TSP-1、SuFu, GLI1在涎腺黏液表皮样癌中的表达及在Hedgehog通路中作用的探讨论文

2020年11月2日10:50:37TSP-1、SuFu, GLI1在涎腺黏液表皮样癌中的表达及在Hedgehog通路中作用的探讨论文已关闭评论

TSP-1、SuFu, GLI1在涎腺黏液表皮样癌中的表达及在Hedgehog通路中作用的探讨论文
中文摘要

目的:1.探讨血小板反应蛋白・1 (thrombospondin-1, TSP-1)及Hedgehog信号通路 (hedgehog signaling pathway, Hh) Fu抑制子(SuFu)、胶质瘤相关癌基因家族锌指 转录因子1 (GLI1)在涎腺黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma, MEC)中表 达及临床意义;2探索TSP-1对黏液表皮样癌Hh信号通路关键基因SuFu、GLI1的 潜在影响。

方法:1.选取2010-2019年遂宁市中心医院口腔颌面外科手术切除的涎腺MEC组织 石蜡切块52例和正常涎腺组织10例,分为实验组(黏液表皮样癌52例)和对照组

(正常涎腺10例)通过苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色复查病理结果; 通过免疫组织化学染色法检测MEC和正常涎腺组织标本中SuFu、GLI1、TSP-1蛋白 表达情况,并分析三者与MEC组织临床、影像及病理特征之间的关系;2.选取黏液 表皮样癌MC-3细胞系(空军军医大学口腔生物学教研室建立并提供)作为研究对象, 将细胞分为空白对照组、TSP-1作用组、TSP-1+CD36阻断组,通过免疫荧光检测、 荧光光密度值测定(Image J软件)分析等方法探究TSP-1在黏液表皮样癌细胞分化 增殖过程中对Hh通路关键基因SuFu、GLI1的蛋白表达影响;3.计数资料采用卡方 检验、Fisher确切概率法;计量资料米用均数士标准差表示,多组之间的比较米用多样 本均数的单因素方差分析,两组之间的比较采用独立样本的t检验;P<0.05为差异具 有统计学意义。

结果:1.MEC 组 TSP・l、SuFu、GLIl 蛋白阳性表达率为 63.5%(33/52)、51.9%(2刀52)、 57.7% (30/52),正常涎腺组TSP・1、SuFu、GLI1蛋白阳性表达率均为10% (1/10), 实验组与对照组蛋白阳性表达率差异具有统计学意义(尸<0.05) ; 2.TSP-1在高、中、 低分化MEC中的阳性表达率依次降低,在高、低分化MEC中蛋白表达率的差异具 有统计学意义(尸<0.05) ; SuFu在高、中、低分化MEC中的阳性表达率呈依次升高, 在高、低分化MEC中蛋白表达率的差异具有统计学意义(尸<0.05);同时,GLI1 在高、中、低分化MEC中的阳性表达率也依次明显的增高,在高、低分化MEC中 蛋白表达率差异具有统计学意义(P<0.05) ; 3.TSP-1蛋白的表达水平与MEC肿瘤 CT(computed tomography, CT)直径差异和颈部淋巴结转移与否有密切关系(P<0.05), 而与吸烟、饮酒、年龄、部位、临床分期、临床直径、原复发等临床特征无密切关系

(P>0.05) ; SuFu蛋白的表达水平与MEC肿瘤CT直径差异、颈部淋巴结转移与否 等临床特征有密切关系(尸<0.05),而与吸烟、饮酒、年龄、部位、临床分期、临床 直径等无关(P>0.05) ; GLI1的表达水平与MEC肿瘤CT直径差异和颈部淋巴结转 移与否有密切关系(尸<0.05),而与吸烟、饮酒、年龄、部位、临床分期、临床直径、 原复发等因素无关(尸>0.05) ; 4.空白对照组中GLI1、SuFu蛋白表达的平均光密度 值最高,TSP-1蛋白作用组平均光密度值最低,TSP-1+CD36阻断组平均光密度值介 于两者之间,三组间SuFu、GLIl蛋白的平均光密度值差异具有统计学意义(P<0.05); TSP・1作用组与空白对照组蛋白表达差异具有统计学意义(PV0.05) , TSP-1作用组 与TSP-1+CD36阻断组蛋白表达差异具有统计学意义(尸<0.05)。

结论:在MEC中,TSP-1蛋白可能通过受体CD36抑制SuFu、GLI1的蛋白表达来 影响Hh信号通路的异常活化强度,进而抑制MEC的发生发展,而TSP-1蛋白通过 与CD36受体结合,影响SuFu和GLI1的上游Hh信号通路启动配体SHH的表达活 性可能是抑制MEC的关键所在,但具体机制还有待于进一步研究。

关键词:血小板反应蛋白Fu抑制子;胶质瘤相关癌基因家族锌指转录因子1; 黏液表皮样癌;Hedgehog信号通路

Abstract

Objective l.To investigate the role of thrombospondin-1 (TSP-1) and hedgehog signaling pathway (Hh) in mucoepidermoid carcinoma of salivary gland; 2.To explore the potential effect of TSP-1 on the key genes Sufu and GLI1 of the Hedgehog signaling pathway in mucoepidermoid carcinoma.

Methods 1 .From 2010 to 2019, 52 cases of mucoepidermoid carcinoma and 10 cases of normal salivary gland were divided into experimental group (52 cases of mucoepidermoid carcinoma) and control group (10 cases of normal salivary gland). The pathological results were reexamined by hematoxylin and eosin (HE) staining; the expression of SuFu, GLI1 and TSP-1 protein in mucoepidermoid carcinoma and normal salivary gland were detected by immunohistochemical staining, and the relationship between the three proteins and the clinical, imaging and pathological characteristics of mucoepidermoid carcinoma was analyzed; 2.The mucoepidermoid carcinoma MC-3 cell line (oral cavity of Air Force Military Medical University) was selected Biology teaching and research office established and provided) as the research object, the cells were divided into blank control group, TSP-1 action group, TSP-1+CD36 blocking group, and the effects of TSP-1 on the protein expression of the key genes Sufu and GLI1 in the process of differentiation and proliferation of mucoepidermoid carcinoma cells were studied by immunofluorescence detection and fluorescence densitometry(Image J); 3.Chi square test and Fisher exact probability method were used for the counting data; and mean 士 standard deviation was used for the measurement data; multiple sample mean single factor ANOVA was used for the comparison between multiple groups, and independent sample t-test was used for the comparison between the two groups; P < 0.05 was statistically significant.

Results l.In MEC group, the positive rates of TSP-1, Sufu and GLI1 were 63.5% (33/ 52), 51.9% (27/52), 57.7% (30/52), the positive expression rate of TSP-1, Sufu and GLI1 protein in normal salivary gland group was 10% (1/10), the difference between the experimental group and the control group was statistically significant (P<0.05); 2.the positive expression rate of TSP-1 in high, medium and low differentiated MEC decreased in turn, the difference between high and low differentiated MEC was statistically significant (P<0.05); The positive expression rate of Sufu in high, medium and low differentiated MEC increased in turn, and the difference of protein expression rate in high and low differentiated MEC was statistically significant (P<0.05); At the same time, the positive expression rate of GLI1 in high, medium and low differentiated MEC was also significantly higher, and the difference between high and low differentiated MEC was statistically significant (P<0.05); 3.The expression level of TSP-1 protein was closely related to the difference of MEC tumor CT(Computed Tomography, CT)diameter and neck lymph node metastasis (P<0.05), but not to smoking, drinking, age, location, clinical stage, clinical diameter, primary and recurrence and other clinical characteristics (P>0.05); the expression level of Sufu protein was closely related to MEC tumor CT diameter and neck lymph node metastasis (P<0.05);but not to smoking, drinking, age, location, clinical stage, clinical diameter, primary and recurrence and other clinical characteristics(T>0.05); The expression level of GLI1 was closely related to the difference of MEC tumor CT diameter and cervical lymph node metastasis (P<0.05), but not to the factors of smoking, drinking, age, position, clinical stage, clinical diameter and primary and recurrence (P>0.05); 4.In the blank control group, the average optical density value of GLI1 and Sufu protein expression was the highest, the average optical density value of TSP-1 protein group was the lowest, the average optical density value of TSP-1+CD36 blocking group was between the two, the difference of the average optical density value of Sufu and GLI1 protein between the three groups was statistically significant (P<0.05); the difference of protein expression between TSP-1 group and blank control group was statistically significant (P<0.05) ; The difference of protein expression between TSP-1 group and TSP-1 + CD36 blocking group was statistically significant (P<0.05).

Conclusion In mucoepidermoid carcinoma, TSP-1 protein may affect the abnormal activation intensity of hedgehog signaling pathway by inhibiting the protein expression of Sufu and GLI1 through receptor CD36, thus inhibiting the occurrence and development of mucoepidermoid carcinoma. However, by binding with CD36 receptor, TSP-1 protein may affect the expression activity of SHH, the upstream hedgehog signaling pathway promoter of Sufu and GLI1, which may inhibit mucoepidermoid carcinoma The key point is, but the specific mechanism needs further study.

