细粒棘球绦虫原头蝴囊化过程的转录组学分析及EgPKA基因克隆与真核表达论文

2020年11月30日13:23:36细粒棘球绦虫原头蝴囊化过程的转录组学分析及EgPKA基因克隆与真核表达论文已关闭评论

细粒棘球绦虫原头蝴囊化过程的转录组学分析及EgPKA基因克隆与真核表达论文
摘要

囊型棘球呦病(Cystic echinococcosis, CE)是由细粒棘球绦虫

QEchinococcus granulosus, Eg)的幼虫棘球呦引起的一种易被忽视的 慢性人畜共患寄生虫病。该病严重危害人类健康,给畜牧业造成了巨 大的经济损失。然而,由于对棘球呦生长、发育、囊液的形成途径缺 乏深入的认识,目前对棘球呦病的防治一直缺乏创新的方法。本研究 首先通过转录组测序技术(RNA-sequencing, RNA-seq)检测细粒棘球 绦虫原头呦(Protoscoleces, PSCs)体外培养不同发育时期的基因转录 表达水平,筛选在原头呦囊化形成棘球呦过程中具有显著上调的差异 表达基因进行KEGGGO数据库富集分析。结果发现血管加压素调节 的水重吸收代谢通路与囊液形成密切相关,而该通路主要是由蛋白激 酶A (Protein kinase A, PKA)介导囊泡转运过程来运输水及小分子物 质。然后,扩增EgPKA基因序列并利用生物信息学方法预测其理化性 质,亚细胞定位,二、三级结构,抗原表位和密码子使用偏好性。结 果表明,与NCBI参考序列相比,EgPKA编码区417-464 bp缺失48 bp, 全长1053bp,编码350个氨基酸。通过序列比对分析发现突变后的 EgPKA特征性保守区域并未改变,如ATP结合位点(GTGSFGRV)、 丝/苏氨酸激活位点(RDLKPEN)PKA调节亚基结合位点 (LCGTPEY) o此外,EgPKA蛋白具有多个抗原表位及较好的免疫反 应性。最后,克隆EgPKA基因,并在毕赤酵母中构建重组菌株 GS115/pPIC9K-EgPKA,纯化目的蛋白后研究其与血清抗体的免疫反应 性o结果显示重组菌株在1・0 %甲醇浓度下培养72 h可获得最优蛋白产 量;NI-NTA树脂纯化的目的蛋白与免疫血清有特异性反应。此外,通 过实时荧光定量 PCR(Quantitative Real-time PCR, QPCR)检测 EgPKA 基因转录表达水平,结果发现EgPKA在体外培养不同发育时间的原头 蝴和在感染原头蝴的小鼠体内不同发育时间的棘球呦囊壁组织中的表 达趋势相同,均呈上升趋势。本研究首次报道细粒棘球绦虫原头呦囊 化形成棘球呦过程中的转录组学信息;发现和验证了 EgPKA编码区序 列发生了基因缺失突变;成功构建EgPKA真核表达体系,诱导表达的 重组蛋白具有较好的免疫反应性,有成为抗细粒棘球呦病临床诊断抗 原的潜在价值,本研究为棘球呦液的形成机制奠定基础。

关键词:细粒棘球绦虫,RNA-seq,蛋白激酶A,真核表达

TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF THE ENCYSTATION
PROCESS OF ECHINOCOCCUS GRANULOSUS
PROTOSCOLECES AND THE GENE CLONING AND
EUKARYOTIC EXPRESSION OF EGPKA GENE

ABSTRACT

Cystic echinococcosis (CE), also called hydatid disease, is a chronic neglected zoonotic disease caused by the larvae of Echinococcus granulosus, which seriously endangers human health and causes huge economic losses in the animal husbandry. However, due to the lack of in-depth understanding of the growth, development and formation of hydatid cystic fluid, the prevention and treatment of CE have been lack of innovative methods. In this study, the RNA-seq technology was first used to detect the gene transcription expression levels of E. granulosus Protoscoleces (PSCs) at different developmental stages in vitro, and differentially expressed genes with significant up-regulation during the process of PSCs encystation into hydatid cysts were screened for enrichment analysis of KEGG and GO database. It was found that the vasopressin-regulated water reabsorption metabolic pathway is closely related to the formation of cystic fluid, and this pathway is mainly transports water and small molecular substances by protein kinase A (PKA) mediated vesicle transport. Then, Echinococcus granulosus protein kinase A (EgPKA) gene sequence was amplified and its physicochemical properties, subcellular localization, secondary and tertiary structures, epitopes and codon usage bias were predicted by multiple bioinformatics methods. The results showed that, compared with the NCBI reference sequence, the EgPKA coding region showed a deletion of 48 bp from 417- 464 bp, with a total length of 1053 bp, encoding 350 amino acids. Notably, sequence comparison analysis revealed that the characteristic conserved domains of EgPKA after mutation were not changed, such as ATP binding site (GTGSFGRV), Ser/Thr activation site (RDLKPEN), and PKA regulatory subunit binding site (LCGTPEY). In addition, EgPKA has multiple epitopes and immunoreactivity. Finally, the EgPKA was cloned and the recombinant strain GS115/pPIC9K-EgPKA was constructed in Pichia pastoris. After purifying the target protein, its reactivity with serum antibodies was studied, and the results showed that the optimal protein production was achieved by cultivating the culture with 1.0 % methanol for 72 h. The recombinant protein which purified by high affinity NI-NTA resin exhibited specific reactivity with immune sera. Apart from that, the transcriptional expression level of EgPKA was detected through Quantitative real-time PCR (QPCR) detect. The results showed that EgPKA had the same rise expression trend in the culture of PSCs at different developmental time in vitro and in the echinococcus cyst wall tissues of different developmental time in mice infected with PSCs. This is the first report on the transcriptome information of E. granulosus PSCs encystation into hydatid cysts; we found and verified the EgPKA coding region sequence had a gene deletion mutation; EgPKA eukaryotic expression system was successfully constructed; The recombinant protein showed a good immunoreactivity to the sera of mice infected with hydatids, and had the potential value as a clinical diagnostic antigen against CE, which layed a foundation for the formation mechanism of cystic fluid.

Key words: Echinococcus granulosus. RNA-seq, protein kinase A, eukaryotic expression

细粒棘球绦虫原头勉囊化过程的转录组学分析及EgPKA基因克隆与真核表达

前言

由细粒棘球绦虫幼虫棘球呦引起的囊型棘球呦病在全世界范围内引起巨大的 经济损失,而且严重危害人类健康⑴。最新的流行病学研究表明,中亚地区至少有 2.7亿人(占人口总数的58%)感染棘球吻病,包括蒙古、哈萨克斯坦、吉尔吉斯 斯坦、塔吉克斯坦、土库曼斯坦、乌兹别克斯坦、伊朗、巴基斯坦和中国西部地 区⑵。细粒棘球绦虫主要寄生在人和其他中间宿主体内的肝、肺等器官⑶。由于对 棘球吻生长、发育、囊泡形成过程缺乏深入认识,目前对棘球呦病的预防和治疗 一直缺乏创新方法,因此寻找新的药物靶点和药物分子,对包虫病的防治具有重 要意义。

棘球呦由囊壁和囊内容物组成,囊壁主要包括外层角质层和内层生发层,囊 内容物主要包括囊液、原头呦、不育囊、子囊和孙囊⑷。生发层具有许多细胞核, 向囊内芽生成群的细胞,待细胞空化后形成生发囊,从而产生最初的原头呦⑸。原 头吻在中间宿主体内可以囊化发育为次生棘球呦,而且随着囊化过程的继续,囊 泡体积不断增大,囊泡体内的囊液量也不断增加。囊液是原头吻生长、发育的内 环境,研究囊液的形成对治疗包虫病具有重要意义。然而,囊液的由来一直是一 个谜,囊液形成这一过程中起关键作用的靶基因及靶基因作用机制也尚待研究。 如果掌握囊液的形成机制,则可通过抑制囊液形成的关键靶基因而阻碍棘球吻在 宿主体内的生长、发育和扩散。

近年来,二代高通量RNA测序技术(RNA-seq)被广泛应用于检测特定生理 条件下样本中所有基因或转录本的表达水平,在基因表达和转录组调控中发挥重 要作用⑹。目前,已完成的研究包括细粒棘球绦虫全基因组测序〃]、蛋白质组学 分析⑼和不同发育阶段的转录组研究(成虫、六钩呦、幼虫、囊壁及胃蛋白酶/H+ 激活的原头呦)[1°]。但是,关于原头呦在体外囊化过程中转录组表达水平、差异 表达基因、维持物质转运及囊液形成的关键代谢通路和靶基因一直未得到研究。

本课题组通过对原头吻囊化过程中不同发育时期(EgPSC_Od> EgPSC_10d> EgPSC_20d> EgPSC_40d> EgPSC_80d)进行转录本测序,将上调差异表达基因进 行KEGG富集分析。发现血管加压素调节的水重吸收代谢通路与囊液形成密切相 关,而该通路主要是由蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)激活下游靶蛋白(Dynein、 Dynactin> rablK VAMP2、AQP),介导囊泡转运来运输水及小分子物质。GO数 据库分析发现Dynein和Dynactin能够介导逆行囊泡运输,参与物质转运过程;rabll 和VAMP2介导囊泡转运过程;AQP参与水的渗透。通过原头呦体外培养不同发 育时期的基因相对表达量统计分析发现,在原头呦囊化过程中,参与囊泡转运的 PKA下游靶蛋白在转录本水平上的相对表达量大多呈上升趋势。因此,本研究提 出科学假说:原头呦在囊化过程中主要通过PKA激活下游靶蛋白介导的囊泡转运 过程来增加囊液的形成。

PKA的催化亚基是目前研究的热点,尤其是在治疗炎症、癌症和其他免疫调 控紊乱等复杂疾病中发挥重要作用,在寄生虫防控方面也是潜在的药物靶点ZU】。 本研究对细粒棘球绦虫蛋白激酶 A (Echinococcus granulosus protein kinase A, EgPKA)进行克隆、生物信息学分析、真核表达及免疫反应性研究,为下一步研 究PKA在原头呦囊化及囊液形成过程中的作用及可能作用机制奠定基础。

第一部分细粒棘球绦虫原头勉囊化过程的不同发育时期转录组学分析

棘球呦病分布地域广泛,已成为全球性重要的公共卫生和经济问题,在我国 棘球呦病主要流行于新疆、西藏、青海等地的农牧区[⑼。细粒棘球绦虫感染宿主 的基本过程是在宿主吞噬了细粒棘球绦虫虫卵后,虫卵在宿主肠道内孵育成六钩 吻,六钩吻侵袭肠道粘膜后进入血液,通过血液循环迁移到宿主的内脏器官中, 六钩呦在器官中逐渐发育成囊泡[⑷。囊泡中的囊液是一种复杂的混合物,富含具 有抗原性的蛋白质,可调节机体免疫应答。如果掌握囊液的形成机制,则可通过 抑制囊液形成的关键靶基因而阻碍棘球呦在宿主体内的生长、发育和扩散。如今, RNA-Seq正成为研究基因和转录组表达水平的重要实验手段。RNA-Seq可为物种 提供丰富的基因组信息,除了量化基因表达外,通过RNA-Seq得到的数据有利于 对新基因、差异表达基因和期特异性表达基因进行鉴定,有助于了解与物种生长 发育相关的重要代谢途径Q]。本研究利用RNA-seq技术检测原头吻囊化过程中的 基因转录本水平变化情况,研究期特异性基因、差异表达基因、关键代谢通路和 靶基因,为细粒棘球绦虫的后续研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源

细粒棘球绦虫棘球吻取自新疆乌鲁木齐市某屠宰场的新鲜包虫病羊肝,通过 冷链运输运至本实验室。

1.1.2实验试剂与耗材

(1)试剂盒:BIOZOL-total RNAExtraction reagent (货号:BSC51M1)购自 杭州博日科技有限公司。TaKaRa PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA Eraser (货 号:RR047A)、TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit (货号:9761)、 TaKaRa SYBR Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus)(货号:RR820A)、TaKaRa ExTaqDNAPolymerase (货号:RR001A)购自宝生物工程(大连)有限公司。

(2) 主要试剂:RNA提取试剂(无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷)购自重庆川 东化工(集团)有限公司。Gold View I核酸染料、DEPC、氨节西林、D2000 DNA Ladder (货号:M1060-50T)购自北京索莱宝生物科技有限公司。Tris base、KC1、 KH2PO4, NaCk Na2HPO4>琼脂糖购自北京鼎国生物科技公司。胃蛋白酶购自美国 Sigma公司,胎牛血清购自杭州天杭生物科技股份有限公司,RPMI 1640培养基、 青/链霉素购自美国HyClone公司。

(3)  主要耗材:0.22 pm无菌滤器购自美国Millipore公司,25 ml细胞培养瓶 购自广州海狸生物科技有限公司,培养皿、巴氏吸管购自江苏世泰实验器材有限 公司,医用载玻片和盖玻片购自北京鼎国生物科技公司。

1.1.3主要试剂配制

(2) 50xTAE储存液超纯水补足1000 mL,用HC1调pH至7.4,高温高压灭菌后室温储存 备用。

超纯水补足1000 mL,高温高压灭菌后室温储存备用。

(3) lxTAE工作液

20 mL 50xTAE储存液,超纯水补足1000 mL。

(4) 1.0%琼脂糖凝胶

用称量纸称取琼脂糖粉末0.20 g倒入锥形瓶中,加入20 mLlxTAE,将 锥形瓶放入微波炉中加热至沸腾(中高火),待琼脂糖粉末全部熔化后取 出锥形瓶(溶液透亮),室温冷却至50〜60。(2时加入0.60(1L Gold View I 核酸染料,轻轻混匀后倒入插好梳子的制胶板,室温放置30 mine

