缓释bFGF的取向纳米纤维膜促进大鼠肌腱再生的实验研究论文

2020年12月14日13:54:28缓释bFGF的取向纳米纤维膜促进大鼠肌腱再生的实验研究论文已关闭评论

缓释bFGF的取向纳米纤维膜促进大鼠肌腱再生的实验研究论文

中文摘要

目的:本研究旨在通过静电纺丝制备缓释bFGF(碱性成纤维生长因子)的取向与随机 纳米纤维膜支架,通过体外成腱分化及体内肌腱再生,探讨制备的聚己内酯纳米纤维 膜支架对损伤肌腱修复的可行性,从而为肌腱组织再生提供了一种有前景的支架。

方法:第一部分,首先利用去溶剂法制作了 BSA纳米微粒(NPs)及负载bFGF的BSA 纳米微粒(bNPs),然后通过静电自组装在纳米微粒上制作壳聚糖外壳。并将bNPs 负载到PCL电纺纳米纤维中制备了负载bFGF的取向与无取向电纺纳米纤维膜支架, 分别检测了纳米纤维膜的载生长因子效率、载生长因子量及体外生长因子释放曲线。 将人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分别接种至各组电纺纳米纤维膜表面,以CCK-8 法及活细胞染色验证纳米纤维膜的细胞毒性与细胞在支架表面的铺展;利用qPCR 与WB检测成腱基因及蛋白的表达。

第二部分,利用动物实验研究了负载bFGF取向纳米纤维膜修复大鼠跟腱2 mm 缺损的效果,将hAMSCs接种到不同组纳米纤维膜支架上培养4d,而后植入到大鼠 跟腱缺损模型中。术后3d、4周和8周,利用MRI观察修复情况;术后4, 8周,利 用qPCR及WB检测体内成腱基因与蛋白表达,组织学观察修复效果。

结果:1、通过去溶剂法制备载bFGF的BSA纳米颗粒,通过静电自组装形成壳聚 糖稳定的纳米颗粒,透射电镜及扫描电镜结果显示纳米颗粒较均匀。包载bFGF的壳 聚糖稳定的纳米微粒直径约146nm,而纯牛血清白蛋白纳米微粒直径约205nmo

2、成功将纳米微粒携载到PCL纤维膜中,制作了载bFGF的不同取向的纤维 膜支架,透射电镜证明了载纳米颗粒的结构,扫描电镜证明了纳米纤维的排列方式。 体外药物释放证实,该支架能够达到持续释放的功能。力学性能测试发现所有取向纤 维的力学强度好于同等无取向纤维膜。体外细胞活性及增殖结果表明,各组支架相 对空白对照组均达到了 80%以上,说明材料对细胞基本无毒,在各组支架上细胞活性 良好。活死细胞染色结果表明细胞形态良好,且与纤维的走向基本一致。培养4天与 1天相比,具有明显的增殖活性。体外腱性基因和蛋白检测发现,载bFGF的取向纳 米纤维膜支架组(aPCL+bFGF)具有最好的成腱细胞能力。

3、然后考察了载bFGF的取向纳米纤维膜支架用于大鼠跟腱缺损模型的修复能 力,成功将不同组PCL-hAMSC构建体植入缺损模型中。植入4周、8周后,通过再 生跟腱的大体形态和解剖图进行宏观评估,通过MRI观察了肌腱的修复情况,载bFGF 取向纳米纤维膜支架(aPCL+bFGF)修复效果最好。qPCR和western blot及免疫荧 光染色结果表明,各组均不同程度表达成腱相关基因和蛋白,其中aPCL+bFGF组表 达量最高,具有较强的成腱能力。组织形态学结果进一步表明,aPCL+bFGF组修复 最好,说明具有缓释的定向纳米纤维支架为促进肌腱愈合提供了一种新的生物学途 径。

结论:1、通过静电纺丝技术成功制备了具有包载bFGF纳米颗粒的取向与无取向纳米 纤维膜支架,并表征了其理化性质。

2、 通过体外实验证实,与其他各组相比,载bFGF的取向纳米纤维膜支架能够 促进成腱相关基因和蛋白的表达。

3、 动物体内修复实验证实,负载bFGF的取向纳米纤维膜支架可促进肌腱的分 化,这些结果验证了利用静电纺丝技术制备仿生取向纳米纤维膜支架的可行性,为肌 腱组织工程支架的选择提供了参考。

关键词:静电纺丝;纤维取向;药物缓释;肌腱组织工程

Controlled delivery of bFGF via nanoparticle-embedded aligned
nanofibrous membranes for improving tendon healing in rat
Abstract

Objective The ideal scaffold not only contains growth factors, but also can functionally simulate the extracellular matrix, thereby regulating cell behavior and tissue assembly. Electrospun nanofiber membranes are widely used scaffold materials. This study aims to prepare slow-release bFGF (basic fibroblast growth factor) orientation and random nanofiber membrane scaffolds by electrospinning, through tendon differentiation in vitro and tendon regeneration in vivo To explore the feasibility of the prepared polycaprolactone nanofiber membrane scaffold for repairing injured tendon, thus providing a promising scaffold for tendon tissue regeneration.

Methods In Chapter 1 of the paper, bovine serum albumin (BSA) nanoparticles (NPs) and bFGF-loaded BSA nanoparticles (BNPs) were prepared by desolvation, and then sei匸assembled on the prepared nanoparticles by electrostatic self-assembly Chitosan shell to stabilize. The diameter of the prepared nanoparticles was measured by DLS and TEM. BNPs were encapsulated in PCL electrospinning fibers to prepare controlled release orientation and random loading growth factor tissue engineering scaffolds, aligned PCL (aPCL), random PCL (rPCL) and bFGF loaded random PCL (rPCL- bFGF) scaffold as a control group, and the morphology and structure of these nanofiber membrane scaffolds were characterized by SEM and TEM. The drug-loading efficiency, drug-loading capacity and in vitro drug release curve of the fiber were measured by ultraviolet-visible spectrophotometer and human bFGF ELISA kit. After inoculating human amniotic mesenchymal stem cells (hAMSCs) onto different groups of PCL nanofiber scaffolds, the cytotoxicity of the scaffolds and the spreading and migration of cells on the fiber scaffolds were investigated by the CCK-8 method and the staining method of living and dead cells With equal ability, the expression levels of genes of different components tendon were detected by qPCR on days 7 and 14, and the expression levels of tenascin were detected by

WB on days 14.

In Chapter 2 of the paper, through in vivo animal experiments, the ability of bFGF-aligned nanofibrous membrane scaffolds to repair the 2 mm defect of the Achilles tendon in rats was investigated. hAMSCs were inoculated onto different groups of nanofibrous membrane scaffolds in vitro. After 4 days of cultivation, Implanted into rat Achilles tendon defect model. After 3 days, 4 weeks, and 8 weeks after implantation, MRI (nuclear magnetic resonance) was used to observe the repair of Achilles tendon defect, and then specimens were collected at 4 and 8 weeks after surgery, respectively. Gene expression level, WB detection of tenascin expression level in vivo, then immunofluorescence staining, histochemical staining, and then observe the repair effect through light microscope.

Results 1. BSA nanoparticles loaded with bFGF were prepared by desolvation method, and chitosan-stabilized nanoparticles were formed by electrostatic self-assembly. The results of transmission electron microscope and scanning electron microscope showed that the nanoparticles were more uniform. The nanoparticles stabilized by bFGF-loaded chitosan had a diameter of about 146 nm, while the pure bovine serum albumin nanoparticles had a diameter of about 205 nm.

  1. The nanoparticles were successfully carried into PCL electrospun nanofibers, and bFGF-loaded nanofiber membrane scaffolds with different orientations were prepared. Transmission electron microscopy demonstrated the structure of nanoparticles, and scanning electron microscopy confirmed the arrangement of nanofibers. In vitro drug release confirmed that the stent can achieve sustained release function. The mechanical property test found that the mechanical strength and Youngs modulus of all aligned fibers are better than the same non-aligned fiber film. The results of in vitro cell viability and proliferation showed that the scaffolds of each group reached more than 80% relative to the blank control group, indicating that the material was basically non-toxic to the cells and the cell viability was good on each scaffold. The staining results of living and dead cells showed that the cells had good morphology and were basically in line with the direction of fibers. Compared with 1 day, culture for 4 days has obvious proliferation activity. In vitro detection of tendon genes and proteins revealed that the aligned nanofiber membrane scaffold group (aPCL + bFGF) carrying bFGF had the best ability to form tenocytes.
  2. Then the ability of bFGF-loaded aligned nanofiber membrane scaffold to repair the Achilles tendon defect model in rats was successfully investigated, and different groups of PCL-hAMSC constructs were successfully implanted into the defect model. After 4 weeks and 8 weeks of implantation, macroscopic evaluation of the general shape and anatomical image of regenerated Achilles tendon was performed, and the repair of tendon was observed by MRI. The bFGF-aligned nanofiber membrane scaffold (aPCL + bFGF) was the best. The results of qPCR, western blot and immunofluorescence staining showed that all groups were expressed into tendon-related genes and proteins to varying degrees. Among them, the aPCL + bFGF group had the highest expression and had a strong ability to form tendons. Histomorphological results further showed that the aPCL + bFGF group had the best repair, indicating that a sustained-release aligned nanofiber scaffold to promote tendon healing provided a new biological approach.

Conclusions 1. The aligned and non-aligned nanofiber membrane scaffolds with bFGF nanoparticles were successfully prepared by electrospinning technology, and their physical and chemical properties were characterized.

  1. Through in vitro experiments, it was confirmed that, compared with other groups, the aligned nanofiber membrane scaffolds carrying bFGF can promote the expression of tendon-related genes and proteins.
  2. It was confirmed by in vivo animal experiments that the aligned nanofiber membrane scaffold loaded with bFGF can improve the healing of autogenous tendon by promoting tendon differentiation. These results verify the feasibility of electrospinning technology in the preparation of biomimetic aligned nanofiber membrane scaffolds, and provide a promising candidate scaffold for tendon tissue engineering.

