泡状棘球拗骨桥蛋白基因的克隆和生物信息学分析论文

2020年11月27日10:05:03泡状棘球拗骨桥蛋白基因的克隆和生物信息学分析论文已关闭评论

泡状棘球拗骨桥蛋白基因的克隆和生物信息学分析论文

摘要

目的 泡状棘球蝴病是一种浸润性生长为主的人兽共患疾病,大多数原发于肝脏,有“虫 癌"之称。目前对其迁徙和转移机制尚不明确。有研究发现骨桥蛋白(OPN)可以促进 肿瘤干细胞迁徙和转移。通过对泡球吻OPN基因进行克隆并对其生物信息学进行分析, 为后续研究奠定基础。

方法取感染多房棘球蝴的长爪沙鼠提取泡球蝴原头节,提取泡球呦总RNA,逆转录成 cDNA,从NCBI基因数据库中通过BLAST找到可能的OPN基因保守序列片段 (EMmg-13dO8.qlk)通过软件设计引物,PCR扩增目的基因测序与多房棘球呦OPN基 因同源性片段再次上传至NCBI进行比对,应用RACE方法进行3LRACEPCR利用引 物合成3LRACE cDNA第一链,以3f-RACE cDNA为模板进行巢氏PCR反应,5f-RACE PCR合成5LRACE cDNA第一链,得到5f-RACE cDNA纯化进行巢氏PCR反应。软件 对泡球吻OPN基因保守序列、3LRACE测序序列、5LRACE测序序列进行校正拼接得 到泡球蝴OPN基因全长序列。推测OPN开放阅读框(ORF)所对应的氨基酸序列,进 行蛋白质二级结构、三级结构预测及抗原位表位分析。

结果 研究表明获得长度为1390 bp的全长序列,其中含有411个腺卩票吟、297个胞卩密 噪、334个鸟卩票吟、348个胸腺卩密噪,编码445个氨基酸,相对分子质量为50 363.75, 理论等电点(pl)为11.18o整个肽链属查找泡球坳OPN全长序列ORF,发现含有一个 长度为849 bp,编码282个氨基酸的完整的ORF阅读框,始于96 bp,止于944 bp。预测 杀疏水性分析结果考虑属于杀水蛋白。二级结构预测a■螺旋(h)占20.81%,卩■折叠(e)占 15.26%,卩■转角(t)占10.08%,无规则卷曲(c)占53.85% o jameson-wolf方法对泡状棘球 吻骨桥蛋白表面抗原预测,可能存在的蛋白质抗原表位区域:1・11,16・34,47・51,59・63, 82-103,110-117,130-133,185-191,204-226,234-248,262-299,312-320,328-344,353-362,371-3 79,386-394,414-424,446-450,453-463氨基酸残基。泡球呦OPN的亲水性区域分布不均匀 主要在:1-10,16-35,48-51,61-73,68-93,97-117,169-176,204-266,231-252,263-297,312-320, 326-346,355-361,372-379,386-394,408-424,451-463 区域。同时预测 OPN 三级结构。

结论 本研究对泡球蝴OPN基因进行了克隆与生物信息学分析,同时发现亲水性部位 与抗原表位主要在227-234,447-453氨基酸残区域无很好的一致性。得到泡球勉OPN基 因全长序列为临床上泡状棘球蝴病晚期患者的治疗、手术后转移、复发提供一个新思路、 为多房棘球坳生发层干细胞多能性的内源因子及其作用机制提供理论基础。

关键字 泡球蝴,骨桥蛋白,基因序列,生物信息学

Abstract

Objective Alveolar echinococcosis is a kind of invasive growth of human and animal diseases, most of which are primary in the liver. It has been found that OPN can promote the migration and metastasis of tumor stem cells. The OPN gene of Echinococcus multilocularis was cloned and its bioinformatics was analyzed.

Methods Extraction of protoscolex of Echinococcus multilocularis from Meriones Unguiculatus infected with Echinococcus multilocularis. The protoscolex was cleaved with TRLZOL reagent, and the total RNA of Echinococcus multilocularis was extracted. The possible OPN gene conserved fragment (EMmg-13dO&qlk) was found from the NCBI gene database by blast. The PCR amplified target gene sequence and the Homologous Fragment of OPN gene of Echinococcus multilocularis were uploaded to the NCBI gene database again NCBI was used to identify, 3 1- RACE PCR was used to synthesize the first strand of 3* - RACE cDNA with primers, Nest PCR was used as template, 5 1- RACE PCR was used to synthesize the first strand of 5* - RACE cDNA, and 5 *- RACE cDNA was purified for Nest PCR. The software corrected and spliced the conserved sequence, 3 *- RACE sequence and 5’ - RACE sequence of OPN gene of Echinococcus. The amino acid sequence corresponding to open reading frame (ORF) of OPN was speculated, the secondary and tertiary structures of protein were predicted, and the in situ epitope analysis was carried out.

Results Studies have shown that a full-length sequence of 1390 bp is obtained, which contains 411 adenines, 297 cytosines, 334 guanines, and 348 thymines, encoding 445 amino acids with a relative molecular mass of 50 363.75. (Pl) is 11.18. The entire peptide chain was searched for the full-length ORF of OPN, and it was found that it contained a complete ORF reading frame that was 849 bp in length and encoded 282 amino acids, starting at 96 bp and ending at 944 bp. The results of the predictive hydrophilicity analysis are considered to belong to hydrophilic proteins. The secondary structure predicted a-helix (h) accounted for 20.81%,卩-sheet (e) accounted for 15.26%,卩-turn (t) accounted for 10.08%, and random curl (c) accounted for 53.85%. Prediction of vesicular echinococcal osteopontin surface antigen by the jameson-wolf method. Possible epitope regions of the protein: 1-11, 16-34, 47-51, 59-63, 82-103, 110-117, 130-133, 185- Amino acid residues. The non-uniform distribution of the hydrophilic region of vesicular bulb OPN mainly lies in: 1-10,16-35,48-51,61-73,68-93,97-117,169-176,204-266, 231-252, 263-297, 312-320,326-346,355-361,372-379,386-394,408-424,451-463. At the same time, the OPN tertiary structure is predicted.

