间充质干细胞上清液对细粒棘球绦虫原头节活性的影响论文

2020年11月26日10:48:44间充质干细胞上清液对细粒棘球绦虫原头节活性的影响论文已关闭评论

间充质干细胞上清液对细粒棘球绦虫原头节活性的影响论文

中文摘要

目的

探讨不同浓度间充质干细胞上清对细粒棘球绦虫原头节活性是否存在影响及浓度差 异性。

方法

  1. 从4・6周龄C57小鼠下肢长骨干内提取培养MSCs;
  2. 倒置显微镜下观察MSCs的细胞形态及生长情况;
  3. MSCs培养、传代并留取培养上清液,稀释成100%及50%浓度;
  4. 从昌吉屠宰场获取自然感染的绵羊羊肝并从中提取细粒原头节,培养观察其形态及 活性;
  5. 实验分组使用不同浓度MSC±清液培养原头节,不同时间节点下伊红染色观察计数, 留取标本检测Caspase-3酶活性,制备电镜标本;
  6. 按照Caspase-3酶试剂盒操作步骤检测标本中酶的活性,电镜下观察不同时间点原头 节的微观形态变化;
  7. 实验数据处理及统计学分析(SPSS 17.0) o

结果

  1. 间充质干细胞上清液与细粒头节体外培养对其生存率有提升。
  2. 间充质干细胞上清降低了体外培养细粒头节Caspase-3酶的活性。实验组与对照组 Caspase-3酶活性有统计学意义(P<0.05)
  3. 电镜下观察原头节实验组较对照组头节形态更具有完整性,局部结构存在差异。

结论

间充质干细胞上清液能有效维持体外培养的细粒棘球绦虫原头节的活性。

关键词

间充质干细胞,细粒棘球绦虫原头节,活性

Abstract

Objective

To investigate the effect of mesenchymal stem cell supernatant of different concentrations on the activity of echinococcus granulosus and the concentration difference.

Methods

  1. Extraction and culture of MSCs from the lower limb long bones of C57 mice aged 4-6 weeks Morphological characteristics of MSCs were observed by microscopy;
  2. Observe the morphology and growth of MSCs under a microscope;
  3. MSCs were cultured, passaged, and the supernatant was taken and diluted to 100% and 50% concentration;
  4. The experimental groups were cultured using different concentrations of MSC supernatants to culture the protocephala, and the eosin staining was observed and counted at different time points, Save the specimen to detect the Caspase-3 enzyme activity and prepare the electron microscope specimen;
  5. Follow the steps of the Caspase-3 enzyme kit to detect the enzyme activity in the specimen, and observe the micromorphological changes of the protocephala at different time points under an electron microscope;
  6. Experimental data processing and statistical analysis by SPSS 17.0.

Results

  1. Mesenchymal stem cell supernatant and fine-grained ganglion has improved its survival rate In vitro culture.
  2. The supernatant of mesenchymal stem cells reduced the activity of Caspase-3 enzyme in fine-grained ganglion in vitro.The Caspase-3 activity of the experimental group and the control group was statistically significant (P <0.05)

3・ Observation under the electron microscope of the protocephala experimental group was more complete than that of the control group, and the local structure was different.

Conclusion

The mesenchymal stem cell supernatant can promote the activity of E. granulosus protozoan activity in vitro.

Key words

MSCs,Echinococcus granulosus,activity

英文缩略语表

List of Abbreviations

前言

Introduction

细粒棘球坳病又名囊性包虫病(cystic echinococcosis, CE),是由细粒棘球虫幼绦虫 的中绦期幼虫引发的一种人畜共患病⑴,它可以寄生于人或者其他动物体内,例如牛羊 犬等,该病好发于畜牧业发达的国家或地区2习,我国西北部为高发区域。目前我们对于 包虫病的治疗手段主要分为手术治疗或保守药物治疗及化疗。手术治疗以切除含有细粒 棘球蝴的团块组织或完整地摘除内囊为主要目的,从1871年传统的内囊摘除术至今, 该术式一直沿用至今,随着外科手术技术的成熟与发展,也继发了其他改良术式,如内 囊摘除外囊缝合术等⑷。内囊摘除术对于患者创伤较小,操作相对简便,但是存在着术 后可能复发,甚至种植性转移,或残腔胆漏、感染等难题,原因可能是手术中包囊的破 裂,导致囊液的溢出El后有彭新宇等⑻总结手术经验并提出的肝囊型棘球坳病外囊完 整剥除术,可完整剥除紧贴棘球蝴外囊壁的外囊,该术式可更好地解决术后复发、胆痿 和合并感染等难题,但对于术者的经验及要求也较高。而药物治疗目前临床的一线用药 仍是以阿苯达卩坐为主要代表药物的苯并咪卩坐类药物,该药物同样可作为棘球坳病患者的 辅助治疗。根据该药物目前国内外临床应用指南,如果服用阿苯达卩坐(片剂),正规有 效的疗程为6〜12个月,具体有效剂量为15〜20 mg/ (kg-d)刃。]。

