NLRP3炎症小体在过敏性鼻炎发展中的作用与机制研究论文

2020年10月30日14:53:29NLRP3炎症小体在过敏性鼻炎发展中的作用与机制研究论文已关闭评论

NLRP3炎症小体在过敏性鼻炎发展中的作用与机制研究论文

摘要

背景:

过敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)全球发病率居高不下,继发于AR的多种临 床症状和疾病严重影响了人类的生活质量。目前国内外对于AR发病机制的研究尚不 透彻,且多集中于适应性免疫应答调控,而天然免疫应答在AR发生发展中的作用研 究相对较少,特别是针对其中炎症反应的临床治疗手段尚不完善,因此慢性炎症如何 维持的调控机制亟待研究。炎症小体过度活化而产生的大量IL-1卩是众多慢性炎症性 疾病发生和进展的重要机制,其活化过程和放大环路的研究是近年来的热点。新近研 究发现炎症小体关键接头分子ASC的聚合体(ASC-specks)可以通过内吞,以类似于旁 分泌的形式活化周边细胞诱导其发生焦亡现象,进而形成炎症小体放大环路,发挥局 部微环境的促炎效应。

目的:

探究NLRP3炎症小体在AR发生发展中的作用,揭示其潜在的分子机制,为AR 的早期干预和临床治疗提供新的思路和靶标。

方法:

1、 临床样本分析:检测AR患者和正常对照组鼻腔灌洗液中IL-1卩和IL-18的表 达量;免疫组化分析AR患者和正常对照组鼻黏膜组织内炎症小体活化情况。

2、 动物模型分析:1)在ovalbumin(OVA)^导的AR小鼠模型中,检测鼻黏膜组 织内炎症小体活化情况;2)在OVA诱导的AR小鼠模型中,比较WT小鼠和NLRP3 基因敲除小鼠AR症状,血清内IgE含量,鼻黏膜组织内炎症小体活化情况、炎症因 子表达情况以及嗜酸性粒细胞相关因子表达情况;3)在OVA诱导的AR小鼠模型中, 给予caspase-1特异性抑制剂干预,建立炎症小体小鼠体内抑制模型,检测小鼠AR 症状,血清内IgE含量,鼻黏膜组织内炎症小体活化情况、炎症因子表达情况以及嗜 酸性粒细胞相关因子表达情况。

3、 细胞实验功能分析:应用NLRP3炎症小体经典活化方案(LPS预刺激THP-1 细胞6h,ATP再刺激30min)收集ASC-specks复合体,体外刺激LPS预刺激的BEAS-2B 细胞,建立模拟鼻黏膜炎症微环境的细胞模型,检测BEAS-2B细胞的活性(是否发 生焦亡)及胞内炎症小体活化情况。

结果:

1、 与正常对照组相比,AR患者鼻腔灌洗液中IL-1卩和IL-18的表达量显著增高, 鼻黏膜组织内caspase-1活化增强、IL-邛表达量增高。

2、 OVA诱导的AR小鼠鼻腔灌洗液和鼻黏膜组织内IL-1卩表达量增多,鼻黏膜 组织内caspase-1剪切体和IL-邛剪切体表达增高。

3、 与WT小鼠相比,NLRP3基因敲除的小鼠AR症状得以明显缓解,血清IgE 含量无变化,鼻黏膜组织内促炎性细胞因子IL-6和IL-邛表达量减少,趋化因子Cxcl9 和CxcllO表达量减少,嗜酸性粒细胞活化相关细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的表达 量减少,嗜酸性粒细胞分泌蛋白Earl表达量减少,caspase-1剪切体、IL-1卩剪切体和 Gasdermin D蛋白表达减少

4、 与对照组相比,应用caspase-1抑制剂处理后小鼠AR症状得以明显缓解,血 清IgE含量无变化,鼻黏膜组织内促炎性细胞因子IL-6和IL-ip表达量减少,趋化因 子Cxcl9和CxcllO表达量减少,嗜酸性粒细胞活化相关细胞因子IL-4、IL-5和IL-13 的表达量减少,嗜酸性粒细胞分泌蛋白表达量减少,caspase-1剪切体和IL-邛剪切体 减少。

5、 与对照组相比,使用ASC-specks体外刺激BEAS-2B细胞,细胞上清中LDH 释放增多,IL-1卩分泌增多,caspase-1剪切体、IL-邛 剪切体和Gasdermin D-N均增 多。

结论:

我们的研究发现AR患者和OVA诱导AR小鼠的鼻腔黏膜内炎症小体活化均显 著增强;NLRP3缺失可有效抑制AR发生发展过程,减轻鼻黏膜组织内炎症反应, 减少鼻黏膜组织内细胞焦亡;使用caspase-1抑制剂治疗可有效缓解AR小鼠病程进 展,减轻鼻黏膜组织内炎症反应;进一步机制研究发现ASC-specks的过度聚集及其 继发的上皮细胞焦亡促进鼻黏膜组织损伤是炎症小体活化诱发AR的关键因素。本课 题研究证实NLRP3炎症小体活化通过维持鼻黏膜微环境的慢性炎症促进AR的发生 发展过程,而炎症小体活化导致细胞过度焦亡引起的组织损伤进一步推进AR疾病进 展,为临床AR的防治提出新的潜在干预靶点。

关键词:NLRP3,炎症小体,IL-1卩,细胞焦亡,过敏性鼻炎

Abstract

Background:

Allergic rhinitis (AR) has been recognized as one of the worldwide highly prevalent nasal inflamatory diseases with multiple clinical symptoms and complications, which severely disturbs the normal life and quality of human beings. Currently, the mechanisms underlying the development and regulation of AR are still elusive, with an intense concentration on the regulation of adaptive immune response. However, the roles of innate immune response in the AR progression has not been thoroughly studied, especially lack of clinical treatment targeting inflammatory response. Therefore, the regulatory mechanism for maintaining chronic inflammation during AR development is of great importance. Production of IL-1(3 resulting from excessive activation of inflammasome plays criticle roles in many chronic inflammatory diseases. And inflammasome activation and its associated amplification loop of inflammation attract much attention. Recent studies show that Asc-specks, a key adaptor of inflammasome, could induce cell pyrosis through endocytosis in a form similar to paracrine, which then forms the amplification loop of inflammasome to promote the inflammation response in the nasal microenviroment.

Objective:

To explore the roles of NLRP3 inflammasome activation in the development of AR, reveal its potential molecular mechanism, and provide novel approaches and targets for early intervention and clinical treatment of AR.

Methods:

  1. Analysis of the clinical specimens: The production of IL-1(3 and IL-18 in the nasal lavage fluid of AR patients and controls were measured. IHC analysis of the caspase-1 expression and IL-ip production in the nasal mucosal tissue was conducted.
  2. Animal model analysis: 1) The inflammasome activation in the nasal mucosal tissue of OVA-induced AR mice was detected. 2) The AR symptoms, serum IgE concentration, inflammasome activation and inflammatory cytokines in the nasal mucosal tissue between NLRP3 knockout mice and WT mice after OVA induction were compared. 3) The AR symptoms, serum IgE concentration, inflammasome activation and inflammatory cytokines in the nasal mucosal tissue between caspase-1 inhibitor-treated mice and controls after OVA induction were compared.
  3. Cell line experiment: The classic activation of NLRP3 inflammasome was applied to collect ASC-specks, which next stimulated LPS-primed BEAS-2B cells. Thus, the cell model of the inflammatory nasal mucosal microenvironment was constrcted. Cell viability of BEAS-2B cells and intracellular inflammasome activation were measured.

Results:

  1. Compared with the control group, the production of IL-1 卩 and IL-18 in nasal lavage fluid of AR patients was significantly increased, and the caspase-1 expression and IL-1(3 production in nasal mucosal tissue were also increased.
  2. The production of IL-1[3, expression of cleaved caspase-1 and cleaved IL-1 卩 were increased in the nasal mucosal tissue of OVA-induced AR mice compared with those of controls.
  3. The AR symptoms were relieved, production of IL-1|3, IL-6, IL-4, IL-5 and IL-13, expression of Cxcl9 and CxcllO, expression of Earl, expression of cleaved caspase-1, cleaved IL-1)3 and Gasdermin D were reduced, and the serum concentration of IgE unaltered in the nasal mucosal tissue of NLRP3 knockout mice than those of WT mice applied OVA-induced AR model.
  4. The AR symptoms were relieved, production of IL-1 卩,IL-6, IL-4, IL-5 and IL-13, expression of Cxcl9 and CxcllO, expression of Earl, expression of cleaved caspase-1 and cleaved IL-1 卩 were reduced, and the serum concentration of IgE unaltered in the nasal mucosal tissue of caspase-1 inhibitor-treated mice than those of controls applied OVA-induced AR model.
  5. The LDH release and production of IL-1(3 were increased in the supernatant of LPS-primed BEAS-2B cells after ASC-specks stimulation. The expression of cleaved caspase-1, cleaved IL-lp and Gasdermin D were increased in the nasal mucosal tissue of LPS-primed BEAS-2B cells after ASC-specks stimulation.

Conclusion:

In this study, we find that inflammasome activation is enhanced in the nasal mucosal tissue both in AR patients and OVA-induced AR mice compared with that of controls. Furthermore, NLRP3 deficiency significantly inhibits the development and progression of IgE-independent AR with alleviative inflammatory response and reduced cell pyroptosis in the nasal mucosal tissue. And caspase-1 inhibitor treatment effectively relieves the IgE-independent AR symptoms and reduces the inflammation in the nasal mucosal tissue. Moreover, mechanistical study shows that ASC-specks over-accumulation and its associated nasal epithelium pyroptosis could promote the injury of nasal mucosa during AR development. These results suggest the crucial roles of NLRP3 inflammasome in promoting the development and progression of IgE-independent AR, which is demonstrated by NLRP3 knockout mice and caspase-1 specific inhibitor treatment in vivo, and provide novel approaches and targets for early intervention and clinical treatment of AR, especially IgE-independent AR.

KEY WORDS: NLRP3, inflammasome, IL-ip, allergic rhinitis, pyroptosis

缩略词表

Abbreviations

英文全称

Absent in melanoma 2 atopic dermatitis airway hyperresponsiveness Allergic rhinitis apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD adenosine triphosphate danger associated molecular patterns Dimethyl sulfoxide extrinsic atopic dermatitis

Gasdermin D house dust mite intrinsic atopic dermatitis immunohistochemistry lactate dehydrogenase long non-coding RNA lipopolysaccharide message RNA microRNA nasal lavage fluid NOD-like receptors

NLR familyCARD-domain-containing 4

NLR family pyrin domain containing 3

白3卵清蛋白病原体相关分子模式模式识别受体RIG-I样受体Toll样受体

引言

过敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是世界公认的重要呼吸道慢性非感染性炎症疾 病之一,发病率居高不下,全球约有20%到30%的人口深受其困扰[切。由于AR患 者的临床数据资料依赖于医院记录,而事实上还存在许多未被诊断或自行用药的患者, 因此AR的实际发病率远高于统计数据显示的结果。根据过敏症状出现的时间不同, AR可被细分为季节性AR和常年性AR⑶。常年性AR —般由室内变应原引起,如尘 嫡、霉菌、动物皮屑、嶂螂等,因此过敏症状常年存在,一般可持续9个月以上,与 季节变化无关。而季节性AR主要由树、草和花粉等变应原诱发,有时被称为“花粉 症”,多发于春秋两季。AR的发生不仅与环境因素密切相关,还受到遗传因素的影 响。有研究表明,在无家族患病史的情况下过敏性疾病的发生率仅为17%;而家族成 员中直系亲属有患病史的情况下,患病风险会增加至29%;如果父母双方均为过敏体 质,其后代发生过敏性疾病的风险高达47%⑷。同时有研究发现,定位于6号染色体 的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)II类基因中某些位 点参与控制IgE介导的超敏反应⑸。AR的临床表现为典型的过敏原反应的结果,主 要症状包括鼻痒、清水样鼻涕、阵发性喷嚏和鼻塞,部分伴有嗅觉障碍,同时可能合 并其他疾病,如哮喘、慢性鼻-鼻窦炎、分泌性中耳炎等⑹。尽管AR是非致死性疾病, 但由于其在不同年龄人群中的高发性和难治愈性,导致AR患者往往生理和心理上承 受双重压力,严重影响患者的生活质量⑺叭 因此,更好的理解AR的发病机制,寻 求新的潜在治疗靶点,一直是AR研究领域的重要科学问题。

目前一般认为AR是由IgE介导的I型超敏反应。当吸入性过敏原首次进入鼻腔 后,刺激机体产生特异性IgE抗体,IgE通过其Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表 面受体结合,此为致敏阶段。当过敏原再次进入机体时,特异性IgE迅速产生,与上 述致敏细胞结合诱导其脱颗粒,释放组胺、胰蛋白酶、白三烯和前列腺素等活性介质, 导致鼻黏膜水肿、鼻腔水样分泌物增多、鼻腔黏膜血液淤积⑼。在持续性接触过敏原 的过程中,鼻黏膜内炎症反应加剧,导致机体对过敏原敏感性逐渐增强,随着时间的 推移,机体愈加容易产生过敏症状。在人体内,免疫应答是免疫系统识别和清除“非 己”物质的过程,可分为天然免疫和适应性免疫两大类。近年来,对于AR发病过程 中的调控机制的研究多关注于适应性免疫应答。研究发现在组胺等介质释放后,大量 炎症细胞可被招募浸润至鼻黏膜组织内,包括Th2淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等,进 而促进鼻腔内迟相过敏反应[1°】。然而天然免疫应答在AR发生发展中的研究尚不透彻, 因此探索天然免疫应答反应在AR发病过程中的作用将为AR的研究提供新的思路。