Conclusion In this study, the OPN gene of Echinococcus multilocularis was cloned and analyzed by bioinformatics. At the same time, it was found that there was no good agreement between the hydrophilic site and the antigenic epitope in 227-234,447-453 amino acid residue. The full-length OPN gene sequence of Echinococcus multilocularis provides a new idea for the treatment, postoperative metastasis and recurrence of the patients in the late stage of Echinococcus multilocularis disease, and provides a

theoretical basis for the endogenous factors and mechanism of the pluripotency of stem cells in the germinal layer of Echinococcus multilocularis.

Key words Echinococcus multilocularis; Osteopontin; Gene sequence; Bioinformatics

中英文缩略词对照表

  • 多房棘球绦虫和泡状棘球蝴病

1.1多房棘球绦虫简介

多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis, Em)是一种能导致人兽共患病的病原 寄生虫,隶属棘球属,另外还包括细粒棘球坳绦虫(E.granulosus)、马棘球绦虫 (E.equinus)、加拿大棘球绦虫(E.canadensis)、狮棘球绦虫(E.ffelidis)、奥氏棘球 绦虫(E.ortleppi)、少节棘球绦虫(E.oligarthrus)、福氏棘球绦虫(E.vogeli)、石渠 棘球绦虫(E.shiquicus) □多房棘球绦虫生活史⑴复杂主要分为四个发育阶段分别为虫 卵期、六钩蝴期、中绦期、成虫期,整个周期都需要宿主的参与。多房棘球绦虫成虫主 要寄生于犬科动物,女口:犬、狼、狐,猫科动物,女口:狮、美洲虎、美洲山猫。虫卵通 过粪便排出,污染环境。

虫卵⑵大多为平均直径30至40屮n的类圆形,在光镜下与带绦虫虫卵难以鉴别,成 熟的虫卵壳薄易脱落,壳内为胚膜在光镜下可见棕黄色放射状条纹结构和大小不等的囊 泡。虫卵进入宿主在小肠内孵出六钩坳,通过血液进入肝脏,形成泡球蝴。

中绦期幼虫又称泡球吻主要寄生于啮齿类或者人体内,呈圆形囊状体,看似“水球= 直径可由不足lcm至数十厘米,主要有囊壁和囊内含物组成,囊壁分为两层:外层为角 皮层,内层为胚层。胚层向囊内生长出原头坳及育囊,育囊内可见生发层,育囊或进一 步发育成与母囊结构一样的子囊,囊内充满胶状液体,具有强抗原性,寄生场所主要为 肝脏、肺脏、脑等。泡球蝴多以外生性出牙方式生长,不断形成的新囊泡与正常组织边 界不清类似恶性肿瘤生长方式。泡球吻在不同宿主最终形成不同发育阶段,在中间宿主 分化为囊泡,而在终末宿主中则会发育成虫⑶

多房棘球蝴绦虫成虫长2-7mm,为最小的绦虫。头节呈梨形,有顶突和四个吸盘, 顶突上有两圈呈放射状排列大小相同的小钩,顶突顶端有可分泌抗原性物质的顶突腺; 链体有幼节、成节和孕节组成,孕节内子宫含有虫卵。当误食或误吸虫卵后,多房棘球 绦虫进入新的循环周期,在多房棘球绦虫的生活史中,人是偶然被感染并不参与其生活 循环⑷。

1.2泡状棘球勉病简介

泡状棘球蝴病(Alveolar echinococcosis, AE)是严重的人兽共患寄生虫病,多由 人误食多房棘球绦虫的幼虫引起。2014年联合国粮农组织把它定义为第三大食源性人兽 共患寄生虫病。该病在我国西部广泛流行,尤其是新疆、青海、西藏等地区。全国人均 患病率约为0.2% ,在高原畜牧业地区可高达10%®6]。危害人民身体健康同时加重了 经济负担,已成为全球严重的经济问题和重要的公共卫生问题。

泡状棘球蝴病大多数原发肝脏,隐匿起病,呈癌样浸润性生长,并可经血液远处转 移至肺、脑、骨。部分患者就诊时已有明显临床表现⑺,未经治疗者10年死亡率达90% 以上⑻。当误食虫卵后进入人体肠道孵育出六钩蝴再转移肝脏内发育成泡球蝴,病灶与 组织周围可发生肉芽肿及炎性反应,不断形成的囊泡与正常肝组织边界不清类似恶性肿 瘤的生长方式,有“虫癌"之称。随着肝脏和寄生虫的增生、萎缩和坏死,压迫肝组织、 Glisson鞘和肝静脉血管到严重破坏,病灶中心可出现大片坏死,并出现特征性的钙盐 沉积[9】。目前对于包虫病的诊断主要是通过影像学及包虫病皮内试验(Casoni)等。治疗原 则首选外科手术,术后予以药物治疗巩固以免复发。但多数未经治疗的患者就诊时已有 明显的肝内转移,甚至远处转移,失去手术机会且姑息性手术也无优势,故该病手术治 愈率不高,约为25%[10川]。并且手术治疗对晚期患者身体创伤大,易复发,并发症多。 晚期泡状棘球蝴病患者保守治疗主要使用咪卩坐类药物,如阿苯达卩坐、甲苯咪卩坐。一方面 药物本身存在明显的毒副作用会加重患者痛苦,另一方面药物通过为肠道吸收后药物浓 度不稳定,疗效欠佳,同时一些患者也会出现耐药表现。目前尽管有新的药剂在不断的 研制,但疗效仍需进一步观察2⑶。

