江西省人间布鲁氏菌病流行现状及分子溯源研究论文

2020年12月4日10:07:25江西省人间布鲁氏菌病流行现状及分子溯源研究论文已关闭评论

江西省人间布鲁氏菌病流行现状及分子溯源研究论文

摘要

目的:

基于江西省2012-2018年人间布病监测资料,掌握江西省2012-2018年人间 布鲁氏菌病疫情的流行病学特征及其动态变化规律,同时对2017-2019年间监测 获得的布鲁氏菌株进行遗传特征分析,通过基因分型和聚类分析掌握我省的优 势菌种和基因型,为今后的防控工作提供参考依据。

方法:

(1)      通过中国传染病报告信息管理系统(按报告地区、发病日期进行统计), 收集2012年1月至2018年12月期间江西省人间布鲁氏菌病例(包括临床诊断 及实验室确诊病例)和按性别、年份和年龄分布的常住人口信息。对2012〜2018 年江西省布鲁氏菌病人间疫情资料进行描述性分析,描述该时期布鲁氏菌病的 流行概况、地区分布、人群分布和时间分布情况。

(2)       通过病例监测收集2017年1月至2019年1月疑似病例及监测对象的 静脉血标本,运用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA-16)技术分析进 行布鲁氏菌分离株的分型鉴定和聚类分析,结合现场流行病学,进行全省范围 内的分子流行病学溯源调查。

结果:

(1)       江西省2012-2018年共报告布病331例,发病率在0.02/10万〜0.2/10 万之间,无死亡病例。发病时间集中在5〜9月份,全年只有2月份发病数最少。 7年间病例分布在全省11个地级市74个县区,主要集中在赣中北部。报告病例 数前三的地级市为南昌市、上饶市、九江市和抚州市,报告病例数前三的县(区) 为新建县、渝水区、南昌县。病例中男性244例,女性87例,男性年均发病率 高于女性;年龄集中在40〜64岁年龄组,最小1岁,最大79岁;职业主要以 农牧民、养殖户等职业人群为主,职业分布动态特征显示非职业人群的占比由 2015年的30%增长至2016年的63.4%o

(2)       2012-2018年年间共报告布病疫情11起,波及3041人,发病22人, 罹患率为0.72%o其中南昌市5起,赣州市、萍乡市、上饶市、鹰潭市、吉安市、 景德镇市各1起。覆盖11个乡镇(街道),乡镇8起,街(区)道3起。媒介动植物传播6起,生活接触3起,原因不明1起,其他原因1起

  • 江西省自2012年首次在新余市开展重点人群布病血清学监测工作以 来,共采集血清样本7160份,经SAT实验复核阳性95份,阳性率33%。其 中2014年阳性率(4.41%)最高。自2013年全面开展布病病原学监测,2013-2017 年间共从193例病例血液中分离出布病菌株62株,经鉴定羊种58株(其中羊I 4株,羊III 54株)猪14株。
  • 两株菌因扩增产物结果不全无法进行聚类分析,MLVA将其余44株菌 均聚类为羊3型。MLVA-8显示44株布氏菌包含4种基因型,以42型为主导基 因型,在Brucell> Bruce43位点上存在差异。MLVA-11将44株羊种菌聚类为 为10种基因型,以(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-7)为主导基因型,panel 2A组的三 个位点上都存在一定的差异。MLVA-16显示32种基因型,其中10种基因型为 共享基因型,22种基因型为单分离株,panel 2B的Bruce04> Bruce 16和Bmce30 位点显示了高度的变异性,仅一株菌在Bruce07位点上有5个VNTR数,所有 菌株Bruce09位点上无差异。
  • 在43名病例中,男性多于女性,集中在40-59岁年龄,职业分布以农 民为主。首次发病地点省内41人,省外2人。多数病人都具有动物接触史,接 触最多的畜类是羊,接触史中以养殖、宰杀、销售动物制品为主,接触史不明 者占3%。分离自同一地区的共享基因型病例间并无现场流行病学上的联系, 同时,菌株jx25、jx32和jx42是从同一起聚集性疫情病例中分离岀,但三者之 间并没有共享相同的MLVA-16型。

结论:

  • 病例呈现散发状态,以青壮年男性农民为主。传播形式多样化,以直 接接触为主,部分出现食源性感染或原因不明。
  • 引起江西省布鲁氏菌病的优势菌型为羊种3型布鲁氏菌。MLVA-8、 MLVA-11和MLVA-16分别产生了 4、10和32种基因型。MLVA-8分型中以基 因型42型为主。MLVA-11分型以(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-7)为主导基因型, MLVA-16分型在Bruce04> Brucel6和Bruce30位点显示了高度的变异性。
  • MLVA-16聚类分析很好的弥补了现场流行病学调查上因中间宿主的存 在而导致的溯源不足。

关键词:布鲁氏菌,MLVA分析,基因型,流行特征

ABSTRACT

Objective:

Based on the monitoring data of human brucellosis in Jiangxi Province from 2012 to 2018, to grasp the epidemiological characteristics and dynamic changes of the brucellosis epidemic situation in Jiangxi Province from 2012 to 2018, and to monitor the distribution of cloth acquired during 2017-2019 The analysis of genetic characteristics of Brucella Strains, through genotyping and cluster analysis, grasp the dominant strains and genotypes in our province, and provide a reference for future prevention and control work.

Methods:

(1 ) Collect the human Brucella cases (including clinical diagnosis and laboratory diagnosis cases) in Jiangxi Province from January 2012 to December 2018 through the Chinese disease prevention and control information system (statistics by reporting area and date of onset) and by sex Resident information by year, year and age. Descriptive analysis of the epidemic data among patients with brucellosis in Jiangxi Province from 2012 to 2018 was carried out to describe the epidemic situation, regional distribution, population distribution and time distribution of brucellosis in this period.

  • Collect venous blood specimens of suspected cases and surveillance subjects from January 2018 to January 2019 through case monitoring, use of multi-site variable number tandem repeat sequences Analysis (MLVA-16) technical analysis carried out typing and cluster analysis of Brucella isolates, combined with on-site epidemiology, and conducted a province-wide molecular epidemiology traceability survey.

Results:

  • A total of 331 cases of brucellosis were reported in Jiangxi Province from 2012 to 2018, with an incidence rate ranging from 0.02 / 100,000 to 0.2 / 100,000, with no deaths. The time of onset was concentrated from May to September. The

incidence was the lowest in February throughout the year. In the past 7 years, the cases were distributed in 74 counties in 11 prefecture-level cities in the province, mainly in the central and northern Jiangxi. The top three prefecture-level cities with reported cases are Nanchang, Shangrao, Jiujiang, and Fuzhou. The top three counties (districts) with reported cases are Xinjian County, Yushui District, and Nanchang County. Among the cases, there are 244 males and 87 females, and the average annual incidence of males is higher than that of females; the age is concentrated in the age group of 40-64 years, with a minimum of 1 year old and a maximum of 79 years old; Mainly, the dynamic characteristics of occupational distribution show that the proportion of non-professional population has increased from 30% in 2015 to 63.4% in 2016.