Keywords: electrospinning; fiber orientation; drug release; tendon tissue engineering

肌腱损伤是由创伤、过度使用及老化引起的肌肉骨骼损伤⑴,临床较常见,因肌 腱的细胞密度较低致氧气与营养供应不足,因此使损伤的肌腱再生一直是骨科领域研 究的热点与难点⑵。治疗肌腱损伤的方法包括缝合、自体移植、同种异体移植、异种 移植与肌腱假体卩同,而近年来利用组织工程修复损伤的肌腱成为了研究热门⑷。

组织工程的3大基本要素中种子细胞具有非常重要的作用,腱细胞、肌腱干细胞 (TSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)与人羊膜间充质干细胞是目前肌腱组织工程应用 较多的种子细胞卩旳。作为一种永久分化的细胞,肌腱细胞在持续传代的过程中会出 现代谢活性降低与张力标志物的缺失⑺叭虽然肌腱干细胞具有较强的增殖能力与张 力表达,但是自体肌腱的有限应用性限制了其临床应用Pi。】。人羊膜间充质干细胞来 源丰富,具有较高的定分化能力与愈合能力,作为种子细胞在肌腱组织工程中应用较 广泛Mi]。

支架作为组织工程中另一个重要的组成部分,可为种子细胞的增殖分化提供良好 的生存空间与营养物质的运输。理想的支架材料应具有良好的机械性能,以及与可模 拟细胞外基质的成分和形貌M2]。近年来利用静电纺丝技术制作的纳米纤维支架,被广 泛应用于肌腱组织工程[1114]。纳米纤维支架具有诸多优点,例如:优秀的生物相容性, 较高的纵横比与孔隙率,较小的孔径等215。并且研究己证实,支架的形貌特征对细 胞活动(包括附着、增殖和分化)有着重要影响"冏。例如,Yin et aK19]观察了静电纺 丝纳米纤维形貌对人肌腱干/腱原分化的影响;Zhang etaP°]的体外实验发现,静电纺 丝纳米纤维形貌可影响人肌腱干细胞的分化,其中排列的支架可诱导其腱性分化,而 随机的支架可诱导其成骨分化;Yin et a,】]将随机排列与取向排列的纳米纤维支架植 入跟腱损伤动物模型中,发现取向排列的支架有利于形成成熟的腱样组织,而随机排 列的支架有利于软骨生成与随后的骨化。

另外,在组织工程中生长因子的作用同样重要,是不可或缺的。虽然干细胞分化 为韧带/肌腱成纤维细胞(肌腱形成)的特定环境与信号组合还不明确,但是研究证实包 括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)、转化生长因子B、血小板衍生生长因 子等在内的多数生长因子均可促进干细胞分化为韧带/肌腱成纤维细胞[22'26]o其中的 碱性成纤维细胞生长因子可与支架的纳米形貌及机械刺激发挥协同作用[27亠]。但是生 长因子的半衰期较短,限制了其在愈合部位发挥持续作用。将生长因子负载到电纺纤 维中来模仿天然细胞外基质作为持续释放生长因子仓库的功能,可达到持续释放生长 因子的作用卩2现。

本研究通过观察hAMSCs在纳米纤维膜支架上的体外成腱分化及对大鼠跟腱缺 损模型的修复作用,验证bFGF协同PCL(聚己内酯)纳米纤维支架在肌腱组织工程中 的可行性,以期为肌腱组织再生提供一种有前景的支架。

第一部分 聚己内酯静电纺纳米纤维膜支架的制备、表征及成腱
定向分化研究

前言

制备理想的支架来修复受损组织并充分再生其生物学功能,一直是组织工程领域 研究的热点。仅由单纯生物材料制作的支架并不能有效调控细胞的行为与组织组装。 虽然生长因子可以诱导细胞与组织工程的生物反应和组织分化,但游离状态下的生长 因子在体内的生物活性极其不稳定,因此,为保持生长因子生物活性的稳定,可将生 长因子引入支架中使其持续可控的发挥作用,减少不良反应,提高生物利用度更-39]。 所以目前迫切需要开发支架中生长因子输送的替代方法。

为保留不同支架的生物活性与生长因子的缓释,研究者已开发了不同的给药系统 肌41],例如:有研究利用肝素结合位点将碱性成纤维细胞生长因子负载在支架表面, 但这样却限制了生长因子的持续释放与长期活性舵]。将生长因子负载到支架中可增加 其释放时间,利用静电纺丝技术可制备直径100nm-5|Lim的三维支架,且该支架具有 高纵横比、高孔隙率与小孔径的特点⑷],这些特点使静电纺丝纤维膜在药物输送方面 脱颖而出屮】。纳米纤维膜支架除了具有生物相容性好、纵横比高、孔隙率高和小孔尺 寸等特点外[20,45],其形态特征还可影响细胞的活动【46,47]。因而利用静电纺丝技术制备 的纳米纤维膜被广泛应用于肌腱组织工程中郎-50]。

1.1实验材料与方法

1.1.1实验方法

本部分中,拟通过去溶剂法将bFGF负载牛血清白蛋白(BSA)纳米微粒中,通 过静电自组装的方式使纳米微粒外层包裹壳聚糖,得到具有壳聚糖稳定的BSA纳米 微粒(bNPs),其中的壳聚糖既可稳定纳米粒又可充当bFGF的二次屏障,很好地保 护其生物活性;随后将该纳米微粒与PCL (聚己内酯)溶液混合电纺成纳米纤维膜, 以有效携载bFGF并确保其生物活性。另外,拟通过调节接收桶的转速获得了负载

bFGF的不同取向排列纳米纤维膜支架,制备过程如图l-lo

11负载壳聚糖稳定的bFGF纳米颗粒与纳米纤维膜支架的制备示意图。

Figure 1-1 Schematic of the preparation of chitosan-stabilized bFGF-loaded nanoparticles and

the nanofiber membrane scaffolds containing the nanoparticles.

1.1.2实验材料

ii实验主要试剂

Table 1-1 Main reagents of the experiment

试剂名称 规格 生产厂家
聚己内酯 Mn=80,000 Sigma-Aldrich,USA
N-N二甲基甲酰胺(DMF) 分析纯 Aladdin, USA
二氯甲烷(DCM) 分析纯 Aladdin, USA
牛血清白蛋白(BSA) 分析纯 Sigma, USA
低分子量壳聚糖 分析纯 成都科龙化工试剂厂
乙酸 分析纯 成都科龙化工试剂厂
乙醇(CH3CH2OH) 分析纯 成都科龙化工试剂厂
bFGF 细胞培养 MCE, USA
LG-DMEM/F12 培养液 细胞培养 Gibco, USA
FBS 细胞培养 Gibco, USA
PBS 细胞培养 Solarbio, China
Collagenase Type II 细胞分离

11

Sigma, USA
Dnase I 细胞分离 Sigma, USA
Trypsin 细胞分离 Gibco, USA
人bFGF酶联免疫试剂盒 释药检测 博世德生物工程有限公司
活死细胞染色试剂盒 细胞检测 Solarbio, China
CCK-8 增殖检测 Dojindo, Japan
Trizol qPCR TaKaRa, Japan
RNAiso Plus 试剂盒 qPCR TaKaRa, Japan
PrimeScript RT 试剂盒 qPCR TaKaRa, Japan
SYBR Green Premix 试剂盒 qPCR TaKaRa, Japan
DEPC 水 qPCR Solarbio, China
异丙醇 分析纯 成都科龙化工试剂厂
氯仿 分析纯 成都科龙化工试剂厂
BCA试剂盒 蛋白检测 Solarbio, China
RIPA裂解液 western blot Solarbio, China
蛋白酶抑制剂(PWSF) western blot Thermo, USA
SDS凝胶配置试剂盒 western blot Thermo, USA
电泳液干粉 western blot Solarbio, China
电转液干粉 western blot Solarbio, China
甲醇 分析纯 成都科龙化工试剂厂
PVDF 膜 western blot Solarbio, China
兔抗人-actin单克隆抗体 western blot Abeam, USA
兔抗人SCX单克隆抗体 western blot Abeam, USA
兔抗人Tmnd单克隆抗体 western blot Abeam, USA
鼠抗兔FITC荧光二抗 western blot Proteintech,China

1.1.3实验主要仪器

12实验主要仪器

Table 1- 2 Main instruments of the experiment

仪器名称 仪器型号 生产厂家
电子天平 FA2004 上海舜宇恒平科学仪器有限公司
自动磁力搅拌器 DF-101S 上海凌科实业发展有限公司
静电纺丝机 FM1108 北京富友马科技有限责任公司
真空干燥箱 DZF-6021 上海精宏实验设备有限公司
扫描电子显微镜(SEM) Ultra 55 蔡司光学仪器公司
透射电子显微镜(TEM) H-700H 日本日立公司
电子万能试验机 TFW-58 上海拓丰仪器科技有限公司
动态光散射仪 Nicomp 380 上海奥法美嘉生物科技有限公司

1.1.4牛血清白蛋白(BSA)纳米颗粒的制备

参考文献冋中的方法,通过去溶剂技术制备牛血清白蛋白纳米颗粒。简而言之, 先将BSA(100 Mg)溶解在10mL蒸馆水中,在连续搅拌下,用微量注射泵以2mL/min 的速度,将40mL乙醇泵入1%的BSA溶液中,搅拌过夜。然后加入40mL壳聚糖溶 液(1 mg/mL,溶于1%醋酸溶液),以0.5mL/min的速度泵入乙醇。将新形成的混合物 再搅拌8h,得到壳聚糖稳定的牛血清白蛋白纳米粒(NPs)o这些纳米颗粒通过 12000rpm离心20min,以蒸惚水/乙醇混合溶液(体积比为1:1)清洗纳米颗粒3次后收 集白色沉淀,将其储存起来以备将来使用。

1.1.5制备负载载人碱性成纤维生长因子(bFGF)BSA颗粒

除引入bFGF夕卜,还采用上述工艺(1.1.4)制备了包载bFGF的壳聚糖稳定的牛血 清白蛋白纳米微粒(bNPS)o使用前将bFGF以50 mg/100mL的浓度保存在温度・20°C 的磷酸盐缓冲液中,并在BSA溶液中加入160U L的bFGF原液(80昶)。

1.1.6不同取向PCL纳米纤维膜的制备

四组纳米纤维膜分别为空白取向纤维膜支架(aPCL),空白非取向纤维膜支架 (rPCL)包载bNPs的取向纤维支架(aPCL+bFGF),包载bNPs的非取向纤维支架 (rPCL+bFGF)。这些纳米纤维支架的制备方法如下描述。

首先,纺丝溶液的配制:

  • 称量100mg的纳米颗粒,将其分散于5ml DMF中;取1.45g (190g/L)的 PCL聚合物溶液,加入7.5ml DCM中溶解;将两种溶液混合,室温下搅拌过夜,获 得负载bFGF纳米微粒的纳米纤维膜(bNPs/PCL)。
  • 将8g的PCL置于2.5ml DMF和7.5ml DCM的混合溶液中溶解,室温下 搅拌过夜,获得单纯的PCL纳米纤维膜。

电纺液条件:设置纺丝电压为(13 土 l)kV、接收距离为18 cm、电纺速度为lml/h, 将电纺溶液通过微量注射泵速度推注到23G喷头处,随后通过调整滚筒的转速分别 为20RPM和1800RPM,从而获得非取向和取向排列的纳米纤维膜。

12材料表征

  • 动态光散射仪(DLS)

将NPs和bNPs以适合的浓度分散于乙醇中,通过动态光散射仪测量粒径大小。

  • 透射电子显微镜(TEM)

纳米颗粒TEM表征:将NPs和bNPs以适合的浓度分散于乙醇中,沉积在碳膜 铜网上后真空干燥72 ho在场发射透射电镜下(150kV)观察样品。

在纳米微粒静电纺丝纤维TEM表征:将电纺aPCL+bFGF、rPCL+bFGF纤维膜 置于铜网上室温干燥,TEM(150kV)下观察。

  • 扫描电子显微镜(SEM)

将制备的所有纳米纤维膜接收后并室温干燥,在其表面进行喷金处理,SEM下 (20.0kV)观察其形貌。采用Image Pro Plus 6.0软件分析扫描电镜图像,测量纳米纤维 膜直径及取向。

  • bNPsbFGF的载药效率

离心后收集上清液,采用人bFGF酶联免疫试剂盒检测bFGF的丢失量,计算bNPs 的载药效率。

1.2.5力学性能

将已经经过真空干燥后的PCL纳米纤维膜取出后,将其沿着纤维的走向裁剪成 大小约2cmX5cm的样品编号保存后待检测,随后将万能力学试验机的夹具夹在样品 的两侧,留有足够的检测区域,操作的过程中动作尽量轻柔,避免破坏纤维膜。将纤 维膜置于万能力学试验机进行拉伸速度为5mm/min.加载力为10N的拉伸测试,并 利用计算机绘制应力■应变曲线。