天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线,研究发现病原微生物表面存 在一些结构恒定进化保守的物质,我们将其称为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs) □天然免疫细胞表面存在特异性识别PAMPs的 受体,称为模式识别受体(pattern recognized receptors, PRRs), PRRs的发现帮助我们 更好地理解机体天然免疫对自我和非我的识别保护功能。常见PRRs包括Toll样受体 (Toll like receptors, TLRs) , RIG-I 样受体(RIG-I like receptors, RLRs), NOD 样受体 (NOD like receptors, NLRs)。目前关于Toll样受体在AR发病中作用的相关研究较多, 而后两者的研究较少且缺乏明确分子机制的探讨。

NOD样受体家族中炎症小体活化及其放大环路的研究是近年来的热点,其中 NLRP3炎症小体是最早被研究和报道的分子,目前证实其在外源性PAMPs引起的微 生物感染,神经退行性疾病以及内源性DAMPs(danger associated molecular patterns, DAMPs)引起的高血压、II型糖尿病、肿瘤、肠炎等疾病中均发挥重要作用Mi]。目前 对于NLRP3激活机制共提出三种模型:1、半通道模型,ATP激活离子通道,钾离子 外流,胞膜形成小孔,配体内流;2、溶酶体破坏模型,主要是晶体类物质内吞破坏 溶酶体,释放蛋白酶激活NLRP3 ; 3、活性氧物质ROS(reactive oxygen species, ROS) 模型,ROS作为共刺激信号激活NLRP3〔i2]。NLRP3激活后通过凋亡相关点样蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain, ASC)与 caspase-1前体相互作用形成高分子量的蛋白复合物,进而活化caspase-1,剪切IL-1J3 和IL-18前体蛋白,促进IL-1卩和IL-18的成熟和释放,参与调控Thl、Th2和Thl7 细胞介导的免疫反应过程[1344]o同时在炎症或应激的病理条件下,炎症小体活化还可 诱导细胞发生焦亡(pyroptosis)o细胞焦亡是一种新的程序性细胞死亡方式,其特征为 依赖于caspase-1和Gasdermin D (GSDMD)的剪切活化,并伴有大量促炎症因子的 释放。有研究发现在屋尘^(house dust mites, HDM)诱发的皮炎模型中,NLRP3炎症 小体活化可诱导角化细胞分泌IL-ip和IL-18[15];哮喘患者支气管上皮细胞中NLRP3 和caspase-1的表达显著增高〔⑹。这些研究结果提示NLRP3炎症小体与过敏性疾病有 密切关联,然而关于NLRP3炎症小体在AR发生发展过程的作用和机制尚不明确。

基于以上研究背景,我们研究了 NLRP3炎症小体在AR发生发展过程中的作用 与机制,结果发现,与正常对照相比,AR患者鼻腔灌洗液中IL-1卩的表达量增高, 且鼻腔黏膜中NLRP3炎症小体活化增强;OVA诱导的AR小鼠鼻腔灌洗液中IL-1卩 的表达量增高,鼻腔黏膜组织内NLRP3炎症小体活化亦有所增强。在OVA诱导模型 中,相较于WT小鼠,NLRP3基因敲除(NLRP3,)小鼠的AR症状明显缓解,鼻腔 黏膜内炎性细胞浸润减少,炎症细胞因子分泌降低;使用caspase-1抑制剂干扰炎症 小体活化后,小鼠的AR症状亦明显改善,鼻腔内炎症反应减弱。进一步探讨其机制 我们发现炎症小体活化导致鼻黏膜细胞过度焦亡是AR黏膜细胞损伤的关键因素,最 终导致AR病情加重,甚至出现嗅觉障碍。由此,我们揭示了 NLRP3炎症小体活化 在AR形成过程中的作用与机制,为AR临床治疗提供了新的思路和靶标。

材料与方法

—、实验材料

1.1临床样本

2017年6月至2019年1月间就诊于长征医院耳鼻咽喉头颈外科的患者,依据 ARIA 2016 (患者的临床表现、鼻腔检查及皮肤点刺实验结果)确诊后入组[⑺,包含 过敏性鼻炎40例(22男,18女,平均年龄48.85岁±12.96岁,范围17岁-67岁)和 正常对照14例(7男,7女,平均年龄41.50岁+14.07岁,范围23岁-68岁)。AR 伴鼻中隔偏曲患者(女,36岁)和鼻中隔偏曲患者(女,31岁)取鼻黏膜组织制作 标本。患有其他鼻腔、鼻窦疾病的患者(慢性鼻-鼻窦炎、非变应性鼻炎、结缔组织 病、鼻腔鼻窦肿瘤等)被排除在外。在本研究中,如果受试者在手术前3个月内接受 过口服类固醇,则被排除在外。样本收集前,患者至少停用局部类固醇和抗组胺药物 一个月。没有患者接受过抗白三烯或免疫治疗。所有患者均已签属临床样本收集知情 同意书。

使用10ml无菌生理盐水缓慢冲洗患者鼻孔。要求患者将头倾斜10秒,闭上软腭, 屏住呼吸,然后收集灌洗液,倒入无菌容器中,加入蛋白酶抑制剂(5871,Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 3000rpmX 15min离心后取上清,-80°C保存样品后以待后 续研究分析[⑻。

正常对照组和AR患者组临床信息详见表1-1-1和表1-1-2。

1-1-1正常对照组临床信息

Table 1-1-1 The clinical characteristics of controls

编号 性别 年龄 过敏史 饮酒史 吸烟史 家族史
1 39
2 24
3 50
4 49 20年,3两/日 20年,10支/日
5 62
6 52
7 24 牛奶
8 23
9 34
10 31
11 42
12 48 15年,2两/日
13 68
14 35

1-1-2 AR患者组临床信息

Table 1-1-2 The clinical characteristics of AR patients

编号 性别 年龄 过敏史 饮酒史 吸烟史 家族史
1 65 30年,3两/日 30年,15支/日
2 53
3 42 20年,2两/日 20年,10支/日
4 55
5 17 头抱 母亲过敏性鼻炎
6 27 5年,1两/日
7 39
8 67
9 61 青霉素
10 57
11 44
12 64
13 60
14 64 女儿过敏性鼻炎
15 41 青霉素 20年,10支/日
16 44
17 49
18 44 青霉素
19 36
20 67 40年,2两/日 40年,10支/日
21 32
22 47
23 61
24 62
25 49
26 18
27 58
28 35
29 60
30 63
31 62
32 37
33 51
34 53
35 36
36 51 儿子过敏性鼻炎
37 55
38 46
39 39 牛奶
40 43

1.2实验动物

C57BL/6小鼠购买于上海必凯实验动物公司。以C57BL/6为背景构建的NLRP3’ 小鼠由华东师范大学杜冰教授惠赠,使用CRISPR/Cas9技术敲除基因组启动子区域 7bp碱基获得[⑼。所有小鼠均在SPF级环境下饲养。

1.3细胞系

人急性单核细胞白血病单核细胞株THP-1购自中科院上海生命科学院细胞库, 使用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Semm,FBS)的DMEM培养基培养。人的支气管 上皮细胞系BEAS-2B由华中科技大学刘争教授惠赠,该细胞系在含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。所有细胞均使用5%CO2, 37弋的孵箱无菌培养。

1.4试剂

实验所使用试剂名称、货号及公司来源详见表1-2O

12实验试剂目录

Table 1-2 Catalog of reagents

试剂 货号 公司
ASC Rabbit mAb单克隆抗体 67824 Cell Signaling Technology

(Danvers, MA)公司

ASC Rabbit mAb单克隆抗体 13833 Cell Signaling Technology

(Danvers, MA)公司

IL-1|3 Mouse mAb单克隆抗体 12242 Cell Signaling Technology

(Danvers, MA)公司

Cleaved Gasdermin D 50928 Cell Signaling Technology
Antibody 抗体   (Danvers, MA)公司
Gasdermin D Antibody 抗体 93709 Cell Signaling Technology

(Danvers, MA)公司

P-actin Rabbit mAb 单克隆抗 4970 Cell Signaling Technology
  (Danvers, MA)公司
Anti-mouse IgG, HRP-linked 7076 Cell Signaling Technology
Antibody   (Danvers, MA)公司
Anti-rabbit IgG, HRP-linked 7074 Cell Signaling Technology
Antibody   (Danvers, MA)公司
二 甲亚砚(Dimethyl sulfoxide,

DMSO)

D2650 Sigma-Aldrich 公司
脂多糖 LPS from Escherichia

co〃Olll:B4

L4391 Sigma-Aldrich 公司
5「三磷酸腺昔(ATP)二钠盐 水合物 A1852 Sigma-Aldrich 公司
细胞毒性检测试剂盒

Cytotoxicity Detection kit

(LDH)

11644793001 Sigma-Aldrich 公司
聚乙二醇(PEG300) 90878 Sigma-Aldrich 公司
RPMI 1640 Medium 培养基 L0500 Biowest 公司(France)
DMEM High Glucose 培养基 L0102 Biowest 公司(France)
Fetal Bovine Serum (FBS) 10099141 Gibco™公司

Australia Origin

Belnacasan VX-765 Selleck 公司
OVA 0-1000-100 Biosearch Technologies
ASC antibody sc-22514-R Santa Cruz Biotechonology
    (Santa Cruz, CA)
Anti-Caspase-1 antibody abl872 Abeam (Cambridge, MA)
Anti-NLRP3 antibody ab214185 Abeam (Cambridge, MA)
Imject®Alum 力161 Thermo Scientific™公司
Mouse IgE ELISA Kit 70-EK275-96 MultiSciences 公司
Mouse IL-1(3 High Sensitivity 70-EK201BHS-96 MultiSciences 公司
ELISA Kit    
Mouse IL-18 ELISA Kit 70-EK218-96 MultiSciences 公司
Human IL-1(3 High Sensitivity 70-EK101BHS-96 MultiSciences 公司
ELISA Kit    
Human IL-18 ELISA Kit 70-EK118-96 MultiSciences 公司
Human IgE ELISA Kit 70-EK175-96 MultiSciences 公司
蛋白定量试剂盒Pierce™ 23225 Thermo Scientific™公司
BCA Protein Assay Kit    
超敏化学发光底物 34095 Thermo Scientific™公司

SuperS ignal™ West Femto

Maximum Sensitivity Substrate

1.5主要设备及软件

病理切片机(上海探卡仪器有限公司RM2016)

脱水机(武汉俊杰电子有限公司JJ-12J)

包埋机(武汉俊杰电子有限公司JB-P5)

组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司KD-P)

烤箱(上海慧泰仪器制造有限公司DHG-9140A) 载玻片(江苏世泰实验器材有限公司80312-3181) 盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司102124320 微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司P70D20TL-P4) 脫色摇床(Servicebio TSY-B)

涡旋混合器(Servicebio MX-F)

移液枪(Dragon KE0003087/KA0056573)

掌上离心机(Servicebio D1008E)

实时荧光定量PCR仪器(Roche公司,所使用的相应软件为Lightcycler3) 荧光共聚焦显微镜(LEICA TCS SP8 CARS)

二、实验方法

2.1小鼠的获得与鉴定

野生型C57BL/6小鼠购自上海必凯实验动物有限公司oC57BL/6背景下的NLRP3 敲除小鼠由华东师范大学杜冰教授馈赠,利用CRISPR/Cas9在基因组启动子区域敲 除7bp构建。采用PCR法对小鼠尾部提取的基因组DNA进行基因型鉴定。鉴定引物 序列为:forward 5'-TTG AAG ATG TGG ACC TCA AG-39Reverse 5 '-CAA TCA TGA GTG TGG CTAGA-35[20]o所有动物实验均按照国家卫生研究院《实验动物护理与使 用指南》进行,并经中国人民解放军第二军医大学科学调查委员会批准。所有动物均 饲养在无病毒设施中,并在标准温度和光照控制的动物设施中饲养。

2.2 AR小鼠模型的构建

试剂配制:OVA储液/滴鼻激发工作液(lOOmg/mL, 100X):无菌条件下称取 lOOmg OVA粉剂,溶于ImL生理盐水,充分混匀,4。(2保存,长时间不用后应重新 配制(观察:OVA无法完全溶解而成混悬液)

OVA腹腔注射致敏工作液(lmg/mL):将OVA储液稀释至IX,按1: 1的比 例与Imject®Alum混合,充分混匀。

A致敏阶段(3周):分别于第0、7、14天,三次进行腹腔注射OVA工作液致 敏,注射剂量为100吐/只(50憾OVA/只)。对照组注射等体积生理盐水BQ]。

B激发及维持阶段(第21-28天):自第21天开始进行滴鼻,每日进行一次, 激发及维持炎症。滴鼻时实验组每只小鼠左右鼻腔各滴入lOpiLOVA储液,滴入后拎 住鼠尾倒置小鼠数秒。对照组同法滴入等量生理盐水㈡㈣。