  • 骨桥蛋白

骨桥蛋白是机体病理生理过程中细胞分泌的一种亲水性、带负电的酸性糖蛋白。目 前证实该蛋白在肿瘤生长、转移和血管的形成等过程中发挥重要作用[1铁研究显示OPN 与肿瘤干细胞特性有关,可促进肿瘤干细胞迁移和转移。OPN与结直肠癌干细胞的特 性相关,肿瘤相关细胞分泌的OPN通过激活Wnt/p-catenin通路增加CD44v6在结直 肠癌干细胞中的表达。且OPN促进肿瘤干细胞的迁移和转移QI; OPN的DNA序列 是高度保守的,其中包含两个重要的功能域avp整合素和CD44结合位点。对胶质母 细胞瘤(Glioblastoma,GBM)的研究显示在,神经胶质瘤起始细胞(Glioma-initiating cells,GICs)中,OPN与几个细胞表面受体整合相互作用,avp3整合素和CD44受体是 GBM细胞表面受体的代表。OPN可通过与受体(妙卩3和CD44)结合开启下游信号 通路。CD44v6在GICs生长和成球形成中发挥了关键的作用,OPN静默可抑制GICs 中SOX2、OCT3/4和Nanog等干性转录因子的转录。OPN-CD44在胶质瘤血管周围龛 中的交互作用增强癌症干细胞表型[16]。体内实验显示OPN静默可抑制GICs干性特征 和致瘤性。同时研究亦证实在GICs中Akt/mTOR/p70S6K是主要的信号途径,此途径 被OPN介导的EGFR受体激活。对肝癌细胞研究显示,OPN可能通过 avp3-NF-KB-HIF-la途径促进癌干细胞样表型。OPN是维持肝癌细胞干细胞样特性的 必须条件[⑺。骨桥蛋白通过激活表皮生长因子受体(EGFR)介导的信号通路在恶性肿 瘤侵袭性生长及转移中发挥着重要作用。EGFR介导的经典信号通路AKT、MAPK对肿 瘤的黏附转移发挥重要作用。当EGFR通路被激活时可促进恶性肿瘤细胞增殖,并且对 肿瘤相关血管生成发挥重要作用[同。AKT信号通路是恶性肿瘤细胞的“生命路J过度 激活该信号通路使正常细胞恶性变,促进致瘤能力Ml,并使机体对肿瘤的抵抗能力下降[20]。另外一条经典通路MAPK主要对细胞周期有丝分裂进行调控,也和肿瘤的发生 密切相关01。

  • 本文研究内容及意义

目前泡型包虫病的手术及药物治疗并发症多,效果欠佳。对此提出对该病的防治应 该重点在预防上,主要分两个阶段,一是对终末宿主的预防,如减少猫犬科动物在环境 中遇到虫卵的污染;二是减少人与宿主污染,加强高发病地区居民的宣传教育和定期对 该病的筛查。由于该措施仍是一个漫长的过程,所以很难减低该病感染。随着分子生物 学突飞猛进的发展,疫苗变成防治包虫病的另一重要途径。多房棘球绦虫在宿主体内的 生长发育离不开其生发层干细胞的迁徙及转移,前期研究国]已经发现opn在生发层中 高表达,调控生发层干细胞转移及迁徙可以作为抑制原头节在体内转移的治疗靶点。尽 管OPN在多种恶性肿瘤中高表达,并且参与恶性肿瘤转移和迁徙。但是多房棘球绦虫 OPN基因还鲜有报道。本研究对多房棘球绦虫OPN同源基因片段鉴定并克隆其全长基 因序列,同时进行生物信息学分析,为以后在核酸水平发现新的药物靶点,为临床上泡 状棘球坳病晚期患者的治疗、手术后转移、复发提供一个新途径,泡球蝴OPN对多房 棘球蝴生发层干细胞多潜能性及其作用奠定基础。

材料与方法

(Material and Methods )

1实验材料

1.1实验动物

无特定病原体级长爪沙鼠(Meriones unguiculatus) 40只(雌雄各20只)购自新疆维 吾尔自治区疾控中心,鼠龄6・8周,体重45 ±5go

1.2主要实验试剂


2实验方法
1.3主要实验设备

2.1提取泡球!H幼原头节制备悬液

取感染多房棘球蝴6月以上的长爪沙鼠,吸入乙醸麻醉2-3mins后,颈椎脱臼法处 死后将老鼠放入装有75%的酒精中浸泡2分钟,将其仰卧位固定于解剖台。腹部备皮, 全腹碘伏消毒2遍,用无菌银子夹起沙鼠皮肤作正中切口长约3-4 cm,把皮肤向两侧 张开,完全暴露腹腔内感染病灶,用新无菌小剪分离感染灶,过程轻柔小心,避免损伤 胃肠道及呼吸道造成泡球吻组织污染,将分离下感染组织反复用PBS冲洗洗净去除血 渍。用无菌剪刀将病灶修剪小块,分次少量放入玻璃研磨器研磨,充分研磨可在研磨器 中加入少量PBS润滑后倒入100目大小筛网上,将滤液倒入500ml烧杯中静置,用移 液器去除上层浑浊液取沉淀用PBS冲洗至上层液清亮为止,加入1%胃蛋白酶消化杂 质后再用PBS清洗后制成泡球蝴原头节混悬液。抽取ltd混悬液台盼蓝染色后放置10 倍镜下原头节计数,将浓度调整约为10000个原头节/ml。

2.2泡球!Il幼体外培养

a.配置含有10%牛胎血清及双抗的DMEM,加入约2*106 Hela细胞,放75cm2 培养瓶放置恒温箱待Hela细胞贴壁。按照SpiliotisME等人方法,将已制备好的泡球 蝴原头节悬液

名称                             引物序列(5「3J
Fig
2 Flowchart summarizing setup of E. multilocularis metacestodes in axenicmedium of feeder cells

2无宿主细胞的多房棘球绦虫培养体系的建立(Spiliotis M等,2009)

(host-cell free) culture. (From Spiliotis M et,al 2009)

2.3提取泡球虫幼总RNA

在无菌工作台提取泡球蝴总RNA,在液氮包围的情况下用杵棒研磨成粉,取 25-30mg加入已预冷1ml TRLZOL的离心管中静置15 min,再加入200ul氯仿常温放置 5 min。将离心管放入离心机4°C, 12000r/min,离心15 min,用移液器吸头小心吸去上 层水相,然后将其转移到新的离心管中。加入异丙醇,混合并放入-20°C的冰箱中放置 1小时。再将新离心管放入4°C离心机,12000i7mim 离心15mino弃上清液,加入75% 乙醇于离心管中用枪头混匀后在离心机4°C, 12000r/min,离心15 min后吸尽上清液, 保留沉淀。加入RNase^free水于・80°C保存备用,使用紫外分光光度计进行浓度和纯度 检测,最后取少量总RNA用于电泳检测并测定A260/A280比值及浓度。

2.4泡球勉第一链cDNA合成

采用5XAll-InOneRTMasterMix踰塩合成cDNA第F,(详细方法参照说明书)按Total RNA l|Lig, 5X All-In-One RT MasterMix 4 |Lil,加入 RNase-free 水至 20ul (表 1),振荡 器混匀后离心。PCR反应条件:25°C 10 min, 42°C 30 min, 85°C 5 s取出,结束反转录 实验;将反转录得到的cDNA置于・20°C保存,用于后续实验。