1.3体外药物释放

将样品aPCL+bFGF、rPCL+bFGF分别置于10mL试管中,两种样品的质量均为 6mg,其中含bFGF 400 ng,每种样品3份。将2mLPBS加入各个试管中,于1, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 35 d时,洗弃管中的PBS,更换为新鲜的PBS。 利用人bFGF酶联免疫试剂盒检测生长因子的释放量,通过标准曲线计算对应各时间 点的生长因子累计释放量。

1.4体外细胞活性和增殖实验

人胎盘来源的间充质干细胞(hAMSCs)是取自成年健康产妇的胎盘组织并利用胰 酶・11型胶原酶消化法提取的Hi]。将直径1.5 cm的纳米纤维膜支架切片置于24孔培养 板中,紫外下灯消毒8h后接种细胞,细胞接种密度为2x104,并加入新鲜培养基, 每组5复孔,每2d换液一次。

根据制造商的说明(北京索莱宝)用活/死染色测量细胞活力。细胞接种1, 4d后 弃掉培养基,PBS清洗3次,随后添加2(iM钙黄绿素・AM及4(iM碘化丙碇(PI)的 混合液,置于37。。、5%CO2的培养箱内培养15min,荧光显微镜下观察活死染色情 况。通过CCK-8法检测细胞增殖情况,培养1、3、5、7d后收获的支架■细胞构建体 在10%(v/v)CCK-8溶液中37°C> 5%CO2孵箱中孵育2h。随后将每孔的100(iL培养 液转移到新的96孔板上,采用680型微型平板阅读器(美国Bio-Rad公司)检测450nm 波长处的吸光度值。

1.5体外成腱能力

1.5.1定量聚合酶链反应(qPCR)

为探讨不同取向纤维支架对成腱分化的影响,将hAMSCs接种于不同支架表面 (2xl04 cells/cm2)J§养液中培养7天或14天后,按照Trizol试剂盒说明书操作规范提 取细胞总RNA 5=3),以相同条件下培养于单纯孔板上的hAMSCs为对照。将提 取的RNA样品利用PrimeScript RT试剂盒反转录为cDNA,完成PCR扩增反应后设 计并合成引物,引物序列列于下表中,反应条件为40个循环。/lactin作为参照管 家基因,然后利用2从at)法计算目的基因的相对表达量阿,最终结以对照组表达量 的倍数表达。

1.5.2 蛋白质免疫印迹法(western blot)

接种7,14d后胰蛋白酶消化细胞,收集细胞于1.5ml EP管中,预冷的PBS洗涤 后1000r/min离心4min,离心环境为4°C ;加入裂解液RIPA与PMSF冰上孵育半小 时后8000r/min离心8min,离心环境为4°C;取上清液后加入蛋白上样缓冲液煮沸变 性5min, -80°C低温下保存。利用BCA法检测蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳,随 后将样品以湿法转移至PVDF膜上,加入脱脂牛奶的TBST缓冲液在37°C环境中孵 育2h;分别加入兔抗人SCX、7WW 蛋白抗体孵育24h,环境温度为4°C;按照每次 lOmin的时间以TBST清洗洗涤PVDF膜,共洗涤3次;再加入鼠抗兔荧光二抗于避 光条件下孵育60min,环境温度为4°C ;同样按照每次lOmin的时间以TBST洗涤PVDF 膜,共洗涤3次;曝光显影。

1.6数据统计分析

采用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析,数据以平均值土标准差(mean土 SD)表示,除非另有说明,每个实验至少重复3次,严0.05提示差异存在统计学意 义。

1.7结果

1.7.1纳米颗粒及静电纺丝纤维的表征

外层包裹壳聚糖BSA纳米微粒(NPs)及携载bFGF的BSA纳米微粒的粒径大 小见图(l・2b、c),两种微粒对应的平均直径分别为(205±40)nm, (146土32)nm。 优于储存于PBS中会致BSA颗粒粒径变小,所以携载bFGF BSA纳米微粒的粒径较 外层包裹壳聚糖BSA纳米微粒小,由此获得了 bFGF在bNPs中较高的载药率(90.22 土3.47%)。实验设计的双层屏障作用有效保证了生长因子的生物活性,最大限度地 生长因子在电纺过程中与有机溶剂的接触。透射电镜下可见纳米微粒表面光滑且大小 均一,粒径分布较均匀(图l-2a> d) o另外,纳米颗粒完全分布在纳米纤维中,在 纤维基质中被完好的包裹(图l-2c> f) o

12纳米颗粒及纳米纤维的形貌分析。a> d分别为NPsbNPsTEM图,be分别为通过

DLS测得的对应纳米颗粒粒径分布图;cf分别为纳米纤维的TEM图。

Figure 1- 2 Morphological analysis of nanoparticles and nanofibers(r) and (d) are TEM images
of NPs and bNPs, respectively, and (b) and (e) are particle size distribution charts of
corresponding nanoparticles measured by DLS;(c) and(f) are TEM images of nanofibers

1.8不同取向纳米纤维的表征

图1-3为四种不同PCL纳米纤维膜支架的扫描电镜图片及直径和取向度分布图。 四种纳米纤维(aPCL+bFGF、rPCL+bFGF、aPCL、rPCL)的平均直径分别为129土 33 nm, 194 + 73 nm, 239+ 146nm, 146土47nm,可以看出纳米颗粒的载入对纤维直 径的影响较小,差异具有统计学意义。4种纳米纤维膜表面光滑,但较单纯的PCL (图 l-3c. d)纳米纤维相比,仍有小部分纳米颗粒从纤维表面凸出,未被纳米纤维完全 包裹,但(图l-3f)显示纳米颗粒完全分散于纤维中。但是纳米微粒的加入并没有影 响纳米纤维的直径与分布。根据纳米纤维的走向分布图可以得到,取向度受到滚筒转 速的影响,高转速下,纤维的取向度更好(图l・3a、e> c、g),而低转速的情况下,
得到的就是杂乱无序的纤维(图l・3b、f、d、h) o

以上结果表明,已成功制备了不同取向载bFGF的纳米颗粒的PCL纳米纤维膜, 这一结构有利于保持bFGF的生物活性及持续释放的作用o

1-3纳米纤维的SEM图及其对应的直径分布图和取向分布图:aeaPCL+bFGF, bf

rPCL+bFGF, cg aPCL, dhrPCL il分别为对应的纤维直径分布;mp分别 为a-d对应的纤维取向分布。

Figure 1-3 SEM image of the nanofiber and its corresponding diameter distribution and
orientation distribution: a, e are aPCL+bFGF, b, f are rPCL+bFGF, c, g are aPCL, d, h are rPCL;

i-1 respectively is the fiber diameter distribution corresponding to a-d; m-p is the fibe orientation
distribution corresponding to Rd

19体外药物释放

图1-4为各种PCL纤维膜中bFGF的体外释放曲线,结果显示,取向纳米纤维膜 的释放速率快于无取向纳米纤维膜,分析原因可能为纤维的排列方式影响了药物的释 放。同时由于多层屏障的作用,bFGF在整个过程中呈现较平顺的缓慢释放,无明显 的突释。与单纯负载bFGF的支架相比Q],双重保护的纳米颗粒在保持生物活性和持 续释放上更有效,作用时间更长。生长因子释放曲线显示,在35d的时间内取向与无 取向纳米纤维膜中可缓慢释放bFGF,生长因子的释放总量约20%,并且取向纳米纤 维膜的总体释放量优于无取向纳米纤维膜。

14取向A)和无取向R)bFGF的纳米纤维体外药物累积释放百分比曲线。药物包载

率约为9022±347%。其中A代表aPCL, R代表rPCLo

Figure 1- 4 Curves of cumulative drug release in vitro for aligned (A) and (R) random nanofibers
with bFGF. The drug loading rate was about 90.22 3.47% Where (A) represents aPCL and (R)
represents rPCL

1.10力学性能

图1・5为测试结果,电纺aPCL, aPCL+bFGF, rPCL(c)和rPCL+bFGF纤维膜的 拉伸强度分别为 4.48±0.33 MPa、3.35 土0.22 MPa、0.74±0.25 MPa 和 0.49土0.31 MPa。 这些数据还表明,aPCL+bFGF与aPCL相比,拉伸强度有所下降,而电纺rPCL+bFGF、 rPCL纤维膜的拉伸强度不如取向纤维好,但伸展性要优于前者。

aPCL aPCL-n rPCL rPCL-n

Strain (%)20 40 60 80 100 120 140

15电纺纳米纤维aPCL (a) , aPCL+bFGF (b) , rPCL(c)rPCL+bFGF的应力■应变曲

线。

Figure 1- 5 Stress-strain curves of electrospun nanofibers aPCL (a), aPCL + bFGF(b),rPCL(c),

and rPCL + bFGF

1.11体外细胞活性和增殖实验

从图1・6可以看出,细胞接种于支架上培养Id后,各组细胞无明显差异,与空

白对照组比细胞也无明显差异,显示人羊膜间充质干细胞可在PCL纳米纤维支架上 良好的生长,说明PCL纳米纤维支架具有良好的生物相容性。接种第3天,负载bFGF 的取向纳米纤维(aPCL+bFGF)表面细胞增殖最好,该效果一直持续至接种的第5, 7天。分析原因可能为:取向排列的纳米纤维膜可引导细胞的增殖,而bFGF的持续 释放也可促进细胞的增殖,二者协同发挥作用而促进了细胞的增殖。另外在负载bFGF 的纳米纤维膜支架中,由于支架的取向排列和生长因子的释放导致人羊膜间充质干细 胞增殖放缓,也说明了细胞因诱导而抑制增殖。

l-7hAMSCs在各组纳米纤维膜支架培养第1天、4天后,活细胞染色的荧光显微照片。

Figure 1- 7 Fluorescence micrographs of live cells stained after hAMSCs were inoculated on
different nanofiber membrane scaffolds on days 1 and 4

图1・7中荧光显微照片显示,细胞接种于各组纳米纤维膜上后可良好的生长,形 态呈梭形,具有较好的活性,几乎无死细胞。提示制备的纳米纤维膜与生物活性因子 不影响细胞的生长。另外还显示,细胞可沿着纤维膜的走向生长,但在无取向纳米纤 维膜上则表现为杂乱无序的生长,而且培养1天与4天相比,细胞的增殖具有显著的 差异,细胞的生长更趋于纤维的走向。

1.12体外成腱分化能力

1.12.1定量聚合酶链反应(qPCR)

l-3qPCR反应的引物序列设计。

Table 1- 3 Primer sequences utilized for real-time polymerase chain reaction.