Key Words TSP-1 ;SuFu;GLIl ;MEC;Hedgehog signaling pathway

黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma, MEC)由黏液细胞、中间细胞和表 皮样细胞所组成,是口腔颌面部最常见的涎腺上皮恶性肿瘤,发病率约占涎腺恶性肿 瘤的30%・40%⑴。由于MEC中不同类型细胞所占比例及形成的结构不同,将MEC 分成高、中、低分化三种组织学类型,根据分化及恶性程度不同,采取的治疗方式也 有所不同,目前最有效的治疗方法是以手术切除为主,但低分化(高度恶性)MEC 由于生长迅速,远处转移率高,手术难以彻底清除肿瘤,以至于患者的预后较差2叫 并且由于肿瘤位于颌面部唾液腺体组织内,术前组织学病理诊断主要依靠穿刺针吸, 组织量获得有限,以至于常规病理组织学分型诊断困难。因此,寻找准确诊断标志物 和新的治疗方法对改善MEC治疗效果具有重要的临床意义。

Hedgehog信号通路(hedgehog signaling pathway, Hh)在胚胎发育、细胞增殖分 化中起着重要的调节作用,是一种高度保守的从细胞膜到细胞核的信号传导途径⑷。 Hh信号通路在胚胎发育中调节许多过程,如口腔黏膜⑸、牙齿⑹、唾液腺“]等的形 成及分化。Hh信号通路组成部分包括HH配体[又包括Sonic Hedgehog (SHH)、 Indian Hedgehog (IHH)、Desert Hedgehog (DHH) ]、Patched (PTCHK PTCH2)受 体、Smoothened (SMO)蛋白、胶质瘤相关癌基因家族锌指转录因子(GLIl、GLI2、 GLI3)、Fu抑制子(SuFu) >运动蛋白KIF7、蛋白激酶A等⑼。其中,GLI1作为正性 调节因子,正向调控Hh信号通路,与各种肿瘤信号通路相互交通问。SuFu通常称 为肿瘤抑制因子nig,但是相关研究显示SuFu是Hh信号通路最大激活所必须的问, SuFu蛋白在活跃的Hh信号通路中表达水平显著增高网。研究显示SuFu蛋白对口腔 上皮异常增生起到促进作用⑹,而且在乳腺癌Q]、宫颈鳞癌[16]等研究中显示SuFu在 肿瘤发生发展中也起着积极作用。SufU通常与Hh信号通路转录激活因子GLI1结合, 以防止其启动Hh信号通路靶基因的转录"I。SuFu蛋白包含C端和N端两个结构域, 约500个氨基酸组成,其C端和N端可以和GLI的C端和N端相互作用。当缺乏 SHH配体时,SuFu阻断Hh信号传导;而在有SHH配体时,SuFu与GLI1蛋白分离, 从而促进GLI1活化并促使GLI1转移到细胞核,进而促进Hh信号传导[缎。因此, SuFu不仅正向调控Hh信号通路,提高GLI1的细胞核转运和稳定性,提高Hh通路 的活性,而且也能抑制Hh信号通路[⑶。在正常组织中,当缺乏SHH配体表达的情 况时,PTCH1抑制SMO的活性,Hh信号通路处于关闭状态;而在SHH配体高表达 的情况下,SHH与PTCH1结合,解除对SMO的抑制,Hh信号通路处于异常激活状 态。从而促进多个靶基因的转录,包括控制细胞周期、细胞迁移、血管生成和凋亡的 靶基因a】。近年来,Hh信号通路的异常激活与肿瘤的发生、迁徙、转移和肿瘤血管 生成密切相关,痣样基底细胞癌综合症㈤】、口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)㈤、肺癌4、胃癌㈡]等肿瘤都存在Hh信号通路异常激活状态。 尽管Hh信号通路参与了多种恶性肿瘤的发病,但目前还未见有关于Hh信号通路在 MEC中的调节影响报道。

血小板反应蛋白(thrombospondin-1, TSP-1)是一种分子量为450KDa多功能 的聚糖蛋白,是一种天然的抗血管生成因子,具有很强的抗血管生成能力,在多种细 胞中表达0]。同时也是一种有效的肿瘤抑制剂©I。CD36和CD47为TSP-1的主要受 体,在TSP-1诱导的血管生成障碍中显示出不同的作用Bl。TSP-1的抗肿瘤机制包括 通过CD36抗肿瘤血管生成来诱导细胞凋亡,潜在转化生长因子■卩(transforming growth factor P,TGF-P)激活和抑制基质金属蛋白酶・9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的激活等0]。也有研究结果证实CD36和CD47都参与介导TSP-1在破骨细 胞中的作用[26]。此外,有证据表明,TSP-1可能通过其受体CD36在Hh信号通路的 调节中发生相关作用,但具体机制尚未完全阐明0]。而且,我们研究小组前期发现 TSP-1在MEC中可能对Hh信号通路相关蛋白SHH产生影响,但具体机制不清旳。 并且,目前还没有证据表明TSP-1在MEC中对Hh信号相关蛋白SuFu、GLI1的影 响。

GLI1作为Hh信号通路正性调节因子,正向调控Hh信号通路oGLIl是一种C2-H2 型锌指转录因子,包含5个锌指(zinc finger, ZF)结构域。其中ZF4和ZF5与DNA 序列5,-GACCCA-3,特异性结合,而ZF1-3则与磷酸骨架相互作用问。由于GLI1不 具有N■末端阻遏结构域,它仅作为Hh信号通路的激活物发挥作用[I*】。GLI1是Hh 信号通路最有效的激活因子,在肿瘤发生中起关键作用,GLI1已被公认为是抑制Hh 通路最有效的靶点岡。GLI1也是一种参与不同癌症发展的转录调节因子,GLI1可以 作为Hh信号激活的分子标志,在与Hh信号通路相关的肿瘤诊断中起着重要作用。 相关证据表明,直接抑制GLI1蛋白与其他化疗药物结合,是治疗不同恶性肿瘤的一 种有效的策略。在肺癌[29】、胶质瘤凶、髓母细胞瘤卩1]等均有发现抑制GLI1的转录活 性来抑制Hh信号通路。

因此,根据TSP-1以及Hh信号通路相关蛋白SuFu、GLI1参与癌症的证据,同 时,根据TSP-1在Hh信号通路中的可能调节情况。我们进行了一项研究,以阐明 TSP-1及Hh信号通路相关蛋白SuFu、GLI1在MEC发生发展中的可能作用,并同时 阐明TSP-1对Hh信号通路的影响以及TSP-K SuFu、GLI1三者的可能关系。本研究 中,我们分析了 TSP-1及Hh信号通路相关蛋白SuFu、GLI1的表达与患者临床、影 像及病理特征的关系,以及TSP-1在MEC中对Hh信号通路关键基因SuFu、GLI1 的蛋白表达影响及相互关系。

1材料

1.1纳入标准

选取2010-2019年遂宁市中心医院口腔颌面外科手术切除的涎腺MEC组织石蜡 切块52例(实验组)。MEC纳入标准为:(1)未行放化疗等抗肿瘤治疗或其它治 疗;(2)未发现远处转移征象;(3)行唾液腺及MEC切除手术且手术成功;(4) 组织病理学结果为MEC; (5)原发灶蜡块完整保存。正常涎腺10例(对照组)纳 入标准为:组织病理学结果为正常涎腺组织。

1.2排除标准

MEC排除标准为:(1)已行放化疗等抗肿瘤治疗或其它治疗;(2)检查发现 有远处转移征象;(3)组织病理学结果不是MEC; (4)原发灶蜡块已破损。

正常涎腺排除标准:组织病理学结果存在炎性或外伤已破损或存在MEC组织。

1.3 一般临床资料

符合入选条件的52例患者中,男性22例,女性30例,年龄为12・80岁,平均 年龄为53岁;其中高分化组22例,中分化组17例,低分化组13例。本研究所选病 例已通过遂宁市中心医院伦理委员会审查。

正常对照组:取10例正常涎腺作为对照组,分别来自组织病理学证实无颈淋巴 结转移的颈清扫腮腺下极组织,或取自舌下腺囊肿患者经病理证实为正常的舌下腺组 织,或取自于外伤的小涎腺正常腺体组织。

2方法

2.1主要试剂

(1) 浓缩型兔抗人多克隆TSP-1抗体(杭州华安生物技术有限公司,中国)

(2) 浓缩型兔抗人单克隆GLI1抗体(杭州华安生物技术有限公司,中国)

(3) 浓缩型兔抗人单克隆SuFu抗体(杭州华安生物技术有限公司,中国)

(4) 磷酸盐缓冲液 PBS (phosphate buffer saline, PBS) (0.01M, PH7.4〜7.6,福州 迈新公司,中国)

(5) 柠檬酸组织抗原修复液(0.01M, PH6.0±0.1,福州迈新公司,中国)

(6) 羊抗兔IgG、HRP (杭州华安生物技术有限公司,中国)

(7) 红色(罗丹明标记)荧光二抗(杭州华安生物技术有限公司,中国)

(8) 绿色(FITC标记)荧光二抗(杭州华安生物技术有限公司,中国)

(9) DAB免疫组化检测试剂盒(兔/小鼠通用型)(武汉赛维尔生物科技有限公司, 中国)

(10) 封闭液:浓缩型正常山羊血清(博士德生物工程有限公司,中国)

(11) 苏木素-依红染色液(成都瑞琦科技实业股份有限公司,中国)

(12) 重组人TSP-1蛋白(R&D公司,美国)

(13) CD36抑制剂琥珀酸磺酯(杭州华安生物技术有限公司,中国)

(14) RPIM-1640 培养基(Hyclone,美国)

(15) 胎牛血清(FBS) (Hyclone,美国)

(16) 胰蛋白酶(上海生化试剂厂)

(17) 二甲基亚砚(DMSO)(上海生工)

  • 5%TritonX-100 (杭州华安生物技术有限公司,中国)
  • DAPI (杭州华安生物技术有限公司,中国)

2.2主要仪器

(1)病理组织切片机 德国 LEICARM2245
(2)病理组织漂烘仪 国产PHYIII型
(3)光学显微镜 日产 OLYMPUS
(4)荧光显微镜 日产 OLYMPUS
(5)数码显微照相系统 日产 OLYMPUS
(6)低速离心机 国产 LC-4012
(7)双功能气浴恒温振荡器 国产ZD-85
(8)微波炉 国产美的
(9)医用冷藏冷冻箱 国产海尔
(10)二氧化碳培养箱 美国Thermo
(11)恒温水域箱 国产 HH-W420
(12)生物安全柜 国产 HFsafe-1500LCB2
(13)移液枪 德国 eppendorf
(14)液氮罐 国产 YDS-30-125
2.3组织实验  
2.3.1 HE 染色  

HE染色具体步骤如下:

  • 切片制备:将蜡块制成3・4um厚度连续切片,放置于60°C漂烘仪中烤热60min。
  • 脱蜡、水化:从漂烘仪中取出切片架,然后放入二甲苯脱蜡两次,各20min, 依次按100%、100%、95%、80%、70%浓度乙醇水化,均浸泡5mim水化完成后蒸 憾水冲洗5mino
  • 苏木素处理切片2min,蒸馆水轻柔冲洗切片5min,除去多余的苏木素。
  • 1%盐酸酒精分化10S,自来水轻柔冲洗切片返蓝5min,蒸馆水洗lmin。
  • 伊红染色处理3min,蒸馆水轻柔冲洗30S。
  • 脱水:依次按70%、80%、95%、100%、100%浓度乙醇脱水,分别为5mino
  • 微波炉中100°C条件下烤片lmin,中性树胶封片。

2.3.2免疫组织化学染色

免疫组织化学染色法具体步骤如下:

  • 切片制备:将蜡块制成3-4um厚度连续切片,放置于60°C漂烘仪中烤热300mino
  • 脱蜡、水化:从漂烘仪中取出切片架,然后放入而二甲苯中脱蜡2次,分别为 20min,依次按100%、100%、95%、80%、70%浓度乙醇水化,分别浸泡5min,随 后用蒸馆水轻柔冲洗5minoPBST处理3次,分别为5mino
  • 抗原修复:将适量柠檬酸抗原修复液倒入合适的容器中,随后将切片架放入容 器中(以修复液足以淹没组织为准)。在脱蜡水化过程中同时在微波炉中100°C条件 下将柠檬酸修复液加热至沸腾(约lOmin),此时快速加入组织切片。然后在80°C条 件下加热30min,此过程注意要预防干片。随后取出容器,放置于水中自然冷却至室 温。
  • 内源性过氧化物酶活性阻断:将组织切片架放入3%过氧化氢溶液的试剂盒中(过 氧化氢能淹没组织为准),避光条件下孵育lOmino随后PBST处理3次,分别为5mino
  • 非特异性抗原封闭:用滤纸吸干组织四周的水分,随后在切片上用组化笔画出 组织的范围,在所画范围内滴加稀释山羊血清(10%浓度)lOOul,放入湿盒,室温条 件下孵育30minoPBST处理3次,分别为5min。
  • 确定一抗的稀释比:切取已知阳性表达的组织切片,按标准的免疫组织化学染 色法,分别对SuFu、GLI1、TSP-1 -抗进行稀释比检测,以公司提供的阳性切片做 对照,对比分析结果。确定SuFu最佳稀释比1:100, GLI1最佳稀释比为1: 100,

TSP-1最佳稀释比为1: 100o

  • 加一抗:按上述最佳稀释比配制完成的SuFu、GLI1、TSP-1抗体滴加到所画圆 圈中静置3mino随后将湿盒轻缓水平放入4°C冰箱过夜,次日将湿盒取出,室温条件 下静置处理45minoPBST处理3次,分别为5min。
  • 加二抗:用滤纸吸干所画圆圈外的液体,向切片上滴加100ul二抗液(浓度为1:500),在湿盒内静置孵育30mino PBST处理3次,分别为5min。
  • 二氨基联苯胺(DAB)染色:向切片中加入100U1DAB染色液,并在显微镜下 观察30s至2min至一定程度棕黄色或棕褐色时终止染色,未显色者至2min终止染色。 PBST处理3次,分别为5mino
  • 用苏木素染液复染切片2min;1%盐酸酒精将其分化;然后继续用自来水轻柔 冲洗切片至返蓝。
  • 依次按70%、80%、95%、100%、100%浓度乙醇脱水,分别为5mino
  • 微波炉100°C条件下烤片lmin,中性树胶封片。

2.4细胞实验

2.4.1细胞复苏

  • 实验开始前提前准备好所需培养液体(胎牛血清+RPIM-1640)、双抗(青霉素 +链霉素)、PBS
  • 培养基配制(含20%FBS的1640+1%双抗)
  • 事先预热水域箱(37°C)
  • 事先在超净台上准备好培养瓶(25cn?)、离心管(15ml)
  • 把预热好的培养液体加入培养瓶内(25cnP)
  • 快速从液氮中取出冻存的黏液表皮样癌MC-3细胞系(空军军医大学口腔生物 学教研室建立并提供)
  • 放入37°C水域箱中融化(快速)
  • 在15ml离心管内加入lml培养液,待冻存管内的细胞融化后,将其吸入离心管
  • 离心 5min, 1500r/min
  • 弃去上层液体,用枪头吸入lml培养液于离心管内吹打均匀
  • 将吹打均匀的细胞移入事先准备好的培养基内
  • 显微镜下观察培养基内细胞悬浮饱满,拧松培养基瓶盖,轻缓放入孵箱孵育

(37°C, 5%CO2)

2.4.2细胞传代

  • 实验开始前准备好所需胰酶、培养基、PBS、15ml离心管、培养瓶、Timer、水 域箱提前预热培养基、PBS
  • 从孵箱中取出待传代的细胞,枪头弃去原培养基、PBS冲洗细胞(用枪头吸5ml)

后弃去PBS

  • 吸lml胰酶于培养瓶内,使之完全覆盖瓶底细胞,Timer计时2min, 2min时间 内不断水平摇晃培养瓶,并同时在显微镜下观察细胞消化状态,细胞大部分漂浮脱离 瓶底时快速加入完全培养基中止消化(操作要快速)
  • 之后用枪头吹打细胞、将细胞悬液吸入离心管后离心5min 1500r/min
  • 弃去上清,吸入2ml培养基吹匀细胞后,分别在两个培养基内加入各lml细胞 悬液(1:2传代)
  • 瓶壁消毒后放入孵箱中

2.4.3细胞冻存

  • 实验开始前准备好所需胰酶、培养基、PBS、15ml离心管、培养瓶、水 域箱提前预热培养基、PBS以及DMSO
  • 从孵箱中取出待冻存的细胞,枪头弃去原培养基、PBS (用枪头吸5ml)冲洗细 胞后弃去PBS
  • 吸lml胰酶于培养瓶内,使之完全覆盖瓶底细胞,Timer计时2min, 2min时间 内不断水平摇晃培养瓶,并同时在显微镜下观察细胞消化状态,细胞大部分漂浮脱离 瓶底时快速加入完全培养基中止消化(操作要快速)。
  • 之后用枪头吹打细胞、将细胞悬液吸入离心管后离心5min 1500r/min
  • 弃去上层培养基,PBS再次清洗细胞吹打均匀后再次离心5min 1500r/min
  • 细胞冻存液(1:9) (DMSO: FBS)将900ulFBS加入离心管中吹打均匀成细 胞悬液后加入冻存管中;将超净台灯关闭,避光操作,加入lOOul的DMSO于冻存 管内。将冻存的细胞放入冻存盒内于4°C冰箱30min, -20°C条件下放置2小时,・80°C 条件下过夜,最后放入液氮中存放。

2.4.4细胞爬片

  • 将盖玻片放置于浓硫酸中浸泡过夜,次日取出用自来水冲洗30遍,再放置于无 水酒精中浸泡6小时,取出用蒸馆水冲洗30遍,放入饭盒中烘干,取出后进行高压 消毒。
  • 高压消毒后,取出放入烘箱中烘干,随后放入超净台中。
  • 胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中,充分吹打后吸取少量培养基于计数 板中,计数。
  • 根据孔板调整盖玻片的大小,事先在每个孔里接近中央的位置滴加少量培养基

(约50ul),使玻片与培养皿相互之间靠培养基的粘合力粘在一起,防止后续加细胞 悬液时盖玻片漂起,造成双层爬片。

2.4.5细胞培养

  • 我们的早期研究,发现黏液表皮样癌细胞在体外研究中2xl04/ml的细胞接种浓 度,TSP-1在40ug/ml的浓度作用72小时对黏液表皮样癌细胞的生物学行为影响最 为明显[辺。因此,我们参考以上研究结果将细胞分成空白对照组、TSP-1蛋白作用组、 TSP-1+CD36阻断组,按照2xl04/ml作为细胞爬片的接种浓度接种于12孔板中,空 白对照组、TSP-1蛋白作用组、TSP-1+CD36阻断组各4个孔,待细胞贴壁后,空白 对照组不做任何处理,TSP-1蛋白作用组加入40ug/ml作用浓度重组人TSP-1蛋白, TSP-1+CD36阻断组加入40ug/ml作用浓度重组人TSP-1蛋白及CD36受体抑制剂琥 珀酸磺酯(浓度9ug/ml),然后分别加入相同剂量的培养基,轻缓放入孵箱培养细胞 72小时(此过程要避免干片),作用72小时后,检测三组中的SuFu和GLI1蛋白免 疫荧光表达情况。
  • 进行免疫荧光染色,荧光显微镜下分别采集空白对照组、TSP-1蛋白作用组、 TSP-1+CD36阻断组黏液表皮样癌细胞免疫荧光图片。

2.4.6细胞固定及免疫荧光

  • 对照组GLI1、SuFu免疫荧光染色方法:首先用预冷PBS液洗涤位于12孔板内 的细胞3x3min次;洗涤后用4%多聚甲醛固定细胞30min,再用PBS漂洗3x3min;加入5%TritonX-100室温通透30min, PBS漂洗细胞3x3min;漂洗后加入3%H2O2 孵育lOmin,然后用PBS漂洗细胞3x3min;加入10%的山羊血清封闭30min,吸水纸 吸干多余液体,不洗;滴加GLI1 (1: 100)或SuFu (1: 100)单克隆抗体4°C冰箱 孵育过夜,PBS漂洗3x3min;避光加入罗丹明荧光标记的羊抗兔IgG二抗(1: 200) 或FITC荧光标记的羊抗兔IgG二抗(1:200) , 37°C孵育30min后,PBS漂洗3x3min; 最后应用50-100ulDAPI进行胞核的荧光染色3min, PBS轻洗细胞3x3min,洗去多 余的DAPI;取出爬片,用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封 片;然后在荧光显微镜下激发红光或绿光及蓝光采集图片。
  • 实验组GLI1、SuFu免疫荧光染色方法:同对照组免疫荧光染色方法。

2.4.7结果判定

  • HE染色结果判定:按照WHO (2005)头颈部肿瘤分类标准进行第九版涎腺恶 性肿瘤分级及评价标准进行高、中、低分化区分昭。
  • 免疫组化结果判定:SuFu、GLI1、TSP-1主要表达于黏液表皮样癌细胞胞质中, 表现为棕黄色或棕褐色染色。每张切片选择无褶皱,无边缘效应,接近组织切片中央 位置的典型部位,随机在显微镜下(x400)选择5个视野进行细胞计数及评分,每个 视野细胞计数大于500个。并且分别计数5个视野中的阳性细胞数,算取阳性细胞的 表达率;阳性细胞表达率二邙日性细胞数/记数细胞总数)xlOO%,取平均值。参照周 雪琴等人的方法计分0],按阳性细胞表达率计分:1%〜25%=1分,25〜50%=2分, 50〜75%=3分,75〜100%=4分;根据组织有无染色和染色深浅程度(以组织绝大多 数阳性细胞的染色为准)评分:未见染色=0分,轻度或离散染色=1分,中度染色=2 分,重度染色=3分。根据组织染色程度及阳性细胞表达率进行评分,每张切片的记 分二染色程度(0〜3分)x阳性细胞表达率(1〜4分),得到的切片记分结果以0〜3 分为阴性(-);大于3分为阳性(+)。