近年来,随着细胞生物技术不断发展与进步,对于干细胞的研究也在不断加深,间 充质干细胞的相关特性也受到了越来越广泛的关注,如骨髓间充质干细胞增殖传代能力 强、细胞均一性好、外源基因转染率高并能高效稳定表达、同时伦理问题和排斥反应也 较少,其在不同条件下可以完成向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞以及神经 细胞分化Hi】。许多研究己经表明,间充质干细胞会定向迁移至某些特定组织,特别是在 这些特定组织出现炎症反应包含创伤、慢性炎症反应(如移植物抗宿主病)和肿瘤等情况 时,该能力被定义为间充质干细胞的归巢QI。

肝细粒棘球绦虫寄生在人类脏器(肝脏多件、其次为肺脏、肾脏等)后,细粒棘球 蝴会形成异物型肉芽肿,并不断纤维化增生,其生长方式为外增性膨胀生长,随着异物 性肉芽肿不断增大,将压迫周围正常肝组织,形成一圈炎性反应带,导致周围肝细胞变 性、萎缩、坏死,加上虫体本身刺激,启动肝纤维化机制,在包虫虫体外囊周围形成另 一层较为致密的纤维囊壁am。在包虫于肝脏体内制病的同时与归巢的干细胞接触并相 互影响,基于这种机制。考虑间充质干细胞是否对细粒棘球蝴产生各种作用,影响其活 性、致病力。本课题组前期已有实验证明细粒棘球原头节对MSCs的增值、钙化及成纤 维化都存在影响,那么MSCs对于细粒头节活性是否也存在某些影响。基于这样的考虑, 本人的预实验中发现,间充质干细胞与细粒棘球绦虫原头节体外培养,对头节的活性存 在着促进作用,且共培养的方式中两者并无直接物理接触,考虑可能是MSCs分泌的某 些细胞因子对细粒原头节产生了刺激并影响其活性。

因此,本实验使用不同浓度的小鼠MSCs上清液处理细粒原头节,探讨MSCs±清液对于细粒头节的活性是否存在着影响,为细粒棘球蝴病的治疗提供一种新的思路。

材料与方法

Materials & Methods

1实验材料

1.1主要试剂和仪器

从新疆医科大学动物实验中心购买的健康黑色C57B/L6小鼠,4〜6周龄大小,雌雄分笼, 于石河子大学转化医学实验动物房喂养,环境温度约为20〜25°C,小鼠口粮标准中颗 粒饲料、饮水来源为冷却后的沸水。(小鼠饲养合格证号SCXK-2011-0003) o1.2实验动物及材料

购买于新疆昌吉回族自治州屠宰场自然状态下感染肝细粒棘球黝病绵羊的肝脏,经过 筛选,包虫囊泡饱满,选取离体不超过24h的新鲜脏器样本。

1.3主要溶液的配置

MSCs培养基的配制

提前将超净台进行紫外线消毒,所有配液操作于超净台内进行,取出灭菌干燥后的 50mL离心管,使用10 mL、500 u L移液器抽取44.5mL DMEM培养基至50mL离心管 中,使用移液器再加入5 niL胎牛血清、0.5 niL双抗(青霉素、链霉素混合剂),用封 口膜将离心管封号,表面做好标记(10%浓度DMEM),存放于4°C冰箱(保质时间约 为一周)。

无血清MSCs培养基的配制

提前将超净台进行紫外线消毒,所有配液操作于超净台内进行,取出灭菌干燥后的 50mL离心管,使用10 mL、500 u L移液器抽取49.5mL DMEM培养基至50mL离心管 中,使用移液器再加入0.5 mL双抗(青霉素、链霉素混合剂),用封口膜将离心管封 号,表面做好标记(0%浓度DMEM),存放于4°C冰箱(保质时间约为一周)。

CE头节培养基的配制

提前将超净台进行紫外线消毒,所有配液操作于超净台内进行,取出灭菌干燥后的 50mL离心管,使用10 mL、500 PL移液器抽取45.5mL 1640培养基至50mL离心管中, 使用移液器再加入5 mL四季青胎牛血清、0.5 mL双抗(青霉素、链霉素混合剂),用 封口膜将离心管封号,表面做好标记(0%浓度DMEM),存放于4°C冰箱(保质时间 约为一周)。

1XPBS缓冲液的配制

使用50 mL无菌注射器分别抽取单蒸水190 mL, 20 X PBS 10 mL,加入200 mL高压 灭菌处理的玻璃瓶中,盖好瓶塞后无菌无纺布覆盖瓶口,剪一小节棉线,一段放入玻璃 瓶中,另一端缠绕玻璃瓶口(防止高压过程中爆瓶或瓶塞脱落),再次高压灭菌后加入 2mL双抗(青霉素、链霉素混合剂),之后摇匀即可使用,4°C保存(使用时间不超过 两周)。

胎牛血清与双抗的分装

提前将超净台进行紫外线消毒,所有配液操作于超净台内进行,取出灭菌干燥后的 lmL、10mL离心管,分别将胎牛血清、双抗放入离心管中,封口膜封号管口,做好标记 (FBS、双抗),存放于・20°C冰箱保存待用,拿出使用时预先12-24h移至・4°C冰箱,融 化至液态后进一步使用。

