负载双氢青蒿素纳米材料的构建及 其在增强肿瘤治疗效果中的应用论文

2020年10月16日11:22:44负载双氢青蒿素纳米材料的构建及 其在增强肿瘤治疗效果中的应用论文已关闭评论

负载双氢青蒿素纳米材料的构建及 其在增强肿瘤治疗效果中的应用论文
摘要
目前,癌症被认为是世界上最威胁人类生命健康的疾病之一。迄今为止,这种严重 疾病的治疗已经受到人们的高度重视。而在癌症治疗的多种方法中,化学疗法已被引入 临床六十余年,由于其高疗效性被人们认为是理想的抗癌治疗选择。作为青蒿素的半合 成衍生物和活性代谢物,双氢青蒿素(DHA)兼具抗疟活性及高代谢率的优点。近年来, 国内外的研究人员相继发现DHA可作为一种新兴的肿瘤治疗剂,可对55种癌细胞系有 明显的抑制作用。DHA分子内含有过氧桥结构,通过与过渡金属离子反应产生活性氧 自由基来杀死癌细胞。研究人员提岀了 DHA的不同抗癌机制,均表明DHA对肿瘤细 胞的杀伤作用来源于过渡金属离子介导活性氧(ROS)的产生,进而氧化脂质、破坏细 胞膜、蛋白质和DNA,最终诱导肿瘤细胞凋亡。为了提高药物的药理和治疗性能以及 给药效率,科研人员在过去几年中设计了基于纳米材料的药物给药系统(DDSs)。截止 目前,科学家已经成功合成了基于包括聚合物、介孔二氧化硅、碳纳米材料、有机物或 金属化合物在内的纳米载体,它们显示出优异的维度结构、可调谐的纳米尺寸以及基于 增强渗透和保留效应(EPR)的被动肿瘤靶向能力。大多数的研究结果表明复杂的合成 步骤同样限制了药物递送系统的应用。因此,设计合成简单而有效的纳米载体负载DHA 治疗癌症是必要的。在本论文中我们巧妙地设计合成了三种纳米材料作为药物递送媒介 负载DHA,实现对肿瘤化疗或协同治疗。首先,我们合成了基于纳米尺寸的金属有机 框架PCN-224配合Fe,进一步负载DHA形成DHA@PCN-224-Fe纳米复合材料,实现 对肿瘤细胞联合化疗及声动力治疗的双模式协同治疗;之后我们通过构建Fe配位的空 心聚多巴胺(HPDA)纳米球,将DHA负载在HPDA的空腔后,制备出生物相容性良 好的DHA@HPDA-Fe纳米复合物,实现肿瘤选择性化疗;最后我们通过改进,将DHA 负载在HPDA的空腔后,外层包裹MnCh纳米涂层,构建了具有肿瘤微环境响应性降解 与药物释放的DHA@PDA@MnO2纳米球,联合磁共振成像与化学治疗的诊疗一体化, 治疗效果进一步提高。本文具体主要包含了以下几部分的内容:
第一章绪论
本章我们对纳米材料的概念、特征、分类及其在生物医学领域的应用进行了简单的 介绍。接着,对现阶段基于纳米材料对肿瘤治疗的各种方式,特别是现阶段肿瘤化疗药 物的优缺点做较为详细的总结。最后对双氢青蒿素的结构特点及其作为潜在抗癌化疗药 物的原因进行综述。
第二章双氢青蒿素负载的金属有机框架纳米平台的构建用于化疗与声动力协同治疗
我们设计合成了负载DHA的金属有机框架(MOF )纳米复合材料 ——DHA@PCN-224-Fe纳米粒子。材料在肿瘤微环境下响应性释放Fe离子,协同化疗 (CT)与声动力治疗(SDT),从而实现被动但特异性的肿瘤靶向性治疗。材料除了具 有可以通过超声辐射MOF产生单线态氧(〔Ch)的强大能力外,从纳米粒子中还原的亚 铁离子还将通过与DHA反应产生活性氧自由基,并消耗肿瘤细胞中的谷胱甘肽(GSH) 以降低肿瘤细胞的抗氧化能力,从而增强化疗效果。并且材料中的Fe离子能够与H2O2 反应生成02,以缓解肿瘤的缺氧特征。我们认为,肿瘤微环境的低pH、高浓度GSH与 H2O2含量以及局部超声(US)辐射特性,可在很大程度上避免治疗所带来的副作用。
第三章具有可生物降解性能的铁配位中空聚多巴胺纳米球在增强肿瘤细胞杀伤效果中 的应用
纳米MOF的合成通常需要较高的温度和复杂的合成原料及步骤。为了改善这些弊 端,在此,我们通过简便而有效的方法制备了一种基于铁配位且负载DHA的中空聚多 巴胺纳米球(DHA@HPDA-Fe)材料。所制备的纳米试剂具有生物可降解性,在肿瘤微 环境中可控释放DHA和Fe离子,被肿瘤中还原性物质还原得到的亚铁离子通过与DHA 作用产生活性氧(ROS),从而有效地杀死肿瘤细胞。活体治疗实验表明,DHA@HPDA-Fe 的抗肿瘤疗效约为当量游离DHA的3.05倍,肿瘤抑制率为88.7%,且对小鼠产生副作 用小,证明该纳米载药体系具有良好的抗肿瘤应用前景。
第四章构建二氧化猛涂层包覆的空心聚多巴胺纳米球载药体系用于癌症有效诊疗
根据前人报道DHA与Mn2+反应可生成更多自由基,引起肿瘤细胞的生长抑制和增 强细胞凋亡。在此,我们合成了具有良好生物相容性且高效性的基于二氧化猛纳米涂层
包覆的中空聚多巴胺纳米球用于肿瘤治疗。DHA载入HPDA的空腔内,形成最终的纳 米药物DHA@HPDA@MnO2o作为一种独特的纳米平台,DHA@HPDA@MnO2在到达 肿瘤部位后显示出DHA和Mn2+的可生物降解和可控释放的性质。值得一提的是,被还 原的Mn2+进一步与DHA作用,产生具有细胞毒性的活性氧(ROS),有效地破坏细胞 内蛋白质和核酸,从而诱导肿瘤细胞死亡。更重要的是,从MnO2中还原出来的Mn2+ 具有肿瘤微环境响应而选择性进行体内磁共振成像的能力。体外和活体治疗实验表明, DHA@HPDA@MnO2的肿瘤抑制作用比游离DHA更有效,且副作用可忽略不计,这为 纳米药物平台在肿瘤化学疗法中的应用提供了一种方案。
关键词:纳米材料、双氢青蒿素、癌症、活性氧检测、化疗、声动力治疗
inSynthesis of Dihydroartemisinin-loaded Nanomaterials and Their
Application for Enhancing Tumor Therapeutic Effect
ABSTRACT