染色结果的判断由两名副高病理科医师盲法独立阅片,证实标本为黏液表皮样癌 或正常涎腺组织。

2.5统计学方法

本实验所有结果均采用SPSS22.0软件包进行分析。计数资料采用卡方检验、Fisher 确切概率法;计量资料采用均数士标准差表示,多组之间的比较采用多样本均数的单因 素方差分析,两组之间的比较采用独立样本的t检验;P<0.05为差异具有统计学意义。

3结果

3.1 HE染色结果

正常涎腺腺泡基本结构正常,腺泡之间排列规则,腺体导管基本结构也正常(A, a);高分化MEC中肿瘤细胞排列成巢状或片状,常形成腺腔和囊腔(B, b);低 分化MEC中肿瘤细胞排列成片或实性上皮团,缺乏腺腔和囊腔(D, d);中分化 MEC介于两者之间(C, c)(图1) o

(图注)正常涎腺腺泡基本结构正常,腺泡之间排列规则,腺体导管基本结构也正常(A, a);高分化MEC中 肿瘤细胞排列成巢状或片状,常形成腺腔和囊腔(E, b);低分化MEC中肿瘤细胞排列成片或实性上皮团,缺 乏腺腔和囊腔(D, d);中分化MEC介于两者之间(C, c)-
X100

1正常腺体及高、中、低分化黏液表皮样癌的HE染色

3.2免疫组化染色结果

3.2.1在正常涎腺及MEC中SuFu的表达

SuFu阳性细胞为细胞质内含有棕褐色或者棕黄色颗粒。正常涎腺中SuFu阳性细 胞主要在导管细胞胞质中表达,腺泡细胞中胞质较少表达(A,a);高分化MEC染色 程度稍浅,阳性细胞数较少,阳性细胞表达程度较低(B, b);低分化MEC染色程 度较高分化深,阳性细胞数多,阳性细胞表达程度较高(D, d);中分化MEC染色 程度及阳性细胞数介于两者之间(C, c)(图2)。

SuFu在MEC组织中的阳性率为51.9%(27/52),高于正常唾液腺组织10%(1/10) (FV0.05)(表2-1) o SuFu在不同分化程度MEC组织中阳性表达率不同。高分化 MEC中染色较浅(B, b),阳性细胞表达率较低31.8% (7/22);低分化MEC染色 较深(D, d),阳性细胞表达率较高76.9% (10/13);中分化MEC染色程度(C, c)及阳性细胞率58.8% (10/17)介于高、低分化MEC之间;SuFu在高、中、低分 化MEC中的阳性表达率呈依次升高,在高、低分化MEC中蛋白表达率的差异具有 统计学意义(尸<0.05)(表2・2) o

SuFu表达水平与MEC临床特征关系(表2・3)。从表2・3可见SuFu在肿瘤CT 直径中的蛋白阳性表达率不同,也在颈部淋巴结转移与否中蛋白阳性表达率不同,其 差异均具有统计学意义(尸<0.05) ; SuFu在吸烟、饮酒、年龄、部位、临床分期、 临床直径、原复发等差异均无统计学意义(F>0.05) ; SuFu蛋白的表达水平与MEC 肿瘤CT直径差异、颈部淋巴结转移与否等临床特征有密切关系(尸<0.05),而与吸 烟、饮酒、年龄、部位、临床分期、临床直径、原复发等无关(F>0.05)。X100

(图注)细胞质内含有棕褐色或者棕黄色颗粒的细胞为SuFu阳性细胞。正常涎腺中SuFu阳性细胞主要在导管细 胞胞质中表达,腺泡细胞中胞质较少表达(A,a);高分化MEC染色程度稍浅,阳性细胞数较少,阳性细胞表达 程度较低(B, b);低分化MEC染色程度较高分化深,阳性细胞数多,阳性细胞表达程度较高(D, d);中分 化MEC染色程度及阳性细胞数介于两者之间(C, c) o

2正常腺体及高、中、低分化黏液表皮样癌的SuFu染色

组织类型 例数 SuFu的表达水平 阳性细胞表达率(%) P
(-) (+ )
正常涎腺 10 9 1 10 0.036*
MEC 52 25 27 51.9

注:正常组与MEC组比较:*尸<0.05。(图注)正常组与MEC组比较:*户<0.05。

2-1 SuFu在正常涎腺与MEC阳性表达率差异

2-2. SuFu高、中、低MEC组织中的表达情况

注:高分化组与中分化组与低分化组比较:*尸<0.05;高分化组与低分化组比较:*户=0.015<0.05;咼分化组与中 分化组比较:P=0.114>0.05;中分化与低分化组比较:P=0.440>0.05o

(图注)高分化组与低分化组比较:*户<0.05。

2-2 SuFu在高、中、低MEC中阳性表达率差异

分组

例数

烟 酒 别 龄40 则有无饭有无性男女符V

40-60 25
>60 17
部位  
大涎腺 29
小涎腺 23
临床分期  
早期(I+II) 38
晚期(III+IV) 14
CT直径(cm)  
<2 31
2-4 16

 

>4 5
临床直径(CH1)  
<2 32
2-4 15
>4 5
淋巴结转移  
18
34
原复发  
原发 44
复发 8
SuFu的表达水平 阳性细胞表达率(%) P
(・) (+ )
12 16 57.1 0.416
13 11 45.8  
14 13 4&1 0.592
11 14 56.0  
9 13 59.1 0.413
16 14 46.7  
6 4 40.0 0.689
11 14 56.0  
8 9 52.9  
12 17 5&6 0.278
13 10 43.5  
16 22 57.9 0.215
9 5 35.7  
20 11 35.5 0.015*
4 12 75.0  
1 4 80.0  
16 16 50.0 0.909
7 8 53.3  
2 3 60.0  
5 13 72.2 0.044*
20 14 41.2  
22 22 50.0 0.705
3 5 62.5  

注:肿瘤CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组与肿瘤CT直径(>4cm)组比较:*P<0.05;肿瘤

CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组比较:*P=0.014<0.05;有淋巴结转移组与无淋巴结转移组比较:

(图注)肿瘤CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组比较:*P=0.014<0.05;有淋巴结转移组与无淋巴 结转移组比较:*P<0.05o

2-3 SuFu表达与临床特征的关系

3.2.2在正常涎腺及MEC中GLI1的表达

GLI1阳性细胞为细胞质内含有棕褐色或者棕黄色颗粒。GLI1正常涎腺中阳性细 胞主要在导管细胞胞质中表达,腺泡细胞胞质较少表达(A, a);高分化MEC染色 程度稍浅,阳性细胞数较少,阳性细胞表达程度较低(B, b);低分化MEC染色程 度深,阳性细胞数较多,阳性细胞数细胞表达程度较高(D, d);中分化MEC染色 程度度及阳性细胞数介于两者之间(C, c)(图3) o

GLI1在MEC组织中的阳性率为57.7%(30/52),高于正常唾液腺组织10%(1/10) (FV0.05)(表3・1) o GLI1在不同分化程度MEC组织中阳性表达率不同。高分化 MEC中染色较浅(B, b),阳性细胞表达率较低40.9% (9/22);低分化MEC染色 较深(D, d),阳性细胞表达率较高84.6% (11/13);中分化MEC染色程度(C, c)及阳性细胞率58.8% (10/17)介于高、低分化MEC之间;GLI1在高、中、低分 化MEC中的阳性表达率依次明显的增高,在高、低分化MEC中蛋白表达率差异具 有统计学意义(FV0.05)(表3・2)。

GLI1表达水平与MEC临床特征关系(表3・3) o从表3-3可见GLI1在肿瘤CT 直径中的蛋白阳性表达率不同,也在颈部淋巴结转移与否蛋白阳性表达率不同,其差 异均具有统计学意义(尸<0.05) o GLI1在吸烟、饮酒、年龄、部位、临床分期、临 床直径、原复发等差异均无统计学意义(P>0.05) ; GLI1的表达水平与MEC肿瘤 CT直径差异和颈部淋巴结转移与否有密切关系(PV0.05),而与吸烟、饮酒、年龄、 部位、临床分期、临床直径、原复发等因素无关(尸>0.05)。

(图注)细胞质内含有棕褐色或棕黄色颗粒的细胞为GLI1阳性细胞。GLI1正常涎腺中阳性细胞主要在导管细胞 胞质中表达,腺泡细胞胞质较少表达(A, a);高分化MEC染色程度稍浅,阳性细胞数较少,阳性细胞表达程 度较低(E, b);低分化MEC染色程度深,阳性细胞数较多,阳性细胞数细胞表达程度较高(D, d);中分化 MEC染色程度度及阳性细胞数介于两者之间(C, c) o

3正常腺体及高、中、低分化黏液表皮样癌的GLI1染色

3-1. GLI1在正常涎腺、MEC组织中的表达情况

组织类型 例数 GLI1的表达水平 阳性细胞表达率(%) P
(-) (+ )
正常涎腺 10 9 1 10 0.013*
MEC 52 22 30 57.7

注:正常组与MEC组比较:*尸<0.05。

(图注)正常组与MEC组比较:*尸<0.05。

3-1 GLI1在正常涎腺与MEC阳性表达率差异

3-2.GLI1高、中、低MEC组织中的表达情况

组织类型 例数 GLI1的表达水平 阳性细胞表达率(%) P

(-) (+ )

高分化 22 13 9 40.9 0.041*
中分化 17 7 10 5&8  
低分化 13 2 11 84.6  

注:高分化组与中分化组与低分化组比较:*户<0.05;高分化组与中分化组比较:P=0.341>0.05;高分化组与低分 化组比较:*P=0.016<0.05;中分化组与低分化组比较:P=0.229>0.05o

(图注)高分化组与低分化组比较:*尸<0.05。

3・2 GLI1在高、中、低MEC中阳性表达率差异

3-3. GLI1表达与MEC临床特征的关系

分组 例数 GLI1的表达水平 阳性细胞表达率(%) P
(-) (+ )
吸烟          
28 13 15 53.6 0.581
24 9 15 62.5  
饮酒          
27 10 17 63.0 0.576
25 12 13 52.0  
性别          
22 8 14 63.6 0.573
30 14 16 53.3  
年龄(岁)          
<40 10 5 5 50.0 0.668
40-60 25 9 16 64.0  
>60 17 8 9 52.9  
部位          
大涎腺 29 11 18 62.1 0.576
小涎腺 23 11 12 52.2  
临床分期          
早期(I+II) 38 15 23 60.5 0.540
晚期(III+IV) 14 7 7 50.0  
CT直径(cm)          
<2 31 18 13 41.9 0.020*
2-4 16 3 13 81.3  
>4 5 1 4 80.0  
临床直径(cm)          
<2 32 16 16 50.0 0.318
2-4 15 5 10 66.7  
>4 5 1 4 80.0  
淋巴结转移          
18 4 14 77.8 0.042*
34 18 16 47.1  
原复发          
原发 44 20 24 54.6 0.442
复发 8 2 6 75.0  