  • In 2012-2018, a total of 11 cases of brucellosis were reported, affecting 3041 people and 22 cases with an attack rate of 0.72%. Among them, there were 5 cases in Nanchang City, 1 case in Ganzhou City, Pingxiang City, Shangrao City, Yingtan City, Ji'an City and Jingdezhen City. Covering 11 towns (streets), 8 towns and 3 street (district) roads. 6 cases of vector animal and plant transmission, 3 cases of life contact, 1 case for unknown reasons, 1 case for other reasons
  • Since the first serological monitoring of brucellosis in key populations was carried out in Xinyu City in 2012, Jiangxi Province has collected 7160 serum samples, 95 of which were positive by SAT test, with a positive rate of 1.33%. Among them, the positive rate (4.41%) was the highest in 2014. Since 2013, the etiology monitoring of brucellosis has been carried out. From 2013 to 2017, 62 strains of brucellosis were isolated from the blood of 193 cases. 58 strains of sheep were identified (including 4 sheep I and 54 sheep III) and pig I 4 strains.
  • Two strains were unable to perform cluster analysis due to incomplete amplification product results. MLVA clustered the remaining 44 strains into sheep type 3. MLVA-8 showed that 44 strains of Brucella contained 4 genotypes, with type 42 as the dominant genotype, and there were differences in Brucell and Bruce43 loci. MLVA-11 clustered 44 strains of sheep seed bacteria into 10 genotypes, with (1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-7) as the dominant genotype, panel 2A group There are certain differences in the three sites. MLVA-16 showed 32 genotypes, of which 10genotypes were shared genotypes and 22 genotypes were single isolates. Panel 2B Bruce04, Bruce 16 and Bruce30 loci showed a high degree of variability. There are 5 VNTRs in Bruce07, and there is no difference in Bruce09 in all strains.
  • In the 43 cases, there are more men than women, concentrated in the age of 40-59 years old, and the occupational distribution is mainly farmers. There were 41 people in the province and 2 people outside the province. Most patients have a history of animal contact, and the most exposed animals are sheep. The contact history is mainly breeding, slaughtering, and selling animal products. The unknown contact history accounts for 16.3%. There were no epidemiological links between shared genotype cases isolated from the same area. At the same time, strains jx25, jx32 and jx41 were isolated from the same cluster of epidemic cases, but the three did not share the same MLVA-16 type.

Conclusions:

  • The cases are sporadic, and they are mainly young and middle-aged male farmers. The form of transmission is diversified, mainly by direct contact, and some food-borne infections or unexplained causes.
  • The dominant bacterial type causing Brucellosis in Jiangxi Province is Brucella mutton type 3.MLVA-8, MLVA-11 and MLVA-16 produced 3, 9 and 32 genotypes, respectively, and genotype 42 is the main type in MLVA-8 typing. MLVA-11 typing is (1 -5-3-13-2-2-3-2-4-20-7) as the dominant genotype, and MLVA-16 typing shows the height at Bruce04, Bruce 16 and Bruce30 Variability.
  • MLVA-16 cluster analysis makes up for the lack of traceability caused by the presence of intermediate hosts in field epidemiological investigations.

Key Words:Brucella; MLVA analysis; Genotype; Epidemic characteristics

主要中英文缩略词语表

1章引言

布鲁氏菌是一类重要的人兽共患病病原菌,不仅对人和多种动物致病,亦 是一种潜在的生物武器⑴。布病是由布鲁氏菌属细菌引起牛、羊、猪、鹿、犬等 哺乳动物和人类共患的一种传染病。世界上170多个国家和地区曾报告发生人 畜布病疫情⑵。上世纪50年代布病曾在我国广泛流行,疫情严重地区人畜感染 率达50%,人感染率为10.6%-16.4%o 20世纪80-90年代,由于加大防控力度, 疫情降至历史最低水平。进入21世纪,随着我国家畜饲养量不断增加,动物及 其产品流通频繁,部分地区布病等人畜共患病呈持续上升势头,不仅严重影响 畜牧业生产,也严重危及人民身体健康和公共卫生安全卩同。此外,布鲁氏菌作 为生物恐怖病原,被用于生物战剂和生物恐怖剂的研制,还危害着国家安全和 人民的健康生活⑸。2005年一2016年,全国人间布病发病率从1.40/10万上升至 3.44/10万,累计报告病437097例,其中以2014年最为显著,报告发病数57222 例,发病率为4.22/10万⑹7】。既往我国布鲁菌病流行区在华北、东北和西北地区, 逐渐扩大至全国31个省(市)、自治区均有疫情报告,2015-2016年全国90.0% 的新发县区(378个)分布在南方,提示疫情由北方向南方播散趋势明显⑹刀。

2011年江西省新余市报告1例布病病例,此病例是我省1986年以后报告的 首例病例;2012年我省新建县报告一起因引进染疫山羊引起的人间布病暴发疫 情。2012年至2017年我省共报告病例239例,与北方疫情高发地区相比,病例 数虽不是很多,但呈快速上升态势,疫情范围也逐渐扩大,2017年报告病例数 为2012年的8倍,病例报告地区由3个设区市扩大到全省11个设区市,防控形 势不容乐观[9】。2015年我省被国家确定为南方草地开发试点省之一,这将大大 促进我省羊养殖、贩运、加工销售、餐饮等行业的发展,羊产业从业人员也将 迅速增加,在目前疫情形势下,将给我省布病防控带来严峻挑战。

目前,WHO公认的布鲁氏菌属分为10个种,其中人间布病的致病菌种主 要为猪种(B.suis)、羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)及犬种(B.canis)[1]。2010 德国Scholz于女性患者的乳房移植物中分离出新型布鲁氏菌(B. inopinata)[10], 2014年美国的Whatmore从狒狒的死胎和残留的胎盘中分离到狒狒种布鲁氏菌 (B. papionis)【⑴,Scholz[12]又于2016年在红狐的下颌淋巴结中分离发现了 B. vulpis,至此布鲁氏菌属扩大至12个种〔I%新的研究还在不断进行中。布鲁氏 菌宿主范围大、疫源地分布广,不同来源的布鲁氏菌菌株在生化特征和致病性 等方面差异较大,不同种型的布鲁氏菌的宿主范围和致病力也存在较大的差异, 其中羊种布鲁氏菌的致病力最高,牛种布鲁氏菌的致病力其次⑻。目前我国主要 流行的菌种是羊种(B. melitensis)及牛种(B. abortus)布鲁氏菌。2012 — 2014 年江西省新余市布鲁菌病监测结果分析,高危人群感染率为7.75%,病羊为主要 传染源,优势菌株为羊种3型[⑷。

