一种新的淋病奈瑟菌丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的功能及致病作用研究论文

2020年11月27日10:25:17一种新的淋病奈瑟菌丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的功能及致病作用研究论文已关闭评论

一种新的淋病奈瑟菌丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的功能及致病作用研究论文
中文摘要

目的:课题组前期通过生物信息学分析提示NGO2105蛋白可能是淋球菌中一种新 的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白,本课题拟对NGO2105蛋白是否具有丝氨酸蛋白酶自转 运蛋白特征及其在致病过程中的作用进行研究,为深入了解淋球菌的致病机理和探寻 新的蛋白疫苗靶点提供实验依据。

方法:原核表达NGO2105蛋白passenger结构域截短蛋白并制备多克隆抗血清,用 于定位分析。通过缺失突变的方法构建淋球菌ngo2105基因缺失突变株,以pCTS32 质粒构建ngo2105基因回复菌株。采用流式细胞分析技术、Western blot技术分析 NGO2105蛋白的表面定位和分泌特征。利用点突变技术将NGO2105蛋白酶活性催化 三联体结构中的267位丝氨酸突变为丙氨酸,以验证其丝氨酸蛋白酶活性是否参与 passenger结构域的酶切与分泌过程。进一步将大肠杆菌自转运蛋白Hbp的passenger 结构域与NGO2105蛋白的translocator结构域融合,通过分析Hbp的passenger结构 域蛋白表面定位,以验证NGO2105蛋白translocator结构域是否具有转运异源蛋白的 功能。利用人宫颈癌上皮细胞探究NGO2105蛋白在淋球菌黏附及侵袭过程中的作用, 同时研究抗NGO2105抗体和抗passenger抗体对细菌黏附的抑制能力。利用雌激素处 理的小鼠淋球菌阴道感染模型,研究NGO2105蛋白在淋球菌定植过程中的作用,同 时分析抗NGO2105抗体在抑制淋球菌定植中的作用。

结果:成功表达、纯化出NGO2105蛋白passenger结构域截短蛋白,免疫小鼠后可 获得效价达到5.12X105的多克隆抗血清,可满足后续实验要求。成功构建了 ngo2105 基因缺失突变菌株和ngo2105基因回复菌株。流式细胞技术及Western blot技术分析 结果显示NGO2105蛋白定位于菌体表面,并通过自体水解切割,分泌至外环境。成 功构建了 NGO2105 S267点突变菌株,Western blot分析显示S267A点突变后 NGO2105蛋白passenger结构域不能被水解切割分泌至培养基,流式细胞分析显示点 突变后NGO2105蛋白仍可定位于细菌表面,提示NGO2105蛋白的丝氨酸蛋白酶活 性介导passenger结构域的自体切割及分泌过程。成功构建Hbp蛋白passenger结构域 与NGO2105蛋白translocator结构域的融合蛋白,通过流式细胞技术及免疫荧光显微 镜观察分析显示Hbp蛋白passenger结构域定位于细菌表面,提示NGO2105蛋白 translocator结构域具有转运异源蛋白的功能。细胞黏附侵袭实验结果显示淋球菌 ngo2105基因缺失突变株的黏附、侵袭能力相对于野生株显著下降,抗NGO2105抗 体和抗passenger抗体能够抑制淋球菌的黏附作用。小鼠阴道定植实验结果显示淋球 菌ngo2105基因缺失突变株在体内的定植能力较野生株显著下降,抗NGO2105抗体 能够抑制淋球菌阴道内的定植能力。

结论:本研究证实NGO2105蛋白符合自转运蛋白分泌特征,是淋球菌中一种新的 丝氨酸蛋白酶自转运蛋白。该蛋白在淋球菌的黏附、侵袭及小鼠阴道内定植过程中发 挥着重要作用,是淋球菌致病过程中一种重要的毒力因子。抗NGO2105抗体能有效 抑制淋球菌的黏附能力及在小鼠体内的定植能力,提示NGO2105蛋白可能是一种潜 在的蛋白疫苗靶点。

关键词:淋球菌,丝氨酸蛋白酶自转运蛋白,NGO2105蛋白,黏附,侵袭;定植

Study on the function and pathogenicity of a new serine protease
autotransporter in Neisseria Gonorrhoeae

Abstract

Objective In the early stage of our research group, bioinformatics analysis suggested that NGO2105 protein may be a new serine protease autotransporter in N.gonorrhoeae. In this study, we intend to prove that whether the NGO2105 protein has serine protease autotransport characteristics and its role in the the pathogenic process, to provide important experimental evidence for further understanding the pathogenic mechanism of N.gonorrhoeae and exploring new protein vaccine targets.

Methods Prokaryotic expression of NGO2105 protein passenger domain truncated protein and preparation of polyclonal antiserum, for localization analysis. Construction of gonococcal ngo2105 gene deletion mutants by deletion mutation method, and ngo2105 gene complement strains were constructed by pCTS32 plasmid. Flow cytometry and western blot were used to analyze the surface localization and secretion characteristics of NGO2105 protein. In order to verify whether its serine protease activity is involved in the cleavage and secretion of passenger domain, point mutation technology was used to mutate serine 267 to alanine, the serine is the main amino acid in the triad structure catalyzed in NGO2105 protease activity. The passenger domain of Hbp autotransporter protein in E. coli was fused with the translocator domain of NGO2105 protein, and the surface location of the passenger domain of Hbp protein was analyzed to verify whether the translocator domain of NGO2105 protein can transport heterologous proteins. Using cervical cancer epithelial cells to investigate the role of NGO2105 protein in the adhesion and invasion of N.gonorrhoeae. and to study the adhesion inhibition ability of anti-NGO2105 antibody and anti-passenger antibody. An estrogen-treated mouse N.gonorrhoeae vaginal infection model was used to study the role of NGO2105 protein in N.gonorrhoeae colonization and the role of anti-NGO2105 antibodies in inhibiting N.gonorrhoeae colonization.

Results After successfully expressing and purifying the NGO2105 protein passenger domain truncated protein, polyclonal antiserum with a titer of 5.12xl05 can be obtained after immunizing mice, which can meet the requirements of subsequent experiments. The ngo2105 gene deletion mutant strains and the ngo2105 gene complement strains were successfully constructed. Flow cytometry and western blot analysis showed that NGO2105 protein was localized on the surface of the bacteria, then cleavaged and secreted into the external environment by autocatalytic hydrolysis. Successfully construced the NGO2105 S267 point mutation strains, western blot confirmed that the passenger domain of the NGO2105 protein cannot be hydrolyzed and secreted into the culture medium after serine point mutation, flow cytometry analysis showed that NGO2105 protein could still be located on the surface of bacteria after point mutation, it was suggested that the serine protease activity of NGO2105 protein mediated the autologous cleavage and secretion of the passenger domain. The fusion protein of Hbp protein passenger domain and NGO2105 protein translocator domain was successfully constructed, flow cytometry and immunofluorescence microscopy showed that the Hbp protein passenger domain was localized on the bacterial surface, it was suggested that the NGO2105 protein translocator domain has the function of transporting heterologous proteins. Cell adhesion and invasion experiment results showed that the adhesion and invasion ability of N.gonorrhoeae ngo2105 gene deletion mutant strains were significantly lower than that of WT strains, and the anti-NGO2105 antibodies and anti-passenger antibodies could inhibit the adhesion of gonococci. The results of mouse vaginal colonization experiments showed that the ability of N.gonorrhoeae ngo2105 gene deletion mutant strains to colonize in vivo was significantly lower than that of WT strains, and anti-NGO2105 antibody could inhibit the vaginal colonization ability of N.gonorrhoeae.

Conclusion This study confirms that NGO2105 is a new serine protease autotransporter in N.gonorrhoeae. which is consistent with the characteristics of autotransporters. NGO2105 plays an important role in the adhesion and invasion of N.gonorrhoeae and intravaginal colonization in mice, and it is an important virulence factor in the pathogenesis of N.gonorrhoeae. Anti-NGO2105 antibody can effectively inhibit the adhesion ability of N.gonorrhoeae and colonization ability in mice, suggesting that the NGO2105 protein may be a potential protein vaccine target.

Key words Neisseria gonorrhoeae; serine protease autotransporter protein; NGO2105 protein; adhesin; invasin; colonization

前言

淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)又称淋球菌,为革兰阴性双球菌,是性传 播疾病淋病的唯一病原体⑴。该菌在男性患者中主要引起尿道炎,而在女性患者多表 现为无症状感染3】。临床上多见因患者治疗不及时而引发宫颈炎,盆腔炎等严重疾 病⑷。同时,感染淋球菌的男女患者罹患艾滋病病毒(human immunodeficiency vims, HIV)的概率也会增加⑸。在我国,淋病被列为乙类传染病,每年报告发病人数位居 乙类传染病前列,给公共卫生安全带来了巨大压力®]。一方面,由于淋球菌具有较 高的抗原变异率与相变率,并且缺乏模拟淋病发生发展的动物模型,导致目前尚无有 效的疫苗可供使用。另一方面,耐药监测发现,已有淋球菌对临床上常用抗生素产生 耐药抵抗&i°],其治疗面临无药可用的危险,因此被WHO列为“迫切的威胁事件叫I】。 目前,已在淋球菌中鉴定出一些毒力候选基因,但人们对其致病及免疫逃逸等分子机 制的了解还十分有限。因此,深入研究淋球菌致病的分子机理,对于筛选保守有效的 蛋白疫苗及抗菌药物作用靶点有重要的理论与现实意义。

自转运蛋白(&皿0说!13卩011切protein)是革兰阴性菌中一类多达1000多个成员的 蛋白家族,其在细菌致病过程中发挥多种重要作用rm。该家族蛋白具有保守的结构 特征:由N端的信号肽、passenger结构域和C端translocator结构域组成[14_16]o translocator结构域在外膜与一些特有的外膜蛋白形成一个复合桶状通道结构, passenger结构域便可通过该通道被转运至膜外[15J7]O转运后的passenger结构域定位 于细菌表面或通过自酶切作用分泌至胞外发挥蛋白功能皿19]。淋球菌中的IgAl蛋白 酶是在细菌中最早被鉴定的,同时也是目前在淋球菌中仅发现的一种自转运蛋白 ▽ON]。随着研究的不断深入,脑膜炎奈瑟菌中先后发现了 8种自转运蛋白,这些自转 运蛋白具有多种生物学功能,大多与毒力有关[22刃。

NGO2105蛋白是本课题组在淋球菌中筛选出的一种新的蛋白,生物信息学分析 提示其具有典型自转运蛋白结构特征,且该蛋白passenger结构域有一个与丝氨酸蛋 白酶自转运蛋白家族相同的保守蛋白酶结构域(pfam02395:Peptidase_S6)。而目前 认为,S6肽酶家族(Peptidase_S6)自转运蛋白与细菌的黏附能力、细胞毒性及免 疫调节等作用密切相关©I。同源模建发现NGO2105蛋白三维结构与大肠杆菌自转运 蛋白Hbp非常相似0]。ngo2105基因存在保守的丝氨酸蛋白酶基序(GDSGSP)及催 化三联体H, D, S氨基酸残基©I,提示该蛋白可能具有丝氨酸蛋白酶活性。据此, 我们认为淋球菌NGO2105蛋白是一种新的具有丝氨酸蛋白酶活性的自转运蛋白,其 可能参与淋球菌的致病机制。

本研究拟通过分析NGO2105蛋白的亚细胞定位,以确定其是否具有自转运蛋白 的典型定位特点;通过对预测的丝氨酸蛋白酶活性位点进行点突变,分析突变后 NGO2105蛋白的亚细胞定位特点,以验证其是否具有丝氨酸蛋白酶活性;最后通过 体内、体外实验探讨NGO2105蛋白在淋球菌黏附、侵袭、定植等致病过程的作用。

(2) NGO2105蛋白在淋球菌致病过程中的作用研究

评估NGO2105蛋白在淋球菌体内定植过程中的作用

1材料

1.1主要实验材料

1.1.1菌株及质粒

淋球菌标准菌株FA1090 (ATCC700825,购自美国菌种保藏中心)、E.coli DH5a、 E.coli BL21 (DE3)、E.coli C41 (DE3)及 pET28a、pCold TF 表达质粒(本实验室 保存),pCTS32克隆质粒(获赠于美国爱荷华大学实验室,ApicellaMA博士)。 1.1.2实验动物及细胞

