'UTR group, ASO-NC + wild E2F6 3'UTR group/mut E2F6 3'UTR group. The fluorescence detection kit and Promega Dual-Luciferase system measured the fluorescence of each group. 4. Then the RT-qPCR assay detected the expression of mRNA of E2F6 and Western Blot assay detected the expression of E2F6 protein, that verified the mutual interaction between miR-424 and E2F6. 5. To reversely verify the E2F6 made influences for miR-424, EC cells transfected by miR-424 mimics were transfected by E2F6 overexpressed plasmid or without E2F6 upregulated plasmid. The experiment were individed into two groups: miR-424 mimics + pcDNA3.1-E2F6 group, miR-424 mimics + pcDNA3.1 group. 6. Then invasion ability of EC cells were detected by Transwell invasive assay, and migration ability was detected through Wound healing assay.

Results: Transwell assay showed that invasion cell counts of miR-424 mimics significant decreased vs control group (P<0.05), and invasion cell counts of ASO-424 group significant increased vs ASO-NC group (P<0.05). And Wound healing assay showed that wound healing ratio of miR-424 mimics significantly decrease w Control group (P<0.05), and wound healing ratio of ASO-424 was markedly higher than ASO-NC group (P<0.05). So knockdown of miR-424 in cell lines of EC facilitated migration and invasion ability of EC cell and invasion and migration ability was disrupted by overexpressed miR-424. Western Blot assay showed that the expressed level of protein E-cadherin in miR-424 mimics that was marker of EMT was dramatically increased compared with Control group (P<0.05). The expression of Vimentin protein was evidently decreased in miR-424 mimics compared with Control group (P<0.05). And the E-cadherin protein expression in ASO-424 group was lower than ASO-NC group (P<0.05). Expressed level of Vimentin protein in ASO-424 group was higher than ASO-NC group (P<0.05). Immunofluorescence assay discovered that EMT-related E-cadherin protein located at around of EC cell membrance. To verify the E2F6 was target of miR-424, Dual luciferase reporter assay was designed. The assay displayed that luciferase intensity of miR-424 + wild E2F6 3'UTR group was incaresed us* Control group (P<0.05), and compared with ASO-NC + E2F6 3'UTR group, the luciferase intensity of ASO-424 + wild E2F6 3'UTR was higher then ASO-NA E2F6 3'UTR group (P<0.05). And the luciferase intensity had no significance of miR-424 + mut E2F6 3'UTR and ASO-NC + mut E2F6 3'UTR respectively w Control and ASO-NC. Then the RT-qPCR study showed that expression of mRNA of E2F6 was decreased in miR-424 mimics group compared with Control group (P<0.05), and expression of mRNA of E2F6 in ASO-424 group was increased compared with ASO-NC group (P<0.05). The luciferase reporter assay indcated miR-424 could directly combined with 3'UTR of E2F6 in EC cells. Western Blot study showed that expression of E2F6 protein was decreased in miR-424 mimics group compared with Control group (P<0.05), and expression of E2F6 protein in ASO-424 group was increased compared with ASO-NC group (P<0.05). To reversely verify the E2F6 made influences to miR-424, designing the assay that EC cells were transfected by miR-424 mimics with E2F6 upregulated plasmid or without E2F6 upregulated plasmid. The transwell assay and wound healing experiment showed that the invaded cell numbers and wound healing ration were markedly increased in miR-424 mimics + pcDNA3.1-E2F6 group vs miR-424 mimics + pcDNA3.1 group(P<0.05).

Conclusion: This work demonstrates a new meschanism that miR-424 actes as a tumor suppressor to inhibite migration, invasion and EMT progression by regulating target E2F6 in EC. And E2F6 weaken the anti-carcinoma influence of miR-424 in EC cells.

Key words Endometrial cancer; miR-424; E2F6; EMT

流行病学资料显示,子宫内膜癌(endometrial cancer, EC)是北美、欧洲等 发达国家最常见的女性生殖道肿瘤,占女性生殖道恶性肿瘤的20%・30%[1】。根据 肿瘤权威杂志(CA: A cancer journal for clinicians)对EC的评估,在2019年将有 61,880新发案例和12,160例死亡案例Qi。在近几年,EC的发生率和相关死亡率 正在增加DO并且在未来几年,EC的发病率会持续升高丹]。这可能与筛查的 普及、他莫昔芬等的应用、初潮期提前、绝经期延迟、老龄人口的增加、激素替 代疗法的使用以及肥胖率的增加等有关。根据分子类型和临床病例研究,在临床 工作中,通常将EC分为两种类型,即ECI与ECII型⑻。ECI型为雌激素依赖、 表达雌激素受体的子宫内膜样类型,包括子宫内膜样子宫内膜腺癌(endometrioid endometrial adenocarcinomas, EEC)和在早期诊断的具有长期生存率的典型内膜 癌,约占80% o通常存在雌孕激素受体的表达,在分子水平上常能发现PTEN, PIK3CA, ARIDIA , FGFR2, CTNNB1, KRAS, AK卩和 mTOR 等基因的突变叨,其中, 最常见的突变基因为磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog) PTEN,在约50%的案列中都能检测到此基因的突变Ml。EC II包括子宫浆液性细 胞癌 (uterine serous carcinoma, USC)、透明细胞癌 (uterine clear cell carcinoma, UCCC )、癌肉瘤/恶性苗勒氏管恶性瘤(uterine carcinosarcoma/malignant mixed Mullerian tumour, UCS/MMMT)和其他混合类型等低分化的肿瘤类型,约占子 宫内膜癌的10%-20%o II型EC可检测到TP53和PIK3CA等基因的突变,II型 EC具有高侵袭性、早期易发生转移、易复发和高死亡率等特点,如EC中的癌 肉瘤,5年生存率仅为15%・30%[11」21。

在FIGO早期阶段能被诊断的EC,可以通过外科手术治疗手段达到治愈,5 年生存率达74%・91%61习,晚期EC患者的5年生存率为16%・45%,约15-20% 的病例会发生转移,复发率约7.7%・63.3%Wi6]。虽然对于早期的和低级别的EC 患者来说,预后较可,但对于晚期、发生转移和复发患者来说,钳类、紫杉醇和 环磷酰胺等化疗药物及其他治疗手段的作用有限,而EC死亡的原因主要是复发 和转移。EC传统的治疗是基于肿瘤的分期和组织学研究,然而,处于同病理阶 段的肿瘤可能存在不同的基因或分子谱,随着测序技术及生物信息学技术等的发 展,故提岀针对肿瘤等疾病的更加精准的靶向治疗。而且,目前用于癌症的诊断 方法,特别是女性生殖道恶性肿瘤的诊断方法仍然基于常规的病理指标(如临床 分期、肿瘤分化程度、侵袭深度和血管侵犯程度)及经阴道超声、肿瘤生物标志 物等的筛查及患者的典型症状。然而,一方面,诸多肿瘤在早期无典型的临床表 现,患者在临床中确诊后已达晚期,失去手术机会;另一方面,现目前临床上针 对子宫内膜癌的治疗,手术是主要的治疗手段,研究资料尚未出现针对内膜癌的 靶基因相关的靶基因治疗策略,因此,为肿瘤的早期诊断找到可靠的生物标志物 和精准的靶向治疗仍面临重大的挑战。而研究资料显示,miRNA在多种肿瘤等 疾病的发生、发展的进程中发挥重要的作用。

目前,诸多研究发现miRNA干扰多种细胞过程参与肿瘤等疾病的发生发展, 也越来越被认为是治疗某些疾病和癌症的特异性靶点和潜在治疗手段,miRNA 也由于其具有可能成为肿瘤预后的预测生物标志物的潜能,越来越受到研究学者 们的关注。这些约22个核昔酸的非编码小分子影响多种细胞过程,包括细胞增 殖、侵袭、血管生成、转移、凋亡等,说明miRNA的失调与诸多疾病密切相关 如:心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病、代谢性疾病、免疫性疾病、肿瘤等[⑺。 据记载,人类转录组包含10,000-32,000条长链非编码RNA(lncRNA),约11,000 个假基因,约9000个小RNA,仅约21,000个蛋白质编码mRNA,表明大多数 人类转录组是非编码RNA [同o ENCODE (Encyclopedia ofDNA Elements)的数据 表明人类约75%的基因组被转录而其中仅有约1%是蛋白编码的mRNA,表明其 他的RNA包括长度约1,000到大于90,000个碱基的长链非编码RNA(lncRNAs) 和小 RNA (包括:small nuclear RNAs(sn RNA), small nucleolar RNAs (sno RNAs), micro RNAs(mi RNAs)及transfer RNAs(t RNAs))都可能在肿瘤等疾病中发挥重 要的调节功能。

miRNA自1993年第一次被发现以来,为活体内基因表达的转录后调控开辟 了一个全新的领域。miRNA与mRNA的3,非编码区(3TJTR)的互补位点配对 结合后引起相应基因的沉默表达,发挥负性调控作用"I。miRNA具有同时靶向 相同或相关通路中的多个基因的独特能力,从而减少功能相关基因的表达。 miRNAs参与超过三分之一的人类基因组的调控,miRNA・mRNA之间的相互作 用是复杂的:mRNA可能包含>40个不同miRNA的结合位点,故每个miRNA 可调节多达200到300种不同的mRNA,每个mRNA也可以被几种不同的miRNA 靶向,而miRNA之间通常协同作用RO],从而解释了它们控制约60%的人类基因 组和参与人类主要的生物学通路。其中很大一部分miRNA嵌套在蛋白质编码基 因的内含子或外显子中,因此,miRNA的生物合成过程或功能失调往往与诸多 疾病包括恶性肿瘤有关。以往的研究表明,miRNA通过调节其靶基因参与代谢 稳态、细胞分化、增殖、存活、凋亡、侵袭、转移和血管生成等过程,从而充当 致癌因子或肿瘤抑制因子[21,22]。现有的研究资料证明miRNA参与各种各样的生 物过程,自从2002年Calin等的研究第一次发现在大多数慢性淋巴细胞白血病 患者中miR・15和miR・16表达下调㈤,表明miRNA与肿瘤之间的关系以来,研 究者们逐渐发现miRNA与人类的诸多肿瘤的发生及进展密切相关,如肝细胞癌、 胃癌、肺癌、前列腺癌、结直肠肿瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌等。

miRNA在肿瘤等疾病的发展中,与靶基因或靶蛋白mRNA的3TJTR互补 配对结合,在转录后水平上调节靶基因/蛋白的表达。如miR・200家族主要是通 过调节EMT-TFs ZEB1,ZEB2,SNAI1和SNAI2的双阴性反馈环,抑制BMI-1的 上调,最终影响E・钙粘蛋白表达水平,参与子宫及其他组织中肿瘤侵袭和肿瘤 转移过程中发生的上皮■间充质转化(epithelial・to・mesenchymal transition, EMT) [24,25]。miR_424被发现在多种肿瘤或疾病中发挥调节作用,如在胃癌中,高表达 的miR・424通过靶向调节大肿瘤抑制激酶1 (Large tumor suppressor kinase 1, LATS1)促进肿瘤细胞的侵袭和增殖[26】。miR-424作为一种致瘤miRNA与喉鳞 状细胞肿瘤(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)的不良预后有关,调节 靶基因细胞粘附分子1 (cell adhesion molecule 1, CADM1)促进肿瘤进展囚】。 MiR-424作为一种抑癌miRNA,通过抑制泛素调节因子(ubiquitination regulatory factor) SMURF 1的表达增加胃癌细胞对Cisplatin (DDP)的敏感性岡。MiR-424通 过与ARK5靶向结合后抑制mTOR的磷酸化,抑制EMT导致肝内胆管肿瘤(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)细胞的转移和侵袭能力降低旳。在本团 队的研究中,发现miR・424在EC组织中的表达是降低的,使用miRNA靶基因 预测软件TargetScan> RNA22和microma.org检测出转录因子E2F家族成员中 存在miR・424的靶点E2F2-E2F7。在本研究中,团队意在探讨在EC中miR・424 的靶基因,探索miR-424通过与其靶基因互补配对结合对EC转移、侵袭、凋亡 等的影响,研究miR・424在EC的发展中发挥的作用极其机制,为后续的精准靶 向治疗提供研究基础和新的思路。