Cancer is currently considered to be one of the most dangerous diseases all over the world. So far, the treatment of this serious disease has received great attention. Among the various methods of cancer treatment, chemotherapy has been introduced into the clinic for more than sixty years, and is considered an ideal anti-cancer treatment option because of its high efficacy. As the semi-synthetic derivative and active metabolite of artemisinin, dihydroartemisinin (DHA) shows the advantages of both antimalarial activity and high metabolic rate. In recent years, domestic and foreign researchers have successively discovered that DHA can be used as an emerging tumor therapeutic agent, which can significantly inhibit about 55 kinds of cancer cell lines. DHA contains a peroxide bridge structure in its molecule, which reacts with transition metal ions to generate reactive oxygen radicals to kill cancer cells. Researchers have proposed different anti-cancer mechanisms of DHA, which show that the killing effect of DHA on tumor cells can be derived from the production of reactive metal oxygen (ROS) mediated by transition metal ions, which in turn oxidizes lipids, destroys cell membranes, proteins and DNA, and finally induces tumor cell apoptosis. In order to improve the pharmacological and therapeutic properties of drugs and the efficiency of drug delivery, researchers have designed nanomaterial-based drug delivery systems (DDSs) in the past few years. So far, scientists have successfully synthesized nanocarriers based on polymers, mesoporous silica, carbon nanomaterials, organics or metal compounds, which show excellent dimensional structure, tunable nanometer size, and enhanced penetration and retention effects (EPR) of passive tumor targeting capabilities. Most research results indicate that complex synthetic steps also limit the application of drug delivery systems. Therefore, it is necessary to design and synthesize simple but effective nanocarrier-loaded DHA to treat cancer. In this article, we have wisely designed and synthesized three kind of nanomaterials as drug delivery vehicles loaded with DHA to achieve chemotherapy and synergistic treatment of tumors. First,
we synthesized a nano-sized metal-organic framework coordinating with Fe, and further loaded DHA to form a DHA@PCN-224-Fe nanocomposite combined with chemotherapy and sonodynamic therapy to achieve dual-mode synergistic therapy of tumor cells; After that, by constructing Fe-coordinated hollow polydopamine (HPDA) nanospheres and loading DHA in the cavity of HPDA, we prepared a biocompatible DHA@HPDA-Fe nanocomposite to achieve tumor selective chemotherapy; At last, through improvement, after loading DHA in the cavity of HPDA, the outer layer was coated with M11O2 nano-coating, and DHA@PDA@MnO2 nanospheres with tumor microenvironment-responsive degradation and drug release were constructed, combined with magnetic resonance imaging and chemotherapy. Integration of diagnosis and treatment, the treatment effect is further improved. This article mainly includes the following parts,