表1.泡球呦第一链cDNA的合成体系

Table 1. The reaction system of the first strand cDNA of Echinococcus multilocularis

2.5泡球虫幼OPN基因同源性片段的获得与引物设计

根据OPN基因高度保守性,从NCBI基因库中寻找人的OPN (Sppl secreted phosphoprotein 1 ) CDS 基因序列,然后与泡球蝴全基因(https://www.sanger.ac. uk /resources/downloads/helminths/ echinococcus-multilocularis.html) 进行 blast 对比,发 现可能的OPN基因同源性片段EMmg-13d08.qlko设计引物序列,如表(2):

2引物序列

Table. 2 The sequence of primer

OPN-F                 CAGTCTGATGAGATGTATAGCAAAG

OPN-R             ACATTCAAGAGACAAGATTTATTCAC

2.6 PCR扩增目的基因与鉴定

以泡球蝴第一链cDNA为模板利用已合成引物,采用2xEasyTaqPCRSuperMix

配合表(3)反应体系。反应程序:94°C 3 min, 94°C 30 s、55°C 30 s、72°C 35 s 35个循 环数,72°C 5 mine反应结束后PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,最后回收目 的基因条带,送欧易生物有限公司测序。测序序列上传NCBI BLAST与人、 EMmg-13d0&qlk进行序列比对。

表3反应体系

Table. 3 The recation system2.7引物设计

根据多房棘球吻OPN基因片段序列设计引物 见表4

表4 PCR引物序列

Table 4 PCR primer sequence2.8.2巢氏PCR反应体系特异性引物2.8 3,RACE PCR 和 5,RACE PCR

281 3,RACE cDNA 链合成

在 0.2 ml PCR 管中加入试剂:5(11 total RNA、1(il 3Adaptor> 1(il ddH2O, 70°C 5 min。 冰浴 2 min;离心加入试剂:2.0(11 5X 第一链缓冲液、0.5(11 10 mmol dNTP、0.25(11 Ribonuclease inhibitor> 0.25 pl 逆转录酶。总容积:10.0 pl。42°C 温浴 60 min, 72°C 温 浴 10 mino

1)以3Adaptor为反转引物的cDNA为模版,得到的PCR产物回收放置・20°C保存, 加样量见表(5)。

5 PCR反应体系

Table.5 The reaction system of PCR

按上述循环条件第一轮:95°C, 3分钟,33个循环(94°C 30 s、58°C 30 s、72°C 35 s) , 72°C延伸7分钟,;以第一轮PCR产物稀释后为模板进行巢氏PCR第二轮反应, 第二轮条件:95°C, 3 分钟,33 个循环(94°C 30 s、58°C 30 s> 72°C 35 s),同样 72°C 延伸7分钟。产物回收测序。

283       5,RACE cDNA 链合成

在 0.2 ml PCR 管中加入试剂:5(11 total RNA、1RC584-RTK 1 pil RC584-RT2, 70°C 温浴 5 min。冰浴 2 min;离心加入试剂:First-Strand Buffer> dNTP、Rnase inhibitor> Reverse Transcriptase> 总容量:10.0 pl, 42°C 温浴 60 min, 72°C 温浴 10 min。

2.8.4巢氏PCR反应体系

以特异性引物 RC584-RT1/ RC584-RT2 反转,得到 cDNA,经 RNase H 和 Terminal Deoxynucleotidyl Transferase处理后,进行巢氏PCR,加样量见表(6),得到的PCR 产物回收。

3 泡球虫幼OPN基因3,RACE、5,RACE扩增结果

35RACE巢氏PCR扩增后将产物(图4)切胶回收测序得到一长度为113bp带有 PolyA尾的碱基序列。55RACE巢氏PCR扩增后将产物(图5)回收与pMD18-T载体 连接,进行菌落PCR后测序分别得到长度为582bp、578bp的序列,经工具拼接长度为 955bp大小碱基序列。

4 3RACE扩增产物

Fig.4 AmpliHcation product of 3,RACE

5 5RACE扩增产物

Fig.5 Amplification product of 5'RACE

4泡状棘球绦虫OPN全长序列及理化性质

将已获得的955 bp的55RACE序列、617 bp的中间序列和113 bp的35RACE序列 导入CExpress进行拼接,获得长度为1390 bp的全长序列,其中含有411个腺瞟吟、297 个胞卩密噪、334个鸟卩票吟、348个胸腺卩密旋,编码445个氨基酸,相对分子质量为50 363.75, 理论等电点(pl)为11.18o整个肽链属查找泡球坳OPN全长序列ORF (图6),发现 含有一个长度为849 bp,编码282个氨基酸的完整的ORF阅读框,始于96 bp,止于944 bpo亲疏水性预测分析结果(图7),单个氨基酸极性MIN为-3.900, MAX为3.578, 总平均亲

5 EmOPN与不同物种的氨基酸序列比对

在 NCBI 上选择了 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、普通獗(Callithrix jacchus)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)、日本鹤鹑(Japanese quail)、 鼠(Mus musculus)、绵羊(Ovis aries) 7个物种CDS区进行氨基酸序列比对,见表(2)。

2泡球呦及其他物种骨桥蛋白

Table 2 Echinococcus multilocularis osteopontin and other specie

如图(8)所示其中EmOPN与鼠的氨基酸序列相似的最高,为57%左右,与秀丽 隐杆线虫氨基酸序列相似度最低为4%左右,与普通獗、日本鹤鹑、斑马鱼、绵羊氨基 酸序列相似度在20%-50%之间。

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6 EmOPN的二、三级结构及抗原表位预测

通过预测二级结构显示a■螺旋(h)占36.94%,卩■折叠©占17.12%,卩■转角(t)占

7.43 %,无规则卷曲(c)占38.51 %□ jameson-wolf方法对EmOPN二级结构及蛋白表面抗 原预测,图(9、10) , EmOPN的亲水性区域分布不均匀主要在:1-10,16-35,48-51, 61-73,68-93,97-117,169-176,204-226, 231-252,263-297,312-320,326-346,355-361,372-