X材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1细胞及转染材料

本实验中所用的EC细胞系为人类子宫内膜腺癌细胞系HEC-1-A和Ishikawa, 于95%湿度和5% CO2的37°C恒温细胞培养箱中培养,培养基为RPMI-1640和

DMEM培养基+10%FBS (胎牛血清)。 转染材料:反义寡核昔酸链和miRNA
mimics 及对照组(negative control, NC), pcDNA3.1-E2F6 质粒及空载体质粒;
lipofectamine 3000 及 opti-MEM 培养基。
1.1.2主要实验试剂及实验材料
1主要实验试剂及材料
主要试剂及材料 来源
HEC-1-A ATCC
Ishikawa ATCC
转染物合成 锐博生物
胰蛋白酶冻干粉 Gibcao
DAPI染色剂 Thermo Fisher Scientific
四甲基乙二胺(TEMED) amresco
羊抗兔/鼠二抗 武汉三鹰
RPMI-1640培养基 Gibco公司
DMEM培养基 Gibco公司
FBS Gibco公司
NaCl 齐都药业有限公司
Opti-MEM Invitrogen 公司
Lipofectamine™3 000 Invitrogen 公司
ECL显色液 碧云天生物技术有限公司
P-Actin鼠源单克隆抗体 Abeam
E-cadherin兔源单克隆抗体 Abeam
Vimentin兔源单克隆抗体 Abeam
E2F6兔源多克隆抗体 Abeam
免疫荧光用E-cadherin鼠源单克隆抗体 Abeam
Transwell 小室 Millipore
细胞培养皿、冻存管、培养板 NEST
基质胶matrigel BD公司
PVDF 膜 PerkinElmer
细胞冻存管 Neset
医用X胶片 Kodak
丙烯酰胺 amresco
亚甲基双丙烯酰胺 amresco
Tris amresco
脱脂奶粉 雀巢
谷氨酸 北京索莱宝生物有限公司
Triton-X Sigma
甘氨酸 北京索莱宝生物有限公司
KC1 齐都药业有限公司
NaOH 齐都药业有限公司
Tween20 天津索罗门生物
2主要的实验设备
主要仪器 来源
高压灭菌锅 hirayama
冰箱 Haier
稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂
无菌操作台 苏州苏洁净化设备有限公司
倒置显微镜 Olympus
荧光显微镜 Olympus
离心机 Eppendorf
细胞培养箱 Gibco
蛋白凝胶成像仪 BIO-RAD

1.2主要试剂配制

  • Western blot 试剂配制

2L 的 10 x SDS 电泳 buffer:甘氨酸 376 g + Tris 60.4 g + SDS 20 g,加去离 子水不足2 L,将pH调至9.5-8.6,最后定容到2L。电泳时将上述浓度的buffer 液稀释10倍。

50 ml 的 5 x loading buffer: SDS 5 g + 甘油 25 ml+lM Tris-Cl (pH 6.8 ) 12.5 ml混合后震荡匀,放入60°C温箱中孵育半小时,定容到50 ml后加入0.1 酚 蓝。

200 ml的IM Tris-HCl: Tris碱24.228g加入150 ml的去离子水充分搅拌混 匀,加HC1将pH调至7.4后定容到200 mb

20%APS: APS 5g溶于50 ml的去离子水中充分溶解并定容,1ml分装,并 于・20°C保存备用。

2L20 x TBS buffer: NaCl 350 g+Tris 242 g加入不足2 L的去离子水中充分 搅拌溶解,将pH调至7.5,定容到2 L,配制TBST时将20 x TBS稀释到1 x TBS。

500 ml 30%丙烯酰胺:丙烯酰胺150 g加入去离子水充分搅拌并定容至500 ml,过滤,4°C保存备用。

200 ml 1%亚甲基双丙烯酰胺:亚甲基双丙烯酰胺2 g加入去离子水中充分 搅拌溶解混匀并定容至200 ml,过滤,4°C保存备用。

500 ml 5 x buflerA: Tris 90.725 g加入400 ml的去离子水中充分搅拌溶解, 将pH调至10.5,后定容至500 mb使用时稀释为1 x buffer A。

500 ml 5 x buffer B: 6■氨基乙酸 13.12 g + 7.57 g Tris 充分溶解于 400 ml 去 离子水中,将pH调至9.4,后定容至500 mb使用时稀释至lxbufferB。

1 L 1 x TBST 缓冲液:900 ml 去离子水 + 100 ml TBS (1 x)+ 1 mlTween20o

封闭液:40mlTBS (1 x) +5%脱脂奶粉

1.2.2免疫荧光试剂配制

封闭液:5 ml PBS (10 x) + 5(11 羊血清 + 2|il Triton-100 (10%) + 38(11 高压水

PBS-Tx: 1 ml PBS (10x) + 100(11 Triton-100 (10%) + 8.9 ml 高压水

固定液:5 ml 37%甲醛+ 1 ml PBS (10x) + 0.2 g蔗糖+ 8.9 ml高压水

1.3实验方法

1.3.1细胞培养、传代及转染

Ishikawa细胞的培养基为RPMI-1640培养基,HEC-1-A用 含有高糖的 DMEM培养基,并添加10% FBS+双抗放置于10 cm培养皿中培养,于5%CO2 + 95%湿度的37°C恒温培养箱中生长,根据细胞的生长情况,倒置显微镜下观察 到:待贴壁细胞生长到约融合度约80%〜90%时按1:3的比例进行传代,并标记 上传代日期、比例、细胞种类等。冻存的细胞为细胞生长良好且处于对数生长期 的细胞,在倒置显微镜下使用细胞计数器计数后,取冻存细胞的浓度约为lx 106〜io?个/mi冻存于细胞冻存管中,放置于・80°C或液氮中冻存留种备用。

根据Invitrogen公司的Lipofectamine™3000说明书进行转染操作:取处 于细胞对数期且生长良好的细胞,转染前一天将培养皿中的细胞铺板,以12孔 板转染为例,选取12孔板,每孔细胞数量为6 x 104个/孔,加入培养基,观察到 细胞融合度为60%左右。miRNA转染系统为:

miR-424 mimics 组:A 管:Lip3000 1.5(11 + Opti-MEM 50 pd 混匀,B 管: miR-424 mimics 2.5(il + Opti-MEM 50 pd 混匀;在室温下静置 15 分钟后将 A、B 管混匀,加入12孔板的细胞中的一孔,每组设置三个平行组,放置于细胞培养 箱中,整个过程在避光条件下进行,操作尽可能做到准确快速。同理ASO-miR-424 组与ASO-NC组转染加样体系同于miR・424 mimics组。48h后收取细胞。

  • Transwell侵袭实验及划痕愈合实验检测miR・424对EC细胞的转移、侵袭 能力的影响

Transwell侵袭实验:实验分组为:miR・424过表达组miR・424 mimics组、 miR-424敲降组ASO-miR-424组、阴性对照组ASO-NC组及空白对照组NC组, 每组设置3个复孔。基质胶准备:将・80°C冰箱中的放入4°C的冰箱过夜,使其融 化。稀释基质胶在冰上操作:将基质胶与无血清培养基按1:8比例稀释基质胶, 于transwell小室中加入基质胶50山,放入37°C细胞孵育箱中孵育4h,在凝胶的 过程中准备细胞悬液,在加细胞之前用无血清培养基洗胶1次。48小时后收取 转染后的细胞,用细胞计数器计数细胞,将用PBS清洗后的细胞选取细胞量为 5x104个/ml加入200(11无FBS的培养基制成细胞悬液,加入铺基质胶的Transwell 小室中,小室放置于预先加入600(11含10%FBS培养基的24孔板中,放置于恒 温细胞培养箱中,24小时候取出细胞板。用真空泵吸出多于培养基,用PBS轻 微漂洗细胞,棉签轻柔擦拭去除小室内的细胞。于24孔板中加入无菌的600山 多聚甲醛,将小室放入24孔板中固定细胞30分钟后,真空泵吸走甲醛,然后于 24孔板中加入600(11的0.1%结晶紫染色小室细胞30分钟,PBS漂洗后室温干燥 细胞,于显微镜200倍下观察穿膜的细胞,随机选取5个视野并计数,算均值, 测算细胞的侵袭能力。

划痕愈合实验:实验分组同上,收取转染48小时后的细胞,计数后,收取 细胞浓度为3 x 105个/ml的细胞加入6孔细胞培养板中,待细胞长到融合度为 80%时,用200山的Eppendorf移液枪枪头制造划痕,用PBS漂洗除去漂浮细胞, 于200倍显微镜下分别在Oh, 24 h, 48 h拍照,观察划痕愈合程度,计算划痕 愈合率,代表细胞迁移能力。

  • Western blot实验检测蛋白

实验分组同上,收取转染48小时后的EC细胞,用预冷的PBS清洗细胞, 1000 rpm,每次5 min,重复3次,弃去上清,加入RAPI buffer裂解液,于冰上 操作,期间于涡旋振荡器上震荡混匀4・5次,30 min后,4°C低温离心机离心12000 rpm离心,25 min,上清即为蛋白,弃沉淀,将上清转移至1.5 ml的EP管中, 放置于・80 °C冰箱保存总蛋白。

BCA法测蛋白浓度:取出蛋白标准版,稀释10倍,使用PBS稀释10倍为 0.5 mg/ml;将BCA原液A液与B液配制比例为50:1配制成BCA工作液,现配 现用,将各试剂加入96孔板,测算蛋白浓度,如下表:

表3 BCA测蛋白浓度加样体系

Table3 system of BCA

序号 1 2 3 4 5 6 7 8
蛋白标准品(pl) 0 1 2 4 8 12 16 20
PBS (|il) 20 19 18 16 12 8 4 0
浓度(mg/ml) 0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

各蛋白浓度设置3个平行复孔,计算平均值,每孔加入200山配制的BCA 工作液,于37°C温浴箱中温浴30 min,于酶标仪中在562 nm波长测定吸光度(OD) 值,在EXCEL表中算出标准曲线,并拟合出标准线性方程关系。

图1蛋白标准曲线图

Fig.l protein standerd curve. R=0.9984

将蛋白从・80°C冰箱中拿出,于冰上融化,稀释10倍,测出OD值,带入方 程,计算得出浓度,结果浓缩10倍即为细胞提取出的蛋白浓度。配制SDS-PAGE 分离蛋白,加样系统如下:

表4 SDS-PAGE配制
试剂(piL) 4%浓缩胶 10%分离胶
30%丙烯酰胺 270 2000
1%亚甲基双丙烯酰胺 200 780
1.5MTris-HCl (pH &8) 0 1500
0.5MTris-HCl (pH 6.8) 500 0
20%SDS 30 30
10%APS 40 40
TEMED 4 4
H2O 1010 1670
总量 2054 6024

遵义医科大学硕士学位论文周念

根据上表的加样体系配制浓缩胶和分离胶,最后加TEMED和APS后,及 时混匀灌胶,先灌分离胶,在玻璃板中分离胶上方用高压水压胶,隔绝氧气,使 胶表面水平,室温中静止30 min,待分离胶在玻璃板中凝固后吸尽高压水,开始 灌浓缩胶,插入梳子,静置30 min后,缓慢拔出梳子。将制胶架放入电泳槽中, 将电泳液导入制胶架观察是否漏液,在电泳槽中加入电泳缓冲液到相应刻度后, 准备加样。蛋白样品与5 x loading buffer按4:1比例配制,于沸水中煮沸30min 作上样蛋白样品。上样量为30g开始点样,一次加入蛋白marker与蛋白样品, 边缘上样孔加入同体积loading buffer防止目的蛋白跑偏。先设置为70V恒压跑 胶,待market'分开后,改为100V跑胶,待漠酚蓝跑到分离胶底部时,停止电泳, 比对marker切胶,并用直尺测量胶的长宽,准备转膜。配制转膜缓冲液,A/B 液配方为,去离子水:5 x buffer A/B :甲醇=3:1:1,将裁好的胶放入A液中。 裁剪稍微偏大于胶的8张滤纸,均分为2组,分别放入A液与B液中,裁剪与 胶大小相似的PVDF膜放入甲醇中激活90s后转入A液中,将B液中的滤纸对 齐放入转膜仪中,用细玻璃棒赶走滤纸中的气泡,然后将胶放在滤纸上,同样用 玻璃棒赶走气泡,并使之贴合,依次再放上PVDF膜,处理同前,最后放上A 液中的4层滤纸,同样用玻璃棒轻轻赶走气泡,盖上转膜仪盖子,开始转膜,设 置电流为200 mA恒流转膜,约1〜1.5h,停止转膜。