对布鲁氏菌的鉴定方法主要有细菌学鉴定及分子生物学鉴定两种方法。传 统的布鲁氏菌分型方法主要有血清学凝集、噬菌体裂解、染料抑菌、硫化氢等 试验。但因其操作繁琐周期较长,还存在实验室获得性感染的风险,致使传统 的细菌学鉴定方法难以满足当前布病防控的需要X⑹。作为常规鉴定方法的补 充和替代,分子生物学方法不论在布病的分子流行病学调查、病原菌的快速分 型鉴定、溯源分析、传播途径的追查,还是菌株之间差异关系分析、疫情预防 控制方面都具有十分重要的作用ZU]。基于16个位点的布鲁氏菌MLVA分型方 法(MLVA-16),具有快速、操作简单、重复性好等优点I?。],不涉及大量活菌操作, 极大地降低了实验室感染机率,且结果转化为字符数据类型,便于实验室间的 比较和保存,己在分子流行病学、区分基因型、种群结构和菌株间亲缘进化关 系等方而得到广泛应用,可以作为传统表型鉴定方法的补充,为布病流行病学 溯源提供更多的分子生物学证据IM。Tian[22]等人对中国1953年至2013年间的 600份布鲁氏菌分离株开展了 MLVA研究,发现布鲁氏菌病具有独特的空间和时 间上分子流行病学特征。B.melitensis和B.abortus菌株在中国占主导地位,B.suis 生物变种1和3在南北部省份散在分布。犬布鲁氏菌病仅在动物中被发现,没 有报告任何人类病例。刘武[刼对甘肃省首例分离的布鲁氏菌菌株采用(MLVA) -16方法分型,在线上传数据库做聚类分析,结果显示该菌株与浙江、广东、福 建、云南羊种3型布鲁氏菌聚为一类,证实为输入性疫情。刘志国a】等人利用 MLVA方法对来自不同宿主的菌株进行基因分型,揭示了内蒙古羊种布鲁氏菌在 羊牛(骆驼)和骆驼(羊牛)中相互循环传播,最后传染给人的潜在传播模式;乌兰 察布地区猪种布鲁氏菌的传播模式为从猪转移到绵羊,绵羊作为中间贮藏库, 随后传播给人类[⑸。

目前江西省尚未开展人间布鲁氏菌病基因分型及溯源分析的相关研究,我 国其他地方陆续开展了对这方面的研究,但其研究多集中于单个暴发疫情的溯 源分析,或单一菌株的聚类分析,而未在整个省的高度上对人间布鲁氏菌的传 播轨迹和进化进行分析。因此,本研究将围绕人间布病的监测工作,结合布病 防控实际开展相关研究。以布病病原菌的分离鉴定、基因遗传特征为研究基础, 结合现场流行病学,进行菌株的基因分型和全省范围内的分子流行病学溯源调 查。

2章资料与方法

2.1流行病学调查

2.1.1人间疫情资料

江西省2012-2018年人间布病疫情资料来自于《传染病报告信息管理系统》 和《突发公共卫生事件管理信息系统》。数据库定义:现住址为江西省,终审 日期为2012-2018年的发病数据及突发公共事件,病例类型为临床诊断病例和确 诊病例。病例诊断根据《全国人间布鲁氏菌病监测方案》(2018版)执行。

2.1.2人口学资料

通过中国疾病预防控制基本信息系统收集以县区(包括县级市)为单位, 按性别、年份和年龄分布的常住人口信息。

2.1.3统计分析

对2012〜2018年江西省布鲁氏菌病人间疫情资料进行描述性分析,描述该 时期布鲁氏菌病的流行概况、地区分布、人群分布和时间分布情况,主要采用 Excel和SPSS 22.0软件包对数据进行整理和分析。

2.2布鲁氏菌基因分型与分子溯源

2.2.1主要仪器

2.2.3布鲁氏圉标准圉株

布鲁氏菌牛种疫苗菌株104M、猪种疫苗株S2、羊种标准株16M由中国疾 病预防控制中心传染病预防控制所布病室提供

2.2.4研究内容和方法

2.2.4.1菌株收集

本次研究共收集菌株样本46株,10株布鲁氏菌标本由2017年从确诊患者 血液中分离保存于本单位实验室;其余36株采集自2018年1月至2019年1月 疑似病例及监测对象的静脉血标本,由当地疾控中心分离血清(2-3份)后保存 送至本实验室分离得到。

2.2A.2 MLVA 分型

多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)是一个基于PCR技术的分型方 法。该方法通过区分基因组上多个具有多态性串联重复序列位点(VNTR)的重复 数来区分菌株。目前,国际上布鲁氏菌通用的是基于16个位点的MLVA分型方 案(MLVA-16) o 16 个位点分别是 Bruce06> Bruce08> Brucell> Bruce 12> Bruce42> Bruce43> Bruce45> Bruce55> Brucel8> Brucel9> Bruce21> Bruce04> Bruce07> Bruce09> Brucel6> Bruce30o本研究采用毛细管电泳的方法确定串联重复数, 引物序列如下:

注:1MLVA-1 (包括Bruce 06> 08、11、12、42、43、45、55),确定布鲁氏菌属的种和地

理信息。MLVA-2 (包括 Bruce04> 07、09、16、18、19、21、30)用于暴发分析。

  1. PCR
  1. 扩增条件

预变性 96°C, 3 min;变性 96°C, 30 s;退火 60°C, 30 s;延伸 72°C, 30 s, 35个循环。最后72°C, 5 mine PCR产物4°C保存。每次扩增均以布鲁氏菌16M 参考菌株作阳性对照。

  1. 扩增结果检测与分析

PCR产物送生物技术公司,采用ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳;根据 GeneScan 1200 LIZ DNAMarker 确定扩增产物大小,采用 Gene-Mapper 4.0 软件 进行分析并计算检测位点中各VNTR的重复次数。

  1. 数据分析

使用BioNumerics(Version 5.1)对16个位点进行聚类分析,聚类方式用平均 连锁聚类法(UPGMA)o

2.2.4.3病例间流行病学关联性调查

通过监测系统搜索到病例个案调查表和流行病学调查进程报告,整理出病 例姓名、性别、电话、年龄、职业、发病日期、报告日期、发病地址、原住址、 临床表现、与动物接触史、是否防护、动物畜别、动物所属、动物购置时间和 地点、动物在近两年是否出现流产、是否为聚集性病例,若是密接人数有多少 等详细的信息,描述分析相同基因型病例间的内在联系。