(5) 0.1%DEPC 处理水

1 mL DEPC,超纯水补足1000 mL,充分搅拌后室温储存备用。配制

0.1%DEPC水时需高温高压灭菌,4。(2储存备用。

(6) 50 mg/mL氨茉西林储存液

2.50 g氨茉西林粉末溶于50 mL无菌双蒸水,0.22 pm滤器过滤除菌, 分装后-20。(2保存备用。工作液浓度为100 pig/mLo

(7) 1%胃蛋白酶(pH=2.1)

lg胃蛋白酶粉末溶于60 mL无菌双蒸水,用HC1调pH至2.1,无菌 双蒸水补足100 mL, 4。(2储存备用。

1.1.4主要仪器与设备

1.2方法

1.2.1原头虫幼的收集

  • 流水冲洗感染细粒棘球呦的羊肝表面,沥干水后置于无菌盘。用无菌纱 布蘸取少量的75%乙醇,轻轻擦拭羊肝表面,待干。用50 mL注射器轻轻插入包 囊中(插入时针头斜面朝下,并用手稍加遮挡,以防棘球呦液溅到眼睛和面部), 吸取棘球呦液,缓缓注入50 mL无菌离心管中,静置,待自然沉淀。
  • 用无菌眼科剪在外囊壁上剪一小口,无菌银子摘取内囊后置于盛有PBS 的无菌培养皿中不断涮洗,使贴于内囊壁的原头呦脫落,静置,待自然沉淀。
  • 将棘球呦沉淀收集在一起,用含1%青/链霉素的无菌PBS清洗5次,每 次均待其自然沉淀后弃上清。
  • 沉淀经孔径为200 pim的无菌不锈钢滤网过滤,用PBS冲涮滤网3次后 将滤液收集于50 mL无菌离心管中,待其自然沉淀后弃上清。

(5 )加入45 mL 1%胃蛋白酶消化液,置于37。(2恒温水浴锅中消化30 min (每 隔10 min轻轻晃动离心管,使组织充分消化),取出离心管,待管内原头吻自然 沉淀后弃上清。

(6)用含1%青/链霉素的无菌PBS反复清洗沉淀至能清晰观察到原头呦自然 下沉为止。清洗后的原头坳悬液经0.4%台盼蓝染色,倒置显微镜下观察原头吻活 ,活力>85%的原头虫幼可用于体外培养及棘球呦小鼠模型的建立。

1.2.2原头勉体外培养不同时期标本收集

光学显微镜下计数原头吻的数量,向每个无菌细胞培养瓶中移入4000个原头 呦并加入适量含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,于37 °C, 5% CCh培养箱中 培养,每隔2〜3天更换新的培养基。收集培养第0天、10天、20天、40天及80 天的原头规 取0.5 mL培养物经0.4%台盼蓝染色,倒置显微镜下观察原头呦囊化 情况,剩下的培养物用适量PBS清洗后装入无酶冻存管中,于液氮中保存备用。

1.2.3原头!I!幼总RNA提取

采用BIOZOL提取细粒棘球绦虫原头吻总RNA,按说明书操作。

  • 用液氮预冷经1% DEPC水处理的研钵,放入清洗干净的原头呦(约 100 mg),加液氮研磨4〜5次,加入1 mL BIOZOL,待恢复至室温,转入1.5 mL 无酶EP管。
  • 加入200(1L三氯甲烷(氯仿),涡旋振荡15 s,室温静置5 mine
  • 4 °C, 12000 r/min,离心 15 min。
  • 小心吸取上清至另一新的5 mL无酶EP管,加入500 piL异丙醇,-20 °C 沉淀2 ho
  • 4 °C, 12000 r/min,离心 10 mmo
  • 弃上清,加入1 mL 75%乙醇(用无菌1% DEPC水和无水乙醇现配现 用),缓慢颠倒洗涤沉淀,4 °C, 7500 r/min,离心8 min。
  • 重复步骤(6) o
  • 弃上清,滤纸上倒置干燥5 mino
  • 加入适量无菌1%DEPC水溶解。
  • 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性并用Nano Drop ND-2000分光 光度计测定浓度及纯度(A260/A280值)。
  • mRNA纯化及链特异性文库的构建

RNA样品检测合格后,用带有Oligo (dT)的磁珠富集原头吻mRNA,然后 加入片段化缓冲液将mRNA打断成短片段。以此为模板,用六碱基随机引物合成 一链cDNA,然后加入缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶I和核糖核酸酶H合成二链 cDNA,用AMPure XP珠纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、 加A尾并连接测序接头,再用AMPure XP珠进行片段大小选择。用USER酶降 解含有U的cDNA第二链,使得最终测序信息都来自于第一链cDNA,从而保留 mRNA的链方向性。分析测序数据以确定转录本来自正义还是反义DNA链。最后 进行PCR扩增,并用AMPure XP珠纯化PCR产物,得到链特异性cDNA文库

1.2.5文库质检及测序

构建的文库先使用Qubit 3.0进行初步定量,稀释文库至1 ng/pd,随后使用 QseplOO对文库的插入片段进行检测,插入片段符合预期后,使用QPCR方法测定 文库有效浓度(文库有效浓度>2mnol/L),以保证文库质量。库检合格后,将不 同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求合并后由上海美吉生物医药有限公 司进行Illumina His seq X测序。测序得到的原始序列(Raw reads)中含有带接头 的、低质量的序列[⑹。为了保证信息分析质量,使用SeqPrep软件 (https://github.com/jstjohn/SeqPwp )对原始数据进行质量控制,获得高质量的过滤后 序列(Clean reads ),后续分析都基于Clean reads □

1.2.6数据组装及功能注释

使用 TopHat2 软件(http://ccb.jhu.edu/softwaTe/tophat/index.shtml)与 NCBI 数据库公布的细粒棘球绦虫参考基因组进行序列比对分析,只有比对到参考基因 组上的数据才能用于后续分析"I。将比对到指定的参考基因组上的序列称为 Mapped Reads,对应的数据称为 Mapped Data然后,使用cufflinks软件 (http://cole-tTapnell-lab.github.io/cufflinks/)组装和拼接总序列。所有的转录本通 过BLASTn和BLASTx与公共数据库进行比对以获得转录本的表达和功能信息, 其中,未得到标注的转录本被定义为新的转录本。公共数据库包括非冗余蛋白(NR)

(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/ );非冗余蛋 白序列数据库(Swiss-Prot ) (http://ww.unipTOt.OTg/ );京都基因与基因组百科全书(KEGG )

(http://www.genome.jp/kegg/); 同源蛋 白家族 (Pfam) (http://pfam.xfani.OTg/); 蛋白质的同源群(COG) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)和基因本体数据库

(GO) (http:www.geneontology.OTg/)

1.2.7样本间相关性分析

期望最大化的转录组测序(RNA-Seq by expectation-maximization, RSEM) (http://deweylab.github.io/RSEM/)可用于定量分析基因、转录本的表达水平,以 及不同样品之间的差异表达基因(Diffewntially expressed genes, DEGs),并揭示 基因的调控机制[⑻。本研究利用RSEM软件建立最大似然丰度估计模型来区分同 一基因的不同转录本亚型[⑸。同时进行Veen分析以揭示样品间的特异表达基因和 共表达的基因。

1.2.8筛选差异表达基因

比较分析不同时期的同一基因表达水平变化情况来筛选差异表达基因,由于
本研究每个时期均有3个生物学重复,因此使用基于负二项式分布的DESeq2软件 直接对原始数据进行统计分析[⑼。以EgPSC_Od为对照组,其他组为实验组,进 行样本间两两比较,先统计差异检验P值,再利用FDR (False discovery rate)来 校准P值。同时满足P值<0.05&l log2FC 1>二1视为差异表达基因㈤]。

1.2.9差异表达基因的QPCR验证

为验证Illumina His seq X测序数据的准确性,筛选12个DEGs(6个上调DEGs

ddH2O                                              4.4 pil

反应体系共 20(11,反应条件:95°C, 2 min; 95°C, 10 s; 55°C, 10 s; 72°C,

20 s, 40个循环;溶出曲线条件:65°C, 5s; 95°C, 5s;     4°C, 30s。每个反应设

三个重复孔,并使用2必2方法评估计算deGs的相对表达量。

1实时荧光定量PCR使用引物

Table 1 Primers used in quantitative real time PCR

通过比对并组装clean reads,本次测序共获得14,903个基因和32,401个转录 本,其中包括未曾报道的3,584个新基因和21,082个新转录本。在32,401个转录 本中,有20,511个转录本注释到GO数据库(63.3%) ; 13,730个转录本注释到 KEGG数据库(42.38%) ; 17,152个转录本注释到COG数据库(52.94%) ; 28,188 个转录本注释到NR数据库(87%); 16,511个转录本注释到Swiss-Prot (51.08%); 17,874个转录本注释到Pfam (55.16%)通过Veen分析,发现共4,458个参考转 录本和53个新转录本同时注释到六大数据库中。此外,未得到注释的部分基因或 转录本或被定义为假定蛋白"I。转录本长度分布广泛,大部分转录本长度超过 1800bp (34.65%),而0 - 200bp之间的转录本数量最少(1.34%)(图2)。本次 测序所获得的细粒棘球绦虫原头呦转录组原始数据集已提交至NCBI序列阅读档 案(Sequence Read Archive, SRA)数据库(登录号:SRP172517)

为膜组成部分,并被归类为GO数据 库的细胞组成部分。在52个DEG中,有13个基因注释到COG数据库中,并发 挥重要的生物学功能,例如:氨基酸转运和代谢,细胞内转运,分泌和囊泡转运 (表3)。本研究在分析了的52个DEG之间的相关系数后(FDRV0.05),获得 了蛋白质可视化网络图,该网络显示了角化蛋白(EGR_03608),血小板糖蛋白 (EGR_09887),钾电压门控通道亚家族C3成员(EGR_05864)和其他许多基因 的表达相关(图3D)。

ach group in the
large circles (EgPSC O d as the control group), including significantly up-regulated DEGs (A)
and down-regulated DEGs (B), respectively, and the number of genes expressed in both groups
are shown in overlapping portion of the circle; (C). Hierarchical clustering map of 52
up-regulated DEGs with red representing up-regulated genes and blue representing
dowregulated genes
The upper part is the tree diagram of the sample cluster, and the name
of the sample is below. The closer the two-sample branches are, the closer the expression
pattern of all genes in the two samples is, means the closer the change trend of gene expression
quantity is; (D). Visualization of inter-gene expression correlation of 52 up-regulated DEGs,
each node represents a gene, and the line between nodes represents the correlation between
gene expressions, the larger the node, the more the gene is correlated with other genes

另一个有趣的发现是,当用Veen图分析EgPSC_0d vs lOd, EgPSC_10d vs 20d, EgPSC_20d vs 40d, EgPSC_40dvs 80d之间的基因集时,发现不存在共有基因同时 存在4个基因集中,意味着在原头呦囊化过程中不存在基因一直保持显著上调表 达。但是,有10个基因同时存在3个基因集中,其中2个基因(EGR_05443和 EGR_03870)分别从EgPSC_10d持续上调至80d,其余8个基因在EgPSC_0d持 续上调至10d,再从EgPSC_20d持续上调至80do 10个基因中除了血小板糖蛋白 (EGR_09887)和动力蛋白轻链(EGR_09469)得到注释,其余的基因均被描述 为假定蛋白(表4)。

4 10个持续上调基因的表达统计

Table 4 Statistics on the expression of 10 consistently up-regulated genes

TPM of different stages

GO是一个综合性数据库,汇集了来自世界各地的所有与基因相关的研究结 果,并且可以标准化来自不同数据库的基因和基因产物的生物学术语,从而提供 基因和蛋白质功能的统一定义和描述%]。本研究通过对细粒棘球绦虫原头吻囊化 过程中1,991个上调DEGs进行GO富集分析,发现1,094、148和263个基因分别 注释为细胞成分(cellular component, CC),生物过程(biological process, BP) 和分子功能(molecular function, MF) □其中,聚类到BP的基因主要参与内质网 未折叠蛋白反应、O-聚糖加工和离子转运;聚类到CC的基因主要参与膜的组成部 分、膜的固有组分和膜部分;聚类到MF的基因主要参与磷酸酯水解酶活性、水 解酶活性及作用于酯键和卩-1,3-半乳糖基转移酶活性(图4),表明原头呦的囊化 过程涉及众多的分子功能,需要广泛复杂的生物过程参与。2.4 DEGsGO富集分析

Number of genes

-log10(FDR)

图4 基因本体数据库转录组分类统计

纵坐标表示GO术语,横坐标表示GO项的基因数,对应折线上的不同点。下横坐标表示富集 的显著性水平,与柱高相对应。其中,FDR越小,-log® (FDR)值越大,GO项越显著。

Fig. 4 Gene Ontology (GO) transcript classification statistics.

The ordinate represents the GO term, and the abscissa above represents the number of genes
compared to the GO term, which corresponding to the different points on the broken line
The
lower abscissa represents the significance level of enrichment, corresponding to the height of
the column. Among them, the smaller FDR is, the larger the -loglO (FDR) value, and the more
significant the GO term is.

2.5 DEGsKEGG富集分析

KEGG数据库可用于系统分析基因功能、基因组信息和功能注释。通过使用 该数据库中的信息分析结果,根据基因或转录本涉及的代谢途径或功能对其进行 分类。主要包括生物系统(organismal systems, OS)、代谢(metabolism, M)、 环境信息处理(environmental information processing, EIP)、人类疾病(human diseases, HD)、遗传信息处理(genetic information processing, GIP)和细胞过程 (cellular processes, CP) [29]O KEGG 富集分析将 1,991 个 DEGs 聚类到 291 个代 谢通路(图5) o对富集程度排名前20的代谢通路分析表明,血管加压素调节的 水重吸收代谢途径(map 04962)排名第一(FDR值<0.05)(图6),其次是泛酸 和CoA生物合成(map 00770)和Hippo信号通路(map 04391)

KEGG enrichment analysis(ALL_up_DEGs)

Number of genes

Vasopressin-regulated water reabsorption Pantothenate arid CoA biosynthesis Hippo signaling pathway - fly

Mucin type O-glycan biosynthesis

Platelet activation

Glycerclipid metabolism

Fat digestion and absorption

Viral myocarditis Nitrogen metabolism Ether lipid metabolism Ribosome Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy

(ARVC) Peroxisome Cholesterol metabolism Arginine biosynthesis

图5 KEGG富集分析-log10(FDR)

图6血管加压素调节的水重吸收代谢通路Fig. 5 KEGG enrichment analysis

注:黄色背景为参考基因,红色边框为得到注释的基因。

Fig. 6 Vasopressin-regulated water reabsorption.

Note: the yellow background represents the reference gene, and the red border indicates that

the genes in the analyzed gene set are annotated.