小鼠挠鼻/打喷嚏症状评价:滴鼻结束后进行实验记录。方法:小鼠静息至少15min 后,单鼠单笼观察记录15min内两种症状发生次数。结果数据展示每分钟挠鼻/打喷 嚏平均次数。

组织形态学评价:实验结束后处死小鼠。使用2%戊巴比妥钠将小鼠深度麻醉, 腹腔注射0.3mL/只,15〜20mL4%甲醛或PFA心脏灌流后取鼠头,去皮,完整保留鼻 腔及嗅球、脑组织,4%甲醛固定,切片。

小鼠鼻腔灌洗液获得:深麻醉下进行部分气管切除后,通过上气道方向的气管开 口将一根22号导管插入后鼻孔。每个鼻腔用0.5 niL预先加热的生理盐水轻轻灌流, 并从鼻孔收集液体,离心分离后上清液在7(TC下储存,用酶联免疫吸附试验(ELISA) 测定细胞因子。

  • Caspase-1抑制剂和ATP刺激组构建

抑制剂组(图2-4-1):首先OVA致敏小鼠,小鼠腹腔注射OVA(1 憾/piL)和 Imject®Alum混合液,每周腹腔注射1次,持续3周,注射剂量为100吐/只。第四周 开始于OVA(100(ig/ML)滴鼻,分别在用OVA滴鼻前10分钟和滴鼻OVA10分钟后, 使用生理盐水(20 pL)或 5 mg/kg Belnacasan (5 mg in 0.7 mL ddH2O with 0.3 mL PEG300 and 20(iLDMSO)给予小鼠滴鼻,所有操作进行7天,每天1次。

ATP组(图2-4-2):首先致敏小鼠,小鼠腹腔注射OVA(1囲/吐)和Imject®Alum 混合液,每周腹腔注射1次,持续3周,注射剂量为lOOpiL/只。然后用生理盐水和 ATP 20|iL滴>,10min后再用OVAdOOfig/pL)滴鼻,所有操作进行7天,每天1次。

抑制剂组(图2-4-3):首先OVA致敏小鼠,小鼠腹腔注射OVA(1(ig/吐)和 Imject®Alum混合液,每周腹腔注射1次,持续3周,注射剂量为100吐/只。第四周 开始使用OVA(100(ig/ML)滴鼻7天,每天1次。第五周开始用生理盐水(20吐)或5 mg/kg Belnacasan(5 mg in 0.7 mL ddH2O with 0.3 mL PEG300 and 20 yL DMSO)给予小 鼠滴鼻刺激7天,每天1次。

最后一次滴鼻刺激结束后,计数小鼠15min内打喷嚏和挠鼻的次数。最后一次鼻 腔刺激24小时后,取下腔静脉外周血,离心制备血清。无菌操作下解剖小鼠鼻腔, 对窦腔结构进行进一步的组织学和免疫学分析。采集鼻窦黏膜组织,进行实时荧光定 量 PCR(Real-Time PCR, qRT-PCR)和 Western blotting 检测。

  • 免疫印迹(Western blotting)

采集细胞或组织,用细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology)加蛋白酶抑制剂 (Calbiochem)进行裂解,12000rpm 4°C 离心 15mino 取上清用双辛酸(biinchoninic acid, BCA)法(Pierce)测定裂解产物的蛋白浓度。使用裂解缓冲液平衡蛋白浓度后,取等量 提取物加loading buffer制样,-20°C保存样品。样品加载SDS-PAGE,电泳完成后转 移到硝化纤维素膜上,转膜完成后在含10%脱脂奶粉的TBST缓冲液中室温封闭lho 孵育一抗4弋过夜;二抗室温lh,随后进行化学发光显影[20】。

  • RNA分离及qRT-PCR分析

按照使用说明书,使用TRIzol试^!j(Invitrogen, Carlsbad, CA)从小鼠鼻腔黏膜组织

中提取总RNAo取0.25mg组织用0.5ml Trizol裂解,使用组织机械研磨仪充分匀浆, 裂解液中加入O.lmL氯仿,室温静置3min,随后4°C, 12000rpm离心15min,转移 上层水相至新EP管中,加入0.25mL异丙醇,混匀室温静置lOmin,再次4°C, 12000rpm 离心lOmin,弃上清,用75%乙醇洗涤沉淀两遍,4°C, lOOOOrpm离心5min后,室 温稍干燥,最后用40ul DEPC水溶解沉淀,进行浓度和纯度测定(GeneQuant II, Pharmacia Biotech),最后进行反转录。qRT-PCR分析采用瑞士罗氏公司的LightCycler 和中国大连Takara公司的SYBR RT-PCR试剂盒进行操作如。mRNA的相对表达量 以P-actin作为内参。

qRT-PCR引物序列如下:

mouse IL-1 卩(forward: 5‘- GGT GTG TGA CGT TCC CAT TAG AC -3\reverse: 55- CAT GGA GAA TAT CAC TTG TTG GTT GA 3);

mouse IL-6 (forward: 5‘- TAG TCC TTC CTA CCC CAA TTT CC -3\ reverse: 55- TTG GTC CTTAGC CAC TCC TTC 3);

mouse IL-18 (forward: 5‘- GAC TCT TGC GTC AAC TTC AAG G -35? reverse: 5‘- CAG GCT GTC TTT TGT CAA CGA 3);

mouse TNF-a (forward: 5‘- AAG CCT GTA GCC CAC GTC GTA -3\ reverse: 55- GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG 3);

mouse IL-4 (forward: 5‘- GGT CTC AAC CCC CAG CTA GT -35, reverse: 5‘- GCC GAT GAT CTC TCT CAA GTG AT -35);

mouse IL-5 (forward: 5‘- GCA ATG AGA CGA TGA GGC TTC -3\ reverse: 5‘- GCC CCT GAA AGA TTT CTC CAATG 3);

mouse IL-13 (forward: 5‘- TGA GCA ACA TCA CAC AAG ACC -3\ reverse: 5‘- GGC CTT GCG GTT ACA GAG G -35);

mouse Cxcl9 (forward: 5‘- GGA GTT CGA GGA ACC CTA GTG 3, reverse: 55- GGGATTTGTAGTGGATCGTGC 3);

mouse CxcllO (forward: 55- CCA AGT GCT GCC GTC ATT TTC -3\ reverse: 55- GGC TCG CAG GGA TGA TTT CAA 3);

mouse Nlrp3 (forward: 5‘- ATT ACC CGC CCG AGA AAG G -3\ reverse: 5‘- CAT GAG TGT GGC TAG ATC CAA G -3 J;

mouse Asc (forward: 5‘- GAC AGT GCA ACT GCG AGA AG -3\ reverse: 5‘- CGA CTC CAG ATA GTA GCT GAC AA 3);

mouse Caspase-1 (forward: 5‘- ACA AGG CAC GGG ACC TAT G -3\ reverse: 55- TCC CAG TCA GTC CTG GAA ATG 3);

mouse Earl (forwardiS9- CAT GCC TGG GTC AAA CCC C -3’,reversed9- ATT TGT TGC CCG ACT GGT GAT 3);

mouse P-actin (forward: 5'-AGT GTG ACG TTG ACA TCC GT-35? reverse: 59-GCA GCT CAG TAA CAG TCC GC-35);

  • 免疫组化(immunohistochemistry, IHC)

使用含有1%牛血清白蛋白的PBS按照1:200浓度稀释抗体,并且在4°C下孵育 过夜。次日,使用 Dako ChemMate EnVision 检测试剂盒(DAB)兔/小鼠(Dako, Glostrup, 丹麦)进行免疫染色,抗原部位出现褐色沉淀为阳性结果。随后,切片使用苏木精 (Zymed Laboratories, San Francisco, CA)进行反染,置于非水介质中并覆盖,脱水封片。 使用 Image - Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD)软件自动计算 IHC 扫片图 片中视野平均浓度(MOD二IOD/area)o小鼠鼻黏膜组织内蛋白表达水平以所有切片扫 描统计数据取平均值获得。

  • ASC-specks 分离纯化

LPS(l(ig/mL)刺激巨噬细胞株THP-1细胞6小时后,AT玖10mM)刺激30分钟。 轻轻摇晃培养板,吸取培养上清。转移至含同样体积的50% Percoll的CHAPS缓冲 液(20mM HEPES-KOH, pH 7.5,5mM MgCl2,0.5mM EGTA, O.lmM PMSF 和 0.1% CHAPS), 10,000g 4。(2离心30分钟,收集离心沉淀并用CHAPS缓冲液洗1次,10,000g 4。(2离心30分钟,弃去上清,PBS吹打收集离心沉淀,BCA蛋白质定量。上述第一 步离心沉淀在50%的CHAPS缓冲液0.5mL中加入2mM的DSS室温交联30分钟后, 109000g 4°C离心30分钟,收集离心沉淀并用CHAPS缓冲液洗1次,109000g 4°C离 心30分钟,弃去上清,PBS吹打收集离心沉淀,BCA蛋白质定量0,26]。

2.8激光共聚焦显微镜

THP-1细胞培养爬片于载玻片上,使用小鼠特异性抗ASC抗体4弋孵育过夜, 随后用 Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (Invitrogen A-11003)抗体标记 1 小时,最后 涂上含DAPI (abl04139)的固定介质进行封片,锡箔纸包裹,避光保存。使用莱卡 LEICA共聚焦激光显微镜观察标记细胞切片。

2.9 ASC-specks诱导细胞焦亡检测

LPS(l(ig/mL)预刺激 BEAS-2B 细胞 6h,随后用 ASC-specks(100(ig/mL)刺激 BEAS-2B细胞lh,以此构建鼻黏膜炎症环境下的体外细胞模型。设计四个不同处理 组进行实验,包括对照组(无刺激)、LPS (l|big/mL, 6h) +ASC-specks (lOOyg/mL, 1 h)组、LPS(l(ig/mL, 6h)+ATP (10mM, 30min)组、LPS (l(ig/mL, 6 h)+ASC-specks (100|ig/mL, lh)+ATP(10mM, 30min)组。

2.10统计分析

采用SPSS 21.0和Graphpad Prism 6统计软件进行数据分析。相关数据以均值土 标准差(Mean 土 SD)来表示。实验组间差异使用两独立样本t检验,米用双尾p<0.05 表示有统计学意义。p值和危害比如图所示(*, p<0.05, **, pvO.Ol, ***, p<0.001)o

实验结果

一'临床相关性研究

(一)AR患者鼻腔灌洗液中NLRP3炎症小体活化增强

由于NLRP3单体在感知到危险信号,即受到活化刺激后,可通过亲和作用与ASC 发生相互作用,招募caspase-1前体的聚集,形成高分子量的炎症小体复合物 inflammasome,剪切caspase-1前体产生具有活性的caspase-1剪切体,进而剪切IL-ip 和IL-18的前体,促进IL-ip和IL-18的成熟和分泌。为了研究NLRP3炎症小体在 AR患者鼻腔内的活化情况,我们首先定量检测FAR患者鼻腔灌洗液(nasal lavage fluid, NLF)与正常对照组NLF中的IL-1卩和IL-18的表达量。结果发现与正常对照 组相比,AR患者的NLF中IL-1卩和IL-18的表达量均显著升高(图1-1),即在AR 患者鼻腔局部微环境内NLRP3炎症小体相关的细胞因子IL-ip和IL-18分泌增加, 提示AR患者鼻腔局部微环境内NLRP3炎症小体的活化增强。

AR患者鼻腔灌洗液中IL•邛和IL-18的表达量显著增咼。

Figure 1-1 The production of IL-1 and IL-18 in the NLF of AR patients (n=40) were increased than that of healthy controls (n=14). Data are shown as mean ± SD. *, pv005, ***, p < 0001

(二)AR患者鼻腔黏膜中NLRP3炎症小体活化增强

为了进一步明确AR患者鼻腔内NLRP3炎症小体的活化情况,我们随后使用免 疫组织化学(IHC)方法检测了 AR伴鼻中隔偏曲患者(AR patient)和单纯鼻中隔偏 曲患者(Control)鼻黏膜组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达情况。结果发现在 AR伴鼻中隔偏曲患者的鼻黏膜组织中IL-1卩和caspase-1的表达水平均显著咼于单纯 鼻中隔偏曲患者,NLRP3的表达水平稍高于对照患者(图1-2),以上结果进一步证 实NLRP3炎症小体在AR患者鼻腔黏膜组织内活化增强,提示其很可能在AR疾病 进展过程中发挥关键作用。

通过对AR患者鼻腔灌洗液和鼻黏膜组织样本的检测,我们发现在AR患者鼻腔 黏膜组织内IL-ip和IL-18的分泌增多,Caspase-1活性增强,提示AR疾病进展过程 中NLRP3炎症小体的活化是增强的。