BALB/c小鼠,SPF级,6〜8周,雌性,18〜20 g,购自国家啮齿类实验动物种 子中心,宫颈癌上皮细胞ME-180o

1.2主要实验试剂耗材及仪器

1.2.1主要试剂耗材

TS211B型恒温摇床 北京索莱宝公司 北京索莱宝公司 北京索莱宝公司 北京索莱宝公司 北京索莱宝公司 北京索莱宝公司 北京索莱宝公司 上海生物工程公司 上海生物工程公司 武汉三鹰公司 武汉三鹰公司 武汉三鹰公司 武汉三鹰公司

美国GE Healthcare公司 美国 Merck Millipore 公司 郑州贝瑞特公司 郑州贝瑞特公司 无锡NEST公司 无锡NEST公司 上海Gibco公司 美国Hyclone公司 美国Hyclone公司

生产厂家

上海力申科学仪器有限公司 上海越平科学仪器有限公司 上海天呈仪器有限公司T100 型 PCR 仪

GZX-9140MBE型数显鼓风干燥箱

Direct-Q8UV-R型超纯水仪

LDZM-80KCS-II型立式压力蒸汽灭菌器

HW-60型电热恒温水浴箱

N60 Touch超微量分光光度计测定仪

3111型二氧化碳培养箱

HERACELL 1501细胞培养箱

MICRO21R高速低温微量离心机

Allegra X-30R高速低温离心机

Ni-NTA亲和层析柱

FUSIONFX凝胶成像分析仪

TYZ0脱色摇床

微波炉

制冰机

超低温冰箱

免疫荧光显微镜

1.3主要溶液的配制

1.3.1抗生素贮存液的配制

抗生素均配置为母液浓度(lOOOx),用一次性0.22 pn无菌过滤器除菌,・20弋 保存,使用时再稀释为使用浓度。

  • 卡那霉素:配置浓度:50 mg/mLo
  • 氨茉霉素:配置浓度:100mg/mL。
  • 壮观霉素:配置浓度:100mg/mL。

1.3.2培养基的配制

  • Kelloggs补充物I贮存液配制(100x): 葡萄糖 40 g

谷氨酰胺                                                   1 g

Kelloggs补充物II贮存液配制(lOOOx):磁力搅拌器混匀,用一次性0.22 ym无菌过滤器除菌,・20弋保存。

磁力搅拌器混匀,用一次性0.22 pro无菌过滤器除菌,・20弋保存。

  • NaHCO3溶液贮存液配制(100x):

磁力搅拌器混匀,用一次性0.2(im无菌过滤器除菌,・20弋保存。

  • GCB培养基:

磁力搅拌器混匀,高压蒸汽灭菌(121.3°C, 20 min),待温度下降到50°C- 60°C左 右时取出,在超净工作台中加入Kellogg^补充物II mL和Kellogg^补充物II 100 ptL,混匀后倾倒于无菌平皿中,琼脂厚度达5 mm即可,待琼脂充分凝固冷却后将平 板盖上盖子,倒扣放置于4弋冰箱备用。

  • GCBL培养基:

磁力搅拌器上搅拌溶解,调接pH至7.5左右,高压蒸汽灭菌(121.3°C, 20 min), 待温度下降到50°C- 60°C左右时取出,在超净工作台中加入100(1L抗生素贮存液, 按1.3.2 (4)方法倾倒平板并保存。

1.3.3蛋白质表达及纯化所需溶液配制

  • IPTG溶液配制:

IPTG                                                          2.38 g

dd H2O                                                      定容至10 mL

磁力搅拌器混匀,用一次性0.2 ym无菌过滤器除菌,分装于1.5 mL EP管中,-20°C 保存。

  • Bingding Buffer:

IM Tris-HCl (pH 为 8.0)                          20 mL

离心管室温保存,使用时取出500(1L于EP管中,再加入卩■毓基乙醇25此。

(2) 5xSDS-PAGE电泳缓冲液:

(3)电转缓冲溶液配制:装于蓝盖瓶中,4。(2保存。

  • SDS-PAGE浓缩胶及分离胶制备:见TaKaRa官网。
  • 考马斯亮蓝染色液配制:


2.1 NGO2105蛋白passenger结构域截短蛋白的表达及纯化
搅拌混匀后室温保存。

(8) lOxTBST溶液配制:

上述溶液混匀后均用一次性0.2 pim无菌过滤器除菌,分别分装在50mL、15 mL 离心管中,用封口膜将外圈封好后于4。(2保存。

2实验方法

2.1.1淋球菌ngo2105基因passenger结构域截短基因引物设计

用Primer Premier 5.0软件,根据GenBank中淋球菌ngo2105基因序列

(NC_002946.2 )设计引物,拟定passenger结构域上游引物F :                          5」

CCGGAATTCGGACACACTTATTTCGGCATCAACT—3', 下游弓I 物 R :       5,—

CCCAAGCTTATGTGGT TCGTAGAATACTGAATGG —3\ 下划线部分分别为 EcoR I Hind"酶切位点,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

2.1.2 淋球菌FA1090细菌基因组DNA提取

将淋球菌FA1090标准菌株接种于GCB平板上,于5%CO2, 37。(2培养箱中过夜 培养,无菌脱脂棉签刮取淋球菌,将菌体重悬于无菌PBS中,调节菌量为OD6ooM).5, 离心收集细菌沉淀,按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取DNAo

2.1.3 PCR扩增目的基因

以提取的淋球菌细菌组DNA为模板,行PCR扩增passenger结构域截短基因, 大小为846 bp。反应体系及条件如下:

PCR产物行1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定,将扩增成功的PCR产物按琼脂糖凝胶回收 试剂盒说明书进行纯化,测定浓度后于・20弋保存。

2.1.4质粒的提取

从・80弋取出E.coli DH5a菌液(带有质粒pColdTF),在含有氨节霉素(100 pig/mL)的LB平板上分区划线,于CO2培养箱中过夜培养,挑取单个菌落接种至含 有相同抗生素的LB液体培养基中,恒温摇床中增菌至OD6ooM).5时,收集细菌沉淀, 按质粒提取试剂盒操作说明书提取pColdTF质粒,测定浓度后于・20弋保存。

2.1.5 passenger目的基因与pCold TF质粒的双酶切及纯化

使用限制性内切酶Eco7?I和Hz加/III同时酶切目的基因及质粒,酶切体系及条件 如下:

20°C保存。

2.1.6目的基因与pColdTF质粒连接

按摩尔比1:8比例将已酶切并纯化的质粒和目的基因混合后,使用T4 DNA连接 酶16。(2连接16h。连接体系如下:

连接体系(10pL)

质粒4.4(1L

目的基因3.6(1L

10 x T4 DNA Ligase Buffer 1(1L

T4 DNA Ligase 1(1L

2.1.7 E.coli DH5a及BL21 (DE3)感受态细胞的制备

按照经典的CaCl2法制备E.coli克隆菌株DH5a以及E.coli表达菌株BL21CDE3 ) 的感受态细胞,验证其转化效率后保存于。(2冰箱待用。

2.1.8重组质粒的转化及鉴定

取出E.coli 感受态细胞于冰上至半融化状态时,将连接产物全部加入,轻 轻混匀并冰浴30 min,再于恒温水浴箱42弋热击90 s,迅速放回冰上冰浴10 min, 再加入LB液体培养基,在37 °C, 180 rpm的恒温摇床中复苏1 h,涂布于含100昭/mL 氨茉抗生素的LB平板上,CCh培养箱中培养过夜。挑取LB平板上单克隆菌落,于 EP管增菌后行菌液PCR鉴定,筛选的阳性克隆菌落于加相同抗生素的液体LB培养 基中增菌,提取质粒行双酶切鉴定,将双酶切阳性的质粒送上海生物工程公司进行测 序,使用DNAssist软件比对测序结果。菌液PCR反应体系如下:

质粒双酶切鉴定条件同前,见方法2.1.5。将双酶切阳性质粒送至上海生物工程

公司进行测序。

2.1.9重组蛋白的诱导表达及纯化

将鉴定正确的pColdTF-passenger重组质粒转入E.coliBLll (DE3)表达菌感受 态细胞后,挑取含有重组质粒的单个菌落于LB液体培养基中培养至吸光度{A600nm) 为 0.6〜0.8 时,加入终浓度为 0.05 mmol/L 的 IPTG, 15。0 80 rpm 诱导 12 h, 12 000 Xg离心10 min收集菌体,并将其重悬于lxBinding Buffer,经超声破菌后分别取上清 和沉淀行SDS-PAGE鉴定蛋白质表达形式。将破菌后的上清液转入预先用1 x Binding Buffer平衡后的Ni-NTA亲和层析柱中,用不同咪卩坐浓度的Washing Buffer洗脱目的 蛋白,SDS-PAGE分析纯度后用PBS去除NaCl及咪卩坐,使用超滤杯浓缩蛋白。BCA 法进行蛋白质定量,调整浓度为0.3 (ig/^iL后分装,保存备用。

2.2淋球菌NGO2105蛋白及passenger结构域截短蛋白多克隆抗体的制 备及效价检测

2.2.1免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体及检测抗体效价

NGO2105全长蛋白的表达和多克隆抗血清制备,课题组前期已完成,在本文中 不再叙述。

取passenger纯化蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分混合后,经皮下多点注射免疫 BALB/c小鼠,免疫剂量20憾/只,于第14、28天分别取重组蛋白与等体积弗氏不完 全佐剂混合,加强免疫,同时设置佐剂阴性对照组。初次免疫42天后,采集尾静脉 血收集血清。

  • ELISA法检测抗体效价

用抗原包被液(pH 9.6的碳酸盐缓冲液)调节纯化重组passenger截短蛋白浓度 为10 |ig/mL,加至96孔酶标板(100(1L/孔),4。(2包被过夜,经5%BSA, 37。(2封 闭2 h后,用封闭液将小鼠抗passenger蛋白血清从1:1 000起倍比稀释,37 °C反应1 ho洗板后,加入HRP标记的羊抗鼠抗体(1:5 000稀释),每孔100 pL, 37 °C反应 45 min;加入显色液,37 °C避光反应30 min,最后加入终止液终止反应,在酶标仪 上读取吸光度值。结果判定标准:以待测标本A450nm/Alum佐剂对照A450 nm >2.1判为 阳性,出现阳性反应的最大稀释倍数为该抗体的滴度。

2.3 ngo2105基因缺失突变菌株构建

由于淋球菌具有较高的自然转化效率,其可以摄取含有一段碱基DUS序列 (GCCGTCTGAA)的外源DNA序列宙,因此,本研究拟在ngo2105基因缺失株构 建引物的亍端设计DUS序列以增加转化效率。首先采用重叠延伸PCR技术构建淋球 菌ngo2105基因起始密码子上游片段(包含DUS序列,・726〜・1 bp)以及ngo2105基 因起始密码子下游片段(1401〜1977bp)的融合片段,根据淋球菌标准转化方案(平 板斑点转化法)al,将融合片段转化淋球菌FA1090菌株,以敲除ngo2015基因起始 密码子及其下游片段(0〜1400bp),分离单个菌落并通过PCR鉴定筛选阳性菌株。 具体方法如下:

  • ngo2105基因起始密码子上游片段以及ngo2105基因起始密码子下游片段引物

设计

根据淋球菌ngo2105基因序列设计引物,扩增区示意图如图1。拟定ngo2105基 因起始密码子上游片段扩增正向引物F1 :                                                                        5」ATGCCGTCTGAA

GGTTCAGCAGCATCTCCATCACTAC—3 \ 反向弓 I 物 R1 : 5TTGAACCAGCTATT TTTCCTTATCTGACGGGATTC —3,,下划线部分为DUS序列。拟定ngo2105基因起 始密码子下游片段序列正向引物 F2 :                                                                                                         5,

—AGGAAAAATAGCTGGTTCAAGCCAAAGGGGAAAAC—3,, 反 向引物 R2 : 5,—TGACCACCCGCTTCCTAAATGATTG—3,,引物由上海生物工程技术服务有限公 司合成。