快速在膜上画好marker,将膜放入圭寸闭液中,放入摇床上,圭寸闭2 h或4°C 冰箱封闭过夜。将膜放入一抗中进行孵育,一抗稀释比例为E-cadherin (1:800), vimentin (1:800), E2F6 (1:800), P-actin (1:800);摇床上孵育 2 h 或 4°C冰箱孵育 过夜。一抗孵育后,将膜用lxTBST洗膜3次,每次5 mine洗膜后转入相应稀 释(稀释比例1:10000)后的二抗中,摇床上孵育2h,再次用1 xTBST洗膜, 时间同一抗孵育后洗膜时间,洗膜后将膜转入配好的ECL (A:B=1:1),于摇床 上轻轻晃动2mim快速将膜转入并包裹于干净的保鲜膜中,去除气泡和褶皱, 蛋白面朝上快速固定于暗匣中。于暗室中曝光:将胶片置于暗匣中,在红灯下观 察胶片中蛋白曝光情况,调整曝光时间,将胶片冲洗晾干,用凝胶成像仪中扫描 图像并拍照,使用Gel-Pro_analyzer 4.0软件读取条带灰度值,以P-actin为内参, 计算各目的条带蛋白的相对表达量。

1.3.3免疫荧光观察

将细胞铺板于预先放置无菌细胞爬片的细胞板中,在显微镜下观察到细胞融 合度达到60%〜70%时,将细胞用PBS洗三次,每次10 min,加固定液孵育15 min; 固定后用PBS洗3次,每次5 min,加入含0.1m Gly的PBS中孵育5 min终止 固定反应,用银子轻轻夹取玻片,细胞面朝上放置于铺好封口膜的细胞培养皿(或 其他容器)中;在玻片上加入100山封闭液,室温封闭40 min,用真空泵洗净封 闭液(注意别吸走细胞);每片玻片加入100(11用PBS・Tx稀释(E-cadherin: 1:50)的一抗,于4°C冰箱中孵育过夜,一抗孵育期间保持爬片湿润(可在培养 皿周围垫加湿润的吸水纸,切忌吸水纸接触爬片);一抗孵育后用PBS-Tx洗爬 片(5 minx 3次),爬片加入PBS-Tx稀释的100山二抗(比例为1:500),室 温避光孵育2h,后吸净二抗,爬片上滴入PBS-Tx稀释的100(11 DAPI (稀释比 例为1:400),避光染色3 min,后吸净DAPI,再次用PBS-Tx洗爬片(5 minx 3 次),在玻片上滴入4山抗淬灭剂,用银子轻轻夹取玻片,细胞面朝下倒扣于载 玻片上,用真空泵吸走多于液体,用甘油封片。于荧光显微镜下观察并拍照。

1.5统计学分析

数据采用SPSS 18.0软件分析处理,统计学方法采用/■检验(Studenfs t-test) 及方差分析(ANOVA),数据均以均数士标准差表示(兀士s)。检验水准a=0.05o 每组实验重复三次。

2结果

2.1 miR-424 EC 影响

  • Transwell侵袭实验及划痕愈合实验检测miR・424抑制EC侵袭和迁移能力

在 EC 中转染 hsa-miR-424 mimics, ASO-hsa-miR-424 和 ASO-negative control (NC)后,Transwell实验可以观察到:与对照组NC组和ASO-NC相比,实验组 miR-424 mimics组侵袭能力明显低于对照组NC和ASO-NC及ASO-hsa-miR-424 组,而ASO-hsa-miR-424组侵袭能力明显高于miR・424 mimics组,差异具有统 计学意义(PV0.05),见图2-6o表明在EC中上调miR・424的表达对EC的侵袭 能力具有抑制效应。划痕愈合实验可以观察到:划痕24h, 48h后,miR-424 mimics 组划痕愈合程度明显慢于NC组、ASO-NC及ASO-miR-424组,同样 ASO-hsa-miR-424组划痕愈合能力明显强于NC组、ASO-NC及miR・424 mimics, 差异具有统计学意义(PV0.05),表明miR・424在体外实验中抑制EC迁移能力。

Fig. 2 Transwell invasive assay detected miR-424 effected the invasion ability EC cell lines HEC-l-A and Ishikawa

Note: Transwell invasive assay observed that invasion ability was significantly attenuated after
miR-424 mimics was transfected into EC cell, and ASO-miR424 increased the invasion ability of

EC cell; the data from transwell assay showed that miR-424 markedly inhibited invasion of EC

4 Wound愈合实验检测miR-424EC细胞系HEC1A的迁移能力的影响

Fig. 4 Wound healing assay detected miR-424 effected the ability of migration of EC cell line

HEC-l-

control

miR-424

ASO-NC

ASO-miR424

Oh

24h

48h

5 Wound愈合实验检测miR-424EC细胞系Ishikawa的迁移能力的影响

Fig. 5 Wound healing assay detected miR-424 effected theability of migration of EC cell lines

Ishikawa

6划痕愈合实验*Pv005)

Fig. 6 wound healing assay of EC cell lines HEC-l-A and Ishikawa

Note * P < 0.05 compared with control group

2.1.2免疫荧光实验检测miR・424对EMT标记物蛋白E-cadherin和Vimentin表 达定量和定位情况

免疫荧光结果同WB结果,miR-424明显促进EMT相关蛋白E-cadherin的 表达,E-cadherin定位于细胞质与细胞膜周围,见图7・8。

7 HEC-1-A细胞免疫荧光实验(200X)

注:miR-424niiniics 组 E-cadherin 蛋白相对表达量明显高于 mimics NC 组,ASO-miR424 组 E-cadherin 蛋

白相对表达量明显低于ASO-NC组,E-cadherin定位于细胞质与细胞膜周围

Fig. 7 Immunofluorescence assay of HEC-l-A (200 X )

Note: The repressed level of E-cadherin is markedly upregulated in miR-424mimics group compared with mimics

NC group, expression of E-cadherin is downregulated in ASO-miR424 group compared with ASO-NC group,

E-cadherin protein located in aytoplasm and around cell membrane

DAPI

Merge

8 Ishikawa细胞免疫荧光实验(200X)

注:miR-424rniniics 组 E-cadherin 蛋白相对表达量明显高于 mimics NC 组,ASO-miR424 组 E-cadherin 蛋 白相对表达量明显低于ASO-NC组,E-cadherin定位于细胞质与细胞膜周围

Fig. 8 Immunofluorescence assay of Ishikawa (200 X )

Note: The repressed level of E-cadherin is markedly upregulated in miR-424mimics group compared with mimics NC group, expression of E-cadherin is downregulated inASO-miR424 group compared with ASO-NC group, E-cadherin protein located in aytoplasm and around cell membrane

  • Western blot实验检测miR・424对EMT相关蛋白表达情况的影响

转染后48h收取的细胞提取的蛋白,Western blot检测EMT相关蛋白

E-cadherin 和 vimentin 的表达,结果如图 9 所示:miR・424 mimics 组 E-cadherin 表达量明显高于NC组,ASO-miR-424组E-cadherin蛋白表达量明显低于

ASO-NC组,miR・424 mimics组vimentin蛋白表达車明显低于NC组、

ASO-miR-424组vimentin蛋白表达量明显高于ASO-NC组,差异具有统计学意

义(PV0.05),见图 9-llo

9 Western blot实验检

10 MiR-424HEC1A 细胞中E-cadherinVimentin的表达量的影响

注:miR-424rniniics 组 E-cadherin 蛋白相对表达量明显高于 mimics NC 组,ASO-miR424 组 E-cadherin 蛋 白相对表达量明显低于ASO-NC组,P<0.05 (n=3); miR-424mimics组Vimentin蛋白相对表达量明显低于 mimics NC 组,ASO-miR424 组 Vimentin 蛋白相对表达量明显高于 ASO-NC 组,P<0.05(n=3)

Fig.10 MiR-424 effected E-cadherin and Vimentin expression in HEC-l-A

Note: The repressed level of E-cadherin is markedly upregulated in miR-424mimics group compared with mimics NC group, expression of E-cadherin is downregulated in ASO-miR424 group compared with ASO-NC group, P < 0.05 (n=3); Vimentin is downregulated in miR-424mimics group and Vimentin is upregulated in ASO-miR424 group respectively vs mimics NC group and ASO-NC group, P < 0.05

11 MiR-424Ishikawa细胞中E-cadherinVimentin的表达量的影响

注:miR-424iniinics 组 E-cadherin 蛋白相对表达量明显高于 mimics NC 组,ASO-miR424 组 E-cadherin 蛋 白相对表达量明显低于ASO-NC组,P < 0.05 (n=3); miR-424mimics组Vimentin蛋白相对表达量明显低于 mimics NC 组,ASO-miR424 组 Vimentin 蛋白相对表达量明显高于 ASO-NC 组,P < 0.05 (n=3)

Fig. 11 MiR-424 effected E-cadherin and Vimentin expression in Ishikawa

Note: The repressed level of E-cadherin is markedly upregulated in miR-424mimics group compared with mimics NC group, expression of E-cadherin is downregulated in ASO-miR424 group compared with ASO-NC group, P < 0.05 (n=3); Vimentin is downregulated in miR-424mimics group and Vimentin is upregulated in ASO-miR424 group respectively vs mimics NC group and ASO-NC group, P < 0.05 (n=3)

2.1.4双荧光素酶基因报告实验检测miR・424的靶基因E2F6

在双荧光素酶基因报告实验中,在转染了 miR・424 mimics, ASO-miR-424 和ASO-NC中转染克隆的野生型和突变型pmirGLO荧光素酶报告载体,可以观 察到miR・424 mimics + wild E2F6 3r-UTR组荧光强度明显低于对照组, ASO-miR-42 + wild E2F6 3f-UTR 荧光强度明显高于 ASO-NC+ wild E2F6 3f-UTR 组;miR-424 mimics + mut E2F6 3f-UTR组与对照组之间荧光强度无明显差异, ASO-miR-42 + mut E2F6 3f-UTR 组与 ASO-NC+ mut E2F6 3f-UTR 组之间荧光强 度无明显差异,见图12(B),表明E2F6 37TR存在miR・424的互补配对结合位 点。RT-qPCR 与 WB 实验结果显示:miR-424 mimics + wild E2F6 3'・UTR 组 E2F6
mRNA的相对表达量明显低于对照组,ASO-miR-42 + wild E2F6 3f-UTR E2F6 -mRNA 的相对表达量明显高于 ASO-NC+ wild E2F6 3r-UTR 组,miR・424 mimics + wild E2F6 3f-UTR组E2F6蛋白的相对表达量明显低于对照组,ASO-miR-424 + wild E2F6 3'・UTRE2F6蛋白的相对表达量明显高于ASO-NC+ wild E2F6 3'・UTR 组,差异具有统计学意义,见图12(D-E)O表明miR・424能直接与E2F6 mRNA 的31 UTR互补配对结合,E2F6是miR・424的靶点。

12双荧光素酶基因报告实验和RT-qPCRWB实验*P < 0.05 (n=3)

Fig.12 Double luciferase reporter assay, RT-qPCR and WB ass町*P < 0.05 (n=3)

2.2 E2F6逆转miR-424EC的抑制作用

  • E2F6逆转miR・424对EC的抑制效应

在过表达miR・424的EC细胞中转染pcDNA3.1-E2F6后,Transwell侵袭

买验及划痕愈合买验结果显示:过表达E2F6后会减弱miR・424对EC的侵袭和 迁移抑制效应,差异具有统计学意义(PV0.05),见图13-14o表明E2F6能减弱 miR-424对EC的抑制效应。