(一)在OVA诱导的AR小鼠模型中,鼻腔炎症小体活化明显 增强
—\动物木吴型机制研究

在临床样本中我们检测到NLRP3炎症小体的活化,我们随后进一步思考这一现 象是否在AR动物模型中也存在。由于小鼠基因图谱已绘制完整,对其免疫系统的认 识也较为完善,小鼠的动物模型更偏于进行分子机制的研究。因此我们选择卵清白蛋 白(ovalbumin, OVA)作为致敏原,Imject®Alum作为佐剂,经腹腔致敏和鼻腔激发 两个阶段,构建AR小鼠模型(详见实验方法2.2),在小鼠体内检测NLRP3炎症小 体的活化情况。

首先在建模完成后(第4周),我们检测了小鼠AR的行为学特征,发现AR实 验组(OVA)小鼠挠鼻和喷嚏症状明显强于对照组(Saline)(图2-1-1)。随后,我 们使用苏木精-伊红染色(Hematein Eosin, HE)小鼠的鼻腔黏膜组织切片,结果显示 相较于对照组(Saline)小鼠,AR实验组(OVA)小鼠的鼻黏膜组织出现损伤,上 皮细胞排列紊乱,纤毛上皮出现部分脱落现象(图2-1-2)。行为学特征及HE病理 组织结果提示AR小鼠模型构建成功。

接着我们在OVA诱导的AR小鼠模型中检测炎症小体的活化情况,包括NLRP3 炎症小体活化相关的细胞因子IL-ip和IL-18的分泌,以及NLRP3炎症小体复合物 中ASC和caspase-1的表达情况和活化情况。首先我们收集了小鼠鼻腔灌洗液,使用 ELISA方法检测了细胞因子IL-1卩和IL-18的表达情况,发现AR实验组(OVA)小 鼠鼻腔灌洗液IL-ip和IL-18的表达量增多(图2-1-3) o使用IHC方法染色小鼠鼻 黏膜组织切片,结果显示AR实验组(OVA)小鼠鼻黏膜组织中IL-1卩的表达量同样 增多(图2-1-2)o与此同时,我们发现AR小鼠鼻黏膜组织中ASC、NLRP3和caspase-1 的表达量均有所增加,中性粒细胞(MPO染色)浸润增多(图2-1-2) o使用Western Blot方法检测小鼠鼻黏膜组织内NLRP3炎症小体相关蛋白的表达情况,我们发现AR 实验组(OVA)小鼠鼻黏膜中ASC单体(monomers)和二聚体(dimer)表达均增多, capase-1剪切体(caspase-1 p20)增多,IL-ip表达增多(图2-1-4)。由于炎症小体 的活化可催化caspase-1的剪切继而促进IL-lp成熟分泌,而NLRP3与ASC形成复 合物后ASC往往以二聚体多聚体形式存在,上述结果证实在OVA诱导的AR小鼠模 型中NLRP3炎症小体的活化显著增强。

细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性死亡方式,其特征继发于炎症小 体的活化,依赖于caspase-1的剪切活性,可参与多种系统性疾病的进展过程 如心血
管疾病、神经系统疾病等。根据实验结果我们进一步推测小鼠鼻黏膜组织的损伤是否 因细胞焦亡引起,所以我们检测了细胞焦亡的标志性蛋白GSDMD,结果发现AR实 验组(OVA)小鼠鼻黏膜组织内GSDMD表达量显著升高(图2-1-4)。以上实验结 果表明,在OVA诱导的小鼠AR疾病进展过程中,NLRP3炎症小体的活化显著增强, 提示炎症小体在AR进展中发挥着重要的作用。

2-1-1AR实验组(OVA)小鼠挠鼻和喷嚏症状明显强于对照组(Saline) o

Figure 2-1-1 Behavioral measures of AR were stronger in the OVA-induced AR mice than those of control mice (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments **, p v 001

2-1-2 AR实验组OVA)小鼠鼻黏膜组织中ASC, NLRP3, Caspase-1IL-1 B的表达量 显著增高,中性粒细胞浸润增多。

Figure 2-1-3 The production of IL-and IL-18 in the nasal lavage fluid of OVA-induced mice were increased than that of controls (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments **, p < 001
2-1-3 AR实验组OVA)小鼠鼻腔灌洗液IL-1PIL-18的表达量显著增咼。

2-1-4 AR实验组OVA)小鼠鼻腔黏膜组织中ASC, IL-ip, Caspase-1, GSDMD-N的表 达显著增高。

Figure 2-1-4 Levels of ASC, NLRP3, IL-ip, Caspase-1 and GSDMD-N were increased in the nasal mucosa tissues of OVA-induced mice were increased than that of controls

(二)NLRP3基因敲除可有效减缓AR疾病进展

NLRP3炎症小体作为最早被科学家关注并研究的炎症小体家族成员之一,在多 种细胞类型中可被激活,进而参与多种疾病的调控过程,例如心血管疾病、肥胖、阿 尔兹海默症等等。然而,在AR的发生发展过程中,NLRP3炎症小体是否具有重要 的潜在调控功能目前尚不清楚。在临床样本和小鼠样本中,我们发现AR患者和AR 小鼠鼻黏膜组织内NLRP3炎症小体活化显著增强(图1-1, 1-2, 2-1-2, 2-1-3), NLRP3 表达亦有所增加,提示NLRP3炎症小体在其中发挥重要作用。为了明确这一作用, 我们引入了 NLRP3基因敲除的小鼠,以期在敲除小鼠体内进一步探究炎症小体在AR 发病过程的作用与机制。首先我们比较了正常生理状态下(无OVA诱导)NLRP37- 小鼠与野生型(WT)小鼠的AR行为学特征,没有发现挠鼻和喷嚏频率有明显差异 (图2-2-1),即NLRP3缺陷并不影响小鼠生理状态下的挠鼻和喷嚏行为。随后我们 在NLRP3 7-小鼠与WT小鼠体内应用OVA诱导AR的小鼠模型,观察发现与WT小 鼠相比较,NLRP3 7-小鼠AR相关的行为学表现明显减少,包括喷嚏和挠鼻的频率(图 2-2-1),提示NLRP3缺陷可以有效缓解AR疾病症状。

2-2-1OVA诱导AR模型中,NLRP3 7小鼠的AR症状显著缓解。

Figure 2-2-1 Behavioral manifests were measured in saline or OVA-induced AR NLRP3 7' and WT mice (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments **, p < 001

接着我们分别对NLRP3 7-小鼠与WT小鼠的鼻腔黏膜组织切片进行HE和IHC染 色,结果分析发现相较于WT小鼠,NLRP3 7-小鼠的鼻腔黏膜内中性粒细胞浸润减少, 鼻黏膜损伤有所缓解(图2-2-2)。同时我们检测了小鼠鼻黏膜组织内NLRP3炎症小 体活化相关蛋白的表达情况,包括NLRP3、ASC、caspase-1及其剪切体、IL-1卩及其 剪切体和GSDMD的N片段。结果显示,NLRP3,小鼠鼻黏膜组织内NLRP3蛋白几 乎不表达,明确我们所使用的NLRP37-小鼠基因敲除有效;NLRP37-小鼠鼻黏膜组 织内caspase-K IL-1卩以及GSDMD-N的表达和活化均受到抑制,明确NLRP3的缺 失虽不直接影响炎症小体相关蛋白的表达,但是可有效抑制鼻黏膜组织内炎症小体的 活化(图2-2-2, 2-2-3) o上述结果证实,NLRP3缺陷后炎症小体的活化降低,从 而有效缓解了 AR的疾病进展过程。

2-2-2OVA诱导的NLRP3 7小鼠鼻黏膜中,IL■邛和caspase-1的表达显著降低,中性 粒细胞浸润减少。

Figure 2-2-2 Levels of IL-1 and caspase-1, and the infiltration of neutrophils in the nasal mucosa tissues of OVA-induced AR NLRP3 /_ mice were reduced than those of WT mice.

2-2-3OVA诱导的NLRP3 7小鼠鼻黏膜中,IL-lp, caspase-1剪切体和GSDMD-N表达 均降低。

Figure 2-2-3 Levels of IL-ip, cleaved caspase-1 and GSDMD-N were all decreased in the nasal mucosa tissues of OVA-induced AR NLRP3 /_ mice were reduced than those of WT mice.

(三)NLRP3通过正向调控鼻腔内炎性细胞因子的表达进而促 进AR病程进展

炎症小体活化后,一方面活化细胞本身发生焦亡,另一方面诱导大量IL-lp的成 熟释放,进而活化周边细胞,诱导局部形成炎症微环境。既然NLRP3缺陷可以缓解 AR症状,我们进一步推测NLRP3炎症小体是否通过调控一系列炎症因子的表达进 而促进AR疾病进展过程中的炎症反应。首先我们使用qRT-PCR方法检测了 NLRP3, 和WT小鼠鼻黏膜组织中促炎性细胞因子和趋化因子的表达情况,如IL-ip, IL-18, IL-6, Cxcl9和CxcllOo其中IL-1卩和IL-18是炎症小体活化下游的重要细胞因子,IL-6 是炎症反应中经典的促炎性细胞因子,Cxcl9和CxcllO分别参与趋化中性粒细胞、淋 巴细胞及单核细胞。使用qRT-PCR检测发现NLRP3缺失并不直接影响上述因子的本 底表达情况(图2-3-1, 2-3-2)。随后我们构建OVA诱导的AR小鼠模型,同样检测 NLRP37-和WT小鼠鼻黏膜组织中促炎性细胞因子和趋化因子的表达情况,发现 NLRP3的缺失可有效抑制上述细胞因子和趋化因子在鼻黏膜组织中的表达情况,进 而有效缓解了局部炎症反应(图2-3-1, 2-3-2)o

Figure 2-3-1 Productions of IL-ip, IL-18 and IL-6 were measured by qRT-PCR analysis. Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments. ***, p < 0.001.
2-3-1通过qRT-PCR技术检测发现在OVA诱导的NLRP3-/-小鼠鼻黏膜中,IL-ip, IL-18 IL6的表达量显著降低。

2-3-2通过qRT-PCR技术检测发现在OVA诱导的NLRP37小鼠鼻黏膜中,Cxcl9

CxcllO的表达量显著降低。

Figure 2-3-2 Expressions of Cxcl9 and CxcllO were increased in the nasal mucosa tissues of OVA-induced AR NLRP3 /_ mice than those of WT mice measured by qRT-PCR analysis. Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments *, p<0.05.

目前多数研究报道证实AR是一种典型的IgE介导型I型过敏症状,因此我们猜 想NLRP3缺失后减轻局部炎症缓解AR疾病进展的过程是否可能通过调节IgE的分 泌。我们比较了 NLRP3,和WT小鼠血清中IgE的含量,发现无论是IgE本底含量(即 无OVA诱导)还是OVA诱导后,二者均没有显著的差异,这一结果提示炎症小体活 化可能通过一种IgE非依赖形式,进而参与调控AR疾病的进展(图2-3-3) o

2-3-3通过ELISA检测发现在OVA诱导的NLRP37小鼠血清中IgE的含量没有显著变 化。

Figure 2-3-3 The concentration of IgE in serum of mice was unaltered by ELISA analysis between NLRP3 7' mice and WT mice Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments

此外,嗜酸性粒细胞是AR发生发展过程中重要的效应免疫细胞之一,那么在 NLRP3炎症小体活化AR疾病进展的过程中,是否引起了嗜酸性粒细胞功能的改变 呢?因此我们进一步研究了 NLRP3缺失对嗜酸性粒细胞分泌的细胞因子和蛋白表达 的作用。通过qRT-PCR检测发现,NLRP3缺失后并不影响小鼠鼻黏膜内IL-4、IL-5、 IL-13和Earl的本底表达量(图2-3-4,2-3-5)-但是在OVA诱导AR的过程中,NLRP3 敲除可显著抑制小鼠鼻黏膜内IL-4、IL-5、IL-13和Earl的表达量(图2-3-4,2-3-5)o 上述结果提示鼻黏膜组织内NLRP3炎症小体的活化参与正向调控AR疾病的进展过 程,这一过程中大量炎性细胞因子和趋化因子活化,招募中性粒细胞、淋巴细胞、单 核细胞等至鼻腔黏膜区域,不影响血清内IgE的含量,但与嗜酸性粒细胞功能密切相 关。

Figure 2-3-4 Productions of 11-4,11-5 and 11-13 were increased in the nasal mucosa tissues of OVA- induced AR NLRP3 7' mice than those of WT mice measured by qRT-PCR analysis. Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments *, p<0.05.
2-3-4通过qRT-PCR技术检测发现在OVA诱导的NLRP3 7小鼠鼻黏膜中,IL-4,IL-5IL-13的表达量显著降低。

NLRP3 -/-WT

2-3-5通过qRT-PCR技术检测发现在OVA诱导的NLRP3 7小鼠鼻黏膜中,Earl的表达 量显著降低。

Figure 2-3-5 The expression of Earl was increased in the nasal mucosa tissues of OVA- induced AR NLRP3 /_ mice than those of WT mice measured by qRT-PCR analysis. Data are

shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments *, p<0.05.