2.3质量控制

调查方法均进行统一标准化,各地区严格按照项目方案中的操作规程开展 现场调查、标本采集和运输以及实验室检测。

3章结果

3.1病例的流行病学特征

3.1.1疫情总体情况

江西省2012-2018年分别报告布病9例、11例、31例、46例、68例、73 例、93例,共331例,发病率在0.02/10万〜0.20/10万之间。无死亡病例,2012-2018 年发病率呈明显上升趋势(咒2趋势= 124.72, P<0.001) o

表1-1江西省2012-2018年布病发病情况

年份           报告发病数(例)             总人口数(10万)        报告发病率(/10万)


3.1.3
人群分布3.1.2时间分布

发病时间集中在5〜9月份,存在春季(5〜6月)大高峰和秋季(9月)小高峰, 病例总数208例,占比62.84%o 2月份发病数最少,共报告4例。

表1-2江西省2012-2018年各月布病发病数(例)

3.1.3.1性别特征

2012-2018年江西省报告病例中男性244例,女性87例,性别比2.80:1 o男、 女性年均发病率分别为0.15/10万和0.06/10万,男性年均发病率高于女性 (咒2二65.45, FvO.OOl)。

表1-3江西省2012-2018年布病发病数性别分布

3.1.3.2年龄特征

2012-2018年间所有病例年龄主要集中在40〜64岁年龄组,占总病例数

65.26% (216/331),该年龄组男性占比 48.04% (159/331),女性占比 17.22% (57/331) o年龄最小1岁,最大79岁。

表1-4江西省2012-2018年布病发病数性别年龄组分布3.1.4地区分布图1-3江西省2012-2018年布病发病数年龄分布

3.1.3.3职业特征

职业分布占比顺位为农牧民61.03% (202/331);职业不详和其它14.20% (47/331);离退休、家务及待业12.38% (41/331);教师和医务人员等其他职 业占比之和为8.46% (28/331);学生、托幼和散居儿童3.93% (13/331)职 业分布动态特征为职业暴露人群占比减少,而非职业人群比例在增加(见表1-5、

图1-4江西省2012-2018年布病发病数职业分布

2012-2018年间331例病例分布在全省11个地级市74个县区,主要集中在 赣中北部(图1 -5) o地级市覆盖率100% (11/11) , 2012-2018年报告病例的地 级市分别为2、5、9、10、10、10、11个,呈逐年增加趋势(咒2趋势=24.06, P <0.001) o县(区)覆盖率74% (74/100) , 2012-2018年报告病例的县(区) 分别为3、7、14、30、33、40、41个,扩增趋势明显(咒2趋势= 76.65, P<0.001), 且呈现由北向南的发展势态(见表1-6) o

上饶市

吉安市

江西卷2012-如讯年布病发須数

S 1 Dot = 1 江西省2012-20场年布病发病率

  • 16^0.34 (2)
  • 13^0.16 (3)
  • 1^0.13 (3)
  • 05 1 (3)

图1-5江西省2012-2018年各地市布病发病情况报告病例数前三的地级市为南昌市(60例)、上饶市(46例)、九江市和抚州(38例),累计发病率前三位分别为鹰潭 市0.34/10万、新余市0.23/10万、南昌市0.16/10万(见表1-7、图1-5)。报告病例数前三的县(区)为新建县(18例)、渝 水区(17例)、南昌县(17例)。

表1-7江西省2012-2018年布病发病数及发病率地区分布

江西省2012-2018年报告聚集性布病疫情11起,波及3041人,发病22人, 罹患率为0.72%o其中南昌市5起,赣州市、萍乡市、上饶市、鹰潭市、吉安市、 景德镇市各1起。覆盖11个乡镇(街道),乡镇8起,街(区)道3起。媒介 动植物传播6起,生活接触3起,原因不明1起,其他原因1起(见表1-8) o

表1-8 江西省2012-2018年布病疫情统计

情况

3.1.5.1血清学监测

江西省自2012年首次在新余市开展重点人群布病血清学监测工作以来,共 采集血清样本7160份,经SAT实验复核阳性95份,阳性率1.33%。其中2014 年阳性率(4.41%)、发病率(0.03/10万)均最高(见表1-9) o

表1-9江西省2012-2017年人间布病血清学监测结果

3.1.5.2病原学监测

2013年江西省全面开展布病病原学监测,2013-2017年间共从193例病例血

液中分离出布病菌株62株,经鉴定羊种58株(其中羊14株,羊III 54株),

3.2布鲁氏菌分型与分子溯源研究 3.2.1 MLVA分型及聚类分析

将46株分离菌编制成jx01-jx46号,对每株菌的16个位点panel 1 (Bruce06> BruceO8> Brucell> Bruce 12> Bruce42> Bruce43> Bruce45> Bruce55 ) 、panel 2A (Brucel8> Brucel9> Bruce21)、panel 2B (Bruce04> Bruce07> Bruce09> Brucel6> Bruce30)进行毛细管电泳确定串联重复数。结果显示39号和46号菌扩增产物 结果不全,未能进入后续聚类分析,其余44株布鲁氏菌株经MLVA-16均聚类 为羊种III型,来自全省9个设区市,其中南昌14株,抚州10株,宜春7株, 吉安5株,九江3株,上饶2株,景德镇、鹰潭、新余各1株。44株菌各位点 串联重复数目、基因分型结果、地区来源、亲缘关系详见图2-1。

表2-1 MLVA-8各位点串联重复数目分型结果3.2.1.1 MLVA-8 分型

panel 1 (8个位点)结果显示,44株羊种菌聚类为4种基因型:37株为42型 (1-5-3-13-2-2-3-2),4 株为 63 型(1-5-3-13-2-3-3-2), 2 株为 114 型(1-5-3-13-2-1-3-2), 1株为新基因型(1-5-5-13-2-3-3-2) o基因型42型为主要基因型,占比84.1%, 8 个位点中仅存在2个位点(Brucell、Bruce43)的差异(见表2-1)。

  • MLVA-11 分型

panel 1+panel 2A (11个位点)结果显示,44株羊种菌聚类为10种基因型,

分别为(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-7 ) 33 株,为主导基因型(33/44 )、

其中 33 株基因型为(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-7)