J缺失基因起始密码子及其下游片段的啣耳阿基因

融合片段ABi:1303bp)

图1重叠延伸PCR扩增示意图

Fig.l Schematic of overlap extension PCR amplification

  • PCR扩增ngo2105基因起始密码子上游片段及ngo2105基因起始密码子下游 片段

以淋球菌FA1090细菌基因组DNA为模板,分别扩增ngo2105基因的起始密码 子上游片段A (引物F1/R1)、ngo2105基因起始密码子下游片段B (引物F2/R2), 再用DNA纯化试剂盒分别纯化A、B片段。PCR分别扩增片段A (726bp)和片 段B (577bp)的反应体系和反应条件均如下:

2.3.3重叠延伸PCR技术构建缺失ngo2015基因起始密码子及其下游片段的融合 片段AB

由于引物R1与F2互补配对,故上游片段与下游片段具有互补末端,以上下 游片段为模板,通过外侧引物F1和R2进行重叠延伸PCR扩增,即可将上下游片 段连接起来,得到缺失ngo2015基因起始密码子及其下游片段的融合片段AB,再用下游引物R2 2piL

Prime Star 酶 0.5 pL

2.3.4融合片段AB转化淋球菌FA1090菌株并PCR筛选鉴定

利用平板斑点转化法将已纯化的融合片段AB与淋球菌FA1090菌株共孵育,挑 选单个菌落,PCR筛选阳性克隆菌。具体方法如下:

  • 将淋球菌从・80弋取出接种于GCB平板上,于CO2培养箱中过夜培养。
  • 将纯化后的融合片段AB (10|iL)滴在GCB平板中央。
  • 通过镜下使用接种针挑取单个有菌毛的淋球菌,以划线的方式将接种针穿过滴 有融合片段AB的DNA斑点,于CO2培养箱中过夜培养。
  • 使用接种针挑取DNA斑点内的单个淋球菌,接种在GCB平板上,于CO2培养

应条件如下:

淋球菌回复菌株构建以ngo2105基因缺失突变菌株为模板,回复菌株所需质粒 pCTS32获赠于博士 Apicella MA所在科研实验室囚岀。将构建的pCTS32-NGO2105 重组质粒使用限制性内切酶Nc。I线性化后,利用淋球菌斑点转化法将重组质粒转入 ngo2105基因缺失突变菌株中〔29],利用壮观霉素筛选阳性克隆,并进行PCR验证。 具体方法如下:

2.4 ngo2105基因回复菌株构建

  • ngo2105基因引物设计

根据淋球菌ngo2105基因序列设计引物,拟定ngo2105基因上游引物F: 5CCGCTTAAGATGAAAACAACCGACAAACGGACAA— 3,, 下游引物 R : 5」CCCCCCGGGTTACCAGCGGTAGCCTAATTTGATG —3,,下划线部分分别为限 制性内切酶劲II和弘Qi的酶切位点。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

  • 淋球菌FA1090细菌基因组DNA提取

方法见2.1.2o

  • PCR扩增目的基因

以提取的淋球菌细菌组DNA为模板,行PCR扩增ngo2105基因,大小为4407 bp。 反应体系及条件如下:

PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将扩增成功的PCR产物按琼脂糖凝胶回收

试剂盒说明书进行纯化,测定浓度后于・20。(2保存。

2.4.4质粒的提取

从・80。(2取出E.coli  菌液(带有质粒pCTS32),在含有壮观霉素(100 pig/mL)

的LB平板上分区划线,于CO2培养箱中过夜培养,质粒提取方法见2丄4。

2.4.5   ngo2105基因与pCTS32质粒的双酶切及纯化

使用限制性内切酶MII和Sma I同时酶切目的基因及质粒,目的基因与质粒酶 切体系及条件均如下:

酶切体系(20(1L)

dd H2O 10(iL

0.1% BSA 2(iL

10xT Buffer 2(iL

目的基因及质粒各4此

4/7II 1 (1L

Sma I 1)liL

酶切条件:37。(2恒温水浴3 11。酶切产物经DNA纯化试剂盒纯化。测定浓度后

于-20°C保存。

2.4.6目的基因与pCTS32质粒连接

按摩尔比1:5比例将已酶切并纯化的质粒和目的基因混合后,使用T4DNA连接 酶16。(2连接16h。连接体系如下:

连接体系(10pL)

质粒1.1(1L

目的基因6.9(1L

10 x T4 DNA Ligase Buffer 1(1L

T4 DNA Ligase 1(1L

2.4.7 E.coli DH5a感受态细胞的制备

见方法2.1.7o

2.4.8重组质粒的转化及鉴定

  • 转化:方法见1.8o
  • PCR鉴定:单克隆菌液制备方法及PCR扩增体系见1.8o反应条件如下: 反应条件

94 °C     2 min

94 °C                   20 s   '

55 °C 15 s                  , 30 个循环

72 °C    4 min 30 s

72 °C     5 min

4 °C oo

  • 双酶切鉴定:质粒双酶切鉴定条件同前,见方法4.5。将双酶切阳性的质粒送 上海生物工程公司进行测序,使用DNAssist软件比对测序结果。

2.4.9重组质粒线性化、转化及鉴定

将鉴定正确的pCTS32-NGO2105重组质粒经限制性内切酶Neo I线性化后,将纯 化后产物以斑点转化的方法转化ngo2105基因缺失突变株,利用壮观霉素抗性平板筛 选,并进行PCR鉴定。具体方法如下:

  • 限制性内切酶Ncol线性化,酶切体系及酶切条件如下:

酶切体系(20(1L)

dd H2O 7(1L

0.1% BSA 2(iL

10xK Buffer 2(1L

重组质粒8 piL

Neo I 1 pL

酶切条件:37。。恒温水浴3 h。酶切产物经DNA纯化试剂盒纯化。

  • 线性重组质粒转化及PCR鉴定

通过斑点转化法将线性重组质粒转化ngo2105基因缺失突变株,斑点转化法见

2.3.4。于壮观霉素抗性平板上挑取单个克隆菌株行PCR再次鉴定。

2.5 pET28a-NGO2105重组质粒构建

2.5.1淋球菌ngo2105基因引物设计

设计方法见2.4.1 o拟定ngo2105基因上游引物F: 5CCGGAATTCATGAAA ACAACCGACAAACGGACAA—3f,下游引 物 R : 5CCCAAGCTTTTACCAGC GGTAGCCTAATTTGATG—3,,下划线部分分别为限制性内切酶EcoR IHind" 的酶切位点。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

  • ngo2105基因PCR扩增及pET28a质粒提取

淋球菌细菌基因组DNA提取方法见2.1.2o PCR反应体系及反应条件见2.4.3 o pET28a质粒提取以E.coli 菌液(带有质粒pET28a)为模板,提取方法见2.1.4。

  • ngo2105基因与pET28a质粒的双酶切及纯化

使用限制性内切酶和H加〃III同时酶切目的基因及质粒,酶切体系及条件 如下:

目的基因6(iL

EcoR I 1 pL

Hind III 1 pL

酶切条件:37。(2恒温水浴3 11。酶切产物经DNA纯化试剂盒纯化。测定浓度后 于・20。(2保存。

2.5.4目的基因与pET28a质粒连接

按摩尔比1:5比例将已酶切并纯化的质粒和目的基因混合后,使用T4DNA连接 酶16。(2连接16h。连接体系如下:

连接体系(10pL )

质粒2.7(1L

目的基因5.3(1L

10 x T4 DNA Ligase Buffer 1(1L

T4 DNA Ligase 1(1L

2.5.5重组质粒的转化及鉴定

E.coli            克隆菌株感受态细胞制备见2.1.7。转化方法见2.1.8。于含有卡那抗

生素(50yg/piL)的LB平板上挑取单克隆菌落,EP管增菌后行菌液PCR鉴定,鉴 定方法见2.4.8。质粒双酶切鉴定条件同前,见方法2.5.3。将双酶切阳性的质粒送上 海生物工程公司进行测序,使用DNAssist软件比对测序结果。

2.6 ngo2105基因点突变菌株构建

分别以pCTS32-NGO2105以及pET28a-NGO2105为模板,利用PCR扩增将 NGO2105 第 267 位丝氨酸突变为丙氨酸(pCTS32・NGO2105 S267A、pET28a-NGO 2105S267A),将纯化后的DNA产物通过 巾刃I酶消化以去除去未突变的DNA后, 将消化产物转化E.coli      感受态细胞,涂布于抗性平板中,培养过夜后挑取单克

隆菌株,经测序鉴定。

2.6.1 PCR 扩增

设计并合成以ngo2105基因为模板,将其第267位丝氨酸突变为丙氨酸的上游引 物 F : 5CTCATTTGGCGACgctGGCTCACCAATGTTTATCTATGATG—3,,下游引 物 R: 5CATCATAGATAAACATTGGTGAGCCagcGTCGCCAAATGAG—3f,通过 PCR扩增。PCR反应体系及反应条件如下:

PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将扩增成功的PCR产物按琼脂糖凝胶回收 试剂盒说明书进行纯化,测定浓度后于・20。(2保存。

  • 印巾1酶消化筛选突变DNA模板

设置PCR扩增前重组质粒经Dpn I酶消化对照组、PCR扩增前重组质粒未经Dpn I酶消化对照组以及未转化质粒的E.colim5a感受态细胞空白对照组。反应体系及 反应条件如下:

PCR扩增前重组质粒消化体系(20(1L)

ddH2O 15.5(1L

10xT Buffer 2(iL

PCR扩增前重组质粒1.5 piL

Dpn I 1)liL

酶切条件:37弋恒温水浴3h, 7(TC热灭活15 mine 2.6.3转化及鉴定

E.coli 克隆菌株感受态细胞制备见2.1.7o转化方法见2.1.8。于抗性LB平 板上挑取单克隆菌落,EP管增菌后将菌液送上海生物工程公司进行测序,使用DNA ssist软件比对测序结果。

2.6.4构建淋球菌ngo2105基因丝氨酸点突变菌株及大肠杆菌ngo2105基因丝氨酸点 突变菌株

方法见2.4.9和2.1.8o

2.7 pET28a-Hbp passenger-NGO2105 translocator 重组载体构建及 pET28a-Hbp passenger 重组载体构建

利用重叠延伸PCR技术将E.coli也〃基因passenger结构域㈤]与淋球菌ngo2105 基因translocator结构域构建融合片段,并且同样利用重叠延伸PCR技术在日切基 因passenger结构域N端插入Myc标签蛋白,由于自转运蛋白其passenger结构域蛋 白由C端至N端被运送至膜外,因此检测到Myc蛋白即说明检测到全长passenger 蛋白OH。将融合片段构建在pET28a表达载体上(pET28a・Hbppassenger・NGO2105 translocator),同时构建 pET28a-Hbp passenger 重组载体的对照组,转化 E.coli C41 (DE3)感受态细胞中,该菌株能够更好的控制外源基因的表达,并且可能具有其他 机制帮助外源性自转运蛋白靶向外膜卩1] O

  • coli Hbp基因passenger结构域以及淋球菌ngo2105基因translocator结构域 引物设计

根据 GenBank E.co"(含有质粒 pSA186_2) 旳基因(NZ_CP022731.1)序 列设计引物,拟定Hbp基因passenger结构域上游引物F1 : 5GCCGGAATTCATGAACAGA ATTTATTCTCTTC—3',拟定插入 Myc 标签下游引 物 R1: 5CAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCTTCATTATTGACCGT—3f, 下划线部分为EcoR I酶切位点;拟定插入Myc标签上游引物F2 : 5GAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTGACGGTCAATAATGAA—3,,拟定 Hbp 基因 passenger 结构域下游引物 R2 :                                                                   5'—GTCAGCGTGTTG

AAACGGGAGCTGATGTGCATGAATG—31 拟定 ngo2105 基因 translocator 结构域上 游弓I 物 F3 : 5,—CATTCATGCACATCAGCTCCCGTTTCAACACGCTGAC—3',

ngo2105 基因 translocator 结构域下游引物 R3:5CCC AAGCTTTTACC AGCGGTAGC CTAATT—3\下划线部分为//加〃111酶切位点,引物由上海生物工程技术服务有限 公司合成。