13 Western Blot实验与Transwell侵袭实验

注:A-B为WB实验:pc-DNA-3.1-E2F6组E2F6蛋白相对表达量明显高于pc-DNA-3.1组,差异具有统计 学意义*P < 0.05 (n=3); C-E. Transwell侵袭实验表明:pc-DNA-3.1-E2F6+ miR-424组侵袭细胞数明显多于 miR-424+control组,差异具有统计学意义*P < 0.05 (n=3)

Fig.13 Western Blot assay and Transwell invasive assay

Note: A-B: WB assay showed that the expressed level of E2F6 protein in pc-DNA-3.1-E2F6 was significantly higher than pc-DNA-3.1 group, *P < 0.05 (n=3); C-E. Transwell invasive assay showed that invasive cell counts of pc-DNA-3.1-E2F6+ miR-424 group was markedly increased compared with miR-424+control group,

是降低的㈤⑶】。使用生物信 息学分析软件(TargetScan、RNA22 ^0 microma.org)寻找miR・424的靶基因发 现,转录因子(E2F transcription factors, E2Fs)家族成员 E2F2-7 mRNA 的 3f-UTR 可能存在miR・424的结合位点,研究显示miR・424通过与其靶基因E2F7 mRNA 的3LUTR互补配对结合后,抑制EC细胞的增殖及导致EC细胞停滞于S期, 诱导肿瘤细胞的凋亡[辺。而miRNA可以靶向调节多个靶基因或靶蛋白,故在本 研究中,继续探索miRNA的其他靶点和对EC的侵袭和转移等肿瘤特性方面的 影响。

  • miR-424 抑制 EMT 过程

鉴于现目前关于miRNA的研究存在诸多未知领域,miRNA对肿瘤等疾病的 功能性研究主要还是基于功能获得性研究和功能缺失性研究,如通过miRNA mimics或siRNA, hnRNA与反义寡核昔酸等技术上调或沉默miRNA的表达, 检测其对疾病或细胞表型等的影响。本实验将合成的has-miR-424 mimics, ASO-hsa-miR-424, ASO-NC转染入EC细胞系中,研究在EC中高表达miR・424 或沉默miR・424的表达后,对EMT的影响。WB实验结果显示:在EC细胞中 诱导miR-424高表达后,miR-424促进EMT标记物E-cadherin的表达和抑制 Vimentin蛋白的表达。免疫荧光实验结果也显示,在EC细胞中过表达miR-424 后,实验组EC细胞的细胞质中检测到E-hadcerin蛋白的相对表达量高于对照组, 这与WB结果一致,表明miR・424能抑制EC细胞的EMT过程。E-cadherin和 Vimentin蛋白是EMT过程中的分子标志物,上皮标志物E■钙黏连蛋白 (E-cadherin)介导肿瘤细胞的凝聚力并抵抗细胞在转移过程中经历的机械应力。 检测上述两个蛋白的表达情况可以反映肿瘤中EMT的状态,如在Blechschmidt 及其团队在卵巢肿瘤等的研究中,他们发现在卵巢癌中抑制E-cadherin的表达会 诱导EMT过程,导致卵巢肿瘤的侵袭和转移能力增强[辺。在三阴的乳腺肿瘤中, 激活p90核糖体S6激酶(p90 ribosomal S6 kinase, p90RSK)会引起EMT标志 物Snail, Twist, ZEB1和N-cadherin的表达下调,增强乳腺肿瘤细胞的侵袭和转移 能力巩

EMT表示上皮细胞重新编程为间充质细胞,表现为细胞■细胞间粘性和极性 丧失及细胞外基质间相互作用增加网,单个肿瘤细胞或肿瘤细胞群获得运动能力 和侵袭能力,参与肿瘤的进展、化疗耐药和转移等过程[均。实际上,肿瘤细胞在 发生侵袭的过程中,很少以单个肿瘤细胞开始,而是一个群体细胞事件[述用。在 EMT导致的肿瘤侵袭和转移过程中,群体细胞改变其细胞表型,经历了巨大的 形态学变化,重塑细胞骨架和细胞间粘附。根据细胞或组织接收到的背景信号和 细胞间的基因信号传导,细胞群进入沿着E・M轴分布的中间状态,当受到刺激 时,上皮状态的细胞将完全转化为间充质细胞状态,使细胞与细胞间失去粘性和 极性,呈现岀独特的细胞特性,如干细胞特性、耐药性、高强度的运动能力、向 血管或远处组织或器官侵袭能力等[40-42]。在EMT过程中,有几种被大众熟知的 标志物表达的变化:E■钙黏连蛋白(E・cadherin)下调,细胞黏附蛋白(白N■钙 粘着蛋白(N-Cadherin)和整联蛋白(integrins))和结构蛋白波形蛋白(Vimentin) 上调等问。

EMT在多种病理过程中发挥至关重要的作用,包括胚胎的形态发生、肿瘤 的发生发展等过程〔44,45]。大量的研究资料证明EMT参与肿瘤的进展,Michael 与团队第一次报道了 EMT参与卵黄囊肿瘤的进展He]。il・8通过调节Wnt/卩- catenin通路介导的EMT促进卵巢肿瘤的转移⑷]。在炎性微环境中,miR・101, miR-22和miR・29家族等通过抑制NF-kB信号通路,导致NF-kB介导Snail的稳 定后抑制头颈部鳞状细胞肿瘤(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) 中EMT的发生和肿瘤细胞的存活,抑制肿瘤的转移郎]。长链非编码RNA SNHG7 通过sponge miR-449a上调TGIF2的表达后促进NSCLC细胞的增殖、转移、侵 袭和 EMT过程Bl。转录因子超家族成员 SOX17CSex-determining region Y-box 17) 通过失活Wnt/p-catenin-EMT轴抑制EC细胞的转移冈。有研究发现有多达30% 的EC在诊断之初就已经发现侵袭肌层,并随后发生局部或远处的转移el,而 EMT对肿瘤最初获得转移和侵袭特性是至关重要的。最近的一些研究表明 miRNAs在EMT过程中扮演关键的角色炉亠],如抑制miR・200的表达后,EMT 过程中涉及肿瘤细胞转移、抗失巢凋亡的间叶细胞标志物的表达会受到影响[旳。 在EC细胞系Hec-50B中抑制BMI-1的表达后导致E-cadherin的表达和vimentin 的表达降低,导致细胞的侵袭性降低,而在EC中转入miR-194 mimics后,miR・194 通过靶向BMI-1后逆转EMT过程冈。

在细胞功能实验中,在EC细胞系中转染hsa-miR-424 mimics、 ASO-hsa-miR-424和ASO-NC后,Transwell侵袭实验和划痕实验观察到miR・424 能够抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。EMT是肿瘤发生转移级联反应的重要一步, 保护肿瘤细胞在迁移过程中免受免疫检查细胞或其他不利环境等的伤害,而肌层 侵袭、盆壁和淋巴结及远处器官组织的转移是EC不良预后和死亡的主要因素3, 凋。上述实验结果表明:miR-424可以通过抑制EMT过程在转移和侵袭方面发 挥抑癌效应。众所周知,EMT是一个可逆的过程,可以通过激活MET使处于中 间状态的细胞恢复到正常状态,故在EC的治疗过程中,是否可以通过靶向调节 miR-424使之逆转EMT,降低EC细胞的侵袭、转移和耐药情况,这可能在以后 肿瘤治疗的研究中,成为新型治疗的突破点。

  • miR-424 的靶点是 E2F6

研究发现转录因子E2F家族中的一个或多个成员可能被miR・424靶向调节 在肿瘤或疾病的发生或发展中发挥重要的效应的。双荧光素酶报告基因检测实验 结果发现E2F6 mRNA的3r- UTR存在miR・424的互补结合位点。诸多研究显示 E2F参与细胞或组织、器官等的正常发育、生长及异常的病理生理等过程。E2Fs 是一组在高级真核生物中编码转录因子(transcription factors, TFs)的家族,包 含九种成员。因其在细胞周期中的调控功能得到广泛的认知,通过与视网膜母细 胞瘤(Retinoblastoma, Rb) pl07和pl30等结合发挥相应的功能网。根据其具 体的功能,大体上主要分为两组:转录激活组(E2F1, E2F2和E2F3a)和包含 抑制域的转录抑制组(E2F3b与E2F4-8)画。E2F在细胞功能(DNA修复、DNA 损伤检查点控制、细胞的增殖、死亡、凋亡、细胞周期调节)和机体功能(调节 分化、发育及肿瘤的发生)等发面发挥重要的调节作用Pi®],如在静止的细胞中 过表达E2F 1-3后会诱导细胞周期中S期进展。E2F家族成员根据其表达和转录 调节特性被又可将其细分为三种亚类a®]:门E2F l-2,E2F3a通常被分为激活组 (activator),在细胞周期内S期其表达水平达到最大值;ii) E2F3b和E2F4-5 在整个细胞周期均有表达,因与Rb家族成员共同作用而被认为是阻遏组 (repressor); iii) E2F6-8因缺乏RB结合域被归类为转录阻遏组(transcriptional repressor)oE2F家族成员在特定的细胞环境或启动子组装蛋白的情况下表现出特 定的转录抑制或激活作用。

E2F6是数十年前研究者发现的不同于E2F家族的一个成员,具有抑制E2F 反应的作用3’网°E2F6是一种核蛋白,缺乏Rb结合域和口袋蛋白(pocket protein) 结合域,E2F6也能与DP1/2形成能与DNA结合的二聚体(heterodimer),具有 高度的DNA结合活性,并显示出对TTTCCCGC E2F结合位点的亲和性,这与 源自E2启动子序列TTTCGCGC的E2F共有序列略有不同,比如高表达E2F6 后会导致S期细胞累积a,勿。E2F6普遍表达于细胞周期中,并且能结合不同寻 常的常规E2F的靶基因或蛋白。诸多研究发现E2F6在体细胞减数分裂、细胞周 期及肿瘤的发生等过程中发挥重要的调节作用,如在Velasco等的研究中发现, 涉及减数分裂的基因,在其启动子区域存在一个共同的转录因子结合位点,DNA 甲基转移酶(de novo DNA methyltransferases 3b, Dnmt3b )在转录阻遏子 (transcriptional repressor) E2F6的协助下,被募集到启动子区域,调节一些生殖 系基因(germ-line genes)的启动子区域的甲基化⑺】。这与Leseva等的研究一致, 他们的研究表明:在体细胞的减数分裂过程中,多梳基因家族的PRC2 (polycomb repressive complexes 2)协助E2F6介导的基因沉默作用⑺】。在关于心肌细胞的研 究中,E2F6通过调节E2F的活性减少包括心肌细胞在内的细胞的凋亡,增加细 胞的存活能力,在由于细胞死亡导致的疾病如扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy)中调节E2F6的表达水平可能成为一种有效的治疗策略⑴】。在 非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中,LINC01436 被鉴定为一 种缺氧敏感的IncRNA,由于在LINC01436的启动子(promoter)区域存在E2F6 的两个结合位点,故在常氧条件下,LINC01436的启动子区域被E2F6占据,E2F6 抑制LINC01436的表达,但在缺氧的微环境中,这种抑制作用会解除,因此缺 氧会减轻E2F6对LINC01436的抑制作用并加强LINC01436对NSCLC的致瘤性 [%]。在一项关于卵巢肿瘤(ovarian cancer)的研究中,E2F6通过募集EZH2表 观遗传层面(如增加miR-193a启动子的超甲基化等)抑制miR-193a的表达,促 进卵巢肿瘤的干细胞特性(stemness)和肿瘤发生⑴】。