Genes 5!-3! Primers Product size(bp) Reference sequence
Collal Forward AAAGATGGACTCAACGGTCTC 181 NM 000088.3
  Reverse CATCGTGAGCCTTCTCTTGAG    
Col3al Forward TCCAGGAGGACCAGGAAGTGATG 172 NM 000090.3
  Reverse GCCACCTCGTTCTCCATTCTTACC    
TNC Forward TAGTGAAAAACAATACCCGGGG 90 NM 002160.4
  Reverse TGACATCTTTCACCTCGATCTG    
BGN Forward GAACATGAACTGCATCGAGATG 174 NM001711.6
  Reverse ATTTTGTTGTGGTCTAGGTGGA    
sex Forward ACCGCACCAACAGCGTGAAC 102 NM 001080514.3

 

  Reverse

Forward

CCAGGCGCAGCGTCTCAATC

AATATTCAGAAGCGGAAATGGC

TNMD     97 NM_ 022144.3
  Reverse ACATTTTTGAAGACCCACGAAG      
FN1 Forward AATAGATGCAACGATCAGGACA 82 NM_ _001306129.1
  Reverse GCAGGTTTCCTCGATTATCCTT      
DCN Forward GACAACAACAAGCTTACCAGAG 163 NM_ _001920.5
  Reverse TGAAAAGACTCACACCCGAATA      
B -actin Forward AAGTTCAACGGCACAGTCAAGG 139 NM_ _001256799.3
  Reverse CGCCAGTAGACTCCACGACATA      

l-8hAMSCs在不同支架上体外培养7天和14天后肌腱相关基因的mRNA的表达水平。所 有培养均在正常培养基中进行。数据以mean±SD表示,n=5,<0.05

Figure 1- 8 mRNA expression levels of tendon-related genes after hAMSCs were cultured on
different scaffolds for 7 days and 14 days in vitro. All cultures are carried out in normal medium
The data is expressed as mean SD, compared with control, n = 5, <0.05

细胞形态已经被证明对干细胞分化至关重要"55]。细长的形状促进了 rBMSCs 的伸长分化[56-60]o为了进一步验证伸展过程中细胞形态对hAMSCs向肌腱系细胞的 调控作用,利用定量逆转录聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质印迹法(WB)测定hAMSCs 在不同支架上培养7天和14天后肌腱相关基因和蛋白的水平。

I型胶原和III型对肌腱纤维组织再生有重要作用Wil。SCX和TNMD是肌腱的特 异性转录因子,对肌腱的发育至关重要mi。此外,BGNFN1DCN和7WC是肌腱 中调节胶原原纤维组织和功能的重要蛋白多糖[込刖。女口(图1・8)所示,在不同的纤维 膜支架上培养7天后,aPCL+bFGF上的伸长细胞产生了更高水平的肌腱相关基因的
mRNA表达。与aPCL相比,DCNSCX和TNMD分别上调约2.5倍、2倍和3倍。 与rPCL+bFGF相比,DCNSCX和77VMD分别上调约3倍、2倍和2.5倍。尽管在 不同支架的细胞分化基因差异在减小,但在第14天仍然观察到相似的表达趋势。此 外,在第14天,SCX和77WD在aPCL+bFGF上的蛋白表达也高于在aPCL和 rPCL+bFGF上的表达(图8)。

总之,无论是基因表达还是蛋白表达都证实了 aPCL的纤维取向可以调节细胞形 态,进而促进hAMSCs的伸长分化,除此之外,包载有bFGF的取向纤维(aPCL+bFGF) 具有更多取向排列的胶原纤维,显著促进肌腱分化。

1.12.2蛋白质免疫印迹法(western blot)

1-9 (A)(B):hAMSCs在不同支架上培养14天后,Western blotting检测SCX
77VMD的表达;(C)(D):根据图像定量分析SCY和的表达,并归一化为价必紡1

所有培养均在正常培养基中进行。数据表示为mean±SD, n=5, ^<0.05o

Figure 1- 9 (A) and (B): After culturing hAMSCs on different scaffolds for 14 days, Western
blotting was used to detect the expression of SCX and TNMD; (C) and (D): quantitative analysis of

the expression of SCX and TNMD according to the images and normalized to p-actin All cultures

are carried out in normal medium The data are expressed as mean SD, n = 5, * p <0.05

1.13讨论

多年来,牛血清白蛋白(BSA) —直作为研究BMP・2、VEGF、bFGF等砂呦载 体,由于血清白蛋白具有价格便宜、可生物降解吸收且降解产物安全无毒、无细胞毒 性及免疫原性等优点,用于输送生长因子的优势明显3-70]。然而,仅由牛血清白蛋白 组成的纳米颗粒不能很容易地满足肌腱或者韧带修复的临时要求,因为这通常需要数 月以上的时间。即使这些纳米粒子由PLGA、PLLA等高分子聚合物涂覆稳定,也很 难满足释放的要求。此次实验中,负载纳米颗粒的纳米纤维膜支架为bFGF提供了多 重保障,有效避免了 bFGF生物活性的丧失,达到持续缓释的作用,同时纤维的取向 对仿生肌腱的结构至关重要,取向纳米纤维膜模拟肌腱的微结构,bFGF的持续缓释 在功能上模拟了细胞外基质的功能,两者协同作用,最初刺激hAMSCs细胞增殖, 随后促进其向肌腱样细胞分化。

aPCL+bFGF的释放速率略高于rPCL+bFGF的,如图所示。两者之间没有显著的 差异,说明纳米纤维的取向对两种不同的纤维膜生长因子的释放没有显著的影响。为 了保持bFGF的生物活性,延长其血浆半衰期,这种多屏障结构达到了这种效果。体外 药物释放结果也证实了 bFGF体外释放长达35天,仍然还有约80%的bFGF可以继 续释放。细胞增殖、细胞活性及体外成腱基因及蛋白的表达也证实了 bFGF仍然保持 其生物活性。载bFGF的纳米纤维膜支架(aPCL+bFGF)的细胞活性及增殖与其他各 组支架相比具有显著差异,说明了 bFGF与取向纤维膜两者协同作用更有利于促进 hAMSCs向腱样细胞的分化。根据应力应变曲线图所示,aPCL+bFGF纳米纤维膜的 最大机械拉伸强度与aPCL相比有所下降,而电纺rPCL+bFGF> rPCL纤维膜的拉伸 强度不如取向纤维好,但伸展性要优于前者。这种结果可能是因为纤维取向导致不同 组支架的机械力学不同,取向纳米纤维膜支架的韧性及力学性能更仿生肌腱的结构与 功能。

韧带/肌腱含有两种主要的细胞外基质蛋白■[型胶原与III型胶原,该两种胶原对 纤维组织的修复于再生至关重要SI。本研究中,不同组纳米纤维膜支架在7天、14 天时I型和III型胶原表达均上调。此外,在非胶原细胞外基质蛋白中,纤维连接蛋 白(FN1)DCNTNC双聚糖(BGN)SCX, 77VW对调节初始细胞附着和存活非常 重要"2], BGNDCN7WC是一种蛋白多糖,它的主要作用是调节韧带/肌腱发育和 修复过程时的生长因子活性,并影响胶原纤维的组装。SCX和:™D是肌腱的特异 性转录因子,对肌腱的发育至关重要⑹。细胞接种14天时,人羊膜间充质干细胞在 不同支架上SCX和77VMD蛋白均有表达,且各组有显著差异。人羊膜间充质干细胞 在不同支架上ECM基因的表达均有所上调表明,释放的bFGF最初使hAMSCs保持 活跃的增殖并发生腱性分化。纤维的排列方式对间充质起到干细胞的张力分化起到正 反馈作用,本实验结果表明与单纯定向纤维膜(aPCL)和包载bFGF的杂乱无序的纳 米纤维膜支架相比,包载bFGF的定向纳米纤维膜(aPCL+bFGF)可更好地促进 hAMSCs的张力分化。这也进一步验证了 bFGF联合取向纳米纤维膜支架两者能够协 同作用促进hAMSCs的腱性分化。

1.14结论

1、 成功制备了负载bFGF的BSA纳米颗粒与静电自组装形成壳聚糖稳定的纳米 颗粒。

2、 成功制备了不同取向的载bFGF的纳米纤维膜支架,所制备的支架具有缓释 性能,对细胞无毒性,取向纳米纤维膜优于无取向纳米纤维膜。

3、 体外腱性基因和蛋白检测发现,载bFGF的取向纳米纤维膜支架组 (aPCL+bFGF)成腱细胞能力优于其它各组,具有显著差异。

第二部分 载bFGF的纳米纤维膜支架用于跟腱缺损模型的修复 、八 ・亠

肌腱为致密的结蹄组织,主要负责关节的运动和稳定。由于受到高生理负荷的影 响,这些组织通常会受到损伤,由于它们的细胞密度和血管性较低,无法获得最佳愈 合⑴]。肌腱移植物的外科治疗通常是必需的,但这种治疗伴随着强度降低、关节僵硬、 修复断裂以及供体部位发病率的并发症[74]。组织工程使韧带/肌腱具有与天然组织相 似的力学和功能特性,可以预防这些并发症"VS。因此,设计的韧带/肌腱支架应具 有合适的机械性能,并尽可能地模仿天然细胞外基质的结构与功能,并为细胞附着、 增殖和基质沉积提供有利的条件,以及影响细胞命运所需的生物功能。因肌腱组织工 程支架尤其是纳米纤维膜支架能模拟细胞外基质的特点,所以将其应用于修复缺损具 有一定的可行性,其具有高孔隙率对引导细胞的生长、营养的扩散、肌腱细胞的分化 等很重要。bFGF、VEGF等生长因子是目前诱导性肌腱修复的常见选择,因此需要 一种能够保持其生物活性且能持续释放的载体。

在第一部分已经制备岀具有上述功能的肌腱组织工程支架,因此本部分将考察载 bFGF的取向(aPCL+bFGF)和无取向(rPCL+bFGF)纳米纤维膜支架用于跟腱缺损的 修复能力。并分别术后4周、8周后将大鼠跟腱取出,通过核磁共振(MRI)、再生肌 腱的宏观评估、组织学检查,评价缺损部位的修复情况。

2.1实验材料与方法

2.1.1实验方法

将所制备的纳米纤维膜支架与人羊膜间充质干细胞复合培养4天后植入到大鼠 跟腱2mm直径缺损中,动物试验过程示意图如图(2・1)所示。

21人羊膜间充质干细胞与不同纳米纤维膜支架体外复合培养4天后,构建体移植到大鼠跟
腱缺损模型中的不意图。

Figure 2-1 Schematic diagram of human amniotic mesenchymal stem cells co-cultured with
different nanofibrous membrane scaffolds in vitro for 4 days, and the construct was transplanted
into a rat Achilles tendon defect model.