注:肿瘤CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组与肿瘤CT直径(>4cm)组比较:*P<0.05;肿瘤

CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组比较:*P=0.014<0.05;有淋巴结转移组与无淋巴结转移组比较:

*P<0.05o

3-3 GLI1表达与临床特征关系
(图注)肿瘤CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组比较:*P=0.014<0.05;有淋巴结转移组与无淋巴 结转移组比较:*户<0.05。

3.2.3在正常涎腺及MEC中TSP-1的表达

细胞质内含有棕褐色或棕黄色颗粒的细胞为TSP-1阳性细胞。TSP-1在正常腺体 阳性细胞数主要在导管细胞胞质中表达,腺泡细胞胞质基本不表达(A, a) o高分 化MEC染色程度高,阳性细胞较多,阳性细胞表达程度高(B, b);低分化MEC 染色程度较高分化低,阳性细胞数较低,阳性细胞表达程度较低(D, d);中分化 MEC染色程度及阳性细胞数介于两者之间(C, c)(图4)。

TSP-1在MEC组织中的阳性率为63.5%(33/52),高于正常唾液腺组织10%(1/10) (尸<0.05)(表4-1) o TSP-1在不同分化程度MEC组织中阳性表达率不同。高分化 MEC中染色较深(B, b),阳性细胞表达率较高86.4% (19/22);低分化MEC染 色较浅(D, d),阳性细胞表达率较低38.5% (5/13);中分化MEC染色程度(C, c)及阳性细胞率52.9% (9/17)介于高、低分化MEC之间;TSP-1在高、中、低分 化MEC中的阳性表达率依次降低,在高、低分化MEC中蛋白表达率的差异具有统 计学意义(尸<0.05)(表4・2) o

TSP-1表达水平与MEC临床特征关系(表4-3) o从表4-3可见TSP-1在肿瘤 CT直径中的蛋白阳性表达率不同,颈部淋巴结转移与否中蛋白阳性表达率也不同, 其差异均具有统计学意义(尸<0.05) o TSP-1在吸烟、饮酒、年龄、部位、临床分期、 肿瘤临床直径、淋巴结转移、原复发等差异均无统计学意义(F>0.05) ; TSP-1蛋白 的表达水平与MEC肿瘤CT直径差异和颈部淋巴结转移与否有密切关系(PV0.05), 而与吸烟、饮酒、年龄、部位、临床分期、临床直径、原复发等临床特征无密切关系

(F>0.05) o

X100 X400

(图注)细胞质内含有棕褐色或棕黄色颗粒的细胞为TSP-1阳性细胞。TSP-1在正常腺体阳性细胞数主要在导管 细胞胞质中表达,腺泡细胞胞质基本不表达(A, a) o高分化MEC染色程度高,阳性细胞较多,阳性细胞表达 程度高(B, b);低分化MEC染色程度较高分化低,阳性细胞数较低,阳性细胞表达程度较低(D, d);中分 化MEC染色程度及阳性细胞数介于两者之间(C, c)。

4正常腺体及高、中、低分化黏液表皮样癌的TSP-1染色

4-1. TSP-1在正常涎腺、MEC组织中的表达情况

组织类型 例数 TSP-1的表达水平 阳性细胞表达率(%) P
(-) (+ )
正常涎腺 10 9 1 10 0.006**
MEC 52 19 33 63.5

注:正常组与MEC组比:**尸<0.01。

(图注)正常组与MEC组比较:**卩<0.01。

4-1 TSP-1在正常涎腺与MEC阳性表达率差异

4-2. TSP-1高、中、低MEC组织中的表达情况

高分化 22 3 19 86.4 0.009**
中分化 17 8 9 52.9  
低分化 13 8 5 3&5  

(-) (+ )

注:高分化组与中分化组与低分化组比较:**户<0.01;高分化组与中分化组比较:P=0.052>0.05;高分化组与低 分化组:**P=0.007<0.01;中分化组与低分化组;P=0.431>0.05o

(图注)高分化组与低分化组比较:**户<0.01。

4-2 TSP-1在高、中、低MEC阳性表达率差异

4-3. TSP-1表达与MEC临床特征的关系

分组 例数 TSP-1的表达水平 阳性细胞表达率(%) P
(-) (+ )
吸烟          
28 8 20 71.4 0.253
24 11 13 54.2  
饮酒          
27 7 20 74.1 0.099
25 12 13 52.0  
性别          
22 10 12 54.5 0.382
30 9 21 70.0  
年龄(岁)          
<40 10 4 6 60.0 0.156
40-60 25 6 19 76.0  
>60 17 9 8 47.1  
部位          
大涎腺 29 8 21 72.4 0.157
小涎腺 23 11 12 52.2  
临床分期          
早期(I+II) 38 14 24 63.2 0.940
晚期(III+IV) 14 5 9 64.3  
CT直径(cm)          
<2 31 7 24 77.4 0.018*
2-4 16 8 8 50.0  
>4 5 4 1 20.0  
临床直径(cm)          
<2 32 10 22 6&8 0.463
2-4 15 6 9 60.0  
>4 5 3 2 40.0  
淋巴结转移          
18 11 7 3&9 0.014*
34 8 26 76.5  
原复发          
原发 44 17 27 61.4 0.736
复发 8 2 6 75.0  

注:肿瘤CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组与肿瘤CT直径(>4cm)组比较:*P<0.05;肿瘤

CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组比较:*P=0.023<0.05;有淋巴结转移组与无淋巴结转移组比较:

*P<0.05o

(图注)肿瘤CT直径(V2cm)组与肿瘤CT直径(2-4cm)组比较:*P=0.023<0.05;有淋巴结转移组与无淋巴 结转移组比较:*P<0.05o
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4-3 TSP-1表达与临床特征关系

3.3免疫荧光结果

通过免疫荧光定性蛋白检测技术发现,SuFu、GLI1蛋白表达于胞质中,SuFu表 达绿色荧光(图5) , GLI1表达红色荧光(图6);空白对照组(a, b, c) GLI1、 SuFu蛋白表达的平均光密度值最高,TSP-1作用组(d, e, f)平均光密度值最低, TSP-1+CD36阻断组(g, h, k)平均光密度值介于两者之间,三组间SuFu、GLI1 蛋白的平均光密度值差异具有统计学意义(FV0.05) ; TSP-1作用组与空白对照组蛋 白表达差异具有统计学意义(尸<0.05) , TSP-1作用组与TSP-1+CD36阻断组蛋白表 达差异具有统计学意义(PV0.05)(表5)(图7)。

SuFu DAPI Merge
a b c
50um   5Q.um
d e f
50um 50um 50um
9 h k
50um 50um  

(图注)胞质SuFu表达绿色荧光(a, d, g);同镜下,DAPI表达蓝色荧光(b, e, h) ; SuFu绿色荧光与DAPI 蓝色荧光Merge结果(c, f, k);空白对照组(a, b, c)与TSP-1作用组(d, e, f)与TSP-1+CD36阻断组(g, h, k) o

5 MECSuFu免疫荧光染色(x400)

DAP! Merge

对照组

TSP-1 作用组

TSP-1 +

CD36 阻断组

a   b   C  
      50urm    
d   e   f  
  50um   50um    
g   h   k  
  5Qum   50unn   50um

(图注)胞质GLI1表达红色荧光(a, d, g);同镜下,DAPI蓝色荧光(b, e, h) ; GLI1红色荧光与DAPI蓝 色荧光Merge结果(c, f, k);空白对照组(a, b, c)与TSP-1作用组(d, e, f)与TSP-1+CD36阻断组(g, h, k) o

6 MECGLI1免疫荧光染色(x400)

5. SuFu> GLI1的表达情况(X ±S)
  空白对照组 TSP-1作用组 TSP-1+CD36 阻断组
SuFu 0.045±0.011 0.032±0.008* 0.043±0.010*
GLI1 0.063±0.019 0.042±0.013* 0.057±0.017*

注:空白对照组与TSP-1作用组与TSP-1+CD36阻断组比较:*户<0.05;空白对照组与TSP-1作用组比较:*P<0.05;

TSP-1作用组与TSP-1+CD36阻断组比较:*P<0.05o

(图注)空白对照组与TSP-1作用组与TSP-1+CD36阻断组SuFu平均光密度值(A);空白对照组与TSP-1作 用组与TSP-1+CD36阻断组GLI1平均光密度值(B) ; *户<0.05。

7SuFu> GLI1蛋白的表达情况

4讨论

黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma, MEC)是唾液腺中最常见的恶性上 皮性肿瘤,占唾液腺所有恶性肿瘤的30・40%[1】。由于不同类型细胞所占比例及形成 的结构不同,将MEC分成高分化(低度恶性)、中分化(中度恶性)、低分化(高度恶 性)三种基本类型,高分化MEC属于低度恶性肿瘤,低分化MEC属于高度恶性肿瘤, 中分化MEC属于中度恶性肿瘤卩4-均。目前最有效的治疗方法是以手术切除为主,但 低分化(高度恶性)MEC由于生长迅速,远处转移率高,手术难以彻底清除肿瘤, 以至于患者的预后较差。目前常用的治疗方法是手术切除结合放化疗的方式,但手术 难以彻底清除肿瘤。而且低分化MEC常常生长速度较快、转移率较高,并且术后复 发率较高,预后较差31;并且由于肿瘤位于颌面部唾液腺体组织内,术前组织学病 理诊断主要依靠穿刺针吸,组织量获得有限,以至于常规病理组织学分型诊断困难。 因此,寻找准确诊断标志物和新的治疗方法对改善MEC治疗效果是有重要的临床意 义。