在成胶质细胞瘤(glioblastoma, GBM)的研究中,Huang等人在EGFRvIII 过表达的GBM中检测到E2F6的表达升高,E2F6的表达主要由 EGFRvIII/AKT/NF-kB信号通路控制,他们发现E2F6是导致表达EGFRvIII的 GBM对替莫卩坐胺(temozolomide, TMZ)发生化疗耐药的主要原因,E2F6的表 达水平可以监测GBM对TMZ的反应,降低E2F6的表达使GBM对TMZ的敏 感性上升[%】,这表明在发生化疗耐药的GBM中抑制E2F6的表达可能成为一种 有效的治疗手段。低表达E2F6后抑制胃癌(gastric carcinoma, GC)细胞的增 殖、转移和侵袭抑制促进肿瘤细胞的凋亡,E2F6通过抑制癌易敏感型候选基因 (cancer susceptibility candidate 2, CASC2)的表达在胃癌中作为一种预后标志物 "I。这与Sun等对乳腺肿瘤(breast cancer)的研究一致,他们也将E2F6作为乳 腺癌的预后的生物标志物[78]o在IGF2BP2 (胰岛素样生长因子2-mRNA结合蛋 白 2 ) 的协助下,GHET1 (Gastric carcinoma proliferation enhancing transcript 1) 通过靶向E2F6调节AKT/mTOR和Wnt/p-catenin信号通路,参与宫颈癌细胞的 增殖、侵袭和EMT过程旳。表明E2F6在疾病如肿瘤等的发生、发展和肿瘤化 疗耐药及治疗过程中发挥重要的作用。

在EC中过表达miR・424后,WB实验结果显示miR・424 mimics组EC中 E2F6蛋白的表达量低于对照组,ASO-miR424组E2F6蛋白的表达量高于对照组, RT-qPCR实验结果显示,miR-424 mimics组E2F6 mRNA的相对表达量明显低于 对照组,ASO-miR424组mRNA的相对表达量明显高于对照组,表明miR・424 对E2F6发挥负性调节作用,结合双荧光素酶基因报告结果实验,表明在EC中, miR-424通过靶向调节E2F6在EC中扮演着重要的角色。为了反向验证miR・424 是否通过与E2F6 mRNA的3TJTR结合抑制EC的进展,在转染miR・424 mimics 的EC细胞系中过表达E2F6后,Transwell侵袭实验、划痕实验结果表明:E2F6 减弱了 miR・424介导的细胞侵袭和转移抑制。综上实验结果表明:在EC中, miR-424通过靶向调节转录因子E2F6,抑制EC细胞的转移、侵袭和EMT;反 之,E2F6可以减弱miR・424的抑癌效应。

  • MiR-424E2F6/E2F7之间的相互作用

研究资料表明E2F家族中E2F7也是miR・424靶点之一,本实验证明E2F6 是miR・424的靶点刖。E2F6和E2F7包含独特的且高度保守的抑制臂,但缺乏 转录激活所需或与Rb蛋白相互作用的C・端序列(C-terminal sequences),与E2F8 一起被归类为E2Fs家族的抑制组[67,68,呵。文献资料显示,E2F7也在细胞分化、 细胞周期、DNA损伤、减数分裂等过程中扮演着重要的角色。如在G2期保持 适当的E2F7/8水平,有助于DNA损伤的修复,使细胞顺利进入有丝分裂状态⑻】。 E2F7在G1晚期被E2F1大量诱导,能与miRNA和E2F共有结合域(consensus motifs)编码的蛋白基因如E2F1, CDC6, MCM2等结合,抑制其表达陀删。在应 用DNA拓扑异构酶抑制剂处理的细胞中,检测到p53依赖的E2F7的反式激活 导致调节细胞周期基因DHFR, RRM2和E2F1等的抑制网,表明E2F7在DNA 损伤时的细胞周期停滞发挥重要的转录作用。大量的研究资料显示E2F6与E2F7 参与肿瘤的进展应旳,如在胃癌的研究中,Manicum等研究发现,高表达的E2F6 和E2F7与胃癌的良好的总体生存期之间存在明显相关性阴。结合本团队的研究, 可以发现:miR-424在EC中可以同时靶向调节E2F家族的两个成员E2F6与E2F7, 与E2F6及E2F7的3r- UTR互补配对结合,导致E2F6及E2F7 mRNA的降解和 抑制E2F6和E2F7的转录、翻译等过程,抑制EC细胞的增殖、转移和侵袭和 EMT过程等恶性行为,促进细胞周期停滞和肿瘤细胞的凋亡,miR・424与E2F6 之间存在的反馈环在EC的EMT、细胞侵袭、转移等过程也发挥调节作用。

4结论

MiR-424在EC中扮演抑癌作用,通过与E2F6 mRNA的3f- UTR互补配对 结合抑制EC的转移、侵袭,miR・424促进EMT的标记物蛋白E-cadherin和抑制 EMT的标记物蛋白Vimentin的表达,抑制EMT过程,将间充质状态的细胞转 化为上皮状态的细胞,抑制肿瘤的转移和侵袭过程,表明miR・424在EC中是一 种抑癌miRNA, MIR-424/E2F6之间存在的反馈环在EC的侵袭、转移过程中发 挥调节作用。

5研究的不足与展望

本研究的不足之处:E2F6含有在细胞周期G1/S转化调节过程中发挥重要效 应的MAX基因关联蛋白MGA和MYC关联因子X (MAX), miR-424是否能通 过调节E2F6影响EC细胞的细胞周期,这一点在本研究中未予以说明。未探究 miR-424通过靶向调节E2F6是否可以细胞凋亡,需要动物实验去进一步验证 miR-424的抑癌效应。展望:肿瘤患者的循环中无细胞肿瘤核酸tumour acids)女口 cfDNA、cfRNA、cfhiiRNAs、cflncRNAs等可能成为肿瘤的液体活检 中的新型标记物,可以使用RT-PCR技术、微整列分析(microarray analyses)及 深度测序(deep sequencing)等实验技术检测循环中的cell-free tumour nucleic acids,提取cfmiRNAs用于肿瘤的预后监测,开展新型诊断和监测EC手段。EC 在内的肿瘤中细胞内信号通路和肿瘤微环境的复杂性,如在EMT过程中,一些 基因如TGF卩可诱导上皮细胞相关的蛋白表达从而调节miRNA的表达,而EMT 相关的转录因子可以抑制靶向间质成分的miRNA表达,从而促进EMT;或激活 PI3K-AKT哺乳动物TOR复合物1 (mTORCl)信号等,而PI3K-AKT信号通 路导致的体细胞突变是EC发展进程中的重要因素,miR・424可能通过靶向调节 E2F6或E2F7失活PI3K-PTEN-AKT通路从而抑制EC细胞的侵袭、转移和EMT 过程,找寻miR・424参与的信号通路调节;miRNA可以靶向多个靶点,多种 miRNA可以靶向同一蛋白或基因,是否可以找出以单个miRNA或单个蛋白(基 因)为中心的调节网络,有助于建立miR・424的network调节网络,为EC的个 体化精准治疗提供研究基础。

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综述

MiR-424的研究进展

周念综述李权审校

摘要:现目前在临床工作中,对肿瘤或某些疾病的诊断或治疗急需新的诊断手 段或治疗策略,一些晚期或复发的肿瘤出现化疗耐药或放疗抵抗,这促使研究 者们不得不寻求新的突破和更加精准的治疗方式。故现目前就有一种新秀被研 究者们所注意并重视,那就是microRNA (miRNA)o miRNAs是一类小的非编 码RNA,是一种RNA转录物,在转录后水平与信使RNA (mRNA)的结合控 制基因的表达或转录。大量的证据已经表明miRNA通过与靶基因结合相互作 用在各种生理或病理过程中发挥主干作用,女口:表观遗传控制、细胞分化、凋 亡、增殖、肿瘤发生和肿瘤抑制等;针对miRNA的这些研究有助于帮助人们 对miRNA的研究有更深一步的理解和辅助人们对miRNA在疾病或肿瘤中机 制的更进一步的探索。迄今为止,越来越多的miRNA也已经被研究者们所发 现。在本综述中,我们想简单综述一下miR・424的功能,包括在肿瘤或疾病中 的失调情况、靶基因、调节机制或者生物标记物等。以至于在后续的关于 miR-424在生理或病理过程中的研究提供基础以及为miRNA对肿瘤的靶向治 疗提供思路。

Abstract: On clinical practice, based on cases which advanced or recrudescent cancer lose sensitivity for chemotherapy and radiotherapy are increasing, doctors carni't successfully achieve destination of treatment and diagnosis for tumors and diseases. So scientists have to seek new treatment and breakthrough point of diseases and tumors, and precise target therapy. Nowdays, a rising star is getting attention from researchers, ifs microRNA (miRNAs). miRNAs are a class of small non-coding RNA that are defined as RNA transcripts, and control gene expre ssion or degradation on post-transcriptional level through binding with messanger RNAs (mRNAs). A growing body of evidences indicate that miRNA can play pivotal role involved in various of biological or pathological processes such as cell cycle, apoptosis, priliferation, epigenetic control, carcinogenesis and anti-oncogenesis etc. by regulating target gene, which help us get some brand-new views so that we go further explore potential and novel understand and treatment trategy for diseases and malignant tumor. To date, more and more miRNAs have been found. In our review, we plan to simply summarize the function of miR-424 which is useful for us to profoundly understand interaction between miR-424 and cancer, including condition of dysregulation, target, mechanism and others, so that miRNA therapy can provides an potential target therapical approach for integrated cancer therapy in the future.

关键词:miR-424;靶基因;肿瘤;疾病

1背景介绍

随着人类基因测序技术的发展,越来越多的miRNAs已经被发现。据报道, 有超过50%的miRNAs被发现位于肿瘤相关的染色体区域(genomic regions) 或易碎位点(fragile sites)⑴,积累的证据也表明miRNA在肿瘤或其他类型疾 病的发生发展过程中发挥重要的作用。在最初关于miRNA的研究中,由于大 多的miRNA位于基因间区域,故被认为是属于转录噪音(transcriptional noise) ⑵。但随着科学技术的进步和对于miRNA的研究的深入,研究学者们发现 miRNA参与多种正常细胞的生理过程、组织生长、疾病以及肿瘤的发生和发 展等过程。关于miRNA的发展历程:据报道,科学家们第一次发现miRNA 是Lee及团队在一项关于秀丽隐杆线虫(C.elegans)的研究,他们发现,秀丽 隐杆线虫的异时性基因lin・4 (heterochronic lin-4)能够编码一种小RNA,这种 小RNA与lim4存在反义互补关系⑶。随着对这种小RNA的深入研究,在后 续的研究中,把此小RNA命名为miRNAo miRNA自1993年第一次被发现以 来,为活体内基因表达的转录后调节开辟了一个全新的领域oMiRNA是被RNA 多聚酶 Pol II 或 Pol III (RNA ploymerase II (Pol II) or Pol III)转录的一种单链 的非编码小RNAH7]。在合成之初,在细胞核中最开始被转录为双链的初级转 录物(primary transcripts, pri-miRNA),随后,pri-miRNA 被蛋白 DGCR8 和

Drosh 处理成长度约 60-80nt 的 pre-miRNA,蛋白 Export in-5 将 pre-miRNA 从 细胞核运送到细胞质*刃,在细胞质中,pre-miRNA被Rnase III酶Dicer剪切 后Win,双链中的一条链随后被Ago (Argonaute)蛋白处理后嵌入RNA诱导 的沉默复合物(RNA・induced silencing complex, RISC)中变成成熟的miRNA 发挥作用,而另一条链则被当做过客链被溶解掉[I'M]。

