稳定型冠心病患者肠道菌群变化特点的研究论文 

2020年10月22日13:54:07稳定型冠心病患者肠道菌群变化特点的研究论文 已关闭评论

稳定型冠心病患者肠道菌群变化特点的研究论文

中文摘要

研究背景:

心血管疾病(candiovascular disease,CVD)的发病率与死亡率已跃居世界第一,是 当今危害人类健康和生命的主要疾病之一,其中很大部分归因于冠状动脉粥样硬化 性心脏病。肠道菌群失调(intestinal dysbacteriosis, ID)是指由于某种原因打破了人 体肠道正常菌群的种类、数量、定位以及生物学特点的变化,使肠道菌群之间失去 平衡从而产生病理性组合,并危害着人体健康。有研究提示肠道菌群失调与冠心病、 心力衰竭、肥胖、高血压病及糖尿病等疾病存在相关性。本实验旨在稳定型冠心病 与肠道菌群之间的关系,为肠道菌群与稳定型冠心病的研究进一步提供了理论依据。 目的:

本研究旨在通过16SrRNA测序技术分析稳定型冠心病患者的肠道菌群变化特 点,研究肠道菌群改变与稳定型冠心病之间的关系,以期为冠心病的防治提供新的 靶点和理论依据。

方法:

13例受试者收集于2018年12月至2019年5月陕西省人民医院心血管内一科的 住院患者及门诊健康体检者,分为稳定型冠心患者9例和健康对照组4例。采集研 究对象的粪便5g用于提取粪便总DNA,利用16SrRNA测序技术获得基因序列, 然后在Illumina Miseq测序平台对样本进行双端测序,分析两组肠道菌群的物种组 成、两组间OTU差异、Alpha多样性和Beta多样性,从而获得生物学信息。Alpha 多样性指数及Beta多样性指数利用Wilcoxon秩和检验对于两组之间进行比较并绘制 箱式图,反映两组的物种多样性、丰度及组间菌群结构差异,以p<0.05表示差异有 统计学意义。

结果:

1、 物种组成分析结果显示,稳定型冠心病组肠道菌群主要以四大门为主(总占 比大于99%),按照占比情况从高到低分别是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门

(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)以及拟杆菌门(Bacteroidetes),其 余总占比不足于1%的肠道菌门包括软壁菌门(Tenericutes )、疣微菌门

(Verrucomicrobia)、TM7 门、梭杆菌门(Fusobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、 Thermi门、OD1门以及酸杆菌门(Acidobacteria)其中厚壁菌门在稳定型冠心病 组与对健康照组中丰富度均最高,变形菌门在两组的丰富度是第二高;

2、 稳定型冠心病组肠道菌群与健康对照组相比在物种组成上存在显著差异,厚 壁菌门和放线菌门丰度明显升高,而变形菌门和拟杆菌门丰度明显减少。

3、稳定型冠心病组丰度较高的菌群是放线菌门(Actinobacteria)、乳杆菌科

(Lactobacillaceae)以及乳杆菌属(Lactobacillus);健康对照组丰度较高的菌群是 气球菌科(Aerococcaceae)、脱硫弧菌属(Desulfbvibrio)以及乳球菌属(lactococcus) 结论:

稳定型冠心病患者存在肠道菌群失衡,通过调整肠道菌群失衡可能成为治疗稳 定型冠心病的新方法。

关键词:肠道菌群;稳定型冠心病;16SrRNA测序技术

Changes of Intestinal Flora in Patients with

Stable Coronary Heart Disease

Abstract

Background

Candiovascular disease (CVD) has become the leading cause of morbidity and mortality in the world, and is currently one of the major diseases endangering human health and lives, largely due to coronary atherosclerotic heart disease.Intestinal dysbacteriosis (ID) refers to the change of the type, quantity, location and biological characteristics of the normal intestinal flora, which causes the imbalance between intestinal flora to produce pathological assemblage and harm human health.Studies have suggested that intestinal flora imbalance is associated with coronary heart disease, heart failure, obesity, hypertension and diabetes.This experiment aims at the relationship between stable coronary heart disease and intestinal flora, and provides a theoretical basis for further research on the relationship between intestinal flora and stable coronary heart disease.

Objective:

This study aims to analyze the change characteristics of intestinal flora in patients with stable coronary heart disease by 16SrRNA sequencing technology, and study the relationship between intestinal flora change and stable coronary heart disease, so as to provide a new target and theoretical basis for the prevention and treatment of coronary heart disease.

Methods:

The 13 subjects were collected from inpatients and outpatient health check-up patients in the first department of the cardiovascular department of shaanxi people's hospital from December 2018 to May 2019, and were divided into 9 patients with stable coronary heart and 4 patients with healthy control group.The fecal 5g of the study subjects was used to extract the total fecal DNA, obtain the gene sequence by 16S rRNA sequencing technology, and then conduct double-terminal sequencing on Illumina Miseq sequencing platform to analyze the species composition, OTU difference, Alpha diversity and Beta diversity of the intestinal flora of the two groups, so as to obtain biological information. Wilcoxon rank-sum test was used to compare Alpha diversity index and Beta diversity index between the two groups and draw box charts to reflect the differences in species diversity, abundance and microflora structure between the two groups. P < 0.05 was considered as significant difference.

Results:

  1. The results of species composition analysis showed that the intestinal flora of the stable coronary heart disease group was mainly composed of four gates (the total proportion was more than 99%).According to the proportion, the Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes were respectively from high to low.The remaining intestinal microbiome, which makes up less than 1% of the total, includes Tenericutes, Verrucomicrobia, TM7, Fusobacteria, Chloroflexi, Thermi, OD1 and Acidobacteria.Firmicutes were the most abundant in both the stable coronary heart disease group and the healthy radiography group, and the Proteobacteria were the second most abundant
  2. The intestinal flora of the stable coronary heart disease group was significantly different from that of the healthy control group in terms of species composition. The abundance of Firmicutes and Actinobacteria increased significantly, while the abundance of Proteobacteria and Bacteroidetes decreased significantly.
  3. Actinobacteria, Lactobacillaceae and Lactobacillus were the most abundant bacteria in the stable coronary heart disease group.The bacterial communities with high abundance in healthy control group were Aerococcaceae, Desulfovibrio and Lactococcus. Conclusion:

Patients with stable coronary heart disease have imbalance of intestinal flora, and adjusting the imbalance of intestinal flora may become a new method to treat stable coronary heart disease.

Key words: Intestinal Flora; Stable Coronary Heart Disease ; 16S rRNAsequencing

学统计,心血管疾病(candiovascular disease,CVD)的发病率与 死亡率已跃居世界第一⑴,是当今危害人类健康和生命的主要疾病之一,其中很大部 分归因于冠状动脉粥样硬化性心脏病。2008年全球死亡原因中有30.46%因CVD死 亡(约1733万)。我国CVD的患病率及死亡率也处于连续上涨阶段。《中国心血 管病报告2018》⑵中指出,CVD死亡率居各病因之首,超过人口疾病死亡的40%, 尤其是农村高于城市。CVD住院费用从2004年开始飞速增长,年均增长速度远超过 GDP的增长速度。高润霖院士⑶对我国人群冠心病流行病学中调查后指出,心血管 疾病死亡占主要疾病死因首位,已超过肿瘤以及其他等疾病的死亡率。据资料统计, 预计中国当前有2.9亿人口患CVD, 1100万人口患冠状动脉粥样硬化性心脏病 (coronary atherosclerotic heart disease, CHD)。冠心病已成为我国重大的公众卫生 问题,因此冠心病的预防和控制已成为当前推进健康中国、促进全民小康工作中非 常重要的一项任务。

冠心病主要发生在中老年人,但近几年发现有年轻化的趋势。发病率受其性别、 职业、种族、地区的差异,其中男性高于女性,白领人群高于蓝领人群,发达国家 高于发展中国家,在我国北方地区高于南方地区,土著血统较欧洲血统的加拿大人 的患病率高。但CHD的病因及发病机制一直未明确得完全阐述。冠心病传统不可改 变的危险因素有:CHD家族史、年龄、性别;传统可控的危险因素有以下几项:过 度紧张劳累、吸烟、肥胖、酗酒史、高脂血症、高血压以及糖尿病等⑷。

大多数微生物生活在一个复杂的群落内,人体肠道内的微生物群也不例外,研 究发现肠道微生物大多数为细菌,还有古生菌、真菌以及病毒和噬菌体⑸。一项Meta 研究表明,根据粪便标本中的主要细菌属,可以区分人类肠道细菌的三大集群或“肠 型” :I型是以高水平的拟杆菌;II型以普氏菌为主,III型是瘤胃球菌属型⑹,但肠 道菌群受自身因素如饮食习惯等和客观因素如遗传等的影响会随环境的变化而发生 改变。

