结核分枝杆菌德拉马尼耐药相关基因突变的研究论文

2020年11月30日13:45:33结核分枝杆菌德拉马尼耐药相关基因突变的研究论文已关闭评论

结核分枝杆菌德拉马尼耐药相关基因突变的研究论文

中文摘要

目的:了解治疗耐多药结核病新药德拉马尼对结核分枝杆菌相关耐药基因突变 以及与体外药敏表型的相关性,为德拉马尼治疗耐多药结核病提供实验室数据。 方法:收集2017年〜2018年本院肺结核患者临床痰标本进行抗酸染色、结核分 枝杆菌培养获得结核分枝杆菌临床分离菌株,利用CTAB法提取菌株DNA,进 行PCR验证确定为结核分枝杆菌后,进行全基因组测序,对德拉马尼耐药相关 基因〃c仞、沧刃、JbiA矽和/SzC进行分析,与结核分枝杆菌标准菌株H37Rv 序列进行比对,分析耐药相关基因突变位点;应用液体法将痰培养阳性的结核分 枝杆菌临床分离株进行德拉马尼表型药敏试验及MIC测定,以及比例法进行抗 结核一线和二线药的表型药物敏感试验;分析对比德拉马尼耐药相关基因突变与 药敏表型的关系,以及德拉马尼与利福平耐药相关性。

结果:本研究共获得124例结核分枝杆菌临床分离株,利用CTAB法提取DNA 进行全基因组测序,成功获得123例全基因组测序数据,德拉马尼5个耐药相关 基因ddn、fgdl, fbiA. 〃出和〃ZC在123例结核分枝杆菌临床分离株中共发现 10个非同义突变位点,具体如下:力渤共出现3个非同义突变点,分别为G158A

(Gly53Asp)、C160T (Arg54Cys)和 G421A (Aspl41Asn),突变率为 2.4% (3/123);沧刃出现1个同义突变点T960C (Phe320Phe) ; 共出现5个突 变点,其中突变点 G595A(Alal99Thr) > G616A(Ala206Thr) > C584G(Alal95Gly) 为非同义突变,C337T (Leull3Leu)和G315A (GlylO5Gly)为同义突变,非同 义突变率为3.3% (4/123) ; JbiB出现1个非同义突变位点C997T (Arg333Cys), 突变率为1.6%(2/123);>C共出现5个突变点,其中突变点C1571G(Ala524Gly)、 A1711G(Lys571Glu)和 T1640CCVal547Ala)为非同义突变,C2427G(Gly809Gly) 和G630C (Ser210Ser)为同义突变,非同义突变率为4.9% (6/123)。进行德拉 马尼表型药物敏感试验(液体法)及MIC测定,浓度范围为0.002〜1.024卩g/ml, MIC50 为 0.064(ig/ml, MIC90 为 0.512(ig/ml, H37Rv 的 MIC 为 0.016(ig/ml 和 0.008(ig/mlo 6例结核分枝杆菌临床分离株德拉马尼MIC>1.024^g/ml,其中2 例出现沧刃・T960C (Phe320Phe)突变,1 例出现#M-C337T (Leull3Leu)和 #zL4-G315A(GlylO5Gly )突变,1 例出现 fbiC-C 15 71G (Ala524Gly )和 #/C-C2427G

(Gly809Gly )突变,1 例出现 #zC-C1571G(Ala524Gly )突变,1 例出现 #zL4-C337T (Leull3Leu )和 fgdl-T960C ( Phe320Phe )突变。德拉马尼 MIC 为 0.004^1.024(ig/ml 的 69 例菌株中,存在 fbiA-G616A (Ala206Thr)和#z^-C584G

(Alal95Gly)突变的菌株 MIC 为 0.512(ig/ml,存在#/C-T1640C (Val547Ala) 的MIC为0.256(ig/ml; 50% (3/6)的德拉马尼耐药菌株和59.4% (41/69) 的德拉马尼敏感菌株中均存在fgdl-T960C (Phe320Phe),存在ddn-G!58A

(Gly53Asp)和 C160T(Arg54Cys)突变的菌株德拉马尼的 MIC 均为 0.004(ig/ml; 存在#/5-C997T (Arg333Cys)的菌株德拉马尼 MIC值为0.008(ig/ml。进 行抗结核一、二线药物敏感试验(固体比例法)后获得利福平耐药菌株52例(单 耐利福平2例,多耐药2例,耐多药44例,广泛耐药4例),利福平敏感菌株 72例(全敏感68例,多耐药4例)。另外在利福平耐药菌株中,德拉马尼耐药 率(MIC>1.024(ig/ml)为15% (5/33),在利福平敏感菌株中,德拉马尼耐药 率为 2.4% (1/42)-

结论:本研究成功获得123例结核分枝杆菌临床分离株的全基因组测序结果, 在德拉马尼5个耐药相关基因ddn, fgdl, fbiA, JbiBjbiC中发现10个非同义 突变位点,其中#z^-C584G(Alal95Gly) >#zL4-G616A(Ala206Thr) >#/C-C1571G

(Ala524Gly)和#zC-T1640C (Val547Ala)可能与德拉马尼耐药相关, #/5-C997T (Arg333Cys) > 加介G158A (Gly53Asp)和水加・C160T (Arg54Cys) 未明显导致德拉马尼MIC升高,与德拉马尼耐药关系尚不明确。本研究发现 ddn 基因的 G421A、G158A 和 C160T 突变,〃z% 基因的 G616A、G595A 和 C584G 突变,:fbiB基因的C997T突变,以及〃ZC基因的C1571G、T1640C和A1711G 突变目前未见报道,其意义有待进一步研究。此外,利福平表型耐药与德拉马尼 表型耐药无明显相关性。

关键词:结核分枝杆菌,耐药结核病,德拉马尼,基因突变,fbiA, JbiC,全基 因组测序

Delamanid resistance related genes in clinical isolated
strains of Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Objective: To understand the mutation of Delamanid-resistant genes associated with Mycobacterium Tuberculosis (MDR-TB) and the correlation with drug-resistant phenotype in vitro of the new drug delamanid for the treatment of MDR-TB,and to provide laboratory data for the treatment of MDR-TB with Delamanid.

Methods: Collected in our hospital in 2017〜2018 tuberculosis patients clinical sputum specimens of this acid fest stain,mycobacterium tuberculosis culture for mycobacterium tuberculosis in clinical isolates,using the method of CTAB extraction strains of DNA,identified as mycobacterium tuberculosis PCR,to carry on the whole genome scqucncmg.ddnfgdl,fbiA,fbiB and fbiC of delamanid resistance related gene is analysed, and contrast with the standard strains of mycobacterium tuberculosis H37Rv sequences .The clinical isolates of mycobacterium tuberculosis were tested by the liquid method for the phenotypic drug sensitivity test and the MIC test,and the phenotypic drug sensitivity test for the first-line and second-line anti-tuberculosis drugs was carried out by the proportion method.To analyze and compare the relationship between delamanid resistance related gene mutation and drug susceptibility phenotype,as well as the correlation between delamanid and rifampin resistance.