Chapter 1・ Introduction
In this chapter, we briefly overview the concepts, characteristics and applications of nanomaterials in biomedical fields. Then, the advantages and disadvantages of various methods about tumor treatment based on nanomaterials are summarized in details, especially chemotherapeutic drugs. Finally, the structural characteristics of dihydroartemisinin and its potential reasons for anticancer chemotherapeutic drugs were reviewed.
Chapter 2・ Dihydroartemisinin encapsulated metal-organic framework nanoplatform for enhanced chemo and sonodynamic synergy therapy to tumor cells
We designed and synthesized DHA-loaded metal organic framework (MOF) nanocomposites一DHA@PCN-224-Fe nanoparticles. The nanoparticles release Fe ions in response to tumor microenvironment and permits synergistic chemotherapy (CT) and sonodynamic therapy (SDT) to achieve passive but specific tumor targeting. In addition to the powerful ability of the material to generate singlet oxygen CO2) presumably through ultrasound (US) irradiation of MOF, the reduced ferrous ions from the nanoparticles will also generate reactive oxygen free radicals by reacting with DHA and consume glutathione in tumor cells (GSH), reducing the antioxidant capacity of tumor cells and enhancing the effect of chemotherapy thereby. Moreover, the Fe ions from the nanoparticles can react with H2O2 to produce O2 to relieve the characteristics of tumor hypoxia. We believe that due to the low pH
of the tumor microenvironment, the high concentration of GSH and H2O2, and the local US radiation characteristics, side effects shall be largely avoided.
Chapter 3・ Biodegradable iron-coordinated hollow polydopamine nanospheres for dihydroartemisinin delivery and selectively enhanced therapy in tumor cells
The synthesis of nano-MOF usually requires higher temperature and complicated synthetic materials and steps. In order to avoid these disadvantages, herein, we develop a facile yet efficient strategy based on facile-prepared iron-coordinated hollow polydopamine (HPDA-Fe) to load DHA (DHA@HPDA-Fe). The as-prepared nanoagent shows biodegradable and controllable release of DHA and Fe ions in tumor microenvironments, resulting in ferrous ion-enhanced production of cytotoxic reactive oxygen species (ROS) by DHA and thus effectively killing the tumor cells. In vitro and in vivo therapy experiments indicated that the antitumor efficacy of DHA@HPDA-Fe was about 3.05 times greater than free DHA, and the tumor inhabitation ratio was 88.7% compared with the control group, accompanied with negligible side effects, conferring the proposed nanomedicine platform was promising for anti-tumor applications.