肠道微生物群是从人类出生开始建立直到婴儿期发展稳定后最终达其成年形式 ⑺。一项研究包含98名瑞典婴儿出生一年内肠道菌群分析婴儿肠道菌群a多样性增 加、B多样性减少,到3岁后差异性缩小,逐渐成熟为成人结构罔。成人肠道菌群主 要由以下几种菌门组成:厚壁菌门(Firmicutes) >拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线 菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)组成⑼。美国 Ringel-Kulka[10]教 授和荷兰Hollister教授等人⑴吩别对1-4岁和7-12岁儿童肠道菌群进行分类和功能 分析,发现出生后3年的肠道微生物群像成年人一样稳定。但2019年荷兰医学家 Willem等人〔I?]最新研究表明微生物群在3岁后依然继续变化,但儿童微生物比成人 更容易受环境的变化而改变[⑶,且同时发现母乳喂养方式的儿童肠道菌群微生物比 奶粉喂养的多样性低。

2011年Wang等人使用代谢组学技术研究发现了 3种物质,分别是胆碱、 氧化三甲胺(trimethylamine oxide, TMAO )和甜菜碱,他们均是磷脂酰胆碱 (phosphatidylcholine, PC)代谢的产物,都具有促进人类和小鼠动脉粥样硬化风险, 可作为预测心血管疾病的新型标志物。以此同时还发现一种新的途径,将饮食脂摄 入、肠道菌群和动脉粥样硬化联系起来。该途径是膳食类磷脂碱胆碱(PC) /胆碱. 肠道菌群形成的TMA■肝FMO形成的TMAO,即:肠道菌群代谢食物中胆碱和卵磷 脂(常称为磷脂酰胆碱)时生成三甲胺(trimethylamine, TMA) , TMA吸收入血后 经肝脏黄素单加氧酶(flavin monooxygenase, FMO)催化生成TMAO的代谢物,进 一步参与动脉粥样硬化(Atherosclerosis’AS)的发生发展,增加心血管疾病的发生风 险[mi%最新的一项针对2000多个人群代谢物的研究发现,与肠道菌群有关的代谢 物氨基三甲基赖氨酸(trimethyllysineJML)和L■瓜氨酸跟心血管疾病的发病风险 密切相关,同时发现TML是TMAO的前体物质[20】。同时在动物实验中,研究发现 饮食中的肉碱通过人体代谢产生的Y ■三甲丁内鞍盐可以增加小鼠主动脉根部AS的 发病风险。近些年国内外学者研究证实人体内的肠道微生物通过免疫炎症、肠道菌 群代谢中间产物例如SCFAs等途径参与冠状动脉粥样硬化性疾病的发生发展BQ]。

研究发现,肠道菌群紊乱不止参与了 CVD的发生发展,而且还与其他系统疾病 有关,如DM、IBD、ALD以及结肠癌方的等。美国加州大学段屹等人凹利用16s rDNA 测序研究发现,与健康人相比,酒精性肝炎(alcoholic liver disease, ALD)患者的 粪肠球菌(Enterococcus fhecalis)呈显著差异,同时发现靶向粪肠球菌的噬菌体可以 杀灭粪肠球菌分泌的外毒素溶细胞素并能够缓解酒精性肝炎。Franzosa等人卩通过 对155例炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)患者和65例对照组, 采用非靶向代谢组学和鸟枪法宏基因组学对其粪便样本进行分析,发现IBD患 者粪便中的钙网蛋白较对照组明显差异。因此人体内肠道微生物也是影响健康和 疾病的一个重要因素。一个涉及尼日尔、马拉维和坦桑尼亚地区600名学龄前儿童 的粪便进行宏基因组DNA测序的试验表明,阿奇霉素能够通过减少肠道弯曲菌 (Campylobacterupaliensis)显著降低儿童致命性胃肠炎发作、减轻肠道炎症反应以 及增加肠道吸收作用,从而降低儿童死亡率卩1】。总之,调节肠道菌群可成为治疗疾 病的新措施。

一项研究结果发现,冠心病患者与健康人群在肠道菌群多样性方面没有明显差 异,但在菌群结构上存在较大差异,主要表现为拟杆菌门(Bacteroidete)明显下降、 厚壁菌门(Firmicutes)显著升高卩习。动脉粥样硬化性心脏病(Atherosclerotic heart disease, ASCVD)患者的粪便与健康人群相比主要在类杆菌和普雷沃氏菌相对减少, 而链球菌和埃希氏菌增多⑴]。2019年Tang等人㈤】采用16SrRNA测序技术对JieZ 等人的研究结果作进一步补充,结果显示AS组乳杆菌(厚壁菌门)比例明显增加, 拟杆菌的比例明显下降;同时观察到ASCVD患者与健康对照组相比,肠杆菌科细 菌和口腔混合细菌以及产生丁酸盐的细菌数量增加。

最新研究发现,人体内的肠道菌群除了致病菌还有与人体共同生存的细菌,即 “共生菌”。分布在肠道内的共生菌参与人体许多生理过程。美国麻省理工学院Shijie Zhao和Eric J. Alm等人卩勺在2019年《Cell Host & Microbe》上发表了利用培养的群 体基因组学和宏基因组学相结合的方法研究健康人群的肠道共生细菌脆弱拟杆菌 (Bacteroides fragilis),发现脆弱拟杆菌通过重新突变适应个体肠道菌群,并促进肠 道定值。但在不同人群这种突变出现频率不同,欧美人群较中国人突变频率明显高。 2020年1月6日英国MRC分子细菌学与感染中心的Thomas B. Clarke等人厲】于 《Nature Microbiology》上表明,共生拟杆菌产生的定殖因子通过阻止白介素(IL) -36信号传导阻止肺炎克雷伯氏杆菌的定殖与传播,这进一步揭示了共生菌在人体内 健康的作用机制。但也有学者发现共生菌并非“有益菌”2019年11月Gil-Cruz 等人昭在《Science))上发表一篇关于动物实验结果表明,在小鼠实验上发现共生的 拟杆菌属可引起细菌蛋白和心脏表位的交叉免疫反应,导致心肌病的发生。因此, 共生菌到底在人体内“利”与“害”的作用还需进一步证实。

综上所述,肠道菌群与各种疾病紧密相关,但肠道菌群与稳定型冠心病之间进 一步的关系尚不明确关系,且研究较少。本研究通过比较稳定型冠心病患者与健康 对照人群在肠道菌群上的差异,为稳定型冠心病与肠道菌群之间的关系提供临床数 据,为稳定型冠心病治疗方案提供新的靶点,为改善CHD患者预后以及降低死亡风 险提供进一步的科学依据。

1稳定型冠心病的研究进展

1.1稳定型冠心病的概述

稳定型冠心病(stable coronary heart disease, SCHD)是冠心病的一种新的分类, 特指具有稳定型心绞痛症状的冠心病,主要的临床表现为稳定劳力性心绞痛。由于 在一些外界因素作用下使得发生病变的冠脉进一步减少了血液灌注,导致心肌缺血 而发生的心绞痛。劳累、情绪激动、饱餐、寒冷是其常见诱因,典型的心绞痛主要 疼痛部位位于胸骨后部,呈压榨样或紧缩样疼痛,阵发性发作,疼痛持续时间和病 变冠脉严重程度相对固定。而大多数慢性心绞痛患者能生存率较高,可长达十余年, 但仍然有发生急性心肌梗死(acute myocardium infarction,AMI)或猝死的危险,但决 定预后的主要因素为冠状动脉病变范围和心功能的分级。冠心病是最常见和致死率 较高的心血管疾病之一,严重危害着人类健康且降低生活质量。