Results: In this study,a total of 124 clinical isolates of Mycobacterium Tuberculosis were obtained. DNA was extracted by CTAB method for whole-genome sequencing, and 123 whole-genome sequencing data were successfully obtamcd.Ddn,fgdl,fbiA, fbiB and fbiC of five delamanid drug-resistant genes were found in a total of 10 non-synonymous mutation sites in 123 clinical isolates of mycobacterium tuberculosis, as follows:there were 3 mutation points in 6/旳,G158A (Gly53Asp),C 160T (Arg54Cys) and G421A (Asp 141 Asp) were non-synonymous mutations, and the non-synonymous mutation rate was 2.4% (3/123),T960C (Phe320Phe) was found in fgdl.There were 5 mutation points in among which G595A (Alai99Thr),G616A (Ala206Thr)? C584G (Alal95Gly) were non-synonymous mutations, C337T (Leull3Leu) and G315A (GlylO5Gly) were synonymous mutations,and the non-synonymous mutation rate was 3.3% (4/123).One non-synonymous mutation site C997T (Arg333Cys) was found in fbiB. and the mutation rate was 1.6% (2/123).There were 5 mutation sites in fljiC, of which C1571G (Ala524Gly) and A1711G (Lys571Glu) were non-synonymous mutations, T1640C (Val547Ala),C2427G (Gly809Gly) and G630C (Ser210Ser) were synonymous mutations, and the non-synonymous mutation rate was 4.1% (5/123).The drug sensitivity test (liquid method) and MIC for the phenotype of delamanid were conducted, with concentrations ranging from 0.002〜1.024)big/ml, MIC50 is 0.064|Lig/ml, MIC90 is 0.512|iig/ml, and H37Rv is 0.016|Lig/ml and 0.008|Lig/ml respectively.lt was found that 6 cases of delamanid MIC > 1.024|Lig/ml, among which 1 case had mutation pointsy&zL4-C337T (Leull3Leu) and/SzL4-G315A (GlylO5Gly), 1 case had mutation points #/5-C1571G (Ala524Gly) and #zC-C2427G (Gly809Gly),and 1 case had mutation points y&/5-C1571G (Ala524Gly).Mutation points fbiA-C331T (Leull3Leu) and fgdl-T960C (Phe320Phe) were found in 1 case and 2 cases had fgdl-T960C (Phe320Phe).Among the 69 strains with a MIC of 0.004^1.024(ig/ml,the MIC of#z^-G616A (Ala206Thr) and#z^-C584G (Alal95Gly) mutated strains was 0.512 |Lig/ml?and the MIC of fbiC-T 1640C (Val547Ala) was 0.256|Lig/ml.Fg(i7-T960C was found in 50% of delamanid resistant strains and 59.4% of delamanid sensitive strains, showing no significant correlation with delamanid resistance.The MIC of the mutated strains of ddn-G 158A(Gly53Asp) and C160T (Arg54Cys) was 0.004|Lig/ml.The MIC of delamanid in 2 cases with/&/5-C997T was 0.008|iig/ml.52 cases of rifampicin resistant strains (2 cases of rifampicin alone, 2 cases of multidrug resistance, 44 cases of multidrug resistance, and 4 cases of extensive drug resistance) and 72 cases of rifampicin sensitive strains (68 cases of total sensitivity, 4 cases of multidrug resistance) were obtained after the sensitivity test of first-line and second-line drugs against tuberculosis (solid proportion method).In addition, in rifampicin resistant strains,the drug resistance rate of delamanid (MIC > 1.024|Lig/ml) was 15% (5/33) ,and in rifampin sensitive strains, the drug resistance rate of delamanid was 2.4% (1/42).

Conclusion In this study,whole-genome sequencing results of 123 clinical isolates of mycobacterium tuberculosis were successfully obtained. Mutational sites were found in ddn, fgdl,fbiA, fbiB and fbiC genes related to drug resistance of delamanid. It was speculated that non-synonymous mutational sites of fbiA and fbiC genes #zL4-C584G (ALal95Gly)屛z/・G616A (Ala206Thr) 〃zC・C1571G (Ala524Gly) and y&zC-T1640C ( Val547Ala ) might be related to resistance of mycobacterium tuberculosis to delamanid.The mutation sites of fbiB and ddn genes /&/5-C997T

(Arg333Cys) 0必・G158A (Gly53Asp) and ^-C160T (Arg54Cys) did not significantly lead to the increase of delamanid MIC,so it is necessary to further expand the sample size for indepth study on whether it is related to drug resistance.In this study,G421A, G158A and C160T mutations of ddn gene,G616A, G595A and C584G mutations offbiA gene, C997T mutations offbiB gene and C1571G, T1640C and A1711G mutations of fbiC gene have not been reported, and their significance remains to be further studied.There was no significant correlation between rifampin resistance and delamanid resistance.

Key Words: Mycobacterium tuberculosis; Drug-resistant tuberculosis;delamanid; fbiA; fbiC; Genetic mutations; Whole genome sequencing

由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)引起的结核病(tuberculosis, TB)是一种慢性传染病,主要侵犯肺部,引起咳嗽、乏力、咯血等症状,也会 累及人体肺外其他组织器官,当肺结核患者通过咳嗽等方式向空气中排出细菌时, 这种疾病就会传播。WHO《2019年全球结核病报告》指出,2018年,全球范围 内约有1000万新发结核病病例,约150万人死于结核病,是目前全球传染病致 死的主要原因⑴有效的药物治疗仍是治疗结核病的主要手段,最早出现在20世 纪40年代,它们大大降低了结核病的负担水平,但随着耐多药结核病的出现, 终止结核病仍然是一种愿望。2018年报告的耐多药结核病患者总体治愈率仅为 56%,广泛耐药结核病治愈率为39%0,即使采用最有效的治疗方法,耐多药结 核病的治愈率仍低,死亡率也高于药物敏感性结核病。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)数据报道,2018年估算约有50万例新增耐利福平 结核病(RR/TB),其中 78%为耐多药结核病(Multidrug resistance tuberculosis, MDR-TB),中国新发RR-TB/MDR-TB患者数量仍占据全球第二位⑴。耐药结 核菌的出现增加了结核病防治的难度,并阻碍终止结核病目标的实现,迫切需要 具有安全性的新型抗结核药物来扭转局势。

德拉马尼(Delamanid, DLM)是一种硝基咪卩坐类衍生物的新型抗结核药物, 由日本大冢制药厂合成,于2014年被欧洲药品管理局(European Medicines Agency, EMA)批准用于治疗成人肺部MDR-TBo它主要通过抑制分枝杆菌细 胞壁成分甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸的合成,在对结核分枝杆菌耐药菌株的 体内外试验中均表现出较强的抗菌活性⑶,与异烟腓不同的是,这种药物不抑 制—霉酸⑷,且分枝菌酸只存在于分枝杆菌细胞壁中,而在其他革兰阳性或 革兰阴性细菌中不存在,因此,德拉马尼对分枝杆菌的抑制作用具有特异 性⑷⑸,分枝菌酸使分枝杆菌细胞壁难以被药物渗透,因此,抑制菌酸合成 有助于药物渗透从而缩短治疗方案⑹⑺。

在国内外临床研究中,德拉马尼表现出早期的杀菌活性罔,德拉马尼与利福 平、毗嗪酰胺联合应用和只有利福平、异烟腓、乙胺丁醇、毗嗪酰胺组成的标准 方案对比,可以显著加快痰培养转阴率⑸。针对中国、美国、日本等9个国家的 一项临床研究表明,给予耐多药结核病患者德拉马尼有较好的疗效,小剂量组

(200mg/d)和大剂量组(400mg/d)患者痰培养转阴率均高于未使用德拉马尼 的耐多药结核病患者,且长疗程治疗C6个月)的痰培养转阴率和死亡率都优 于短疗程(S2个月)治疗[9】。Olayanju O等问进行的一项前瞻性研究,目的是 比较单用贝达卩奎卩林与贝达卩奎卩林和德拉马尼联合治疗耐多药结核病患者的 长期治疗结果和安全性,研究发现对于治疗预后差或耐药水平高的患者, 在组成有效治疗方案存在挑战时,德拉马尼可作为有效的联合治疗药物。 在WHO《2019耐药结核病治疗整合指南》Mi]以及《中国耐多药和利福平耐 药结核病治疗专家共识(2019版)》g中德拉马尼的地位均较前提升。此外, 德拉马尼的优势在于不受肝微粒体酶活性的影响,主要通过血浆白蛋白代谢和小 部分经细胞色素P450酶参与的多种代谢途径而非全部通过肝脏代谢,因此德拉 马尼肝毒性较小⑷21,有较高的安全性,是一种很有前景的新型抗结核药,有望 为耐多药结核病提供更短、更安全和更有效的治疗方案。