2实验方法

2.1骨髓间充质干细胞(BM・MSCs)的分离和培养

实验采用本课题组前期研究的方法来提取培养小鼠骨髓间充质干细胞[14,15]。从动 物房中取4〜6周龄C57B /L6小鼠,选取时尽量选取毛色均匀黝黑、活力良好的小鼠10% 水合氯醛完全麻醉后脱颈处死,75%酒精浸泡消毒10分钟,将小鼠的四肢固定于无菌手 术操作板上,使小鼠充分暴露双侧下肢,高压灭菌眼科器械(小齿银、小剪刀)按解剖 层次快速分离并取出双侧股骨胫骨,尽可能去除骨组织周围粘连肌肉组织及结缔组织, 且避免损伤长骨干垢端结构。使用无菌纱布轻微挫除骨周残余组织,加入无菌PBS缓冲 液,移液器冲洗长骨三次,移至另一超净台,更换灭菌眼科小剪刀,剪去长骨干两端干 肪端,使用无菌注射器抽取约5mLMSCs培养基,卸下针头,换用1 niL无菌注射器针头 (更细便于刺入骨髓腔),刺入骨髓腔中并反复冲洗约2・3次,直至骨髓腔颜色变白或 透明,换用移液器吹打混匀冲洗后含骨髓细胞的培养液,并接种于60 mm无菌培养皿中, 于37°C、5% CO2温箱中进行培养。20・24h倒置显微镜下观察干细胞贴壁及成簇情况, 并首次换液,换液时弃掉培养皿内原有培养液,加入2mLPBS缓冲液轻柔洗除皿内未贴 壁细胞及杂质,弃液,再加入3mL新鲜MSCs培养基,同样放入如前培养箱中继续培养。 每隔48 h换液一次并于显微镜下观察细胞生长情况。当显微镜下观察贴壁细胞生长范围 达到整个皿底面积的90%以上时,可进行传代操作。传代操作如下:弃掉培养皿内培养 液,加入ImL含0.25%EDTA的胰蛋白酶,轻轻晃动培养皿,确保消化酶渗透整个皿底, 消化时长约1 min (计时器计时),计时器响铃后,立刻加入2mL含血清的DMEM培养 基终止消化,使用ImL移液器吹打至皿底,边吹打边转动培养皿,直至80%的细胞脱落 (必要时可显微镜下观察皿内细胞情况),将所有含细胞的培养液加入15mL离心管中 1000 r/min离心5 min,离心完毕后,轻轻拿起离心管,避免晃动,可观察离心管内下侧 壁上附着的白色沉淀物为细胞,小心吸弃上清液,向15mL离心管内加入3 mL新鲜DMEM 培养基,吹打重悬细胞后按1:2比率接种于新的60 mm无菌培养皿中进行传代培养,做好 标记(第几代时间),培养至第3代MSCs用以后续试验。

2.2细粒棘球绦虫原头节(CE原头节)的分离和培养

从新疆昌吉自治区屠宰场购买自然状态下感染肝细粒棘球呦病绵羊的肝脏,将大体

标本取回实验室,先用清水洗尽肝脏表面杂物、血液及多余组织附带物,清洗约4・5次。 将肝脏移至无菌操作台,提前准备好提取相关器械及容器(如:30ml无菌注射器、50ml 无菌注射器、手术刀片及刀柄、组织银2・3个、无菌玻璃瓶200ml)。用酒精给肝脏消毒 后提取囊液及头节,放置于无菌玻璃瓶中,用PBS反复冲洗后弃掉上清,重复以上操作 15次以上,洗尽头节及杂质后将所有沉淀转移至10cm培养皿中,加入10ml PBS混匀, 用无菌lml注射器吸出或挑出大体积囊皮及杂质。顺时针或逆时针方向轻微晃动培养皿, 将培养皿倾斜30。左右,可见液面与培养皿交接处细粒头节聚集成线状排列,用移液器 吸取此处头节置于另一装有PBS的培养皿中。重复以上提纯操作1・2次可获得无杂质头节。 将头节置于加有5ml 1640培养液(10%FBS                                               1%双抗)的培养瓶,于无菌恒温培养箱

(37.5°C 5%CO2)下培养2d,下一步实验前换作DMEM培养基提前适应实验环境。0.1% 伊-红染色于光学倒置显微镜下来观察上述原头坳的活性,存活率N98%可用于下一步 实验。Fig 2.1,2.2 extraction and cultivation of MSCs and echinococcus granulosus

2.3细胞形态学的观察

使用上述方法提取并进行培养所得的MSCs及CE原头节于倒置相差显微镜进行细胞 形态学观察,具体观察指标为细胞的形态、生长规律、数量多少;头节的活动度、口器、 吸盘、末端胚泡的形态位置及变化情况。