Chapter 4・ Glutathione-depleted prodrug platform of MnCh-coated hollow polydopamine nanospheres for effective cancer diagnosis and therapy
According to previous reports, DHA reacts with Mn2+ to generate more free radicals, causing tumor cell growth inhibition and enhancing apoptosis. Herein, a biocompatible and efficient nanoplatform for tumor treatment was fabricated based on manganese oxides coated hollow polydopamine (HPDA@MnO2). Dihydroartemisinin (DHA), a kind of derivative of Chinese traditional anti-malarial medicine artemisinin, was selected to be loaded into the cavity of HPDA@MnO2 to form the final nanodrug DHA@HPDA@MnO2. As a unique nanoplatform, DHA@HPDA@MnO2 showed biodegradable and controllable releasing of DHA and Mn ions upon reaching to the tumor sites. It was worth mentioning that the reduced Mn2+ would interact with DHA to generate cytotoxic reactive oxygen species (ROS) which effectively damaged proteins and nucleic acid, then induced the tumor cells death. More importantly, the Mn ion reducing from M11O2 shows capable of in vivo magnetic resonance imaging selectively in response to tumor microenvironment. In vitro and in vivo therapy experiments showed that the tumor inhibition of DHA@HPDA@MnO2 was more efficient than free DHA, accompanied by negligible side effects, which conferred the proposed nanomedicine platform promising for applications in tumor chemotherapy.
Keywords: Nanomaterials, Dihydroartemisinin (DHA), Cancer, Detection of Reactive oxygen species (ROS), Chemotherapy (CT), Sonodynamic therapy (SDT).
第一章绪论
1.1纳米材料的简介
1.1.1纳米材料的概念、制备方法及性质
纳米(nanometer, nm)是长度的公制单位。纳米材料可概括为结构特征介于原子、 分子和宏观物质之间,至少有一维介于1-100 nm的材料。由于纳米材料性质变化的连 续性,在特殊情况下,当材料尺寸大于100 nm而仍表现优良的纳米性质时,也将其称 为“纳米材料”⑴。
纳米粒子的合成可以分为“自上而下”及“自下而上”两种方法。在“自上而下” 法中,体材料的维度通过化学或物理的方法逐渐减小至纳米尺寸。“自下而上”法涉及 到经由组分当中原子和分子在适当的合成环境中制备出纳米尺寸的材料,通过物理或化 学的方法控制粒子生长,防止大尺寸粒子甚至体材料的生成。目前已有大量纳米粒子的 合成方法衍生出来,包含了如:热胶体化学法、微乳液化学法、共沉淀法、自组装法、 种子生长法、生物合成等⑵。
纳米材料具有独特的性质,包括:宏观量子隧道效应、表面效应和量子尺寸效应, 这些特性影响着材料的力学、电学、光学与磁学等物理性质,以及它们的化学活性"1。
微观粒子具有穿越势垒的能力称为隧道效应。宏观量子隧道效应在构建现代电子设 备方面有着重要的应用,如共振隧穿晶体管,它是未来微电子、光电子器件发展的基础。 表面效应是指随着纳米粒子直径的减小,表面原子数与总原子数之比以及比表面积急剧 增加的现象。例如,当Au纳米粒子粒径10 nm时,所含原子总数约为3X 104个,表面 原子所占比例约为20%;而当粒径减小至lmn时,所含原子总数约为30个,表面原子 所占比例高达99% o
量子尺寸效应是指纳米粒子尺寸下降到某一值时电子能级的变化大于热能、光能、 电磁能的变化程度时,材料的物理化学性质(如磁性、光吸收、导电性、溶点、催化活 性等)表现出与宏观物质显著不同的特性。如铁磁金属尺寸小于10 nm时表现为超顺磁 性;金纳米粒子相比于块状金,其熔点要低几百摄氏度。这为纳米材料的应用开拓了广 阔的新领域©I
1.1.2纳米材料的分类 纳米材料按维度可分为零维纳米材料(贵金属团簇、量子点、纳米粒子等),一维 纳米材料(纳米棒、纳米线、纳米管、纳米带等),二维纳米材料(多层膜,超薄膜等)。
按照纳米材料的组成成分,可以分为以下几类:
(1) 无机纳米粒子:无机纳米材料主要包括以下:a.半导体量子点;b.等离子体纳 米材料;c.磁性纳米粒子;d.硅基纳米材料;e.上转换纳米材料;f.金属氧族化合物纳米 材料等。
无机纳米粒子可以通过精细控制其晶型、尺寸、形状、组成及表面性质来调控其独 特的电子、光学及磁性质,使得它们具有多功能的应用。无机材料的优势是十分稳健, 即非常稳定且对酶降解具有抗性。然而,纳米毒性是构建含重金属无机纳米载体时需考 虑的重要方面,因此需要在其表面包覆生物可兼容性的保护层⑹。
(2) 碳基纳米粒子:碳纳米结构包含富勒烯、碳量子点(CDs)、碳纳米管(CNTs) 及石墨烯量子点(GDs)等。

东 DHA MB U Fe3+ • 02( Fe-PDAP
图1.新型基于铁掺杂聚二氨基毗喘梭形粒子多模式纳米诊疗药物〔VI。
Figure 1. A new multimodal theranostic nanoconstruct based on Fe-doped polydiaminopyridine nanofusiforms 口习.