德拉马尼属于二环・4■硝基咪卩坐类药物[14],需要由脱氮黄素(辅因子F420)依 赖的硝基还原酶(应/刃)激活,这种酶将德拉马尼转化为一种无活性的去硝 基衍生物,目前认为该转化过程中产生一些中间体对结核分枝杆菌具有杀 菌作用问。该反应将F420的还原形式F42oH2氧化为F420,然后葡萄糖6磷酸脱 氢酶(fgdl)将F420还原为二氢形式,准备进入下一个还原周期,F420氧化还原 循环需要NADP依赖的葡萄糖・6■磷酸脫氢酶(沧刃)催化葡萄糖・6■磷酸氧化为 6■磷酸葡萄糖内酯,而fbiAfbiBfbiC参与F420辅因子的合成昭。德拉 马尼的抑制作用可能与NO等活性自由基的释放有关,而NO在哺乳动物 抵抗分枝杆菌感染的防御机制中起着关键作用Vi%

目前许多学者研究认为,结核分枝杆菌对德拉马尼耐药主要与激活前体药物 所需酶功能丧失有关,主要包括ddn.fgdl,参与F420生物合成途径的fbiA .JbiB fbiC任一基因突变也可能会引起结核分枝杆菌对德拉马尼耐药BE。 有研究证明德拉马尼与另一种硝基咪卩坐类药物PA-824有类似的耐药机制 [16]。

Ddn (Rv3547)全长 456bp (GenelD: 887496),其编码的一种膜结 合蛋白参与了氧化应激下的保护机制。。必将前药转化为三种主要代谢物, 一种去硝基咪卩坐和两种不稳定的副产物[20],去硝基咪卩坐代谢物随后释放出 HNO2,降解为NO0]。在PA-824耐药菌株中发现〃几突变体对噁卩坐环上具有较 长的疏水尾的硝基咪卩坐有部分抗性,所以推测具有长亲脂尾的底物可能会与ddn 发生立体选择性相互作用0],而德拉马尼同样是一种在恶卩坐环上有疏水尾的双 环4■硝基咪卩坐类药物。在一项研究中,有20%的耐德拉马尼菌株中鉴定出应仞 的突变[⑹。Haver^等人报告了 伽中19种不同位点的突变,包括终止点 突变;与药物激活相关的Gly81Asp突变。Gly81Ser突变在耐药菌株中出 现的频率很高(75.6%),但在敏感株(MICW0.0125mg/L)中也发现了同 样的突变,因此,是否与耐药性有关尚不清楚[绚。

沧刃基因(Rv0407)全长lOllbp (GenelD: 886418),其编码6■磷酸葡萄 糖酸脱氢酶,催化葡萄糖6■磷酸氧化为磷酸葡糖内酯,进而将F420还原为 F42OH20]。通过对PA-824敏感与耐药的结核分枝杆菌菌株的比较显示,编 码F420依赖的葡萄糖・6■磷酸脱氢酶的沧刃中开放阅读框突变导致PA-824 耐药Q], 一株XDR-TB分离株在用含有德拉马尼的方案治疗期间获得了对 德拉马尼的耐药性,发现fgdl ±有移码突变陆27]。目前全基因组转座子突 变筛选和其他遗传学研究未能证明沧〃/在Mtb复制或F420生物合成酶中的 重要性[28-30] o

参与 F420 生物合成途径的"z/ (Rv3261)、:fbiB (Rv3262) > fbiC CRvll73) 全长分别为996bp、1347bp、2571bp,在F420生物合成中,基因编码7,8・ 二甲基.8■轻基・5■去氮杂黄素(FO)合酶,将轻基茉基从4■轻基苯丙酮酸 转移到卩密噪二酮卩i], fbiC参与了卩密噪二酮和FO之间F420生物合成途径的 一部分,〃力对F420的生产至关重要[32> 33KfbiA和〃汩随后参与2■磷酸乳 酸的添加和生成F420辅因子的五聚谷氨酸尾部的聚合卩4]。fbiA编码2■磷酸 乳酸转移酶,负责将2■二磷酸・5■鸟昔的磷酸乳酯部分转移到FO中 编码L■谷氨酸连接酶,通过连续向F420-0中添加L■谷氨酸残基来催化F420 生物合成途径的最后步骤,产生聚L■谷氨酸尾fbiC基因的失活使结核 杆菌对氧化应激反应变得敏感旳。在其他已发表的研究中,发现〃滋与〃 ZC 的单核昔酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)的差异最大, 的突变频率最低,只出现在较低浓度的MIC中1株XDR-TB在阳 上有终止密码子突变页】,2株XDR-TB在fbiC上有单一氨基酸替代㈤]。 所以推测〃M和〃ZC基因突变是结核分枝杆菌对德拉马尼耐药的重要因素。

德拉马尼作为新型抗结核药,其耐药相关基因与耐药表型的研究较少。本 研究拟对结核分枝杆菌临床分离株进行全基因组测序,了解德拉马尼相关 耐药基因ddn. fgdl, fbiA. fliB及的突变与药敏表型的关系,同时了解 德拉马尼表型耐药与利福平表型耐药的相关性,为德拉马尼治疗结核病提供实验 室数据。

1材料与方法

1.1 主要标本

  1. 1. 1结核分枝杆菌标准菌株H37Rv由本省疾病预防控制中心结核病防治所提 供。
  2. 1. 2结核分枝杆菌临床标本来源于2017年〜2018年就诊于我院结核病病区与 门诊的肺结核患者临床痰标本。
  3. 1. 3纳入排除标准

(1) 纳入标准:①符合结核病确诊病例诊断标准②为抗结核治疗的初治及复治 患者③患者依从性良好④有结核分枝杆菌菌株者。

(2)     排除标准:①年龄小于16周岁者②患有严重并发症者③患者依从性差,不 同意参加者。

1.2主要试剂

1.2. 1主要试剂及生产厂家(表1)

表1实验试剂及生产单位

1.2.2主要试剂配制(表2)

  1. 3实验方法
  2. 3. 1标本涂片、萋-纳氏(ZiehlNeelsen)抗酸染色及显微镜检查
  • 标本涂片、萋-纳氏(Ziehl-Neelsen)抗酸染色
  • 涂片:在载玻片右侧2/3处,用无菌棉签取痰标本均匀涂抹,直径约 0-2. 0cm, 自然风干后酒精灯烧灼使其固定。
  • 将上一步的涂片水浴加热(50-70°C),在标本中心处覆盖石碳酸红染液,20min 后取出静置冷却,再用馆水冲洗后晾干。
  • 3%盐酸酒精滴加在标本处脱色,当肉眼观察不再出现红色液体流下即可用流水

冲洗。

  • 在标本处再覆盖亚甲兰复染液,方法和位置同上,流水冲洗lmin,自然晾干。

(2)显微镜检查

  • 用40倍物镜观察在载物台上固定的玻片,见细菌形态,再用100倍油镜进行 观察。
  • 抗酸性细菌染色在淡蓝色背景下观察呈现红色,形态稍弯曲,有分枝生长趋势 且细长,Ziehl-Neelsen抗酸染色报告标准见表4。
  1. 3. 2结核分枝杆菌培养

(1)酸性培养基的制备

  • 称取表5各组成成分,置于干净的烧瓶使其充分混合溶解后进行高压(121°C) 灭菌20mino

表5配制1632mL酸性培养基基础液成分

  • 选取新鲜鸡蛋,刷洗干净后浸泡在75%酒精中30min,把消毒后的打蛋器和鸡 蛋在紫外线下消毒30min,打破鸡蛋后将全卵放置于灭菌容器中,用打蛋器将蛋 黄与蛋清充分搅拌在一起,充分混匀后用无菌纱布过滤,用蒸馆水定容至1000 mL, 加入第一步配好的1632mL酸性培养基基础液和2%孔雀绿20 mL摇匀后,室温下 静置lho
  • 将上述溶液按每管7ml分装到培养管中,放置于倾斜角度为30°的倾斜架, 然后置于85 °C蒸汽恒温烘箱中lh。
  • 烘烤固定结束后于超净工作台内室温冷却后放置在4 °C冰箱内保存。
  • 为了鉴定本次培养基制作是否达到质控要求,选取本次制作的1%的培养管放 置于37 °C恒温培养箱中,若培养管内未见细菌生长则认为质量合格。