血小板反应蛋白・1 (thrombospondin-1, TSP-1)是一种多功能基质蛋白,具有抑 制肿瘤生长的功能,部分原因是其抑制新生血管的能力,进而介导许多肿瘤发生发展 的过程卩"I TSP-1由六个结构域组成,它们与不同的分子结合,参与癌症的多种功 能,在癌症的多种途径中起着关键作用。TSP-1在某些途径中起到癌症促进作用,但 在其他途径中起到癌症抑制作用,这使得不同的分子与TSP-1不同的结构域结合而发 挥不同的作用师]。近年来,研究发现TSP-1在抑制肿瘤的的增殖、粘附、迁徙等生 物学行为和抑制肿瘤的新生血管形成中发挥重要作用㈤-41]。相关研究表明,TSP-1与 CD36的结合诱导了肿瘤细胞凋亡或阻断血管内皮生长因子受体2通路在肿瘤微血管 内皮细胞中的作用,抑制肿瘤的转移[26]。本研究团队前期已初步研究了 TSP-1在MEC 发生发展中的关系,结果表明TSP-1蛋白表达率随着MEC恶性程度增高而降低,提 示TSP-1可能具有潜在抑制MEC生长的作用,这一研究结果与本次研究结果一致 0][42]。但因为前期MEC样本量较小,临床意义尚需进一步研究㈤]。前期研究结果显 示TSP-1与MEC患者的年龄有关[27】,而本次研究结果显示TSP-1与MEC患者年 龄不相关,这可能是前期样本量较小的原因。并且本次实验增加了烟酒、临床肿瘤直 径、CT (computed tomography, CT)肿瘤直径、淋巴结转移、原复发等临床及影像 学特征对比。结果表明TSP-1蛋白表达与吸烟、饮酒、肿瘤临床直径、原复发不相关 (P>0.05),与肿瘤CT直径、淋巴结转移密切相关(FV0.05)。TSP-1蛋白阳性表 达率随着肿瘤临床直径的增大而降低,同时在影像学肿瘤CT直径中的表达也是相似 结果,但CT直径有统计学意义(尸<0.05),同样提示TSP-1可能具有潜在抑制MEC 生长的作用。虽然肿瘤临床直径无统计学意义,但是肿瘤CT直径结果有统计学意义, 这一原因可能是临床医生在肿瘤可视范围内主观性较强,估计肿瘤直径存在相关误 差,而CT直径更能准确显示肿瘤的大小,因此提示临床可能更需要CT结果来判读 肿瘤直径大小。而且,随着肿瘤直径的增大,TSP-1蛋白阳性表达率明显降低,这与 MEC恶性程度越高TSP-1蛋白的阳性表达率降低趋势一致。提示临床患者肿瘤直径 较大,CT直径可能较大,肿瘤恶性程度可能较高,肿瘤侵犯周围组织能力的可能性 就较强。因此,TSP-1表达强度可能作为临床肿瘤波及范围的预判参考。而且,TSP-1 蛋白阳性表达率与淋巴结转移相关(FV0.05),淋巴结转移患者的蛋白阳性率低于无 淋巴结转移患者,提示TSP-1可能具有抑制MEC淋巴结转移的相关作用。并且,淋 巴结转移患者中TSP-1蛋白阳性表达率较低,恶性程度较高患者中蛋白阳性率也较 低,提示临床上发现淋巴结转移患者,其MEC恶性程度可能较高,因此,TSP-1表 达强度也可能为后续诊断及手术方案的选择及淋巴结清扫的范围提供参考。

Hh信号通路控制着复杂的发育过程,Hh信号的异常激活有促进肿瘤发生和发展 作用问。Hh信号通路参与了许多癌症的发生和进展,如OSCC0】、肺癌屮]、胃癌[45]、 膀胱癌3等恶性肿瘤中都存在Hh信号通路异常激活的开放状态。Hh信号通路的异 常活化是由Hh通路相关基因突变或相关信号分子过度表达引起的,可能存在3种基 本机制:(1)配体独立型信号传导。若存在PTCH1突变或SMO突变,此时SMO 不再受PTCH1抑制,从而异常激活信号通路;⑵自分泌型配体依赖性信号转导。SHH 配体由肿瘤细胞分泌,并进入同一肿瘤细胞或相邻肿瘤细胞,从而异常激活信号通路;

(3)旁分泌型配体依赖性信号传导或反向旁分泌型配体依赖性信号传导。前者的SHH 配体由肿瘤细胞分泌,并被基质细胞吸收,活化的基质细胞合成和分泌信号因子,从 而异常激活信号通路;后者的SHH配体直接由基质细胞分泌,并被肿瘤细胞吸收, 反向异常激活信号通路。因此,配体有助于肿瘤细胞的生长和增殖H7]。基于团队前期 已初步研究的Hh信号通路相关配体蛋白SHH的表达情况,本次实验研究重点在于 探讨Hh信号通路关键相关蛋白SuFu、GLI1在MEC中的蛋白表达情况,并结合本 课题组前期关于Hh信号通路相关配体蛋白SHH的表达的研究结果进一步探究TSP-1 在MEC中影响Hh信号通路异常活化的可能存在的相关分子机制。本团队前期研究 结果表明Hh信号通路相关配体蛋白SHH的表达在MEC中蛋白阳性表达率高于正 常涎腺组织[20】;同样,本次研究结果也显示SuFu. GLI1蛋白阳性表达率高于正常涎 腺组织,且具有统计学意义(FV0.05);而且,不同分化程度的MEC中SuFu、GLI1 有着不同的蛋白表达情况。随着MEC恶性程度的增高,SuFu、GLI1蛋白的阳性表 达率逐渐升高。SuFu在高、低分化MEC之间蛋白表达差异与GLI1在高、低分化 MEC之间蛋白表达差异均具有统计学意义(PV0.05),提示Hh信号通路关键相关蛋 白SuFu、GLI1也可能参与了 MEC的发生发展。SHH、GLI1、SuFu作为Hh信号通 路的重要组成部分,在MEC的发生发展中起到了重要的作用,SHH蛋白作为Hh信 号通路的启动配体,可能由于SHH蛋白的过度表达异常激活了 Hh信号通路,导致 下游GLI1及SuFu蛋白的异常表达,这一级联信号传导提示Hh信号通路参与MEC 的发生发展机制可能主要是通过自分泌型配体依赖性信号转导方式异常激活了该信 号通路,蛋白之间的互相作用可能影响了 MEC的发生发展。

YanW的研究发现,通常情况下,当Hh信号被激活时,Hh配体与PTCH结合, 从而激活细胞间的级联信号,进而分离SuFu与胶质瘤相关癌基因同源物(GLI)复 合物的相互作用,导致下游基因GLI1、GLI2的转录增加,尤其是GLIl^o GLI1介 导了 Hh信号,在激活的信号转导中作为癌基因参与肿瘤的发生,而且GLI1仅作为 Hh信号通路的激活物发挥作用。因此,GLI1蛋白表达水平是衡量Hh通路异常激活 强度的重要指标之一,阻断GLI1蛋白的过度表达可能是治疗与Hh信号通路相关癌 症进展的一种新的治疗方法H9]。越来越多的研究证据表明,Hh信号通路异常激活与 OSCC的病情进展和预后不良有关,并被认为是晚期OSCC的新治疗靶点a®。本研 究也发现MEC中存在GLI1蛋白的过度表达情况,而且随着MEC恶性程度的增高 GLI1蛋白的表达明显增强,则进一步表明Hh信号通路可能参与MEC的发生发展。 同时,我们结合了 GLI1与临床、影像及病理特征的关系。我们的数据显示GLI1的 过度表达与淋巴结转移的发生有关,淋巴结转移患者的GLI1蛋白表达阳性率显著高 于无淋巴结转移患者,提示GLI1可能促进MEC淋巴结的转移。并且,淋巴结转移 的GLI1蛋白阳性率与MEC的恶性程度蛋白阳性表达率一致,提示淋巴结转移患者 其MEC恶性程度可能更高,因此,GLI1蛋白表达的强弱可能成为临床上是否进行颈 淋巴清扫的病理学参考指标。同时我们观察到,在较大的的肿瘤直径(>4cm)中, GLI1的阳性表达率80.0% (4/5)显著高于较小(<2cm)的肿瘤直径,CT直径的蛋白 阳性表达率趋势也是这一结果,提示GLI1可能促进了肿瘤细胞增殖。考虑到GLI1 蛋白阳性率在MEC中随着肿瘤恶性程度增高而增高,结合临床分期、肿瘤CT直径、 颈部淋巴结转移、原复发等GLI1蛋白阳性表达率趋势。提示随着肿瘤CT直径越大, 颈部淋巴结转移可能性增高,肿瘤恶性程度可能更高,临床分期较高,预后也较差。 因此,GLI1表达强弱可能为临床治疗方案及诊断依据提供参考。

SuFu在肿瘤发生发展过程中对Hh信号的激活起着至关重要的作用,SuFu可抑 制恶性肿瘤的发生[22]。研究表明SuFu的突变与基底细胞癌⑴]、髓母细胞瘤[54]、痣样 基底细胞癌综合征阿发生相关。然而,随着对SuFu蛋白不断的深入研究,也发现它 可能具有正向调节作用网。相关研究结果发现,SuFu不仅能提高Hh信号通路的活 性,而且还能提高GLI1蛋白核转运过程问。Dias⑹等学者研究发现SuFu蛋白在异常 口腔发育上皮组织中存在不同程度的表达,但在正常口腔黏膜组织中却未检测到SufU 的表达,提示SuFu可能促进了正常口腔黏膜组织向异常发育上皮组织及OSCC的转 化。同时,SuFu在宫颈癌中过度表达,对宫颈癌的发生发展也起到了促进作用,提 示SuFu可能作为宫颈癌新的诊断指标和治疗靶点[⑹。上述研究结果表明:SuFu可能 在肿瘤的发生发展过程中起着双重作用,但具体作用机制不明。结合本次研究结果, 发现SuFu在MEC中蛋白阳性率明显高于正常涎腺组织,且具有统计学意义 (P<0.05);提示SuFu蛋白在MEC的发生发展过程中可能起着促进作用,而且其 蛋白表达率随着MEC恶性程度的增高而增高。相关临床数据发现SuFu蛋白的表达 水平与MEC肿瘤CT直径、颈部淋巴结转移与否有密切关系(PV0.05),而且随着 肿瘤CT直径的增大,SuFu蛋白阳性表达率也逐渐升高,其向淋巴结转移的可能性 增高,侵犯周围神经血管的能力也相应增高,恶性程度也随之增高,SuFu蛋白的表 达强度提示在手术切除过程中,组织切除范围可能更大;并且在有淋巴结转移MEC 中,SuFu蛋白的表达率明显高于无淋巴结转移者,同样提示SuFu可能具有促进淋巴 结转移的作用。但对临床分期、原复发等不相关临床特征分析发现,SuFu蛋白的表 达水平在复发患者中较原发患者高,两者比较无统计学意义(尸>0.05),但由于复发 患者比例较小,探究原因可能是初次手术治疗效果较好,患者的预后较好,手术仍是 较为合适的选择方案之一,SuFu蛋白的表达强度能否作为评价患者预后的临床指标 有待进一步研究。以上研究结果可能为后续MEC恶性程度的诊断以及选择合适的治 疗方案提供理论和临床上的支持和帮助。