的菌株是在MLVA-8分型42型的基础上保持了 100%相似,3株基因型为

(1-5-3-13-2-3-3-2-4-20-7)的菌株是在MLVA-8分型63型的基础上保持了 100%

相似,同时,该两种基因型在panel 2A组三个位点保持完全一致。总体上来说, panel 2A组的三个位点上都存在一定的差异,Brucel8位点有1、2、3、4四种 VNTR 重复数,Brucel9 位点有 18、20、22、25 四种 VNTR 重复数、Bruce21

位点仅有7和8两种VNTR重复数(见表2-2)。

表2-2 MLVA-11各位点串联重复数目分型结果

基因 £££££££££££ 菌一

型编 8                  8 g g g g g g g g 菽 株株

  • MLVA-16 分型

MLVA-16聚类显示44株布鲁氏菌被分为32种基因型,其中22种基因型为 单基因型分离株,10种基因型为共享基因型(见表2-3),即100%同源,分别 由2-3株布氏菌分离株共享,共计22株。10种共享基因型中01号(含2株菌)、 11号(含3株菌)、27号(含2株菌)和23号(含2株菌)基因型分别分离自 同一地区;10号(含2株菌)、16号(含2株菌)、22号(含2株菌)基因型 均分离自宜春和抚州;06号基因型(含2株菌)分离自九江和吉安,20号基因 型(含2株菌)分离自上饶和抚州,26号基因型(含2株菌)分离自新余和吉 安(见表2-3) , panel 2B的Bmce04、Bruce 16和Bmce30位点显示了高度的变 异性,仅一株菌在Bruce07位点上有5个VNTR重复数,所有菌株在Bruce09 位点上无差异。

3.2.2病例流行病学溯源调查分析

3.2.2.1病例基本特征

本次研究收集的46份菌株均为单独分离自46名疑似病人的血液标本,通 过监测系统搜索到个案调查表和流行病学调查报告43份,整理报告显示43名 病例中,男性32人,女性11人。以40-59岁年龄为主,占比58% (25/43), 其次是20-39岁和60-80岁年龄组。职业分布以农民为主,占比51.2%,其次是 动物产业从业人员,占比18.6%,非动物产业的民工,占比16.3%。首次发病地 点省内41人,省外2人。多数病人都具有动物接触史,其中接触的畜类以羊为 主,占比74.4% (32/43),接触史中以养殖、宰杀、销售动物制品为主。占比 61.5% (28/43),接触史不明者占16.3%, 4人是聚集性病例,其中3人为同一起 聚集性疫情(见表2-4) o

表2-4 43例病人的基本情况一览表3.2.2.2共孚基因型病人I可的关联分析

MLVA-16得出的01号、11号、27号共享基因型均来自南昌市,但从流调 报告中看病人之间并无联系,且每个共享基因型组内都有一人无动物接触史。 10号、16号、20号、22号共享基因型组别中均含有来自抚州的菌株 (jxl6/jx05/jx20),两个病例(jxl6和jx20)均直接接触羊内脏,发病时间相近, 且发病地区为同一区域,与同组内其他病例间无现场流行病学上的联系。在16 号共享基因型组的三个病例中,病例jx03就职于外省的羊养殖厂,首次发病地 点在外省,其余两例居住和发病均在江西省内,三人发病时间间隔为半年以上。 06号、26号共享基因型组别中均含有来自吉安的菌株(jx35/jx36),均是自家 养羊,均未将羊出售至其他地区,与同组内其他病例间无流行病学联系。特别 的是,菌株jx25、jx32和jx42是从同一起聚集性疫情病例中分离岀,但三者之 间并没有共享相同的MLVA-16型,均为独立基因型,存在两个位点的差异。

4章讨论

4.1江西省20122018年人间布病流行特征

江西省2012-2018年布病年均发病率为0.1/10万,低于北方及周边省份址2引。 全省报告病例数不多,但每年都有新发县(区)报告病例,发病率上升趋势明 显,波及范围呈扩增势态,与全国南方区域流行特征一致⑻。原因可能为老疫区 养殖户对传染病的恐惧心理,为逃避责任,跨地区贩卖染疫羊群,导致传染源 难以控制。同时,新地区群众对布病知识了解少或不了解,多发生疫情暴发事 件。此外,个案病例和聚集性疫情多集中在南昌市地区,可能是因为南昌市为 省会城市,畜肉类产品需求量大,畜牧交易频繁导致的。考虑到我省周边省份 湖北圖、湖南踊、浙江布病持续上升,故应警惕由输入染疫动物造成的布病 疫情。

人群分布特征显示,男性多于女性,集中在40〜65岁年龄组,与福建省报 道一致可,这是由于羊群的接羔、运输、宰杀等工作为重体力活,多由青壮年 男性负责,加上人防护意识不强,使得暴露机会大于女性。职业以农牧民为主, 说明职业暴露仍是病例增加的主要因素,但“其他和不祥”、“家务及待业”、 散居儿童与学生均有分布,且这部分非职业人群的占比在逐年增加。结合部分 聚集性疫情未追溯到传染源,提示应考虑布病感染的其他途径,提示应考虑布 病感染的其他途径,如食源性暴露卩匕 性传播他等。回顾流行病学调查报告显 示:学生及儿童病例与家庭聚集性有关,提示应对养殖户进行家庭健康教育。时 间集中在5〜9月份,存在夏季(5月)大高峰和秋季(9月)小高峰,与国内多数地 区不一致阴塚。可能与本地羊群“两年三产”的产羔特点有关,产羔频次增加, 助产和照顾幼羔等工作增加了人群的暴露机会,也可能该疾病近几年才在江西 省内抬头,还未形成明显的季节性特征。高发地区集中在赣中北部,发病数最 高地市为南昌、上饶、九江和抚州。发病率最高地市为鹰潭、新余和南昌,与 县区发病情况保持一致。全省有7个地市共发生11起聚集性疫情,南昌市最多; 乡镇多于街道;暴发原因主要与媒介动植物接触为主,说明疫情的发生与当地 卫生状况及卫生习惯有关。

职业人群血清监测阳性率为1.33%,以2014年阳性率和发病率最高,与动 物监测情况一致[辽迢。该省优势菌株为羊[[I型布鲁氏菌,其毒性最强,其次为 猪种,2016-2017连续两年从病人血液中分离出猪种布鲁氏菌,提示猪种布病的 抬头,全国布病病原监测显示猪种布鲁氏菌广泛存在于中国南部,其中猪I型 存在于北方,猪III型分布于南方跆,与江西情况不一致。与邻近省份相比,广 西省2000年前以猪III型为主导型,2012开始以羊III型为主导,同时存在犬种 布鲁氏菌厲]。浙江省从人血液标本中分离出羊种、牛种和犬种m 38\与江西省 有明显差异。考虑到要防止羊种和猪种布鲁氏菌共同流行,畜牧部门应对猪的 布鲁氏菌带菌情况给予重视。同时,据监测显示,血清学监测结果与全省病例 报告趋势不一致,究其原因一可能是对职业人群的防治干预起到了一定的效果; 二是猪种布病及其他感染途径存在一定的影响;三是布病病例因症状不典型, 病患辗转多地治疗,迟诊情况严重,导致了疫情发现和报告的滞后性。