(2) 痰标本处理

将痰标本用4% NaOH约2〜4ml消化约15min,待时间结束后将液体放入 另一管中,将离心机转速设置为3000 rpm,在温度范围为20 °C左右离心5 min。

(3) 接种及培养

吸取步骤二中离心后沉淀物均匀接种在酸性培养基斜面上,每个痰标本接种 2管,瓶盖拧至3/4紧,做好标记后放入37 °C C02培养箱中培养,接种后在第 三天、第七天观察菌株生长情况,之后每周观察一次,1-2月后报告结果。

(4) 结核分枝杆菌培养结果判定标准(表6)

表6分枝杆菌培养结果判定标准


  • TE溶解,再用ND-1000核酸蛋白测定仪检测其DNA浓度及OD值。
    用无菌的接种环将上述菌落刮取至装有1皿的EP管中,置于80°C恒温水 浴箱,灭活30mino
  • 灭活后的菌液4500 rpm lOmin离心,弃掉部分上清液(仅留约400yL上清)。
  • 加入20此的50mg/ml溶菌酶,颠倒混匀,置于37°C恒温水浴2h或过夜, 约 12ho
  • 提前将CTAB/NaCL置于65°C水浴中预热;异丙醇置于-20°C预冷。
  • 向EP管中加入70yL10%SDS和10yL20mg/m 1蛋白酶K,轻柔的混匀,置 于温度恒定在65 °C的水浴锅中10 mine
  • 将lOO^L 5MNaCl和lOO^L CTAB/NaCl加入EP管中,轻柔的颠倒混匀, 在温度恒定在65 °C的水中保留10 mine
  • 加入等体积(约700yL)的氯仿/异戊醇(25: 24: 1),颠倒数次使其充 分混匀,13500 rpm离心lOmin□
  • 用200yL的枪头小心取上清液(尽量不要取到中间层的白色沉淀物)至 一干净的EP管中。
  • 加入6体积(约420yL)的异丙醇,颠倒混匀,若已有絮状物可直接进 行下一步,若无絮状物可加入4yL20mg/糖原。
  • -20°C放置2h或者更长时间,取出后以16000rpm离心30min,同时将1 XTE置于37°C水浴中预热备用,。
  • 离心后,用枪头吸去上清液,避免白色沉淀丢失,加入150^iL 75%酒精, 上下颠倒3-5次,以13500rpm离心lmin (重复1次)
  • 室温晾干3-5min,可见白色沉淀逐渐变为透明状。
  • DNA溶解:根据加入异丙醇后絮状物的有无及多少,用20-200^iL的1 X
  • CTAB法提取结核分枝杆菌DNA定量分析

待提取结核菌DNA后,使用ND-1000核酸蛋白分析仪检测CTAB法提取

的结核分枝杆菌DNA浓度及质量,此次提取的结核分枝杆菌临床分禺株DNA 均符合实验要求。例:图2为:54号菌株DNA浓度1215. 6ng/nL, OD260/280 为 1.80o

图1 ND-1000检测结核分枝杆菌DNA浓度

(15)鉴定标本是否为结核分枝杆菌

  • DNA模板制备:在每个PCR管里加入PCR Mix( 5yL Tap酶,2yL引物,2^iLddH2O)
  • 聚合酶链式(PCR)反应条件:

预变形:94°C min

变性:94°C 30秒「

退火:62°C 30秒卜25循环

延伸:72 °C 30秒」

再延伸:72 °C 7分钟

  • 验证PCR反应产物:

1)称取0.4g琼脂糖,加入40ml 0. 5XTBE,在天平上称重后放入微波炉,高火 加热2-3分钟,使琼脂糖完全溶化,摇匀,观察为均一透明溶液,无颗粒,再在 天平称量,补入适量的ddH20,以保持胶的浓度不受影响。

  • 待融化的凝胶冷却至55°C左右时加入2ul漠化乙锭(10ug/ml),轻轻旋转 以充分混匀。用18齿的梳子制胶,将温热的凝胶浇灌入胶盘。
  • 待凝胶完全凝结(室温下放置40分钟),小心拔出梳子,取出托盘,放入电 泳槽中。电泳槽中加入 5XTBE缓冲液,没过胶面1〜2mm。
  • PCR产物上样:每个孔中加入3ul PCR产物,每块胶上留一个孔加入5ul的 50bp DNA Marker I,每块胶上加一个H37Rv做为质量控制。电泳电压设置为150V, 电泳时间为45分钟。

1.3.4结核分枝杆菌临床分离株全基因组测序

  • 将上述DNA低温保存送至北京邦莱生物科技有限公司进行全基因组测序。
  • 将全基因组测序结果通过linux系统,使用BWA, Picard-tools, samtools,

GenomeAnalysis,Varscan等软件提取全基因组中全部单核昔酸多态性(Single

nucleotide polymorphism, SNP)位点,如图2所示为部分路径代码及终端命令。

将SNP与H37Rv标准序列进行比对,在与德拉马尼耐药有关的应仞、沧刃、 fbiA ,fliB及〃zC序列范围内检测有无突变位点。以“以基因突变分析为例, ft)iA 基因组序列为 3 (3640543. . 3641538),如图 3 所示为 3640879 突 变位点,在〃対基因中为第337位点,碱基由C突变为T。图2 linux系统中部分编程代码及终端命令

图3 /M4基因第337位点突变测序分析图(同义突变)

C337T完全匹配,故该基因突变位点曾有过报道。

Sequence ID:POOR7*7* Length: 4539435 Number af Matches: 1Mycobacterium tuberculosis strain 0A092DS genome

Range 1 376656 to 377651 GenBmnX Graphics声分散管中,放入超声分散仪;(2)将罗氏培养基上的菌,用接种环刮取适量菌落置于装有1H11生理盐水的超

  • 超声分散后会显示McFarland,调整菌液和生理盐水的量至McFarland达到

2.5〜3.0Mcf (lMc匸2X107CFU/ML, 2.5^3.0Mcf^5X107^6X107CFU/ML)

  • 取lOOpd混悬液至装有10ml 7H9-OADC药敏接种培养液中,涡旋振荡混匀 30秒。
  • 向96孔药敏板中除阴性对照空外每孔加样200ul菌液,一个96孔板可加 入8个不同菌株,德拉马尼药物终浓度范围为002-1.024(ig/ml (如图6),阴 性对照孔加入200(11 7H9-OADC培养液,质控菌株选用H37Rv。

图6德拉马尼96孔药敏板图示

  • 用条形封口膜缠绕药敏板并密封,置于37°C的温箱中孵育培养,前3天观 察板有无污染并拍照,以后每周观察菌落生长情况并拍照,白色沉淀区域表示该 药物浓度下有菌生长,黑色区域表示结核菌生长被抑制,如图7、图8所示。

阳性对照 1.024 0.512 0.256 0.128 0.064 0.032 0.016 0.008 0.004 0.002 阴性对照

阳性对照 1.024 0.512 0.256 0.128 0.064 0.032 0.016 0.008 0.004 0.002 阴性对照3. 6抗结核一线药与二线药药物敏感试验;40

(1)改良罗氏培养基的配制(表7):

表7改良罗氏培养基配置

(2)配制含抗结核药物培养基(表8)

表8含药培养基浓度

(3)     制备菌悬液(在生物安全柜内操作)

  • 准备物品:10%吐温80, 0.5%吐温80生理盐水,二级生物安全柜,玻璃比浊 管,5皿离心管,磨菌器,无菌一次性接种环。
  • 在每个玻璃比浊管和离心管中分装好 5%吐温80生理盐水,向磨菌器中 加入lOO^iLO. 5%吐温80生理盐水,用接种环轻轻刮取酸性培养基中的菌落,力口 入到磨菌器中,使用磨菌棒研磨至菌液。
  • 制备lmg/ml菌悬液:在装有 5%吐温80生理盐水的玻璃比浊管中加入10 yL结核分枝杆菌菌落液,混匀,调整生理盐水与菌落液的量使麦氏浓度达到1.0 即可。
  • 制备lO^mg/mL菌悬液和10_4mg/mL菌悬液:取10 |iiLlmg/ml菌悬液加入到 装有 5%吐温80生理盐水的离心管中,混匀,即浓度为10-2mg/mL菌悬液, 取IO-2 mg/mL菌悬液加入到装有lmlO. 5%吐温80生理盐水的离心管中,混匀, 即浓度为ICT4 mg/mL菌悬液。