  • 细菌基因组DNA提取

E.coli (含有质粒pSA186_2)质粒提取方法见2.1.4o淋球菌FA1090细菌基因组

DNA提取方法见2.1.2o

  • PCR扩增Eco方H切基因passenger结构域基因以及淋球菌ngo2105基因 translocator结构域基因

PCR扩增Hbp基因passenger结构域片段A(Myc标签上游),Hbp基因passenger 结构域片段B (Myc标签下游)以及ngo2105基因translocator结构域片段C。A、B、

C片段PCR反应体系及反应条件如下:

  • A片段反应体系及反应条件

反应体系(50)liL)

dd H2O 32(iL

5xPS Buffer 10(iL

dNTP Mixture 4)liL

质粒模板DNA 1.5此

上游引物Fl 1(1L

下游引物R1 1 |1L

Prime Star 酶 0.5 pL

  • B片段反应体系及反应条件

反应体系(50 pL)

dd H2O 32(1L

5xPS Buffer 10(iL

dNTP Mixture 4)liL

质粒模板DNA 1.5 piL

上游引物F2 1吐

下游引物R2 1(1L

Prime Star 酶 0.5 pL

  • C片段反应体系及反应条件

反应体系(50 pL)2.7.4重叠延伸PCR扩增构建ABC融合片段、AB融合片段PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将扩增成功的PCR产物按琼脂糖凝胶回收 试剂盒说明书进行纯化,测定浓度后于・2(rc保存。

重叠延伸PCR技术扩增融合片段ABC,由于引物R1与F2互补配对,引物

R2与F3互补配对,故A与B、B与C片段具有互补末端,以A、B、C片段为模 板,分别通过外侧引物F1/R2和F1/R3进行重叠延伸PCR扩增,即可将A、B 及A、B、C片段连接起来,得到融合片段AB及ABC,再用DNA纯化试剂盒纯

片段B的PCR纯化产物 1(1L                 72 °C 5 min

片段C的PCR纯化产物1 |1L                    4°C oo

上游引物Fl 1(1L

下游引物R3 1 piL

Prime Star 酶 0.5 pL

2.7.5构建融合片段的重组质粒

质粒提取方法见2.1.4o目的基因(AB、ABC)与pET28a质粒的双酶切及纯化 方法见2.5.3。目的基因(AB、ABC)与pET28a质粒连接方法见2.5.4。重组质粒的 转化及鉴定见2.5.5。

2.8流式细胞技术检测及免疫荧光显微镜观察分析蛋白定位

以抗NGO2105抗血清作为一抗,通过流式细胞分析仪分别检测淋球菌(包括 WT, ngo2105基因缺失菌株)以及E.coli C41 (DE3)(分别含有质粒pET28a、 pET28a-NGO2105> pET28a-NGO2105 S267A)全菌表面荧光强度,同时设置不加抗 体的空白对照组(Blank)以及以免疫前血清(PI)作为一抗的阴性对照组,从而对 NGO2105蛋白进行定位分析。以抗Myc蛋白抗体作为一抗(passenger结构域蛋白中 插有Myc标签蛋白),通过流式细胞分析仪检测E.coli C41 (DE3)(分别含有质粒 pET28a、pET28a-Hbp passenger> pET28a-Hbp passenger-NGO2105 translocator)的全 菌表面荧光强度及免疫荧光显微镜观察细菌表面荧光,对Hbp蛋白passenger结构域 蛋白进行定位分析,从而探究NGO2105蛋白translocator结构域是否具有转运功能。 具体方法如下:

2.&1淋球菌的样品制备

将淋球菌接种于GCB平板,无菌脱脂棉签刮取淋球菌重悬于无菌PBS,将其菌 液MCF调节为4.0,分为3组。

(1)    空白组:将菌液加至EP管,加入1%多聚甲醛,保存于4弋。

(2)    阴性对照PI组:菌液加至EP管,5 000为加离心20 min,用含有1%BSA, 0.01% Tween 20的PBS (PBS+ )重悬菌体,将免疫前小鼠血清作为一抗加至菌悬液中(1:100 稀释),室温孵育lh, 5 000 rpm离心20 min, PBS+洗涤沉淀3遍,避光加入含FITC 标记的抗体(1:200稀释),室温避光孵育lh, 5 000 rpm离心20 min, PBS+洗涤沉淀 3遍,加入1%多聚甲醛,保存于4。(2。

  • 待测组:菌液加至EP管中,5000 rpm离心20 min, PBS+重悬菌体,将制备的 抗NGO2105抗血清作为一抗加至菌悬液后(1:100稀释),剩余方法见&1 (2)。 2.8.2大肠杆菌的样品制备

将含有不同质粒的E.coliCAX (DE3)接种在卡那霉素抗性平板中,过夜培养后, 挑取单个克隆菌株于LB液体培养基中扩大培养至吸光度(A6oonm)为0.6〜0.8时,加入 0.5 mM的IPTG, 15。(2过夜诱导,5 000 rpm离心20 min, PBS洗涤3次,将其菌液 MCF调节为2.0,分为3组。

  • Blank组:将含有质粒pET28a-NGO2105的菌液加入1%多聚甲醛,保存于4。(2。
  • 阴性对照PI组:将含有质粒pET28a-NGO2105的细菌菌液加至EP管后,乘lj余 方法见方法&1 (2)。
  • 待测组:将含质粒 pET28a、pET28a-NGO2105 S267A> pET28a-NGO2105 的菌 液及含质粒 pET28a、pET28a-Hbp passenger、pET28a-Hbp passenger-NGO2105 translocator的菌液加至EP管中,一抗分别为抗NGO2105抗血清及抗Myc蛋白抗体

(1:100稀释),5 000 rpm离心20 min, PBS+重悬菌体,避光加入含FITC标记的抗 体(1:200稀释),室温避光孵育lh, 5 000 rpm,离心20min, PBS+洗涤沉淀3遍,加 入1%多聚甲醛,保存于4弋。

2.8.3上机检测及显微镜观察

上述不同样本分别吸取200 piL至流式分析管中或取5 piL滴于载玻片上,做好标 记,上机进行流式分析及免疫荧光显微镜观察。

2.9 Western blot技术分析蛋白定位

2.9.1淋球菌的样品制备

  • 全菌蛋白:将淋球菌菌株(WT, ngo2105基因缺失菌株,ngo2105基因回复菌 株)分别接种于GCB固体培养基中,置5%CCh , 37弋培养箱中过夜培养,刮取菌 体置灭菌PBS中洗涤2次,加50 |1L lx SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,沸水煮20 min 后,・20°C保存备用。
  • 培养基上清蛋白:将淋球菌菌株(WT菌株,ngo2105基因缺失菌株,ngo2105 基因回复菌株,ngo2105基因丝氨酸点突变株)分别接种于GCB固体培养基中,置 5%CO2 , 37。(2培养箱中培养至对数生长期时使用脱脂棉签刮取菌体,用37。(2预热的 GCBL将菌体调节至OD540为2后,放置摇床,37°C, 180 rpm培养18 h,直至OD54o 为0.8时[26], 4°c, 13 000 g离心10 min收集培养基上清,上清使用0.2 pim 一次性 滤头抽滤后用甲醇氯仿法浓缩培养基上清蛋白卩%加50 pL lx SDS-PAGE蛋白上样 缓冲液,沸水煮20 min后,・20弋保存备用。

2.9.2大肠杆菌样品制备

培养基上清蛋白:将E.coli C41 (DE3)表达菌株(含质粒pET28a-NGO2105> pET28a-NGO2105 S267A)分别接种在卡那霉素抗性平板中,过夜培养后,挑取单个 克隆菌株于100 mLLB液体培养基中扩大培养至吸光度(厶。皿)为0.6〜0.8时,加入 ImM的IPTG, 37。(2诱导4h后,4°C, 13 000g离心10 min收集培养基上清,抽滤 后采用甲醇氯仿法浓缩培养基上清蛋白。

  • Western blot 检测蛋白

室温最高转速离心5 min,取15(1L上清行SDS-PAGE电泳,然后转PVDF膜,

5 %脱脂奶粉封闭2 h,再用1:1 000稀释的一抗(分别为抗NGO2105抗体、抗passenger 抗体,抗Myc蛋白抗体),4弋摇床孵育过夜。TBST洗涤3次(10 min/次),再用HRP 标记的抗体(1:5 000稀释),37。(2摇床温育lh。TBST洗涤3次(10 min/次),洗涤 后用高灵敏化学发光底物检测试剂盒(ECL)进行显色分析。

2.10细胞培养

2.10.1复苏

取出细胞冻存管,置37。(2温水中融化。将细胞悬液移至装有5 mL含10 % FBS 的MEM细胞培养基的离心管中;800 rpm离心5 min,弃上清;使用培养基洗涤细胞 一次后,在沉淀中再次加入5mL含10%FBS的细胞培养基,吹打均匀,转移至细 胞培养瓶中,放置于37 °C, 5%CO2的无菌培养箱中培养,第二天更换培养基继续 培养。

2.10.2传代

当细胞生长至培养瓶底面积的80 %左右时,去除培养基,用无菌PBS洗涤3次, 加入0.25%的胰蛋白酶消化细胞,室温孵育数分钟,待观察细胞开始变圆时,弃去 胰酶溶液,加入5mL含10 % FBS的细胞培养基终止消化,多次吹打后将细胞悬液 转至15 mL离心管中,800 rpm离心5mim于细胞沉淀中加入培养基重悬细胞,并按 需要的密度接种于新的培养瓶中。

2.11淋球菌黏附侵袭上皮细胞实验以及抗体黏附抑制实验

2.11.1淋球菌黏附ME-180上皮细胞实验

  • 细胞培养:收集对数生长期的ME-180细胞hl,按每孔1x105密度接种于24 孔板中,于37 °C. 5%CO2培养箱中培养24 h,使其生长至单层贴壁细胞〔27]。
  • 细菌培养:将淋球菌(WT, ngo2105基因缺失菌株,ngo2105基因回复菌株以 及ngo2105基因丝氨酸点突变菌株)分别接种在GCB平板上,37 °C. 5%C O2培养 箱中培养18h,使用无菌棉签刮取菌体至MEM培养基中,将菌液调至MCF为5 后,按1:100稀释,将菌量调节为1 xl06CFU/mLo
  • 去掉孔内原有培养基,将含有细菌的MEM培养基加至铺有细胞的24孔板中(细 胞数与细菌数比值MOI为1:10) o 37°C, 5%CO2培养箱中孵育3 h。
  • 去掉孔内含菌培养基,沿孔壁轻柔加入无菌PBS,轻轻吹打洗涤,重复3次, 以去除未黏附于细胞的细菌。
  • 收集孔内细胞,将其经连续稀释后涂布于GCB平板上,37°C, 5%C O2培养箱 培养18h,计数平板上不同菌株的菌落数。

2.11.2淋球菌侵袭ME-180 ±皮细胞实验

  • 将不同淋球菌菌株与上皮细胞孵育,方法见11.1 (1-4) o
  • 向孔内加入含庆大霉素(100憾/mL) 0]的MEM培养基,37°C, 5%C O2培养 箱中孵育1 h,以杀灭黏附于细胞表面的细菌。
  • 去掉孔内含抗生素的培养基,沿孔壁轻柔加入无菌PBS,轻轻吹打洗涤,重复 3次。
  • 收集孔内细胞,将其经连续稀释后涂布在GCB平板上,37 °C, 5%CO2培养箱 培养18h,计数平板上不同菌株的菌落数。

2.11.3抗体抑制淋球菌黏附上皮细胞实验

  • 上皮细胞与细菌的培养见11.1 (1-2) o
  • 将淋球菌(WT)预先与热灭活的抗NGO2105抗体及抗passenger抗体(分别 用MEM培养基按1:20、1:40、1:80稀释)室温孵育30 min。
  • 将预处理后的WT菌株与上皮细胞孵育,方法见11.1 (3) o
  • 洗涤及收集细胞并涂板计数,方法见11.1 (4-5) o