目前已有证据表明Hh信号通路对唾液腺形态发育起到重要作用⑺叫而在正常唾 液腺中,导管上皮细胞也具有较低的增殖能力a】,在不同肿瘤诱发因素的影响下可能 出现异常增殖现象,进而可能引起正常唾液腺组织转变成恶性肿瘤组织,而唾液腺 MEC主要来源于唾液腺导管上皮细胞的异常增殖,这使我们推测唾液腺MEC的生成 可能会与调控正常唾液腺发生的Hh信号通路的异常活化有关。我们研究结果显示 SuFu和GLI1的阳性表达率均随MEC恶性程度增高而明显增高,而TSP-1的阳性表 达是随MEC恶性程度增高而明显降低,这提示SuFu、GLI1在MEC发生发展过程中 可能起着相互促进的作用,TSP-1功能蛋白可能会影响Hh信号通路关键蛋白SuFu、 GLI1在MEC的表达。基于相关文献证明TSP-1可能通过其受体CD36在Hh信号通 路的调节中发生相关作用的证据0],以及前期实验MEC中TSP-1蛋白表达与Hh信 号通路启动子SHH蛋白表达呈显著负相关的研究结果©I,本次实验增加了 Hh信号 通路异常活化启动子SHH下游相关蛋白SuFu, GLI1的研究,总结以上研究结果发 现,与高分化MEC比较,TSP-1蛋白在低分化MEC中表达明显降低,而Hh信号 通路启动子SHH表达蛋白以及其下游关键基因SuFu和GLI1蛋白表达明显升高,提 示TSP-1在影响MEC分化中,对Hh信号通路异常活化起到了重要的调控作用。在 我们的早期体外研究发现,黏液表皮样癌细胞2xl04/ml的细胞接种浓度,TSP-1在 40ug/ml的浓度作用并作用72小时对黏液表皮样癌细胞的生物学行为影响最为明显 阳。为了在体外最大限度降低内源性TSP-1对研究结果的影响,进一步了解MEC中 TSP-1蛋白对Hh信号通路的具体调节作用,我们选择了 TSP-1表达低的黏液表皮样 癌MC-3细胞系作为研究对象,2xl04/ml的黏液表皮样癌细胞浓度为体外实验的接种 浓度,40ug/ml的TSP-1蛋白浓度作为有效作用浓度,作用72小时为最佳作用时间 点。将体外实验分为空白对照组、TSP-1蛋白作用组、TSP-1+CD36阻断组。体外实 验发现,与空白对照组比较,TSP-1蛋白作用组中Hh信号通路关键基因GLI1、SuFu 的表达蛋白平均光密度值显著低于空白对照组,差异具有统计学意义(尸<0.05); TSP-1+CD36阻断组与TSP-1蛋白作用组比较,GLI1、SuFu的表达显著明显升高, 差异具有统计学意义(尸<0.05);而与空白对照组比较,GLI1、SuFu的表达有轻度 降低,但差异无统计学意义(P>0.05) o阻断CD36受体功能后,TSP-1蛋白对GLI1、 SuFu表达的影响作用被抑制,说明MEC细胞膜受体CD36在TSP-1蛋白影响Hh信 号通路关键基因GLI1、SuFu表达蛋白的调节作用中起到关键作用。

综上所诉,在MEC中,TSP-1蛋白可能通过受体CD36抑制SuFu、GLI1的蛋 白表达来影响Hh信号通路的异常活化强度,进而抑制黏液表皮样癌的发生发展,而 TSP-1蛋白通过与CD36受体结合,影响SuFu和GLI1的上游Hh信号通路启动配体 SHH的表达活性可能是抑制MEC的关键所在,但具体机制还有待于进一步研究。

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Hedgehog信号通路相关蛋白GLI1与SuFu在口腔鳞癌中的
研究进展

口腔鳞癌细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是来源于口腔鳞状上皮细 胞的恶性肿瘤,是口腔恶性肿瘤中最常见的类型,占口腔恶性肿瘤的90%⑴。尽管外 科手术、放化疗等治疗方法发展迅速,但患者的5年生存率仍未见明显变化。由于 OSCC局部复发、远处转移等特点,患者的预后较差,总生存率较低。因此,寻找新 的治疗策略和诊断标记物对改善OSCC治疗效果是有重要的临床意义。目前,在识别 肿瘤相关生物标记物的热点研究领域,肿瘤干细胞胚胎信号的相关研究具有较大的前 景。其中,与肿瘤干细胞胚胎信号相关的刺猬信号通路(hedgehog signaling pathway, Hh)失调与一系列恶性肿瘤的发生、发展密切有关,OSCC尤为突出⑵。

1、Hedgehog(Hh)信号通路

Hh信号通路在细胞发育、增殖、分化中过程中起着相关的调节作用,是一种高 度保守的从细胞膜到细胞核的信号传递途径。Hh信号通路组主要由SHH ( Sonic Hedgehog)配体蛋白、Patched(PTCH1)膜受体蛋白、Smoothened (SMO)膜蛋白、 胶质瘤相关癌基因家族锌指转录因子(GLIl、GLI2、GLI3)、Fu抑制子(SuFu)、运动 蛋白KIF7、蛋白激酶A等组成⑶。其中,GLI1不仅作为Hh信号通路的正向调节因 子,并且还与各种肿瘤信号通路紧密联系⑷。SuFu不仅正向调控Hh信号通路,提高 GLI1的细胞核转运和稳定性,提高Hh通路的活性,而且也能抑制Hh信号通路⑸。 在正常组织中,当缺乏SHH配体蛋白表达的情况下,PTCH1蛋白抑制SMO蛋白的 活性,Hh信号通路处于关闭状态;而在SHH配体蛋白高表达的情况下,SHH配体 与PTCH1膜受体结合,解除对SMO膜蛋白的抑制,Hh信号通路处于异常开放状态 (如图8)。从而促进多个靶基因的转录,包括控制细胞周期、细胞迁移、血管生成 和凋亡的靶基因⑹。Hh信通路参与了许多癌症的发生和进展,如痣样基底细胞癌综 合征⑺、OSCC罔、肺癌[9]、胃癌[10]等肿瘤中都存在Hh信号通路异常激活的开放状态。 Hh信号通路的异常活化是由Hh通路相关基因突变或相关信号分子过度表达引起的, 可能存在3种基本机制:(1)配体独立型信号传导。若存在PTCH1突变或SMO突 变,此时SMO不再受PTCH1抑制,从而异常激活信号通路;(2)自分泌型配体依赖 性信号转导。SHH配体由肿瘤细胞分泌,并进入同一肿瘤细胞或相邻肿瘤细胞,从 而异常激活信号通路;(3)旁分泌型配体依赖性信号传导或反向旁分泌型配体依赖性 信号传导。前者的SHH配体由肿瘤细胞分泌,并被基质细胞吸收,活化的基质细胞 合成和分泌信号因子,从而异常激活信号通路;后者的SHH配体直接由基质细胞分 泌,并被肿瘤细胞吸收,反向异常激活信号通路。因此,配体有助于肿瘤细胞的生长 和增殖Hi](如图9) o而且,Hh信号通路与转化生长因子卩(transfbrming growth factor beta, TGF-卩)、TRAIL (tumor nerosis factor-related apoptosis-inducing Ligand, TRAIL)> EGFR (epidermal growth factor recepter,EGFR)等多条信号通路紧密联系,与多种途径 共同调节g。

(图注)当缺乏SHH配体蛋白表达的情况下,PTCH1蛋白抑制SMO蛋白的活性,Hh信号通路处于关闭状态; 而在SHH配体蛋白高表达的情况下,SHH配体与PTCH1膜受体结合,解除对SMO膜蛋白的抑制,Hh信号通 路处于异常开放状态。

8 Hh信号通路“开放”与“关闭”

(图注)配体独立型信号传导(A);自分泌型配体依赖性信号转导(B);旁分泌型配体依赖性信号传导或反 向旁分泌型配体依赖性信号传导(C) o

9 Hh信号通路基本作用机制

2、Hh信号通路与OSCC

Hh信号通路调节许多口腔胚胎发育中的过程,如口腔黏膜[⑶、牙齿[14]、唾液腺 2⑹等的形成及分化。越来越多的研究发现Hh信号通路的异常激活及相关蛋白过度 表达与OSCC关系密切,在OSCC发育和进展中起着关键作用"I。Schneider S等阴 研究发现正常皮肤及口腔粘膜中未见GLI1、GLI2、GLI3、SHH、PTCH、SMO等蛋 白表达,而研究的所有蛋白均在头颈部鳞癌细胞中高表达。SHH、PTCH、SMO和 GLI1在头颈部鳞癌的表达均显著升高,与正常皮肤及口腔黏膜中Hh信号蛋白的表 达情况形成显著对比。Buim等[19]对OSCC与非OSCC 口腔黏膜组织中Hh信号通路 相关蛋白的表达情况与临床病理特征等研究中,发现SHH、PTCHI、SMO和GLI1 在非OSCC 口腔黏膜中均未表达,而在OSCC中均高表达PTCHI、SMO和GLI1等 蛋白。结果提示SMO蛋白的表达与临床分期和颈部淋巴结转移相关CPvO.05) ,PTCH1 的表达与SMO和GLI1的表达有很强的相关性(FV0.05) , SMO和GLI1的表达也 相互相关(尸<0.05) - Wang YF等学者也对OSCC和非OSCC组织中Hh信号蛋白 的相关蛋白表达情况进行研究,发现在非OSCC 口腔粘膜组织中Hh信号蛋白表达低, 而OSCC中Hh信号蛋白表达高。在40例OSCC中,SHH阳性表达29例(72.5%), PTCH阳性表达19例(47.5%) , GLI1核表达14例(35%),分析结果发现OSCC 中SHH的蛋白表达与PTCH和GLI1蛋白表达呈正相关。Hh信号通路相关蛋白的表 达与临床相关特征中分析,PTCH阳性表达与颈部淋巴结转移相关(PV0.05) , GLI1 过度表达与颈部淋巴结转移、肿瘤复发等临床特征相关(尸<0.05) o Gonzalez等卩习 对口腔正常粘膜上皮、异常发育上皮、OSCC三种组织的研究中发现,OSCC组织中 SHH、PTCH、SMO、GLI2蛋白的表达较异常发育上皮均有增加,尤其是GLI2、SMO 蛋白的表达显著增加,但与异常发育上皮比较,不具有统计学意义(P>0.05)o轻度和 中度异常增生组与不同程度的唇鳞状细胞癌相比有统计学意义(PV0.05),尤其是从 轻度异常增生到高分化唇鳞状细胞癌和中分化唇鳞状细胞癌具有统计学意义