(4)    接种及培养

使用消毒的接种环沾mg/mL及IO 4mg/mL菌悬液,分别接种在药敏培 养基及无药对照培养基上,做好标记放入37°CCO2恒温培育箱,3・4周观察菌落 生长情况。

(5)     判读药物敏感试验结果

①菌落结果观察与记录如下(表9)

表9观察与记录结果标准

②计算耐药百分比:

含抗结核药物培养基上生长的菌落数

耐药百分比=----------------------------------- x 100%

无药对照培养基上生长的菌落数

表10耐药百分比结果判读

2结果

  1. 1肺结核患者及临床标本基本信息

收集痰标本进行结核分枝杆菌培养后共获得124例结核分枝杆菌临床分离 株,其中因11例个人信息(包括性别、年龄或初/复治情况)缺失,因此统计中 仅包括113例。其中男性73例,女性患者40例,男女比例为1:0. 55,最低年 龄17岁,最高年龄83岁,平均年龄46. 7岁,初治患者68例,复治患者45例 (表 11) O

表11  113例肺结核患者年龄、性别、初/复治情况

  1. 2全基因组测序结果

将124例结核分枝杆菌临床分离株的DNA进行全基因组测序,其中1例因
测序失败被排除在研究之外,因此将123例菌株的DNA全基因组测序结果通过
linux 系统,BWA, Picard-tools, samtools, GenomeAnalysis,Varscan 等软件分析
以及与H37Rv标准序列进行比对,在与德拉马尼耐药相关的加弘fgdl, fbiA,
〃洱及向C五个基因中均存在突变位点,总检出率分别为2.4%, 60.2%, 11.3%,
1.6%及7.2%Oddn中发现2个非同义突变位点和1个同义突变位点,总突变
率为2.4%; fgdl中发现1个同义突变位点,总突变频率为60.2%; JbiA中发现2
个同义突变和3个非同义突变,总突变频率为11.3%; 〃汩中发现1个非同义突
变,总突变频率为1.6%; 中发现2个同义突变和3个非同义突变,总突变
频率为7.2%,具体突变形式及氨基酸改变如下(表12)-

表12德拉马尼5个耐药相关基因在123例临床菌株中的检测分析

2.3.1为了进一步了解基因突变与德拉马尼耐药的关系,我们进行了德拉马尼的 表型药物敏感试验,在123例结核分枝杆菌临床分离株中,由于污染或生长欠佳 排除了 48株,同时使用2株H37Rv (1株生长2周,1株生长3周)在与试验 相同的条件下进行质量控制,共获得75例MIC信息(表13) o通过参考国内 外文献肌40,41],将德拉马尼浓度范围定为0.002〜1.024憾/ml,除阴性对照孔外,均 有200以菌液,每个孔中菌量浓度为5X107〜6X107CFU/ML,阴性对照孔加入 7H9-OADC培养液,阳性对照孔中无药物。将所有药敏板在37。(2恒温箱下孵育 14天,观察菌株生长情况及MIC值,发现6例MIC>1.024(ig/m 1的耐药菌株, 69例结核分枝杆菌分离株的 MIC为0.004〜1.024憾/ml, MIC50为0.064(ig/ml, MIC90为0.512(ig/ml (表13),在H37Rv对照菌株中,MIC分别为0.016和 0.008(ig/ml,具体分布详见表13。2.3德拉马尼表型药敏及MIC测定结果(液体法)

表13  75例结核分枝杆菌分离株的MIC ( u g/ml)分布情况

2.3.2德拉马尼MIC值>1.024(ig/ml与基因型比较

本试验通过分析6例MIC>1.024pig/ml的德拉马尼耐药菌株的基因型发现其 中 1 例同时存在突变点#z^-C337T (Leull3Leu)和#zL4-G315A (GlylO5Gly), 1 例同时存在突变点#zC-C1571G (Ala524Gly)和#zC-C2427G (Gly809Gly), 1例存在突变点 >C-C1571G ( Ala524Gly ) , 1例存在突变点#zL4-C337T (Leull3Leu)和 fgdl-T960C (Phe320Phe) , 2 例存在突变点 fgdl-T960C (Phe320Phe)。6例德拉马尼表型耐药(MIC>1.024憾/ml)与基因型关系见表

表14 6例德拉马尼表型耐药(MIO1. 024pig/ml)与基因突变关系

2.3.3德拉马尼MIC值(0.004〜1.024憾/ml)与基因型比较

69例德拉马尼表型药敏MIC为0.004〜1.024(ig/ml, MIC值与沧刃-T960C

(Phe320Phe)无明显相关性,存在〃沏基因突变的菌株MIC为0.004(ig/ml,存 在JbiA-G6l6A > C584G非同义突变位点的菌株MIC为0.512(ig/ml,存在 #/5-C997T的菌株MIC为0.008(ig/mlo另外有25例无突变位点,MIC值在 0.004〜0.128(ig/ml,其余44例具体基因突变及氨基酸改变形式与MIC值的关系 如表15所示,其中3例同时存在2个突变位点,2例同时存在3个突变位点, 故表中菌株数量为51例。

表15  44例德拉马尼表型药敏MIC (0.0041.024/ml)与基因突变位点关系情况

基因突变位点碱基突变密码子变化           氨基酸变化           MIC (憾/ml) 菌株数量(例)

注:“F”表示失败的试验菌株或菌株受污染。

2.4基因突变菌株基因型与表型的关系

本试验成功获取123例结核分枝杆菌临床分离株全基因组测序结果,在与德 拉马尼耐药相关的显仞,fgdl, fbiA, 〃洱及五个基因中均存在突变位点, 总检出率分别为 2.4% (3/123) , 60.2% (74/123) , 11.3% (14/123) , 1.6% (2/123) 及7.3% (9/123),应用96微孔板液体法进行德拉马尼表型药敏试验及MIC测 定,MIC>1.024(ig/ml为德拉马尼耐药菌株,MIC在0.004〜1.024(ig/m 1范围内为 德拉马尼敏感菌株,我们发现有59.4% (41/69)的德拉马尼敏感菌株和50% (3/6) 的德拉马尼耐药菌株都存在fgdl-T960C突变,考虑为基因多态性,可能与耐药 无关,其余四个基因具体突变位点与德拉马尼表型药敏的关系如下表所示(表 16) o

表16 ddn, fbiA, 〃沼及“疋基因突变菌株基因型与德拉马尼表型的关系

注:DLM:德拉马尼;“NA”表示药敏失败,无结果;R:耐药;S:敏感

2.5抗结核一线药与二线药药物敏感试验(固体比例法)结果

将123例临床痰标本经培养后,采用固体比例法进行包括一线药物(异烟腓、
利福平、乙胺丁醇和链霉素等四种药物)及二线药物(氧氟沙星、左氧氟沙星、
莫西沙星、加替沙星、阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素、丙硫异烟胺和对氨基水
杨酸等9种药物)在内的13种抗结核药药物敏感试验,获得对利福平敏感的菌
株72例(68例全敏感,4例多耐药),对利福平耐药的菌株52例(2例单耐
药,44例耐多药,2例多耐药,4例广泛耐药)。有9例缺乏初/复治情况信息,
因此统计中仅包括115例,在耐药菌株中,复治患者比例高于初治患者比例,在
敏感菌株中,初治患者比例高于复治患者比例(表17)。