2.2.2实验材料

21实验中应用的主要试剂

Table 2-1 Main reagents of the experiment

试剂名称 规格 生产厂家
戊巴比妥钠 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
聚维酮碘 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
无水乙醇 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
二甲苯 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
中性树胶 组织染色 国药集团化学试剂有限公司
分化液 组织染色 国药集团化学试剂有限公司
返蓝液 组织染色 国药集团化学试剂有限公司
HE染液 组织染色 北京索莱宝科技有限公司
天狼猩红染液 组织染色 北京索莱宝科技有限公司
masson染液套装 组织染色 北京索莱宝科技有限公司

22实验中应用的主要仪器

Table 2- 2 Main instruments of the experiment

仪器名称 仪器型号 生产厂家
脫水机 JJ-12J 武汉俊杰电子有限公司
包埋机 JB-P5 武汉俊杰电子有限公司
病理切片机 RM2016 上海彳来卡仪器有限公司
冻台 JB-L5 武汉俊杰电子有限公司
组织摊片机 KD-P 武汉俊杰电子有限公司
烤箱 GFL-230 武汉俊杰电子有限公司
载玻片   北京索莱宝科技有限公司
正置光学显微镜 Nikon Eclipse E100 日本奥林巴斯
成像系统 Nikon DS-U3 日本奥林巴斯
核磁共振 BioSpec 70/20USR 德国布鲁克
相机 Canon 日本佳能
组织匀浆机 Miltenyi 德国美天旋
离心机 Thermo Scientific 美国赛默飞

2.2材料准备

分别将aPCL、rPCL、aPCL+bFGF、rPCL+bFGF纳米纤维支架剪成直径约lcm 的圆片,分别置于48孔板中。紫外灯消毒8 h后再以含1 %双抗的PBS灭菌2 h, PBS 清洗3次,相应孔中加入200(iL培养基浸湿0.5ho每孔接种2xl04hAMSCs,培养4 天后待用。

2.3动物试验

挑选体重200-230 g的成年雄性SD大鼠75只,随机分5组处理:(1)空白缺 损组,(2)aPCL, (3)rPCL, (4)aPCL+bFGF, (5)rPCL+bFGF,每组 15 只。第 2、3、4、 5组将hAMSCs(l X 104cells/cm2)接种于纳米支架表面培养4d,体外扩增细胞数。

跟腱缺损模型是根据先前报道的方案建立的,稍作修改"I%腹腔注射戊巴比妥 钠(36mg/kg)麻醉后消毒大鼠左后肢。随后,在这些肢体的皮肤上做了一个20 mm的 纵向切口。在腓肠肌内侧肌腱作2mm大小的缺损,用4・0缝线(中国金环)将 PCL-hAMSCs构建体植入缺损处缝合,外层包裹2mm纳米纤维膜支架以牢靠固定, 未植入构建体的作为阴性对照(缺损)。对照组(正常)为大鼠右侧后肢。皮肤切口用2・0 线缝合(中国金环)。术后以聚维酮碘涂抹消毒伤口,放回笼中自由喂养。术后4周和 8周处死大鼠,对再生的跟腱进行评估,如下所示。

分别在术后4周、8周取样。先准备高浓度戊巴比妥钠溶液,腹腔注射过量戊巴 比妥钠麻醉后处死大鼠,取材。褪毛,切开皮肤后钝性分离肌腱和皮下组织,切取修 复部位肌腱组织,无菌水清洗后置于40g/L多聚甲醛溶液固定,分别进行组织学观察 及免疫荧光染色。

24磁共振成像(MRI)

术后3d(0周)、4周和8周分别利用MRI扫描大鼠跟腱,每组5只。使用表面线 圈的序列为:矢状位 T2 加权成像(REARE, TR=4000ms, TE=45ms, FOV=30X30 mm, 矩阵大小=256X256,层厚=0.5 mm,层间距=0 mm)o

根据MRI图像,在跟骨后上角上方随机选取20个点,测量跟腱前后径。采用 ImagePro软件,在T2加权图像的基础上,将腱内病变面积比表示为跟腱区域内高、 中信号面积(AHS)与总纵面积(AT)的比值。同时还测量了腱内病变强度与背景的比值。

2.5再生肌腱的宏观评估

术后4周和8周,大鼠被实施安乐死,手术动物根据先前研究的宏观评分系统进 行临床评分,稍作修改画]。暴露跟腱复合体,并用相机拍摄。随后,切取腓肠肌和跟 骨之间的全长肌腱复合体。然后测量每组5只大鼠肌腱的重量和厚度,并与相应的右 后肢正常肌腱直接比较。

2.6组织学检查及免疫荧光染色

将不同时间获取的标本(每组n=5)置于10%甲醛中室温固定24h,梯度乙醇脱水 后石蜡包埋,切片,分别进行HE、Masson染色和天狼猩红染色。利用改良的组织学 评分系统对再生组织的质量进行评估画]。在缝合区拍摄所有断面的显微照片。在光镜 下随机选择的三个视野进行检查。

2.7基因与蛋白表达

采用定量反转录聚合酶链反应(qPCR)和蛋白质免疫印迹法(WB)检测肌腱相关基 因和蛋白的表达,分析再生组织的愈合质量。

组织样品使用液氮研磨3次,在2g/L的Trizol试剂和lg/L的RIPA裂解缓冲液 中裂解,组织匀浆后12000 r/min离心5min。收集上清液,分别提取总RNA和蛋白 质。RNA和蛋白质的分离和分析遵循方法1.12.1和1.12.2中描述的步骤。

2.8数据统计分析

采用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析,数据以平均值土标准差(mean土 SD)表示,除非另有说明,每个实验至少重复3次,p<0.05提示差异存在统计学意 义。

2.9结果

2.9.1跟腱缺损模型的外科手术步骤

22动物造模手术步骤:(町暴露跟腱、b)不缝合造成缺损、c)跟腱缝合、d) PCL-hAMSCs

构建体植入和(e)皮肤缝合。

Figure 2 2 Animal modeling surgery steps: (a) exposed Achilles tendon(b) defect caused by no
suture, (c) Achilles tendon suture, (d) PCL-hAMSCs construct implantation, and (e) skin suture.

2.10再生肌腱的宏观评估

Figure 2- 3 The general shape and anatomy of regenerated Achilles tendon at 4 and 8 weeks after
23术后不同时间点再生跟腱的大体形态和解剖图。(A)(B)分别为术后4周和8周再 生跟腱的大体形态,(C)为术后4周和8周再生跟腱的解剖图。

surgery. (A) and (B) are the general morphology of the regenerated Achilles tendon at 4 and 8
weeks after surgery, and (C) are the anatomical images of the regenerated Achilles tendon at 4
and 8 weeks after surgery.

为了确定纳米纤维膜支架在缺损肌腱再生中的安全性和有效性,采用己建立的大 鼠跟腱缺损模型进行体内评价"79]。将hAMSCs在PCL纤维膜(径向宽10 mm,轴向 长5 mm)上培养4天,扩增细胞,然后卷成PCL-hAMSCs结构(图2・1)。将构建体缝 合到跟腱缺损2mm处(图2-2),并观察4周和8周。

肉眼观察跟腱的颜色、表面结构、厚度和粘连的存在是评估跟腱愈合的最简单和 直观的方法“so]。健康的肌腱颜色亮白,表面不粗糙,与周边其他组织分界清(图C・ 正常)。而术后肌腱呈玫瑰色或淡黄色,表面粗糙,与肌腱旁、筋膜、皮下组织甚至 皮肤均有明显粘连,尤其是rPCL-hAMSCs组和rPCL+bFGF-hAMSCso此外,通常可 以观察到手术后肌腱明显增厚(图)。愈合8周后,出现新的腱样组织(图),aPCL和 aPCL+bFGF-hAMSCs组损伤有效再生,与周围组织的粘连可忽略不计。相反,其他 组仍然存在明显的粘连(图)。改良的宏观评分系统[呵(图4F(A))的数据显示,术后4 周和8周,aPCL+bFGF-hAMSCs的宏观评分几乎与修复前相当,明显高于其他手术 组(rPCL、aPCL 和 rPCL+bFGF・hAMSCs 组)。提示 aPCL+bFGF-hAMSCs 组对肌腱缺 损有较好的愈合效果。

此外,量化愈合肌腱的厚度和重量以评估肿胀(图4F(B)和(C))。与正常对照组相 比,除缺损组(去除跟腱,不植入支架)外,术后4周肌腱厚度均明显增加。术后8周, 修复组和aPCL+bFGF-hAMSCs组的厚度明显减少,且明显低于其他手术组。在第8 周,aPCL和aPCL+bFGF-hAMSCs组的体重也有类似的降低。因此,可以得岀结论, 与rPCL+bFGF-hAMSCs相比,aPCL+bFGF-hAMSCs结构导致了较弱的溶胀,这可能 是由于aPCL+bFGF纤维的定向排列所致。尽管如此,值得注意的是,即使在术后8 周,rPCL+bFGF・hAMSCs组和aPCL+bFGF-hAMSCs组的厚度和重量仍明显高于正常 组。

2 4再生跟腱的矢状位T2加权MRI扫描结果。A)正常跟腱结构;B)买验组在选定的时
间点(3天、48周)再生的跟腱结构(红色箭头表示肌腱区域,蓝色箭头表示植入的构建体),再
生跟腱结构(红色箭头表示肌腱区域,蓝色箭头表示植入构建体)。(C)AHSAT的比值分析。(D)
肌腱内病变强度的比值以背景为依据,并将结果归一化到正常组水平。E)平均前后径分析。数
据表示为平均值土标准差,n=3, ^<0.05o注:缺损组0周时出现明显收缩,跟腱与周围组织区
分不清,AHS/AT、强度比、前后径不能量化。

MRI是评估软组织病理,特别是评估跟腱的愈合反应和退变的一种强大的非侵 入性成像形式1。因此,我们使用MRI矢状位T2加权成像来观察大鼠跟腱缺损的 再生情况。健康跟腱呈现岀低信号、均匀信号和清晰的边缘(图2・4A■正常)。此外, 通过连续横断面成像可以观察和区分跟腱的主要成分。术后3天(0周),腱内病变及 其周围组织明显隆起,轮廓不规则,呈不均匀高信号或不连续信号,表明大鼠跟腱缺 损模型建立成功,缺损区存在炎症反应(图2-4B)o术后4周,仍有明显的隆起,但高 信号区域逐渐减少,尤其是rPCL+bFGF-hAMSCs组和aPCL+bFGF-hAMSCs组(图 2-4B)o具体地说,尽管前后尺寸相似(图2-4F), aPCL+bFGF-hAMSCs组的AHS/AT 值和强度比明显低于rPCL-hAMSCs组和rPCL+bFGF-hAMSCs组(图2-4D和E),应 该注意的是,缺损组的前后尺寸与检测到的宏观肌腱厚度不同(图2-4E)o这种差异可 能归因于通常由多种因素引起的高强度信号表达,如出血、水肿和渗出,这些因素影 响了尺寸测量剛。术后8周,rPCL+bFGF・hAMSCs组和缺损组仍存在边界不清、高 信号的信号区和前凸,而aPCL+bFGF-hAMSCs组的信号强度(图2・4B、D和E)和大 小(图2・4E)明显减小。尽管如此,aPCL+bFGF-hAMSCs组的再生腱质量仍低于正常 跟腱。

212体内成腱分化能力

2.12.1实时定量聚合酶链反应(qPCR)

25移植8周后再生腱的肌腱相关基因mRNA转录水平。基因表达水平被归化到内参基因

p-actin,并且相对于 rPCL+bFGF 组。数据表示为 Mean±SD, n=5, *p<0.05o

Figure 2- 5 Tendon-related gene mRNA transcription levels of regenerated tendons 8 weeks after
transplantation Gene expression levels were normalized to the internal reference gene p-actin and
relative to the rPCL + bFGF group.The data is expressed as Mean SD, n = 5, * p <0.05.