2.12细菌小鼠体内定植实验

2.12.1实验动物准备

将购买的雌性BALB/c小鼠(6・8周)随机分成4组,每组8只,分别为WT组, ngo2105基因缺失突变组,ngo2105基因回复组,WT经抗NGO2105抗体预处理组。 分笼饲养,饲养所需笼具,饲料,垫料及饮用水均经高压后灭菌,小鼠自购进后适应 性饲养1周,期间每天用巴氏无菌滴管吸取少量灭菌生理盐水冲洗小鼠阴道,冲洗液 涂片以观察其动情周期,小鼠的动情周期分为动情前期,动情期,动情后期及动情间 期。据研究发现,在小鼠动情前期最易感染淋球菌,因此通过阴道分泌物细胞学特征 即满视野有核上皮细胞,偶见少量角化细胞,极少甚至没有白细胞,以确定小鼠处于 动情前期。

2.12.2动物的预处理

  • 配制雌激素贮存液(20x)

17卩■雌二醇                                            50 mg

DMSO                                                       1 mL

使用时用芝麻油稀释20倍,上下剧烈晃动混匀后使用厲]。

  • 配制抗生素贮存液

硫酸盐万古霉素配置浓度:50 mg/mL,硫酸链霉素配置浓度:100mg/mL,用一 次性无菌过滤器除菌,・20弋保存。

  • 在即将进入动情周期的小鼠,将油溶形式的17卩・雌二醇5 mg在接种细菌前 二天,当天,以及接种细菌后第二天以皮下注射方式预处理小鼠昭。
  • 小鼠在接种细菌前二天,腹腔注射水溶形式的硫酸盐万古霉素(0.8 mg)及硫 酸链霉素(1.2 mg),每天两次,以抑制小鼠生殖道共生菌的过度生长卩I
  • 感染小鼠

(1)菌液的制备:将淋球菌(WT, ngo2105基因缺失菌株,ngo2105基因回复菌株) 分别接种在GCB平板上,37°C> 5%C Ch培养箱中培养18h,使用无菌棉签刮取菌 体将菌悬液调至MCF为0.5o

  • 抗NGO2105抗体预孵育的菌液制备:使用无菌棉签刮取WT菌株,重悬于加 有热灭活的抗NGO2105抗体的PBS中(1:20稀释),调节菌液浓度MCF为5,室 温预孵育30 mine
  • 小鼠体内感染细菌:阴道分泌物涂片观察小鼠进入动情前期时,用50 mmol/L HEPES (PH=7.4)缓冲液30 yL冲洗小鼠阴道,以提供更稳当的局部生理环境有利于 实验细菌的感染。雌激素预处理后,取20 yL菌悬液(WT, ngo2105基因缺失突变 株,ngo2105基因回复菌株)接种于小鼠阴道,接种菌量为2xlO6CFU/只。

2.12.4小鼠阴道分泌物采集

于细菌接种后第3、4、5、6天分别用50 piL生理盐水多次冲洗阴道,以采集阴 道分泌物,经连续稀释后涂布于GCB平板,于次日菌落计数[隔。同时将阴道分泌物 分别做革兰染色和瑞氏染色,革兰染色用于确定分泌物中淋球菌,瑞氏染色用于观察 分泌物中多形核白细胞(PMN)数量。

2.13统计学方法

本研究实验数据采用SPSS 19.0和Graph-Pad Prism 5.0软件进行统计分析并制 图。PV0.05视为组间比较差异具有统计学意义。

2.14生物安全及伦理声明

本研究涉及实验操作严格按照生物安全二级实验室的标准操作。动物实验经伦理 委员会批准。

3结果

3.1 表达及纯化NGO2105蛋白passenger结构域截短蛋白

3.1.1 pCold TF-passenger原核表达载体的构建

PCR产物行电泳鉴定,可见大小为846 bp的目的条带。提取阳性克隆中重组质

粒行双酶切鉴定,酶切产物经电泳鉴定可见与目的基因大小相符的酶切片段。测序结 果与GenBank数据库中淋球菌FA1090菌株的passenger截短基因序列相符,提示

pCold TF-passenger重组质粒构建成功(图2)。

注:M: DNAMarker; A: passenger 片段 PCR 产物;B: 1: pCold TF-passenger 重组质粒;2:重组质粒双酶切peak sequencing of partial sequencing of objective gene

鉴定;C:重组质粒passenger序列部分测序峰图

  • 重组passenger截短蛋白的诱导表达及纯化

提取pCold TF-passenger重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)表达菌中,经IPTG诱 导后,在相对分子量约为90 kD处可见明显增粗的目的蛋白条带(为passenger截短 蛋白35 kD和pCold TF 55 kD标签蛋白之和)。超声破菌后对蛋白表达形式进行分析, 该蛋白主要以可溶形式存在。经Ni-NTA柱亲和层析纯化后,可获得高纯度的目的蛋 白(图3)。

3重组蛋白诱导表达及纯化SDS-PAGE

Fig.3 The SDS-PAGE picture of induced expression and purification of recombinant protein 注:M:蛋白 Marker; 1:空载 EL21 (DE3)未诱导;2:空载 BL21 (DE3)诱导;3: pCold TF-passenger 重组 质粒BL21 (DE3)未诱导;4: pCold TF-passenger重组质粒BL21 (DE3)诱导;5:诱导重组质粒超声破菌后沉 淀;6:诱导重组质粒超声破菌后上清;7:含300mM咪瞠的Elution Buffer经Ni柱纯化后的目的蛋白 3.2passenger截短蛋白多克隆抗血清制备及鉴定

为分析蛋白定位,需制备抗passenger抗体。将纯化的passenger截短蛋白免疫5 只BALB/c小鼠后采集其血清,行间接ELISA法测定抗体效价。结果显示,与免疫 前血清相比,重组蛋白免疫小鼠后均产生高效价的抗体滴度,抗体滴度均达5.12X105 (图 4)。

图4免疫前后小鼠血清抗体效价分析

Fig.4 Analysis of mouse serum antibody titers before and after protein immunization

注:Pre-immunity:免疫前血清;Post-immune serun:免疫后血清

3.3 ngo2105基因缺失菌株构建及ngo2105基因回复菌株构建

为进一步研究NGO2105蛋白,需构建ngo2105基因缺失突变株及ngo2105基因 回复菌株。首先构建缺失ngo2105基因起始密码子的融合片段,通过斑点转化法将融 合片段转化淋球菌FA1090菌株,经PCR筛选ngo2105基因缺失突变菌株。通过斑点 转化法将构建的重组质粒pCTS32-NGO2105转化ngo2105基因缺失突变菌株,经抗 性筛选ngo2105基因回复菌株。通过PCR验证,成功构建ngo2105基因缺失菌株及 ngo2105基因回复菌株。

3.3.1   ngo2105基因缺失菌株构建及筛选

以引物Fl/Rl、F2/R2、F1/R2分别扩增ngo2105基因始密码子上游片段A、下 游片段B以及缺失ngo2105基因起始密码子的融合片段AB,扩增产物经电泳验证, 结果如图A所示,PCR成功扩增出726 bp的上游片段A (A图中1泳道)、577 bp 的下游片段B (A图中2泳道)以及1303 bp的融合片段AB (A图中3泳道)。将 融合片段AB经斑点转化法转化淋球菌FA1090菌株,以引物F1/R2行菌落PCR验证, 结果如图B所示,WT菌株扩增片段大小为2703 bp (B图中2泳道),而ngo2105 基因缺失突变株扩增片段大小为1303 bp (B图中1、3泳道),以上结果表明淋球菌 ngo2105基因缺失突变株构建成功。

5 PCR产物鉴定以及淋球菌菌落PCR产物电泳结果

Fig.5 Identification of PCR products and electrophoresis results of PCR products of TV.

gonorrhoeae colonies

注:M: DNAMarker; A: 1: A片段PCR产物;2: E片段PCR产物;3: AE融合片段PCR产物;B: 1、3:

淋球菌ngo2105基因缺失菌株菌落PCR产物;2:淋球菌WT菌株菌落PCR产物

  • ngo2105基因回复菌株构建及筛选

PCR产物行电泳鉴定,可见大小为4407 bp的目的条带。提取阳性克隆中重组质 粒行双酶切鉴定,酶切产物经电泳鉴定可见与目的基因大小相符的酶切片段。测序结 果与GenBank数据库中淋球菌FA1090菌株的ngo2105基因序列相符,提示 PCTS32-NGO2105重组质粒构建成功。经斑点法转化ngo2105基因缺失菌株,经抗性 平板筛选阳性克隆株。

6 PCR产物鉴定和重组质粒双酶切鉴定及目的基因部分测序峰图

Fig.6 Identification of PCR products and recombinant plasmid double digestion identitication and

peak sequencing of partial sequencing of objective gene

注:M: DNAMarker; A: ngo2105基因PCR产物鉴定;B:重组质粒双酶切鉴定;C:重组质粒ngo2105基因

部分测序峰图

3.3.3菌落PCR验证ngo2105基因缺失菌株及ngo2105基因回复菌株构建

PCR产物行电泳鉴定,结果如图7所示,淋球菌WT菌株以及ngo2105基因回 复菌株均扩增出大小为4407 bp的片段,而ngo2105基因缺失突变株则无相应条带, 提示ngo2105基因缺失菌株以及ngo2105基因回复菌株构建成功。

7淋球菌菌落PCR产物电泳结果

Fig.7 Electrophoresis results of PCR products of N. gonorrhoeae colonies

注:M: DNAMarker; 1: WT菌株PCR产物;2: ngo2105基因回复菌株PCR产物;3: ngo2105基因缺失突变

株PCR产物

3.4 重组质粒pET28a-NGO2105的构建

将构建的重组质粒转化E.coli           感受态细胞后,提取阳性克隆中重组质粒行

双酶切鉴定,酶切产物经电泳鉴定可见与目的基因大小相符的酶切片段。测序结果显 示无点突变及移码突变,提示pET28a-NGO2105重组质粒构建成功(图8)。

3.5构建ngo2105基因丝氨酸点突变菌株

分别以重组质粒pCTS32-NGO2105以及pET28a-NGO2105为模板,利用突变引 物,行PCR扩增,产物行电泳鉴定,结果如图9中A、B所示,成功扩增出大小为 9619 bp的目的条带(pCTS32质粒与NGO2105全长基因之和)及大小为9776 bp的 目的条带(pET28a质粒与NGO2105全长基因之和)。通过 印刃1酶消化后,将消化 产物转化E.coli   感受态细胞,如图C、D所示,菌落生长情况与预期相符。提

取1号平板单克隆菌株质粒进行测序,测序结果如图E、F所示,成功将ngo2105基 因第267位丝氨酸(AGT)突变为丙氨酸(GCT)。将突变成功的重组质粒分别转化 淋球菌ngo2105基因缺失菌株及E.coli C41 (DE3)菌株,构建ngo2105基因丝氨酸 点突变菌株。

9点突变PCR扩增产物鉴定和Dpn I酶消化后平板菌落生长情况及目的基因部分测序峰图

Fig.9 Identification of point mutation PCR amplification products and colony growth of plate
after digestion with Dpn I and peak sequencing of partial sequencing of objective gene

注:M: DNAMarker; A: 1: pCTS32-NGO2105 重组质粒 PCR 产物;B: 1: pET28a-NGO2105 重组质粒 PCR 产物;C: 1: pCTS32-NGO2105重组质粒突变后经酶消化转化感受态细胞于抗性平板有菌落生长;2:重组质粒 未突变经酶消化转化感受态细胞于抗性平板无菌落生长;3:重组质粒未突变未经酶消化转化感受态细胞于抗性

平板有菌落生长;4:未转化质粒的感受态细胞于抗性平板无菌落生长;D: pET28a-NGO2105重组质粒转化感受 态细胞平板生长情况(分组对应编号与C相同);E: pCTS32-NGO2105重组质粒ngo2105基因含丝氨酸突变位 点的部分测序峰图(红框);F: pET28a-NGO2105重组质粒目的基因含丝氨酸突变位点的部分测序峰图(红框)