讨论

FrohmanB]等人提出以PCR为基础获得目的cDNA完整序列的技术。此方法主要 有简单、快捷、灵敏等优点,已广泛用于人类、寄生虫、真菌的未知基因克隆©J经过 长期的发展基因测序将是今后多功能研究的主流方向,本研究应用cDNA末端快速扩 增技术获得3末端及5末端目的基因,通过拼接获得泡球吻OPN全长基因序列。了 解蛋白质的结构非常重要,因为它有助于理解其功能活性。此外对配体蛋白质相互作用 进行建模的药物设计研究也很有帮助。随着生物信息学的发展,许多组织和机构设计了 信息软件供生物学家们易于对蛋白质分析,抗原表位的预测可以通过蛋白质二级结构、 亲水性原则、可及性方案、抗原性方案、可塑性方案、电荷分布方案等综合分析。研究 发现蛋白质二级结构对其稳定性、亲疏水性和抗原性发挥着重要作用。由于a■螺旋和彷 折叠常在蛋白内部出现多为疏水性,而卩■转角和无规则卷曲经常呈现在蛋白表面,与亲 水性和抗原表位区域密切相关。通过预测二级结构显示a■螺旋占36.94 %,卩■折叠占 17.12%,卩■转角占7.43 %,无规则卷曲占38.51 %o从理论上说明EmOPN具有良好的 稳定性且有利于抗原表位形成。预测蛋白质中的抗原表位区域将有助于合理合成肽,这 种方法可以引发与完整蛋白质具有反应性的抗体。预测EmOPN二、三级结构为表面 抗原的存在提供有力依据,分析发现亲水性部位与抗原表位主要在227-234,447-453氨 基酸残区域无很好的一致性,说明在亲水性部位与抗原表位有密切关系的同时,但疏水性 部位也可出现在抗原表位,这与亲水性原则中TPHoppa]等人的发现一致:并非所有抗 原区都是亲水性的,也不是所有亲水区都具有抗原性。虽然本研究预测了 EmOPN存 在抗原表位,但由于结果预测出多个抗原表位且存在特异性和非特异性表位的区别,所 以需要进一步实验研究明确在虫体与EmOPN反应的特异性抗原表位,减少无效抗原 或降低非特异性抗原与宿主产生交叉反应。通过对EmOPN氨基酸序列分析发现与其 他物种同样存在功能性的精氨酸■甘氨酸■天冬氨酸序列(RGD),有理由猜想其与整联 蛋白膜受体或CD44膜受体结合开启与宿主体内泡球蝴免疫应答及炎性反应[⑹。获得 该序列后还未进行其原核表达载体及构建,下一步通过基因工程技术,将目的片段转化 大肠杆菌表达目的蛋白。将目的蛋白进行纯化,免疫小鼠或兔,进行攻虫实验。用来评 价EmOPN保护效力。

目前对于泡球吻相关基因的克隆研究标本取材大致有两种途径:一、感染宿主体内 获得原头节;二、体外培养无宿主泡球蝴囊泡。方法一是主要用于传染动物保种传代, 因易获得头节且对于实验室条件要求不高,广泛被使用。但在头节提取过程中必须多次 重复的清洗吹打搅拌沉淀组织,将中间层提取再加入胃蛋白酶消化宿主杂质,最后进行 活性检测。方法二在方法一的基础上,将原头节与Hela细胞及其上清液共培养,获得 不含宿主细胞的囊泡。该方法不仅要求相当高的实验室条件及娴熟的细胞培养技术,而 且培养期间易发生细胞污染,导致整个培养周期延长。然而不可否认该法可以剔除宿主 细胞对实验的干扰,可以模拟泡球蝴在体外的生长发育阶段,为实验提供更高级的研究 条件。

在多房棘球绦虫的生命周期中,总是保留一群“干细胞''样细胞,即生发层干细胞, 它们被认为是其在宿主中生长和发育的基本基础之一 0],同时有研究显示激活 EGFR/ERK信号通路传导有助于生发层干细胞增殖関。骨桥蛋白参与肿瘤进展和转移的 大多数方面,目前报道了多种类型的癌症中发现了高表达OPN基因。有研究报道缺乏 OPN并不会影响某些原发性肿瘤的生长过程,但却显着降低了肿瘤的转移潜能〔29-30], 并且OPN水平的升高会唆使惰性肿瘤的转移卩I】。Lamour 等人研究发现OPN可以 激活EGFR/Akt/mTOR信号通路维持脑胶质瘤起始细胞中的干细胞样表型,当下调 OPN基因表达时可以使其成球能力和致瘤能力下降,同时也可以抑制SOX2、OCTs/4 和Nanog等转录因子的表达,二聚体形式的OCT4可以激活OPN基因的转录,而 SOX2可能通过干扰OCT4二聚体形成抑制OPN的表达,所以我们推断EmOPN 基因表达下降时,将对泡球吻生发层干细胞的成球及增殖能力起到一定的抑制作用,从 而减少泡球蝴在宿主体内的侵袭生长及转移。有学者研究泡球吻感染的宿主体内可见 OPN高表达,主要分布在肝泡状棘球蝴纤维囊壁的生发层中[22],但是由于寄生虫■宿主 之间的相互作用难以明确高表达OPN来自哪一物种,并且由于OPN基因的高度保守 性,非特异性的抗OPN抗体对抑制肝泡状棘球勉的转移和侵袭并不能达到很好的理想 效果并可与宿主产生反应。为了排除宿主内环境对泡球蝴的影响,己有学者㈡]等人运用 体外培养技术将泡球坳囊泡在有氧及无氧条件下与Hela细胞及其上清液共培养并继 续进行生发层干细胞培养研究。本研究成功获得泡球吻OPN cDNA序列并对其进行了 生物信息学分析,不仅可以了解EmOPN的理化性质、特殊的蛋白结构,而且发现有 成为疫苗分子的潜能,同时为更好地设计抗原提供了便利,为后期开发理想的EmOPN 抗原疫苗提供实验基础及理论条件,为晚期包虫病人抗泡球呦转移治疗提供新途径。