长度约20-24nt的miRNA,能够负调节mRNA的稳定性,与靶基因的3, 端非转录区(3iuntraiislated regions, 3TJTRs)结合后在转录后水平阻滞蛋白的 转录或翻译。诸多研究资料显示miRNA的突变或失调表达在大量的正常的生 理或异常的病理过程中发挥重要调节的作用,如氧化应激、内分泌过程、炎症 反应、新陈代谢、生殖、分化、发育、自噬以及肿瘤等的转移、粘附、侵袭、 细胞周期、凋亡和信号通路等过程“a]。人类编码蛋白的基因中存在超过60% 的基因的3,端存在3TJTR0],故研究学者认为有超过30%的蛋白转录物被 miRNA修饰QI。单个的miRAN能够与几种甚至多种不同的mRAN的3PTR 结合参与其靶基因的调节,同样,单个的mRNA也能被多种不同的miRNAs 靶向调节,这就形成了 miRNA与mRNA之间复杂的调节网㈤。此外,在miRNA 与mRNA组成的调节网络中,可以由单个的miRNA及此miRNA家族的成员 共同组成调节网络,如研究比较多的miR-200家族、miR15/16家族以及let・7 家族等;也可以是完全不同家族的miRNA组成调节网络。现目前,由于诸多 研究证明了 miRNA可以与抑瘤或促瘤基因或蛋白结合后参与肿瘤和疾病的发 展,故在临床工作中,是否可以考虑在肿瘤和疾病的治疗中,miRNA能被视 为一种肿瘤等疾病的治疗靶点,开展肿瘤和疾病的精准治疗新疗法。

2 MiR15/16 家族

在miRNA合成的过程中,一些miRNAs被成簇地转录为多顺反子,如 miR・15/16家族。miR-424属于miR-15/16/195/424/497家族成员,在此家族中, 如miR-424 (啮齿动物中为miR-322)和miR・503等成员被共转录为多顺反子 的pri-miRNA,并组成miR-424(322)/503簇回必],他们之间拥有共同的3PTR 结合种子域(表1) o最新的关于miR-15/16家族的研究中发现,此超家族包 括10个miRANs成员(表1) o此超家族被报道参与炎症、血管生成、代谢、 细胞周期、老化、凋亡和自噬等过程Bl。而第一次发现关于miRNA参与人类 的肿瘤的报道是位于染色体13ql4的miR・15/16家族:在2002年的一项关于 慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)的研究中,Calin等 发现在大多的CLL患者中,检测到miR・15a和miR-16的缺失或低表达西。这 也是研究者们第一次发现miRNA参与肿瘤发生的调节。自此便开启了关于 miRNA参与肿瘤等疾病发生发展的新纪元,miRNA也开始获得科学家们的关 注。在2004年,Cimmo等发现miR-15a与miR・16・l通过负调节凋亡基因Bcl-2 能够参与CLL细胞凋亡的调节[2刀。另外一项关于非洲爪蟾的研究中,发现 miR-15和miR・16可以通过靶向Acvr2a (Nodal type II receptor)参与非洲爪蟾 早期胚胎的"斯佩曼组织中心” (Spemannfs organizer)的调节凹。M1R-16/-424 靶向内皮血管相关蛋白如VEGFR2和FGFR1等可能参与内皮细胞的血管生成、 增殖、转移和分化等过程[29】。miR・195是miR-16/15/195/424/497家族成员之一, 可以靶向调节多个靶基因(如CCND1, CDK6和E2F3等)抑制Rb-E2F信号通 路后,导致细胞周期G1/S的停滞㈤]。

表1 miR-15/16家族成员包含共同的6nt序列

miRNA 碱基序列

miR-15a U A G C A G C A C AU AAU G G U U U G U G

miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA

miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG

miR-322 C AG C AG C AAUU C AU GUUUU G GA

miR-424 CAG C AG C AAUU C AU GUUUU GAA

miR・503 UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG

诸多研究表明miR-424在多种肿瘤中呈现失调(表2)。例如,在前列腺 肿瘤(prostate cancer)的研究中发现miR-424-5p的表达水平在前列腺癌和良 性前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia)中是明显不同的,而miR-424-5p 联合PSA在诊断前列腺癌方面有一定的特异性刖。在CLL样本中,miR-424 呈现低表达水平卩I与B型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者相比,T型急 性淋巴细胞白血病(T-ALL )患者的miR・424水平更高卩习。在结直肠肿瘤 (colorectal cancer, CRC)中miR-424的表达水平是明显高于正常组织的㈤]。 在非小细胞肺癌(nomsmall cell lung cancer, NSCLC)中,与预后较可的患者 相比,miR-424的表达水平在预后较差的NSCLC患者中是明显上调的网。与 常规的CML相比,非典型性慢性粒细胞白血病(aCML)中能观察到明显高表 达的miR・4243]。在在喉和咽的鳞状细胞肿瘤中发现miR-424的表达明显升高 [36];这与Rentoft等的研究一致卩7]。Luis等报道了在41例子宫内膜癌 (endometrial cancer )组织样本中,miR-424的表达水平是明显降低的卩8】。

Has-miR-424在EB病毒(EpsteimBair vims, EBV)感染导致的弥散性大B细 胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBL)中的是高表达的,并能够靶 向调节c・MYB〔39]。表达失调的miR・424联合miRNAs如mi. 155和mi.222及 mir-503能够促进单核细胞的分化以及细胞周期的停滞㉛】。Mir-424-5p在存在 转移灶的肝细胞肿瘤(hepatocellular carcinoma, HCC)的样本组织及患者血清 中的表达是降低的跑。低表达的miR・424可能涉及NPM1 (nucleophosmin)阳性 的细胞遗传学正常急性髓细胞性白血病(cytogenetic normal acute myeloid leukaemia, CN-AML)的病理过程的。基于在早期胰腺肿瘤中(pancreatic cancer, PC)的miR-424-5p及miR-139-5p等7种miRNAs呈现的低表达特征,高风险 的PC患者可能能被诊断M2]。在结肠癌(colonic cancer)组织和未存在淋巴结 转移的的癌旁组织之间,能观察到miR・424的差异表达⑷]。在肝内胆管癌

(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)中也能观察到低表达的 miR・424[M]。

Pallasch等在B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-cell CLL)的研究中,观察到 在miR-424启动子区域呈现甲基化,发现在B-cell CLL中低表达的miR-424能 靶向锌指转录因子 PLAG1 (pleomorphic adenoma gene 1)的 3TJTR 去调节 B-cell CLL的进展mi。这些研究表明失调表达的miR・424可能参与多种肿瘤中的发生 和发展,诸多研究也已经报道miRNAs在不同类型的组织、器官和细胞中呈现 出特异的表达⑷】,miR-424亦是如此。但关于miR-424发挥的抑癌作用或促瘤 作用,在研究中均有被报道,现目前的研究中存在一些争议性(表3,4)o

2在肿瘤中失调的miR-424家族

miRNA 失调 肿瘤 参考文献
miR15a/16 下调 慢性淋巴细胞白血病 26
miR-424 下调 食管鳞状细胞肿瘤 70
上调 弥散大B细胞淋巴瘤 39
下调 肝内胆管癌 44
下调 老年性血管瘤 76
下调 结肠肿瘤 77
上调 结肠肿瘤 42
下调 细胞遗传学正常性急性髓细胞性白血病 41
下调 胰腺胆管腺癌 93
上调 喉鳞状细胞癌及咽鳞状细胞肿瘤 36
上调 T型急性淋巴细胞白血病 33
上调 非小细胞肺癌 34
上调 非典型性慢性粒细胞白血病 35
下调 子宫内膜癌 59
下调 宫颈癌 56
下调 肝细胞肿瘤 91
下调 上皮性卵巢肿瘤 50
下调 卵巢透明细胞肿瘤 49
下调 膀胱肿瘤 71
下调 直肠肿瘤 74
上调 直肠肿瘤 30
miR-424-5p 上调 胃癌 85
miR-424-3p 下调 前列腺癌 96

3 miR-424家族成员发挥抑癌效应

miRNA 靶点 肿瘤中发挥的效应
miR-424 BCL-2, IGF1R 增加对化疗药物的敏感性和抑制肿瘤的发生
Chkl,p-Chkl 抑制宫颈癌细胞增殖、转移、侵袭和促进细胞凋亡
FASN 抑制骨肉瘤细胞增殖、转移和侵袭
BAR-ABL 抑制慢性淋巴细胞白血病肿瘤细胞增殖,促进肿瘤 细胞凋亡,增加化疗敏感性
E2F7 抑制子宫内膜癌细胞的增殖
c-Myb 抑制干细胞转移、增殖、侵袭和肿瘤组织的转移
ARK5 抑制肝内胆管癌上皮间充质转化过程
PBX3 抑制肿瘤起始细胞的特性
PD-L1, CD80 逆转卵巢肿瘤细胞对化疗药物的耐药性
SMAD7 阻滞食管鳞状细胞肿瘤的上皮间充质转化过程
Akt3, E2F3 调节cell cycle/pRb-E2F信号通路
KDM5B-Notch 抑制宫颈肿瘤细胞的增殖和促进其凋亡
EGFR 阻滞膀胱肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导肿瘤细胞凋亡, 预测膀胱癌患者的肿瘤无进展生存期
AKT3, PS ATI 抑制直肠肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡
miR-424-5p DCLK1 抑制卵巢透明细胞肿瘤的上皮间充质转化、转移和侵袭 能力
miR-424-5p/-503-5p KIF23 抑制卵巢肿瘤的侵袭和转移能力
miR-424-3p YAP1 抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、转移和侵袭,增加肿瘤 对化疗药物的敏感性

遵义医科大学硕士学位论文

4 miR-424家族成员发挥致瘤效应
miRNA 靶点 肿瘤中发挥的效应
MiR-195 CCND1, CDK6, E2F3 阻滞肿瘤细胞G1/S期转变
miR-424 PRKCD, WEE1 促进食管鳞状细胞肿瘤的增殖,抑制细胞周期G1/S和

G2/M的转变

ICAT/CTNNBIP1, P-catenin 抵抗肝癌细胞的失巢凋亡和间充质上皮(MET)转化过 程

调节mir-424/MEKl/cyclinEl信号通路导致异常老年性 血管瘤的增殖

MEK1, cyclin El
Rictor 激活Akt导致肿瘤细胞的增殖和侵袭能力增加
TNFAIP1 促进非小细胞肺癌的增殖、转移和侵袭
GFBR3 促进舌鳞状细胞肿瘤的转移、侵袭和增殖能力
DSC2, FUR, MYB, VAMP8 促进前列腺肿瘤的转移能力
E3泛素连接酶COP1 miR-424/COPl/STAT3轴具有监测肿瘤的复发潜能
miR-424-5p STAT5 增加口腔鳞状细胞肿瘤的侵袭和增殖能力
SOCS6 促进胰腺肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭能力,抑制肿瘤 细胞的凋亡
Smad3 促进胃癌细胞的增殖能力

3 miR-424发挥抑癌作用

MiR-424在多种肿瘤和疾病中发挥重要的作用,异常表达的miR・424阻滞 肿瘤的发生发展,这一点是毋庸置疑的。越来越多的证据表明miR・424在多种 生理或病理过程及多种肿瘤的发生发展过程中作为一种抑制miRNA发挥作用。 例如,在细胞周期调节过程中,miR・16家族可以直接调节蛋白CCND1 (Cyclin D1)的表达导致细胞周期G1期停滞,同时,在调节细胞周期方面,miR・16 家族还能沉默细胞周期调节过程中的其他基因如Cyclin D3 (CCND3), Cyclin El (CCNE1)与 CDS"%]。在原发性乳腺肿瘤(primary breast cancer)中,低表 达的miR・424能通过靶向癌基因BCL-2和胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF1R)后调节乳腺肿瘤的化疗耐药和抑制肿瘤发生, 在乳腺癌中调节miR-424的表达可能成为一种治疗策略和恢复肿瘤对化疗药 物的敏感性⑷]。在另外一项关于基底样乳腺癌(basalJike breast cancer)的研 究中跑,miR-424-5p通过与在多种肿瘤的生长、上皮间充质转化

(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)和转移等过程中发挥必要作用的蛋 白DCLK1 (doublecortin-like kinase 1)的3f-UTR结合,调节基底样乳腺肿瘤细 胞的增殖、转移和侵袭及肿瘤的晚期临床阶段、肿瘤大小、淋巴结转移和不良