(四)抑制炎症小体活化可有效减缓AR进展

通过NLRP3基因敲除小鼠体内实验,我们证实炎症小体的激活参与促进了 AR 的发生发展,进而我们推测其可能成为AR新的潜在临床治疗靶点。为了探讨这一问 题,我们在OVA诱导AR小鼠模型中,分别引入caspase-1特异性抑制剂(Belnacasan) 和炎症小体激活剂(inflamasome activator, ATP),按照方法中详述步骤和剂量联合给药, 随后进行相应实验检测。通过对小鼠AR行为症状的检测,我们发现使用caspase-1 抑制剂(抑制炎症小体活化)后小鼠AR行为症状明显得以缓解图2-4-1);相反使 用AT玖炎症小体过度激活)可加重小鼠AR行为症状(图2-4-2) o

2-4-1使用caspase-1抑制剂联合给药治疗有效降低小鼠挠鼻和喷嚏频率。

Figure 2-4-1 Behavioral manifests were measured in OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment or Ctrl (n=5). Mice after sensitization were adjuvant challenged with saline or Belnacasan once a day 10 minutes before OVA challenging (Belnacasan before OVA group) or 10 minutes after OVA challenging (Belnacasan after OVA group). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments *, pv005, **, p < 001

2-4-2使用ATP处理小鼠挠鼻和喷嚏频率增多。

Figure 2-4-2 Behavioral manifests were measured in OVA-induced AR mice with inflammasome activator treatment (n=5). Mice after sensitization were adjuvant challenged with saline or ATP before OVA challenging. Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments *, p<0.05

上述结果提示在AR的发生阶段,使用caspase-1抑制剂可有效缓解AR的进展, 我们进一步思考此抑制剂是否可能在AR形成后(即患病阶段)发挥治疗作用,由于 临床中大多数AR患者前来治疗时往往处于患病阶段而非预防阶段,因此针对AR患 病阶段治疗的研究意义更为重要。我们在OVA诱导AR小鼠模型建立后,第五周开 始使用caspase-1抑制剂进行滴鼻给药治疗一周,随后进行相应实验检测。同样发现 使用caspase-1抑制剂处理后,小鼠的AR行为症状明显改善(图2-4-3) □Figure 2-4-3 Behavioral manifests were measured in OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment (n=5). Mice after 7-day-OVA intranasal administration were challenged with control or Belnacasan once a day. Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments **, p < 001
2-4-3 AR造模成功后,使用caspase-1抑制剂治疗有效降低小鼠挠鼻和喷嚏频率。

同时,AR模型小鼠的鼻黏膜组织免疫组化分析显示,caspase-1抑制剂治疗可以 缓解鼻黏膜组织的损伤,使其结构和细胞排列保持相对完整,减少中性粒细胞浸润, 降低IL-1卩和caspase-1的表达水平(图2-4-4)。通过对小鼠鼻黏膜组织的蛋白进行 Western blotting分析,我们确认了 caspase-1抑制剂可有效抑制炎症小体的活化,而 ATP可显著加剧炎症小体的活化(图2-4-5) o

上述结果提示鼻腔内局部炎症小体活化受阻可有效缓解AR症状,因此针对鼻腔 黏膜内炎症小体活化的调控可能是AR临床治疗的潜在靶点。

2-4-4 HEIHC染色分析发现,caspase-1抑制剂治疗后小鼠鼻黏膜组织损伤改善,IL-ip 的表达降低,中性粒细胞浸润减少。

Figure 2-4-4 Levels of IL-1 and infiltration of neutrophils in the nasal mucosa tissues from OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment were reduced than that of controls measured by IHC analysis Mice after sensitization were adjuvant challenged with saline or Belcnasam once a day 10 minutes before OVA challenging (Belcnasam before OVA group) or 10 minutes after OVA challenging (Belcnasam after OVA group).

2-4-5使用Western blotting方法在蛋白水平检测发现,caspase-1抑制剂治疗后小鼠鼻黏 膜组织内IL•邛和caspase-1剪切体表达减少。

Figure 2-4-5 Levels of cleaved IL-1 and cleaved caspase-1 in the nasal mucosa tissues from OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment were reduced than that of controls detected by Western blotting.

  • 抑制炎症小体活化可减少炎症细胞因子的表达进而缓解 AR疾病进展

前期研究发现,炎症小体活化通过促进促炎性因子的分泌参与AR的发生发展过 程,那么炎症小体活化受阻后,这些促炎性因子的表达是否受到抑制呢?随后我们在 OVA联合caspase-1抑制剂滴鼻给药的小鼠模型中,使用qRT-PCR技术分别检测了鼻 黏膜组织中促炎性细胞因子、趋化因子和嗜酸性粒细胞相关蛋白的表达情况。结果显 示,使用caspase-1抑制剂后,小鼠鼻黏膜组织内IL-邛、IL-6、Cxcl9、CxcllO、IL-4、 IL-5、IL-13和Earl的表达均显著降低(图2-5-1, 2-5-2, 2-5-3, 2-5-4),即炎症小 体活化受阻后,小鼠鼻黏膜组织内促炎细胞因子IL-邛和IL-6分泌减少,负责招募中 性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的趋化因子分泌减少,嗜酸性粒细胞功能相关的细胞 因子和蛋白分泌减少,局部微环境炎症反应减弱。

2-5-1通过qRT-PCR技术检测发现caspase-1抑制剂治疗后,小鼠鼻黏膜组织内IL-ipIL6的表达水平显著降低。

Figure 2-5-1 Productions of Il-ip and 11-6 in the nasal mucosa tissues from OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment were reduced than that of controls measured by qRT-PCR analysis (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments. *, p v 0.05, **, p < 0.01.

2-5-2通过qRT-PCR技术检测发现caspase-1抑制剂治疗后,小鼠鼻黏膜组织内Cxcl9 CxcllO表达量降低。

Figure 2-5-2 Expressions of Cxcl9 and CxcllO in the nasal mucosa tissues from OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment were reduced than that of controls measured by qRT-PCR analysis (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments *, p v 0.05

Figure 2-5-3 Productions of 11-4,11-5 and 11-13 in the nasal mucosa tissues from OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment were reduced than that of controls measured by qRT-PCR analysis (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments *, p v 0.052-5-3通过qRT-PCR技术检测发现caspase-1抑制剂治疗后,小鼠鼻黏膜组织内IL-4JL-5 IL-13的表达量降低。Ctrl+ Belnacasan Belnacasan

2-5-4通过qRT-PCR检测发现caspase-1抑制剂治疗后,小鼠鼻黏膜组织内Earl的表达 量降低。
OVA before OVA after OVA

Figure 2-5-4 The expression of Earl in the nasal mucosa tissues from OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment were reduced than that of controls measured by qRT-PCR analysis (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments *, p v 0.05

前期结果发现NLRP3缺失可通过IgE非依赖的形式缓解AR病情进展,因此我 们推测caspase-1抑制剂可能存在相似作用。通过ELISA检测小鼠血清内IgE的含量, 我们发现与对照组相比caspase-1抑制剂处理后,IgE含量没有显著的变化(图2-5-5 ), 从而证实了我们的假设,即caspase-1抑制剂也可通过IgE非依赖的形式缓解AR病 情进展。

上述结果表明,使用炎症小体的特异性抑制剂可有效抑制鼻腔黏膜中局部微环境 的炎症反应,减少促炎性细胞因子和趋化因子的分泌,干扰嗜酸性粒细胞功能,进而 有效缓解AR疾病进展过程,因此可能成为AR临床治疗的潜在新靶点分子。

2-5-5通过ELISA检测发现caspase-1抑制剂治疗后,小鼠血清中IgE的含量无差异性变 化。

Figure 2-5-5 The concentration of IgE in serum of OVA-induced AR mice with caspase-1 inhibitor treatment was unaltered measured by ELISA analysis (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments

三' 细胞与分子机制研究

ASC-specks的过度聚集及继发的上皮细胞焦亡促进鼻黏膜组织损伤

NLRP3炎症小体复合物激活后,可诱导ASC聚集形成ASC-specks,进而剪切 caspase-1 成为具有酶活性的 cleaved caspase-1[13],继而 cleaved caspase-1 水解促炎性 细胞因子IL-1卩前体,促进成熟的IL-lp合成并释放胞外;同时cleaved caspase-1可 剪切Gasdermin家族成员引起细胞穿孔,继而触发一种特殊的细胞死亡形式,称为细 胞焦亡(pyroptosis) [14]o细胞焦亡是新发现的一种炎症细胞程序性死亡方式,作为
机体天然免疫反应应答重要效应之一,它参与了多种系统性疾病的进展过程 如过敏 性疾病、心血管疾病以及神经系统疾病等,是近年来研究的热点。当细胞发生焦亡时, 大量的ASC-specks可被释放到细胞外基质中,并被附近的细胞以内吞等形式吸收, 进而促使细胞发生焦亡,释放成熟的IL-1卩[926]。由此,我们进一步推测,在AR的 发展过程中,是否是炎症小体活化后的ASC-specks过度聚集和相应的鼻黏膜细胞焦 亡导致了炎症反应放大,进而促进AR的病情进展。

为了解决这一问题,我们拟在体外细胞层面进行实验验证。首先我们使用 LPS+ATP体外联合刺激免疫细胞系THP-1,以激活炎症小体促进ASC-specks释放胞 外。通过ELISA、荧光共聚焦等相应检测,我们发现细胞外基质中存在ASC-specks 聚集,以及乳酸脱氢酶(LDH)和IL-1卩的释放(图3-1, 3-2)o3-1LPS预刺激和ATP刺激的THP-1细胞外基质中ASC-specks (A), LDH (B)IL-(C)的含量均随时间呈梯度增高。
ATP stimulation (min)

Figure 3-1 Quantification of extracellular specks (A), LDH (B) and IL-(C) were measured in cell-free supernatants of LPS-primed THP-lcells which then activated with ATP at indicated timepoints (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments.

3-2荧光共聚焦显微镜标记展示胞外ASC-specks聚集情况,箭头所示可观测到LPS+ATP 联合刺激活化诱导ASC-specks的聚集形成。

Figure 3-2 Confocal microscopy of ASC was shown of LPS-primed THP-lcells which then activated with ATP. Arrowhead indicated extracellular and potential extracellular ASC-specks.

随后,我们分离并纯化获得ASC-specks,刺激经LPS预处理过的BEAS-2B上皮 细胞,构建细胞模型模拟鼻腔黏膜炎症环境。LDH试剂盒检测显示存在LDH的胞外 释放,ELISA方法检测到IL-1卩的分泌,Western blotting显示细胞内caspase-1和 GSDMD (GsaderminD)剪切体明显增多(图 3-3,3-4,3-5)。

上述体外细胞实验结果表明,来源于巨噬细胞的ASC-specks可以被上皮细胞内 吞,促进上皮细胞焦亡、放大局部炎症反应。这一过程很可能是体内炎症小体活化正 向调控AR疾病进展的潜在机制,即鼻黏膜微环境中的ASC-specks激活上皮细胞的 炎症小体诱导其发生焦亡,随后炎症信号放大,造成局部上皮组织的损伤。

3-3 ASC specks刺激BEAS-2B细胞后,细胞上清中LDHIL1卩的含量显著增高。

Figure 3-3 Quantification of LDH and IL-1 were increased in supernatants of LPS-primed BEAS-2B cells which then stimulated with ASC-specks than that of untreated controls (n=5). Data are shown as mean ± SD from one representative experiment of three independent experiments

LPS +

LPS+ LPS+ ATP+

Ctrl ASC ATP ASC

ASC
3-4 ASC specks刺激BEAS-2B细胞后,胞内GSDMD-N蛋白水平的表达量显著增加。 Figure 3-4 Levels of GSDMD-N were detected by Western blotting of BEAS-2B cells.

Ctrl speaks

p45

Caspasel

p20

IL-1p

p-actin

3-5 ASC specks刺激BEAS-2B细胞后,胞内IL1卩和caspase-1剪切体蛋白水平的表达 量显著增高。

Figure 3-5 Levels of IL-ip and caspase-1 were detected by Western blotting of LPS-primed BEAS-2B cells.