8 weeks after transplantation; (C) and (D) quantitative analysis of SCX and TNMD expressions based on the images and normalized to p-actin  The data is expressed as Mean SD, n = 5, <0.05.
Figure 2-6 Western blotting images (A) and (B) of tendon-related proteins of regenerated tendons

26移植8周后再生腱的肌腱相关蛋白的Western blotting图像(A)(B) (C)(D)根据 图像定量分析SCXTNMD的表达,并归一化为价必加。数据表示为MeaniSD, n=5, *p<0.05o

不同的PCL-hAMSCs结构对肌腱再生的贡献也可以通过各种肌腱相关基因和蛋 白的表达来评估。如(图2・5)所示,术后8周,aPCL+bFGF-hAMSCs组肌腱相关转 录因子基因(SCX、77WD)和细胞外基质基因(CollalCol3al, BGNDCNFN1 7WC)的表达明显高于rPCL+bFGF-hAMSCs组,但各手术组的表达均明显低于正常跟 腱。

与mRNA表达水平相似,aPCL+bFGF-hAMSCs组SCX和TNMD的蛋白水平明 显高于rPCL+bFGF-hAMSCs组(图2-6),表明aPCL+bFGF-hAMSCs构建可以促进体
内肌腱分化和更成熟的新生肌腱的再生,这可能是由aPCL+bFGF-hAMSCs轴向排列

的胶原纤维触发的。

2.13组织学检查及免疫荧光染色

2.13.1免疫荧光染色

    •tow WfaB
IDjim   ZDy=n*   20|>rn
     

 

Cl   * 丝      
         
  ‘ *

20prn 1

    20|jm Mum

 

    Mw»      
      20|jm   20miti

27术后8周各组再生肌腱的免疫荧光结果。(A)免疫荧光染色观察I型胶原(Collal)表达, 红色显示I型胶原,蓝色显示细胞核;(B)免疫荧光染色观察III型胶原(Col3al)表达,红 色显示III型胶原,蓝色显示细胞核;(C)免疫荧光染色观察纤维连接蛋白(FN1)表达;红 色显示纤维连接蛋白,蓝色显示细胞核;(D)免疫荧光染色观察细胞连接素(77VC)表达,红 色显示细胞连接素,蓝色显示细胞核。

Figure 2-7. Immunofluorescence results of regenerated tendons in each group at 8 weeks after
surgery. (A) Collagen type I alpha 1 (Collal) immunofluorescence results, collagen type I alpha 1
(red), nucleus (blue); (B) collagen type III alpha 1 (Col3al) immunofluorescence results,
collagen type III alpha 1 (red), nucleus (blue) ); (C) fibronectin (FN1) immunofluorescence
results; fibronectin (red), nucleus (blue) (D) tenascin C (TNC) immunofluorescence results,
tenascin C (red), nucleus (blue).

qPCR与WB已经分别在基因和蛋白层面已经证明了纳米纤维膜支架体内成腱的 能力,免疫荧光进一步验证各组支架在蛋白层面的成腱能力。如图是术后8周各组再 生肌腱的免疫荧光结果。(A)图是免疫荧光染色观察I型胶原(Co〃刃)表达,红 色代表I型胶原,蓝色代表细胞核;(B)图是免疫荧光染色观察III型胶原(Co/3刃) 表达,III型胶原显示红色,细胞核显示蓝色;(C)图是免疫荧光染色观察纤维连接 蛋白(FM)表达,纤维连接蛋白显示红色,细胞核显示蓝色;(D)图是免疫荧光 染色观察肌钙蛋白C (77VC)表达,肌钙蛋白C显示红色,细胞核显示蓝色。各组免 疫荧光的定量结果(如图7),结果表明与正常组相比,aPCL+bFGF组无论是I型胶原、 III型胶原还是纤维连接蛋白、肌钙蛋白C表达量均高于其他各组,差异具有显著性。

2.13.2组织形态学

为了进一步验证各组纳米纤维膜支架对跟腱缺损的修复能力,进行了组织形态学 分析。HE、天狼猩红和MT染色结果及相应的组织学评分如(图2・8)所示。健康跟 腱呈波状致密的ECM,纤维平行排列,排列成排的细胞(主要包括腱母细胞和腱细胞) 沿纤维排列,具有细胞核拉长、异染色核和细胞与ECM比值(C/M)低的特点(图2® 正常)。术后8周,除了 aPCL+bFGF组外,其余组纤维排列不规则,可见炎性细胞浸 润,C/M明显增加,再生组织明显过度。炎症在所有治疗中都明显消退。aPCL+bFGF 支架组细胞外基质密度高,胶原纤维含量多,C/M较低,结果优于rPCL+bFGF支架 组。天狼猩红染色显示各手术组中,aPCL+bFGF组中I型胶原、III型胶原的定量分 析结果优于其他各组,但比正常组低,差异具有统计数意义。MT染色进一步显示胶 原组织重组的组织形态学变化。术后8周新生的组织有成熟胶原纤维(MCF,染红)和 未成熟胶原纤维(ICF,染蓝)两种类型。aPCL+bFGF组的MCFs明显多于rPCL+bFGF 组,与正常组相当。然而,aPCL+bFGF组的MCFs高度致密排列,而rPCL+bFGF的 MCFs无序且疏松,表明aPCL+bFGF结构提供了与自体肌腱几乎相当的重塑性能。

此外,组织学评分(图2・8)也证实了组织形态学结果,aPCL+bFGF组在术后8周 再生肌腱的质量明显好于rPCL+bFGF组和aPCL组,接近正常组。

Normal rPCL aPCL 『PCL+bFGF aPCL+bFGF

2-8 (A)正常对照肌腱和再生肌腱的代表性组织学染色(包括HE、天狼猩红和Masson染色

(MT))O蓝色箭头指示的是胶原纤维,红色箭头指示的为纤维细胞,黄色箭头指示的为残余材料。

(B)术后8周对再生跟腱进行组织学评分。数据表示为平均值土标准差,n=5, ^<0.05o

Figure 2-8 (A) Representative histological staining of normal control tendons and regenerated
tendons (including hematoxylin-eosin (HE) staining, Sirius scarlet staining, and Masson^
trichrome staining (MT)). Blue arrows represent collagen fibers, red arrows represent fibroblasts,
and yellow arrows represent residual material. (B) Histological scoring of regenerated Achilles
tendon 8 weeks after surgery. The data are expressed as mean SD, n = 5, <0.05

2-8 (B)术后8周对再生跟腱进行组织学评分。

Figure 2-8 (B) Histological scoring of regenerated Achilles tendon 8 weeks after surgery.

2.14讨论

排列良好的纤维支架模拟肌腱生理性ECMs的化学成分和形态结构,为肌腱组织 工程的理想支架阴列。产生与自身肌腱相当的愈合质量。本研究结果验证了静电纺丝 技术制备载生长因的定向排列仿生肌腱支架的可行性,为肌腱缺损的有效再生提供了 一种有前途的仿生支架。广泛的研究表明,支架的形貌可以影响细胞的形状,从而进 一步调节细胞的分化,甚至调节细胞的后续功能妙隔。本研究中,通过调节静电纺丝 机的参数得到不同取向的具有缓释生长因子的纳米纤维膜支架,通过体外和体内 aPCL+bFGF-hAMSCs结构上都观察到了更高的肌腱相关基因和蛋白表达,证实了 aPCL+bFGF定向排列缓释生长因子支架为促进伸长分化提供了合适的微环境。

众所周知,成纤维细胞样细胞,如腱细胞或腱母细胞,能够分泌I型胶原,通过 施加牵引力,使胶原分子沿其细胞形状重组和排列陷91]。体内实验表明,在 aPCL+bFGF-hAMSCs结构上的高张力分化显示了比在rPCL+bFGF-hAMSCs结构上 更成熟和排列的胶原基质(图2-8-MT)。我们认为取向排列缓释材料非常适合于肌腱组 织工程,因为它们可以充分利用支架仿生的特性,形成与天然材料相似的分级结构。 Orretal^证明,与未排列的支架相比,排列的电纺支架可以增加肌腱调节蛋白的表 达,并且在体外种植hASCs 28天后,在整个厚度上都显示出排列的胶原纤维。I型 胶原与III型胶原的表达水平反映了胶原纤维的组成。本实验组织学结果与且qPCR 和western blot结果一致,即aPCL+bFGF-hAMSCs组I型胶原含量最高。

这项研究有两个局限性。首先,这项研究中使用的肌腱缺损模型不同于使用人类 的模型。但是,这种动物模型在文献中已经建立得很好了[9习,因而选用此模型。其次, 这是一个样本量较小的研究,观察期和评价工具都是有限的。然而各组间差异显著, 结果令人满意。本研究为具有缓释的定向纳米纤维弄支架促进肌腱愈合提供了一种新 的生物学途径。

2.15结论

1、 成功将不同组PCL-hAMSC构建体植入缺损模型中。

2、 载bFGF取向纳米纤维膜支架(aPCL+bFGF)修复效果最好。

3、各组均不同程度表达成腱相关基因和蛋白,其中aPCL+bFGF组表达量最高, 具有较强的成腱能力。

全文结论

本论文通过利用静电纺丝技术与组织工程研究的需求相结合,采用生物相容性良 好的PCL (聚己内酯)高分子材料,成功制备了具有缓释的载bFGF的取向纳米组织 工程支架。表征了纳米纤维膜支架的理化特点及生物相容性等,通过检测体外成腱分 化及体内肌腱再生的能力,对各组支架进行评价。

1、 成功制备了负载bFGF的BSA纳米颗粒与静电自组装形成壳聚糖稳定的纳米 颗粒。

2、 成功制备了不同取向的载bFGF的纳米纤维膜支架,所制备的支架具有缓释 性能,对细胞无毒性,取向纳米纤维膜优于无取向纳米纤维膜。

3、 体外腱性基因和蛋白检测发现,载bFGF的取向纳米纤维膜支架组 (aPCL+bFGF)成腱细胞能力优于其它各组,具有显著差异。

4、 成功将不同组PCL-hAMSC构建体植入缺损模型中。

5、 载bFGF取向纳米纤维膜支架(aPCL+bFGF)修复效果最好。

6、 各组均不同程度表达成腱相关基因和蛋白,其中aPCL+bFGF组表达量最高, 具有较强的成腱能力。

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综述

引言

在20世纪80年代末,Langer^]提出“组织工程”这一概念,目的是为了使受损 组织和器官得以修复,提高和改善医疗健康水平。由于人口老龄化和运动损伤发生率 的增加,肌肉骨骼疾病已成为世界卫生组织主要的健康问题之一⑵。近年来,组织工 程作为一种治疗骨科和运动医学相关疾病的方法得到越来越多的支持3]。与传统方 法相比,组织工程学可提供更有效修复骨骼肌肉疾病的治疗方法。

支架材料是组织工程化韧带的3大要素之一,其性能直接决定移植物重建效果。 良好的支架既要具有良好的生物相容性,又要能够吸附种子细胞,使其在支架上增殖 分化,并且能够吸附外源生长因子或者自身分泌生长因子。组织工程中所要求的支架 材料在性能要求上与一般生物材料是有差别的,既要有良好的生物降解性,又要保证 其降解所产生的降解产物对机体无毒无害⑻。此外,良好的支架材料在组织工程中应 该是与细胞外基质组成成分相类似,例如去有机质的天然骨是再生骨的理想支架材 料,而胶原蛋白是软骨、韧带等组织构建所使用的主要支架材料旳0】。文章就组织工 程中目前常用的支架材料进行综述,重点介绍石墨烯在组织工程中的应用。