由于原头呦的在体外培养前10天形态变化最大,因此,本研究对EgPSC_0d 和EgPSC_10d之间的DEGs进行了 GO和KEGG富集和弦分析(FDR值<0.05)。 分别获得了 43和61个特异性基因(图7)。

GO term

H establishment of spindle orientationGO term:

  • ion transport
  • G protein-coupled receptor signaling pathway, coupled to cyclic nucleotide second messenger transmembrane transport
  • establishment of spindle localization
  • spindle locali^tion
  • establishment of mitotic spindle localizaOon
  • positive regulation of phosphate metabolic process
  • positive regulation of phosphorus metabolic process
  • regulation oftransmnrabrane receptor protein serine/threonine kinase signaling pathway

KEGG Pathway

图7 GO和KEGG富集弦图分析

Fig. 7 GO and KEGG enrichment chord analysis

2.6 RNA-seq测序结果验证

为了验证RNA-seq数据的准确性,本研究随机选择12个DEGs通过QPCR检

测其相对表达水平。其中,6个上调DEGs分别为:角化蛋白(Cornifelin) >硫氧 还蛋白相关跨膜蛋白(Thioredoxin) >囊泡转运蛋白(VTP)、次要组织相容性抗 原(MHA)、胶原蛋白(Collagen)及信号转导适配分子(STM) ; 6个下调DEGs 分别:转录延长因子(TEF)、脂肪酸结合蛋白(FAB)、热休克蛋白(heatshock)、 LIM和SH3结构域蛋白(Domain) >假设性蛋白(Hypothetical)和bola类肌动 蛋白(bolA-like)。样本间统计分析采用t检验,0.01vP<0.05被认为是显著的(*), P<0.01     (**) , P<0.001 (***)为极显著。将QPCR数据与RNA-seq中基因的相

对表达水平(TPM值)进行比较,结果表明QPCR实验结果与转录组分析结果具 有一致性,证明RNA-seq测序数据可靠(图8)。

Fig. 8 Results of RNA-Seq verification by QPCR.
图8 QPCR验证RNA-seq结果

3讨论

细粒棘球绦虫引起的囊型包虫病是世界卫生组织公布的17种易被忽视的热带 病之一⑼。在其生命周期中,棘球吻有多向分化的能力,在终宿主(犬)中发育为成 虫,在中间宿主(人和家畜)中发育为继发性棘球圳沏。此外,棘球呦可以通过血液 传播至宿主体内任何器官或组织,例如心脏、骨骼和神经系统卩I】。患者感染早期 无明显症状,随着囊泡体积增加可机械压迫周围组织和器官而导致物理损伤[辺。 包虫病的发病率和死亡率与囊泡大小、感染器官位置、自发或外力(创伤或手术) 引起的囊泡破裂以及继发性过敏反应有关卩1]。因此,需要基于细粒棘球绦虫生物 学应用,尤其是基因组、转录组和蛋白质组学分析,开发新的预防和控制策略。

已有研究发现,体外培养的第一周内可观察到原头吻微囊初步形成;第20天 左右可观察到一些具有完整角质层的微囊泡;在第38天到第42天之间,可以观 察到微囊完全发育国1。本实验室观察到上述重要的时间节点分别为10d, 20d和 40d,并且在体外培养80天后,囊泡体积肉眼可见。这些现象与先前的描述稍有 不同,可能与原头呦的培养基不同或基因型有差异有关卩°]。

从小鼠腹腔中分离原头吻具有耗时长且难以观察到原头呦囊化过程中具体形 态改变的缺点[均。因此,本研究采用RNA-seq检测原头呦体外培养不同发育阶段 的转录表达水平。与以前的基于杂交的微阵列和基于Sanger序列的方法相比, RNA-Seq在标本上提供了丰富的基因组信息〔殉。除了量化基因表达外,RNA-Seq 获得的数据还有助于鉴定新基因、新转录本、DEGs以及了解标本生长和发育过程 中重要的代谢途径所涉及的不同机制卩7】。本研究使用TPM (Transcripts per million reads)来测量基因及转录本表达水平,与FPKM( fragment per kilobase of exon model per million mapped reads)不同,TPM首先使序列长度均质,然后使基因深度均质。 TPM的均质化过程使不同样品中的总表达水平保持一致,从而使基因表达水平的 比较更加直观[网。

本研究通过RNA-seq共获得32,401个转录本和14,903个基因,鉴定了大量期 特异性表达基因,并筛选得到1,991和2,517个显著上调和下调的基因。与湄公吸 虫Bl和日本血吸虫㈤]的一样,细粒棘球绦虫原头吻囊化过程中,上调差异表达基 因编码的蛋白质主要涉及假定G蛋白偶联受体(GPCR)、酪氨酸激酶和丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶等信号通路。这些信号通路在寄生虫的运动、发育和繁殖等关键 功能中发挥重要作用㈤]。已有研究将细粒棘球绦虫60多个GPCRs归类为潜在的 抗寄生虫药物靶点⑺。本研究通过将低表达或未表达的编码假定GPCRs基因进行 过滤,将其范围缩小至6个基因(EGR_01295, EGR_00873, EGR_07838, EGR_08773, EGR_00585 和 EGR_06296)。其中,EGR_00873 从 EgPSC_Od 到 EgPSC_20d呈现显著上调趋势。此外,编码酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 的EGR_10296和EGR_09273在原头呦体外培养的前10天中表达量并未上调,但 在后期却显示出明显的上调趋势。这些代谢通路的成员可能代表抗寄生虫干预的 新型药物靶标,还需要进一步研究。

大多数无脊椎动物都可产生特殊物质参与灭活或消灭寄生虫的免疫反应,如 活性氧(reactive oxygen species, ROS) [41]o ROS是疟疾中巨噬细胞炎症激活的 关键触发因素,同时,ROS还可以破坏蛋白质、碳水化合物和DNA,不利于寄生 虫的生存[何。为了中和宿主的免疫反应和由氧自由基引起的氧化损伤,寄生虫体 内会产生保护性抗氧化蛋白(如日本血吸虫)[43]o本研究鉴定了原头呦体内存在 的三种主要的抗氧化蛋白:细胞色素c氧化酶(EGR_08027)、硫氧还蛋白谷胱 甘肽和谷胱甘肽过氧化物酶(EGR_06748)。根据COG数据库注释,细胞色素c 氧化酶作为上调DEGs,具有与血红素结合并在线粒体电子传输链中转运蛋白的分 子功能。已有研究表明,细胞色素c氧化酶功能异常与线粒体ROS产生增加、刺 激炎症产生和细胞凋亡有关屮"I,而细粒棘球绦虫细胞色素c氧化酶可调节线粒体 的氧化代谢〔他。硫氧还蛋白谷胱甘肽系统在维持寄生虫中的氧化还原平衡方面起 着至关重要的作用,例如日本血吸虫[47]、细粒棘球绦虫[27]、布鲁吸虫郎]和曼氏血 吸虫[呵。本研究通过COG数据库注释获得三个硫氧还蛋白谷胱甘肽相关蛋白:硫 氧还蛋白(EGR 6727) >硫氧还蛋白相关跨膜蛋白(EGR 01550)和含硫氧还蛋 白域的蛋白(EGR_09201),这些蛋白可作为潜在药物靶点。谷胱甘肽过氧化物 酶参与清除细胞和遗传毒性化合物,保护寄生虫免受氧化损伤的过程H9],是血吸 虫病在氧化还原环境中生存所必需的酶[河。在细粒棘球绦虫中谷胱甘肽过氧化物 酶具有结合非底物分子的能力,尤其是结合抗寄生虫药物的能力QI。

本研究通过分析细粒棘球绦虫基因组学©1、蛋白质组学卩2]和转录组学【27]筛选 的关键基因,发现某些关键基因在原头呦的囊化过程中具有显著差异表达:①热 休克蛋白在翻译后修饰、蛋白质转化和ATP结合过程中起重要作用,已有研究发 现编码热休克蛋白的EGR_09650仅在成虫中表达,EGR_10561在棘球坳膜上高表 达©I。但是,本次测序发现二者都存在于原头呦中。值得注意的是,在原头呦囊 化过程中,EGR_10561是所有编码热休克蛋白的基因中始终维持高表达量的基因; ②钙粘蛋白在细胞粘附和识别中发挥重要作用,其过表达可引起阴道锥虫寄生虫 的聚集[河。测序结果发现编码细粒棘球绦虫钙粘蛋白的基因超过40个,但除 EGR_06182以外的所有基因均显示出较低的转录表达水平;③糖基磷脂酰肌醇 (GPI)锚定的壁转移蛋白虽然是细粒棘球绦虫重要且特有的蛋白,但在原头吻囊 化过程中,其编码基因(EGR_06221)的表达水平却很低。其中一个可能原因是 异源蛋白通过将它们与GPI锚定的细胞壁转移蛋白的锚定域融合而共价锚定到原 头吻囊壁上,但是本次测序采用体外培养的原头吻,体外培养阶段无异源蛋白产 生[5典 ④四跨膜蛋白作为一种跨膜蛋白,已经成为其他蠕虫感染的潜在候选疫苗 3-56]。已有研究表明细粒棘球绦虫具有多个跨膜蛋白,例如四跨膜蛋白,转运脂 质和核酸的通道蛋白"58]。本研究确定了两个编码四跨膜蛋白的基因(EGR_11042 和EGR_06311),它们在原头呦囊化过程中表现出明显的上调趋势,推测膜蛋白 转运相关基因在原头吻囊化过程中的大量表达可能是寄生虫适应外部环境以满足 自身连续囊化发育过程的一种代偿机制。

本研究通过KEGG富集分析,发现在原头吻囊化过程中1,991个上调DEGs 富集程度最高的代谢通路是血管加压素调节的水重吸收代谢途径(map 04962), 该通路主要包括24个DEGo在原头吻囊化过程中动力蛋白轻链(DLC)、ras相 关蛋白、突触样蛋白、水通道蛋白4 (AQP4)呈现上调趋势。已有研究表明加压 素调节的水重吸收代谢途径在调节水,尿素和钠的转运以保持体内水平衡中起关 键作用a】。但是,由于寄生虫的特殊结构和生活史,在原头吻中不存在血管加压 素(Vasopressin, AVP)及其相应的 V2 受体(Vasopressin V2 receptor, V2R), 但是含有完整的cAMP信号通路及具有囊泡运输功能的下游靶蛋白(DLC、 Dynactin、Rabll、VAMP2、AQP)。其中,DLC参与蛋白质、碳水化合物等物质 的运输以及逆行囊泡运输的过程[创。Rabll在激活后参与囊泡运输过程,寄生虫 可分泌细胞外囊泡以实现细胞间通讯,并将生物学活性分子转移至宿主细胞以调 节宿主免疫反应⑹]。因此,囊泡运输被认为是寄生虫与外部环境之间物质运输和 信息传递的重要途径Q]。本研究检测到原头吻的细胞膜中存在AQP4,而真核生物 通常会渗透水并通过激活AQP (例如日本血吸虫厲]和曼血吸虫®])来调节水的重 吸收。因此,研究血管加压素调节的水重吸收代谢途径在原头呦中的作用可为开 发新药物靶标提供有用的线索。

总之,本研究通过RNA-seq获得原头吻囊化过程中的转录组信息。该研究揭 示了许多新基因、新转录本、DEGs、期特异性基因和关键的代谢通路。这些数据 为了解原头虫幼的生长和发育机制提供了宝贵的信息,可作为进一步研究新药和疫 苗靶标的基础。

第二部分蛋白激酶A基因克隆及生物信息学分析

蛋白激酶A (Protein kinase A, PKA),也称cAMP依赖性蛋白激酶,是丝/ 苏氨酸蛋白激酶超家族成员之一。PKA经cAMP活化后,在ATP的存在下使得下 游靶蛋白中的丝氨酸或苏氨酸磷酸化,从而调解多种细胞生命过程,广泛参与多 种疾病,研究表明PKA已成为治疗癌症a】、糖尿病a】、炎症a]及其他免疫调节紊 乱疾病中的重要药物靶点。PKA可通过磷酸化各细胞底物来调节蠕虫的各项生物 学活动,是寄生虫潜在的疫苗候选分子和药物设计靶标Hi】。已有研究发现,PKA-C 亚基对于血吸虫的活力和动力至关重要3],比如被激活的PKA被定位到曼氏血吸 虫尾吻的神经/排泄系统,导致躯体运动增强表型[网。PKA介导的磷酸化与杜氏利 什曼原虫从无鞭毛体向前鞭毛体分化的有关[何。本研究通过RNA-seq技术对原头 蝴囊化过程进行转录组测序,对1,991个上调DEGs进行KEGG富集分析后发现, 血管加压素调节的水重吸收代谢途径(map 04962)与囊液形成密切相关,而该通 路主要是由PKA激活下游靶蛋白进行囊泡转运的过程。

近年来,生物信息学分析在预测蛋白质结构、功能和生物学特性中起着重要 作用,并被广泛用于蛋白质表位的分析㈤]。而且,利用生物信息学方法寻找新抗 原还具有高效、低成本的优点SI。本研究扩增EgPKA基因,发现该基因的编码区 发生了缺失突变。使用生物信息学方法来分析EgPKA蛋白质的理化性质、亚细胞 定位、二级和三级结构、磷酸化和翻译后修饰位点、抗原表位和密码子使用偏好 性。为进一步研究EgPKA的生物学功能及作为诊断抗原的可行性提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1虫株、质粒和圉株

虫株同前,pET-28 ( + )载体和DH5a感受态细胞(货号:9057)购自宝生物 工程(大连)有限公司。

1.1.2主要试剂

T4 DNA连接酶(货号:2011A)购自宝生物工程(大连)有限公司,胰蛋白 月东、酵母粉、NaCk琼脂、DEPC水、甘油等购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.1.3主要仪器与设备

1.2方法

  • EgPKA基因的克隆

根据基因组学和转录组学的分析结果,筛选出和囊液形成有关的EgPKA基因:

(基因登录号:EGR_04421),运用Oligo 7.0软件设计特异性引物扩增EgPKA基 因序列,引物由擎科有限公司合成(表1)o细粒棘球绦虫原头吻总RNA提取和 逆转录步骤同前。PCR反应体系如下:模板cDNA lul,上下游引物(10umol/L) 各 1 ul,金牌 MIX PCR 22 ulo 扩增程序:98°C 2 min; 98°C 10 s, 55.5°C 10 s, 72°C 30 s,35个循环;72°C 2 min终延伸。反应结束后,取5 ul PCR产物于1 %琼脂糖凝 胶中电泳观察结果,其余产物经回收纯化后克隆至pET-28 ( + )载体,再转化至大 肠杆菌DH5a感受态细胞中,经菌液PCR鉴定为阳性的克隆菌株送至擎科生物有 限公司进行测序。

1扩增引物序列及相关信息

Table 1 Primer sequences and relative information for amplification

Sequence (5'-3')                                                   Theoretical product length (bp)

  • EgPKA基因生物信息学分析

1.2.2.1基本理化性质分析

采用 Expasy ProtParam 软件(https://web.expasy.org/protparam/)分析 EgPKA 理化性质;Proscale 软件(https://web.expasy.org/proscale/)分析其亲、疏水性。

1.2.2.2开放阅读框和亚细胞定位

使用在线工具 ORF Finder (http://www.ncbi.rdm.nih.gov/gogorf.html) 分析 EgPKA 蛋白的开放阅读框(Prediction of open reading frame, ORF);利用 Cell-Ploc 2.0 软件 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/) 预测蛋白亚细胞定位。

1.2.2.3二级结构和翻译后修饰位点

通过 SOMPA 软件分析 EgPKA 蛋白的二级结构 (https://npsa-prabi.ibcp.fi7cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/iipsa_sopma.html); NetPhos 3.1 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )和 Mot讦 Scan (https://myhits.isb -sib.ch/cgi-bin/moti]scaii)被用来预测蛋白磷酸化位点和翻译后 修饰位点(post-translational modification, PTM)。

  • B细胞和T细胞表位预测

利用 ABC pred (http://cnJd.osdd.net/raghava/abcpwd/)分析 HLA-A * 0401 和 HLA A *   0201 结合位点的 B 细胞表位;SYFPEITHI

(http://www.syfjpeithi.de/bin/mhcserve匚dll/epitopeprediction.htm ) 和 IEDB ( http:/ /tools.iedb.org/mhcii/)软件综合分析 HLADRB1 * 0701、HLA-DRB1 * 1501 和 HLA-DRB1 * 0301结合位点的 CD4 + T 细胞表位⑴】;IEDB 在线工具

(httD:〃tools.iedb.org/mhci/)预测 HLA-A * 1101、HLA A * 0201 和 HLA A * 0301 结合位点的CD8 + T细胞表位⑴]。

1.2.2.5三级结构和跨膜结构预测

使用 SWISS-MODEL ( https://swissmodel.expasy.org/ )在线分析软件构建 EgPKA 三维模型;TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 分析其跨膜结构域。

1.2.2.6密码子偏好性分析

通过 CodonW (http://sourcefbrge.net/projects/codonw )检测 EgPKA 基因编码区 的密码子使用偏好性。为了筛选EgPKA最适外源表达体系,使用EMBOSS在线 软件(http://www.kazusa.or.jp/codon)分别计算 EgPKA> 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris^和大肠杆菌(Escherichia coli)基因编码区的密码子使用频率。

2结果

2.1 EgPKA基因扩增

根据NCBI公布的细粒棘球绦虫全基因组测序结果,EgPKA参考序列全长 1101 bp,编码366个氨基酸序列(基因号:>XM_024493670.1)。然而,测序结 果表明EgPKA基因编码区序列发生了 48 bp的缺失突变(417-464 bp),全长仅 有1053 bp,编码350个氨基酸。为了验证EgPKA的缺失突变,本研究根据缺失 部位的前后基因序列(338 bp-514 bp)设计特异性引物进行基因扩增,对扩增产 物进行测序分析。结果表明,EgPKA在417-464 bp的编码序列中存在缺失突变(图 1),且EgPKA碱基A415 > G°i6和T%5合成形成新的丝氨酸Ser154 (图2)。

图1 克隆EgPKA和缺失片段

(A)具有缺失片段的序列的扩增产物;(B)全长EgPKA扩增产物。

Fig. 1 Cloning of EgPKA and deletion fragment

(A) The amplified product of the sequence with the missing fragment; (B) Full-length EgPKA
ampliHed product.

1 ATGGGTAATACCGCTTCAATCAAAAAGGGCGAACCAGCAGATGTTAAGGCGTTCTTAGAT 60

1 MGNTASIKKGEPADVKAFLD20

61 GATGCGAAAAAGGAATTCCTTGAAAAATGGGAAAAACCCrrCCCAGAACACAGCCTGCCTA 120

21 DAKKEFLEKWEKPSQNTACL40

121 GACGACT^GACAGAATAAA^CTTTGGGAACTGGGTCCTTCGGTCGTGTCATGCTTGTT 180

41 DDFDRIKTL | G T G S F G R ¥ | M L V 60

181 CAACACAAAGCAAAAAAGACGTATTATGCCATGAAAATTCTTGACAAGCAGAAGGTCGTG 240

61 QHKAKKTYYAMKILDKQKVV80

241 AAGCTAAAGCAAGTTGAGCATACGCTTAACGAAAAGCGAATTTTACAAGCCATCTGCTTT 300

81 KLKQVEHTLNEKRILQAICF 100

301 CCTTTTCTAGTAAAGTTGAACTATTCATTTAAGGACAATAGCAATTTGTACATGGTCCTG 360

101PFLVKLNYSFKDNSNLYMVL120

361 GACTTTATAAATGGCGGCGAAATGTTTTCTCACCTCCGCAAAATCGGTCGATT10GCGA 420

121 DFINGGEMFSHLRKIGRFRR 140

421 GTTGGTGTTTATTTCTTTG<XrrATGTTGCTGCATGTCAATCAC(S;AAAGTCATGCACGC 480

141 VGV¥FFAYVAACQ[S]PESHAR 160

481 TTCTATGCTAGCCAACTAGTTCTGGCCTTTGAGTATTTGCATCACCTCGAATTGGTGTAT 540

161FYASQVVLAFEYLHHLELVY180

541 CGCGATCTCAAACCCGAAAACATCCTTATCGATGAACGTGGTTATCTTAAGATAACGGAT 600

181 RDLKPENILIDERGYLKITD 200

601 TTCGGTTTCGCCAAACGAGTAAAAGGACGAACTTGGACTCTTTGCGGTACTCCTGAATAT 660 201FGFAKRVKGRTWT | L (? G T F E F 220 661 CTAGCTCCTGAGATCATTTTAAGCAAGGGCTACAATAAAGCAGTTGACTGGTGGGCTTTG 720

221 LAPEIILSKGYNKAVDWWAL 240

721 GGWJTGTTGGTTTATGAGATGGCTGCTGGCTACCCACCCTTTTACGCCGACCAACCCATT 780

241 GVLVYEMAAGYPPFYADQP I 260

781 CAAATTTATGAAAAGATTGTCTCTGGAAAGGTTCGATTCCCGTCACACTTCAGCTCGGAC 840

261 QIYEKIVSGKVRFPSHFSSD 280

841 CTGAAGGATCTACTTCGCAATTTGCTTCAAGTGGACTTGACAAAGCGCTATGGCAACCTG 900

281 LKDLLRNLLQVDLTKRYGNL 300

901 AAGAATGGTGTCAATGACATCAAAAACCACAAATGGTTTGCTTCCACAGATTGGTTTGTT 960

301KNGVNDIKNHKWFASTDWFV 320

961 ATCTACAAGTGTGAGGCTGAGGCGCCATTTGTGCCCAAGTGCAAAGGTCCCGGTGACGCC 1020

321 IYKCEAEAPFVPKCKGPGDA 340

1021 GACAACTTTGACGAATACGAAGAGGAACCACTGCGTATATCAGCAACGGAGAAGTGCGCC 1080

341 DNFDEYEEEPLRISATEKCA 360

1081 AAGGACTTTGCCGACTTTTAA 1101

361 K D F A D F *                                       366

图2 EgPKA核昔酸序列和推测的氨基酸序列

推测的氨基酸序列以单字母代码显示在核昔酸序列下方。与参考序列相比,EgPKA缺失的48 bp 核昔酸序列和16个氨基酸序列标记为红色。蓝框表示A, G和T碱基新合成的丝氨酸;绿框 是ATP结合位点(GTGSFGRV);黄色框是Ser / Thr激活位点(RDLKPEN);紫色框是PKA调

节亚基结合位点(LCGTPEY) ;        表示ORF末尾的终止密码子TAA。

Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of EgPKA

The deduced amino acid sequence is shown in single letter code below the nucleotide sequence・

Compared with the reference sequence, the deleted 48 bp nucleotide sequence and the 16
amino acid sequence of EgPKA are marked in red. The blue box indicates the newly
synthesized serine codon of EgPKA with A, G, and T bases. The green box is the ATP binding
site (GTGSFGRV). The yellow box is the Ser/Thr activation site (RDLKPEN), and the purple
box is the PKA regulatory subunit binding site (LCGTPEY). Stop codon TAA at the end of the
ORF is marked with an asterisk.

2.2 EgPKA基因的生物信息学分析

2.2.1理化性质

EgPKA编码350个氨基酸残基,CDS区共1053个碱基,其分子量(molecular weight, MV)为40.41 kDa。MV<5-10kDa的抗原通常被认为免疫原性较差叫】, 说明EgPKA具有良好的抗原性。EgPKA理论等电点为&63,分子式为 C1852H2844N476O515S12,不稳定系数(Instability index)为 29.04。不稳定系数可用于 预测蛋白质的稳定性,该值大于40表明蛋白质属于不稳定蛋白⑺]。结果表明 EgPKA被归类于稳定蛋白。EgPKA脂肪系数(Aliphatic index)为82.49,总平均 亲水性(The grand average of hydrophilic, GRAVY)为-0.374。通常 GRAVY 在-2 和2之间波动,负值表不杀水性蛋白质,结果表明EgPKA是一种杀水性蛋白,易 形成抗原表位(图3)。

 

3 EgPKA蛋白的亲疏水性

横轴代表该蛋白质中氨基酸的位置,纵轴的正值代表疏水性,负值代表亲水性。

Fig. 3 Hydroph迅city and hydrophobicity of EgPKA proteins

The horizontal axis stands for the position of amino acids in this protein, and the positive value of vertical axis represents hydrophobicity and the negative value represents hydrophilicity.

2.2.2开放阅读框与亚细胞定位

由于EgPKA蛋白CDS区发生了基因突变,其ORF也随之改变(表2)。使 用Cell-Ploc 2.0、Euk-mPLoc 2.0软件预测EgPKA蛋白的亚细胞定位,结果显示其 主要定位于细胞膜、细胞质、线粒体和细胞核,表明EgPKA分布广泛,在多个部 位发挥作用。

2 EgPKA蛋白开放阅读框预测

Table 2 Open reading frame (ORF) regions of EgPKA protein

  • EgPKA蛋白的二级结构和翻译后修饰位点

蛋白质的二级结构对抗原表位的形成具有重要作用。a螺旋和卩折叠结构紧密, 大部分位于蛋白质内部,因此很难形成抗原表位[沟。相反,无规则卷曲结构相对 较松散,主要位于蛋白质表面,易形成抗原表位[77]。EgPKA的二级结构如下:a 螺旋占41.43%; P折叠占13.71 %;卩转角占6.29%;无规则卷曲占38.57% (图4), 表明其易形成抗原表位从而被抗体识别和结合。

由于蛋白质翻译后修饰广泛影响的蛋白质的结构和功能,如蛋白激活、酶活 性和生命周期,因此它在真核生物中起着重要作用%]。如今,磷酸化修饰作为生 物学上最重要的蛋白质翻译后修饰之一,在大量信号转导途径中起着关键作用"9]。 本研究使用NetPhos和Mot讦Scan软件综合分析EgPKA蛋白的PTM,结果显示 EgPKA蛋白包含27个磷酸化位点(Ser: 12; Thr: 8; Try: 7)和11个PTM位点, 包括N-糖基化位点(107-110),酪蛋白激酶II磷酸化位点(88-91,109-112>338-341), N-豆蔻酰化位点(2-7、282-287)和蛋白激酶C磷酸化位点(6-8、109-11K 252-254、 278-280、340-342)。EgPKA可通过这些位点调节蛋白质功能,从而影响细粒棘 球绦虫原头蝴生长发育过程中的蛋白质活性。

MGNTASIKKGEPADVKAFLDDAKKEFLEKWEKPSQNTACLDDFDRIKTLGTGSFGRVMLVQHKAKKTYYA hhcccccccccccchhhhhhhhhhhhhhhhhhhccccchhhhhheeeeecccccceeeeeecccccclhee MKILDKQKWKLKQVEHTLNEKRILQAICFPFLVKLNYSFKDNSNLYMVLDFINGGEMFSHLRKIGRFSE hhhhhhhheeehhhhhhhhhhhhhhhhcccceeeeeehhccttcceeeeeeecttcchhhhhhhttccch SHARFYASQWLAFEYLHHLELVYRDLKPENIILIDERGYLKITDFGFAKRVKGRTWTLCGTPEYLAPEII hhhhhhhhhhhhhhhhhhhhheehhtccttceeeetttceeeehttcceecccceeeetccccccchhhe LSKGYNKAVDWWALGVLVYEMAAGYPPFYADQPIQIYEKIVSGKVRFPSHFSSDLKDLLRNLLQVDLTKR ecttcccccchhhhhhhhhhhhttccccccccchhhhhhhhhtccccccccchhhhhhhhhhhhhcchhh YGNLKNGVNDIKNHKWFASTDWFVIYKCEAEAPFVPKCKGPGDADNFDEYEEEPLRISATEKCAKDFADF hhhhhttcchhcccccccccchhhhhcccccccccccccccccccccccccccccccccccchhhhhhhe

4 EgPKA蛋白二级结构预测

Fig. 4 Prediction the secondary structure of EgPKA protein・

  • B细胞表位预测

ABCpred在线服务器用于预测EgPKA蛋白的B细胞线性表位,预测结果与四 个参数(亲水性、柔性、高抗原指数区域和可及区域)相关[阿。基于这些参数对 预测的B细胞表位进行排序(阈值设置为0.85),共获得了 8个B细胞抗原表位 (表 3) o

3预测EgPKA蛋白B细胞抗原表位

  • T细胞表位预测

T细胞表位主要分为辅助性T淋巴细胞(CD4 + Th)和细胞毒性T淋巴细胞

(CD8 + CTL),需要抗原呈递细胞加工才能被T细胞识别⑻]。研究表明,中国 新疆地区维吾尔族具有高频等位基因CD4 + T细胞(HLA-DRB1 * 0701、DRB1 * 1501、DRB1 * 0301)和 CD8 + T 细胞(HLA-A* 110K A* 0201、A* 0301)⑴〕。 本研究使用SYFPEITHI和IEDB在线预测软件来预测该蛋白的CD4 + T细胞表位

(表4)和CD8 + T细胞表位(表5)。表中所示为得分排名前三的表位。

表4分析EgPKA的CD4+ T细胞抗原表位

表5分析EgPKA的CD8+ T细胞抗原表位

Table 5 Analysis of the CD8+ T cell antigenic epitopes of EgPKA.