3.6 NGO2105蛋白的细胞定位分析

3.6.1流式细胞技术分析淋球菌NGO2105蛋白的定位

为对NGO2105蛋白的定位进行分析,将淋球菌WT菌株,ngo2105基因缺失突 变株全菌经抗NGO2105抗血清为一抗孵育后,采用流式细胞技术进行定位分析。结 果如图10所示,图中空白组、以免疫前血清作为一抗的阴性对照组和ngo2105基因 缺失突变株均未见明显的荧光信号,而淋球菌WT菌株表面荧光强度明显升高,提示 NGO2105蛋白定位于淋球菌外膜表面。

10流式细胞技术对淋球菌NGO2105蛋白的定位分析

Fig.10 Location analysis of N.gonorrhoeae NGO2105 protein by flow cytometry

3.6.2流式细胞技术分析大肠杆菌中NGO2105蛋白的定位

为探究NGO2105蛋白分泌至表面是不依赖于淋球菌中的特定结构,同样采用流 式细胞技术对不同E.co” C41 (DE3)全菌(包括pET28a、pET28a-NGO2105)进行 定位分析。结果如图11所示,图中Blank组,以PI作为一抗的对照组和只含载体 pET28a的E.coli对照组未见明显的荧光信号,而含有质粒pET28a-NGO2105的菌株 表面荧光强度明显升高,提示NGO2105蛋白同样定位于Eco〃外膜表面。

图11流式细胞技术对大肠杆菌中NGO2105蛋白的定位分析

Fig.ll Location analysis of E.coli NGO2105 protein by flow cytometry

  • Western blot分析淋球菌NGO2105蛋白定位

为研究淋球菌NGO2105蛋白的分泌特征,将淋球菌全菌及其培养基上清蛋白分 别行Western blot分析,结果如图12所示。A图中,可在淋球菌WT菌株以及ngo2105 基因回复菌株中检测出3个蛋白条带,分别对应NGO2105全长蛋白,大小约为160 KDa, NGO2105蛋白passenger结构域在第一个切割位点(954)切割后的蛋白,大 小约为100 KDa,以及NGO2105蛋白translocator结构域蛋白,大小约为30 KDa, 而ngo2105基因缺失突变株中不能检测出相应条带。B图中,淋球菌WT菌株以及 ngo2105基因回复菌株上清中可检测出2个蛋白条带,分别对应NGO2105蛋白 passenger结构域在第一个切割位点(954)切割后的蛋白,大小约为100 KDa,以及 NGO2105蛋白passenger结构域在第二个切割位点(1190)切割后的蛋白,大小约为 130 KDa,而ngo2105基因缺失突变株中不能检测出相应条带。以上结果说明 NGO2105蛋白符合自转运蛋白的分泌特征,即可通过自身水解切割,将passenger结 构域部分蛋白释放至上清。

12 Western blot分析淋球菌全菌及培养基上清NGO2105蛋白

Fig.12 Western blot analysis of N.gonorrhoeae NGO2105 protein in whole bacteria and the medium supernatant

注:A:淋球菌全菌蛋白;B:淋球菌培养基上清蛋白;1:淋球菌WT菌株;2: ngo2105基因回复菌株;3: ngo2105 基因缺失菌株

3.7 NGO2105蛋白丝氨酸蛋白酶活性位点探究

3.7.1 Western blot分析NGO2105蛋白丝氨酸位点突变后的水解切割情况

为进一步探究NGO2105蛋白passsenger结构域的切割水解是否依赖于其内源性 丝氨酸发挥蛋白酶活性,将NGO2105蛋白酶活性催化三联体结构中的267位丝氨酸 突变为丙氨酸,收集淋球菌以及E.coliC41 (DE3)不同菌株(包含pET28a-NGO2105> pET28a-NGO2105 S267A)的培养基上清浓缩蛋白行Western blot分析。图13A中, 可在淋球菌WT以及NGO2105回复菌株中检测出2个蛋白条带,结果同图12B,而 ngo2105基因缺失突变株以及ngo2105基因丝氨酸突变菌株中不能检测出相应条带。 图13B中,含有质粒pET28a-NGO2105大肠杆菌中可检测出大小约为100 KDa的 NGO2105蛋白passenger结构域蛋白,而含有质粒pET28a-NGO2105 S267A的大肠杆 菌中不能检测出相应条带。以上结果说明NGO2105蛋白第267位丝氨酸具有蛋白酶 催化活性,能介导其passenger结构域蛋白发生水解切割,分泌至细胞外环境。

13 Western blot分析培养基上清NGO2105蛋白

Fig. 13 Western blot analysis of NGO2105 protein in the medium supernatant

注:A: 1: ngo2105基因回复菌株;2:淋球菌WT菌株;3: ngo2105基因缺失菌株;4: ngo2105基因丝氨酸位 点突变菌株;B: 1:含pET28a-NGO2105重组质粒菌株;2:含pET28a-NGO2105 S267A重组质粒菌株

3.7.2流式细胞技术分析大肠杆菌中NGO2105蛋白丝氨酸位点突变后的蛋白定位

为探究NGO2105蛋白丝氨酸位点突变后其蛋白的定位情况,将不同E.coli C41

(DE3)全菌(包括 pET28a、pET28a-NGO2105> pET28a-NGO2105S267A)行流式 细胞分析。结果如图14所示,图中Blank组,以PI作为一抗的对照组和只含有空载 体的大肠杆菌对照组未见明显的荧光信号,含有质粒pET28a-NGO2105以及含有质 粒pET28a-NGO2105 S267A的菌株表面荧光强度均明显升高,说明NGO2105蛋白丝 氨酸位点突变后,蛋白同样能够分泌至细菌表面,丝氨酸蛋白酶活性只介导其蛋白自 身水解切割。

14流式细胞技术对大肠杆菌中NGO2105蛋白的定位分析

Fig.14 Location analysis of E.coli NGO2105 protein by flow cytometry

3.8 NGO2105蛋白translocator结构域转运功能的研究

众所周知,自转运蛋白的translocator结构域能将passenger结构域转运至膜外,
为研究NGO2105蛋白translocator结构域是否具有转运功能,表达Hbp蛋白passenger 结构域与NGO2105蛋白translocator结构域的融合蛋白,通过流式分析以及免疫荧光 显微镜观察对含有Myc标签蛋白的Hbp蛋白passenger结构域蛋白进行定位分析,从 而探究NGO2105蛋白translocator结构域是否具有转运异源蛋白的功能。

3.&1 重组质粒 pET28a-Hbp passenger-NGO2105 translocator 及 pET28a-Hbp passenger 的构建

PCR成功扩增出大小为204 bp的Hbp蛋白passenger结构域片段A(Myc标签上 游),大小为3123 bp的Hbp蛋白passenger结构域片段B (Myc标签下游),大小 为1554 bp的NGO2105蛋白translocator结构域片段C。重叠PCR分别成功扩增出大 小为3327 bp的融合片段AB,大小为4881 bp的融合片段ABC。将AB融合片段及 ABC融合片段分别克隆至载体pET28a中,经测序比对,成功构建重组质粒 pET28a-Hbp passenger 以及重组质粒 pET28a-Hbp passenger-NGO2105 translocatoro

15 PCR产物鉴定及目的基因部分测序结果

Fig. 15 Identification of PCR products and partial sequencing results of objective gene

注:M: DNAMarker; A: 1: A 片段 PCR 产物;B: 1: B 片段 PCR 产物;C: 1: C 片段 PCR 产物;2:

AB融合片段PCR产物;D: 1: ABC融合片段PCR产物;E: pET28a-Hbp passenger部分(含Myc标签序列) 测序结果;F: pET28a-Hbp passenger-NGO2105 translocator部分(含B片段下游及C片段上游序列)测序结果 3.8.2流式细胞技术分析大肠杆菌中Hbp蛋白定位

含不同质粒的E.coli C41 (DE3)经IPTG诱导后行流式细胞分析,结果如图16 所示,含有质粒pET28a-Hbp passenger-NGO2105 translocator的细菌表面荧光强度 (77.88%)明显高于含有质粒pET28a-Hbp passenger的大肠杆菌(0.21%)及对照组 (含质粒pET28a)大肠杆菌(0.08%)。以上结果说明NGO2105蛋白translocator 结构域具有一定的转运功能,可将Hbp蛋白passenger结构域蛋白转运至细菌表面。

CdtAtdI

16流式细胞分析大肠杆菌Hbp蛋白的定位

Fig.16 Location analysis of E.coli Hbp protein by flow cytometry

注:A:含质粒pET28a的大肠杆菌对照组;B:含质粒pET28a-Hbp passenger的大肠杆菌;C:含质粒pET28a-Hbp
passenger-NGO2105 translocator 的大肠杆菌

3.8.3免疫荧光显微镜观察分析大肠杆菌Hbp蛋白定位

为再次确定具有NGO2105蛋白translocator结构域的细菌其Hbp蛋白passenger 结构域蛋白定位于外膜,采用免疫荧光显微镜观察大肠杆菌Hbp蛋白定位情况,结 果如图17所示,含质粒pET28a (图A)以及含质粒pET28a-Hbp passenger的大肠杆 菌表面未观察到绿色荧光(图B),而含质粒pET28a-Hbp passenger-NGO2105 translocator的细菌表面可见明显绿色荧光(图C)因此,以上结果再次说明NGO2105 蛋白translocator结构域具有一定的转运异源蛋白的功能。

17免疫荧光显微镜观察大肠杆菌Hbp蛋白定位

Fig.17 Location analysis of E.coli Hbp protein by immunofluorescence microscopy

注:A:含质粒pET28a的大肠杆菌对照组;B:含质粒pET28a-Hbp passenger的大肠杆菌;C:含质粒pET28a-Hbp

passenger-NGO2105 translocator 的大肠杆菌

3.9 NGO2105蛋白在淋球菌致病机制中的探究

3.9.1 NGO2105蛋白介导淋球菌黏附于宫颈癌上皮细胞

为探究NGO2105蛋白是否能介导淋球菌黏附宫颈癌上皮细胞,将淋球菌WT菌 株,ngo2105基因缺失突变株,ngo2105基因回复菌株以及ngo2105基因丝氨酸突变 菌株分别与ME-180±皮细胞相互作用后,除去未黏附于细胞的细菌,收集细胞菌落 计数,结果如图18所示,图中ngo2105基因缺失突变株黏附细胞菌数相对于WT组 明显下降(F < 0.001),而ngo2105基因回复菌株其黏附能力趋近于WT组,说明 NGO2105蛋白能够介导淋球菌黏附宫颈癌上皮细胞。NGO2105 S267A突变菌株其黏 附能力略强于WT组,提示未切割的NGO2105蛋白可能会增强细菌的黏附能力。

注:不同菌株相对于野生株的黏附率(X ±S,n=3)              <0.00118不同淋球菌菌株对ME-18 ±皮细胞的黏附能力

Fig.18 Adhesion ability of different N.gonorrhoeae strains to ME-18 epithelial cells

3.9.2 NGO2105蛋白介导淋球菌侵袭宫颈癌上皮细胞

为探究NGO2105蛋白是否能介导淋球菌侵袭宫颈癌上皮细胞,将不同淋球菌分 别与ME-180±皮细胞相互作用,去除胞外细菌后,收集细胞菌落计数,结果如图19 所示,缺失ngo2105基因的淋球菌其侵袭上皮细胞能力降低(尸< 0.001),回复ngo2105 基因的淋球菌侵袭能力恢复。丝氨酸蛋白酶活性消失后,更多的NGO2105全长蛋白 发挥侵袭功能。说明NGO2105蛋白能够介导淋球菌对宫颈癌上皮细胞先黏附并随后 侵入细胞内。

Fig.19 Invasion ability of different N.gonorrhoeae strains on ME-18 epithelial cells19不同淋球菌菌株对ME-18 ±皮细胞的侵袭能力

注:不同菌株相对于野生株的侵袭率(X ±5,n=3)    *^<0.001

3.9.3抗NGO2105抗血清和抗passenger抗血清能够抑制淋球菌黏附宫颈癌上皮细胞 为了进一步验证淋球菌NGO2105蛋白介导的黏附能力,通过以抗NGO2105抗 血清以及抗passenger抗血清行抗体黏附抑制实验,结果如图20所示,随着抗体滴度 的减低,淋球菌WT株黏附细胞菌数相对于未处理组(0)呈依赖性递增,说明抗 NGO2105抗血清以及抗passenger抗血清均能抑制淋球菌黏附于上皮细胞。