分化等肿瘤恶性行为,因此,miR・424在基底样乳腺癌中被认为是一种抑癌的 miRNAo此研究结果与另一项卵巢透明细胞肿瘤(ovarian clear cell carcinoma, OCCC)的研究结果一致,与邻近的非肿瘤组织相比,在OCCC组织中能检测 到低表达的miR-424,在ES-2细胞中转染了 miR・424 mimics后,观察到DCLK1 的表达被明显抑制,导致ES-2细胞的转移、侵袭和EMT能力被明显抑制IQ。 同样,在上皮样卵巢肿瘤中(epithelial ovarian cancer, EOC),在 miR-424-5p 通过与CCNE1的3TJTR结合与EOC的恶性特性如肿瘤大小、TNM分期、病 理分级、淋巴结转移之间存在相关性,并且miR-424-5p还通过调节E2Fl-pRb 信号通路阻滞G1/G0期的转变a】。Xu及团队也揭露了 miR・424(322)与卵巢肿 瘤(ovarian cancer)患者的无进展生存期(disease・fi*ee survival time)之间存在 正相关性,在他们的研究中,miR-424(322)通过抑制PD-L1 (Programmed death-1) 和CD80蛋白结合到T淋巴细胞相关抗原4 (T-lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)受体后调节PD-L1/PD-1和CD80/CTLA-4信号通路的激活,逆转卵 巢癌对化疗药物的耐药PH。

研究显示,阻滞免疫受体PD-1, CTLA-4和免疫配体PD-L1已经被考虑 为一种一些晚期肿瘤的治疗方式[52]。在肿瘤的发生中,上调pd・L1的表达后, 免疫逃逸机制通过协助肿瘤细胞免于免疫细胞的监管促进肿瘤的发生发展[呵。 故在一些由免疫逃逸机制参与的肿瘤中,若能恢复miR-424(322)的表达,则可 能通过激活T细胞和调节免疫检查点(immune checkpoint)后会在肿瘤的治疗 上产生新的进展如恢复化疗耐药肿瘤对化疗药物的敏感性等。在高级别的宫颈 上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)中,miR・424 能调控细胞周 期信号通路从而调控细胞的凋亡[列。在Xu等的研究报告中,miR・424在宫颈 癌(cervical cancer)中的表达水平比正常的宫颈组织更低,低表达的miR-424 与肿瘤的分化、晚期临床阶段、淋巴结转移之间存在联系,研究中报道了 miR-424抑制其靶基因细胞周期检查点激酶1 (checkpoint kinase 1, Chkl )和磷 酸化的Chkl (p-Chkl)的表达后抑制宫颈癌细胞的增殖、转移、侵袭、细胞 周期G/S期的转变和增强细胞的凋亡[旳。另一项被Zhou等报道的关于宫颈癌 的研究中也发现在组织和细胞中明显低表达的miR-424-5p,miR-424-5p作为一 个抑癌miRNA抑制蛋白KDM5B、Notchl和Notch2的表达后减少肿瘤细胞的 增殖及促进细胞的凋亡[殉。这些研究数据与另一项关于宫颈癌的研究一致,在 Xu和团队的研究中发现,在CLU2, E2F1和miR・424之间存在反馈调节环,蛋 白E7在反馈环的作用下,募集蛋白CUL2,此过程加速由HPV-16感染导致的 宫颈癌的进展,而miR・424能抑制此过程QI。在关于宫颈癌的研究中发现, miR-424在放疗抵抗的宫颈癌细胞和样本中表达水平是下降的,miR・424作为 一个放疗敏感的miRNA可以直接靶向aprataxin,以至于miR・424能够增加放 疗抵抗肿瘤细胞的DNA损伤、肿瘤细胞的凋亡和G2/M期的转变等发挥增加 放疗敏感性网。

miR-424能够靶向E2F转录因子家族中的一个或多个成员参与不同肿瘤的 发展过程。在子宫内膜癌(endometrial cancer, EC)中miR・424可以沉默E2F7 的表达抑制EC细胞的增殖,因为E2F家族成员之一的E2F7在调节细胞增殖、 凋亡和分化方面发挥重要的作用a】。miR-424在HCC中扮演着抑癌作用,在 转录后水平沉默Akt3和E2F3调节cell cycle/pRb-E2F信号通路后,抑制HCC 的进展a】;而且,miR・424与肿瘤的尺寸大小、TNM分期、静脉侵袭、患者 总体生存时间(overall survival time)及无进展生存期等肿瘤特性之间存在相 关性。当然,miR・424还能与其他种类的miRNAs—起同时靶向多个蛋白或基 因参与肿瘤的进程。在Han等关于HCC的研究中,miR・424联合let-7c> miR-200b和miR・222共同作为作为电压门控钙通道a2§l (—种HCC肿瘤起始 细胞(tumou—initiating cells,TICs)的表面标志物)的抑制子并同时靶向调节 PBX321],而PBX3是TIC获得肿瘤干细胞特性和维持干细胞特性所必须的, miR-424及另外的三种miRNAs在a261阳性的HCC中沉默PBX3的表达后, HCC中的TICs失去肿瘤干细胞特性,从而减弱肿瘤的发生,因为HCC的TIC 由于其具有肿瘤干细胞特性自我更新等的特点,负责HCC的转移和复发264]。 来自于Zhang与其团队的关于HCC的临床数据研究表明肿瘤组织中的miR・424 的表达水平明显低于正常的肝脏组织,低表达的miR・424与HCC的病理分期、 TNM分期有关,他们在HCC细胞中增加miR-424的表达后,观察到异常高表 达的miR・424通过直接与靶蛋白ICAT/CTNNBIP1和P-catenin的启动子区域结 合后逆转肿瘤转移、失巢凋亡和EMT等关键过程,控制肿瘤的恶性行为Ho】。 这项研究数据与Yu等的研究一致,他们也在HCC细胞系和原发性肿瘤组织样 本中观察到miR・424的降低,miR・424与其下游的靶基因c-Myb的3PTR结 合,减少肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭@1。在ICC中频繁下调的miR-424-5p 被发现与ARK5( —种人类AMP・激活蛋白激酶家族的新成员)mRNA的35UTR 结合后抑制靶基因ARK5的表达后引起mTOR的磷酸化,随后抑制EMT的进 程后导致ICC的转移和侵袭能力减弱[旳,暗示miR・424・5p /ARK5/p-mTOR信 号通路中的一个组分或多个组分可能成为ICC治疗的一个新的靶点。

在人类的骨肉瘤(osteosarcoma, OS)中,miR・424抑制靶基因脂肪酸合成 酶(fatty acid synthase, FASN)的表达致使OS细胞增殖、转移和侵袭能力降 低[6刀。MiR-424-3p在NSCLC中通过靶向YAP1抑制肿瘤细胞的增殖、转移、 侵袭和增加肿瘤对化疗药物的敏感性[网。miR-424在CML中被发现发挥抑癌 作用,参与CML肿瘤细胞的增殖、凋亡,并参与CML对酪氨酸激酶抑制剂 (tyrosine kinase inhibitors, TKIs)如伊马替尼的敏感性衍刃。因为在CML中, miR-424能够靶向调节酪氨酸激酶融合基因BCR-ABL,表明在存在对TKIs类 药物耐药的CML中,在针对化疗耐药方面,miR・424可能增加CML对化疗药 物的敏感性,成为一种新的治疗靶点。miR・424・5p在食管鳞状细胞肿瘤

(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)细胞和组织中检测到 miR-424-5p 的表达水平是低于正常的粘膜组织,在存在淋巴结转移的ESCC中的 miR-424-5p的表达水平也明显低于无淋巴结转移的ESCC组织,在ESCC中, miR-424负调节SMAD7信号通路后扰乱EMT的发展,导致转移和侵袭能力降 低叫

在膀胱肿瘤中,miR・424被DNA甲基转移酶1 (DNAmethyltransferasesl, DNMT1)调节后直接靶向EGFR后去参与EGFR介导的PI3K-AKT通路过程, 导致膀胱肿瘤细胞的生长被阻滞、侵袭能力减弱、EMT过程减弱和诱导肿瘤 细胞凋亡增加,并能预测膀胱肿瘤的无进展生存期⑺]。Lu等应用GO和KEGG 分析发现,SMURF 1和BCL2L1是miR・424的两种hubgenes,当SMURF 1的 表达被miR-424抑制后,RhoA (Rho GTP酶家族的一个成员)增强对钳类化 疗药物(Cisplatin, DDP)产生的耐药的胃癌细胞对DDP的敏感性⑺⑺]。在结 直肠肿瘤(colorectalcancer, CRC)的研究中[74],丝氨酸/苏氨酸激酶3( AKT serine/ threonine kinase 3, AKT3 )和磷酸丝氨酸转氨酶 1 ( phosphoserine aminotransferase 1, PS ATI )的mRNA被鉴定为miR-424的功能靶基因,导致 CRC细胞凋亡增加和增殖减少。诸如此类的研究都表明miR・424在多种肿瘤 中靶向不同的基因调节肿瘤的进展,在多种肿瘤中均发挥着抑癌作用。但亦有 诸多不同的研究表明,miR・424在肿瘤的发生发展中发挥的是积极的作用,促 进肿瘤的进展。

4 miR-424发挥致癌效应

研究资料表明miR・424在一些肿瘤中扮演着致瘤miRNA的角色。如在食管 鳞状细胞肿瘤中,miR・424的表达水平是明显上调的,在ESCC细胞中敲降 miR-424的表达后,miR・424通过调节靶基因PRKCD和WEE1抑制ESCC细 胞周期的转变,因为PRKCD和WEE1能增强p21Cipl蛋白的稳定性并激活p38 MAPK和JNK信号通路,导致CDK2蛋白失活后抑制G1/S和G2/M的转变, 低水平的miR・424与ESCC患者的无进展生存期是正相关的,在ESCC细胞中 过表达miR・424后会增加肿瘤细胞的增殖"I。在老年性血管瘤(senile hemangioma 中 miR・424 抑制 mi—424/MEKl/cyclinEl 通路调节轴中蛋白 MEK1 和cyclin El的表达后导致细胞异常的增殖皿。在结肠肿瘤中,miR・424/503・ Rictor调节轴发挥重要的作用:miR・424/503簇诱导Rictor高表达后导致雷帕 霉素复合物 2 的哺乳动物靶标(mammalian target of rapamycin complex 2, MTORC2)的表达增加并激活MTORC2,激活的MTORC2又激活AKT后增 加结肠肿瘤的增长和侵袭⑴]。当miR-424-5p/-503-5p簇的启动子区域发生DNA 超甲基化后会沉默miR・424・5p/・503・5p簇的表达,然后引起KIF23的表达增加, 增加的KIF23会引起卵巢癌的恶性行为增加,女口:细胞增殖和转移能力增加等 [78]o 在一项口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)的研究中"刃, 基于IL-8/STAT5/SOCS2与miR・424・5p之间存在的反馈环,当IL-8诱导 miR-424-5p表达后会增加磷酸化STAT5和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的表达,使得OSCC细胞的增殖能力、转移和侵袭 能力增加。在NSCLC的研究中,TNFAIP1被miR-424沉默期表达后,增强了 NSCLC的增殖、转移和侵袭[阿。

在Li等关于舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)的研 究中,高表达的miR-424和miR・19a通过介导转化生长因子III型受体 (transforming growth factor type III receptor, TGFBR3 )的表达,促进 TSCC 的 转移和EMT过程Mi,82]。在胰腺肿瘤(pancreatic cancer)中,上调的miR-424-5p 负调节ERK1/2信号通路中细胞因子调节信号家族成员SOCS6后增加胰腺肿瘤 细胞的增殖、转移和侵袭[冏。在胃癌中,SMAD基因家族成员的Smad3作为 miR-424-5p的一个靶基因之一,被发现在多种肿瘤的进展中发挥重要的作用阿, miR-424-5p通过负调节Smad3后抑制TGF■卩信号通路的激活参与一些列胃癌 肿瘤的进展,如促进肿瘤细胞的增殖等[冏。在前列腺肿瘤中,Banyard等发现, miR-424在上皮间充质转化中也发挥中心作用,由于miR・424可以同时靶向调 节多个基因如 DSC2, F11R, MYB 和 VAMP8 引起 E-cadherin, vimentin, EpCAM, cytokeratin 1&卩.catenins, y-catenins等表达的变化,促进前列腺肿瘤的转移[旳。 在HCC患者血清中的miR・424被认为可以作为一个独立的风险预测因子,研 究发现,在血清中呈现低表达miR・424的HCC患者表现出静脉更容易被肿瘤 侵袭、更高的TNM分期、更低的总体生存率及更短的总体生存期3】。