结论

  1. 通过RACE技术成功获得多房棘球绦虫OPN同源性序列,通过软件分析显示该基因 全长1390 bp, ORF长度为849 bp,编码282个氨基酸。
  2. 预测EmOPN二级及三级结构显示a■螺旋(h)占81%,卩■折叠(e)占15.26%,卩■转角 (t)占10.08%,无规则卷曲(c)占53.85% ,为下一步合理设计重组抗原分子定制特异 性靶向药物提供帮助。

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综述

泡状棘球呦生发层细胞相关基因的研究进展

摘要:泡状棘球蝴病是一种危害极大的人兽共患寄生虫病,原发于肝脏,呈恶性浸润性 生长,其浸润性生长和转移的机制尚不明确。目前泡球坳生发层细胞被认为是一种全能 干细胞,中间宿主中囊泡的繁殖和转移都是基于它们自我更新和分化的能力。OCT4和 SOX2对全能干细胞的多潜能性的调控发挥至关重要的作用,骨桥蛋白可促进肿瘤干细 胞迁移和转移。在这篇综述中主要概述上述3种基因与泡状棘球坳生发层细胞的研究现 况。

关键词:泡球吻;生发层细胞;全能干细胞;基因

Abstract: Alveoor echinococcosis (AE) is a potentially fetal zoonosis caused by Echinococcus multilocularis (E.m), primary in the liver, showing the growth of malignant invasion, can secondary to lung and brain metastasis, the mechanism that invasive and metastasis in the host is not clear. The germinal layer cell is a kind of pluripotent stem cell, alveococcus new vesicle formation and growth, scolex occurrence and development, transmission and transfer of Echinococcus multilocularis in intermediate host depend on their self^renewal and differentiation ability. OCT4 and SOX2 play an important role in the regulation of pluripotency of totipotent stem cells. Osteopontin can promote the migration and metastasis of tumor stem cells. In this review, we mainly summarized the current research situation of the three genes and the germinal layer cells of Echinococcus alveolaris.

KEY WORDS: alveolar echinococcus; germinal layer cell;Totipotent stem cells; Gene

1.泡型包虫病具有与肿瘤类似的生物学行为

包虫病是一种人畜共患寄生虫病,主要分布在新疆、甘肃、青海、宁夏、西藏、四 川、内蒙古等7个省,流行区人间患病率为0.5%〜6.5%,人群平均患病率为1.08%,病 人约38万⑴。我国是世界上包虫病最严重国家之一,而新疆是该病的高发区之一⑵。 包虫病有两种常见类型:一种是由细粒棘球绦虫幼虫感染所致的囊型包虫病;另一种是 由泡状棘球绦虫幼虫感染所致的泡型包虫病。该病病程约1・5年,患者多为20至50岁 青壮年,几乎全部由泡球蝴侵犯肝脏为主要表现,呈恶性浸润性生长,可继发肺、脑转 移,其危害性较大⑵。大部分的患者在5年内死亡,不经治疗者10年死亡率达93% 以上阳]。其中对肝泡球蝴的治疗给患者的家庭和社会带来极大的负担。然而由于寄生虫 与宿主的关系密切,并不能将泡状棘球吻与宿主完全分离,所以对该疾病的自然转归并 不完全清楚,有研究发现无宿主细胞培养泡球勉可能更好的模拟泡球吻在宿主体内的自 然进程,为后期进一步研究其生长周期变化提供帮助⑸。

泡状棘球绦虫虫卵进入宿主在小肠内孵出六钩蝴,通过血液进入肝脏,形成泡球峻I, 早期被感染的肝脏肝细胞未见明显变化,随着感染时间的延长病灶与正常组织之间形成 纤维囊壁,囊壁外周可见成纤维细胞增殖及炎性细胞浸润,此时可见肝小叶结构破坏。 有时病灶中央可见坏死组织,常被巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞,纤维细胞所包 围,偶有肉芽肿结节形成,随着感染进一步加重门静脉周围出现弥漫性纤维增生、纤维 化。在感染的后期病灶有可能出现血液转移到肺、脑、骨等器官。被感染的患者最初无 特异性症状,可能会疲劳、体重减轻或可能患有肝肿大。少数人可能出现腹痛或者黄疸。 晚期通常会发生肝功能衰竭,常伴有门脉高压、腹水和脾肿大。未经治疗或治疗不当的 患者预后差⑹。

近年来外科医师普遍接受对寄生虫肿块进行根治性手术切除是泡状棘球蝴病唯一 的治疗方案⑺。肝移植是晚期患者肝功能衰竭的一种选择。世界卫生组织将阿苯达卩坐 (ABZ)或甲苯咪卩坐(MBZ)作为药物治疗的首选推荐⑻,但只是在不杀死寄生虫的情况 下停止其生长。然而目前已知的副作用包括:中毒性肝炎、中性粒细胞减少、可逆性脱 发和眩晕等。由于潜在的肝毒性在服药期间必须定期检测肝功能,部分患者并无良好的医 从性。有研究表明Hl,早期患者完全行根治性手术同时服用阿苯达卩坐辅助治疗相结合, 接在20年后几乎100%存活。但是由于该病在诊断时就已经进入晚期,大多数患者的病 灶与邻近器官侵犯或者远处转移不适合进行完全切除,也不建议姑息性切除术。目前咪 卩坐类药物的使用已有40多年的历史,药物的疗效有限且并发症不少。为了弥补这一不 足,迫切需要新的药物治疗代替品。