1.2稳定型冠心病的治疗

目前稳定型冠心病的治疗以药物治疗与经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)为主。药物主要强化调脂、抗血小板药物。目前PCI技术 主要包括单纯球囊扩张(Simple balloon expansion)、冠状动脉支架术(Coronary stenting)>冠状动脉旋磨(Coronary artery rotation)、以及冠状动脉定向旋切术(Directed coronary artery rototomy)等等。随着科技的提升,PCI有新技术的出现,如新型药物 洗脱支架可以防止支架内血栓再次形成。2008年《新英格兰医学杂志》报道了美国 的一项随机对照关于治疗稳定型心绞痛患者的治疗情况研究,结果显示单纯药物组 与PCI组发生心血管事件发生率与运动耐量无明显差异。但随访三年时间内,发现 PCI组从治疗第6个月开始获益昭。2018年《新英格兰医学杂志》再次报道一组关 于治疗5年的数据,结果提示PCI联合药物组(n=447)主要终点的发生概率明显低 于药物组5=441)。PCI以其创伤小、恢复快、危险性相对较低故而普遍应用于临 床。2017年大陆地区PCI总数可达753142例,较2016年增长13%,平均植入支架 数约1.47枚,术后患者死亡率维持在较低水平(0.23%)卩I随着科技技术的日益 提高,医学技术也随之发展,相应介入手术也出现了一些新技术,其中就是药物涂 层支架。但PCI术后仍有血管再狭窄的风险,因此介入治疗后综合性的健康管理尤 为重要。但近年日本一项多中心RCT研究,PCI术后一年内口服氯毗格雷双抗联合 1个月或12个月准阿司匹林+氯毗格雷双抗治疗,随访1年两者术后疗效无明显差 异,故临床上术后单用抗血小板药物疗效即可卩I 一项随访长达4年包括两千多例 多支血管病变参与的RCT研究师],提示同时处理多支病变血管较仅处理主要病变血 管的预后更好,术后死亡率明显降低。因此,临床上选择以个体化为主,综合评估 患者病情状况。

2肠道菌群的研究进展

2.1肠道菌群的概述

人类生存离不开细菌而人体本身就是一个带菌体,而人体最大的细菌场所就 是肠道,我们将存在肠道的细菌称之为“肠道菌群”。肠道菌群沿着消化道(解剖 上可分为胃、小肠、大肠)上分类的不同其组成的数量和多样性也不同。研究发现 胃肠道的丰度和组成彼此之间都有明显差异:胃里大概有10^103 CFU/ml菌群,空 肠里有&〜IO? CFU/ml菌群和回肠末端有&〜IO* CFU/ml菌群,然而在结肠中发现 的细菌细胞大约有IO】。〜IO】? CFU/ml菌群;而且组成成分也不同,空肠中多为链球菌, 而回肠远端、升结肠和直肠的微生物群落不同,主要由拟杆菌、柔嫩梭菌亚群和球 形梭菌组成卩%同时发现胃肠道不同区段的菌群与其消化道疾病有关,例如口腔疾 病牙周病原体的放线共生放线杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、牙龈 口卜卩林单胞菌(Porphyromonas gingivali)以及衣氏放线菌(Actinomyces israelii)与食 道肿瘤等疾病有关。现今肠道细菌可分为1150多种,其中大多数属于以下菌门:厚 壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门,疣微生物区系等,其中厚壁菌门和拟杆 菌门构成人类肠道菌群中的90%购。

但宿主与肠道菌群处于互利共生的动态平衡关系,宿主为肠道细菌提供赖以生 存的营养物质,同时肠道细菌参与宿主的多种生理过程,包括宿主赖以生存营养物 质的吸收,必需维生素的供给、正常肠上皮屏障功能的调节、免疫系统的防御以及 信号分子的产生(短链脂肪酸和次级胆汁酸)。

2.2肠道菌群的研究方法

2.2.1分离培养法

分离培养法主要是利用不同培养基把各种细胞分离开来,这种技术主要依靠 形态学和生理生化检测对菌株进行鉴定,相比而言,该技术已经相对成熟,而且操 作简单、价格便宜等优势。但该方法也有其弊端,耗时长、培养条件局限,对自然 界有90%-99%的微生物无法用该培养法分离开。由此总结,对肠道微生物中的特点 菌属的研究不单单只用分离培养法。

2.2.2宏基因测序

宏基因测序与分离培养法主要区别在于不需要分离培养某一微生物,可直接从 实验样品中提取岀DNA,再利用高通量测序即二代测序(Next Generation Sequencing, NGS)最后与数据库对比分析出研究样品的微生物组成及菌落功能。

3肠道菌群及其变化与人类健康的相关性分析

正常健康情况下肠道微生物的各类细菌数量、种类、比例保持相对恒定的比例, 共同维护肠道微环境的稳定。由于某种原因打破了人体肠道正常菌群的种类、数量、 定位以及生物学特点的变化,使肠道菌群之间失去平衡从而产生病理性组合,并危 害着人体健康称为肠道菌群失调(intestinal dysbacteriosis, ID)。其失调原因是饮食 成分的不同、生活方式差异、抗生素等药物使用以及疾病等,这些单一或者多种因 素都可影响打破肠道菌群稳态HU并且可以在短时间内迅速变化O2019年H2]采用16S rRNA测序联合代谢组学的方法探究了不同脂肪含量的饮食对肠道菌群及其代谢产 物的影响,结果显示出低脂饮食组的Blautia菌和Faecalibacterium菌丰富度较高,高 脂饮食组肠道菌群中的Alistipes菌和拟杆菌的丰度明显增加而Faecalibacterium菌丰 度明显减少。此外与低脂饮食组相比,高脂饮食的人群的总短链脂肪酸浓度明显下 降。2020年荷兰Rinse K教授等人跑在^Nature Communications^发表了一项关于 41种药物对肠道菌群的Mate分析(n=1883),结果发现其中19中药物与肠道菌群 相关性最强。其中使用二甲双孤的人群肠道菌群的链球菌属、埃希氏杆菌属、粪球 菌属明显增多,同时研究发现二甲双月瓜与人体代谢的丁酸生成和多粘菌素抗性途径 等的增加有关;使用抗生素(近3个月内)人群肠道菌群双歧杆菌丰度下降,并且 发现影响氨基酸生物合成等途径;质子泵抑制剂(PPI)的使用人群的Veillonella菌 属丰度明显增加。

当处于某些疾病状态时,肠道菌群会发生显著变化。临床研究表明屮],与健康 组对比,非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fhtty liver disease, NAFLD )患者体内变形 菌门与梭杆菌门丰富,而且发现普沃氏菌的减少跟非酒精性脂肪肝有关。最近研究 发现核梭杆菌、产大肠杆菌素的大肠杆菌和产肠毒素脆弱拟杆菌,都与脱氧核糖核 酸损伤和肿瘤进展有关HU 2019年,国内王保红教授等人通过对97名参与者肠道菌 群进行一项前瞻性和横断面研究发现与健康老年人相比,阿尔茨海默症的患病人群 肠道菌群发生显著变化,即厚壁菌门丰度降低且变形杆菌丰度增加,这与阿尔茨海 默症的病情严重程度相关。近年来,动物实验研究表明肠道菌群可能与淀粉样蛋白 沉积相关。近年来,肠道菌群失调已成为研究疾病发生发展的热点问题。

4肠道菌群紊乱与心血管疾病的相关性分析

近几年,调节肠道菌群已成为治疗和预防心血管疾病新的潜在靶标。多项国内 外研究,揭示了肠道菌群紊乱与心力衰竭、肥胖、高血压及糖尿病等CVD存在相关 性。

4.1肠道菌群紊乱与心力衰竭之间的关系

一项研究慢性心衰组肠道微生物区系结构与对照组差异显著(F=5.66, p=0.003, R2=0.0580),而 DCM-组与 ICM 组间差异极显著(F=2.01, p=0.101, R2=0.0380)[46]o 此外,表明心力衰竭患者肠道微生物与对照组相比,F.prausnitzii减少和R.gnavus增 加。这可与慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)患者肠道微生物功能改变有 关,CHF患者肠道微生物参与有益代谢物(如丁酸盐)减少和有害代谢物(如TMAO) 升高的代谢不平衡旳。

Martin R教授等人跑研究表明F.prausnitzi是产丁酸盐最丰富的的菌属之一,同 时被认为是一种重要的抗炎共生菌。损失或缺乏F.prausnitzi其抗炎作用可能加重慢 性炎症。丁酸盐产生菌的减少可作为肠道菌群紊乱的一种生物标志物,并补充其作 为益生菌在几种疾病中的治疗作用〔49]。此外,慢性心力衰竭患者粪便和血浆代谢模 式的改变与肠道微生物区系失调有关。这些发现表明慢性心力衰竭患者肠道微生物 异常。肠道微生物失调可作为CHF的一个独立预测因素,还需进一步探讨所涉及的 具体机制,并探索相关的干预策略。

4.2肠道菌群紊乱与肥胖症之间的关系

肥胖是一种慢性代谢紊乱性疾病,体重指数(体重与身高的平方的比值)大于 或者等于30o 2011年时统计预测,到2030年美国罹患肥胖成年人数高达6500万例, 同时,英国有1100万肥胖成年人a】。