2.4细胞及头节的计数

使用倒置显微镜下观察干细胞的生长数量达到整个皿底面积的90%以上时,弃掉培 养基,加入3mLPBS缓冲液润洗两次,弃液后再加入ImL的胰蛋白酶消化约1 min (计 时器计时),计时器响铃后加入2mLDMEM培养基终止消化,使用ImL移液器吹打至 培养皿底,边吹打边转动皿底,直至80%的细胞脱落(必要时可显微镜下观察皿底细胞 脱落情况),将所有含细胞培养液加入15 mL离心管中1000 r/minM^5 min,弃掉上清 液,向离心管内加入PBS缓冲液,吹打重悬,将细胞稀释并混匀,使用微量移液器吸取 lOpiL细胞混悬液,滴入计数板中,显微镜下计数4个大方格内的细胞总数量,所得细胞 浓度(细胞数/mL)为=4大格细胞数/4><10仪稀释倍数。

将培养好的细粒头节装入15ml离心管,800g离心5分钟,弃掉上清液,使用小剂量 移液器(1UL)吸取沉淀头节置于倒置显微镜下计数,重复以上操作计数3次,计数结 果约为1 M头节纯沉淀液约等于110-120个细粒头节。

  • MSCs上清液的收集与稀释

显微镜下观察p3代MSCs生长数量达到整个培养皿底的90%以上时,弃掉培养基, 加入PBS缓冲液轻洗两遍,每个皿中加入无血清DMEM培养基3mL (以防止血清对后 续头节活性实验的影响),于无菌恒温培养箱(37.5°C 5%CO2)下培养2d。将一部分 培养基吸取后装入15mL离心管内,封口,做好标记(100%浓度MSCs上清液)。另 一部分培养基吸取后加入等量毫升数的无血清DMEM培养基,移液枪吹打混匀后装入 15mL离心管内,封口,做好标记(50%浓度MSCs上清液)。将收集到的MSCs上清 液放入・20°C冰箱保存待用,拿出使用时预先12-24h移至・4°C冰箱,融化至液态后进一 步使用。

  • MSCs上清液培养CE原头节

在使用MSCs上清液培养CE原头节之前需将原有培养细粒头节的1640培养基提前 2・3d换成DMEM培养以适应新的环境,以排除不同培养基对于CE头节活性实验的影响。 培养容器为6孔培养板,实验组分为三组,第一组为:100%浓度MSCs上清液+约20000 个头节;第二组为50%浓度MSCs上清液+约20000个头节;第三组为无血清DMEM培养 基+20000个头节。每种培养液初始加入3mL,每48h (0d 2d 4d 6d 8d lOd)半数换液并收 集少量头节(约100-200个)作为伊红染色样本、Caspase酶检测样本、电镜样本进行后 续检测。换液时需将培养容器稍向一侧倾斜,使头节聚集在液面一侧,使用移液器于液 面另一侧吸取培养基,以确保头节数目不随换液而减少。

  • CE原头节伊红染色及显微镜下观察抗染情况

不同时间节点取出的CE头节样本置入洁净的玻璃载玻片上,使用移液器加入约lOpiL 苏木精■伊红染液,静置约半分钟后移至显微镜下,观察头节抗染情况,部分口器染红 或整体染红头节均记为染色,虫体透明无红染记为抗染。镜下记录标本头节总数及抗染 头节数目。

  • CE原头节Caspase-3酶标本的制备及检测

Caspase是一个在细胞凋亡中其重要作用的蛋白酶家族,而其中Caspase-3属于 Caspase家族的CED-3亚家族,是细胞眺望中的一个关键酶,可以直接特异性的剪切许 多caspase底物。正常的状态下Caspase-3以酶原的形式存在于胞浆中,没有活性。但在 细胞发生凋亡阶段,它被激活,活化的Caspase-3可裂解相应的胞浆胞核底物,最终导 致细胞凋亡。本试剂盒将Caspase-3序列特异性多肽偶联至黄色基团pNA;当该底物被 Caspase-3剪切后,黄色基团pNA游离出来,可通过酶标仪或分光光度仪(X=405nm或 400nm)测定其吸光值,考察Caspase-3的活化程度。pNA在405nm附近有强吸收峰值。

Caspase-3活力曲线的绘制:取无菌96孔板中横向8孔进行标准品加样,其下面对 应8孔为空白孔对照,从左至右浓度等梯度递减(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、 OyM)所有待测孔中加入适量缓冲液,确保每个孔中为lOO^iL待测液,充分混匀。使用 分光光度仪检测横向两排16孔的405nm吸光值。每个孔吸光值检测3次取平均值,得 到标准品的吸光度值减去空白孔的吸光度值进行后续计算。以所有检测标准品的数值为 横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上作图,画出标准曲线。

CE头节的Caspase-3值检测:将取出的CE头节样本放入ImL离心管中,加入PBS 洗涤3次,第三次放入离心机中(1000rpm5mhi),弃掉上清液。将包虫样本使用超声 破碎仪进行破碎,每次破碎时长1S, 2-3次后完成。加入冰冷裂解液lOOyL,震荡冰浴 10分钟,将样本放入4°C离心机中(12000rpm 10min)离心,取出样本离心管,小心吸 取上清液(含裂解的蛋白质)转移至新的ImL离心管中,做好标记(d高/低浓度/对照), 放入・20°C冰箱,待10d标本收集完毕后统一进行检测,避免多次测量带来的误差。