2.2.6三级结构和跨膜结构预测

蛋白质三级结构(3D)在分子水平上为其功能研究提供了宝贵的见识,并为 生命科学研究中的广泛应用提供了有用信息血]。本研究利用全球使用最广泛的结 构建模服务器SWISS-MODEL阿预测EgPKA蛋白的3D结构(图5)。构建的3D 模型与EgPKA蛋白的最大覆盖率达到80.57%,具有较高的序列一致性。此外, TMHMM Server的跨膜结构预测结果表明,EgPKA蛋白序列中无跨膜结构,表明 它不是定位于生物膜的蛋白。

ABC

图5 EgPKA的三级结构域的预测。

(A) 3D模型;(B)局部质量图,模型的每个残基(x轴),预期与天然结构的相似性(y
轴),通常得分低于0.6的残基预计为低质量;(C) EgPKA序列的结构评估,深蓝色和深橙
色为优选区域,浅蓝色和浅橙色为允许区域。

Fig. 5 Prediction of tertiary structure domains of EgPKA・

(A) 3D model; (B) The Local Quality plot. Each residue of the model (x-axis), the expected
similarity to the native structure (y-axis), typically, residues showing a score below 0.6 are
expected to be of low quality; (C) The structure assessment of EgPKA sequence・ Dark blue
and dark orange colored region are favored regions, light blue and light orange colored are
allowed regions.

2.2.7同义密码子相对使用程度

研究生物体中密码子相对使用程度对了解基因在进化过程中的分子机制和功 能表达具有重要意义阳]。在真核生物中,编码同一个氨基酸的密码子并非每一个 都得到均衡使用,在使用过程中产生的不均衡性称为同义密码子相对使用程度 (relative synonymous codon usage, RSCU) [85]O 本研究通过分析 RSCU 值确定了 EgPKA的10种最常用密码子(表6) o

6 CodonW分析细粒棘球绦虫PKA密码子使用偏好性

注:*表示密码子使用偏倚较弱;**表示密码子使用偏倚强(RSCU值大于1.5) TER表示终 止密码子;下划线表示RSCU值大于1

Note: * indicates the codon usage bias was weak; ** indicates the codon usage bias was strong (RSCU value greater than 1.5); TER indicates the terminate codon; the underlined data indicates that the RSCU value is more than 1.

2.2.8有效密码子数与各基因碱基量分布情况统计

有效的密码子数(Effective number of codons, ENC)的参考范围为20〜61,越 靠近20偏好性越强跑。CodonW软件分析表明,EgPKA的ENC值为57.06,表明 EgPKA基因各密码子使用偏离随机选择的程度比较一致。密码子适应指数(codon adaptation index, CAI)可确定基因中的密码子使用偏倚,该值介于0和1之间, 越接近1,则密码子偏好性越强〔8刀。密码子偏好指数(Codon bias index, CBI), 往往用来阐释某一特定的基因中所有最优密码子的组分情况[附。EgPKA基因CAI 和CBI分别为0.256和0.038,说明EgPKAs基因具有较弱的密码子偏好性。另外, EgPKA 基因 G3s (26.47%)、C3s (34.98%)均低于 A3s 及 T3s 的平均含量,GC 含量的平均值为44.2%, GC3s含量的平均值为45.8%,两值均小于50%。这表明 EgPKAs基因的CDS编码区碱基选择及其密码子第三位的碱基选择上均存在较弱 的偏好性,偏好使用以A/T结尾的密码子。本研究的发现与先前观察到的一致, 即与其他蠕虫相比,细粒棘球绦虫基因组(42.1%)和编码区(49.4%)均有相对 较高的GC含量[23】。

2.2.9最佳外源表达系统筛选

蛋白表达情况、免疫原性和功能研究常常需要进行蛋白的异源表达(原核或 真核系统)。因此,选择合适的外源表达系统对目的蛋白的表达尤为重要。本研 究将EgPKA与大肠杆菌JE. coli)、毕赤酵母CP. pastoris}密码子使用频率进行 比较(表7),其中PKA/E coliPKA/F pastori分别表示EgPKA基因分别与大肠 杆菌、酵母的每种密码子使用频率的比值。结果发现PKA/E. coli> PKA/P pastori 比值在0.5〜2的数目分别为13和16个,表明毕赤酵母真核表达系统更适合EgPKA 基因的外源表达。

表7 EgPKA基因和P. pastoris. E.coli的密码子使用频率(f/%o)

Table 7 Codon use frequency of the EgPKA genes and genome of P. pastoris and E.coli (〃%o)

注意:PKA/E. coliPKA/P. pastoris 分别表示 EgPKA E. coli/P. pastoris 之间每个密码子 的使用频率之比。下划线和加粗内容表明两个物种之间密码子偏好性较一致(05~2) o

Note: The PKA/E. coli and PKA/P. pastoris represent the ratio of the usage frequency of each codon between EgPKA and E. coli/P. pastoris, respectively・ Underlined and bold content indicates that there are relatively close codons biases (0.5-2) between two species.

3讨论

蛋白激酶A参与寄生虫的生长、发育、繁殖等过程,是新型抗寄生虫病的重 要药物靶点,如恶性疟原虫、曼氏血吸虫和刚地弓形虫[妙90]。本研究扩增了 EgPKA 基因序列,发现并验证了细粒棘球绦虫PKA基因存在缺失突变。EgPKA突变后, 碱基A。% G4"与碱基T465重新结合形成新的氨基酸ser154o在哺乳动物细胞中, PKA-C具有两个结构元件有助于其发挥功能和调节作用:(1)高度多态的活化片 段,当PKA-C在丁血⑼处磷酸化时,该片段由多态变为有序Hl; (2)螺旋束, 通常被用作蛋白质底物的结合位点,并被认为与活性位点呈变构偶联[92】。螺旋束 可通过Arg280. Glu208之间的保守离子对,直接与活化片段相连接。此外,PKA的 C末端是一种保守的结构元件,在与激酶核心区域整合过程中起顺式调控元件的作 用[93】,它包含三个主要部分:N瓣(NLT) (FxxF基序)、C瓣(CLT) (PFxP 基序)、和活性部位(AST) (FDxY基序)网。在PKA中,NLT由保守的疏水 基序(HF)锚定到其C螺旋上,并且只有在转换基序(Ser338)被磷酸化时才能识 别HF基序[95】。Ser338是丁血⑼磷酸化的前提,Ser338的磷酸化对于PKA的加工和 成熟至关重要[96】。有趣的是,经过序列比对后,本研究发现EgPKA在基因缺失突 变后存在关键的磷酸化位点(Thr197, Arg280, Glu208, Ser338),推测EgPKA的缺 失突变使该酶具有磷酸化作用活性。此外,应注意的是,突变前后,EgPKA-C的 保守基序和特征域没有改变,例如FxxF基序、PFxP基序、FDxY基序、ATP结合 位点(Gly-x-Gly-xx-Gly -x-Val)、Ser/Thr 激活位点(Arg-Asp-Leu-Lys-x-x-Asn) 和PKA调节亚基结合位点(LCGTPEY)旳。

蛋白质T/B细胞表位的预测可用于合成肽的检测、相应抗体的制备、高特异 性和灵敏性诊断系统的研发,为诊断性抗疫苗的开发奠定基础邸]。本研究获得 EgPKA蛋白的8个预测的B细胞线性抗原表位和6个T细胞抗原表位,这些表位 可用于设计针对细粒棘球绦虫的多表位的疫苗,并引发机体体液和细胞免疫应答 [99】。通过生物信息学分析EgPKA,本研究可以确定EgPKA是潜在的强抗原性蛋 白,可诱导机体产生强烈的体液和细胞免疫反应,并且可能是对抗细粒棘球绦虫 的DNA疫苗候选物。

分析密码子的偏好性对于外源基因选择合适的宿主表达系统,进行基因体外

表达提供一定的理论依据。如果外源基因含有大量宿主表达系统的稀有密码子, 尤其是这些稀有密码子呈连续分布时,就会造成表达量降低或翻译提前终止,阻 碍基因工程和酶工程的发展[1°°]。通过密码子偏好性分析可选择合适的表达系统以 及通过密码子优化可提高外源基因的表达。因此,本研究对已克隆EgPKA基因家 族成员cDNA序列以codonWl.4.2软件分析该基因在密码子使用上存在的偏好性, 并将其与大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母的基因组密码子偏好性进行比较,结果发现 真核表达系统更适合EgPKA的体外诱导表达。

综上所述,本研究首次全面预测了 EgPKA的理化特性、生物学结构、密码子 偏好性和生物学功能,为进一步对其进行体外诱导表达和免疫反应性研究奠定了 基础。

第三部分 蛋白激酶A真核表达及免疫反应性研究

基因工程技术又称DNA重组技术,是以分子遗传学为理论基础,以微生物学 和分子生物学的现代方法为手段,将DNA大分子提取出来,在离体条件下用内切 酶切割后,在体外与载体DNA分子连接起来,然后导入某一更易生长、繁殖的受 体细胞中,使这个基因能够在受体细胞中复制、转录、翻译,基因工程技术是基 因的结构和功能研究的基础必]。本研究通过生物信息学分析发现EgPKA具有一定 的免疫反应性且最适外源表达体系为巴斯德毕赤酵母菌。为验证生物信息学结果, 本部分克隆EgPKA基因并构建真核表达载体,利用感染原头吻的小鼠血清检测重 组蛋白的免疫反应性,为探讨其作为CE诊断抗原的可行性奠定实验基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1组织来源

虫体来源同前。36只18〜20 g, 6〜8周龄雌性BALB/C小鼠由重庆医科大学 动物实验中心提供。动物的饲养及实验相关程序均遵循实验动物管理和保护的相 关规定。

1.1.2菌株与载体

载体pPIC9K与表达宿主菌Pichiapastoris GS115由本实验室保存。

1.1.3实验试剂

(1) 限制性内切酶:Ecol05 I CSnaB I)(货号:FD0404)、Not I (货号: FD0594)、SacI (货号:FD1133)购自 Thermo Fisher Scientific 公司。

(2) 试剂盒:TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit (货号:9761)、 TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II (货号:RR820A)购自宝生物工程(大连)有 限公司。NI-NIAResin购自重庆泽恒生物有限公司。去内毒素质粒小提试剂盒(货

(4) BMMY (BMGY)培养基(1L)

酵母提取物                                10 g

蛋白月东                                  20 g

1M磷酸钾缓冲液                           100 mL

lOxYNB                                                                     100 mL

500xB                                                                        2 mL

10xM (lOxGY)                                                           100 mL

先加酵母提取物和蛋白月东于650 mL双蒸水,溶解后补水至700 mL, 121°C高压蒸汽灭菌30 min,室温冷却至50〜60弋再加入其余试剂,倒入平 板中,凝固后倒置,4弋保存2月。

(5) YPD-G418 平板

配置30 mL 100 mg/mL的G418, 0.22 um过滤除菌,-20 °C保存备用。 取出高压灭菌的YPD培养基,室温冷却至50〜60。(2再加入适量的100 mg/mL的G418,以配置不同浓度的YPD-G418平板,0C保存2月。

1.1.5主要试剂配制

  • lOxYPD (500 mL)

67g YNB溶解于450 mL双蒸水中,后补至500 mL,过滤除菌后0C 保存1年。

  • 500xB (lOOmL)

20 mg生物素溶解于90 mL双蒸水中,后补至100 mL,过滤除菌后4°C 保存1年。

  • 10xM (1L)

量取50 mL甲醇溶解于1L双蒸水中,过滤除菌,4弋保存2月。

  • 10xD (500 mL)

100g葡萄糖溶解于450 mL双蒸水中,后补至500 mL,过滤除菌后室 温保存1年。

  • lOxGY (1 L)

量取100 mL甘油溶解于1 L双蒸水中,121弋高压蒸汽灭菌30 min,

室温保存1年。

(6) 100mg/mLG418

称取lgG418溶解于10 mL双蒸水中,过滤除菌后-20。(2分装保存。

(力10x磷酸钾缓冲液(PH6.0)

132 mL IM K2HPO4 与 868 mL IM KH2PO4 混合均匀,调 PH 为 6.0, 121。(2高压蒸汽灭菌30 min, 4。(2保存3月。

(8) 1M山梨醇

18.217 g山梨醇溶解于10 mL双蒸水中,12FC高压蒸汽灭菌30 min,

4。(3保存1月-

(9) TBST缓冲液的配制(lx)

100 ml的TBST缓冲液(10x)中加入900 ml的ddH2O并充分搅拌混 匀。用盐酸于pH测量仪调节TBST缓冲液的配制(lx)的pH至&0。添 加2 ml吐温-20,颠倒混匀后4。(2储存。

(10) 转模液(lx)

准确称取三羟甲基氨基甲烷30.3 g甘氨酸14.4 g置于1000 ml的容器 内,添加ddH2O 800 ml超声震碎粉末,使上述粉末完全溶解。添加ddHzO 补充至1000 mL置于4。(2冰箱保存。取上述液体100 ml、甲醇200 mL,再 添加ddH2O补充至1000 mL

(11) 封闭液

5 g脱脂奶粉溶解于100 mL lxTBST缓冲液中,颠倒混匀后4。(2储存。

1.1.6主要仪器与设备

1.2方法

  • 2.1原头虫幼体内、外培养不同时期标本收集

原头吻体外培养步骤同前,即每个无菌细胞培养瓶中移入4000个原头呦并加 入适量含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,于37 °C, 5% CCh培养箱中培养, 每2-3天更换一次培养基。收集体外培养0天、40天、80天及120天的原头呦用 于后续试验。将重庆医科大学动物实验中心提供的BALB / c小鼠随机分为感染组