表17 115例结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药与初/复治的关系

注:全敏感:对所检测的一线和二线抗结核药物均敏感;耐多药(MDR-TE):结核病患者感染的结核杆菌 体外被证实至少对异烟月井、利福平耐药;多耐药:结核病患者感染的结核杆菌体外被证实对不同时包括异 烟月井、利福平在内的一种以上的一线抗结核药物耐药;广泛耐药(XDR-TE):结核病患者感染的结核杆菌 体外证实除了至少对两种一线抗结核药物异烟月井、利福平耐药外,还对任何氟唾诺酮类抗生素产生耐药, 及三种二线抗结核注射药物(如卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等)中的至少一种耐药

2.6德拉马尼表型与利福平表型的比较

在利福平耐药的33例菌株中,德拉马尼耐药(MIC>1.024(ig/ml)占15%

(5/33),在利福平敏感的42例菌株中,德拉马尼耐药(MIC>1.024yg/ml)占
2.4% (1/42),提示德拉马尼耐药与利福平耐药无明显相关性(表18) o

表18德拉马尼耐药表型与利福平耐药表型比较3讨论

本研究收集2017年〜2018年就诊于我院门诊及住院部的肺结核患者临床痰 标本,进行结核分枝杆菌培养,获得124例结核分枝杆菌临床分离株,通过全基 因组测序了解单核昔酸多态性,应用96微孔板液体法进行德拉马尼表型药物敏 感试验及MIC测定,应用固体比例法行抗结核一线药与二线药表型药敏,进一 步明确基因型与药敏表型之间的关系。

本研究将肺结核患者的临床分离株提取DNA并成功获得123例全基因组测 序结果,发现在ddn険di, fbiA, 〃出及基因中均发现突变位点,其中 和fbiC中SNP的多样性最大,包括5个同义突变和5个非同义突变, 〃加C337T (Leull3Leu)与Schena等网和Jeong等舵]报道的相一致。在 74例菌株中发现沧刃・T960C (Phe320Phe) , Feuerriegel等问对另一种硝基咪 卩坐类药物PA-824的研究中发现几乎所有菌株也存在同义突变fgdl-T960C (Phe320Phe)。本研究在应仞基因中发现3个非同义突变,分别为G158A (Gly53Asp) , C160T (Arg54Cys) , G421A (Aspl41Asn),总突变率为 2.4%, 在国内外文献中均未报道过,Schena等网发现了 〃以和力渤中的四个突变, 这些突变都是导致过早终止密码子的无义突变。Haver等㈡]报告了 ddn环 同位点的19种突变,包括终止密码子突变,其中与药物激活相关的 Gly81Asp突变尤其重要,但在本研究中未发现该突变位点。〃汩基因在本 研究中出现1个突变位点,为C997T (Arg333Cys),均在2株敏感菌株中出现, 突变频率为1.6%,国内外文献均未报道,Haver等㈡]研究中报告的〃汩突变 频率为6.7%,在耐德拉马尼菌株中出现的频率最低。

我们对结核分枝杆菌临床分离株进行德拉马尼耐药表型药物敏感试验和 MIC测定,发现有6例MIC>1.024(ig/ml的德拉马尼耐药菌株,大部分MDR-TB 的MIC为0.256〜0.512(ig/ml,与Jeong等跑报道的基本相符,而与我国Pan或刃 等研究中MIC<0.031(ig/ml不同。本研究中质控菌株H37Rv的MIC值为 0.016(ig/ml和0.008]ng/ml,与国内外文献舵㈣定义的H37Rv的MIC范围 0.002|Lig/ml~0.016|Lig/m 1相符。由于本研究中样本来源于同一地区,可能与其他地 区存在地域差异。德拉马尼作为新型抗结核药物,检出耐药菌株较少,下一步可 扩大样本量进一步观察相关数据。

本试验通过分析6例MIC>1.024pig/ml的德拉马尼耐药菌株基因型发现2 例MDR-TB存在#/C-C1571G (Ala524Gly),所以推测〃zC基因的该突变位 点可能与结核分枝杆菌对德拉马尼产生耐药性有关,fbiC作为辅酶F420生 物合成途径的一员,主要催化4■瓮基苯丙酮酸向卩密噪二酮转移轻基茉基, 对F420的生成至关重要,Haver等㈡]对耐PA-824的菌株研究中表明fbiC 基因对硝基咪卩坐类耐药性有重要作用另外有1例XDR-TB的MIC> 1.024(ig/ml,存在#zL4-C337T (Leull3Leu),在对德拉马尼敏感菌株中同样出 现,MIC为0.008-0.016(ig/ml,在Schena等禺研究耐德拉马尼菌株中未发现该 突变位点,提示该突变位点可能与德拉马尼耐药无明显关系。存在fbiA-G616A

(Ala206Thr )、C584G ( ALal95Gly)菌株的 MIC 均为 0.512(ig/ml,存在 #zC-T1640C (Val547Ala)菌株的MIC为0.256(ig/ml,均高于流行病学定的临界 浓度0.2(ig/ml[46],所以推测fliA和〃ZC基因是结核分枝杆菌对德拉马尼耐药的 重要基因。存在突变点#/5-C997T (Arg333Cys)菌株的 MIC 为 0.008(ig/ml, JbiB 由两个结构域组成:F420连接酶的N端结构域与硝基还原酶蛋白序列相似 的C端结构域[47],是一种沪谷氨酰连接酶,通过连续向F420-0添加L ■谷氨 酸残基来催化F420生物合成途径的最后步骤,产生聚沪谷氨酸尾部㈤]。因 此,:fbiB突变体产生F420-0,这可能会降低应%活性,从而可能会导致德 拉马尼活性减弱[⑹。57.7%的德拉马尼敏感菌株和50%的德拉马尼耐药菌株都 存在fgdl-T960C突变,且与MIC值无明显相关性;发生应仞基因突变的3例 菌株,德拉马尼的MIC均为0.004(ig/mlo

德拉马尼作为一种新型抗结核药,尚未在我国临床正式使用,6例耐德拉马 尼临床分离菌株中有5例来源于初治患者,因此推测本研究中德拉马尼耐药菌株 属于原发性耐药bl,本研究中,3例德拉马尼MIC>1.024(ig/ml的菌株均对RFP、 EMB耐药,而我国罗明等H9]研究中报道的5例德拉马尼耐药菌株均对RFP、EMB、 INH、Rft、Lfic耐药。本研究中3例XDR-TB的德拉马尼MIC值明显升高,提 示随着耐受药物的增多,菌株对德拉马尼的敏感性有可能会降低。

本研究在利福平耐药的33例菌株中,检测到德拉马尼耐药(MIC> 1.024(ig/ml)占15% (5/33);在利福平敏感的42例菌株中,德拉马尼耐药(MIC >1.024|ng/ml)占2.4% (1/42) , KuksaL等网在拉脱维亚的一项研究中,16 名使用含德拉马尼治疗方案的RR-TB患者中,最终治疗结果数据显示治愈 率为84.2%,提示说明利福平耐药与德拉马尼无明显相关性。

在本研究中,发现复治患者中的耐一线及二线抗结核药比例高于初治患者, 其中55%的耐多药、83.3%的多耐药及75%的广泛耐药菌株均来自复治患者,这 与早期治疗方案及管理不合理,患者依从性差导致疗程中断等有关Bl。结核病的 发生不分年龄性别,但成年男性(年龄N45岁)在本研究中占比例较高,为41%, WHO出版的《2019年全球结核病报告》中同样提到男性患者(年龄N15岁)占 2018年所有结核病病例比例最高,为57%[1】。