  • CE原头节电镜标本的制备及检测

固定:将取出的CE头节样本放置于玻璃载玻片上,滴下可覆盖包虫组织的3%浓 度戊二醛固定[17]样本2h,之后使用O.lmol/LPBS洗2次,每次5min。脱水:调制50%、 70%、90%、95%浓度乙醇进行脱水,室温下在摇床上进行操作,按浓度梯度从低到 高依次将标本放入乙醇溶液,每次5min,多余水分或酒精用吸水纸轻轻吸干,避免触 碰样本。干燥:置于无尘洁净试验台上12h可采用自然干燥法[16],将电镜样本放入洁 净储物盒内。扫描取样时使用牙签固定法[17],喷金后进行扫描。

2.10统计学分析及数据处理

本实验所得数据记录于Excel (2003)中,采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析, 各组数据均采用均数的形式表示,三个实验设置组间的比较本研究采用方差分析,组间 两两之间的比较我们采用Bonferroni法,本次研究以P<0.05认为有统计学意义。

实验结果

Results

1 MSCs及CE头节培养及观察

l.lMSCs形态学观察

使用细胞自然贴壁法对小鼠的骨髓内细胞进行提取、分离及培养所得MSCs,传至 p3代后,如图所示可见48h内,MSCs成细胞集落簇样生长,形态大小不一,与成纤维 细胞类似,细胞呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出2-3厘 米多个长短不同的突起。4 d时细胞由集落中心向四周扩散增长,培养至7・8d左右细胞 数目可大培养皿底面积95%以上(图1.1) o

图1.1倒置显微镜下MSCs形态特征

Fig 1.1 Morphological characteristics of MSCs

  • CE头节形态学观察

细粒棘球原头蝴头节来源于棘球蝴母囊、子囊、育囊中,每个棘球蝴含头节数目几 百甚至几千个。头节外形呈梨形或类圆形,头节头端有顶突及四个吸盘,顶突上有两圈 大小相间的小钩,高倍光镜下可看到一圈黑色钩状结构,为头节的口器,头节末端有一 末端胚泡。头节活性下降时,末端胚泡会逐渐增大,如图B培养第5天头节末端胚泡明 显大于图A培养第1天,口器、顶突的外翻也提示头节活性的下降,但运动状态下的头 节也可表现为顶突的外翻,但其头节后部分为紧缩长条状;而活性不好的头节除了顶突 外翻,头节后面常为膨大状(图1.2) o

A: CE头节培养第1天                                                           B: CE头节培养第5天

图1.2显微镜下CE头节形态学观察

Fig 1.2 Morphological characteristics of echinococcus granulosus

2 MSCs上清液培养头节各时间点抽样样本的检测

2.1 MSCs上清液在体外培养原头节对其存活率的影响

从不同时间节点抽取的头节样本进行伊红染色,显微镜下观察如图A所示,活性 较差或死亡头节被染至红色,活性较好头节拒染,仍保持原有半透明虫体黄色。记录所 有时间节点头节拒染数及总数(表2.1),计算头节存活率,绘制头节存活率活力曲线 如图B。

图B活力曲线高浓度组与低浓度组对于单独培养对照组的头节存活率有提升,且从 第6d开始,头节存活率差异有统计学意义(PV0.05)。但高浓度组与低浓度组间对比, 虽然从活力曲线看,存活率高浓度组高于低浓度组,但无明显统计学差异。(图2.1)

表2.1各时间点CE头节抗染计数及百分比

Tab 2.1 Count and percentage of echinococcus granulosus resistance at each time node

注:表中数据录入格式为 抗染头节数(抗染数占抽样总数百分比)

图2.1显微镜下CE头节伊红染色及头节活力曲线图

Fig 2.1 HE stain and Vitality curve of echinococcus granulosus

  • MSCs上清液在体外培养原头节对其Caspase-3酶活性的影响

高浓度MSCs上清液培养CE头节第6d-10d Caspase-3酶的活性值别为12.603±0.492、 14.723±0.287、1 &260±1.526;与对照组 Caspase-3 酶的活性值 18.131±0.669、23.711±1.652、 26.240±0.834对比有统计学差异(P<0.05)(表2.2)低浓度MSCs上清液培养CE头 节第 8d-10d Caspase-3 酶的活性值别为 18.514±1.340、20.940±0.882 与对照组 Caspase-3 酶的活性值23.711±1・652、26.240±0.834对比有统计学差异(P<0.05)。而高浓度与低 浓度组间对比无统计学差异。

表2.2各时间点Caspase-3酶活力值(元土S)

Tab 2.2 Caspase-3 enzyme activity value at each time node

2.2原头节Caspase-3酶的检测

Fig 2.2 Detection of Caspase-3 enzyme of echinococcus granulosus

  • MSCs培养细粒头节与对照组电镜标本的差异性

从电镜图片观察,大体形态上同一时间节点高浓度组头节相较于对照组更加饱满, 对照组头节虫体出现皱缩及扁平情况。高浓度组头节的局部吸盘结构完整性高,而对照 组头节的吸盘周围结构出现破裂及支解情况。