(30只)和空白组(6只),分别通过腹腔接种1 ml原头呦悬浮液(4000个/ml) 和1 ml PBSo接种第4、8和12个月,取10只感染组小鼠和2只空白对照组小鼠 进行乙醸麻醉,收集小鼠眼球的血液和腹腔内的囊泡,保存在-8(TC进行后续研究。

1.2.2重组质粒的构建

按照之前的步骤提取总RNA ,逆转录为cDNA ,使用正向引物 5,-CCCTACGTAATGGGTAATACCGCTTCAATC-3,SnaB I )和反向引物 5WGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGAAAGTCGGCAAAGTCCTTG G-3f CNotD扩增EgPKA基因序列。其中,下划线为SnaB 1^0 Not I限制性酶切位 点,斜体为保护碱基,粗体字为6XHis标签。PCR产物纯化后与pPIC9K质粒分 别用SnaB 1^ Not I双酶切,酶切体系如下:

1.2.3阳性克隆的筛选与鉴定按以上体积加入微量离心管后,轻轻涡旋混匀,在PCR仪中37。(2反应90 min, 65。(2加热20 min使酶失活。将目的基因和空质粒的双酶切产物根据3〜9:1的比例 加入微量离心管中,用T4连接酶4弋连接过夜。连接产物通过热激法转化至大肠 杆菌DH5a感受态细胞中,取100(11菌液均匀涂布在含50憾/mL Amp抗生素的 LB固体平板上,37。(2培养30 min后倒置培养过夜。

将上述转化平板上挑取pPIC9K-EgPKA20个单菌落,接种于ImL含50 pig/mL Amp抗生素的LB液体培养基中,37。(2摇床220 rpm震荡培养过夜。分别取1 ul 进行PCR验证,初步筛选阳性克隆,PCR反应体系同前。PCR产物用1%琼脂糖 凝胶电泳检测,条带与目的基因大小一致的菌株可初步鉴定为阳性菌株。挑取阳 性菌株划线扩大培养,提取质粒进行双酶切验证,其反应体系如下:

双酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测后,将酶切正确的重组质粒送至擎科生物有 限公司进行测序,将测正确的菌株用20%甘油保存保存于-80°Co

1.2.4重组质粒线性化

将测序正确的重组质粒pPIC9K-EgPKA扩大培养,提取重组质粒,用限制性

将上述反应物按比例加入微量离心管中,轻轻混匀,37。(2孵育90 min, 65°C 加热20 min使酶失活。

1.2.5电穿孔转化GS115

将线性化的重组质粒pPIC9K-EgPKA和空质粒pPIC9K分别转化至毕赤酵母 GS115感受态细胞中,由于GS115属于组氨酸缺陷型,后续实验用MD平板进行 筛选。电转操作步骤如下:

  • 电转杯从无水乙醇中用银子夹出来放置在超净工作台,紫外照射30 mine
  • 将-8(TC保存的毕赤酵母感受态细胞置于冰上融化后,加入10憾线性化 质粒,轻轻吹打混匀,转移至电转杯中,冰浴10 mine
  • 设置电击参数2000 V、200兆、25 “F、4 ms,然后用擦镜纸擦干电转杯, 放入点转仪中开始电击。
  • 电击后,迅速向电转杯中加入预冷的1M山梨醇溶液lmL,轻轻吹打混 匀,移至无菌5 mLEP管中,3(TC静置孵育2h。
  • 5000 rpm离心2 min,弃去部分上清,留100 pl上清重悬菌体,涂布于 MD平板上,3(TC倒置培养2〜3天。

1.2.6高表达菌株筛选及鉴定

用取菌环挑取MD平板上的单个菌落,分别接种在MM和MD平板相同位置 上,30。(2倒置培养2〜3天。His+Mut+表型菌株在MD和MM平板上都能正常生长, 一般甲醇利用快型(Mut+)菌株表达量更高,因此挑选在MD和MM平板上均能 正常生长的单菌落扩大培养。菌落PCR初筛阳性的单菌落接种于装有200 pil YPD 液体培养基的1.5 mLEP管中,3(TC静置培养2天。再取10山该菌液重新接种在 装有200(11YPD液体培养基的1.5 mL EP管中,3(TC静置培养2天。再从中取1山 菌液点在含不同G418浓度的YPD平板上,浓度依次为0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、 1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL> 3 mg/mL, 3(TC静置培养 3〜5 天。

挑取在G418高浓度抗性平板上菌落生长较大的菌株接于装有10 pil无菌水的 微量离心管中,95。(2热激5 min,以此为模板,使用正向引物(5AOX I: 5,-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3,) 和反 向引物 (3AOX I: 5,-GCAAATGGCATTCTGACArCC-3,)进行菌落 PCR 鉴定。使用 5AOXI/3AOXI 不仅可以验证目的基因片段是否插入基因组,还可以确定表达宿主是甲醇利用型。 PCR产物送擎科生物有限公司测序,将测序正确的重组菌株GS115/pPIC9K-EgPKA 用20%甘油-2(TC保存。

1.2.7重组蛋白在毕赤酵母中的诱导表达

挑选测序正确的重组菌株进行摇瓶发酵,以甲醇作为唯一碳源诱导重组蛋白 表达。具体步骤如下:

  • 将保存于2(TC的GS115/pPIC9K-EgPKA菌株在含G418的YPD平板上 划线培养,后接种至含G418的YPD液体培养基中,30°C, 220 rpm震荡培养过夜。
  • 取1 mL菌液接种在50 mL (250 mL锥形瓶)BMGY培养基中,30°C,

200 rpm震荡培养16〜18 h,使其ODgoo为2〜5。

  • 将菌液在4。(2下5000 rpm离心10 min,弃上清,收集菌体。
  • 用200 mL (500 mL锥形瓶)BMMY培养基重悬菌体,使其起始发酵

ODgoo 为 1.0, 28°C, 220 rpm 震荡培养。

  • 每隔24 h向BMMY中加入甲醇,使其终浓度为1%。
  • 分别在发酵的Oh、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h收集发酵上清1 mL, 将发酵上清4弋储存,进行后续检测。

1.2.9浓缩发酵上清

用丙酮沉淀法浓缩发酵上清后进行SDS-PAGE及Western Blotting,具体步骤 如下:

  • 取各个时期的发酵上清4。。12000 rpm,离心15 min,弃上清。
  • 菌体沉淀中加入200(11预冷的丙酮,剧烈震荡后,4。。12000 rpm,离 心15 min,弃上清。
  • 重复上一步,所得沉淀加入双蒸水溶解。
  • 浓缩蛋白添加蛋白上样缓冲液,在100°C金属浴条件下加热10 min后冷 却,4。(2暂存。

1.2.10 SDS-PAGE 及 Western Blotting 检测

  • 清洗制胶的玻璃板、制胶架、橡胶封条和梳子,待其干燥后进行固定。
  • 配胶:查漏后配制分离胶,从一侧缓慢加胶,无水乙醇压胶,使凝胶表 面保持水平,待凝胶凝固后倾净无水乙醇。此时配制并添加浓缩胶,立即插梳, 待聚合拔梳。
  • 加样:竖直向加样孔中加入4 pl蛋白Mari©和10 pl蛋白样品,加满电 泳缓冲液。
  • SDS-PAGE电泳:80 V恒压电泳至两胶分界,调整至120 V电泳至样本 游至底边关闭电源。
  • 染色:考马斯亮蓝快速染色液染色1 h,双蒸水脫色2h,观察蛋白条带。
  • 参照以上步骤重新跑胶,根据目的蛋白在凝胶中的位置去除凝胶上的多 余部分,然后浸泡在转膜液中,进行Western Blotting验证。
  • 转膜:裁剪比SDS-PAGE稍大的PVDF膜浸于甲醇中活化5 min。按从 下(黑色,负极)向上(无色,正极)的顺序依次放置海绵垫、厚滤纸、SDS-PAGE 胶、PVDF膜、厚滤纸、海绵垫,并不断滴加转膜液使其保持湿润状态。200 mA 恒流,4 °C,转膜lh。
  • 封闭:取出PVDF膜并置于水平摇床上使用双蒸水洗膜5〜10 mine将 PVDF膜取出,蛋白面朝上,置于5 %脱脂奶粉封闭液中室温摇床封闭2 h。
  • 洗膜:TBST洗膜3次,每次室温低转速摇床洗涤5〜10 min。
  • 一抗孵育:将一抗(His抗体)用一抗稀释液按1:500比例稀释,4 °C 孵育过夜。
  • 洗膜:TBST洗膜3次,每次室温低转速摇床洗涤5〜10 min。
  • 二抗孵育:将二抗Goat Anti-rabbit IgG/HRP用二抗稀释液按1:5000比 例稀释,二抗室温低转速摇床孵育2 ho
  • 洗膜:TBST洗膜3次,每次室温低转速摇床洗涤5〜10 min。
  • ECL显色:使用ECL超敏增强化学发光显色试剂盒于暗室进行显色并 进行化学发光。

1.2.11 Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白

GS115/pPIC9K-EgPKA重组菌株带有6XHis标签,因此可以通过Ni-NAT亲 和层析的方法纯化目的蛋白。

  • 丙酮大量沉淀浓缩目的蛋白。
  • 柱平衡:色谱柱内加入Ni-NTA树脂悬液2mL,待其自然下沉,放干储 存液,用双蒸水洗涤柱子两遍,并用无咪卩坐的洗涤缓冲液洗涤柱子一遍。
  • 上样:将沉淀浓缩的蛋白样品加到柱子中,控制流速5-1 mL/mino重 复上样3次,使目的蛋白充分挂柱。
  • 洗涤:用5倍体积的含不同浓度咪卩坐的洗涤缓冲液以5-1 mL/min的流 速洗涤柱子,将洗涤液收集在15 mL离心管中。
  • 洗脱:用5 mL含高浓度咪卩坐的洗脱缓冲液以5-1 mL/min的流速洗脱 柱子,将洗脱液收集在15 mL离心管中。
  • 柱平衡:在柱子中加入5倍体积的双蒸水,反复洗涤柱子3遍,最后用 20%浓度的乙醇保存Ni-NTA悬液。

1.2.12重组蛋白免疫反应性研究

分别取10山纯化后的EgPKA进行Western Blotting检测,健康小鼠和原头呦 感染的BALB/c小鼠血清(1:500)作为一抗,其余步骤同前。

1.2.13 QPCR鉴定体内外表达情况

使用QPCR检测原头呦体内、外不同发育阶段的EgPKA的mRNA表达水平。 总RNA提取和逆转录过程步骤同前,根据EgPKA基因序列设计QPCR的正向引 物系列 (5,-TTGAGCATACGCTTAACGAA-3,) 和反向引物序列 (5,-TTGAGCATACGCTTAACGAA-3,),引物由擎科生物技术有限公司合成。使 用 TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II 进行 QPCRo 反应体系共 20 以:10 以 SYBR QPCR混合物(2x) , 0.8 ^il 10(1M正、反向引物,4以稀释cDNA,添加ddH2O 使体积达到 20 以。反应条件:95°C, 2 min; 95°C, 10 s; 55°C, 10 s; 72°C, 20 s, 40个循环;溶出曲线条件:65°C, 5s; 95°C, 5s; 4°C 30s。每个反应设三个重复 孔,并使用2 -肚。方法评估计算EgPKA的相对表达量变化情况。

2结果

2.1表达质粒的构建和验证

将PCR纯化产物(1053 bp)和pPIC9K空质粒(9276 bp)用相同的限制性内 切酶引胡1和No/I分别双酶切,获得含有相同粘性末端的目的片段和质粒。用T4 连接酶将二者连接之后转化至大肠杆菌DH5a中。挑取单菌落扩大培养进行菌液 PCR鉴定,电泳结果如图1 A所示,成功扩增1053 bp左右的目的条带。将条带正 确的转化子提取质粒进行双酶切验证,电泳结果如图1 B所示。将双酶切正确的菌 株送擎科生物有限公司测序,测序结果与目的片段大小一致,无碱基突变,证明 重组质粒pPIC9K-EgPKA构建成功。

250

lOO^J

1转化子的菌液PCR鉴定及双酶切验证

A: M: DL2000 DNA Marker; 1-6 6 个转化子的菌液 PCR。B: M: DL2000 DNA Marker;
1:重组质粒的双酶切;2:目的片段;3:空质粒

Fig.l Bacteria liquid PCR detection of transformants and double enzyme digestion
verification

A: M: DL2000 DNA Marker; 1-6: Bacterial liquid PCR of 6 transformants. Figure 1 B: M:

DL2000 DNA Marker; 1: Double restriction digestion of recombinant plasmid; 2: Target
fragment; 3: Empty plasmid

2.2重组酵母菌株的构建和筛选

线性化的DNA片段对酵母细胞的转化和整合基因组的效率高于未线性化的质 粒,因此,在电穿孔转化前将测序正确的重组质粒pPIC9K-EgPKA用限制性内切

酶SqcI线性化后转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中,涂布于MD平板上,30°C 倒置培养2〜3天。pPIC9K载体中含有His 4基因,而GS115菌株是His缺陷型菌 株,因此可用MD平板筛选His+表型。另夕卜,MM平板以甲醇为唯一碳源,因此 可用MM平板筛选Mut+表型菌株(图2)。

图2 pPI C9K-EgPKA酵母转化子Mut+H i s*表型的筛选

Fig. 2 Phenotype screening for Mut+His+ yeast transformants of pPIC9K-EgPKA

2.3高拷贝酵母菌株的筛选

多拷贝基因的插入整合可能会提高目的蛋白的表达量,由于pPIC9K载体中携 带G418抗性基因。因此拷贝数越多的菌株能在更高浓度G418抗性的平板生长。 不同 G418 浓度(0.25 mg/mL>0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL>2 mg/mL> 3 mg/mL) 的YPD平板生长情况如图3所示。

0.25 mg/ml

图3 pPIC9K-EgPKA高拷贝转化子的筛选

Fig. 3 Screening of high-copy transformants of pPIC9K-EgPKA

2.4阳性克隆测序鉴定

挑取在G418高浓度抗性平板上菌落生长较大的高拷贝重组菌株 GS115/pPIC9K-EgPKA接于装有10山无菌水的微量离心管中,95。(2热激5 min, 以此为模板,使用正反向引物5AOX I和3AOX I进行菌落PCR扩增。His+Mut+型 GS115阳性转化子能够扩增出两条DNA片段,分别是1545 bp和2200bp。其中, 2200 bp的DNA片段是野生型酵母乙醇氧化酶基因AOX I的PCR扩增产物,而1545 bp是pPIC9K上下游引物之间的片段492 bp与插入片段1053 bp之和。扩增结果 如图1所示,成功扩增出与预期大小一致的两条带。将PCR产物送擎科生物有限 公司测序,测序结果显示整合到毕赤酵母基因组中的外源基因序列和EgPKA突变 后序列一致,说明重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-EgPKA构建成功。

图4酵母转化子的PCR产物

M: DL2 000 DNA Marker; 1-5: 5个阳性酵母转化子的PCR产物。

Fig. 4 PCR amplification products of yeast transformants

M: DL 2 000 DNA Marker; 1-5: PCR products of 5 positive yeast transformants.