4结论

本研究成功获得123例结核分枝杆菌临床分离株的全基因组测序结果,在德 拉马尼耐药相关基因ddn,fgdl,JbiA,JbiB及JbiC中共发现10个非同义突变点, 其中 #z^-C584G(Alal95Gly)>#zL4-G616A(Ala206Thr)>#/C-C1571G(Ala524Gly) 和#/C-T1640C ( Val547Ala )可能与 德拉马 尼耐药 相关。#z5-C997T (Arg333Cys)、〃加G158A (Gly53Asp)和 奶・C160T (Arg54Cys)未明显 导致德拉马尼MIC升高,与德拉马尼耐药关系尚不明确。有59.4% (41/69)的 德拉马尼敏感菌株和50% (3/6)的德拉马尼耐药菌株都存在沧刃-T960C突变, 且与MIC无明显相关性,考虑为基因多态性。本研究发现〃旳基因的G421A、 G158A和C160T突变,jbiA基因的G616A、G595A和C584G突变,jbiB基因的 C997T突变,以及〃zC基因的C1571G、T1640C和A1711G突变目前未见报道, 其意义有待进一步研究。另外利福平表型耐药与德拉马尼表型耐药无明显相关性。

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德拉马尼治疗耐多药结核病的研究进展

WHO《2019全球结核病报告》显示,2018年全球范围内约有1000 万新发结核病患者,约150万人死于结核病,其中2/3集中于包括印度(占 27%)、中国(占9%)、印尼(占8%)等在内的8个国家,我国新发结核病患 者数量仍居世界第二位;此外,新发结核病患者中约50万人为耐利福平结核 病(RR-TB),而在RR-TB患者中约78% 为耐多药结核病(MDR-TB),我 国新发RR・TB/MDR・TB患者数量居世界第二位⑴。由于耐多药结核病治愈率仅 为56%,总体治疗转归情况不容乐观⑴,因此耐多药结核病仍是目前全球公共 卫生危机和卫生安全威胁之一,耐药结核菌的出现增加了结核病防治的难度, 并阻碍终止结核病目标的实现,迫切需要具有安全性的新型抗结核药物来扭转局 势。德拉马尼(delamanid)和贝达卩奎卩林(bedaquiline)是过去50年成功开发的 两种新型抗结核药物⑵,其中德拉马尼由于良好的临床前特征而被选择进入临床 试验以评估其药物动力学、安全性和有效性。2014年4月,欧洲药品局(EMA) 批准德拉马尼用于治疗成人耐多药结核病。本文主要综述了德拉马尼的作用机制 及抗菌活性、临床前研究及临床试验、毒副作用及药物■药物相互作用、耐药机 制等,以提高临床对德拉马尼的认识并为合理应用该药提供参考。

1.作用机制及抗菌活性

德拉马尼是一种硝基咪卩坐类衍生物,又称OPC-67683,主要通过抑制结核 分枝杆菌细胞壁成分甲氧基分枝菌酸及酮基分枝菌酸的合成而发挥杀菌作用, 对处于复制、休眠期的结核分枝杆菌及胞内结核分枝杆菌均具有强效杀灭作用。 由于革兰阳性、革兰阴性细菌及哺乳动物细胞并不存在分枝菌酸,分枝菌酸仅存 在于分枝杆菌中,因此德拉马尼对革兰阳性、革兰阴性杆菌没有杀菌/抑菌作用⑶, 对分枝杆菌的抑制作用具有特异性,有利于减少结核分枝杆菌耐药性。动物 实验结果显示,与其他抗结核药物相比,德拉马尼口服生物利用度较高,约为 50%叫并且随着食物特别是高脂肪食物的增加而升高。德拉马尼门/2为3438小 时并可直接通过血液去除,而其代谢物门/2为121-322 h并主要通过粪便排泄、 尿液清除率较低⑸。在新陈代谢方面,德拉马尼的独特之处在于其主要通过血 浆白蛋白及由细胞色素P450 (CYP450)参与的多种代谢途径而非通过肝脏代谢, 且其代谢产物无抗结核分枝杆菌作用,因此德拉马尼肝毒性较小⑵。肝毒性是目 前一线抗结核治疗最严重的并发症,而新型抗结核药物对肝功能受损患者 的安全性是一个重要的临床考虑因素。研究表明,口服德拉马尼后4・8h血 药浓度达到峰值,且短时间德拉马尼暴露显示出强大的体外杀伤能力并对结核分 枝杆菌具有强抑制作用,因此这可能是德拉马尼间歇治疗的优势之一⑸;通过给 予小鼠14C标记的德拉马尼发现,德拉马尼可广泛分布在包括中枢神经系统、眼、 骨、胎盘及胎儿等在内的多种组织且组织中德拉马尼浓度与血浆德拉马尼浓度相 似或更高,提示德拉马尼能透过脑、视网膜及胎盘血液屏障,对肺外结核具有潜 在的治疗价值⑹。

2006年,一项针对67例药物敏感或耐药结核病患者结核分枝杆菌 株的研究首次指出德拉马尼最低抑菌浓度(MIC)划・006・0.024|Lig/nil⑶; 2011—2014年有研究人员对分离自经德拉马尼初次治疗结的核病患者的10 种野生型结核分枝杆菌菌株进行了测试,结果显示德拉马尼对于野生型结核分 枝杆菌菌株的MIC值为0.016(ig/ml,对耐多药及广泛耐药结核分枝杆菌菌株 的MIC为0.005-0.040 |ig/ml,对敏感表型结核分枝杆菌菌株的MIC为0.013 pig/ml,但对德拉马尼获得性耐药、广泛耐药结核分枝杆菌菌株的MIC贝IJ>0.320 pig/ml,表明德拉马尼对敏感和耐药结核分枝杆菌菌株的不同亚群具有不同的抗 菌活性⑺。

2临床前研究及临床试验

临床前研究表明,德拉马尼抗菌谱较窄,主要包括结核分枝杆菌和非结核 分枝杆菌,但其具有强有力的抗结核分枝杆菌效果;单独使用德拉马尼对结核 病小鼠及豚鼠复制、非复制或细胞内结核分枝杆菌均具有杀灭作用,而物敏感 或MDR-TB动物模型联用德拉马尼则能加速结核分枝杆菌的死亡并提高痰培 养结果转阴率,因此德拉马尼进入临床试验阶段⑵。德拉马尼相关临床试验 始于2003年,目前已有超过1200例受试者参与,包括I期临床试验(12个 试验,2003-2006年),II期临床试验(6个试验,2007—2012年)、一项在 MDR-TB患者中进行的III期临床试验(2013—2017年)及2项正在MDR-TB 患儿中进行的III期临床试验⑵。德拉马尼I期临床试验未出现严重不良事件并 确定了II期临床试验德拉马尼剂量,即100 mg/次2次/天和200 mg/次,2次 /天2]。德拉马尼II期临床试验主要关注痰培养结果转阴率,结果发现耐多药结核 病患者经德拉马尼(100-200 mg/次,2次/天)治疗2个月后痰培养结果转 阴率升高约50%、治愈率为45.4%(接受安慰剂者治愈率为29.6%),治疗6个 月后治愈率为74.5% (接受安慰剂者治愈率为55%)、病死率为2.9% (接受安 慰剂者病死率为12.0%);广泛耐药结核病患者中经德拉马尼治疗2、6个 月治愈率分别为44.4%、64.7%&11】。此外,德拉马尼对标准化和临床分离的结 核分枝杆菌菌株显示出有强有力的体外抗菌活性,且不会对利福平、异烟月井、 乙胺丁醇及链霉素产生拮抗作用[12】。德拉马尼期III期临床试验采用双盲、安 慰剂对照,研究对象来自伊斯坦尼亚、拉托维亚、立陶宛、摩尔达维亚、菲律宾、 秘鲁、南非共7个国家,旨在评估德拉马尼作为新增药物的为期6个月的优 化背景治疗方案对成人MDR-TB患者的安全性和有效性,但由于III期临床试 验是在北京用药的基础上加用德拉马尼而非新的药物组合、缺少德拉马尼与 其他新型抗结核药物的比较、含德拉马尼和其他新型抗结核药物联合方案的 疗效研究,因此世界卫生组织(World Health Organization, WHO)发表的立 场声明表示,根据WHO推荐不能组成有效方案时可将德拉马尼加入耐多药 结核病患者的长期治疗方案⑵。在国内外临床研究中,德拉马尼表现出早期的 杀菌活性[⑶,德拉马尼与利福平、毗嗪酰胺联合应用和只有利福平、异烟腓、 乙胺丁醇、毗嗪酰胺组成的标准方案对比,可以显著加快痰培养转阴率Hl。