4.2江西省布鲁氏菌基因分型与分子溯源

在多位点串联重复序列分析方法中,选择不同的位点得到分型结果大有不 同。本研究中的菌株在8个位点上的分型鉴定为4种基因型,分别为基因型42 型(包含38株菌)、63型(含4株菌)和114型(1株菌),同时还发现一株 新的基因型(1-5-5-13-2-3-3-2),分离自南昌一例聚集性疫情患者。其中以基因型 42型为主,占比84.1%,与国内北方地区保持一致m 40],可以证实布鲁氏菌北 病南输的特征,也提示江西省布鲁菌起源于东地中海血统"宀」。江西与广西⑼、 浙江重合的基因型有42型、63型和114型,但三省均聚类得到了新型未被命 名的基因型,说明三省有共同起源,受地理、人文环境的影响,种/型正在进化。 panel 1组中仅有2个位点(BrucelK Bruce43)存在数目变异,表明MLVA-8分 型方法属于目前稳定使用的分型方法。为继续研究布氏菌的遗传进化,本研究 在8个位点的基础上加入panel 2A组形成MLVA-11分型方法,44株羊种菌聚类 为10种基因型。以(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-7)(包含33株菌)主导基因型,占 比75%O这33株菌在MLVA-8分型42型的基础上保持了 100%相似,3株基因 型为(1-5-3-13-2-3-3-2-4-20-7)的菌株是在MLVA-8分型63型的基础上保持了 100%相似,同时,该两种基因型在panel 2A组三个位点保持完全一致。两株基 因型为114型的菌株在panel 2A组的三个位点上VNTR数完全不同,从而形成 两种不同的基因型(1-5-3-13-2-1-3-2-1-20-7)和(1-5-3-13-2-1-3-2-4-18-8),表 明布鲁氏菌在具有亲缘性的基础上发生了些微进化。全球大部分地区羊种布氏 菌MLVA-11分型都是以(4-41-8)为主[30,37,39,41,42],本研究中panel 2A组的三 个位点上显示的基因型为(1-20-7)、(2-20-7)、(3-20-7)、(4-20-7)、(4-22-7)、 (4-25-7)、(4-18-8) o目前在国内外未能找不到与其相同或相似的基因型, 与青海省情况相似⑷]。提示经菌种的传入、分布和发展,江西省内的布鲁氏菌 已经形成其独特的遗传特征。

MLVA-16分型在11个位点的基础上加入panel 2B上的五个位点,将44株 羊种菌分为32个基因型,包含22种单分离株基因型,10种共享基因型。基因 型别进一步扩大,差异主要是在panel 2位点上,以panel 2B上Bruce04> Bruce 16 和Bruce30位点的高度变异为主,与Jiang[44]学者认为的Brucel6和Bruce30位 点对分析中国布氏菌株最有用的观点相比多了位点Bruce04,表明这三个位点对 江西省相同种/型菌株间的微进化具有重要的研究价值。MLVA-16聚类得出的01 号、11号、27号共享基因型均来自南昌市,但病人之间并无联系,符合学者 Delphine[18]在患者病史缺失的情况下,以遗传为基础追溯菌种起源的观点,提示 南昌市内暴发布病疫情的风险较高。同时,菌株jx25、jx32和jx42是从同一起 聚集性疫情病例中分离出,但三者之间并没有共享相同的MLVA-16型,这与既 往研究⑷]中流行病学相关的菌株具有相同或相似的基因型的观点相悖,导致这 样结果的原因可能为本研究未能从该聚集性疫情分离出更多的菌株,从而导致 的偏倚,也可能是两者接触的传染源不同,或者是菌株发生了变异[46]O 10号、 16号、20号、22号共享基因型组别中均含有来自抚州的菌株(jxl6/jx05/jx20), 两个病例(jxl6和jx20)均直接接触过羊内脏,发病时间相近,且发病地区为 同一区域,提示该地区可能存在着两人共同传染源,比如染疫的羊。根据流调 报告显示抚州的种羊可能来自于陕西省,陕西是羊、牛、犬种布病的混合疫区, 1996年之后以羊I和羊III型为主导基因型⑷],与江西现流行的种/型保持一致。 在16号共享基因型组的三个病例中,病例jx03就职于外省的羊养殖厂,首次发 病地点在福建省,其余两例居住和发病均在江西省内,三人发病时间间隔为半 年以上。有文献表明目前福建省存在羊种和猪种布病的共同流行,MLVA-8分析 为42型、43型和63型,MLVA-11分析为41型(4-20-8) [21],与江西省流行菌 株情况保持大体一致。提示江西与福建之间可能存在共同的传染源,有交叉感 染的风险,可能与省际染疫动物的转运交易有关。22个单分离株表现出不同的 基因型,并且病例间没有流行病学上的联系,提示江西省目前布病疫情仍然以 散发为主。

综上所述,江西省人间布病疫情依然严峻,为更好地防控布病的发生。本 文提出以下两点建议:一是继续加强多部门联防联控。政府部门统一沟通协调, 建立卫生与农业部门信息互通制度,掌握人畜间布病疫情动态,互相支持、联 合作战。食药监、工商等市场监管部门规范动物制品的流通,加强检验检疫, 取缔不合格产品及生产作坊,以控制传染源01。二是扩充监测内容。1、加强宣 传:联合农业部门,对全省牲畜养殖户开展(家庭)健康宣传,普及布病防治 知识,提高群众特别是布病高危人群的自我防护意识[徊。2、建立健康档案:通 过血清学监测分批次对监测点内的所有职业人群建立布病健康档案。3、加强布 病防控专业人员培训⑷]:以多种形式培训全省的临床医师、公卫医师及实验室 检测人员,以提升专业人员的布病防控意识和诊治能力。特别是针对无猪、羊 直接接触史的病人,应学习北方疫区经验“逢发热的患者必做血培养心0],及早 发现、诊断病例,进行规范化治疗,减少慢性布病的发生。

5章结论与展望

5.1结论

  • 病例呈现散发状态,以青壮年男性农民为主。传播形式多样化,以直 接接触为主,部分出现食源性感染或原因不明。
  • 引起江西省布鲁氏菌病的优势菌型为羊种III型布鲁氏菌,MLVA-8、 MLVA-11和MLVA-16分别产生了 3、9和32种基因型。MLVA-8分型中以基因 型 42 为主o MLVA-11 分型以(1-5-3-13-2-2-3-2-4-20-7)为主导基因型,MLVA-16 分型在Bruce04> Bruce 16和Bruce30位点显示了高度的变异性。
  • MLVA-16聚类分析很好的弥补了现场流行病学调查上因中间宿主的存 在而导致的溯源不足。