2.泡状棘球虫幼生发层细胞是一种全能干细胞

干细胞(Stem cell)在是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞〔⑼。主要分为全 能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。扁形动物门包括涡虫纲、吸虫 纲及绦虫纲。扁虫最奇特的细胞类型是一种小的、圆形或卵形的未分化细胞,称为新生 细胞(neoblasts)。它们具有独特的有丝分裂活性及惊人的再生能力和发育可塑性,所 以扁虫具有极强的再生能力。由于有类似干细胞特性的全能干细胞,当把扁虫切成多个 身体碎片时,一段时间后每个碎片都能长成新的生物体。可见这种全能干细胞在扁虫的 生长发育中起着关键作用Mi%目前由于新生细胞的数量庞大,实验可及性强,组织分 化多样,是其成为再生医学技术中干细胞研究理想的研究对象o 1950-1980年代是绦 虫超微结构研究的黄金时代,发现一种未分化的“生发细胞"经常出现在各种成虫和幼虫 的头颈部组织中。从形态学上观察,这些细胞与其分化的相邻细胞有明显的区别,它们 有一个大的细胞核和一个突出的核仁,周围是稀少的嗜碱性细胞质。通过结合电子显微 镜和放射性标记物摄取研究得出了“生发细胞"和在扁虫中的新生细胞一样,是绦虫中唯 一能产生所有其他细胞的有丝分裂活性细胞的分化细胞WE。Galindo等问研究发现泡 状棘球绦虫幼虫的发育也是由作为胚层一部分的生发层细胞诱导的,具有与新生细胞一 样的强大再生能力。尽管在形态和功能上与其他扁虫的新生细胞相似,但在基因表达水 平上显示岀重要的差异,这可能与它们的生物进化变化有关"I。与其他绦虫中不同, 多房棘球坳能够像肿瘤一样浸润生长在宿主组织中,国外有学者皿19]进行了无宿主组织 的泡球呦原头节体外培养发现从囊泡中可以分离出生发层细胞,并且在稳定内环境培养 基条件下生发层细胞可在体外维持数月并增殖。在与宿主肝脏细胞共培养发现囊泡聚集 随后形成中心空腔,被生发层细胞围绕。能够在体外完全再生感染性囊泡,这是证明其 寄生虫起源的最有力证据。生发层干细胞的自我更新和分化能力是泡球蝴新囊泡的形成 和成长,头节的发生和发育以及泡球蝴在中间宿主体内的传播和转移的基础。

  1. OCT4SOX2在全能干细胞多潜能性及肿瘤中发挥重要作用

OCT4是一种POU结构域蛋白,在外胚层中表达,随后在生殖细胞中表达。它对于 建立和维持全能干细胞的多能性是至关重要的,在没有OCT4的情况下,胚胎在着床后 死亡,并且体外实验发现也不能生长[20】。有趣的是在OCT4中加入成纤维细胞生长因子 4 (FGF4),没有表达FGF4的胚胎干细胞不能恢复全能干细胞的多能性,反而会促进 滋养外胚层的增殖01。SOX2是SRY相关的HMG-box基因家族的一员,它编码具有单 个HMG-DNA结合域的转录因子。根据HMG框内外的同源性,SOX2属于SOXB1亚 群,也包括SOX1和SOX3,Sox家族成员已经在动物界得到了确认,并根据SOX蛋白 序列的相似性定义了 SOX A-to- SOX H亚群。其在干细胞维持、细胞重编程和癌症等方 面的重要作用已被广泛的研究QI。有证据表明[2习,SOX2可能起到维持全能干细胞发展 潜力的作用。例如,SOX2的表达与中枢神经系统的全能干细胞和前体细胞有关,所以 像OCT4—样,它在全能干细胞、外胚层和生殖细胞中表达。因此SOX2很可能是维持 外胚层细胞处于未分化状态所必需的基因,在没有SOX2的情况下,它们会改变自己的 特性成为滋养外胚层或胚外内胚层。而缺少OCT4的早期胚胎全能干细胞只能形成滋养 外胚层衍生物。SOX2和OCT4可能在整个早期发育过程中共同维持全能干细胞多潜能 状态。OCT4作为POU家族转录因子能够与SOX2形成活性三元络合物协同激活下游 通路0], OCT4/SOX2通过两个转录因子之间的蛋白相互作用激活FGF・4。OPN表达与 OCT4二聚体结合的方式被调控,而SOX2利用反式激活抵消这一作用,证明SOX2可 能干扰OCT4与OPN二聚体的形成。目前已知在全能干细胞中SOX2充当OCT4活性 的正或负调节因子。然而,OCT4/SOX2复合物是否需要桥接整合因子仍有待确定。近 年来研究发现[251OCT4和SOX2不仅是调控胚胎干细胞自我更新和分化的转录因子也可 作为乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤同时表达预后不良的新预测因子。Lopez 等人发现[26]OCT4和SOX2通过DNA甲基转移酶依赖性的microRNA激活胶质母细胞 瘤变成多能干细胞并肿瘤增殖能力。所有这些都意味着这两个基因似乎对癌细胞的生存 具有重要意义。

  1. OPN在促进肿瘤细胞迁移和转移中发挥着重要作用

骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)又称早期T淋巴细胞激活基因1,是细胞在机体发 育过程中或在一定病理条件下向细胞外基质分泌的一种亲水性、酸性、分泌性糖蛋白。 在病理情况下,OPN的表达可归因于炎症、血管生成、纤维化和不同器官的癌变[27]。 在体外研究中OPN具有多种重要功能,早期人们已经认识到OPN具有粘附活性,这一 发现已被其受体均介导细胞粘附的观察所证实。另一个特征鲜明的OPN的功能是调节 迁移:不仅对于许多细胞类型都是趋化性的,而且缺乏OPN的细胞也缺乏运动能力曲, 这表明该蛋白在迁移中起着固有的作用。从过去十几年对培养细胞的大量研究中可以清 楚地看出,OPN表达使细胞更具致瘤性和/或转移性。在肿瘤恶化方面,OPN已成为一 个潜在的生物标记物。刘莹莹[29】研究发现OPN可以激活P-Catenin信号通路促进反应性 胆管细胞增殖加速正常肝组织结构破坏加速肝癌的转变。OPN与结直肠癌干细胞的特性 相关,肿瘤相关细胞分泌的OPN通过激活Wnt/p-catenin通路增加CD44v6在结直肠 癌干细胞中的表达。且OPN促进肿瘤干细胞的迁移和转移卩0】;OPN的DNA序列是 高度保守的,其中包含两个重要的功能域civ卩整合素和CD44结合位点。对胶质母细 胞瘤(Glioblastoma,GBM)的研究显示在,神经胶质瘤起始细胞(Glioma-initiating cells,GICs)中,OPN与几个细胞表面受体整合相互作用,av|33整合素和CD44受体是 GBM细胞表面受体的代表。OPN可通过与受体(时卩3和CD44)结合开启下游信号 通路。CD44v6在GICs生长和成球形成中发挥了关键的作用,OPN静默可抑制GICs 中SOX2、OCT3/4和Nanog等干性转录因子的转录。OPN-CD44在胶质瘤血管周围 龛中的交互作用增强癌症干细胞表型卩1]。体内实验显示OPN静默可抑制GICs干性特 征和致瘤性。同时,研究亦证实在GICs中Akt/mTOR/p70S6K是主要的信号途径,此途 径被OPN介导的EGFR受体激活4。对肝癌细胞研究显示,OPN可能通过 avp3-NF-KB-HIF-la途径促进癌干细胞样表型,OPN是维持肝癌细胞干细胞样特性的必 须条件。EGFR在正常组织和肿瘤干细胞中被认为是一种干细胞标记物,无EGF的情 况下,GICs经OPN处理后磷酸化的EGFR水平明显上调。而在OPN处理前经 EGFR抑制剂AG1487处理,磷酸化的EGFR水平明显降低。提示OPN促进EGFR 的磷酸化。EGFR通过激活下游的两个主要的细胞内信号转导通路调控干预干细胞表 型,即ERK和Akt途径。PI3K/Akt/mTOR通路被视为EGFR的主要下游靶点。与 癌症干细胞的细胞生存和维持有关。研究发现GICs中OPN可诱导Akt和mTOR 的下游激酶P70S6K磷酸化,而ERK磷酸化并没有显著改变,提示GICs中OPN促 进EGFR依赖的Akt和mTOR途径激活。而下调OPN阻止干细胞转录因子的表达 可使GICs失去成球能力和致瘤能力QI。提示OPN通过EGFR/Akt/mTOR信号途径 有助于维持GICs干细胞样表型。