2.5目的蛋白Western Blotting验证及免疫反应性研究

将重组毕赤酵母菌株用不同浓度的甲醇(0.5%〜2%)诱导表达,每隔24 h取

诱导上清,用丙酮浓缩发酵上清后,进行Western Blotting检测。电泳结果显示1% 甲醇浓度诱导72 h时蛋白表达量最多(图6),且目的蛋白有两个条带,分别在 35kDa和40kDao本实验在设计目的基因的引物序列时,在其C端添加了组蛋白 标签(6XHis),在目的蛋白上样后,带有His-tag的蛋白可与金属离子(N*+) 发生相互作用形成螯合物从而特异性结合到柱子里,其他杂蛋白流出。当用咪卩坐 洗脱液进行梯度洗脱时,咪卩坐竞争性地结合到镰柱上且与Ni2+结合能力更强,从 而对目的蛋白进行纯化(图5)。

Fig. 5 SDS-PAGE analysis of protein fractions obtained from purification of the recombinant图5高亲和力Ni-NTA树脂纯化EgPKA重组蛋白的SDS-PAGE分析

M蛋白Marker 1洗涤液;2流穿液;3粗提取上清液;4从洗脱液中分离纯化的重
组蛋白

EgPKA by high affinity Ni-NTA resin.

Lane M: protein marker; Lane 1: wash fraction; Lane 2: flow through fraction; Lane 3: crude culture supernatant before loading; Lane 4: purified recombinant protein from eluted fraction.

纯化的EgPKA重组蛋白转膜后与健康小鼠血清、原头呦感染不同时期的小鼠 血清进行反应,Western Blotting检测结果表明,纯化的目的蛋白能够与感染原头 虫幼不同时期的小鼠血清发生特异性反应,而与健康血清不反应,说明EgPKA蛋白 存在于外周血中,可刺激机体产生免疫应答,且免疫反应性良好。

图6 Western BI ott i ng分析重组EgPKA蛋白的不同诱导时间和免疫反应性。

泳道1:空载GS115/pPIC9K; 2-6:诱导后24、48、72、96和120小时收集的样品;C:纯化 的蛋白质与对照小鼠的血清反应;7-9:纯化的蛋白质与感染了原头黝4、8和12个月的小鼠 血清反应。

Fig. 6 Western Blotting analysis the different induction time and immunoreactivity of the
recombinant EgPKA protein.

Lane 1: GS115/pPIC9K; Lane 2-6: sample harvested at 24, 4& 72, 96 and 120 h post-induction; Lane C: the purified protein was combined with the sera of control mice; Line 7-9: the purified protein was combined with sera from mice infected with protoscolex at 4, 8 and 12 months.

2.6 EgPKA表达谱变化情况

本研究通过QPCR鉴定原头呦囊化形成棘球呦过程中EgPKA基因的转录表达 水平变化情况(图7)。结果表明,在体外培养的原头坳囊化形成棘球吻过程的早 期发育阶段(0天、40天和80天),EgPKA基因的转录表达水平相对较低,但在 原头呦明显囊化形成次生棘球吻的120天时表达升高;而将原头呦在接种小鼠体 内发育的8月、12月时间点,其EgPKA相对表达水平也是增加的。

7 EgPKA体内外相对表达量

Fig. 7 Relative expression of EgPKA in vivo and in vitro.

3讨论

蛋白功能的研究需要将蛋白进行体外表达,大肠杆菌原核表达系统具有操作 简单、遗传背景清楚的优点;毕赤酵母真核表达系统具有易培养、产量高、稳定 性好、可对外源蛋白进行翻译后折叠修饰(如剪切、糖基化、二硫键形成等)的 优点ail。本研究利用生物信息学软件预测EgPKA具有良好的免疫反应性,且其 最适表达系统是毕赤酵母菌真核表达系统。

该部分对EgPKA基因进行克隆,通过His+Mut+的筛选、遗传霉素G418抗性 筛选、菌液PCR验证以及测序验证等方法筛选了目的重组酵母菌株 GS115/pPIC9K-EgPKAo毕赤酵母菌是甲醇营养型酵母,以甲醇为唯一碳源,其表 达载体携带的乙醇氧化酶(AOX I)基因启动子高效且严格的受甲醇的诱导调控 [102]o使用不同浓度(0.5%-2%)的甲醇对重组酵母菌株进行诱导表达,收集不同 诱导时间(0-120 h)的发酵上清进行丙酮沉淀浓缩,随后对浓缩目的蛋白进行 SDS-PAGE、Western Blotting检测。甲醇耗尽或浓度过低会导致AOX I启动子不能 有效启动,易产生小分子量的杂蛋白;甲醇浓度太高会对细胞产生毒害作用,从 而影响重组菌株的生长;诱导时间过长会导致BMMY培养液中PH降低,而影响 蛋白质活性[1°习。所以筛选最适甲醇诱导浓度和诱导时间对目的蛋白的大量表达具 有重要作用。

SDS-PAGE、Western Blotting检测结果表明1 %甲醇浓度、诱导表达72 h时重 组菌株表达量较高,而且重组菌株有两条明显的蛋白条带,分别为35 kDa及40 kDao本研究通过生物信息学方法预测EgPKA基因突变后蛋白分子量大小为40.41 kDa,而实验结果显示两个条带,其中一条与预期相符合,另一条偏小。通常蛋白 条带大小与预测结果不一致时,可能出现以下情况:①该蛋白有其他亚型;②蛋 白质发生剪切活化,可造成蛋白质变小;③蛋白质为二聚体或多聚体,此时蛋白 质大小与预测值有明显的倍数关系;④蛋白质发生翻译后修饰,如甲基化、乙酰 化、糖基化、生物素化等,均可导致蛋白质比预测值偏大。本研究通过SWISS-Prot 数据库查询,发现除了本次克隆的EGR_04421,还存在另外3个cAMP依赖性蛋 白激酶A催化亚基的蛋白亚型,其基因登录号分别是EGR_06039、EGR_06851和 EGR_06877o通过NCBI核昔酸数据库查询3个亚基的核昔酸序列长度,分别为 4005 bp、1173 bp和1113 bp,均大于本次克隆的EgPKA核昔酸序列长度(1053 bp); 通过Novopro在线蛋白分子量计算软件预测蛋白质的分子量大小,分别为150.52 kDa、45.40 kDa和42.44 kDa,均大于本次实验所得目的蛋白的分子量大小(35 kDa 及40 kDa) o故本研究推测35 kDa条带产生原因可能为目的蛋白剪切活化所致。

将重组酵母菌株在最适表达条件下大量诱导,并对目的蛋白进行Ni-NTA纯 化,纯化后的目的蛋白与健康小鼠血清和感染原头吻不同时期的小鼠血清进行反 应原性研究。Western Blotting检测结果表明,纯化的目的蛋白能够与感染原头蝴 不同时期的小鼠血清发生特异性反应,而与健康血清不反应,说明EgPKA蛋白存 在于外周血中,可刺激机体产生免疫应答,且免疫反应性良好,有望作为细粒棘 球蝴病的早期诊断抗原。

QPCR结果表明,在体外培养的原头吻早期发育阶段,EgPKA基因的表达水 平较低,但在原头吻明显囊化形成次生棘球呦的120天时表达升高;而将原头蝴 接种在小鼠体内发育的8月、12月时间点,其EgPKA相对表达水平也是增加的。 值得注意的是,RNA-seq检测结果表明EgPKA基因在EgPSC_0d> EgPSC_40d和 EgPSC_80d 中基因表达量 TPM 值分别为 116.98、106.62 和 95.136667。RNA-seq 测序结果与本次原头呦体外培养不同发育时期QPCR检测结果基本吻合。通常原 头蝴感染后4个月可在小鼠腹腔中发现囊泡,小鼠体内囊泡的数量和体积随培养 时间的延长逐渐增加,最终钙化。EgPKA基因在原头呦体内外培养过程中均呈现 上升趋势,可能与原头呦囊化成次级棘球呦密切相关,但是其具体功能有待进一 步研究。

全文总结

  1. 利用二代高通量RNA-seq技术,对细粒棘球绦虫原头吻囊化形成棘球呦的 不同发育时期(EgPSC_Od、EgPSC_10d> EgPSC_20d> EgPSC_40d、EgPSC_80d) 进行了转录组学分析,共获得32,401个转录本和14,903个基因。对1,991个显著 上调的差异表达基因进行KEGG和GO富集分析,鉴定出血管加压素调节的水重 吸收代谢途径(map 04962)与囊液形成密切相关,而该通路主要是通过蛋白激酶 A (PKA)激活下游靶蛋白,从而介导囊泡转运过程来调节水的重吸收。
  2. 成功克隆细粒棘球绦虫蛋白激酶A基因(EgPKA),发现该EgPKA的编 码区417-464 bp处发生了 48 bp的基因缺失突变。EgPKA在基因缺失突变后存在 关键的磷酸化位点(111严,Arg280, Glu208, Ser338),推测EgPKA的缺失突变使 该酶具有磷酸化作用活性。此外,突变前后EgPKA-C的保守基序和特征域没有改 变,例如FxxF基序、PFxP基序、FDxY基序、ATP结合位点(Gly-x-Gly-xx-Gly -x-Val)、Ser/Thr 激活位点(Arg-Asp-Leu-Lys-x-x-Asn)和 PKA 调节亚基结合位 点(LCGTPEY)。生物信息学分析表明该蛋白具有稳定性、亲水性、分布广泛、 易形成抗原表位、密码子偏好性较弱等特点,其最适外源表达系统为毕赤酵母真 核表达系统。
  3. 成功构建GS115/pPIC9K-EgPKA重组表达菌株,对重组表达菌株进行甲醇 诱导表达,发现1%甲醇浓度、诱导表达72 h时重组菌株表达量较高;重组菌株有 两个条带,分别为35kDa及40kDa。
  4. 将重组酵母菌株在最适表达条件下大量诱导,并对目的蛋白进行Ni-NTA纯 化,纯化后的目的蛋白能够感染原头呦不同时期的小鼠血清发生特异性反应,而 与健康小鼠血清不反应,说明其具有较好的免疫反应性,是潜在的细粒棘球呦病 的候选诊断抗原。

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文献综述

寄生虫蛋白激酶A研究进展

蛋白激酶是人类基因组编码的最大基因家族之一,与许多疾病相关,已成为 主要的疾病治疗靶点之一⑴。蛋白激酶A (Protein kinase A, PKA)又称3; 5匚环腺 昔酸依赖性蛋白激酶A,是蛋白激酶超家族中最常见和发现最早的成员。PKA属 于丝/苏氨酸蛋白激酶,通过对特定蛋白质丝/苏氨酸残基进行磷酸化来调节细胞生 长、繁殖、分化及特定蛋白的表达⑵。PKA已成为治疗癌症⑶、炎症吐5】、动脉粥 样硬化⑹等多种疾病的重要药物靶点。PKA广泛存在于动植物中,也参与寄生虫 生长、发育及繁殖等过程,可作为新型抗寄生虫药物的重要靶标。本文主要从PKA 的结构、功能及其在寄生虫生命活动中的研究现状进彳丁综述。

1 PKA的结构与功能

1.1结构特征

在大部分有机体中,PKA是杂合四倍体,具有两个调节亚基(Regulatory subunit, R)和两个催化亚基(Catalytic subunit, C)虽然已经分离并鉴定了不同C亚基的 特征,但PKA的生化和功能特征在很大程度上取决于R亚基的结构和性质⑺。

R亚基主要有I型(RIoc、Rip)和II型(RIIoc、RIIp)两个亚型,含二聚化结合 域、假底物功能域和环磷酸腺昔(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)结合位点 (TGACGTA) o其中,PKA的oc亚基和卩亚基具有不同的表达模式:oc亚基在大多 数组织中广泛表达,而卩亚基则是以更具组织特异性的方式表达⑻。PKA的I亚型和 II亚型在定位和表达水平上均具有差异:I亚型主要存在于非神经细胞的细胞质中, 在活化过程中不被自磷酸化,需要与三磷酸腺昔(Adenosine triphosphate, ATP)结 合才可以被激活;而II亚型存在于神经细胞的各个亚基细胞组分中,可以自磷酸化, 不需要与ATP结合⑼。在I亚型中,cAMP与RI®结构域结合是RIoc结构域对cAMP 具有高亲和力的前提条件,由于RIoc对R亚基的cAMP亲和力最高,因此RIoc对 维持PKAR亚基活性至关重要,RIoc与肿瘤发生发展关系密切a】。

 

C亚基则主要分为Coc、邙和5 等3种亚型,含ATP结合位点(GTGSFGRV)、 催化位点(RDLKPEN)、R亚基结合位点(LCGTPEY)及保守磷酸化位点(188T)。 其中,Coc被认为是主要的亚型,其在大多数组织中表达;C卩也在各种组织中表达, 由刃曲cb基因编码[in;而由刃曲CG基因编码的5亚型仅在睾丸中表达,但 Cy亚基在睾丸中未发挥功能作用rd】。研究表明,188T是影响催化亚基活性的关 键磷酸化位点[⑷。

PKA以全酶的形式存在时,呈非活性状态,当胞外信号分子(激素、神经递 质、炎性因子)结合到目标细胞的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)上,受体构型发生转化。鸟昔酸结合蛋白(Guanine nucleotide binding protein),可将非活化状态的二磷酸鸟昔(Guanosine diphosphate, GDP)转化为活 化状态的三磷酸鸟昔(Guanosine triphosphate, GTP) [15]o活化的G蛋白亚基结合 并活化腺昔酸环化酶(Adenylate cyclase, AC),腺昔酸环化酶再催化三磷酸腺昔 生成第二信使cAMP, 2个PKA R亚基和4分子cAMP结合后,引起PKA R亚基 构象改变,全酶分子解离,释放出有活性的C亚基,C催化亚基进入细胞核后使 基因调控蛋白即环磷腺昔效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)磷酸化,磷酸化的基因调控蛋白与靶基因调控序列结合,以增强 细胞靶基因表达和物质代谢。最后,cAMP可被磷酸二酯酶(Phosphodiesterase, PDE)水解为亍-二磷酸腺昔(5!-Adenosine monophosphate)而失活「[⑹(图1)

图1 cAMP/PKA信号通路机制图

Fig. 1 The mechanism of cAMP/ PKA signaling pathway.