3 .毒副作用及药物■药物相互作用

德拉马尼常见毒副作用为恶心、呕吐、眩晕,三者发生率约分别为38.3%、 33.0%、30.2%o GLER等⑻研究表明,采用德拉马尼200 mg/次2次/d治疗 的耐多药结核病患者Q・T间期延长发生率(13.1%)高于采用德拉马尼100 mg/ 次、2次/d治疗者及接受安慰剂者(3.8%)。目前研究认为,德拉马尼导致Q-T 间期延长的主要原因与其血浆代谢物DM-6705有关,而由于DM-6705的产生 由白蛋白调节,因此伴有低蛋白血症(血清白蛋白水平<28g/L)者禁用德拉马 尼⑸。迄今为止,尚无有关德拉马尼导致肝损伤等的临床报道,但在耐药结核病 小鼠、兔子、老鼠模型中发现,德拉马尼可通过抑制维生素K1的产生而降低 凝血因子II、VII、IX、X水平并延长凝血酶原时间(prothrombintime, PT)、 活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time, APTT);此外, 耐多药结核病大鼠乳汁德拉马尼峰值浓度是血液德拉马尼峰值浓度的4倍, 且其代谢产物会导致大鼠胎儿畸形⑸。目前还没有关于孕妇使用德拉马尼的数据, 因此在欧洲目前还不建议孕妇使用德拉马尼。

  1. 耐药机制

德拉马尼是一种前体药物,需ddn基因(Rv3547)参与生成依赖去氮杂黄素 辅助因子F420的硝基还原酶,该反应将F420H2简化为F42oF42o依赖的6■磷酸 葡萄糖脱氢酶CfgdD 将F420还原为F420H2并进入下一个还原周期,而JbiA基因 (Rv3261) > fl)iB 基因(Rv3262)及〃zC 基因(Rvll73)均参与合成 F420; 但生物激活的产物即德拉马尼的脱氮形式并没有抗结核分枝杆菌活性,因此只能 推测德拉马尼在生物活化过程中产生一些不明活性中间体对结核分枝杆菌具有 杀灭作用问。

  1. 耐药基因

5Addn (Rv3547)基因:全长 456bp (GenelD: 887496),其编码的 一种膜结合蛋白参与了氧化应激下的保护机制。。几将前药转化为三种主 要代谢物,一种去硝基咪卩坐和两种不稳定的副产物[⑹,去硝基咪卩坐代谢物随 后释放出HNO2,降解为NO"】。在一项研究中,有20%的耐德拉马尼菌株中鉴 定出ddn的突变阴。Havers等人报告了 ddn中19种不同位点的突变,包括 终止点突变;与药物激活相关的Gly81Asp突变。Gly81Ser突变在耐药菌 株中出现的频率很高(75.6%),但在敏感株(MICW0.0125mg/L)中也发 现了同样的突变,因此,是否与耐药性有关尚不清楚。

5.2fgdl (Rv0407)基因:全长 lOllbp (GenelD: 886418),其编码 6■磷酸 葡萄糖酸脱氢酶,催化葡萄糖6■磷酸氧化为磷酸葡糖内酯,进而将F420还 原为F420H2〔20]。通过对PA-824敏感与耐药的结核分枝杆菌菌株的比较显 示,编码F420依赖的葡萄糖・6■磷酸脱氢酶的fgdl中开放阅读框突变导致 PA-824耐药0], —株XDR-TB分离株在用含有德拉马尼的方案治疗期间 获得了对德拉马尼的耐药性,发现fgdl ±有移码突变S23]。目前全基因组 转座子突变筛选和其他遗传学研究未能证明沧刃在Mtb复制或F420生物合 成酶中的重要性BQ]。

5.3fbiA (Rv3261)、JbiB (Rv3262)、JbiC (Rvll73)基因:全长分别为 996bp、1347bp、2571bp, GenelD 分别为 88870K 888693、886061 □在 F420生 物合成中,力ZC基因编码7,8・二甲基・8・瓮基・5・去氮杂黄素(FO)合酶, 将瓮基茉基从4■瓮基苯丙酮酸转移到卩密噪二酮0],      参与了卩密唏二酮和

FO之间F420生物合成途径的一部分,fbiC对F420的生产至关重要胱29]fbiB随后参与2■磷酸乳酸的添加和生成F420辅因子的五聚谷氨酸尾部的 聚合编码2■磷酸乳酸转移酶,负责将2■二磷酸・5■鸟昔的磷酸乳酯 部分转移到FO中卩1], 〃出由两个结构域组成:F420连接酶的N端结构域 与硝基还原酶蛋白序列相似的C端结构域,是一种沪谷氨酰连接酶,通过 连续向F420-0添加L■谷氨酸残基来催化F420生物合成途径的最后步骤,编 码L■谷氨酸连接酶,通过连续向F420-0中添加L■谷氨酸残基来催化F420 生物合成途径的最后步骤,产生聚L■谷氨酸尾卩2]。〃力作为辅酶F420生物 合成途径的一员,主要催化4■轻基苯丙酮酸向卩密噪二酮转移轻基茉基屛ZC 基因的失活使结核杆菌对氧化应激反应变得敏感⑴]。在其他已发表的研究 中,发现 fbiAfbiC 的单核昔酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)的差异最大,fbiB的突变频率最低,只出现在较低浓度的MIC中阴, 1株XDR-TB在fbiA上有终止密码子突变別,2株XDR-TB在fl)iC上有单 一氨基酸替代厲]。所以推测fbiA和基因突变是结核分枝杆菌对德拉 马尼耐药的重要因素。德拉马尼的激活机制涉及ddn基因、沧刃基因(Rv0407)、 fbiB基因及fbiC基因,因此上述基因任一基因突变均会引起结核分枝杆菌对 德拉马尼耐药。德拉马尼天然耐药率为6.44xl0-6-3.95xl0-5,药敏试验结果显示, 744例单用德拉马尼治疗的耐多药结核病患者的临床分离结核分枝杆菌天然 耐药率仅为1.3%邛通过对临床分离的结核分枝杆菌菌株突变进行研究共发现 4种基因突变,包括ddn基因、fgdl基因、fbiA基因及fbiC基因⑷。目前发现 的10株对德拉马尼耐药的结核分枝杆菌菌株中5株为ddn基因非同义突变

[15], 2株为jbiC基因氨基酸替代[殉,2株未发现可能导致德拉马尼耐药的上述 5个基因突变[殉,1株为JbiA基因无义突变[37],具体突变形式及MIC改变详 见表lo HOFFMANN等网对1例38岁获得性耐药的藏族难民进行研究发现, 其在使用德拉马尼之前已对氯法齐明、贝达奎林、环丝氨酸、卷曲霉素、对氨 基水杨酸、乙胺丁醇等出现耐药,而分别于使用德拉马尼治疗前、使用德拉马 尼治疗失败后分离的两个结核分枝杆菌菌株最可能为〃以基因D49Y突变。

6小结与展望

德拉马尼代谢方式独特,有利于减少肝毒性购,与其他二线抗结核药物相 比具有更好的耐受性及更高的安全性,是一种很有应用前景的新型抗结核药物。 临床研究证实,德拉马尼无论是在体内还是在体外均具有较高的抗菌活性,可 有效缩短耐多药结核病患者疗程⑶,有可能在耐多药结核病的治疗方面发挥重 要作用。Olayanju O[41]等进行的一项前瞻性研究,目的是比较单用贝达卩奎卩林 与贝达卩奎卩林和德拉马尼联合治疗耐多药结核病患者的长期治疗结果和安 全性,研究发现对于治疗预后差或耐药水平高的患者,在组成有效治疗方 案存在挑战时,德拉马尼可作为有效的联合治疗药物。而相关国际合作研究 的重点则是德拉马尼最佳使用方案,包括口服治疗方案、更短疗程的治疗方案及 结核分枝杆菌高危接触者毒副作用的预防等陀44]。

 

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