(FV0.05) o Valverde LF等㈤对口腔癌组织、癌旁组织和非癌组织中Hh信号通路 SHH、GLI1的比较。OSCC中SHH和GLI1的表达高于癌旁组织和非癌组织。上诉 研究提示Hh信号通路相关蛋白的过度表达激活了该信号通路,介导了 OSCC的发生 发展,蛋白之间相互影响,可能由于SHH配体蛋白的高表达,引起下游PTCH1、SMO、 GLI1等蛋白的高表达,导致该级联信号的异常激活。Hh信号通路可能在OSCC的生 物学行为中起到重要作用,其相关分子的过度表达可能是信号通路异常的作用机制, 但具体机制仍不明确,需进一步研究。

3、GLI1 蛋白与 OSCC

GLI属于Kruppel样转录因子家族,有3个家族成员:GLI1、GLI2和GLI3。由 于GLI1不具有N■末端阻遏结构域,它在Hh信号通路中仅作为激活物发挥作用,GLI2 具有潜在的激活或抑制Hh信号的作用,而GLI3主要起抑制Hh信号作用Ml。GLI 家族具有调节细胞生长、分化、增殖的特定基因,特别是GLI1可以激活多种下游蛋 白和细胞周期调控蛋白㈡】。GLI转录因子通过各种修饰在翻译后水平上精细调节,如 磷酸化、泛素化、乙酰化等多种蛋白修饰,靶向GLI修饰可能是抑制Hh信号传导的 途径Bl。GLI1是一种C2-H2型锌指转录因子,包含5个锌指(zinc finger, ZF)结 构域。其中ZF4和ZF5与DNA序列5,-GACCCA-3,特异性结合,而ZF1-3则与磷酸 骨架相互作用⑷。GLI1是最有效的激活因子,在肿瘤发生中起关键作用,GLI1已被 公认为是抑制Hh通路最有效的靶点〔25]。在肺癌【26]、胶质瘤[27]、髓母细胞瘤四等均有 发现抑制GLI1的转录活性来抑制Hh信号通路oDiasRB等在口腔上皮异常发育中观 察到GLI1的核染色,然而在非肿瘤性口腔粘膜、角化过度或炎性纤维增生病例中均 未观察到GLI1的核染色,证实了 Hh途径参与了 口腔上皮异常发育,因为GLI1的核 移位仅在Hh信号通路激活时发生〔29]。国内相关研究发现GLI1蛋白阳性表达率在舌 鳞癌组织中显著高于正常舌粘膜组织,两者比较有统计学意义(FV0.05),提示GLI1 在舌鳞癌组织中过度表达可能异常激活了 Hh信号通路。GLI1蛋白的表达与患者年 龄、性别、淋巴结转移无关(P>0.05 ),而与肿瘤分化程度、临床分期有相关性(P<0.05 )。 Spearman等级相关性分析GLI1蛋白与SMO、PTCH呈正相关㈤】。同时,OSCC组织 中GLI1蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤直径大小不相关(尸>0.05),但与淋巴结 转移、肿瘤临床分期相关(尸<0.05) o Spearman相关性分析数据显示,SHH蛋白与 GLI1蛋白的表达呈显著相关关系卩1]。Hh信号通路中SHH激活转录因子GLI1以调 节多种基因的表达,从而控制细胞的增殖、分化、侵袭和迁移。相关研究发现SHH、 GLIKMMP-9(matrixmetalloproteinase 9, MMP-9)在 OSCC 组织中的表达较非 OSCC 组织明显增高,GLI1在OSCC组织中的表达明显高于非OSCC组织,GLI1的高表达 与肿瘤复发和临床分期有关(尸<0.05) o SHH在OSCC中的表达与淋巴结转移有关

(FV0.05) o GLI1蛋白高表达与肿瘤复发、临床分期、淋巴结转移呈正相关。提示 GLI1可能成为OSCC侵袭和转移的重要介导因子,可能成为一种新的预后标志物卩2】。 上诉结果提示GLI1的异常表达可能参与了 OSCC的发生发展,有可能通过抑制GLI1 蛋白活性进而来抑制Hh信号通路的活性。因此,GLI1有可能成为OSCC治疗靶点。 由于GLI1与各种肿瘤信号相互关联,所以GLI1参与OSCC发生发展的可能机制更 为复杂。然而,抑制GLI1过度表达有可能抑制OSCC的发生发展,这为OSCC的治 疗提供了一种新的思路。

4、SuFu 蛋白与 0SCC

SuFu在肿瘤发生发展过程中对Hh信号的激活起着至关重要的作用,被认为是一 个肿瘤抑制基因[33-34]o然而,随着对SuFu蛋白不断的深入研究,也发现它具有正向 调节作用⑸。提示SuFu蛋白可能具有双重调节作用,但具体机制有待进一步研究。 SufU通常与GLI1相互作用,以防止其启动Hh信号通路靶基因的转录厲]。SuFu蛋白 包含C端与N端两个结构域,其两端结构域分别可以和GLI的两端结构域相互作用o 通常情况下,当缺乏配体存在时,SuFu蛋白阻断Hh信号传导;而在有配体存在时, SuFu蛋白与GLI1蛋白分离,GLI1活化并转移到细胞核,进而促进Hh信号传导QI。 目前很少有研究探讨SuFu在OSCC中的表达。相关研究发现,异常发育的口腔上皮 具有向OSCC恶变的倾向,但其向OSCC转化的可能机制尚不明确网。Dias等四研 究发现,SuFu在口腔异常发育上皮组织中存在相当程度的表达,但在正常口腔黏膜 组织中却未检测到Sufu的表达,以上提示SuFu可能参与了正常黏膜向异常发育上皮 及OSCC组织的转化。提示SuFu可能在OSCC的发生发展过程中起着促进作用。然 而也有在头颈部鳞癌组织中研究发现SuFu基因缺乏甲基化卩刀,而基因甲基化缺失是 致癌重要原因。同时,SuFu基因的突变也会导致痣样基底细胞癌综合征哭]、腺样囊 性癌㈤啲发生。SuFu的突变破坏了与GLI1的结合,SuFu与GLI1相互作用的任何 改变都可能导致细胞过度增殖及恶性肿瘤的发生购。上述研究则提示SuFu蛋白可能 又具有抑癌作用。随着相关研究证据显示,SuFu蛋白在全身恶性肿瘤(胶质瘤HU、胃 癌舵]等)组织中低表达,SuFu与GLI1的表达呈负相关。然而,SuFu参与口腔异常发 育上皮进展为OSCC过程的作用机制仍需进一步研究,Hh信号通路相关分子SuFu 可能在其中起着重要作用。

5、总结和展望

Hh信号通路在细胞发育、增殖、分化、迁徙等过程中起着重要的调节作用,其 异常激活途径可能会导致OSCC的发生发展,Hh信号通路相关蛋白GLI1、SuFu参 与OSCC的作用及发生机制也较为复杂,可能涉及到多个信号通路之间相互作用 净44]。因此,抑制Hh信号通路相关蛋白SuFu、GLI1可能会有效抑制OSCC发生、 发展、侵袭、转移等过程。目前已研发出多种Hh信号通路抑制剂,环靶明是常见的 SMO抑制剂,随后多种小分子SMO抑制剂被研发出来,其共同作用机制都是通过阻 断SMO信号传导从而来抑制Hh信号通路传导昭。目前可知,FDA已批准两种SMO 抑制剂(sonidegib和vismodegib)用于医治基底细胞癌跑。同时一些学者以GLI为靶 点研究,发现了不依赖SMO通路的阻断剂,包括GANT-61等旳。在GLI拮抗剂中, 葛兰素B能够结合GLI1的ZF结构域,干扰其与DNA的相互作用,并在体内外抑 制GLI依赖性肿瘤,表明直接干预GLI与DNA相互作用可能是控制Hh通路活化的 一种有价值的治疗策略[锢。目前发现一种Hh抑制作用的新机制,通过多靶点药物拮 抗SMO和GLI1,从而在体外和体内抑制髓母细胞瘤生长⑷]。已有研究显示用SHH 抑制剂环磷酰胺可抑制头颈鳞癌细胞生长,SHH抑制剂的开发可能会改善头颈鳞癌 的治疗a】。目前有一种纳米活性小分子抑制剂奎纳克林能导致口腔癌源性原代细胞中 的凋亡,其作用机制是破坏GLI1与卩■连环蛋白的相互作用来抑制信号通路Bl。虽然 抑制Hh信号通路相关蛋白SuFu、GLI1可能会有效抑制OSCC的发生、发展、侵袭、 转移,但是目前Hh信号通路在OSCC中的作用及机制仍不明确,仍需要进一步研究。 GLI1、SuFu可能作为OSCC潜在的诊治靶点,为OSCC的诊治提供一个新的研讨方 向。

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致 谢

岁月荏苒,时光飞逝,三年研究生生涯即将告一段落,踏上另一个 追梦的旅程。在此,感谢所有在我研究生学习阶段给予我帮助的老师。

首先,衷心感谢我的导师杨森老师,感谢杨森老师给予实验中的引 导,论文撰写中的指导,在工作、学习中的向导。杨森老师不仅是学习 中的导师,而且也是人生中的导师。杨森老师严谨认真的教学方式、雷 利风行的做事方式、谦逊温和的待人方式深深感染了我,教会了我做人、 做事不忘初心。谢谢杨森老师这三年中给予的一切帮助!

其次,感谢基础实验室张爱洁老师、孟君老师、段炼师兄给予我细 胞实验的帮助,感谢病理科崔丽娟老师、杨槐老师、刘禄老师、叶川师 姐、何正月师姐给予我组织实验的支持。归功于各位老师的帮助与支持, 毕业论文实验才能顺利完成。

然后,感谢科室王强老师、罗佳老师、羊正林师兄、贾宝林师兄、 刘小利师兄、何敏师姐、何林师姐在规培过程中的教导,让我对颌面外 科有更深层次的理解。在他们的言传身教下,能熟练的独立完成口腔科 的各种操作,常见病的诊断与治疗。

借此,感谢遵义医科大学,谢谢学校培养了我。这三年的学习生涯, 将是我人生中浓墨重彩的一笔。

最后,感谢我的家人,家永远是我最后的港湾。

再次感谢所有帮助过我的老师!