特定肠道菌群的改变对肥胖有积极的作用El。2019年通过敲除T细胞Myd88 特异性小鼠的实验揭露了肠道菌群结构,即降低脂质吸收能力的梭菌纲的丰度降低, 与肥胖等代谢疾病相关的脱硫弧菌属细菌的丰度增加,可导致了免疫缺陷小鼠发胖 di。同年,国内刘宏伟教授团队等人冋通过减轻小/ob小鼠和高脂饮食的小鼠发现, 肠道吉氏副拟杆菌有助于减轻肥胖和调节代谢失常。但早年Ley®4]等人研究发现肥 胖型小鼠的肠道菌群中拟杆菌门丰度下降,而厚壁菌门丰度。早有研究报道肠道微 生物产生的某些短链脂肪酸可能会改善肥胖。2016年PenyQ]等人研究表明肠道微 生物产生短链脂肪酸醋酸盐(acetate)导致肥胖,且机理是人体内的肠道微生物参与 食物的分解与消化,并产生大量的醋酸盐,这些醋酸盐会随着体内血液循环通过血 脑屏障刺进副交感神经兴奋。这方面主要引起胰岛B细胞分泌胰岛素启动细胞储存 能量的过程。Million^56]等人在利用荧光定量PCR技术在临床研究中(包括68例肥 胖患者与27例健康人)发现肥胖患者粪便中罗伊氏乳杆菌与对照组相比丰富度明显 增加,史氏甲烷短杆菌、双歧杆菌丰富度含量低。

4.3肠道菌群紊乱与高血压之间的关系

高血压(Hypertension,HTN)是指体循环动脉血压升高(收缩压2140毫米汞柱, 舒张压290毫米汞柱),也是心脑血管病发生和死亡的主要危险因素。伴随人民生 活水平的大幅度提升和社会的老龄化到来,我国每年高血压罹患率持稳步增长趋向。 据推算每年新生高血压1000万人QI。

近年来越来越多的证据表明肠道菌群参与高血压的发生发展金59],其中肠道菌 群中的厚壁菌门(F)和拟杆菌门(B)比率(即F/B比率)改变可作为病理状况的 微生物学标志。国内陶阳等人画通过动物实验研究表明,HTN大鼠肠道微生物丰富 度和多样性降低且厚壁菌门和拟杆菌门的比例有所增加,其原因在于特定微生物群 及其相应的代谢物失衡,尤其是乙酸和丁酸产生菌数量减少和产乳酸菌群的增加有 关。米诺环素治疗后,大鼠模型的肠道菌群重新平衡和改善高血压水平,同时对HTN 人群进行了临床研究,结果验证了抗生素确实有调节肠道菌群和缓解高血压的作用。 这些发现清楚地表明肠道微生物区系在动物和人类高血压的病理生理学中的作用。 但肠道菌群失调是在高血压患病之前还是之后发生,这还需进一步研究。2019年德 国MaxDelbruck分子医学中心的Hendrik教授等人⑹]在^Circulation》上发表了一个 输注Angelall的WT小鼠高血压模型和ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型上,研究发现 肠道菌群代谢产物■丙酸盐还具有拮抗高血压和减轻血管炎症以及AS的作用。高盐 摄入导致肠道内鼠乳杆菌丰度的下降,也证明了鼠乳杆菌可能会调节高血压的症状。

4.4肠道菌群紊乱与糖代谢异常及糖尿病之间的关系

糖尿病(diabetes mellitus, DM)主要是以空腹血糖升高为主要表现的代谢性疾 病,可引起身体其他的系统并发症从而严重危害着健康,其致残率和致死率较高,医 疗费用也位于前列。2013年中华医学会与中国疾病预防控制中心根据资料统计我国 成人糖尿病患病率已达11.6%,总患病人数达1.14亿,位于世界第一位el。2015年IDF 统计数据,估计全球约有4.15亿DM患者,到2040年全世界DM患者人数可能高达6.42 亿①]。近年流行病学调查研究显示,全世界DM患者人数每年以5%同比增长,故DM 已成为国际上日益关注的公共健康问题。

多项研究表明⑹,6习,饮食改变例如高塘高脂饮食也会引起肠道菌群紊乱,这可 能与胰岛素抵抗有关,参与2型糖尿病的发生发展。丹麦学者Pedersen等人跑通过 研究发现普沃氏菌可以诱导胰岛素抵抗与加重葡萄糖耐受不良,从而加重患糖尿病 的风险。Larsen等人旳使用主成分分析大观察到2型糖尿病组与健康组的肠道菌群 差异,即拟杆菌门和变形菌门增加,而厚壁菌门明显降低。我国研究人员阴通过临 床研究发现,肠道菌群及其变化随着糖尿病病程发展的不同,同时发现双歧杆菌与 糖尿病患者FPG呈负相关(r二-0.588,PF0170.05)。目前肥胖和2型糖尿病研究的重 点发现是如粘液定殖的Akkermansia muciniphiho主要是因为口服二甲双月瓜增加了 Akkermansia muciniphila,同时埃希氏菌属的相对增加。Yassour等人卩刃在双胞胎中2 型糖尿病发病前,观察到A.muciniphila丰度减少。国内四川大学周涛等研究员㈤】在 《Diabetes Care》上发表了对264名肥胖患者进行饮食干预,结果显示血浆TMAO 水平发生明显下降与糖尿病相关因素的骨密度(BMD)降低相关,同时发现,脊椎 和髓部BMD的变化与TMAO前体左旋肉碱的变化有关(PV0.05)。2019年徐爱民 教授等人[71]在生物学顶级期刊《Cell Metabolism》发表一篇研究,此研究利用宏基因 组学和代谢组学分析方法对糖尿病前期男性患者5=39)的肠道菌群进行分析,结 果发现运动组通过增加肠道菌群代谢产物SCFAs和BCAAs的代谢改善胰岛素敏感 性。这项研究为糖尿病治疗提出新的临床思路。

5肠道菌群的干预治疗

目前研究发现,可通过以下途径调节肠道菌群:

1) 饮食结构的调整:多食蔬菜水果,少食加工肉和红肉。2019年我国研究人员 张燕等人[72】在肥胖小鼠模型上发现,绿色蔬菜里的叶绿素有助于缓解肥胖,其中叶 绿素可降低厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比例,同时发现拟杆菌门和变形菌门的丰富度 明显增加。此外,瑞典Liu等人网发现越桔(山桑子)通过抑制诱导型一氧化氮合 酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和国内李萍教授等人[74]发现陈皮中的多甲 氧基黄酮提取物(Polymethoxyflavonwichextract, PMFE)都有助于调节高脂饮食

(HFD)诱导的肠道菌群失调。同年,英国Gary教授等人〔75]通过对12个超重或肥 胖患者实验,发现菊粉可以改善肥胖人群的岛素的敏感性,同时发现可增加放线菌 纲的丰度,降低梭菌纲的丰度。法国OcCane等人西采用16S rRNA基因Illumina miseq 测序对F344雄性大鼠进行试验,与实验对照组相比富含血红素饮食的大鼠组与癌症 发生率明显增高时,同时发现肠道菌群紊乱和局部肠道炎症。

2) 摄入益生菌或益生元:冯文科等人"I研究发现,益生菌的鼠李糖乳杆菌 GG(Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)可以通过增加含BSH的肠道细菌水平来增加 粪便胆汁酸的排泄,抑制肝损伤和肝纤维化。此前己有研究发现LGG可以改善AMI 大鼠模型的射血分数以及心室重塑。

3) 抗生素的使用:抗生素能够有效地消灭细菌,而被广泛应用于临床治疗疾病 当中。2019年19月马克斯•普朗克陆地微生物研究所FranciscoDiaz-Pascual等人悶 在^nature microbiology》发表了四环素可以破坏霍乱弧菌的生物膜从而破坏了菌群 屏障功能。

  • 粪便菌群移植(FMT):现在FMT是指通过将正常人的粪便移植到患病人 群中,目的在于调整肠道菌群,这种方法已经经在炎症性肠病得到预期的认可。2019 年Llea〔79]等人首次分别对大鼠及小鼠进行人类粪便移植(HST)的实验发现大鼠肠 道微生物群与人类的组成和结果相似度更高,研究证明健康的HST可以改善肠道微 生物的紊乱,恢复a多样性,增加与健康相关属的丰富度。2019年Jasmohan等人]网 通过粪便移植小鼠的动物实验再次证明FMT的治疗效果,结果发现在小鼠身上有肝 硬化相关的炎症的得到有效缓解。2020年美国加州理工学院Rustem F教授等人]丽 采用16S rRNA扩增子测序、微生物功能基因预测和胆汁酸代谢组学分析的方法研究 发现与粪便喂食的小鼠相比,未喂养粪便的小鼠组肠道微生物丰度且厌氧菌丰 度都降低。此外粪便菌群移植(FMT)是治疗IBD的新型潜在方法,事实上就是利 用健康人的“微生物菌群”调节失调的肠道菌群。但有学者认为此方法仍有争议, 原则上移植粪便菌群也可引起受体肠道菌群的紊乱。故其特异性尚不明确,仍需进 一步临床验证。
  • 中药方剂:近年来国内学者一直热衷于我国中药对肠道菌群的调节,其中黄 连、葛根苓连汤、戊己丸和丹参素等的作用已经得到研究证实]砂】。研究发现在大鼠 实验中发现,戊己丸可增加拟杆菌门、嗜粘阿克曼氏菌(Akkermansia)以及 Parasutterella菌的含量,从而达到治疗IBD的治疗效果。南京大学的谭仁祥教授等 人丽发现中药里的黄连生物碱有抗高脂血症的作用。主要是由于黄连生物碱里的小 漿碱、黄连碱等有效成分能够减少大肠埃希菌群和增加贝那氏菌。除此以外,研究 发现小糜碱该具有增加Akkermansia的丰度。此外,中药汤剂的罠坚合剂和泻心汤, 可通过调节T2D肠道菌群改善肠道通透性和减少炎症,从而达到治疗效果。