PKA在细胞中可调节多项生理活动,如基因表达、物质代谢,以及细胞增殖 分化等,主要通过磷酸化广泛存在于细胞膜、细胞核、线粒体、细胞浆以及细胞 骨架中的底物而发挥作用[17'18]o
1.2功能

研究发现,PKA参与脂类代谢调控以及脂类代谢异常相关疾病发病过程,是 脂类代谢调控的枢纽性信号分子[⑼。PKA通过磷酸化激素敏感脂肪酶可以促进甘 油三酯水解过程,敲除PKA的RIIoc亚基,会引起小鼠消瘦、抵御肥胖、抵抗糖耐 量异常等现象Ml。而且,PKA在调节激素分泌和内分泌细胞参与的肿瘤发生中也 起重要作用,促肾上腺皮质激素通过G蛋白偶联黑皮质素2型受体,激活腺昔酸 环化酶并导致cAMP产生,从而诱导PKA活化,活化的PKA磷酸化特定细胞核 因子,其与靶启动子结合并促进类固醇基因转录,当PKA发生突变时可导致类固 醇生成失调、自主皮质醇过量以及肾上腺皮质细胞增殖改变㈤1。另外,PKA参与 视黄酸(Retinoic acid, RA)诱导的人早幼粒细胞白血病HL60细胞的粒细胞分化 过程,RA稳定结合Rlla蛋白并激活细胞核中的PKA,导致核蛋白磷酸化程度增 加01。

药物诱导的肝毒性是一种严重的不良反应,特别是对乙酰氨基酚 (Acetaminophen,APAP)的过量使用,是造成急性肝衰竭的最常见原因之一。该不 良反应严重程度存在较大的个体差异。研究者在动物体内施药APAP前,用选择 性PKA抑制剂H-89进行预处理,发现APAP诱导的肝毒性显著增强,PKA可用 于筛选APAP诱导的肝毒性敏感个体[22】。曲妥珠单抗是HER2阳性乳腺癌的一种 常见治疗方法,在乳腺癌中观察到PKA催化亚基(PRKACA)转录本增加,特别 是对曲妥珠单抗耐药的患者,表明PKAC亚基可以作为癌症的生物标志物和预后 工具㈡]。PKA还可以对糖原代谢进行调节,增加PKA浓度可以促进糖原分解及抑 制糖原合成,最大限度增加肌细胞中葡萄糖含量来满足机体运动的需要叨。此外, PKA参与的cAMP-PKA信号通路对细胞中水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)的表 达起调控作用,细胞外刺激如炎性因子、激素等激活细胞膜上腺昔酸环化酶活性, 可引起细胞内cAMP浓度增加,进而激活PKA,磷酸化核转录因子(Nuclear factor kappa, NF-kB),从而增加下游AQPs的mRNA转录和蛋白合成㈣。

2寄生虫PKA研究现状

2.1原虫

2.1.1疟原虫

PKA可逆的磷酸化在恶性疟原虫^Plasmodium falciparum. Pf)生活史中具有 关键作用Q-26],包括裂殖子排出、增殖分裂、裂殖子入侵红细胞及在红内期生长 和发育等过程[27-28]。PfPKA能及时触发微线体蛋白分泌,参与疟原虫早期入侵红 细胞过程[29】。当裂殖子侵入宿主细胞后,PfPKA信号传导途径就可能通过启动新 的渗透途径来影响寄生虫生长和分化[29'30]o缺乏PfPKA-C的寄生虫在1个红细胞 内生长周期后出现严重生长缓慢现象,并且缺乏对宿主细胞的侵袭能力刖。Syin 等[32]用经典的PKA-C抑制剂H-89和PKI体外干预感染疟原虫的红细胞,发现其 生长受到明显抑制,表明受感染红细胞内PKA对疟原虫增殖至关重要。Merckx 等在受感染红细胞的膜片钳实验中增加外源性重组PfPKA-R含量及在转基因寄 生虫中过表达PfPKA-R,均导致受感染红细胞阴离子膜电导性显著下调。结果表 明,在疟原虫感染的红细胞中,cAMP/PKA还可改变红细胞膜通透性来调节阴离 子运输。

2.1.2刚地弓形虫

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii,!® 编码 3 种 PKAC 亚基(PKAcl〜PKAc3) 和1种PKA R亚基(PKAr)来整合cAMP信号通路传导。失活的PKAcl通过与 酰基化PKAr相互作用维持在寄生虫膜上,无论是下调PKAr或过表达PKAcl均 会阻碍寄生虫的分裂过程;而下调PKAcl或使其不与PKAr稳定结合,均会导致 寄生虫过早地从感染细胞中逸出和宿主细胞破裂,表明PKA活性在弓形虫分裂过 程中发挥重要作用列。另外,PKA-C1亚基在弓形虫入侵宿主细胞时负责C0信号 传导,在PKA-C1缺失后,新入侵的虫体不久就会以穿孔蛋白1依赖性方式离开 宿主细胞;此外,PKA-C 1缺失可避免细胞浆C&2+水平在入侵不久的快速下调,使 得虫体对cGMP诱导的C/+信号传导更敏感,表明PKA与其他信号通路之间存在 功能联系[均。

2.1.3利什曼原虫

Siman-Tov等两克隆并鉴定杜氏利什曼原虫(Leishmcmia donovani, Ld)PKAC 亚基的两种新亚型基因(PKA-C2a、PKA-C2b),发现PKA-C基因位于利什曼 原虫prp8基因下游的35号染色体上,PKA-C2a的基因组结构在利什曼原虫和束 形短膜虫两个物种中均为保守序列。Bhattacharya等卩刀克隆并鉴定杜氏利什曼原 虫PKAR亚基(PKA-R1),发现PKA-R1与PKA-C相互作用,并抑制PKA活 性。LdPKA-Rl在利什曼原虫生命周期的各个阶段均有表达,在前鞭毛体中表达 水平最高,过表达LdPKA-Rl可加速细胞自噬过程。抑制利什曼原虫PKA活性 可导致其前鞭毛体主要裂解产物的磷酸化水平下降,寄生虫生长、繁殖过程明显 受到抑制閃。

2.1.4锥虫

Araujo等卩刃通过序列分析发现,布氏锥虫(Trypanosoma byucei) PKAR亚基 C末端具有充分折叠的a/p结构;TbPKAR亚基接头区域包含无序的PKA磷酸化 位点;TbPKAR亚基N末端缺少对接/二聚结构域,但富含亮氨酸重复序列(Leucine rich repeats, LRR)的基序,表明TbPKAR亚基不能形成同源二聚体。cAMP在在 非洲锥虫进入前循环期的分化过程中具有诱导细胞周期阻滞的作用㈤]。研究发现, cAMP信号通路对克鲁氏锥虫(Trypanosoma cmzi)的增殖、分化起双向调控作用: AC/PKA系统抑制细胞生长,而磷脂酶C/PKC系统刺激细胞生长HU。肌醇是大多 数克鲁氏锥虫表面分子的前体,由于该寄生虫是肌醇营养缺陷型,因此肌醇转运 系统可能是新的锥虫病药物的潜在靶标。Einicker-Lamas等阳研究发现克鲁氏锥虫 PKA效应分子抑制肌醇运输系统,而PKC效应分子刺激肌醇运输系统。Bubis等 通过分子排阻色谱法发现马媾疫锥虫Trypanosoma equipenhim) PKAR亚基是 一个单体蛋白质,其具有对蛋白水解非常敏感的钱链区,不具备结合环核昔酸的 能力。

2.2蠕虫

2.2.1曼氏血吸虫

曼氏血吸虫(Schistosoma mansonD PKA C亚基(SmPKA-C)在其生长发育 和代谢调控中也起着重要作用。通过对不同生命周期阶段的SmPKA-C表达进行定 量分析,发现SmPKA-C mRNA表达受发育调节,在尾呦和雌性成虫中的表达水 平最高。利用不同浓度的PKA抑制剂(H-89和PKI 14-22氨基化合物)处理血吸 虫尾呦和成虫,不仅会导致尾呦活力丧失,而且导致成虫的产卵量以剂量依赖的 方式下降。此外,发现感染血吸虫的小鼠模型中,产卵量下降和SmPKA-C mRNA 表达与PKA活性显著降低有关屮-45]。

通过抗磷酸蛋白激酶A抗体和共聚焦激光扫描显微镜对曼氏血吸虫活化PKA 进行功能定位发现,活化的PKA主要分布于完整尾呦的中枢和外周神经系统、口 腹吸盘、食道和排泄系统;而用腺昔酸环化酶激活剂(毛喉素)刺激SmPKA可导 致其产生运动过度的表现[他。多项研究结果显示,PKA对曼氏血吸虫尾呦的生长 发育是必需的,并且可能在成虫的繁殖过程中发挥特定的作用,有望作为治疗及 控制血吸虫病的药物靶点。

2.2.2绦虫

检测PKA抗原含量可以客观真实地反映宿主虫体感染量和感染状态,有利于 寄生虫的早期诊断和评价药物疗效。研究发现,多头带绦虫(Taenia multiceps} PKA C亚基(TmPKA-C)分为4种不同亚型,分别为(TmPKA-Cl、TmPKA-C2、 TmPKA-C3和TmPKA-C4)各亚型均具有典型的丝/苏氨酸蛋白激酶活性位点、蛋 白激酶ATP结合位点以及蛋白激酶结构域。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白 TmPKA-C 1> TmPKA-C2主要以包涵体形式存在;而Western Blotting结果发现, 重组蛋白TmPKA-CK TmPKA-C2均能与自然感染脑多头呦的绵羊血清发生强烈 反应,而与健康羊血清不反应,说明该蛋白存在于外周血中刺激机体产生免疫应 答。天然蛋白TmPKA-C由某些分泌性囊泡(外泌体)从胞内运输至胞外,进入宿 主外周血,从而刺激宿主产生免疫应答旳。刘光学等跑克隆并鉴定了猪带绦虫 (Taenia solium) PKA的C亚基(TsPKA-C),发现其具有良好的免疫原性,可用 于猪囊尾呦病的血清学诊断。

2.2.3线虫

研究发现,编码盘尾丝虫Onchocerca volvulus) PKA的R亚基(OvPKA-R) 开放阅读框长度为1 122 bp,其蛋白序列与秀丽隐杆线虫相应蛋白的同源性为 84%,与人类相应蛋白的同源性为71%o OvPKA-R蛋白具有独特的结构特征: OvPKA-R包含6个半胱氨酸残基,而哺乳动物只有4个半胱氨酸残基;免疫组织 化学研究发现,O vPKA-R定位于盘尾丝虫成虫和微丝呦的神经系统和感觉器官中, 在感染盘尾丝虫患者血清中发现IgG抗体与重组OvPKA-R反应强烈,说明 OvPKA-R具有良好的反应原性,可用于盘尾丝虫病血清学诊断[49】。

此外,非寄生性的秀丽隐杆线虫(Caenoyhabditis elegans^) PKA也有研究报告。 秀丽隐杆线虫PKA主要由C亚基(kin-1)、R亚基(kin-2)和A-激酶锚定蛋白 (AKAP) (aka-1)构成。由于可变剪接的存在,kiml有多达12种不同亚型网。 克隆并鉴定编码秀丽隐杆线虫PKA的R亚基cDNA和基因组序列,发现R亚基 由375个氨基酸残基构成,其中竣基末端145〜375残基序列鉴定匹配至哺乳动物R 亚基。研究发现,在秀丽隐杆线虫早期胚胎发生期间,R亚基浓度较低,而在线虫 孵化前数小时及幼虫阶段R亚基含量急剧增加(约6倍)达到峰值El。刘芬等炉] 通过遗传学手段直接证明了 cAMP/PKA信号通路参与秀丽隐杆线虫冷耐受;在冷 应激下秀丽隐杆线虫cAMP/PKA信号通路会被激活,而cAMP/PKA信号通路失活 后会增加线虫对冷应激的敏感性。通过筛选29个与线虫脂代谢相关的基因,发现 只有激素敏感脂肪酶(Hormone sensitive lipase, HOSL-1)参与调控脂肪水解,并 且其作用于cAMP/PKA信号通路的下游参与线虫对冷的抵抗。在冷刺激下,线虫 GSA-1/ACY-1信号通路被激活,促进神经元中的cAMP产生和释放,然后cAMP 分别激活肠道和神经元中的PKA, PKA激活CREB,正向调控HOSL-1,从而促 进脂肪水解,释放出更多甘油来抵抗寒冷。同时,神经元中的PKA以细胞非自主 的方式上调肠道、表皮和肌肉中的水通道蛋白AQP-1、AQP-3和AQP-7,促进甘 油的渗透,从而保护线虫免受低温环境导致的高渗压力的影响。

3展望

PKA通过对底物蛋白特定位点磷酸化在寄生虫生长、发育、繁殖等过程发挥 重要作用。对寄生虫中PKA进行基因克隆、序列分析和功能鉴定的研究有助于在 分子水平上了解寄生虫生长、发育和入侵宿主的机制,并有助于揭示各种寄生虫 和宿主之间的关系,为诊断和防治寄生虫病提供科学依据。目前,PKA在寄生虫 领域的研究已取得一定进展,但对其参与的代谢通路机制研究和功能的了解依然 有限,有必要深入研究。相信随着研究工作地深入发展,PKA将在寄生虫病防治 领域的应用会有新的突破。

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