讨论

AR的高发病率及难治愈性,严重影响AR患者的生活质量,因此更深入的探究 AR的发病机制,寻求新的潜在治疗靶点,一直是AR研究领域的重要科学问题。近 年来有关AR疾病相关研究多集中于适应性免疫应答,而人体内另一重要的免疫应答 机制——天然免疫应答,其在AR疾病进展中的作用研究尚不完善。天然免疫应答中 一类重要的分子炎症小体,它的发现为进一步深入理解炎症发生过程提出了新的机制, 也为机体过度炎症反应的控制提供了新的重要靶点,其相关研究近年来备受关注。越 来越多的研究发现,炎症小体可能作为连接天然免疫和适应性免疫的桥梁,发挥重要 的调控作用。目前炎症小体在过敏性疾病中的作用受到广泛关注,例如研究发现 NLRP3、ASC及IL-1R1敲除小鼠对于屋尘嫡(house dust mites, HDM)诱发的过敏性肺 部炎症反应具有抵抗耐受作用0,28]。而NLRP3炎症小体究竟是否直接参与AR的疾 病进展,以及其影响AR疾病进展的分子机制目前仍不清楚。基于此,本课题我们研 究了以NLRP3为代表的炎症小体在过敏性鼻炎疾病进展过程中的作用,发现其过度 活化加重了鼻腔黏膜中炎症反应,加剧黏膜上皮细胞焦亡,进而促进AR的病情进展。 细胞焦亡是一种新的程序性细胞死亡方式,其特征为依赖于caspase-1和Gasdermin D 的剪切活化,并伴有大量促炎症因子的释放;敲除NLRP3或靶向抑制其下游炎症小 体活化可有效缓解AR疾病进展,且这一过程不依赖于血清IgE的表达改变。因此, 该研究结果为AR的早期干预及临床治疗提供了新的潜在靶点。

值得注意的是,NLRP3炎症小体活化的下游主要信号通路为IL-ip和IL-18信号 通路,研究发现IL-1卩可显著促进Thl和Thl7免疫反应,而IL-18对于调节T细胞 的分化和预防过敏性哮喘起着重要作用[29夠,此二者信号在不同组织器官内可能发挥 着多样功能。例如有研究发现,幽门螺杆菌感染可诱导激活TLR2/NLRP3/IL-18信号, 通过IL-18促进组织内Treg分化的作用,参与预防哮喘的发生㈤】,与我们发现NLRP3 炎症小体活化促进鼻腔内黏膜炎症反应作用相反。这可能是由于激活炎症小体的病原 体、炎症发生的组织微环境和炎症小体下游激活信号的不同所致。目前NLRP3炎症 小体由多种类型病原体或危险信号(danger signal)所激活的普遍机制尚未达成一致,且 其中许多刺激可能对细胞的生理病理过程有不同程度的影响,因而很可能导致 NLRP3炎症小体发挥不同的作用。因此NLRP3炎症小体的功能多样性决定了,其在 不同过敏原或感染作用下诱发的呼吸道疾病中可能存在不同的作用。我们的研究明确 了鼻腔黏膜组织内NLRP3炎症小体的功能,即NLRP3炎症小体活化通过激活其下 游IL-1卩和IL-18信号通路,促进局部炎症反应放大,诱导上皮细胞发生焦亡,进而 参与AR疾病进展过程。

炎症小体家族成员包含NLRP1炎症小体、NLRP3炎症小体、NLRC4炎症小体、 IPAF炎症小体、AIM2炎症小体5类,本课题中我们关注并研究了 NLRP3炎症小体 活化在AR疾病进展过程中的作用。首先我们通过ELISA和IHC方法分别检测临床 样本和动物样本发现,在AR疾病进展过程中炎症小体活化显著增强(图1-1, 1-2, 2-1-2, 2-1-3, 2-1-4),同时观测到NLRP3在AR患者和小鼠的鼻黏膜组织中表达增 强(图1-2, 2-1-2),提示NLRP3炎症小体活化在AR疾病进展过程中发挥重要作 用。目前已有研究发现NLRP3炎症小体在2型糖尿病、阿尔兹海默症和动脉粥样硬 化等多种疾病中发挥重要作用,但在AR中的作用研究尚不透彻[113】,因此我们选择 NLRP3炎症小体进行深入研究,引入NLRP3 7-小鼠造模,结果发现NLRP3敲除可有 效缓解AR疾病进展,降低局部炎症反应,抑制上皮细胞发生焦亡,保护鼻黏膜组织 结构(图 2-2-1, 2-2-2, 2-2-3, 2-3-1, 2-3-2, 2-3-4, 2-3-5)上述结果提示 NLRP3 炎症小体的活化确实参与了 AR疾病进展过程,并发挥了重要的正向促进作用。

随后我们进一步思考NLRP3作为AR治疗靶点的可能性,使用成熟的caspase-1 抑制剂治疗AR动物模型,结果发现均可有效缓解AR疾病进展,降低局部炎症反应, 保护鼻腔黏膜组织(图2-4-1, 2-4-4, 2-5-1, 2-5-2, 2-5-3, 2-5-4),提示调控炎症 小体活化确实可以作为AR治疗的潜在有效靶点。但与此同时,由于多种炎症小体活 化均可诱导caspase-1的剪切活化和IL-1卩分泌,例如NLRs其他成员和AIM2家族成 员,我们目前的研究尚不能排除其他炎症小体在AR进展过程中是否发挥作用。有研 究发现蜜蜂毒液可以通过激活AIM2炎症小体诱导IL-1卩和IL-18的分泌,进而促进 Th2型过敏反应3】,提示AIM2炎症小体活化也可能参与过敏性疾病的进展过程。由 于AR鼻腔黏膜微环境一般不存在蜜蜂毒液,而胞质内游离DNA亦可激活AIM2炎 症小体MS],由此推测AR鼻腔黏膜中上皮细胞或神经元细胞的损伤造成的DNA释 放,可能是引起AIM2炎症小体的过度活化,进而参与AR进展的潜在新机制。新近 研究表明,依赖于NADPH氧化酶4的脂肪酸氧化可促进巨噬细胞中NLRP3炎性小 体的活化,这一过程不影响NLRC4或AIM2炎性小体的活化[珂。那么在鼻腔黏膜中 NLRP3炎症小体的活化是特异性存在而非依赖于其他炎症小体的,还是NLRP3炎症 小体与其他不同的炎症小体共同作用进而在AR疾病进展过程发挥协同促进作用,这 一问题将决定治疗靶点的选择,是特异性靶向NLRP3还是往炎症小体下游活化通路 寻找靶点,也将是我们后续研究的重要内容之一。

在鼻腔黏膜微环境中,存在多种细胞类型,包括上皮层的嗅上皮细胞、固有层的 嗅神经元细胞以及大量免疫细胞,那么明确炎症小体活化作用的靶向效应细胞,是探 究NLRP3炎症小体活化促进AR进展分子机制的重要一环。既往报道显示,线粒体 活性氧(reactive oxygen species, ROS)可通过调节NLRP3炎症小体活化,进而参与过 敏性呼吸道炎症发病过程,同时提出呼吸道上皮细胞可能作为免疫应答的重要效应细 胞这一新作用卩习。而我们的研究发现,在体外细胞实验中NLRP3炎症小体的过度活 化确实可以诱导上皮细胞的焦亡(图3-3,3-4),据此我们推测在AR疾病进展过程中, NLRP3的过度活化导致大量鼻腔黏膜上皮细胞发生焦亡,引起鼻腔黏膜损伤,破坏 了鼻黏膜上皮层,进而加重了 AR的病情进展。同时通过应用NLRP3基因敲除小鼠, 我们进一步明确NLRP3炎症小体的活化在AR的发生发展中发挥着重要的作用。但 是,由于我们使用的是全身NLRP3基因敲除小鼠(实验材料1.2),无法确定NLRP3 炎症小体与鼻黏膜组织中各类细胞之间具体作用的机制。而且在鼻腔微环境中,炎症 小体活化的靶向效应细胞除了我们发现的鼻黏膜嗅上皮细胞外,是否还可作用于嗅觉 神经元细胞,继而引起嗅觉神经损伤,甚至造成更严重的嗅觉障碍?因此要全面阐释 NLRP3炎症小体活化的效应细胞,还需要使用NLRP3条件性敲除小鼠,如NLRP3 嗅上皮细胞敲除小鼠或NLRP3神经细胞敲除小鼠进行更精确的研究。

在体外细胞实验中我们发现聚集的ASC-specks可引起胞内NLRP3炎症小体活化 及炎症环路信号放大,诱发上皮细胞焦亡(图3-3, 3-4, 3-5) o目前研究认为细胞 外ASC-specks促进炎症存在两种不同机制。一种是细胞外ASC-specks直接激活 pro-caspase-1, W pro-caspase-1也被释放到细胞外空间。另一种是细胞外ASC-specks 可被巨噬细胞吞噬,诱导吞噬溶酶体损伤,导致NLRP3炎性小体活化[迢辺。吞噬溶 酶体损伤后,被吞噬的ASC-specks被释放到细胞质中,促进可溶性ASC的低聚。这 两种机制都可导致IL-1卩的成熟和分泌发挥促炎症作用MR。所以鼻黏膜中上皮细胞 以何种方式感知ASC-specks的存在,是否存在内吞和外排ASC-specks的过程,可能 是过敏性鼻炎炎症放大的重要分子机制之一,也是我们下一步研究的重点关注方向。 目前外泌体(exosomes)被认为是细胞通讯的重要媒介。它们可以通过向受体细胞传 递 mRNAs( message RNAs ) > miRNAs( microRNAs ) > IncRNAsC long non-coding RNAs) 和各种蛋白质来调节多种病理生理过程。研究发现,在糖尿病视网膜病变的患者的玻 璃体和糖尿病大鼠的视网膜中炎症小体发挥重要作用,同时发现lL-ip. IL-18和 caspase-1水平升高,而MSC-Exos可以下调HMGB1、NLRP3炎性小体和NF-kB/P65 蛋白的表达,从而抑制IL-ip> IL-18和caspase-1的表达。ASC-specks是否可以直接 以外泌体的形式影响鼻黏膜上皮细胞炎症小体的活化,亦或是通过外泌体形式传递非 编码RNA参与鼻黏膜组织内细胞的炎症小体活化及炎症信号放大,这些问题也是我 们下一步研究的方向。

既往研究揭示过敏原介导的肥大细胞IgE释放是AR过敏症状的重要诱发因素之 一。而我们的研究发现,在OVA诱导AR的小鼠模型中,NLRP3缺失并不影响小鼠 血清内IgE含量(图2-3-3),但NLRP3基因敲除小鼠的过敏症状却明显减轻(图 2-2-1)。这一结果提示NLRP3炎症小体活化可能通过一种IgE非依赖的形式参与促 进了 AR的疾病进展过程。有研究发现使用内毒素这类过敏原可诱发小鼠产生IgE非 依赖的鼻部过敏样反应,这一过程依赖于抗原特异性Th2的应答、TLR4-Myd88信号 通路的活化以及单核/巨噬细胞的参与[汽由于单核细胞、巨噬细胞内NLRP3炎症小 体可被Toll样受体激动剂和TNF-a激活,参与调控Th2型局部炎症反应。因此在OVA 诱导AR的小鼠模型中,鼻黏膜组织内NLRP3炎症小体的活化可能通过一种与此相 似的途径诱发I&E非依赖的过敏反应,但其过程是否依赖于内毒素作用,是否存在T 细胞分化的改变,Th2型炎症反应是否增强,都有待进一步研究探讨。同时亦有研究 揭示低浓度屋尘嫡诱导产生的气道高反应性(airway hyperresponsiveness, AHR)不依 赖于IgE及FceRla (IgE结合受体)[40],那么在OVA诱导的AR小鼠模型中是具体 哪种过敏原诱发了 IgE非依赖的AR症状;这一过程是否可能与过敏原浓度有关;除 T OVA,屋尘嫡或花粉等典型过敏原是否也可能诱发NLRP3的活化进而促进IgE非 依赖的AR疾病进展。在临床上有20%的特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)患者血 清内IgE含量并无显著增高,根据血清IgE是否升高,皮肤病学家将其命名为本质性 AD (intrinsic AD, IAD)和 非本质性 AD (extrinsic AD, EAD) [41],那么 AR 患者是 否也存在这样的分型?上述问题值得我们进一步思考和探究。因此我们的研究发现 NLRP3炎症小体活化通过一种IgE非依赖的形式参与促进了 AR的疾病进展过程, 很可能为临床某些IgE非依赖AR患者的个体化治疗提供了新的指导。

目前临床上AR的治疗方法包括手术治疗和保守治疗。由于手术治疗疗效不明确, 眼干等并发症发病率较高,尚存在争议。药物治疗主要包括抗组胺药、皮质类固醇、 减充血剂、白三烯拮抗剂和抗胆碱能药物及脱敏疗法等。但由于药物副作用较重,临 床用药的剂量和频率需要医生进行精确的把控[42问。除药物治疗外,物理方法如鼻腔 盐水灌洗是另一常用AR治疗手段,但遗憾的是上述方法治愈率极低屮]。近年来,免 疫调节剂的研发和临床应用为AR的治疗提供了新的途径,亦取得了一定的成效,但 仍然存在一些不足。例如,研究发现TLR8的新型激动剂可以在短期内有效缓解AR 的症状,但长期免疫调节效果尚不稳定,且其中的分子机制还不明确尽管抗IgE 抗体在AR临床试验中展现出一定的疗效,但由于制备成本高及静脉治疗方式的局限 性,使得其在临床运用中受到很大的限制[购。因此,AR的临床治疗亟待研发更为有 效和便捷的治疗途径。目前尚无靶向干预炎症小体活化进行治疗AR的研究报道,而 我们的研究在小鼠体内证明了靶向抑制炎症小体活化可有效缓解OVA诱导的AR症 状,提示炎症小体有可能成为AR临床治疗的新型靶点,该研究成果也为AR免疫调 节治疗的研究提供了新的思路。

结论

本课题中,我们在临床样本、动物模型和细胞模型三个层面研究探讨了 NLRP3 炎症小体活化在AR进展中的作用与分子机制。主要结果如下:

  • 通过分析临床样本,我们发现与正常对照组相比较,AR患者的鼻腔灌洗 液中IL-ip和IL-18的表达量显著增高,鼻腔黏膜组织中caspase-l> ASC、IL-1卩等 炎症小体相关的蛋白表达增高。
  • OVA诱导的AR小鼠鼻腔灌洗液中IL-1卩和IL-18表达量增多,鼻黏膜组织 内caspase-1剪切体、IL-1卩剪切体以及GASDMD剪切体表达量亦增高。
  • 与WT小鼠相比,NLRP3基因敲除的小鼠AR症状得以明显缓解,血清IgE 含量无变化,鼻黏膜组织内促炎性细胞因子IL-6和IL-1卩表达量减少,趋化因子Cxcl9 和CxcllO表达量减少,嗜酸性粒细胞活化相关细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的表达 量减少,嗜酸性粒细胞分泌蛋白Earl表达量减少,caspase-1剪切体、IL-邛剪切体和 GSDMD-N表达量减少。
  • 与对照组相比,应用caspase-1抑制剂处理后小鼠AR症状得以明显缓解, 血清IgE含量无变化,鼻黏膜组织内促炎性细胞因子IL-6和IL-1卩表达量减少,趋化 因子Cxcl9和CxcllO表达量减少,嗜酸性粒细胞活化相关细胞因子IL-4、IL-5和IL-13 的表达量减少,嗜酸性粒细胞分泌蛋白Earl表达量减少,caspase-1剪切体和IL1-卩 剪切体减少。
  • 与对照组相比,使用ASC-specks体外刺激BEAS-2B细胞,细胞上清中LDH 释放增多,IL-1|3分泌增多,caspase-1剪切体、IL-1卩剪切体和GSDMD-N均增多。

综上,在本项研究中,我们发现AR患者和OVA诱导小鼠的鼻腔黏膜内炎症小 体活化均显著增强;NLRP3缺失可有效抑制AR发生发展过程,减轻鼻黏膜组织内 炎症反应,较少鼻黏膜组织内细胞焦亡,此过程不依赖于血清内IgE含量的变化;使 用caspase-1抑制剂治疗可有效缓解AR病程进展,减轻鼻黏膜组织内炎症反应,此 过程亦不依赖于血清内IgE含量的变化;进一步机制研究发现ASC-specks的过度聚 集及其继发的上皮细胞焦亡促进鼻黏膜组织损伤。本课题研究证实NLRP3炎症小体 活化通过维持鼻黏膜微环境的慢性炎症促进AR的发生发展,而炎症小体活化导致大 量细胞过度焦亡引起的组织损伤进一步推进AR病情进展,为AR疾病的进展提出了 新的机制,也为临床AR特别是IgE非依赖型AR的防治提出新的潜在干预靶点。

下一步研究中,我们首先将明确NLRP3炎症小体活化促进AR疾病进展确实非 依赖于血清IgE含量变化:一方面在构建WT和NLRP3 7- AR小鼠过程中分别给予 FceRla阻断抗体治疗,随后给予IgE重组蛋白rescue实验,分别在不同时间点观测 记录小鼠AR症状;另一方面在构建AR模型的WT小鼠体内分别给予FceRla阻断 抗体治疗和IgG对照,随后治疗组和对照组分别滴加ATP刺激活化NLRP3炎症小体, 同样在不同时间点观测记录小鼠AR症状。其次我们拟构建NLRP3鼻黏膜细胞特异 敲除小鼠和NLRP3巨噬细胞特异敲除小鼠,进一步验证炎症小体活化的始动细胞和 效应细胞,在体内明确NLRP3炎症小体促进AR进展的分子机制。最后我们还将在 WT和NLRP3 7' AR小鼠体内应用AR诱发的小鼠不可逆嗅觉障碍模型旳,更深入地 探讨分析其是否可能参与调控AR引起嗅觉障碍的过程,探究NLRP3炎症小体的活 化是否可能是AR引起嗅觉障碍的重要分子机制。该研究成果也为AR免疫调节治疗 的研究提供了新的思路。

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文献综述

NLRP3炎症小体的研究进展

炎症是人类机体重要的基本病理过程之一,在外伤感染和脏器感染(如肺炎,肝 炎,肠炎等)等炎症性疾病中起防御作用。但是过度的炎症反应会对机体产生不同程 度的损伤,比如炎症因子风暴对自身组织进行攻击造成自身免疫性疾病(系统性红斑 狼疮、强直性脊柱炎等)。因此,炎症是一把双刃剑,既能保护机体功能,也能对脏 器造成损伤,研究炎症反应调控的过程对炎性疾病的防治具有重要意义。免疫应答是 免疫系统识别和清除“非己”物质的过程,可分为天然免疫和适应性免疫两大类,其 中天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线,在炎症控制中发挥重要作用。 研究发现病原微生物表面存在一些结构恒定进化保守的物质,被称为病原体相关分子 模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs),天然免疫细胞表面存在特异性 识别 PAMPs 的受体,称为模式识别受体(pattern recognized receptors, PRRs), PRRs 的发现帮助我们更好地理解机体天然免疫对自我和非我的识别以及炎症反应调控功 能。常见 PRRs 包括 Toll 样受体(Toll like receptors, TLRs ) , RIG-I 样受体(RIG-I like receptors, RLRs), NOD 样受体(NOD like receptors, NLRs)。NLRP3 炎症小体作为 NLRs重要成员之一,近年来引起了科学家广泛关注和研究。NLRP3炎症小体是由 NLRP3蛋白本身、半胱天冬酶-1 ( caspase-1 )和凋亡相关斑点样蛋白

(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)组成。当 NLRP3 炎 症小体接触过敏原或者和产生过敏损伤相关的分子信号时,NLRP3会改变自身的结 构使NLRP3炎症小体重新装配并且激活casepase-1,活化的casepase-1可剪切如IL-1卩 和IL-18前体,有活性的IL-1卩和IL-18在机体中发挥不同的炎症效应。近年来研究 发现,NLRP3炎性小体在外源性PAMPs引起的微生物感染,哮喘,过敏,神经退行 性疾病以及内源性DAMPs引起的高血压,II型糖尿病,肿瘤,肠炎等疾病中均发挥 重要作用。更重要的是一些NLRP3炎症小体的抑制剂已在动物模型中得以应用并取 得良好效果,这些抑制剂的出现为临床上炎性疾病的治疗提供了新的潜在靶点。本文 主要总结了 NLRP3炎症小体在不同疾病中的进展,为炎性疾病的治疗提供新的思路。

一、NLRP3炎症小体的定义

2002年科学家首次报道了一种新发现的模式识别受体,它可以与caspase-1和

ASC共同形成复合物称为炎症小体⑴。随着对炎症小体研究的深入,其家族成员不断 扩大,目前已知的炎症小体包括 NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、AIM2等⑵。 NLRP3炎症小体是NLRs家族中最早被发现和研究的成员之一,它由NLRP3, ASC 和caspase-1共同组成的一个高分子量蛋白复合物。NLRP3是由CIAS1基因编码的 一种蛋白,该蛋白含有氨基末端的pyrin结构域、中心核昔酸结合结构域和C端富含 亮氨酸的重复序列(LRR), NLRP3的特征是它的N终端PYD通过PYD-PYD相互作 用来吸引ASC, ASC由Pycard基因编码,通过其PYD和CARD结构域分别连接 NLRP3和caspase-1分子,caspase-1是caspase家族中促进炎症反应的重要半胱蛋白 酶之一。具体来说,当NLRP3单体在感知到危险信号后,可能通过其LRR结构域, 诱导发生低聚作用,并通过亲和作用与ASC的pyrin结构域(PYD)发生相互作用, 促进了 caspase-1前体的聚集,形成了炎症性复合体,进而活化caspase-1,活化的 caspase-1可以剪切IL-ip和IL-18的前体,变成其活性形式,随后成熟的IL-ip和IL-18 分泌到细胞外发挥免疫功能⑶。

二、NLRP3炎症小体的活化机制

现有研究发现NLRP3炎症小体参与人类多种疾病的发生发展,了解其活化机制不 仅有助于理解相关疾病的致病机制,还能为其临床治疗提供潜在的药物干预靶点,所 以NLRP3炎症小体活化机制的研究一直是该领域的热点。目前相关文献报道了三种 经典的NLRP3炎症小体活化模型:第一,细胞K+穿梭模型,即胞内K+浓度改变⑷。 例如,细胞外高浓度ATP可通过激活P2X purinergic receptor 7 (P2X7)降低细胞内K+ 浓度进而活化炎症小体。P2X7被认为是激活NLRP3炎症小体的重要信号通路。此 夕卜,当机体在受到细菌感染或MSU晶体和成孔毒素的作用时,细胞内K+水平也会降 低进而激活NLRP3炎症小体。近年来,细胞内K+浓度降低被认为是NLRP3炎症小 体最常见的激活途径。但是,胞内K+浓度下降导致炎症小体活化的分子机制尚不清 楚,介导K+外流的离子通道蛋白也没有被明确,因此细胞质中K+浓度的变化激活 NLRP3炎性小体的机制还有待进一步研究。第二,Ca2 +诱发溶酶体破裂模型⑸,即 溶酶体膜的破坏可导致NLRP3炎症小体的活化。特定的晶体和颗粒物质的吞噬作用 可引起溶酶体的不稳定,导致溶酶体内容物释放。研究发现组织蛋白酶B是溶酶体 内容物之一,已被证实可激活NLRP3炎症小体,相反组织蛋白酶B抑制剂CA-074-Me 可抑制NLRP3激活⑹刀。除了内源性晶体的活化机制外,石棉、硅、铝盐等外源性 晶体被细胞吞噬后,吞噬体可被溶酶体降解破坏,进而释放晶体进入细胞质,随后被 NLRP3识别并激活NLRP3炎症小体。最新的一项研究发现溶酶体破裂可以激活 TAK1-JNK通路(MAPK信号通路),继而促进NLRP3炎症小体的活化⑻。第三, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生模型。ROS主要与正常或损伤的线粒 体相关,目前已被证实在NLRP3炎症小体的活化中发挥重要作用⑼。研究发现线粒 体ROS对NADPH氧化酶的损伤可以激活炎症小体2 Ml,其中硫氧还蛋白互作蛋白 (thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是 ROS 促进 NLRP3 炎症小体活化的敏感调节 因子[10]oTXNIP通过结合N LRP3,增强ASC和caspase-1前体的聚集,进而促进N LRP3 炎症小体的形成和活化M 12]o当使用线粒体ROS的抗氧化剂Mito-TEMPO时可以抑 制炎症小体的产生,同样减少IL-1 B和IL-18的分泌2⑺。但是,有研究发现NADPH 氧化酶和ROS的产生对NLRP3炎症小体的活化不是必须的,但是对于IL-1卩的分泌至 关重要[15, is]o研究表明,线粒体ROS影响NLRP3的上调和IL-ip前体的转录,而并 非促进NLRP3炎症小体的活化a]。因此,需要更多的研究来了解ROS在调控NLRP3 炎症小体激活中的确切作用。

三' 炎症小体在不同疾病中发挥的作用

(一)过敏性疾病

早期研究认为NLRP3炎症小体在过敏性哮喘发展和加重过程的调控作用存在争 议。Kool等Ro】人确认了哮喘由尿酸晶体促进Th2细胞驱动,以及尿酸结晶对哮喘的 影响不依赖于NLRP3或IL-iPo这些结果表明了 NLRP3炎症小体对小鼠的呼吸道炎 症没有明显的影响。同样,Allen[21]发现在无铝的情况下,NLRP3炎症小体的作用只 是有限地影响OVA诱导哮喘小鼠模型,而NLRP3炎症小体没有严重影响呼吸道的炎 症反应和哮喘症状。但是,2012年以来大量研究表明NLRP3炎症小体在哮喘疾病进 展过程中发挥重要作用。Hirota等人鉴定了 NLRP3和caspase-1在人类呼吸道上皮支 气管中表达Qi,并发现在哮喘患者中呼吸道支气管上皮细胞分泌更多的IL-ip[23]oKim RY等在衣原体感染的小鼠模型中发现NLRP3, caspase-1和IL-ip的表达增加可以导 致类固醇抵抗性中性粒细胞性炎症和气道高反应[刑。Simpson等人发现中性粒细胞浸 润的哮喘患者中NLRP3, caspase-1和IL-1卩基因的表达和IL-1卩蛋白的表达比对照组 显著增高©I。他们同时发现嗜中性粒哮喘患者的痰液和中性粒细胞表达了 NLRP3和 caspase-1,而且症状严重的哮喘患者中NLRP3炎症小体的表达显著增加,相关研究 也发现嗜中性哮喘患者的NLRP3炎症小体的活化可能与Th2驱动的炎症相关[26]oKim BG等人发现,TiCh可以诱导NLRP3炎症小体的合成组装,进而促进caspase-1被剪 切活化,分泌有活性IL-1卩和IL-18,诱导哮喘的气道炎症发生囚]。Sebag等人发现 线粒体Ca2+/钙调蛋白激酶II (CaMKII)介导的ROS产生可以刺激NLRP3炎症小体 活化并促进OVA诱发的炎症哮喘,而MCC950 (一种NLRP3抑制剂)可以阻断 Mt-CaMKII介导产生ROS的作用进而缓解哮喘症状曲。Besnard利用NLRP3基因敲 除的小鼠建模发现OVA诱发哮喘依赖于NLRP3炎症小体活化,并伴随IL-1P分泌和 Th2炎症反应的增强[29]。在颗粒物暴露下,相较于NLRP37-小鼠野生型小鼠肺部 NLRP3炎症小体的活化、IL-1卩的分泌以及呼吸道炎症更强。Ritter M等人也发现, 在OVA诱导的模型中,NLRP3,小鼠的呼吸道炎症和IL-1卩表达与野生型小鼠相比显 著减少网。上述研究表明,NLRP3炎症小体活化促进哮喘的发生,同时对NLRP3炎 症的靶向抑制可能是哮喘病人一种新的治疗选择。