6展望

近期证据表明,肠道菌群的功能不止是参与人体正常的消化吸收生理,还可作 为一种内分泌器官。肠道菌群失调可作为CVD新发现的一种可控性危险因素,参与 HF、肥胖、HTN及DM的发生发展。因此,调节肠道紊乱为心血管疾病的预防和治 疗提供了新的潜在途径和方向。

正 文

1研究对象

1.1病例选择

收集2018年12月至2019年5月在陕西省人民医院心血管内一科的住院患者 及门诊健康体检者共13例,其中9例稳定型冠心病患者设为稳定型冠心病组(男5 例,女4例,年龄分布58-74岁)、4例健康人群设为健康对照组(男2例,女2例, 年龄分布58・68岁)

1.2纳入标准

1.2.1稳定型冠心病组

根据患者典型的发作症状和体征、结合患者年龄、冠心病的危险因素,排除 其他原因引起的心绞痛发作。心绞痛发作时在心电图可明显看见ST-T改变(ST段 下移)或行运动负荷试验发现ST段明显下移大于O.lmV以上,而发作间歇期时检 查结果正常,心肌损伤标志物等未见异常;或者冠脉造影、CTA提示主要冠状动脉 ±50%狭窄。

1.2.2健康对照组

(1) 入组人群均无高血压、糖尿病、冠心病及其他心血管疾病等;

(2) 近4周无服用抗生素、抑酸剂、益生菌及影响肠道菌群的药品;

(3) 无消化道疾病及消化道手术病史;

1.3所有入选患者排除标准

(1) 近4周服用抗生素、抑酸剂、胃粘膜保护剂、益生菌或影响肠道菌群的药 品;

(2) 近4周内曾有消化道手术病史或消化道疾病,如胃溃疡、IBD;

(3) 结缔组织、肿瘤等疾病;

本课题经陕西省人民医院伦理委员会审核同意,向患者说明收集患者基本资料 及粪便标本的目的,取得患者同意后进行资料收集,严格遵守知情同意及信息保密 原则。

2实验用品与方法

3.1实验试剂

DNA抽提试剂盒 E.Z.N.A.® Soil DNA Kit Omega Bio-Tek 美国
琼脂糖 biowest agArose biowest 西班牙
FastPfu PolymeDNA      
抽提试剂盒 FastPfu Polymerase TransGen 中国
rase      
AxyPrep DNA Gel Axygen Biosciences Axygen 美国
Extraction Kit NEXTFLEX® Rapid    
建库试剂盒 DNA-Seq Kit Bioo Scientific 美国
测序试剂盒 MiSeq Reagent Kit v3 Illumina 美国
3.2实验仪器      

 

仪器 型号 公司 国家
移液器 EppendorfN13462C Eppendorf 德国
    合肥艾本森科学仪  
小型离心机 ABSON MiFly-6 器有限公司 中国
小型离心机 Eppendorf 5430 R Eppendorf 德国
高速台式冷冻离心机 Eppendorf 5424R Eppendorf 德国
  超微量分光光度计 NanoDrop2000 Thermo Fisher

Scientific

美国
  酶标仪 BioTek ELx800 Biotek 美国
  旋涡混合器 QL-901 海门其林贝尔仪器

制造有限公司

中国
  粉碎研磨仪 TL-48R 上海万柏生物科技

有限公司

中国
  MP研磨仪 FastPrep-24 5G MP 美国
  微型荧光计 Quantus™

Fluorometer

Promega 美国
  磁力架 / 生工生物工程(上

海)股份有限公司

中国
  电泳仪 DYY-6C 北京市六一仪器厂 中国
  PCR仪 ABI GeneAmp®

9700 型

ABI 美国
  测序仪 Illumina Miseq Illumina 美国
3.3 -般临床资料采集      
  收集研究对象的年龄 、性别,患病史及临床症状、个人史、 居住地,药物使用
史、 饮食习惯、生活习惯C      
3.4 实验方法      

图1 Miseq测序实验流程ZF意图

收集样本时间为2018年12月一2019年5月,分别采集稳定型冠心病组和健康 对照组粪便样本。于入院后第一日早晨收集患者新鲜粪便并在排便后2小时置于封 闭的粪便收集管中,同时贴上标签、封口后置将标本存放于・80°C冰箱保存。粪便样 本DNA提取由深圳微生太科技有限公司进行。
2.4.1
样本采集及提取样本总DNA

2.4.2DNA提取和检测

  • 总 DNA 提取
  • 添加500 mg磁珠、5g粪便和1 mL SLX- Mlus Buffer到2 mL离心管中, 粉碎研磨仪45 HZ震荡250 sec;
  • 加入 100 iliLDSBuffer,颠倒混匀;
  • 70°C孵育 10 min, 95°C孵育 2 min;
  • 室温 13000 rpm,离心 5 min;
  • 转移800 |1L上清至新的2 mL离心管中,加入270 |1L P2 Buffer以及100 pL HTR Reagent;
  • 颠倒混匀,・20°C孵育5 min;
  • 室温 13000 rpm 离心 5 min;
  • 转移上清至新2mL离心管,加入等量XP5 Buffer及40此磁珠,上下颠 倒混匀8 min;
  • 磁力架吸附,弃去残液,取下管子,加入500 ^iLXP5 Buffer,混匀;
  • 磁力架吸附,弃去残液,取下管子,加入600 ^iLPHB,混匀;
  • 磁力架吸附,弃去残液,取下管子,加入600 ^iL SPWWash Buffer,混匀;
  • 磁力架吸附,弃去残液,取下管子,加入600 ^iL SPWWashBuffer,混匀;
  • 磁力架吸附,弃去残液,室温13000 rpm,离心10s;
  • 磁力架吸附,用移液枪弃去残液,室温静置8 min;
  • 加入 100 |liLElution Buffer,混匀,静置 5 min;
  • 磁力架吸附,转移上清至新的1.5mL离心管,得到总DNA。

3.2.2 DNA 检测

  • DNA纯度和浓度检测:利用NanoDrop2000
  • DNA完整性检测方法:利用1%琼脂糖凝胶电泳,电压5 V/cm,时间为

20 min进行DNA检测。

2.4.3引物设计与PCR扩增

  • 引物设计

引物对应区域:16SDNAV3-V4区

上游引物 338F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 下游引物 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT

  • PCR扩增

在PCR反应管中按照表1配置PCR反应体系,震荡混匀后按照前期模拟实验确 定好的参数设置反应相关数值,具体反应参数如下:预变性:95°C, 3分钟;变性: 95°C30秒,退火:55°C, 30s,延伸:72°C 45s,循环25次;后延伸:72°C 10分钟; 10°C下冷却。

表1 PC反应体系

试剂 使用量
5 xFastPfu Buffer 4pil
2.5 mM dNTPs 2 |il
Forward Primer(5 |1M) 0.8 |il
Reverse Primer(5 yM) 0.8 |il
FastPfu Polymerase 0.4 pil
BSA 0.2 |llL
Template DNA 10 ng
补ddH2O至 20 |1L

2.4.4 PCR产物鉴定、纯化及定量

  • PCR产物鉴定

每个样本做3个PCR重复,再将3个重复的PCR产物混合,最后用2 %琼脂糖 凝胶电泳检测PCR的产物。

2AA.2 PCR产物纯化

检测后的PCR产物参考AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒说明书的实验步 骤进行操作,具体流程见附录1。