(3)有机-无机杂化纳米粒子:通过金属离子或金属簇与有机分子配体通过配位键 合所构建的金属有机框架(Metal-organic血111申0趾,MOFs),是一种新兴的多孔杂化功 能材料,其具有可裁性和易功能化等特性。由于其丰富的空间拓扑结构、高比表面积、 独特的光电磁等性质,在气体储藏、生物成像及气态信号分子传输等方面具有重要的应 用前景。最近研究表明,纳米级MOFs (Nanoscale MOFs, nMOFs)材料展现出了许多 优异性能使其适合作为药物载体,如超高比表面积及合适的孔径使其适合吸附药物;金
属位点和有机配体不稳定结合使其具有固有的生物可降解性;开放的金属位点或配体上 路易斯酸或碱位点使其与药物分子间有更强的相互作用,并可对药物进行可控释放等 Win。除MOFs夕卜,也有少数通过金属与有机配体构成的聚合物纳米粒子(如图1)也 含有丰富的物理化学性质[12]。
(4)有机及高分子聚合物纳米粒子:高分子聚合物纳米材料在调控其化学成分、 尺寸、生物降解性、形貌及表面功能方面具有很大的灵活性,因此,可作为优异的药物 载体应用于传感、成像及治疗等方面〔⑶。药物释放模式可以通过控制聚合物的生物降解 或适当的刺激激活。刺激激活机制可以是被动的,如pH的改变导致其溶胀,也可以通 过外部刺激,如经由光照激发聚合物骨架中对光不稳定化学键的断裂[14'16]o并且,特别 指出的是,有几种亲水聚合物如聚乙烯醇(PEG)、壳聚糖及葡聚糖等已被广泛用作其 他粒子的涂层试剂,以此来提高粒子在水溶液中的分散性,维持生物活性及靶向效率Z
18]
图2.研究聚多巴胺的简要时间轴及2007-2013年发表相关文章的数量[⑼。
Figure 2. (A) A brief timeline for the development of polydopamine and the number of related articles
published in 2007-2013 [⑼.
近年来,基于聚多巴胺(Polydopamine, PDA)材料的制备和应用迅速广泛发展,从 2007年作为涂层材料问世以来的大量出版物就表明了这一点(图2)。聚多巴胺作为一 种新兴且生物相容性良好的软质聚合物材料在许多领域有着广泛的应用Ml,迄今为止, PDA基纳米复合材料已在能源、环境、生物医学传感、成像和工程等领域的工作进行了 较为全面的讨论和展望。PDA具有良好的生物相容性、生物降解性、粘合性、金属离子
螯合性和简单的合成工艺,因此被认为是理想的药物载体。
嵌段共聚物由至少一种亲水性嵌段及脂溶性嵌段组成,在运载方面也极具潜力。其 结构含有pH或热敏感基团的亲水性嵌段共聚物,使粒子具有水凝胶特性,在特定pH 及温度下能够发生溶胀使药物分子得到释放[20-2叭另一类嵌段共聚物,其结构中含有磷 脂作为亲脂单元,在药物运输中有多种应用,比如作为磷脂纳米胶束或其他纳米粒子的 涂层试剂爼25]。
树枝状聚合物具有由明确的超支化有机单元构成的超大分子结构,可用于传感及药 物运输。这种枝状聚合物能够通过将药物分子连接到其枝状终端而将其封装进它的结构 内核,控制连接数量来控制负载量。并且,若药物分子通过一个可生物降解的化学交联 剂连接则可实现药物分子的可控释放。而且,其枝状末端还可以进一步开发,比如连接 PEG或靶向基团师。
1.1.3纳米材料在生物医学领域的应用
纳米材料在诸多领域都有着广泛的应用,例如电子器件和设备、环境治理与保护、 工业生产、人民生活、机械制造等,特别是将纳米粒子应用于生物医学领域(即纳米生 物医学)旨在解决传统医学所面临的各种医学挑战和缺点,其中包括生物药效差,靶向 特异性受损,全身和器官毒性等0-29]。包括以下方面:
1、 纳米技术在生物医学基础研究中的应用。纳米尺度的一些高精度单分子观测操 纵技术,如单分子实时蛋白质和DNA相互作用纳米操纵仪器装置、纳米红外光谱成像 技术等在生物医学基础研究中意义重大。
2、 纳米生物传感器:纳米粒子的性质决定其可以用于生物体组织、细胞的功能化 成像,例如荧光成像、光热成像、光声成像、磁共振成像、计算机扫描断层成像等。目 前纳米生物传感器仍处于研究的初期,长远发展意义明显。另外,目前有关蛋白质检测 的方法仍有不足,如酶联免疫吸收实验,当探测到蛋白质浓度变化时,往往已经到了疾 病晚期。而纳米材料具有更加灵敏的核酸序列和蛋白质检测的能力,因此,基于纳米技 术的检测方法将革新许多疾病的物理治疗。
3、 纳米药物,包括纳米药物载体与给药系统、纳米药物粒子。早期纳米医学载体 的建立是从体内发现的各种“自然%内米颗粒寻找灵感,包括以各种纳米尺寸的囊泡、脂 质、蛋白质和一些调控人体功能的复杂的生物大分子作为生物活性分子的载体。将药物 包封于纳米粒子中,可以调节释药的速度,增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、 提高生物利用度等。表面功能化的纳米材料大大增强穿过细胞膜进入细胞的效率,根据 这一特性可以运载遗传物质进入活细胞里面,这一过程被叫做转染。例如,-NH2基团修 饰的介孔硅纳米球可以静电结合含聚阴离子DNA并将其成功运输到细胞里面a】。
另一种纳米药物粒子,可以利用和响应特性条件或物质,应用在肿瘤治疗上。例如 响应肿瘤微环境特性:如乏氧、弱酸性、过氧化氢与还原型谷胱甘肽含量高等特点来实 现选择性治疗的纳米药物,如Cu-TCPP纳米片卩1]、M02C衍生的含氧酸盐纳米簇卩2]等。
4、纳米生物医用材料:纳米纤维支架可以被用于细胞(如神经纤维细胞)以及其 他组织器官的再生。部分纳米粉末具有抗菌的性能,可有效破坏细菌(如大肠杆菌)的 细胞结构从而高效杀死细胞。例如:小于100 nm的Ag与TiCh纳米颗粒均具有良好的 抗菌效果,可以被用作外科手术口罩的涂料⑴】。其他一些具有催化、抗菌与消炎作用的 纳米酶也在生物医学领域日渐兴起。
1.2肿瘤治疗方式
肿瘤是由人体组织的不可控生长与迅速侵入机体所造成的,所谓恶性固体肿瘤就是 癌症。细胞凋亡抗性、逃避生长抑制因子、增殖信号、血管生成、侵袭转移以及永久性 的自我复制[珂等六种生物学特性被认为是癌症的标记。近半个世纪以来,癌症已经成为 一种常见病、多发病,严重威胁着人类健康。据《世界癌症报告》统计显示,2018年约 有近两千万新发癌症病例,并预测十七年后将递增至2400万人更亠]。因此,癌症的防 治与研究正成为全世界科学家日益关注的课题。对于癌症的各种治疗方式来说,大体可 以分为传统治疗和新型治疗方式,特别是基于纳米材料的新型治疗日新月异,下面介绍 以基于纳米材料的新型治疗为主。
1.2.1传统治疗手段
恶性肿瘤的传统治疗方式有:手术、放射、化学药物等治疗模式。
外科手术治疗需要将肿瘤组织整块切除,治疗范围比较广泛。缺点是术后易复发、 某些全身性恶性肿瘤无法实现手术治疗、切除浸润性肿瘤可能危及生命、发生转移扩散 的晚期肿瘤,手术治疗同样失去了意义。