5.2进一步工作的方向

本研究以定量指标,客观地揭示了江西省布病确诊病例的流行病学特征; 以病原为基础开展的遗传特征分析及菌株间的关联研究,充分显示了病例间的 遗传关联性。为制定有针对性的防治策略和溯源灭点行动提供指导,为政府采 取干预策略、卫生和农业部门间联防联控机制、疾控和医疗部门加强患者诊疗 等方面发挥着积极作用。在以后的研究中,我们希望从不同牲畜、不同来源的 标本中分离出更多的布鲁氏菌种/型,对布鲁氏菌的遗传进化进行全方位分析。 同时,在动物间开展病原学监测,以便于提出更全面的布鲁氏菌病防控措施。

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综述

MLVA技术在布鲁氏菌分子流彳丁病中的应用现状

黄玉萍(综述)               胡国良(审校)

在全球流行和发展中国家高发流行的背景下,从分子水平研究病原菌的进 化程度和变异趋势,并且将分子生物学与流行病学相结合的研究方法——分子 流行病学在布鲁氏菌基因分型应用方面优势凸现。多位点可变数目串联重复序 列(variable number of tandem repeat VNTR)分析(multi-locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)通过基因座在布鲁菌之间突变率的变化获得有价 值的进化/分类信息,从而区分密切相关的菌株。该技术只需PCR扩增和凝胶电 泳即可完成细菌的分型和多态性分析。

1・布鲁氏圉病原

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella, spp)引起的一种严重的人畜 共患的传染、变态反应性疾病。1887年英国军医Bruce在马耳他岛从死于“马耳 他热"的英国士兵脾脏中分离到羊布鲁氏菌(B. melitensis),首次证实了该病的病 原体的存在。自首次分离到布鲁氏菌后,相继从其他宿主分离到了布鲁氏菌。 1985年,WHO将布鲁氏菌属分为6个种19个生物型⑴,即羊种布鲁氏菌(B. melitensis ) 3个生物型、牛种布鲁氏菌(B. abortus)8个生物型、猪种布鲁氏菌(B. suis)5个生物型、沙林鼠种布鲁氏菌(B. neotomae)>绵羊附皋种布鲁氏菌(B. ovis) 和犬种布鲁氏菌(B. cams)o随着世界上一些发达国家有效根除布鲁氏菌病后,开 始对水生哺乳动物布鲁氏菌病开展相关研究及调查。2007年英国Foster[2]从海洋 哺乳动物体内分离到鲸布鲁氏菌((B.ceti)和鳍布鲁氏菌(B.pinnipedialis), 2008年, 德国Scholz和捷克Hubalek发现了田鼠布鲁氏菌(B. microti)⑶。2010德国Scholz 发现(B. inopinata)⑷,2014 年 Whatmore 发现 B. papionis, Scholz⑸于 2016 年又 发现了 B. vulpis,总计12个种⑹。

2 .VNTR基因分型位点

细菌在染色体和质粒上的某些基因或基因间区含有重复的DNA基因座,即 一段相同或相似的核昔酸序列称为重复单位(也称核心序列),(VNTR)在原核 与真核生物基因组中广泛存在,其作为遗传标记的多态性主要来自于不同数目 的串联重复,串联重复次数的改变是由细菌在复制过程中出现错配和重组而产 生⑺。真核生物VNTR多态性位点存在于非编码区,而原核生物中VNTR多态 性位点同时存在于编码区和非编码区,主要由中间的核心区和外围的侧翼区构 成,中间的核心区为主要构成单位,每个重复单位在2个到几十个碱基之间, 重复次数为数次或者数百次不等。在同种细菌不同菌株基因组中,相同位点 VNTR基序重复次数可变异,存在种内VNTR序列多态性,整个重复序列长度 也存在多样性,称为长度多态性或数目可变串联重复多态性切。

利用基因扫描分型相关软件分析细菌染色体和质粒序列中等位基因的碱基 数,然后采用非加权平均组(UPGMA)算法即可将不同菌株划分为不同的基因 型,该方法被称为MLVAo MLVA技术根据细菌VNTR的多态性,针对不同位 点设计特异性引物,用扩增出来的PCR产物片段长度减去侧翼序列的长度即可 推算出每个位点的重复序列拷贝数[⑹。

3.MLVA技术在布鲁氏菌中的发展

2003年Bricker等首次利用串联重复序列建立高变八聚体寡核普酸指纹 (HOOF-Prints)用于基因分型,之后利用MLVA-8对97株分离株和6株实验室保 存菌株分析,分型结果良好,重复性强,但VNTR位点的突变率很高,不能准 确预测分离株种型等[⑵。近年来,MLVA分型技术发展迅速,对VNTR位点的 选择也相对多样化,根据VNTR数目的不同衍生出MLVA-1K MLVA-15、 MLVA-16和MLVA-21等多种方案。

Whatmore⑺在HOOF-Prints基础上新增13VNTR位点,建立MLVA-21,应 用121株布鲁氏菌分离株,分岀119个基因型,构建进化树显示,牛3型与羊种 聚为一类,犬种与猪种聚为一类,部分同种间各生物型彼此重叠,一定程度上 表现出布鲁氏菌种系进化的复杂性。Le Fleche等[⑶分析确认了 71个VNTR位 点,建立MLVA-15,应用257株分离株(含21株标准株)予以验证,所有菌株分 为204个基因型,与传统分类一致。SanogoM等冋利用MLVA方法探索了非洲 西部部分国家牛种3型布鲁氏菌的遗传多样性,发现25个基因型,其中19个 来自尼日利亚。

相对于国外,国内MLVA技术应用相对较晚,早期采用的高变八聚体寡核 昔酸指纹对上海华山医院分离的2株布鲁菌进行研究,发现均属B・suis2型。 Hai Jiang等小】运用MLVA-16对分离自人的105株羊种布鲁氏菌分型,得到69 个基因型。杨杰[⑹优化MLVA-16,结果表明MLVA-16能够区分所有标准菌株和 分离株,聚类结果同样表明犬种与猪种亲缘关系近,鉴别能力优MLVA-15 陈 燕芬M重新设计引物,优化条件,选取国内部分地区129株,所有菌株分出87 个基因型,牛种、羊种各聚为一支,犬种猪种为一支。SunMJ等问运用MLVA-16 对59株分离自新疆的流行株分型得到2g个新基因型。Tian GZ等〔⑼对我国自 1953-2013年间600株布鲁氏菌流行株运用MLVA-11进行分型,区分出104个 基因型。