2.4.4.3 PCR产物定量与均一化

将PCR产物用Quantus™ Fluorometer进行检测文库定量。并按照每个样本的 测序量要求,进行相应比例的混合。

2.4.5构建PE文库及Illumina测序

  • Miseq文库构建

使用NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit进行建立文库,具体操作步骤见附录2。

  • Illu mina 测序

用Illu mina公司的Miseq PE300平台上机进行测序,具体操作步骤见附录3。

2.5统计学方法

利用16S rRNA测序技术获得基因序列,然后在Illumina Miseq测序平台对样本 进行双端测序,分析两组肠道菌群的物种组成、两组间OTU差异、Alpha多样性和 Beta多样性,从而获得生物学信息。Alpha多样性指数及Beta多样性指数利用 Wilcoxon秩和检验对于两组之间进行比较并绘制箱式图,反映两组的物种多样性、 丰度及组间菌群结构差异,以pV0.05认为有显著差异性。

3结果

3.1 —般资料分析

稳定型冠心病组及健康对照组的性别、年龄在两组间的差异无统计学意义(均 P>0.05) o结果见表2。

表2两组一般资料统计分析表

  稳定型冠心病组(n=9) 健康对照组(n=4) P值
年龄(岁) 65.44± 6.94 62.75±6.37 0.48
性别(男/女) 5/4 2/2 0.74

3.2测序数据分析

本买验米用Illumina MiSeq平台对测序样本进行双玄而测序。(详见 https://en.wikipedia.org/wiki/Fastq)在本实验中得到的测序数据经过barcode拆分后获 得的有效序列信息统计,如图2所示:最低限度:39691,中位数:50268.0,平均: 50735.5652174,最高限额:67213,共计:1166918。

40000 45000 50000 55000 60000 65000

Number of sequences

图2序列样本拆分统计

说明:在数据按照barcode拆分之后每个样品的实际所含的序列数量统计。X轴代表样品所 含序列数目的区间,Y轴代表在这个所含序列数目的区间有多少个样品。

使用Qiime2软件中的DADA2插件对所有样品的全部原始序列按以下步骤形 成操作分类单元(Operational Taxonomic Unit, OTU):质量控制(input)—去噪(denoised) —拼接(merged)—去嵌合体(non-chimeric) □值得注意的是在本报告中提到OTU也可 被称之为扩增特征序列。表3显示了该过程各个步骤之后剩余序列数目。(treatment 代表稳定型冠心病组;Control代表健康对照组)

表3 DADA2去噪生成OTU的过程统计表格

Group Sample-id input filtered denoised merged non-chimeric
treatment A1032520 44805 38969 38969 36116 29216
treatment A1032558 52716 46751 46751 42756 35024
treatment A1035907 49042 43735 43735 38582 30837
treatment A1038768 47177 41777 41777 39385 34291
treatment A1039839 45079 39773 39773 37339 35068
treatment A1040705 52132 46459 46459 41224 30349
treatment A643149 47419 40677 40677 39224 34775
treatment A735254 53676 46934 46934 44493 37291
treatment A921935 43882 38713 38713 37574 33533
Control C1028345 58288 51848 51848 45913 34743
Control C1028380 47988 42418 42418 41767 38427
Control C1036618 52098 46199 46199 44444 36712
Control C1039921 42790 38109 38109 37766 36543

3.3序列注释程度分析

实验选取OTU的代表性序列,与核糖体RNA数据库(Greengenes Database

13_8版本[按99%序列相似性聚类])进行比对获得物种注释信息,即得到每个

cluster的序列及其代表序列(即为OTU)。对每个样本而言,OTU丰度构成该样 本的组成结构。使用R软件ggplot2包中的ggplot函数可对示例样本在各分类水 平注释的相对程度进行堆叠图绘制,可视化结果如图3,代表所有样本在各分类 水平上的序列注释程度柱形图。横坐标(SampleName)是样品名,纵坐标(Sequence Number Percent)表示注释到该水平的序列数目占总注释数据的比率,柱状图自上 而下的颜色顺序对应于右侧的图例颜色顺序。每个分类水平最高值为1,代表100% 的序列都得到了至少在这个级别的注释。本研究结果主要针对每个样本肠道微生 物的物种分别在门、纲和属3个水平分类级别进行分析。

说明:A样本为稳定型冠心病组,C样本为健康对照组
3.4物种组成分析

一般进行群落结构分析,可以从两个角度来入手。一是群落结构分布柱状图, 可以展示不同样本或者分组整体群落的构成,以及构成之间的差异;二是群落结构 分布Heatmap图:可直观展示物种在门纲目科水平的丰度高低。

首先,根据图4・A在门水平上群落结构分布柱状图,我们在稳定型冠心病组 中发现主要以四大门为主(总占比大于99%),按照占比情况从高到低分别是厚 壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)

以及拟杆菌门(Bacteroidetes),其余总占比不足于1%的菌门其中包括软壁菌门 (Tenericutes)、疣微菌门(Veirucomicrobia)、TM7 门、梭杆菌门(Fusobacteria)> 绿弯菌门(Chloroflexi) 、Thermi 门、OD1 门以及酸杆菌门(Acidobacteria)。根 据两组样本的物种注释结果,厚壁菌门(Firmicutes)在两组中均丰度最高,其中 厚壁菌门在稳定型冠心病组和健康对照组中占比情况分别是69.38%、64.72%O依 次丰度从高到低是:变形菌门的占比情况分别是12.89%、21.02%,放线菌门的占 比情况分别是12.99%、3.30%,拟杆菌门的占比情况分别是4.40%、10.52%。软 壁菌门的占比情况分别是0.20%、0.19%0疣微菌门的占比情况分别是0.05%、 0.10%。我们通过两组样本的物种注释分辨率(即群落结构分布柱状图)发现在门 水平上存在明显差异,稳定型冠心病组(treatment组)的厚壁菌门和放线菌门与 健康对照组(Control组)相比明显增多,而变形菌门和拟杆菌门明显减少。

厚壁菌门(Firmicutes)在稳定性冠心病组和健康对照组的丰度最高。根据图 4-B在纲水平的群落结构分布柱状图分析结果显示,稳定型冠心病组和健康对照 组肠道菌群中的梭菌纲(Clostridia)均占第一位,厚壁菌门中丰度中最高的纲是 梭菌纲(Clostridia),在稳定型冠心病组所占比为52.37%,在健康对照组所占比 为58.59%,其次是芽抱杆菌纲(Bacilli)和产芽鞄菌纲(Erysipelotrichi),在稳 定型冠心病组和健康对照组所占比为15.47%、4.81%和1.56%、1.30%。根据图4-C 所示,厚壁菌门门中占比从高到低的属依次是:Blautia属、链球菌属

(Streptococcus)> 粪球菌属(Coprococcus)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、罗 氏菌属(Roseburia)、梭菌属(Clostridium)、Ruminococcus 属、Lachnobacterium 属,其占比均〉0.3%0

变形菌门(Proteobacteria)在稳定型冠心病组所占比为12.89%,在健康对照 组所占比为21.02%0根据图4・B和图4・C所示,变形菌门中丰度中从高到低的前 三位的纲是分别是Y变形菌纲(Gammaproteobacteria )、B变形菌纲 (Betaproteobacteria)以及 Q 变形菌纲(Alphaproteobacteria),他们在稳定型冠 心病组和健康对照组所占比分别是12.82%、18.73%, 0.04%、1.32%和0.004%、

0.95%。变形菌属内丰度较高的属是Gemmiger属和克雷伯氏杆菌属(Klebsiella ) 其占比均〉0.3%0

放线菌门(Actinobacteria)在稳定型冠心病组所占比为12.99%,在健康对照 组所占比为3.30%。根据图4・B和图4・C所示,放线菌门丰度最高的属是双歧杆 菌属(Bifidobacterium )占比>0.3%。拟杆菌门(Bacteroidetes)在稳定型冠心 病组所占比为4.40%,在健康对照组所占比为10.52%0根据图4・B和图4・C所示, 其丰度位于前两位的属分别是拟杆菌属(Bacteroides)与普氏菌属(Prevotella), 其占比均〉0.3%。

PiwsdteDna

  • CdfesdU

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仙抽记甘

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Cba血吐 riiFTi

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口龙臨翻i

  • Ufsuttji«l_-^ri<JKJ!uo-aei

Genus Level Barplot(C)

图4在各分类水平上的序列注释程度柱形图(门、纲、属)