放射线杀死肿瘤细胞主要是破坏其细胞核内的DNA。但是,辐射可能对线粒体DNA 和其他细胞会造成一些损害,以及通过产生ROS对细胞产生间接损害與]。目前放射治 疗主要分为以下四类:(1)伽马(Y)射线治疗;(2) X射线治疗;(3)医用直线加速 器所产生的高能X线及电子线;(4)组织间及腔内放疗,放疗源主要是1.192所产生的 Y射线,或1-125产生的丫射线;(5)质子治疗,采用带有正电荷的高能粒子射线。随 着目前放疗仪器设备的更新换代与经验的积累,逐渐发展了如:Y刀(Co-60)、X线刀、 三维适形放射治疗、强调适形放射治疗等,放疗的疗效逐渐提高。有数据显示,约有 65%-75%的术前、术中和术后治疗的过程中,均需要协同放射治疗。但研究和临床实验 表明,并非所有肿瘤细胞都能被放射线所消灭,并且不同类型的肿瘤细胞对射线的敏感 性也不同。
肿瘤化疗具体的过程是比较复杂的,但其作为肿瘤治疗不可缺少的一环,不仅仅可 以为手术做好准备,还可以减少术后肿瘤复发的几率。甚至有些癌症治疗不需要手术, 只需要化疗就可以达到治愈的效果。化疗可以分为以下四类:(1)根治性化疗;(2)提 高生存率的化疗;(3)术前化疗;(4)术后辅助性化疗;(5)局部化疗——腔内化疗。
化疗药物通过作用在肿瘤细胞生长过程的不同周期,抑制细胞分裂或直接杀死细胞。 化疗药物种类繁多,例如抗生素、免疫制剂等。目前化疗药物大多以化学合成药物和植 物提取物为主,例如顺氯胺钳(DDP)㈤]、多西他赛(DTXL) Ho】、阿霉素(DOX) [41\ 紫杉醇(PTX)阳、喜树碱(CPT)妙等传统药物以其独特的抗癌机制在化疗中发挥着 重要作用。然而传统药物也存在许多缺点,例如较为明显的毒副作用:脱发、局部反应、 胃肠毒性、肾毒性、肝脏毒性、神经毒性等损伤,长期治疗过程中出现耐药性或过高的 药物价格等因素,从而阻碍其在临床上普遍有效应用屮】。
1.2.2基于纳米材料的新型治疗手段
如前所述,许多粒子在纳米尺度表现出很多独特的性质,这促进了其在癌症治疗中 的应用。纳米材料用于癌症治疗主要具有以下的优点:
首先,纳米材料能够通过EPR效应被动地积聚在肿瘤部位。其次,由于纳米材料 的表面可能存在多种官能团,可以很容易地用蛋白质、肽和有机生物分子等进行修饰和 改造,从而减少网状内皮系统(RES)的非特异性摄取,并进一步特异性结合过度表达 的肿瘤细胞受体增加聚集,如纳米粒子对脑恶性胶质瘤细胞的靶向治疗。第三,纳米材 料的大比表面积可以有效地负载药物、基因和其他治疗分子,不仅解决传统药物水溶性 差、靶向性缺失、快速失活以及药代动力学弱等缺点,并且可以对这些分子起到保护作 用,使它们免受复杂生理微环境中的酶促反应的降解。第四,功能化的纳米材料能够通 过不同的刺激因素(例如,pH、GSH、光辐射等)控制负载药物分子的释放,防止药物 在正常组织中过早泄漏并降低其潜在的副作用。第五,除了负载药物,目前已报道了的 多种纳米材料,由于其自身特殊的性能:如光热、光动力、声动力性质以及在肿瘤微环 境条件下响应性的催化反应等,可直接作为治疗试剂对肿瘤进行光热治疗、光动力治疗、 免疫治疗、饥饿治疗、声动力治疗、化学动力学治疗、多模式协同治疗等新型治疗。⑷-50] 因此对纳米材料在肿瘤治疗的应用分述如下。
(一)基于纳米材料的化疗与化学动力学治疗
一方面,由于肿瘤组织脉管系统泄漏造成纳米材料容易在此聚集的过程称为EPR 效应。另一方面,通过在纳米材料上进行特异性靶向修饰,如抗体、多肽等等靶向分子, 从而大大增强与肿瘤细胞作用的效率,实现纳米颗粒细胞内吞并在胞内释放药物。纳米 药物递送系统(nano-drug delivery system, DDS)在过去的二十多年间已经得到飞速发展, 其具有打破生理屏障、提高靶向能力以及增强对肿瘤组织的渗透能力等优势。许多纳米 生物材料如无机纳米粒子、金属-有机聚合物、高分子聚合物等等通过物理或化学手段 修饰,满足了药物运输的各种需求。