1资料和方法

1.1资料来源 检索中国生物医学文献数据库(CBM)、中国知识资源总库(CNKI)系 列数据库、中文科技期刊数据库、PubMed、Engineering Village> Web of Science等 数据库1990至2018年发表的文献。

1.2纳入与排除标准

纳入标准:文章所述内容与组织工程支架材料密切相关,同一领域中论点、论据 可靠的文献。

排除标准:文章内容与本文相关性不强,发表时间过早,参考价值不高;不是最 新研究或已有更新的研究结果。

1.3数据提取 共检索到文献1 592篇,其中中文文献830篇,英文文献762篇,排除与 研究目的的相关性差及内容陈旧、重复的文献1 524篇,纳入68篇符合标准的文 献进行综述。

2结果

2.1天然材料 最初记载的现代组织工程材料文献中,大部分使用的是自然来源的 生物材料Hi]。这些天然材料来源广泛,并且它们的可降解生物聚合物,如蛋白质(例 如胶原、丝、纤维蛋白原、弹性蛋白)和多糖(例如几丁质、纤维素、糖胺聚糖)等,与 细胞外基质具有显著的相似性,具有良好的生物学特征,并且无毒、具有低免疫排斥 反应。此外,具有良好骨传导性的磷酸钙(CaP)等生物吸收性填充剂(如B ■磷酸三钙、 羟基磷灰石)又具有良好的生物相容性、可吸收性,这些材料常被用于组织工程多种 类型的支架Mo

在任何给定的组织工程应用中,支架材料均要满足应用的条件,必须具有良好的 机械性能、大小适宜的孔隙结构、合适的降解时间,以及能够产生理想的组织修复效 果。天然材料大多数无毒,生物相容性、细胞亲和性及亲水性都较好,并且其分解产 物可被完全吸收,但其缺点是机械强度较差,单一使用很难满足组织工程的需要,并 且天然支架材料的降解时间不确定性和质量重复性差等特点限制了其广泛的应用。尽 管天然材料的应用范围受其固有结构的限制,但在天然材料基础上进行相应的加工修 饰,或者利用某些天然材料独特的优势已取得了许多不错的进展。下面主要介绍胶原 蛋白、蚕丝蛋白、壳聚糖及其衍生物。

2.1.1胶原蛋白 胶原蛋白家族占人体蛋白总量的25.33%,是人体中最丰富的蛋白 质〔BE,由大量细胞外基质蛋白构成,其中哺乳动物体内含量较多。目前胶原蛋白在 韧带重建中已得到了广泛应用,因为在韧带重建手术中,不论移植物选择是自体移植 还是同种异体移植,胶原蛋白均是移植物的主要成分。自体移植面临着供体来源有限、 供区容易发生感染等缺点,同种异体移植也面临着免疫排斥风险,基于以上各种原因, 寻求一种替代性的修复材料成为一种趋势,包括使用人工韧带,而这种合成韧带主要 由胶原蛋白构成购。胶原蛋白具有良好的特性,所以应用较为广泛[17]。目前已有28 种不同类型的胶原蛋白分子阴,其中I, II, III和IV型研究最多[19]。由于小牛III 型胶原蛋白来源丰富,且临床应用较为成功,已被广泛用于制作组织工程支架〔20-21]。

Nehrer等㈤从猪软骨提取I型胶原蛋白和II型胶原蛋白,然后制成多孔支架,分别在 两种类型支架上接种犬软骨细胞并培养3d、1周和2周,组织学结果显示,在各时 间点具有球形形态细胞的百分比显著高于软骨细胞形态,说明胶原蛋白可为细胞的黏 附和生长提供良好环境。同时将其植入体内后不仅不会引起炎症或毒性反应,而且该 支架还可被机体吸收,其降解速度与组织再生速度相一致,说明胶原蛋白支架应用于 组织修复中具有一定的可行性。胶原蛋白也存在着一些不足之处,由于胶原材料大多 来源于动物组织,移植入体内后会引起免疫反应,而且可能存在免疫排斥、外源性病 毒感染的风险㈡]。因此研究者在胶原蛋白的基础上,通过基因工程技术研发出了重组 胶原蛋白。重组胶原蛋白是利用基因工程技术开发重组系统来生产的人类序列胶原, 通过使用各种宿主细胞比如转基因蚕、烟草、小鼠和酵母等生产重组胶原蛋白。相对 于动物胶原蛋白而言,重组胶原蛋白具有安全性高、亲水性好、免疫排斥较低等优点, 因此存在较为广泛的应用〔24]。

2.1.2蚕丝蛋白 蚕丝蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白,主要由丝素蛋白 和丝胶蛋白组成,其来源决定了蚕丝蛋白的结构和性质。由于家蚕易于培育和生产, 故家蚕是生物材料应用中最常见的蚕丝蛋白来源©I。但蚕丝并不是唯一的天然蚕丝来 源,除了桑蚕以外,还有其他几种昆虫和动物产生丝绸,包括蜜蜂、黄蜂、蚂蚁a】、 贻贝[27】、蜘蛛等。丝素主要由3种氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)组成;丝胶是 一种易溶于水的物质。在韧带重建中,因为蚕丝蛋白具有超微物理构造和特殊的多孔 结构,同时具有很好的细胞和组织相容性,种子细胞在具有这些特性的支架结构中增 殖良好陈],因此在韧带重建中应用得比较多。有研究发现将成骨细胞接种于丝素蛋白 支架内之后,丝素蛋白膜在体外可诱导骨组织生长[29】。蚕丝蛋白为基质支架设计提供 了多种多样的组织工程需求卩0】。组织工程学的出现,增加了对多种生物材料组合的需 求,以在体内植入之前支持体外组织的发展卩I】。由于丝素在提纯过程中常会发生丝胶 残余,因而存在生物相容性问题。随着技术的改进,目前丝胶残存发生概率降低。丝 胶蛋白的存在是丝素生物材料使用过程中的关键问题,因为丝胶蛋白与超敏反应和生 物相容性差有关;丝胶被去除后,免疫应答反应也有显著降低。丝素在体内几个月的 时间内可降解,主要通过异物反应介导的蛋白水解活性增加来达到降解。然而,降解 过程取决于许多因素,包括植入部位、该部位的机械性能、丝的加工条件及丝支架的 物理特性(即孔隙率、孔径大小、表面积尸2】。Pillai等用静电纺丝技术制备了不同 配比(2 : 1, 3 : 1和4 : 1)的丝素蛋白和聚乙烯醇混合电纺纳米纤维支架,使用原子
力显微镜表征支架的形态学(图2),将混合纳米纤维垫用体积分数25%戊二醛蒸气交 联,交联的纳米纤维在模拟体液中培养35 d后,显示缓慢降解20%的质量;在纳米 纤维中,3 : 1的丝素蛋白与聚乙烯醇共混物显示出均匀的形态和纤维直径,将人原 代半月板细胞传代培养并接种到混合纳米纤维支架上,发现3 : 1的丝素蛋白与聚乙 烯醇纳米纤维支架可更好地支持细胞附着和生长,显著增加DNA和胶原含量,结果

表明丝素蛋白与聚乙烯醇比例为3 : 1的纳米纤维支架适合于半月板细胞增殖。

图注:图中A为丝素蛋白支架,B为聚乙烯醇支架,C2  1配比的丝素蛋白/聚乙烯醇纳米纤 维支架,D3  1配比的丝素蛋白/聚乙烯醇纳米纤维支架,E4  1配比的丝素蛋白/聚乙烯 醇纳米纤维支架。
2原子力显微镜观察丝素蛋白与聚乙烯醇以不同比例混合的纳米纤维支架

2.1.3壳聚糖及其衍生物壳聚糖是由甲壳素通过脱乙酰化后形成的天然高分子聚 合物,在自然界中广泛存在,其含量仅次于纤维素。壳聚糖的具体形成过程是:由 N■乙酰葡萄胺和葡萄胺通过脱乙酰化的B・l, 4糖昔键而形成,是一种具有线性结构 的多糖,与软骨基质糖氨多糖结构相似。由于壳聚糖是一种带正电荷的聚合物,因此 能够很好地吸附细胞和其他物质,与之结合。例如:带负电荷的生物分子或DNA可 与壳聚糖的阳离子链复合,提高壳聚糖支架的生物活性,或保护DNA等分子规避热 失活和核酸酶降解的机会[34];阴离子葡萄糖胺聚糖如肝素与壳聚糖形成离子复合 物,赋予壳聚糖材料特定的生物学功能W],其在许多组织的生长中发挥积极作用。壳 聚糖的降解产物是氨基葡萄糖单体,对人体无毒无害,因此其具有良好的生物相容性。 此外,壳聚糖还具有甲壳素的优良特征:良好的吸水性、亲水性,无免疫排斥反应等。 但壳聚糖分子内和分子间含有大量的氢键,因此其结晶度高,此弱点限制了其广泛的 应用和发展。通过一些改性的方法可适度改善壳聚糖的性能於殉,国内外常用的改性 方法有:聚合物接枝壳聚糖、小分子接枝壳聚糖、交联壳聚糖等。基于壳聚糖良好的 生物相容性、低免疫原性、可降解性等优良特性,作为能够替代细胞外基质的支架材 料,具有其自身的优越性,在医学领域的应用越来越多,也取得了很多不错的成绩。 另外壳聚糖本身可促进血管内皮细胞生长,成骨分化及其角质细胞的增生,此外壳聚 糖的阳离子结构可能是壳聚糖具有一定抗菌性能的原因之一,由于阳离子氨基与阴离 子微生物壁的相互作用,可抑制细菌的生物合成或破坏穿过细胞壁的蛋白物质转运, 干扰细菌微生物的正常代谢卩7-覘。在骨、软骨及韧带等组织工程中,壳聚糖已被用作 生长因子载体和支架材料[39'41]o Boukari等阳发现天然衍生壳聚糖制成的多孔支架具 有生物可降解性,其机械和生物学性能良好,间充质干细胞容易附着到含有壳聚糖的 支架上,与间充质干细胞搭载后可显著促进细胞的成骨分化,并且在体内研究显示该 支架具有良好的组织相容性。壳聚糖支架是从生理pH值溶液中制备的,这样能提供 有利的环境,降低掺入具有变性风险的蛋白质,具有适合快速进入临床试验的机械性 能和生物学特性。

2.1.4海藻酸盐 海藻酸盐是在海藻中发现的一种生物聚合物,形态较易改变,制成 的产品有水凝胶、微球、微胶囊、海绵、泡沫和纤维等⑷]。可通过化学和物理方法修 饰海藻酸盐,以调节其生物降解能力、机械强度、凝胶性质和细胞亲和力等功能。关 于海藻酸盐作为骨组织工程材料的应用已进行了大量研究屮-45]。Almeida等跑开发了 一种多孔仿生形状记忆藻酸盐支架,使用碳二亚胺化学共价交联藻酸盐,引入形状记 忆特性,使用定向冷冻技术改变支架的结构。这种排列的孔隙结构改善了支架的机械 性能,并且促进了更高水平的硫酸化糖胺聚糖和胶原沉积,同时胶原蛋白的复合促进 了干细胞与支架的黏附,促进了整个构建体中软骨组织更均匀的沉积。将II型胶原蛋 白并入支架,促进更大的细胞增殖,更高的硫酸化糖胺聚糖和胶原积累,并且与用I 型胶原功能化的支架相比组织强度更高。这项研究结果表明,支架结构和组成可在形 状记忆海藻酸盐支架中制定,以指导干细胞分化并支持软骨组织的发育。此外还有研 究发现藻酸盐对细胞没有毒性,具有良好的生物相容性,因此适用于多种生物医学应 用。