说明:treatment代表稳定型冠心病组;Control代表健康对照组

3.5样本共有物种分析

OTU的丰度揭示了样本肠道菌群的丰富程度。根据分组里每个样本的OTU 的丰度可计算出每个样本或组间共同拥有和特有的OTU,可用Veen图表示。

从图5可看出共有OTU数是780个,稳定型冠心病组特有OTU数是415个, 健康对照组特有OTU数是174个,两组共有OTU数是191个。

图 5 OTU Veen 图

说明:treatment代表稳定型冠心病组;Control代表健康对照组

3.6两组间OTU的差异分析

3.6.1 ANC0M 分析

ANCOM分析是指用于比较微生物组学数据中物种在组间的显著性差异的分析 方法。图6代表属水平组间ANCOM分析示意图,W值越高,代表该物种在组间的 差异显著性越高。根据图6显示,稳定型冠心病组与健康对照组肠道菌群无显著性 差异。

1.H-

D.B -

° 1 1 « 1-

35 -30 -2 5 蔬 0 -1 5 也 0 山 5 0.0 05 1 0 K5 20

图6 ANCOM分析示意图

3.6.2 LEfSe 分析

LEfSe分析是指非参数检验和线性判别分析的结合,适合菌群丰度差异检验。图 7代表LEfSe分析LDA柱形图(LDA>2)是对两组的肠道菌群进行组间差异性分 析。通过LEfSe分析LDA值分布柱状图结果的分析我们可以得出,稳定型冠心病组 丰度较高的菌群是放线菌门(Actinobacteria) >乳杆菌科(Lactobacillaceae)以及乳 杆菌属(Lactobacillus);健康对照组丰度较高的菌群是气球菌科(Aerococcaceae)、 脱硫弧菌属(Desulfbvibrio)以及乳球菌属(lactococcus)。

Lactbbacillaceae
p_Actinobacteria

liactobacillus

: g_Lactocodcus : :

I g_Desu向yibrio : : :

-f_Aerococcaceae

-4.8 -3.6 -2.4 -1.2 0.0 1.2 2.4 3.6 4.8

LDA SCORE (log 10)

图7 LEfSe分析LDA柱形图(LDA>2)

说明:每一横向柱形体代表一个物种,柱形体的长度对应LDA值,LDA值越高则差异越大。柱形的颜 色对应该物种是哪个分组的特征微生物,特征微生物(Biomarkers)表示在对应分组中的丰度相对较高。

3.7多样性分析

3.7.1 Alpha多样性分析

Alpha (a)多样性分析是对某个样品中物种的丰富度和均匀度进行分析。群落 丰富度(Community richness)的指数主要包括Chaol指数和ACE指数。群落多样 性(Community diversity )的指数通常用 ObservedOTU , Shannon 以及 Faith!s Phylogenetic Diversity 等指数。

Chao指数:1084年Chao提出的理论代表着物种丰富度,两者呈正相关,即Chaol 值越大代表物种总数越多,表明群落的丰富度越高。Observed OTU指数:是指样本 中实际测定得到的OTU数量,衡量样品中OTU丰富度的指数,两者呈正相关。

Shannon指数:是考虑到样品中的分类总数,和每个分类所占的比例,是评估样本中 物种组成的丰富度,两者呈正相关。Simpson指数:1949年EdwardHugh Simpson提 岀Simpson,用来估算样品中微生物的多样性指数之一。该指数可以评估群落中优势 物种的地位和作用,两者呈负相关。即Shannon指数值大,表明群落多样性越低。

采用Kruskal Wallis方法比较在各个样品分组之间Alpha多样性指数是否有显著 性差异,结果如图8所示。

如图8A-E,对稳定型冠心病组和健康对照组的样本进行组间Q多样性分析,样 本的 Chao 指数、ObservedOTU 指数,Shannon 指数、Faithfs Phylogenetic Diversity 指数以及Simpson指数的指数数值结果表明,稳定型冠心病组和健康对照组在肠道 菌群种群多样性方面无显著差异。

图8两组样本组间a多样性分析

说明:treatment代表稳定型冠心病组;Control代表健康对照组。X轴表示分组名称,Y轴表示Alpha

多样性指数。*, **, ***分别代表p<0.05,p<0.01,p<0.001; ns代表无统计学意义。

3.7.2 Beta多样性分析

1)利用Bray Curtis算法计算样本间距禺矩阵,绘制PCoA图形。通过对数据的 第一 (PC1)、第二(PC2)、第三(PC3)主成分分析制作图9。两组样本的PCoA 分析示意图结果表明,稳定型冠心病组与健康对照组在肠道菌群结构上没有明显差 异。

说明:图中的一个点代表一个样本;颜色或者椭圆反应样本分组。treatment代表稳定型冠心病组,Control 代表健康对照组。图中两点之间的距离越近,显示出两个样本之间的微生物群落结构差异性越小,结构相似度较 高。
图9 PCoA分析示意图

2)根据PERMANOVA方法比较在各个样品分组之间的微生物组成结构是否有显 著性差异,得到的结果如表3所示,q值是校正过的p值,更具参考价值,q<0.05 可推断组间菌群结构存在显著差异。根据表3中q值>0.05无统计学意义,表明稳定 型冠心病组与健康对照组在肠道菌群结构上没有明显差异。

表4 PERMANOVA方法计算结果

Group 1 Group2 Sample size Permutations pseudo-F p-value q-value
treatment Control 13 999 0.744849 0.797 0.797

说明:treatment代表稳定型冠心病组;Control代表健康对照组。

4讨论

随着微生物测序技术不断挖掘影响微生物聚类的因素和微生物的分子代谢产 物,可有效明确宿主微生物组对医疗的作用,开辟微生物医疗的新纪元阴]。2019年 Pasolli E等人在《Cell》上发表了一篇涉及31个国家的宏基因组样本,结果从尚未 命名的物种中鉴定了超过150000个微生物基因组,4930个物种。其中,77%的物种 在此之前是未知的,扩展了人类相关的微生物基因组阿。同时揭露了肠道菌群及其 代谢产物与疾病之间的联系,使我们对疾病有了一定“宿主一微生物一疾病”的观 念。

越来越多的国内外研究表明,肠道菌群的失调及其代谢产物TMAO、TML和 L■瓜氨酸与各种疾病紧密相关。但2015年Yin J等人网采用16SrRNAV4标记的 Illumina序列分析做了一项关于卒中和短暂性脑缺血发作的研究结果表明,脑卒中和 短暂性脑缺血发作患者的TMAO水平明显低于无症状组,2019年4月26日协和医 院张抒扬课题组旳在《Microbiome》发表一篇涉及161名CAD患者(SCAD组n=44, UA组n=80, MI组n=37)与40名健康对照组采用多组学分析方法,研究发现肠道 菌群中的罗斯氏菌属、克雷伯氏菌、梭菌属IV和瘤胃球菌科随病情的严重程度而发 生显著变化,进一步揭示了健不同的冠状动脉疾病亚型的肠道菌群的组成和功能不 同,同时还发现细菌可调节人类的牛磺酸、鞘脂、神经酰胺和苯的代谢途径,影响 AS,这一点将肠道微生物与代谢途径相连接,为AS的发病机制进一步详细地进行 阐述。2019年Armour等人[隔首次对8项研究中约2000例粪便标本进行分析,发现 肠道菌群功能多样性发生变化与各种疾病相关,例如直肠癌患者体内含有更丰富的 蛋白家族(PV0.0 1),同时发现,不同疾病的微生物功能基因识别敏感性和特异性不同 (例如克罗恩病,AUO0.9539;肝硬化,AU00.9023),而其他疾病的识别准确度较 低(例如,类风湿性关节炎,AUO0.6641;结直肠癌,AUO0.5955)。此研究采用宏 基因组功能学,研究不仅揭露了肠道菌群与心血管疾病之间的关系,也揭露了与类 风湿关节炎、非酒精性脂肪肝、炎性肠病、结直肠癌等联系。2019年欧洲分子生物 学实验室Georg Zeller等人比刃对结直肠癌病例(CRC, n=386)和无肿瘤对照(CTRL, n=392)的粪便进行一项Meta分析,结果发现CRC宏基因组的功能分析显示富含蛋 白质和粘蛋白分解代谢基因且碳水化合物降解基因减少。此外,研究发现肠道菌群 的代谢产物对AS有积极作用。2018年Kasahara教授等人莎发现肠道内的主要产丁 酸盐菌的罗氏弧菌(Roseburia intestinalis)的水平与模型小鼠动脉粥样硬化的发生呈 负相关,降低全身炎症,从而改善动脉粥样硬化。此外,小鼠饮食中补充丁酸盐能 显著减少内毒素血症和动脉粥样硬化的发展。2019年,我国曾晓雄团队阿发现 Porphyromonadaceae, Helicobacter, Parasutterella, Parabacteroides, Oscillibacter 禾口 Lachnospiraceae是与炎症性肠病相关的关键细菌,与先前国外Jayarathne等人阿研究 相符。