高浓度组第8昌                                     高浓度组第8d

对照组第8d                                         对照组第闵

图2.3原头节电镜图片

Fig 2.3 Electron microscope picture of echinococcus granulosus

讨论

Discussion

细粒棘球蝴病一种世界范围广泛流行的人畜共患寄生虫病,在亚洲中部,我国西北 地区高发[同。根据2016年中国棘球蝴病抽样调查结果显示,我国受该病威胁人数高达 千万,患病人数多至100多万Hl,西北地区多个省市(自治区)人群细粒棘球坳检出率 为0.4%,患者的伤残损失寿命年为1.64年,损失对当地人民的健康及畜牧业的发展存 在巨大危害[20】。

细粒棘球蝴病目前的有效治疗手段仍以手术为主0],药物为辅的治疗方式。药物治 疗以苯并咪卩坐类药物为首,其主要作用机理为使寄生棘球蝴无法对葡萄糖进行吸收利用 产生能量,导致虫体能量物质耗尽并抑制延胡索酸还原酶,阻碍ATP的生成过程,能量 的缺失使虫体无法存活S23]。由于新的有效药物研发的长期停滞,原有药物的新型剂型 提供了更加有效的疗效,如乳型、脂质体等,经疗效评价及临床研究显示,脂质体的疗 效及安全性明显高于片剂0,25]。有效药物研制困难与细粒棘球坳病制病性与免疫逃逸性 有密不可分的关系,其中细粒棘球蝴已被证实在人类脏器中可形成两层纤维囊壁(外层 纤维囊壁及包虫外膜)a】,纤维囊壁的形成过程会使得宿主机体的免疫反应发生某些病 理性的改变,在此过程中抑制机体免疫,并且躲避免疫细胞的攻击[27】。近年来,为研制 新的细粒棘球坳病治疗药物及方案,多种药物及试剂被用以体外培养研究抑制细粒头节 的活性,如Smad蛋白抑制剂对体外培养头节的杀伤作用联],或去氢骆驼蓬碱对细粒造 模小鼠血液中逃逸相关因子Thl/Th2的影响[29]。本实验已证实MSCs对于CE头节的活 性有促进作用,可为细粒棘球绦虫头节体外培养提供一种新的条件,或为细粒棘球感染 的造模工作提供帮助。

间充质干细胞(MSCs)是一种成体的多能干细胞,有着强大的自我更新复制能力 和多分化潜能,是干细胞家族的重要成员,在不同的适宜环境下,不仅可分化为中胚层 组织骨骼、脂肪、软骨等细胞,还可以跨胚层横向分化各种组织细胞㈤-辺,例如神经细 胞、内皮细胞、成纤维细胞等⑴】。随着科技的发展和再生医学研究的深入,干细胞基因 修饰成为许多临床疾病新的研究方向,由于间充质干细胞的低免疫原性“均和组织修复 能力,使其成为了基因修饰的重要种子细胞,而间充质干细胞的归巢特性也是目的基因 移植的重要因素。干细胞归巢是指自身或者外源性的干细胞在体内多种因素的调控参与 下,通过机体循环系统具有趋向性的迁移,穿过血管内皮细胞到达靶组织,定制并存活 的特性[殉。间充质干细胞表面有着众多趋化因子和生长因子受体,其归巢过程由多种趋 化因子、黏附因子、生长因子和酶等多种配体及其受体共同参与"39]。而其中当前研究 最多的是基质细胞衍生因子1、CXC趋化因子受体、肝细胞生长因子(HGF)及其受体离 散因子受体c-met(HGF/c-met)>单核细胞趋化蛋白(MCP)、CC趋化因子受体(CCR)、黏 附因子等㈤]。而其中CC趋化因子家族和CXC趋化因子家族在肝损伤纤维化中的重要 趋化因子。已有生物实验证明,在早期肝损伤的过程中,骨髓间充质干细胞(BMSCs) 会趋化募集至肝损伤部位,主要位于汇管区的纤维间隔附近,促进肝纤维化的形成,修 复干细胞的损伤,改善肝功能⑷]。而在干细粒棘球病发病过程中,棘球坳包囊会不断增 殖挤压周围组织,而导致肝纤维化©J间充质干细胞与细粒棘球蝴在肝组织内相互作用 并产生影响,本课题组前期己有实验证明,细粒头节可促进间充质干细胞的增值、纤维 化及钙化,而本实验也表明间充质干细胞上清液对于细粒头节的活性存在维持作用,不 同浓度的上清液对头节的影响无明显差异,考虑可能为浓度梯度过小所致。两者相互作 用并存在着互相促进增值或滋养的关系,这一结论实际也印证了疾病的临床发展过程。 而两者相互影响的具体机制目前尚未明确,对于间充质干细胞影响头节活性机制的深入 研究可能为细粒棘球呦病的治疗提供一种新的思路。

结论

Conclusion

间充质干细胞(MSCs)上清液能有效维持体外培养的细粒棘球绦虫原头节的活性。

参考文献

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文献综述

Review

间充质干细胞归巢的研究进展

邹海亮(综述)          吴向未(审校)