2.2合成可生物降解材料 合成生物可降解的聚合物材料较天然材料有更多的优 势,其材料质地均一,与机体发生免疫排斥反应性较低,是一种可靠的组织工程支架 材料来源Hl另外由于高分子材料具有基本的结构单元,具有简单而清楚的结构和特 性。目前合成的可生物降解支架材料主要包括聚乙二醇、聚酯、聚B羟基丁酯、聚 氨基酸、聚Y瓮基丁酯等,研究最多的还是脂肪族聚酯,如聚乳酸郎]、聚乙醇酸及其 共聚物眇52]。生物可降解材料具有良好的可降解性、组织相容性、生物相容性,无细 胞毒性,可塑性好,无致热源性,无致畸形致突变,这类材料都能体内代谢并最终被 完全吸收。部分高分子材料还可作为植入型药物释放体系的载体材料、神经导管、临 时血管移植物及人工皮肤支架。但是这些合成的高分子支架材料疏水性强、细胞黏附 能力差,不具备组织工程化韧带要求的生物力学特性[刑。此外,与天然生物材料相比, 其亲和力较差。因此,合成的生物可降解材料仍需要通过表面修饰法、化学改性法及 杂化改性法等对其表面进行改造,以增加其对于细胞的黏附能力和促进细胞生长分 化。有研究将合成生物降解材料与天然生物材料结合做成混合支架,不仅改善了天然 生物材料的力学性能,而且提高了合成生物降解材料的促进细胞黏附和增殖能力QI。 Bach等冋采用温冷冻干燥方法将聚乙烯醇与胶原制成复合支架,将前交叉韧带细胞 种植到该复合支架上培养,24 h后通过扫描电镜观察到细胞贴附支架生长,表明这种 复合支架具有良好的生物相容性和组织相容性,能够成为体外培养前交叉韧带细胞的 理想支架。但其力学性能还远远达不到人韧带的力学标准,有待进一步改善。

2.3生物复合材料目前的研究表明任何一种单一材料的生化特性无法满足组织工 程韧带的要求,因此,将不同材料通过一定的手段复合在一起,使其优缺点相互互补, 进一步提高各自的优良特性,已成为目前支架研究的一种趋势。目前新兴的复合材料 结合了单一材料的特点,并且将各自的特点整合,使其功能更加全面。复合支架材料 的发展具有吸引力,因为两种或多种材料的优点可结合在一起,更好地满足宿主组织 的机械和生理需求,因而复合支架材料成为当前组织工程研究的重点。

生物复合材料是由2种或2种以上不同物理化学性质的材料复合而成的新材料, 一般由基体材料和增强材料组成[刑。生物复合材料不仅能保持原有组分的部分优点, 而且可产生原组分所不具备的更优特性。可降解高分子材料聚乳酸、聚羟基乙酸等的 降解产物会使局部pH降低,引发炎症,同时力学性质也较差。因此,有学者将聚乳 酸与轻基磷灰石、胶原等混合制成复合材料,能够在一定程度上改善聚乳酸的一些不 足之处,有望获得性能更好的组织工程的支架材料[旳。胶原■蚕丝复合支架的机械承 受强度与正常前交叉韧带数值接近网。疏水性的聚乙内酯和亲水性的聚羟基乙酸共聚 物组成的混合支架,可调节支架的亲水性、机械强度和降解速率。将超细聚乳酸纤维 和脱胶后编织好的微纤维蚕丝支架制成支架,可促进祖细胞的黏附、增殖、分化等功 能,提高韧带中胶原及基质蛋白表达量,增强支架材料的机械强度卩5]。胶原■糖胺聚 糖复支架使支架细胞快速增殖,并表达韧带成纤维细胞表型芮57]。相比于单纯壳聚糖 支架而言,壳聚糖■藻酸盐复合支架不仅力学性能明显提高了,而且力学强度显著增 高,并且这种结构也相对稳定,活体中减少了蛋白质变性的可能性歩-59]。文章重点介 绍石墨烯与不同物质复合制备的复合支架材料,在组织工程中的应用和最新研究进 展。

石墨烯作为目前世界上最薄的新型纳米材料20],在组织工程中已得到了广泛应 用,并且也取得了突破性的进展。石墨烯是以sp2杂化轨道而形成的单层二维平面晶 体,其厚度只有0.335 nma-62],最早是由Konstantin和Andre分离并发现的,因其良 好的稳定性、导电性、导热性、机械强度,所以近几年在组织工程学、生物医学等领 域应用广泛[63'66]o单纯的石墨烯质地较薄,很难塑形,并且其生物相容性和水溶性并 不是特别理想,所以很多研究者通过对石墨烯进行改性和修饰来提高它的性能。常用 的方法通常是将石墨烯与其他物质复合,进一步完善它的特性。Wang等旳的研究发 现,MC3T3-E1细胞在涂有石墨烯的聚对苯二甲酸乙二醇酯表面增殖速度明显提高, 并且该复合材料有助于加速细胞的成骨分化,对腱■骨愈合有一定的促进作用。通过 进一步的实验发现:用石墨烯和聚对苯二甲酸乙二醇酯复合制成的人工韧带性能较单 纯的石墨烯或者聚对苯二甲酸乙二醇酯人工韧带更好,表现出较高的骨平均矿物沉积 速率和更好的生物力学性能。尽管很多研究者通过复合技术制备了纳米羟基磷灰石・ 聚酰胺支架,但其性能、对细胞的黏附能力、促进细胞增殖能力还需要进一步提高。 Zhang等阴将石墨烯材料进一步与纳米羟基磷灰石/聚酰胺支架复合,进而使原有的遵义医科大学硕士学位论文 葛振 支架性能得到进一步改善。并且将鼠骨髓间充质干细胞种植在改支架上,发现骨髓间 充质干细胞在经过石墨烯修饰后复合支架上的黏附能力和增殖速度均较单纯纳米羟 基磷灰石■聚酰胺支架好,并且与成骨相关的基因和蛋白表达水平也明显提高,提示 石墨烯有促进间充质干细胞成骨分化的能力。组织工程化韧带支架材料见表lo

表1构建组虹提第用的支架村料

         
粋生   来滋泛、轴监收、忸的竝惊僭、机岐修龍担' 较好的担匿和軾沖 有!3荣删曲番、做实E斥的凤哇 [24-25]
  垂过垢白 僭、具有离好的主物相眷啓、无哥啓. 离好的沁 组怨相眷修、 裁余垃旅总番蜀生物相眷習问墨 [34-35]
    生物相眷骨、可控的蛊料啓、稔、姒莢、毅厝作用 力学啓施杀 [42-44]
  遇期磁 生物招甞骨好 力学骨能杀 [45 . 47-

[53. 55]

    生物相眷骨好,呈商镰扶或水塚肢扶,SWttiW好 力学啓施杀
  附皓白 岚好的主物相甞骨、可黑骨規、 机媒対更杀.察脅方送少,准萍内不愿定 [43 . 51-
會成可主物蛊   生物招甞骨好、蛊料产物均无哥、并可遛过萍内世谢排嗓、兀龜 浆和力较杀,谨番汕胆弑用、主长麼分比
    轴激習、兀姒晾習&兀倉曙緒契婪作用    
    生物蛊料快,主物苦僭饥 垃啓世谢产物无番锹 无毫轴瀬僭、无 浆和力较杀,透莆汕胆弑用、主长麼分比 [59-60]
    姒惊骨玻兀毫瓊終鏗强作用 的能力较杀  
  嚴広二畜 生亀趙聊快,生惑聊产亀均巫哥、击斷轴激習、击姒晾 浆和力慢冬,谨导笨胆軾用、生长玻分比 [61-62]
    骨玻无龜瓊終尝强作用 的能力较杀  
    生亀相眷習吁、可蛊桝肖&机域邇艮方面瀚崖啊常冉生的雯求   [66-67]
  胶惊-曲檢聲曲 罐交架幽鳧快建旳牆.并聂这锁證嵐州鞏幽鹿立   岡]

3总结与展望

组织工程是多学科交叉发展的一门学科,需要多学科的共同努力,才能更好的整 合资源,推进组织工程的发展。组织工程支架是最近几年研究的热点,也是一大难点。 文章总结了目前组织工程中常用的支架材料,由于每种材料都有其独特的优势,因此 吸引了广大研究者去研究,但目前尚未找到一种理想的支架材料来替代原有的组织, 应用于再生和修复过程。骨科领域对支架材料的依赖是相当密切的,不管是骨的再生, 软骨的修复还是交叉韧带的重建,都与支架材料有着密切联系。可以说支架材料是骨 科领域组织工程的基石,只要找到具有良好机械性能、生物相容性好、可降解的支架 材料,那么骨组织工程研究已成功了一半。作者介绍了应用于骨科领域的常用支架材 料,虽然都有一定的优势,但想要应用于临床还有很长的路要走。石墨烯的出现为骨 组织工程研究提供了新的方向,因为石墨烯是目前发现的性能极佳的一种新型纳米材 料,其应用于骨组织工程有独特的优势:石墨烯是目前世界上最薄的纳米材料,具有 良好的机械性能;石墨烯对机体无毒无害,且生物相容性极佳;石墨烯有促进间充质 干细胞成骨分化的能力,对细胞增殖和成骨分化有积极的促进作用,应用于骨再生有着极其独特优势。参考文献

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致谢

时光飞逝,转眼间就到了 2020年,不知不觉中已经到了自己在遵义 大的第3个年头。

在此,首先我要感谢我的导师一一董立明教授及刘毅教授,能够顺 利完成本论文都得益于两位老师严格的要求和悉心的指导。在完成我的 硕士论文期间,是两位老师严谨的学术作风、渊博的专业知识、高度的 责任心、无私奉献的精神和无微不至的鼓励和支持教育和影响着我,让 我从一个无知的科研小白慢慢成长为一名合格的硕士研究生。在两位老 师的鼓励和教育下,我知道了学以致用,学到了潜心做科研的精神,提 升了自己的科研素养,最终收获了很多,在此论文完成之际,谨向两位 老师表达我最崇高的敬意和衷心的感激。同时,感谢感谢贵州大学材料 与冶金学院李龙博士在实验和检测上给我的指导和帮助。

感谢科室彭笳宸教授、何兴川教授、瓦庆德教授、洪嵩教授、宋凌 霞护士长等老师对我临床经验的传授及无私的帮助,让我受益匪浅。感 谢李豫皖师兄、刘子铭师兄、杨继滨师兄、金瑛师姐、吴兴凯师兄、朱 治同师兄、顾龙枫师兄、张玲师姐、王婕同学、张骏同门、汤井峰师弟、 杨启帆师弟、韩松师弟等,感谢你们陪伴我一路走来,感谢你们对我在 实验上和生活中的帮助与支持!特别感谢李豫皖师兄对我实验上的莫大 鼓励和支持!感谢所有给予过我指导、帮助的老师,同学。

由衷地感谢我的父母及亲人,你们是我学习生涯中坚实的后盾,感 谢你们为我所付出的一切!感谢我的朋友,给予我生活和精神上的支持与 关怀!

最后感谢母校一一遵义医科大学,为您的开放和包容而自豪!