在过敏性疾病中,NLRP3炎症的作用已逐渐得到认识。角化细胞内的NLRP3能 够快速感应入侵的病原体,构成天然的第一道防线。病原体通过激活NLRP3炎症小 体,促进IL-ip和IL-18的分泌,增强机体对于病原体的抵御作用的。Sutterwala等 人发现在三硝基苯氯诱导的小鼠模型中,NLRP3和ASC基因缺乏的小鼠与野生型小 鼠相比,出现较低程度的CHS (接触性皮炎)反应〔辺。Watanabe等人通过对皮肤过 敏性疾病患者活组织分析发现,NLRP3可能与CS-介导的IL-1卩活化有关,进而推测 NLRP3炎症小体在CHS中是先天免疫的关键调节分子厲]。此外,在特应性皮炎模型 中,Dai等人发现HDM刺激诱导后可募集ASC, caspase-1和NLRP3到核区域并诱 导角化细胞分泌IL-1卩和IL-18[34]o 2017年,Adam等证明了引起过敏的铭(VI)化 合物有效地刺激了 NLRP3炎症小体的活性,促进人单核细胞和角化细胞对IL-ip的 分泌,而使用特定的NLRP3炎症抑制剂可以减少皮肤炎症厲]。上述研究表明,NLRP3 炎症小体成分及下游活性细胞因子在过敏性皮炎的发病机理中起着重要作用,并且针 对NLRP3的小分子抑制剂可能有助于治疗过敏性皮炎。

Mansson[36]等观察到,与正常鼻黏膜组织相比,慢性鼻窦炎和鼻息肉中NLRP3 表达显著增高,而且类固醇治疗可一定程度抑制NLRP3的表达;同时Wang®]等在 静黄色葡萄球菌诱导的急性鼻窦炎小鼠模型中观测到NLRP3炎症小体的活化及 IL-1卩的分泌增加,提示NLRP3在急慢性鼻窦炎中可能具有潜在作用。AR患者鼻黏 膜中microRNA-133b (miR-133b)表达降低,在小鼠模型中应用miR-133b拟似物治 疗,发现其通过靶向抑制NLRP3表达有效缓解AR症状[附。这些研究结果提示NLRP3 炎症小体与过敏性疾病有密切关联。

(二)心血管疾病

动脉粥样硬化是心血管疾病中最常见也是最易引起各种并发症的疾病。动脉粥样 硬化斑块是炎症过程和脂质代谢异常的综合结果,往往在大、中动脉内膜出现含胆固 醇、类脂肪等黄色物质。这类物质的病理结构显示其主要是由泡沫细胞、免疫细胞、 胆固醇晶体和平滑肌细胞组成,并且可以在炎症细胞因子的作用下发生扩增。动脉粥 样硬化的危险因素很多,其中高胆固醇血症是主要危险因素之一。相较于正常胆固醇 和低密度脂蛋白,结晶胆固醇和氧化低密度脂蛋白(oxLDL)更为广泛地参与斑块的 形成,oxLDL与其受体CD36结合后可被巨噬细胞吞噬,而由于oxLDL对巨噬细胞 胞内溶酶体酶具有抗性,往往造成oxLDL在巨噬细胞中的积累,进而导致泡沫细胞 的形成。同时我们在动脉粥样硬化斑块中发现大量胆固醇晶体和oxLDLs亦可引起炎 性小体活化[眇40]。炎性小体将脂质代谢和炎症状态相互联系起来。同样,多项研究 表明NLRP3炎性小体在动脉粥样硬化中发挥重要作用。ZHENG分两组进行试验, 试验组是36例接受冠状动脉旁路移植术(CABG)患者(试验组)的升主动脉组织 标本,对照组是通过肾捐赠方案收集到无动脉粥样硬化患者的动脉组织标本Si】。通 过采用免疫组织化学法测定两组 样本内NLRP3的表达,并且通过Gensini评分评价 冠状动脉粥样硬化的严重程度,将二者进行相关分析,结果显示,NLRP3在高胆固 醇血症、高血压和糖尿病吸烟者主动脉中过表达。这些患者主动脉NLRP3与总胆固 醇、LDL-胆固醇、脂蛋白呈正相关,与HDL-胆固醇水平呈负相关。

(三)自身免疫性疾病

自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害,分为系 统性自身免疫性疾病和器官特异性自身免疫性疾病O常见的系统性自身免疫性疾病包 括系统性红斑狼疮(systemic lupus erythe-matosus, SLE)、类风湿关节炎(riieumatoid arthritis, RA)等;器官性自身免疫性疾病包括各种组织或器官的特异性损伤,如I型 糖尿病、重症肌无力等跑]。异常的NLRP3炎性小体活化与许多人类自身免疫性疾病 有关。例如,编码NLRP3的基因获得功能突变与冷卩比卩林相关周期性综合征(CAPS) 的进展密切相关⑷],这种疾病包括家族性感冒自身炎症综合征,穆-韦二氏综合征和新 生儿多系统炎症性疾病屮]。目前研究发现有超过90个杂合NLRP3基因突变和CAPS 有关S5], CAPS患者持续表现为慢性炎症,在临床上出现自发性发热、外周性发热、 血液和组织嗜中性粒细胞增多,以及皮肤、关节、肌肉和脑脊液局部炎症等症状。上 述症状产生的原因是由于IL-1卩和IL-18过度的表达。当在小鼠中敲入携带NLRP3 和CAPS表型相关的FCAS和MWS时,IL-1卩会过度表达时。同样,从CAPS患者 的外周血单核细胞中可以提取到过度表达的NLRP3炎症小体,并且与正常人相比产 生IL-1卩和IL-18的能力更强旳。

SLE是一种多发于青年女性累及多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病,轻型和 不典型的病例日渐增多。SLE的特点是持续性产生自身抗体,与自身抗原(如DNA) 形成免疫复合体(immunol complex, IC)。IC位于远端器官(如肾脏),可引起免疫 病理和炎症损伤。SLE患者中发现IL-18的表达量是升高的,SLE患者外周血单核细 胞中NLRP3炎性小体异常活跃,提示NLRP3炎性小体在SLE患者中活性升高,这 可能也是SLE致病机制之一时49]。

  • 神经系统疾病

脑外伤(Trau-matic brain injury, TBI)是由物理力量对脑组织造成的损伤,它会 引发初级损伤和次级级联反应。最初的损伤会导致神经细胞的直接损伤和坏死,接着 是一系列的损伤级联反应,包括兴奋毒性、氧化应激、线粒体功能障碍、血脑屏障破 坏和炎症,大量研究强调炎症反应在继发性脑损伤起主要作用冈。研究发现,TBI 可以诱导NLRP3炎症小体合成,ASC表达,caspase-1活化以及IL-1卩和IL-18分泌, IL-1卩和IL-18在脑损伤炎症反应中起关键作用已经被证实〔"I。所以说NLRP3炎症 小体可能是TBI患者的一个有前途的治疗靶点Qi。

脑卒中是一种严重的疾病,致残率和死亡率高。临床上,脑卒中可分为缺血性脑 卒中和出血性脑卒中。缺血性卒中约占所有卒中病例的80%,出血性卒中约占20%[53] o 缺血性脑卒中诱导神经元细胞死亡的机制包括生物能量衰竭、氧化应激、兴奋毒性、 细胞凋亡和炎症过程[54'56]o近年来,越来越多的证据表明,先天免疫系统的炎症机制 可能导致脑缺血过程中神经细胞和胶质细胞的死亡[切。NLRP3炎性小体已被证实在 缺血性脑卒中检测细胞损伤和介导组织损伤炎症反应中发挥重要作用[涸。研究发现 静脉注射免疫球蛋白具有神经保护作用,在模拟缺血的体外和小鼠模型的局灶性缺血 性卒中,它可显著降低NLRP3炎症小体,IL-1卩和IL-18的蛋白水平网。因此,明确 NLRP3炎症小体信号的上下游通路为开发治疗卒中的新药物提供重要前景。

近年来,NLRP3炎症小体在致癌基因和肿瘤进展中的重要作用已被报道。许多 内源性和外源性刺激通过诱导慢性炎症,可作为肿瘤的前驱因子,从而为炎症小体在 癌症中的激活提供信号a】。也有NLRP3炎症小体抑制自然杀伤细胞控制肿瘤发生和 转移作用的报道["I。越来越多的证据表明,先天免疫和慢性炎症在癌症发生和肿瘤 进展中起着至关重要的作用。在中枢神经系统肿瘤中,恶性胶质瘤是最常见的原发性 脑肿瘤,预后差,而NLRP3炎症小体在胶质细胞瘤(GBM)细胞中具有结构活性m2]。 此外,通过小鼠胶质母细胞瘤模型,已经证明抑制NLRP3可以降低肿瘤生长,延长 红外线治疗后小鼠的生存期。他们证明NLRP3炎症小体是脑衰老与胶质瘤进展及放 疗耐药之间的分子联系[斶。由此证明,NLRP3炎症小体在肿瘤控制中发挥重要作用, 可能成为肿瘤患者提供预后标志物和有前途的治疗靶点[64]。

四、展望

NLRP3炎症小体及其下游产物IL-18和IL-ip在多种疾病的发病过程中发挥重 要作用,目前已有部分靶向药物应用于动物实验,但由于其制备成本、副作用以及给 药方式的限制,其应用于临床试验和治疗还有待进一步研究。近年来,随着表观遗传 学、结构生物学和传统生物化学、细胞生物学的有机融合,对于NLRP3炎症小体及 其活化过程中的精细调控依然是该领域的热点问题,值得更为深入的研究和探索。

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发表文章及科研工作情况

―、发表文章

  • Yang Z X, Liang C Q, Liu H H et al. NLRP3 inflammasome activation promotes the development of allergic rhinitis via epithelium pyroptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2019 Nov.(已接收)
  • Liang C Q, Yang Z X, Fan J P et aL Construction of an irreversible allergic rhinitis-induced olfactory loss mouse model[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2019 Jun 4;513(3):635-641 (IF 2.705)
  • 杨子轩,刘环海.真菌性鼻窦炎的影像表现特征与诊断分析.(己接收)
  • 梁才全,杨子轩,邹庆云等鼻窦CT评分在评估慢性鼻-鼻窦炎嗅觉障碍中的 应用[J]冲国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2019,25(2):157-161.
  • 邓月,程寅,杨子轩等.内镜下低温等离子射频消融切除高位咽旁隙肿瘤的临 床疗效分析[几中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2019,25(1):69-72.
  • 程寅’康渊春,杨子轩等单侧真菌性上颌窦炎192例临床分析[几临床医学 进展.2019, 9(3), 277-282.

二、参加科研工作情况

  • 国家自然科学基金面上项目"SIRT3调节巨噬细胞炎症修复功能参与慢性 鼻-鼻窦炎嗅觉障碍的机制研究,,81870702
  • 国家自然科学基金面上项目“Sirt5通过促进M2型巨噬细胞分化与功能加 重慢性鼻■鼻窦炎的效应与机制研究飞1770980

致谢

本课题是在我尊敬的导师刘环海教授悉心指导下完成的。从课题的选择、资料的 收集到思路的设计以及论文的攥写,每一步都是在导师的亲自引导、协助下进行的, 花费了您许多的宝贵时间和精力,由衷的向我的导师刘环海教授表示感谢,感谢您在 学习、工作、生活中无微不至的关心,感谢您给予的耐心,作您的学生是我的幸运; 敬仰您严谨的治学态度、诲人不倦的助学品格,您在指导我的过程中所展现的求实、 求是、求真、求新的科研态度使我获益终生,我将在今后的工作及科研工作中秉持相 同的信念,努力提升自己、学习终身。

感谢我的爱人周悴对我的关爱和付出。

感谢长征医院耳鼻喉科廖建春教授、王海青教授、范静平、郎军添教授、吴建教 授、赵舒薇教授、林顺涨教授在实验设计、实验方案修改上的帮助及对我工作及学习 上给予的指导及鼓励。

感谢我的好师弟梁才全、邹庆云、林柏键、王天宇、蔡博宇、周梦夏的全力帮助, 他们在实验方法、实验具体实践步骤及结果分析上提供的宝贵意见及建议,让我才能 更高效、高质的完成我的课题内容。

感谢纪振华老师、邓月老师、刘海斌老师、程寅师兄、朱雅静师姐在工作中的帮 忙,感谢长征医院耳鼻喉科各位医护工作人员及同伴们在工作及生活上给予的帮助及 关心,有你们给予强大的后盾,让我在科研及学习的路上走得更加顺利和长久。

最后,感谢百忙之中抽时间对本文进行审阅的各位专家老师们!