20抗体对淋球菌黏附上皮细胞的影响

Fig.20 Effect of antibodies on N. gonorrhoeae adhesion epithelial cells

注:A:经抗NGO2105抗血清预孵育的淋球菌黏附细胞的菌数;B:经抗passenger抗血清预孵育的淋球菌黏附

3.10 NGO2105蛋白介导淋球菌定植于小鼠阴道

为了探究NGO2105蛋白在体内是否能介导淋球菌的定植作用,将淋球菌WT株, ngo2105基因缺失突变株,ngo2105基因回复菌株以及预先与抗NGO2105抗体孵育 的淋球菌WT菌株接种于雌激素预处理的小鼠阴道内,于不同时间点收集小鼠阴道分 泌物进行菌落计数,结果如图21所示,ngo2105基因缺失突变株和经抗体处理的WT 菌株在体内的定植菌量相对于WT组明显下降,ngo2105基因回复菌株体内定植能力 趋近于WT组,说明NGO2105蛋白在淋球菌定植过程中有着重要的作用。

4讨论

丝氨酸蛋白酶自转运蛋白作为革兰阴性菌致病过程中重要的一类的毒力因子,涉 及细菌的细胞毒性、黏附定植、侵袭、免疫逃逸等作用㈤-41]。目前,已在脑膜炎奈瑟 菌中发现多种丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的存在,其中IgAl蛋白酶作为最早被鉴定的, 同时也是目前在淋球菌中仅发现的一种丝氨酸蛋白酶自转运蛋白[21],在奈瑟氏菌致病 过程中发挥多种生物学功能,如促进细菌侵袭上皮细胞H2],加速溶酶体的降解而利于 细菌在细胞内存活跑,并且可以通过诱导肿瘤坏死因子(I和其他炎性细胞因子的释放, 从而有助于奈瑟氏菌感染发病屮,45]。那么,除了 IgAl蛋白酶,淋球菌中是否还存在 其他自转运蛋白呢?如果有,它又在淋病发病过程起什么作用?

针对上述问题,本课题组根据自转运蛋白的共同分子特征,通过分析淋球菌 FA1090基因组,发现NGO2105蛋白具有典型的自转运蛋白组成结构。进一步采用 同源模建对NGO2105蛋白三维结构进行分析,发现该蛋白与大肠杆菌自转运蛋白 Hbp非常相似,氨基酸序列比对显示ngo2105基因与脑膜炎奈瑟菌中的丝氨酸蛋白酶 自转运蛋白App具有较高的同源性,且ngo2105基因存在保守的丝氨酸蛋白酶基序 (GDSGSP)及催化三联体H, D, S氨基酸残基。因此,我们认为NGO2105蛋白是 淋球菌中一种新的具有丝氨酸蛋白酶活性的自转运蛋白。

据此,本课题组首先通过流式细胞分析技术分别在淋球菌和大肠杆菌中验证了 NGO2105蛋白能分泌至细菌表面,说明该蛋白可通过细菌中一些辅助蛋白如外膜蛋 白肌47],经过加工转运,分泌至细菌外膜,且该过程不依赖于淋球菌中的特定蛋白。 Western blot分析淋球菌NGO2105蛋白时,我们通过抗NGO2105抗血清检测出全长 NGO2105 蛋白(160 KDa) , passenger 结构域部分蛋白(100 KDa)以及 translocator 结构域蛋白(30 KDa),这与在脑膜炎奈瑟氏菌MC58中App蛋白的研究不同,该 蛋白 Western blot 检测出 4 个条带,大小约为 175 kDa, 160 kDa, 140 kDa 和 100 kDa, 但并未检测出App蛋白的translocator结构域蛋白[4M9],分析该差异可能来源于两种 蛋白在两种细菌间的水解切割方式不同。如丝氨酸蛋白酶自转运蛋白App,该蛋白的 passenger结构域既能通过内源性蛋白酶活性催化介导水解切割,还可以通过其他自 转运蛋白如Nalp蛋白介导切割a】,但由于基因被破坏,淋球菌中不存在Nalp蛋白, 因此引起两种自转运蛋白水解切割不同。接下来,根据已知的自转运蛋白App和Hap 的切割位点,我们预测出NGO2105蛋白的两个切割位点,分别为954NTG956, 1190NSL1192,通过Westemblot分析,我们在淋球菌培养基上清中检测到大小约为100 KDa和130 KDa的条带,分别对应于两处切割位点切割所产生的NGO2105蛋白 passenger结构域蛋白。然而,我们在大肠杆菌(pET28a・NGO2105)培养基上清中只 检测出大小约为100 KDa的passenger结构域蛋白,该结果与Hadi H.A.等人对App 蛋白的研究类似邯1。为进一步研究NGO2105蛋白的分泌特征,我们将预测的 NGO2105蛋白酶活性催化三联体(H, D, S)结构中的主要氨基酸丝氨酸突变为丙 氨酸后,结果发现passenger结构域蛋白不再能被水解切割至培养基上清,而流式细 胞分析结果显示突变模型中,NGO2105蛋白仍可定位于细菌表面,说明NGO2105 蛋白passenger结构域的自身水解切割依赖于其蛋白内源性丝氨酸发挥蛋白酶催化活 性。以上结果说明NGO2105蛋白是淋球菌中一种具有丝氨酸蛋白酶活性的自转运蛋 白。

研究发现,自转运蛋白的translocator结构域具有转运功能,可将重组蛋白转运 至细菌表面,大肠杆菌中Hbp蛋白passenger结构域蛋白通常被用作评估自转运蛋白 translocator结构域转运功能的靶标蛋白。为验证NGO2105蛋白translocator结构域是 否具有转运功能,我们将Hbp蛋白的passenger结构域与NGO2105蛋白translocator 结构域蛋白融合表达。通过流式细胞分析和免疫荧光显微镜观察结果显示Hbp蛋白 passenger结构域被有效的转运至细菌表面。但遗憾的是,我们未能在培养基上清中 检测到切割至外环境的Hbp蛋白passenger结构域蛋白,类似的结果也出现在Soprova Z等人在大肠杆菌中表达Hbp蛋白passenger结构域与EspP蛋白translocator结构域 的融合蛋白,分析可能是由于大肠杆菌DegP周质蛋白的降解,导致分泌至细菌表面 的passenger结构域蛋白总量较低冋。总而言之,以上结果说明NGO2105蛋白与大 多数自转运蛋白类似,其translocator结构域蛋白具有一定的转运异源蛋白的功能。

NGO2105蛋白与App蛋白具有较高同源性,已证实App蛋白能够介导脑膜炎奈 瑟氏菌黏附上皮细胞。细菌的黏附和内化是建立局部黏膜感染的重要环节,引起致病。 因此,本课题组为研究NGO2105蛋白是否参与淋球菌对细胞的黏附侵袭作用,通过 细胞黏附侵袭实验发现缺失ngo2105基因的淋球菌其黏附侵袭宫颈癌上皮细胞的能 力较野生菌显著下降,且抗NGO2105抗体和抗passenger抗体能够抑制淋球菌的黏附 能力。以上结果说明NGO2105蛋白在淋球菌黏附、侵袭上皮细胞过程中发挥着重要 的重要。更多的,我们发现相比抗passenger抗体,抗NGO2105抗体能更显著的抑制 淋球菌黏附于上皮细胞,这与Serruto D.等人对App蛋白的研究类似,表达App蛋白 passenger结构域蛋白和表达translocator结构域蛋白的大肠杆菌均能够黏附于上皮细 胞冷9],猜测除passenger结构域蛋白以外,NGO2105蛋白的translocator结构域以及 其余结构域蛋白同样能够介导淋球菌的黏附作用。

在过去的研究中发现,丝氨酸蛋白酶自转运蛋白可以靶向白细胞上的糖蛋白和切 割粘蛋白家族底物,因而更利于细菌的致病,如志贺氏菌中的丝氨酸蛋白酶自转运蛋 白Pic,它能诱导粘蛋白释放并切割粘蛋白,从而有利于细菌在粘膜中的定植H1]。而 目前App蛋白的体内生物学功能尚不了解,因此我们通过构建雌激素处理的小鼠淋 球菌阴道感染模型,在体内探究NGO2105蛋白的致病机制,结果显示淋球菌ngo2105 基因缺失突变株在体内的定植能力较野生株显著下降,并且抗NGO2105抗体能够抑 制淋球菌体内定植能力,提示NGO2105蛋白可能是一种潜在的蛋白疫苗靶点。

淋球菌能够引起强烈的局部免疫反应,其特征是中性粒细胞大量被募集到感染部 位,中性粒细胞可以通过各种机制杀灭病原微生物,但却不能完全清除感染的淋球菌。 目前研究发现淋球菌不仅能表达防御嗜中性粒细胞杀菌成分的因子,而且还操纵中性 粒细胞产生和释放这类成分,它能够有多种方法逃避中性粒细胞的杀伤Q]。那么, NGO2105蛋白的表达是否是淋球菌逃避中性粒细胞清除的机制之一呢?该机制又是 怎样发挥作用的呢?本课题组将在后续进行更深入的探讨。

5结论

在这项研究中,我们首次证实NGO2105蛋白是一种丝氨酸蛋白酶自转运蛋白, 该蛋白作为淋球菌致病过程中一种重要的毒力因子,参与淋球菌的黏附、侵袭等致病 过程,并在淋球菌小鼠阴道定植过程中发挥重要作用。抗NGO2105抗体能有效抑制 淋球菌的黏附能力及在小鼠体内的定植能力,提示NGO2105蛋白可能是一种潜在的 蛋白疫苗靶点。本研究为将该蛋白作为药物作用的新靶点和蛋白疫苗靶点提供重要的 实验依据,对淋球菌所致淋病的防治具有重要意义。

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综述
丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的研究进展

迄今为止,革兰阴性菌已经进化出不同的蛋白分泌系统,主要分为I至IX。其 中,由V型分泌系统(T5SS)分泌的蛋白通常称为自转运蛋白(autotransporter protein, AT)。该类蛋白是革兰阴性菌中一类多达1000多个成员的蛋白家族,具有黏附、侵 入、蛋白水解活性、细胞毒性、血清抗性和细胞间播散等多种功能⑴。其中,丝氨酸 蛋白酶自转运蛋白属于革兰阴性菌中一类特殊的自转运蛋白,该类蛋白在奈瑟氏菌, 志贺氏菌、致病性大肠杆菌、柠檬酸杆菌,沙门氏菌和爱德华氏菌等革兰阴性菌中相 继被鉴定出来。例如致病肠杆菌中的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白(serine protease autotransporter of Enterobacteriaceae, SPATEs) , SPATEs 是革兰阴性菌中一类重要的 毒力蛋白家族,其成员主要属于胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族⑵。一方面SPATEs可 通过其活性位点催化以及其主要毒力蛋白结构域发挥功能,降解宿主细胞内外底物或 其他更多致病机制,对宿主细胞产生各种不利影响,另一方面由于同一细菌中存在多 种类别的SPATEs,导致肠杆菌具有较高的致病率。在过去20年中,人们通过对细菌 基因组测序和生物信息学分析,已经预测出多种丝氨酸蛋白酶自转运蛋白(Serine protease autotransporter) □在这里,我们总结当前对丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的结构、 功能以及其致病机制的研究,有助于深入探讨丝氨酸蛋白酶自转运该类蛋白的生物学 功能及其致病机理,为本课题组研究思路提供可靠的理论依据。

1丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的分类

自转运蛋白一般由N端信号肽、passenger结构域以及translocator结构域三部分 组成,根据结构不同,蛋白一般分为五类。首先是以N末端passenger结构域和C末 端translocator结构域为特征的经典单体自转运蛋白Va型⑶;接着是双伴侣分泌系统 Vb型,其特点为蛋白的passenger结构域和translocator结构域位于不同的多肽链上, 且translocator结构域包含多肽转运相关(POTRA)基序⑷;其次是三聚体自转运蛋 白Vc型,其蛋白存在三个passenger结构域,且三者与具有完整功能的translocator 结构域三分之一区域相融合环 第四类自转运蛋白Vd型与Va型结构相似,区别为在 passenger结构域和translocator结构域之间有一段与Vb型自转运蛋白同源的POTRA 基序⑹;最后是Ve型自转运蛋白,该蛋白的passenger结构域和translocator结构域与 Va型呈相反方向⑺。本课题研究的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白属于经典自转运蛋白Va 型。

2丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的结构

丝氨酸蛋白酶自转运蛋白属于Va型自转运蛋白,即由N端信号肽、passenger 结构域以及C端translocator结构域组成。早在十多年前,SPATEs便被提出用来描 述由肠杆菌科产生的具有相似结构和功能的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白,首先是N端 具有较长的信号肽(48-59aa),该结构域可以将蛋白靶向内膜(IM),使其进入周 质空间;接着是N端的passenger结构域(也称为a-domain),其编码自转蛋白主要 的生物学功能,该结构域具有丝氨酸蛋白酶的活性位点,丝氨酸蛋白酶是生物体中种 类丰富,功能多样的蛋白水解酶罔,这类酶可切割蛋白质底物中的肽键,其中丝氨酸 残基作为酶活性位点,被用作亲核氨基酸,因此称之为丝氨酸蛋白酶,发挥该活性还 依赖于另外两个残基,通常是组氨酸(Histidine)和天冬氨酸(Aspartic);最后是C 端translocator结构域(也称为P-domain)通过两个连续的天冬酰胺(NN)与passenger 结构域相连接⑵,该结构域为一个孔通道结构,具有较高的保守性,除了少数例外叨, 成熟的passenger结构域可通过蛋白酶催化活性发生自动水解切割经translocator结构 域释放至外环境中问。

3丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的分泌机制

首先,自转运蛋白通过其信号肽识别细菌IM中的Sec易位子,将自转运蛋白由 内膜靶向到周质空间中Eg,目前有研究表明这是自转运蛋白分泌过程中的第一处瓶 颈,可能会影响蛋白的分泌214】。当自转运蛋白穿过内膜进入周质空间后,其在周质 伴侣如Skp, SurA的帮助下保持正确折叠[⑸,尽管两者对于蛋白的分泌并不是必须 存在的另外,周质中存在一种细胞外膜压力调节蛋白DegPM,它不仅能有助于 自转运蛋白的正确折叠,还在蛋白分泌受阻时充当类似质量控制的作用,由于该蛋白 具有蛋白酶活性,可降解或隔离累积在Bam复合物内无法分泌至膜外的蛋白,从而 利于有效蛋白的分泌冋。总而言之,周质中的伴侣蛋白能帮助自转运蛋白保持一种易 位叩勺状态,这种状态有助于自转运蛋白折叠和插入到细菌外膜蛋白Bam复合物中 [19-21]oBam复合物被认为是自转运蛋白分泌过程中所必需的,它的主要亚基为BamA, 其卩■桶状结构和自转运蛋白的translocator结构域形成一个混合桶状结构,该结构内径 较大,足以允许未折叠或部分折叠的passenger结构域易位至外膜的陀习。BamA蛋 白还能在passenger结构域蛋白易位发生停滞时,与其形成交叉连接,从而促进 passenger结构域蛋白的自我转运㈤】。总之,Bam复合物可能是帮助passenger结构域 易位至外膜的重要结构。当passenger结构域通过孔样通道开始易位至外膜时,易位 是由passenger结构域的C端开始,然后是其远端的N端,直到整个passenger结构 域到达外膜Q®。研究表明,c端passenger结构域跨越通道时会形成一种唆夹模型J 由于周质中不存在ATP源,因此这种折叠可能是提供passenger结构域分泌至外膜的 重要驱动力[却,但值得注意的是,该折叠并非唯一的驱动力,一些未折叠的passenger 结构域由于自身带有可以与细菌表面特定静电力相互作用的酸性区域阳5],因此仍能 克服蛋白的分泌阻滞或逆行滑动从而到达细菌表面。当自转运蛋白转运至细菌表面 后,一类自转运蛋白其passenger结构域以非共价键形式和translocator结构域相连接, 附着在细菌表面。而另一类自转运蛋白如丝氨酸蛋白酶自转运蛋白,其内源性蛋白酶 可发挥催化活性,介导passenger结构域与translocator结构域发生切割,使其passenger 结构域被释放至外环境中。

4丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的致病作用

研究发现宿主细胞中存在许多丝氨酸蛋白酶水解底物,丝氨酸蛋白酶自转运蛋白 可水解其细胞上的配体而影响细胞骨架的稳定性、细胞自噬作用、宿主先天性和获得 性免疫,从而利于细菌感染和逃避宿主防御。目前发现的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白可 分为两类,一类具有明显的细胞毒性,使细胞发生病变⑶的,而二类丝氨酸蛋白酶自 转运蛋白则表现出凝集素样活性和降解各种粘蛋白的活性,包括降解白细胞表面O 型糖蛋白,从而利于细菌在宿主黏膜中定植SB。]。迄今为止,已明确其毒力的一类丝 氨酸蛋白酶自转运蛋白有 EspP (extracellula r serine protease plasmid-encoded ), Pet (plasmid-encoded toxin) , Sat(secre ted autotransporter toxin)禾口 SigA (Shigella IgA- like protease homologue)等,这类蛋白均具有细胞毒性作用,主要表现为破坏细胞肌 动蛋白骨架,使细胞变圆,细胞间连接破坏而致细胞脱落;切割水解人凝血因子V 因子、补体C3/C3b、C5,从而减少补体介导的调理吞噬作用、杀菌作用、炎症反应; 直接参与大肠杆菌生物膜形成和黏附T84肠上皮细胞;具有肠毒素活性,水解血红蛋 白从而获取营养物质利于细菌生长等[31'34]o二类丝氨酸蛋白酶自转运蛋白包括PiC (protease involved in intestinal colonization), Tsh (temperature-sensitive hemagglutinin) 以及Hbp (hemoglobin binding protein)等,其主要的毒力表现为能够结合并水解切 割糖蛋白,对糖蛋白的水解最可能是由于二类蛋白具有凝集素活性,进而说明该类蛋 白能够凝集红细胞厲,36],红细胞上的特定碳水化合物也存在于白细胞上,因此丝氨酸 蛋白酶自转运蛋白的“凝集素"区域同样可能与白细胞中的碳水化合物相互作用,使得 白细胞表面糖蛋白被水解切割卩7],利于细菌逃避宿主的防御。更有二类丝氨酸蛋白酶 自转运蛋白如流感嗜血杆菌中Hap (hemoglobin protease ),其可介导细菌对上皮细 胞的黏附,增强细菌的定植能力,并可激发细菌的聚集及生物被膜的形成,加强细菌 对宿主的抵抗阴。

由此可见,丝氨酸蛋白酶自转运蛋白是革兰阴性菌中一类重要的毒力蛋白,涉及 细菌的细胞毒性、黏附定植、侵袭、免疫逃逸等多种致病机制。

5奈瑟氏菌中的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白及其致病

淋球菌IgAl蛋白酶是在细菌中最早被鉴定的,同时也是目前在淋球菌中仅发现 的一种自转运蛋白,其酶活性依赖于胰蛋白酶样活性位点(GDGSP),因此属于丝 氨酸蛋白酶自转运蛋白家族蛋白卩%其蛋白酶结构域需要通过自酶切水解后,分泌到 胞外才能形成成熟的IgAl蛋白酶。研究显示,IgAl蛋白酶除了能特异性水解人分泌 型IgAl夕卜,在淋球菌致病过程中还有许多重要的生物学功能。IgAl蛋白酶能够促进 淋球菌侵袭通过T84上皮细胞单分子层,淋球菌IgAl蛋白酶活性越强,该菌表现出 的侵袭能力更强购。此外,IgAl蛋白酶还能酶切溶酶体相关膜糖蛋白 1 (Lysosome-associated membrane glycoprotein 1,LAMP1),加速溶酶体的降解而利于细 菌在细胞内存活MH。

随着对自转运蛋白更加深入的研究,目前已在同为奈瑟氏菌的脑膜炎奈瑟菌中发 现8种自转运蛋白,其中属于丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的有IgAl蛋白酶, NalP, App以及MspA。除了上述描述的IgAl蛋白酶的致病作用,目前在脑膜炎奈瑟氏菌 中发现的IgAl蛋白酶还显示出较强的免疫刺激性,并且可以通过诱导肿瘤坏死因子a 和其他炎性细胞因子的释放,有助于奈瑟氏菌感染的发病机制™oNalP不同于IgAl 蛋白酶,其属于枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶自转运蛋白。NalP蛋白passenger 结构域蛋白转运至外膜后,会通过N端脂质暂时连接在细菌表面屮],随后与脑膜炎 奈瑟氏菌中分泌至外膜的其他几种自转运蛋白以及脂蛋白相互作用。例如:NalP蛋 白可以介导IgAl蛋白酶中a肽的释放以及介导脂蛋白NHBA ( Neisseria heparin-binding antigen) C端部分蛋白从细胞表面释放,从而刺激细胞凋亡并增加内 皮细胞和上皮细胞层的通透性。相反,当NalP表达减少或不表达时,IgAl蛋白酶a 肽和完整的NHBA蛋白会保留在细菌表面,从而刺激生物膜的形成和介导细菌的黏 附作用并防止宿主防御。因此,NalP蛋白的表达可能导致细胞凋亡和侵袭,而缺少 NalP蛋白似乎更有利于细菌的定植和生物膜的形成。除了细菌自身蛋白,NalP还水 解切割至少一种宿主蛋白,如补体因子C3,从而避免补体的激活〔45]。丝氨酸蛋白酶 自转运蛋白App的表达能够刺激B细胞和T细胞,并可以诱导杀菌抗体反应肌47]。 随着研究的深入,发现App更重要的毒力表现为黏附作用,是脑膜炎奈瑟菌对上皮 细胞的黏附所需要的最佳黏附素郎1。而且认为,当App分泌至外膜后部分蛋白被自 动切割并释放[佝,这是一种有助于脑膜炎奈瑟菌分离和扩散的机制。MspA丝氨酸蛋 白酶自转运蛋白的表达与App类似,同样可以诱导杀菌抗体应答H9],被认为是脑膜 炎奈瑟菌中一种重要的毒力蛋白。

由此可见,在奈瑟氏菌中,通过自转运蛋白途径分泌的丝氨酸蛋白酶功能多样, 且大多数与毒力有关QI。

6总结与展望

丝氨酸蛋白酶广泛存在于真核和原核生物中,并且随着生物的进化,其种类更加 丰富,功能更加多样化。病原菌利用各种复杂的方法定植在宿主体内,逃避宿主的防 御,增殖并损害宿主,这些细菌表现出多种毒力因子,其中一种称为丝氨酸蛋白酶自 转运蛋白。该类蛋白家族已进化为两类,分别针对细胞内和细胞外的底物,使细菌损 害宿主体内平衡并影响免疫应答的调节。淋球菌作为性传播疾病淋病的唯一病原体, 由于该菌能够有效逃避宿主免疫防御系统的杀伤,目前尚无有效的疫苗可供使用a】, 并且已有淋球菌对临床上常用抗生素产生耐药抵抗,其治疗面临无药可用的危险,美 国CDC已将其列为“超级细菌"冋。目前已经发现淋球菌中也有丝氨酸蛋白酶自转运 蛋白的存在,但对于其蛋白功能及致病作用研究报道尚少,只有一种自转运蛋白在其 生物学功能和结构表征方面得到了更广泛的研究。因此,深入研究丝氨酸蛋白酶自转 运蛋白的功能及其致病分子机理,将会对淋球菌中该类蛋白有进一步的科学认识,为 临床治疗淋球菌提供新的治疗靶点和治疗策略。本综述旨在对丝氨酸蛋白酶自转运蛋 白的分类,结构、分泌过程以及致病机制的研究进展进行总结回顾,为本课题组在淋 球菌中发现的推测为丝氨酸蛋白酶自转运蛋白的研究奠定相关理论依据,对于筛选保 守有效的蛋白疫苗及抗菌药物作用靶点有重要的理论与现实意义。

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