随着再生医学的迅速发展,间充质干细胞(MSCs)因为其自我复制、分化及归巢 特性,使其成为再生医疗的重要研究对象,而具体关于MSCs归巢的机制目前仍不能完 全明确,归巢的过程也受到多种多样因素的调节。虽然MSCs的在再生医学方面有着诸 多优点及适宜性,但归巢效率的不足仍是棘手问题,要想提高归巢效率,对其机制的充 分了解是提出解决办法的前提,本文简单对MSCs的归巢机制及效率提升方法进行描述, 以期为再生医学的发展提供参考依据。

间充质干细胞(MSCs)是一种多功能的成体干细胞,具有干细胞的所有共性,有 着强大的自我复制更新及横向纵向分化能2】。国际细胞治疗协会(ISCT)为鉴定间充 质干细胞设立了几个定义标准⑶:1.在标准培养条件下为贴壁细胞;2.具有关键表面标志 分子,包括:CD29、CD44、CD73、CD 105和CD146; 3.不具有如下的造血细胞表面标 志分子:CD34、CD45、CD14、CDllb, CD79 ci , CD19 和 HLA・DR; 4.具有经典的三 系分化能力,可在体外分化成成骨细胞(Osteoblast)、脂肪细胞(adipocyte)、软骨细 胞(chondrocyte)、肌细胞(myocyte)和其它结缔组织,神经细胞的分化能力尚存争议。 虽然从任何组织中提取的MSCs都必须符合这些最基本的标准,但从不同组织中分离出 来的MSCs的转录谱却往往存在较大的差异性⑷。事实上,MSCs不是单单指某一类干 细胞群体,国际细胞治疗协会所定义的标准更倾向于将MSCs定义为一种具有祖细胞、 分化细胞、多能干细胞的非克隆混合体⑸。由于这一情况,我们其实可以将间充质干细 胞叫做间充质基质细胞,这一命名可以充分体现其异质性,而实际情况中这些术语是可 以相互替代使用的。

尽管对于间充质干细胞的鉴别及定义有着诸多的难以确定及争议,但这丝毫不影响 其在再生医学中的受关注程度。当身体组织受损时,间充质干细胞会被自然释放至周身 循环血管中,定向迁移至损伤部位,分泌相关细胞因子,稳定局部环境,创造组织再生 ©I这一干细胞特性称为干细胞的归巢,干细胞归巢是指内源性或外源性的MSCs在多 种因素的共同作用下,能具有趋化性的转移,到达目的组织后,能够跨越血管内皮,定 植在目的组织的过程罔。骨髓间充质干细胞到达目的组织后,分泌多种细胞因子,具有 强大的免疫调节、血管生成和抗凋亡作用旳0],由于MSCs与血管内皮细胞具有相似性, 更加利于MSCs的迁移与定植。而组织修复的效果与MSCs的归巢效率有着直接联系, 提升MSCs的数量及浓度可提高归巢效率,但短期内获得大量高纯度的MSCs仍是一个 难题,所以归巢机制的深入探究或许能成为提高归巢效率的突破口。

间充质干细胞归巢的过程大致分为几部分,分别是粘附/滚动、激活、逮捕、变形、 迁移[11]。而在各个步骤中,将有不同的配体及受体、细胞因子共同参与并调控这一过程。 MSCs表达的CD44与内皮细胞分泌的选择素相结合,促使了 MSCs从血管层流中向边 缘滚动的过程,并加强了 MSCs的粘附性DI也有一些实验表明,缺少P■选择蛋白的生 物模型体内,MSCs向血管壁滚动的行为明显减少,也有类似实验表明VLA-4/VCAM 信号通路轴在MSCs的归巢中扮演重要角色,VLA-4除了一方面可以调控间充质干细 胞归巢第一步黏附过程,另外也参与归巢其他步骤如捕获、滚动等,是间充质干细胞完 成归巢过程的重要成分[GE。炎症反应是MSCs激活的首要条件,G蛋白欧联趋化因子 受体会接受炎症因子的刺激并激活粘附的MSCso有实验证明,暴露于射线后的小鼠接 受MSCs的移植,成功率大大提高[⑹。由于SDF-1相较于其他配体有着更强的趋化能力, 所以SDF-1/CXCR4轴成为了目前研究的热点,其主要功能为调节前体细胞的趋化,移 植能力Hl早年也有一些报导称MSCs不表达CXCR4阴,猜测可能有其他的受体参与 归巢过程,近年来有新的报导已证实MSCs可表达CXCR7,其余SDF-1结合同样参与并 促进MSCs的归巢过程a】。心肌修复过程中也有其他趋化因子及受体的组合参与MSCs 的归巢。例如MCP-KMCP-3/CCR-2的相互作用使得心肌损伤后可招募相应受体CCR-2 的MSCs归巢,参与心肌炎症的修复〔20-21]。除此以为,骨髓间充质干细胞还可表达多种 其他受体,包括 CCR1、CCR4、CCR7、CCR9、CCR10、CXCR5 禾口 CXCR6Q-23]。在酉己 体与受体相结合后,细胞表面构象会因此发生改变,并与整合素有着更好的亲和力,而 整合素在细胞逮捕过程中起到关键性的作用[24-25]。MSCs激活后,有MSCs表达的 VLA-4(整合素a4bl)与内皮细胞上的VCAM-1受体相结合必勺。此后,骨髓间充质干细 胞会分泌基质金属蛋白酶(MMPs)破坏血内内皮基底膜[27],以此来跨越内皮细胞层及基 底膜。有实验证明MMP2的敲除使得外源性的MSCs迁移数量明显减少联]。其实对于 MSCs变形迁移至血管外的过程机制并不清楚,大部分研究都将其类比为白细胞向血管 外组织迁移的过程[29]。而MSCs迁移出血管后需到达损伤的组织部位,这一步骤受到受 损组织释放的多种趋化因子所调控,例如生长因子・AB、胰岛素样生长因子(IGF-1)、 趋化因子 RANTES、MDC 和 SDF-l^o