本研究采用16SrRNA测序技术对稳定型冠心病组进行分析,结果表明发现稳定 型冠心病人群主要以四大门为主(总占比大于99%),按照占比情况从高到低分别 是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria) 以及拟杆菌门(Bacteroidetes),其余总占比不足于1%的肠道菌门其中包括软壁菌 门(Tenericutes) > 疣微菌门(Verrucomicrobia) > TM7 门、梭杆菌门(Fusobacteria)> 绿弯菌门(Chloroflexi)、Thermi门、OD1门以及酸杆菌门(Acidobacteria)。其中 厚壁菌门在稳定型冠心病组与健康对照组中丰富度均最高,变形菌门丰富度最二高。 稳定型冠心病组肠道菌群与健康对照组相比在物种组成上存在显著差异,即稳定型 冠心病组肠道菌群的厚壁菌门和放线菌门丰度明显升高,而变形菌门和拟杆菌门丰 度明显减少。国外Sanchez-Alcoholado等人阿研究发现拟杆菌门的显著减少和变形 杆菌门丰度的增加可能反映了冠心病的主要危险因素之一。2017年Emoto等人网 利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)和16核糖体RNA的方法研究发现,冠 心病的拟杆菌门丰度降低且厚壁菌门/拟杆菌门的比例明显上升。Emoto等人研究结 果与本研究结果相符。同年,CuiL等人〔95]利用高通量测序研究发现,与健康对照组 相比,冠心病患者的拟杆菌门和变形杆菌门减少而厚壁菌门增加,进一步验证了冠 心病患者肠道菌群的厚壁菌门和拟杆菌门的丰度发生了明显改变。JieZ等人阿在动 脉粥样硬化性心血管疾病患者肠道菌群的临床研究实验中同时发现,与健康人群相 比,厚壁菌门中的肠杆菌科和链球菌.SPP明显升高。因此,肠杆菌科和链球菌.SPP 可能参与疾病的发生发展。

2015年Jandhyala SM等人阿研究结果显示,健康人群的肠道菌群是以厚壁菌门 (Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)占主导,而本研究发现健康对照组肠道菌 群中的厚壁菌门和变形菌门是优势菌群,这一点与是与先前研究不相符。同时,为 了研究两组实验对象在肠道菌群的丰富度、多样性以及群落结构上有无显著差异, 我们对样本进行了两组间OTU差异、Alpha多样性和Beta多样性分析,结果显示两 组研究对象在肠道菌群丰富度、多样性及群落结构方面均没有显著差异。分析寻找 这种结果的原因考虑以下方面:第一,高通量测序平台差异,本次测序平台采用的 是深圳微生太科技有限公司提供的Illumina Miseq PE300平台进行测序,与之前的相 关性研究平台有所差异;第二,测序引物可变区定位不同,本研究针对16SDNAV3-V4 区进行高通量测序。第三,本实验样本量过少,增加样本量可能会对两组样本丰富 度、多样性以及结构的比较会有不同结果;第四,选取实验对象的纳入人群:受试 者环境的不同以及用药不同,这都有可能会造成肠道菌群组成的不同。

通过LEfSe分析提示,健康对照组丰度较高的菌群是气球菌科(Aerococcaceae)、 脱硫弧菌属(Desulfbvibrio)以及乳球菌属(lactococcus)。而2015年Yin J等人[旳 发现脑卒中和短暂性脑缺血发作患者人群肠道菌群中的机会性病原体较多,如肠杆 菌、巨噬菌、颤菌、脱硫弧菌等,而共生菌或有益菌属较少,如拟杆菌属、普氏杆 菌属和粪小杆菌属。因此,同种机会致病菌如脱硫弧菌对不同疾病的发生发展有着 不同的作用。

目前研究发现,药物、饮食、生活方式、Body Mass Index>粪便性状以及疾病 都可影响肠道微生物阿。同时研究发现日常生活中的许多食物,如枸杞、茶叶等具 有调节肠道菌群的作用。2019年国外Jayarathne等人阿也在枸杞中发现花青素有助 于调节肥胖相关的肠道菌群的作用。此外,我国赵立平团队a。]发现绿茶多酚(PPE) 和红茶多酚(PPE)对db/db小鼠(糖尿病和肥胖症模型小鼠)实验发现,PPE和PPE 有降低空腹血糖和肠系膜脂肪。2020年2月西班牙食品科学Carolina Cueva等人〔⑹] 在《Nutrients》上发表了,多酚及其代谢物可以抑制口腔致癌细菌F. nucleatum和P. gingivalis的生长和粘附,同时具有抗炎和调节免疫活性从而防止和预防结直肠癌的 发生。

本研究数据发现稳定型冠心病患者的肠道菌群特征与健康人群之间存在明显差 异,提示肠道菌群的改变可能参与稳定型冠心病的发生发展,为肠道菌群与稳定型 冠心病的研究进一步提供了理论依据。

结 论

  • 研究结论

稳定型冠心病患者存在肠道菌群失衡,通过调整肠道菌群失衡可能成为治疗稳 定型冠心病的新方法。

  • 不足与展望

本研究仅对陕西省人民医院心血管内一科的住院患者进行了研究,并且样本量 收集较少,所以对稳定型冠心病患者的肠道菌群特点研究存在一定的局限性,希望 将来可以对不同地区、更大样本、多阶段进行进一步研究,对患者进行长期随访以 及研究干预后措施的效果。

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附 录

  1. PCR产物纯化

PCR产物纯化使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit,具体流程如下:

(1) 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面液体 并切碎。计算凝胶重量,该重量作为一个凝胶体积(100 mg=100 ^iL体积);

(2) 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,混合后与75°C加热,间断混合,直至 凝胶完全融化;

(3) 力口 0.5个Buffer DE・B,混合均匀;

(4) 吸取步骤3中的混合液,转移到DNA制备管中,lOOOOrpm离心1 min, 弃滤液;

(5) 将制备管置回 2mL 离心管,力0 500 |1LBuffer W1, 12000 rpm 离心 30 sec, 弃滤液;

(6) 将制备管置回2mL离心管,加700 ^iL Buffer W2, 12000 rpm离心30 sec, 弃滤液,以同样的方法用700 ^iL Buffer W2洗涤一次,12000 rpm离心1 mim

(7) 将制备管置回2 mL离心管,12000 rpm离心1 min;

(8) 将制备管置于洁净的1.5 mL离心管,在制备膜中央加25-30此去离子水, 室温静置1 min, 12000 rpm离心1 min洗脱DNA。

  1. Miseq文库构建

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库,具体流程如下:

(1) 接头链接;

(2) 使用磁珠筛选去除接头自连片段;

(3) 利用PCR扩增进行文库模板的富集;

(4) 磁珠回收PCR产物得到最终的文库。

3.111u mina 测序

利用Illu mina公司的Miseq PE300平台进行测序,具体流程如下:

  • DNA片段的一端与引物碱基互补,固定在芯片上;
  • 另一端随机与附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成“桥(bridge)";
  • PCR扩增,产生DNA簇;
  • DNA扩增子线性化成为单链。
  • 加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP,每次循环只合成 一个碱基;
  • 用激光扫描反应板表面,读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核昔 酸种类;
  • 将“荧光基团”和“终止基团”化学切割,恢复引端粘性,继续聚合第二 个核昔酸;
  • 统计每轮收集到的荧光信号结果,获知模板DNA片段的序列。

致 谢

六月,总是阳光灿烂。六月,总要曲终人散。

花儿谢了芬芳,迎来硕果飘香。毕业带来别离,我们走向辉煌。在论文完稿之 际,给予我帮助的老师、同学、朋友以及亲爱的家人,表示深深的感谢!

首先要感谢我的导师姬新才教授在这三年对我的谆谆教导,在研究生生涯中对 我生活上的照顾及学业上的指导,细致严谨的工作作风将是我今后一直学习的榜样。

其次要感谢导师王军奎教授,在承担繁重的教学和工作任务的情况下,他主动 关心我的学习和科研倾注了老师大量的心血,无论是为人还是治学,他都是我学习 的榜样,值得信赖的良师益友。谨在此对您表示衷心的感谢。

还要感谢刘富强老师从论文定题到写作定稿,在论文的写作中给予了许多指导 与建议,使我顺利成文。

然后感谢轮转科室带教各位老师对我的尽心培养,特别是陕西省人民医院心内 一科的各位老师,你们为人师表的风范令我敬仰,严谨治学的态度令我敬佩。

同时感谢西安医学院的老师们、同门师哥师姐妹们、同窗好友在研究生生涯期 间给与我莫大的鼓励与帮助。

另外,要感谢我的父母、妹妹,是家人的鼓励和支持,使我能够全心投入学习 和工作之中,顺利完成学业。

最后衷心感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授!