值得注意的是,IncRNA,作为非编码家族成员中的一员,通过与miRNA 结合,也被发现在肿瘤和疾病的发生发展中发挥着重要的作用,miRNA和 lincRNA及另外的基因或蛋白一起形成反馈调节环参与多种肿瘤或疾病发生和 多种信号通路的激活或失活。例如,在Wang等的研究中,长链非编码RNA PVT1被证明在宫颈癌中扮演抑癌角色,在宫颈癌中作为miR-424的一种竞争 性内源性 RNA (competing endogenous RNA, ceRNA )或"spong'RNA 在宫颈肿 瘤中发挥重要的作用[隔。在NSCLC中miR・424・5p同时靶向两个IncRNAs,即 IncRNA PVT1和共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1 (Coactivatogssociated arginine methyltransferase 1. CARMI)参与 NSCLC 的调节〔8刃。因此,MiR-424 的致瘤效应可以通过负调节多种靶基因或蛋白参与多种肿瘤的进展,在不同的 肿瘤中发挥不同的作用。除了参与肿瘤的进展以外,在肿瘤或疾病的诊断及预 后的预测方面也可能会发挥效应。

5 miR-424作为诊断或预后的标志物

迄今为止,对于原发或复发肿瘤的诊断主要依靠一些分子标志物或临床 表现,一些肿瘤在临床上确诊时已经达到晚期,失去手术机会,或对化疗、放 疗等治疗的效果均欠佳。故在临床工作中,对肿瘤的早期诊断有助于临床工作 者对肿瘤患者的早期诊断;探索新兴生物标记物可以用于监测肿瘤的复发,监 测肿瘤对化疗药物或放疗治疗效果等。越来越多的证据也表明miRNAs可以作 为肿瘤的诊断和预后的分子标志物[9。] o Has-miR-424和另外的miRNAs如 hsa-mir-3677, hsa-mir-421, miR-326等被发现与HCC患者的总体存活率相关, 并且对HCC的精确诊断有一定的作用[91】。Bauer和团队的研究发现,与慢性胰 腺炎相比,miR・424 在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) 中的表达是降低的,但相比于正常的胰腺组织来说,PDAC中miR・424的表达 水平更高,这些研究数据与另外一项Yu及团队关于PDAC的研究存在少许偏 差:在PADC中miR・424的表达水平是低于正常的一胰腺组织皿旳。结合上 述两家团队的研究数据发现,miR・424在可能在炎症到肿瘤的发展历程中可能 作为一种生物标志物,有助于区分正常胰腺组织与肿瘤组织,并且能够预测 PADC的总体生存率。Shen等对于宫颈癌的研究发现,在HR-HPV阳性和阴性 宫颈癌中,miR・424的表达水平存在明显的差异,他们认为miR-424可以作为 宫颈癌的诊断和预后的一个生物标志物[94】。miR-424在结肠肿瘤中也可能成为 有用的诊断标志物,因为早期的在结肠肿瘤中发现miR・424的高表达[95]。在一 项大规模的前列腺癌组织样本的研究中(no = 535 )发现〔96],低表达的 miR-424-3p 与不良的临床无进展生存(clinical failure-free survival, CFFS)、前 列腺肿瘤的侵略表型之间存在明显的相关性,miR-424-3p通过与CTLA-4/CD80 和PD-1/PD-L1调节轴相互作用减少前列腺肿瘤患者的CFFS ,表明 miR_424-3p/CTLA-4和miR・424・3p/PD・l通路可能是前列腺肿瘤的治疗新靶点 和预后的生物标志物。这些研究数据与Dallavalle等的研究结果一致,他们的 研究结果发现,miR・424靶向E3泛素化连接酶COP1后激活STAT3 (肿瘤的 进展中的一种重要的转录因子),激活的STAT3导致ESE3/EHF轴的失调,而 ESE3/EHF 又是激活 miR・424/COPl/STAT3 轴的触发器,miR・424/COPl/STAT3 轴激活后,致使肿瘤细胞获得肿瘤干细胞特性和增加转移特性3-99],因此,可 以通过监测miR・424/COPl/STAT3轴中的组分表达水平的变化预测前列腺癌的 预后和复发情况。这些研究数据充分说明,miR・424在成为肿瘤诊断的生物标 志物和预后的监测标志物方面具有巨大的潜能。

6在生理和病理过程中的miR-424

在多种疾病中也有监测到miR-424的变化和观察到miR・424在疾病中发挥 重要的作用。在哺乳动物的内皮细胞的发育过程中,成熟的miR-424(322)/503 簇抑制IGF1RBCL2基因的表达参与内皮细胞的发育【I。。】。在人类的骨髓分 化进程中,miR-424 阻滞核转录因子 I-A(transcription nuclear factor I-A, NFI-A) 的表达参与骨髓分化Mi' io?]。在肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)模型鼠的血浆、肺、右心室和PAH患者的血浆中均能检测到miR-424 的表达水平增加[1°习。在一项关于缺氧内皮细胞的研究中,Ghosh等发现缺氧诱 导RUNX-1和C/EBPa的增加,随后引起PU.1的表达水平上升,导致PU.1依 赖的miR-424被高水平的PU.1诱导后,其表达水平增加,miR-424能够靶调 节CUL2 (cullin 2) [104]o而CUL2是一种泛素连接酶的折叠蛋白,对缺氧诱导 因子HIF-la (hypoxia-inducible factor la)的稳定性发挥关键的作用,因此, 当高表达的miR-424沉默CUL2的表达后可能参与缺氧后的内皮细胞的血管重 塑和血管生成。在立克次体(rickettsiae)感染的真皮组织、脑组织和内皮细胞 中,检测到miR-424/503的表达水平是降低的;在被感染的真皮组织、脑组织 和内皮细胞中miR・424/503会调节FGF2/FGFR1的表达,由于FGF2和FGFR1 会增加内皮细胞的增殖后引起被感染细胞的存活、生长、血管形成、病理复制、 病原体进一步侵袭和播散[14106],故在被立克次体感染后,基于在被立克次体 感染的宿主细胞中FGF2, FGFR1和miR・424/503之间的反馈环的存在,升高 miR-424/503可能成为治疗立克次体感染的治疗。miR・424・5p可以靶向调节核 糖体 RNA (ribosomal RNA, rRNA)转录中的蛋白如 PolRlA、UBTF、IGF - 1、 IGF - 1R、RPS6K和RRN3等减少rRNA和合成,因此miR・424・5p在肌肉中抑 制相关蛋白的合成后导致肌肉萎缩的发生[1°刀,表明miR・424在肌肉萎缩中发挥 正向调节作用。MiR-424/322和miR-503直接抑制Cdc25A基因(一个对cdk2 的激活具有关键作用的磷酸酶)诱导肌肉细胞周期的停滞并参与肌肉细胞的分 化[10—09]。结合上述的研究结果表明,miR・424通过靶向不同的蛋白参与多种 生理过程和疾病的进展。

7 MiR-424的矛盾作用

然而,miR・424在生理、病理过程及肿瘤进展中尚存在一些争议,女口:发 现miR・424在同种肿瘤中的表达水平的呈现矛盾,在同种肿瘤中不同的研究资 料显示不同的作用机制及抑癌和促癌作用之间的矛盾。这可能与miRNA的表 达水平和具体作用与不同的组织、细胞和具体的环境有关,具有组织特异性a, no】。文献42和77资料显示,在结肠癌中,miR-424的表达水平是矛盾的,Ramon 等的研究认为在结肠肿瘤中miR-424的表达水平是降低的,而Oneyama等的 研究发现miR-424在结肠肿瘤中的表达是升高的。在miR・424功能方面,如在 关于EMT过程的研究中,miR・424调节EMT诱导因子TWIST 1和ANAI1参 与EMT的进展,通过分别调节EMT-MET轴和ERK信号通路减弱肿瘤起始细 胞(tumo.initiating cell, TIC)特性后参与一些肿瘤的过程,在此过程的调节中 认为,miR・424对EMT的作用为负性调节作用,在肿瘤的晚期,miR・424在肿 瘤的转移能力中发挥抑制效应;但在肿瘤的早期阶段miR-424的可以通过调节 EMT-MET轴促进肿瘤的转移能力,成为促癌miRNA促进肿瘤的发展[IE。表 明miR-424在不同的背景下可能会发挥不同的效应,miR・424在同一种肿瘤或 病理生理过程中的表达水平可能上升或下降,miR・424在同样的肿瘤中可能发 挥抑癌作用或促癌作用,表明miR・424可能存在环境依赖效应。

结语与展望

综上所述,自从miR-15a和miR-16-l在CLL中的研究报道以来,关于 miRNA参与包括肿瘤过程的研究越来越多,包括肝内胆管癌、结肠癌、子宫 内膜癌和胃癌等。MiR-424通过与与靶基因或蛋白结合后在肿瘤细胞凋亡、增 殖、转移、侵袭和EMT过程、血管形成等方面发挥重要的作用。由于现阶段 一些肿瘤的治疗在临床上已经达瓶颈,例如肿瘤的耐药和化疗抵抗时有报道, 尤其在晚期肿瘤和复发的肿瘤中更多见,而miR・424在肿瘤的治疗可能成为一 个潜在的靶点,在临床上,对肿瘤的精准治疗需求越来越高,而miR・424恰好 具有精准靶向治疗的潜能,因为miR・424在肿瘤中可能同时靶向调节多个不同 的靶基因或蛋白和不同的信号通路而组成miR-424调节网,因此,破译miR・424 调节网络对肿瘤的诊断和治疗可能是非常有用的。miRNA作为特殊的治疗靶 点也为我们的肿瘤的治疗开拓了新的视野,miRNAs的调节也是一个值得研究 者们关注的课题。上述的研究数据也表明miR・424在多种肿瘤和生理病理过程 中发挥不同的效应,越来越多的可靠的证据也表明miR・424在诊断肿瘤和预测 肿瘤的预后和复发方面可能成为可靠的生物标志物和检测生物标志物。但现目 前关于miRNA (包括miR-424)的研究尚不充分,尚存在许多挑战需要克服, 可能在以后的研究中,miRNA会成为肿瘤等疾病的治疗和检测的新的突破点, 故对miR・424的深入研究可能会对肿瘤等疾病的治疗及检测提供重要依据。

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致 谢

籍此论文完成之际,首先要向尊敬的导师李权教授致以最诚挚的 谢意,整个课题的研究工作以及论文撰写都离不开导师的尽心尽力地 指导和谆谆的教诲。导师的谦逊和为人师表深深感染了我,一生受用O

衷心感谢我的导师在在繁忙之际抽出时间在我三年研究生生活、 学习和工作中给予的关怀、帮助;在学习上,激励我努力学习,追求 上进,教导我对待学习须有认真、谨慎、谦虚的态度。在生活中,指 导我学习怎样和病人沟通、交流,使我受益颇多。在此,对恩师李权 老师表达我最诚挚的谢意!

衷心感谢李黎老师、张强老师、费叶青老师、吴悠老师、方徳容 老师、陈源老师、浦永老师、袁弘玉师姐、王宁宁师姐、钱媛师姐、 李智琦师姐、郑璐师姐、穆茂玲师妹在我的临床和科研学习中给予的 指导、帮助与鼓励!

衷心感谢研究生院、临床学院研究生科和妇产科教研室全体老师 对我的指导和大力帮助。感谢师弟师妹在我课题完成过程中给予的真 诚相助!感谢我的家人及所有在我学习期间帮助过我的朋友,他们的 理解和支持是我求学道路上最大的动力,是他们的支持和鼓励才使我 能更潜心进行课题研究,顺利完成学业!

感谢在百忙中抽出宝贵时间参加论文评阅和答辩的专家教授们, 您们辛苦了!祝福母校越来越好,明天更加辉煌!