外源性的MSCs植入途径也是多样性的,有动静脉移植、心脏内移植和针对局部注 射移植。每种移植方法都有各自的优缺点,例如静脉注射可能会导致肺部毛细静脉血管 的阻塞,使移植的干细胞无法顺利到达末端肺组织;动脉注射操作难度较大,创伤大; 局部注射相对于移植率较高9小]。像肝素类的抗血凝剂和血管扩张剂,可减少移植MSCs 在肺静脉中的阻塞,使归巢至肺部的MSCs效率提高卩4]。其实归巢过程的调控取决于特 定细胞因子的相互作用,有时归巢效率的低下可能是MSCs表达的细胞因子(如CXCR4) 过低[均。有时由体外MSCs细胞系培养扩增所获得的MSCs,经过多次传代后也也会导 致表达因子的降低3】。其实虽然我们治疗疾病的依据是MSCs的归巢,但实际上归巢的 MSCs由于上述多种原因及机制的不明而导致归巢效率并不高,本着为治疗疾病的思想, 可以省略MSCs归巢的前一些步骤,直接将外源性MSCs注射至目的组织中或附近,这 样可避免出现归巢途中因各种原因丢失的MSCs,就像治疗肺部疾病就可使用纤维支气 管镜等设备注射MSCs,心肌内主色MSCs以治疗心脏病,门静脉注射MSCs以治疗肝 脏疾病等。如有实验证明相同大鼠模型。由门静脉注射途径的移植率明显高于尾静脉注 射的移植率el然而也不是所有的局部注射就能产生更好的疗效[涸。近年来,由于基因 研究的深入,经过基因修饰的MSCs,具有干细胞治疗及基因治疗双重优势,也逐渐成 为生物治疗的研究热点,转染后的MSCs可提高MSCs的归巢率也成为了一种优化手段。 Chen等㈤]实验研究证明,经过转染SDF-1/HOXB4的重组MSCs的造血功能和其迁移能 力都明显高于小鼠体内的自身的造血干细胞。但与其他类型基因治疗一样,这些方法都 存在着固有安全性的问题,基因的修改可能导致出现无限制生长,类肿瘤基因的出现。 而且基因传染本身也是一项昂贵的技术。也有研究尝试在干细胞表面配体上进行优化, 例如Won等人将CXCR4与DMPE-PEG结合,DMPE-PEG是一种组成细胞膜关键结构 的磷脂,结合后的MSC能够更好地向SDF-1迁移Ho】。还有研究合成了一种双特异性抗 体,该抗体一端识别MSCs表达的CD90,另一端识别缺血心肌表达的MLCHi],这种设 计的新颖之处在于改变了原有的结合方式,但还没有应用于临床试验。也有实验显示目 的组织放射暴露后,MSCs的移植率会大大提高H2],就如同前面所提及的小鼠放射实验 a],具体原理可能是因为放射导致了 SDF-1表达上调,促进了 MSCs归巢中的激活步骤, 提高了其归巢效率。当然,这种方法可能并不适合临床应用,毕竟放射暴露对人类本身 健康存在危害。不过由此再次充分说明了 MSCs归巢收到多因素的调控,改变其过程中 任一条件,就可能对归巢效率产生影响。

尽管MSCs归巢的研究道路上困难不断,但对于MSCs的研究依旧是当下热点, 对于其机制的深入探究成果可能成为再生医学发展上重要的里程碑。目前MSCs已有部 分异体MSCs用于治疗临床疾病,如心肌疾病及消化道肛痿疾病H3-44],并且疗效优良。 然而目前MSCs归巢机制仍有很多不明确性,尤其在MSCs跨越血管及迁移过程的中机 制更是不清楚,只能类比白细胞的炎症趋化作用等。任一归巢阶段机制的明确就可能会 直接给归巢效率带来质的提升。当然,除了 MSCs归巢中所遇到的苦难,外源性MSCs 的来源及纯度问题也有待解决,过度自我更新复制会使MSCs干性的降低或消失。也有 学者的研究表明表明,MSCs实际上可能由于与人HLA不匹配而发生移植免疫排斥反 应[45-46],还有可能会存在理论知识与临床应用或与道德伦理问题冲突的情况出现。总之 医学研究者们在MSCs细胞疗法的过程中还有很多的问题、很长的路要走,找到问题的 根源,面对并解决问题才是关键所在。

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