  1. MLVA技术在分子流行病学中的应用

4.1探究布鲁氏菌病传播的流行关系

分子流行病学是监测传染病传播的有效途径,它是建立在“感染相同菌株的 患者有相同的传染源即存在分子流行病学联系''假设基础之上的,在评估布病近 亲传播方面引用了“簇"cluster)的概念,“簇吟弋表的是具有高度相似或相同DNA 分型特征的一组布鲁氏杆菌。成簇病人所感染的布鲁氏杆菌往往可能来自于相 同的传染源,如果在检测中至少两株结核菌的基因型完全相同,那么这些菌株 就属于同一个基因分型簇。人群中成簇的比例越高,意味着在该地区有相同基 因分型簇的患者是由共同的传染源引起,有爆发流行可能,与之对应的菌株就 是当地流行的优势菌株。

HOOF Prints和MLVA-16技术在共同来源的人类布病爆发或被证实为复发 的研究中都得到了准确的鉴定[231]。MLVA-16也被用来确定实验室获得感染, 同时也证实在特定区域类的布病也存在多态性,鉴定到从秘鲁分离的 B .melitensis与之前在欧洲分离的菌,形成一个显著不同的簇凹,MLVA-15也被 用来评价活疫苗株的稳定性,结果表明同一区域内的野猪和家猪分离的B .suis 为一个基因型[23-24]。Minharro S等[⑸应用MLVA-16分型方法对167137株牛种 布鲁菌进行了分型以及菌株分布情况的研究,证实了巴西境内分布的牛种菌主 要有牛1、2、和3型,其中3型为3b型;并首次描述了有牛种4型和6型在存 在。

杨红霞[26]等对山西祁县同年内多个乡村分离的布鲁氏菌进行mlvA分型迅 速查找到引起多地疫情的布鲁氏菌病传染源。李世军等从贵州首次分离的6株 羊种布鲁氏菌与其他省份的105株布鲁氏菌进行MLVA-16聚类分析,结果显示 其中5株与云南、广东和福建的羊种3型布鲁氏菌聚类较近,提示贵州作为输 入性传播的布鲁氏菌病,其云南、福建和广东可能为其布鲁氏菌病的来源地旳。 刘武凶对甘肃省首例分离的布鲁氏菌菌株采用(MLVA) -16分型方法,在线上 传数据库进行分型并做聚类分析,结果显示该菌株与浙江、广东、福建、云南 羊种3型布鲁氏菌聚类为一类。证实为输入性疫情。刘志国等[29】人利用MLVA 方法对来自不同宿主的菌株进行基因分型,揭示了内蒙古羊种布鲁氏菌在羊牛 (骆驼)和骆驼(羊牛)中相互循环传播,最后传染给人的潜在传播模式。

4.2证明布鲁氏菌的种系间遗传与进化

Kreizinger等网用MLVA-16与其MLVA-11子集对来源于野兔、野猪和家猪 的猪布鲁菌生物2型分离株进行遗传学相关性分析,发现来自匈牙利的野兔和 野猪分离株呈现大幅遗传分化,表明单独谱系没有跨种属感染的实例,欧洲的 野猪基因型一般基于地理起源集群。Her等⑶]采用17个位点对韩国1996-2008 年共177株流产布鲁菌分型研究,发现MLVA-17对原始接种菌株有足够稳定的 鉴定能力,鉴定出来源于动物和人类的布鲁菌具有遗传相关性。Rees等阳运用 6 种 VNTRs(VNTR17、VNTRK7、VNTR2、VNTR5A, HOOF2 和 VNTR12A 发 的79布鲁菌菌株分型,聚类图发现有两个主要的分支,51种特殊的小分支,为 布鲁菌病疫情流行株系间遗传与进化的研究提供了依据。Garofolo[33]对意大利南 部8个地区160个农场的布鲁氏菌VNTR基因型的遗传多样性和地理分布进行 了精细分析,基于16个VNTR位点检测到56个基因型,其中43个为首次检测 出的基因型,占比77%,提75意大利南部的布鲁氏菌进行了较大进化变异。

钟志军等[河应用15个VNTR位点对我国保存的19株布鲁菌标准株与4株 减毒活疫苗以及松源地区10株临床分离株进行基因多态性与遗传研究,发现15 个位点能区分大部分种的不同亚种。此外,在10株临床分离株中有8株聚类到 羊种2型,表明目前在松源地区流行以羊种2型为主。田国忠等时人选择11个 可变数目串联重复序列位点,对1953-2013年全球48个国家和地区分离的布鲁 氏菌VNTR资料进行聚类分析,绘制系统发育树和最小生成树,结果显示中国 羊种布鲁氏菌与土耳其、黎巴嫩、以色列和德国同源性较近,牛种生物1型与 巴西和葡萄牙同源性较近,牛种生物3型具有中国地理特异性,中国猪种布鲁 氏菌以生物1和3型为主,并且具有地域特异性,尽管波兰、美国和克罗地亚 也有生物1型菌株,但与中国菌株有基因型上的差异,中国分离的生物3型与 印度分离的菌株具有同源性。欧洲地区猪种菌主要是生物2型为主,且葡萄牙 和西班牙具有极高的同源性;犬种菌主要是来自中国和韩国,而且具有同源性。

5 •总结与展望

布鲁菌属作为一类烈性病原菌和重要的生物战剂[殉,对菌株进行准确分型、 流行病学调查和溯源分析、暴发后寻找感染源头以及控制传播尤为重要。目前 用于布鲁氏菌基因分型的主要有16个位点,包括bruce04> bruce07> bruce09> brucel6> bruce30> bruce06> bruceO8 > brucell> brucel2> brucel8 > brucel9> bruce21> bruce42> bruce43> bruce45 和 bruce55o 其中 bruce04> bruce07> bruce09> brucel6 和bruce30等位点,由于其变异系数大,适合疫情暴发的菌株溯源,而bruce06> bruceO8> brucell> brucel2> brucel8> brucel9> bruce21> bruce42> bruce43 > bruce45 和bmce55等位点(MLVA11 Orsay)的变异系数小,适合研究布鲁氏菌的进化关系 和流行病学特征〔°辽37]。随着细菌全基因组序列的公布,越来越多的细菌MLVA 数据库逐渐建立与完善,便于数据比较和分析。未来MLVA技术应着重进行不 同分析仪器、实验操作标准规程及标准菌株的应用研究,以构建全球或地区统 一的MLVA分型数据库,使MLVA技术在细菌分型方面发挥更大的作用。

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