  1. OCT4SOX2OPN 在多房棘球绦虫中的研究

泡状棘球蝴生发层细胞是一组全能干细胞样细胞,被认为是在宿主体内驱动向其他 分化持续生长的细胞。目前对这种控制生发层细胞分化的行为的机制和相关分子尚不清 楚。商桂华卩3]通过基因克隆技术扩增编码多房棘球蝴绦虫同源性OCT4基因并获得序列 全长203lbp,可编码氨基酸676个。获得的序列与低等生物到高等生物比对,发下 EmOCT4的POU结构域相似性很高,证明POU结构域保守较好。运用免疫组织化学 发现EmOCT4在泡球坳的生发层细胞核内、原头节核中表达。对EmOCT4进行诱导多 能干细胞试验证明其作用位点具有高度保守性。Zhe Chen或勺等人对多房棘球蝴绦虫中的 SOX家族成员,EmSOX2,进行克隆并认为EmSOX2可作为一个潜在的生发层细胞细 胞调节因子。发现用EmSOX2替代小鼠SOX2可从体细胞中获得诱导多能干细胞

(iPSCs),提示EmSOX2在功能上可能与哺乳动物SOX2有密切关系。通过免疫荧光 染色发现在多房棘球绦虫的生发层细胞中EmSOX2表达活跃,定位在细胞核中,约有 18.4%的细胞表达EmSOX2o这与Koziol%】等人之前报道的生发层细胞占所有细胞的 21%结果接近。经羟基服处理可以有效的耗尽生发层细胞群,从而显著减少囊泡中的 EdU+细胞数量。去除羟基服后可以恢复其增殖并进行类似于干细胞的克隆扩增。这些结 果表明,EmSOX2可能在调节多房棘球绦虫生殖细胞中起关键作用。李建辉[均等研究发 现在人肝细粒棘球呦囊壁中,OPN表达主要集中分布于近肝侧纤维性囊壁(内层),而近 肝侧纤维性囊壁(外层)表达很少,且骨桥蛋白表达阳性的囊壁均有不同程度钙化表现, 提示骨桥蛋白可能与肝细粒棘球坳囊壁钙化有关等人研究人肝囊性包虫病发现 OPN存在于钙化细粒包虫囊肿内层中,并且与肉芽肿反应有关,认为OPN是这两种过 程之间的桥梁。张龙旳等研究发现骨桥蛋白在长爪沙鼠肝泡型棘球蝴纤维囊壁的生发层 和炎细胞中高表达,OPN定位于细胞浆,呈棕黄色或棕褐色。伴有胸廓淋巴结转移的 肝泡型棘球蝴组织中OPN阳性细胞检出率高于未发生胸廓淋巴结转移的肝泡型棘球呦 组织,OPN在淋巴转移灶中的阳性细胞率高于肝泡型棘球坳组织,OPN可能促进泡型 棘球蝴转移。另外,研究还发现,外源性给予抗OPN抗体,可以阻断OPN的功能, 从而抑制肝泡型棘球蝴的生长及转移。骨桥蛋白与白细胞介素・10具有协同作用,不仅 具有免疫双向调节作用,而且对肿瘤的发生、发展也具有双向调节作用。一方面通过抑 制抗原提呈功能及T细胞的活化和免疫应答从而诱导肿瘤免疫逃逸,促进肿瘤的生长 及转移;另一方面IL-10抑制辅助性T细胞17 (T helper cell 17, Thl7)、巨噬细胞等 促进肿瘤发生、发展的炎性因子,抑制肿瘤相关炎症,提高机体抗肿瘤能力,而且IL-10 可以提高自然杀伤细胞和CD8+T细胞的细胞毒性活性,提升机体杀伤肿瘤效应,抑制 肿瘤的发展及转移[隔。动物实验发现抗OPN抗体可使动物模型体内泡球蝴组织中 IL-10的表达下降,同时增强机体抵抗力可减少增殖及转移卩刃。赵江桥等人也证实外源 性给予抗OPN抗体可抑制血清中IL-10的表达Ho】。提示OPN与IL-10高表达可能对 肝泡状棘球坳转移的发生有促进作用。

6.展望

目前为止,对于多房棘球绦虫相关基因对生发层细胞多潜能性的研究寥寥无几。随 着分子克隆技术广泛用于寄生虫邻域国内有学者分别对的泡状棘球绦虫同源基因 Em95、EmLDH、极光激酶(EmAurora)进行了克隆⑷心],目的都在通过不同途径为研 究适合的靶向药物提供理论基础。Spiliotis MH4]等人利用大鼠肝癌细胞及其上清液培养 泡球蝴生发层细胞,此培养体系可以进一步研究宿主与寄生虫相互作用和免疫逃避的分 子基础,也为多房棘球绦虫相关基因的研究提供实验基础。不可否认尽管相关研究基因 被克隆且表达蛋白,可以用来制备多克隆抗体,但仍然对其如何激活通路发挥何种作用 了解甚少,这是下一步研究的重点也是难点。

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