在癌症治疗中应用纳米技术,使用设计的纳米载体输送疏水性药物,改变药物在体 内的分布,并将药物输送到靶向器官,具有克服传统化疗方法缺陷的潜力。纳米载体包 括:金属纳米粒子[刃、碳纳米管(CNTs)卩2]、介孔二氧化硅[53]、石墨烯氧化物(GO) 【54]和脂质体[55]等常被用来包埋和负载疏水性抗癌药物。例如:如图3制备了具有空心结 构且用聚乙二醇(PEG)修饰的H-MnO2纳米壳,其可以共同装载光动力剂——二氢吓 酚e6 (Ce6)和化疗药物阿霉素(DOX)叫

图3,aH-MnO2-PEG的合成与表征步骤,指示了 H-MnO2-PEG纳米颗粒的逐步合成以及随后的双重 药物负载流程。b, c H-MnO2-PEG的TEM图像(b)和高分辨的TEM图像(c)。d H-MnO2-PEG的 HAADF-STEM图像和元素映射。e用于大规模制备H-MnCh的500 mL反应容器的照片。f数字图 片显示了在一个反应中H-MnCh纳米壳的克级生产量。g以克为单位制备的H-MnCh纳米壳的代表 性TEM图像卩1]。
Figure 3. Synthesis and characterization of H-M11O2-PEG. aA scheme indicating the step-by-step synthesis
of H-M11O2-PEG nanoparticles and the subsequent dual-drug loading, b, c ATEM image (b) and a
magnified TEM image (c) of H-MnCh-PEG. d HAADF-STEM image and elemental mapping for
H-M11O2-PEG. e A photo of the 500 mL reaction vessel for preparation of H-M11O2 in a large scale, f
Digital picture showing the gram-scale production of H-M11O2 nanoshells in one reaction, g A
representative TEM image of H-M11O2 nanoshells prepared in the gram-scale ^51^.
化学动力疗法(Chemodynamic therapy, CDT)是一种新兴的抗癌策略,它通过类过 氧化物酶催化、金属催化或基于过渡金属的芬顿(Fenton)反应来大大提高肿瘤细胞内 活性氧(ROS)的水平实现肿瘤治疗的方法师57]。过渡金属(Fe, Cu和Mn)衍生的纳 米材料[58-60]在通过Fenton反应与肿瘤细胞内H2O2作用产生有害的羟基自由基(-OH) 方面具有出色的功效。相较于依赖激光连续照射下产生ROS的光动力疗法(PDT), CDT 作为持久的化学过程不需要外界光照和氧气参与反应,因此有利于低氧肿瘤的深层组织 治疗⑹⑥]。然而,治疗过程在引起显著的氧化损伤之前,可以通过随后在肿瘤微环境中 的还原性物质如谷胱甘肽(GSH)的上调来中和产生的ROSo [61]由此,CDT的治疗功 效也严重受损。考虑到高氧化价态的过渡金属离子(例如Mf+或CU2+) WO, 63]由于可逆
氧化还原特性已用于清除还原性GSH,随后被还原的离子可用作类Fenton试齐叽例如: 考虑到石帝化合物的毒性要比单质高得多(例如,石帝酸的毒性比Te的毒性高10倍),因 此,研究者开发了一种新型的Te纳米线(TeNW)可以由H2O2触发产生ROS,并且消
耗肿瘤细胞内高浓度的GSH,在癌症治疗中显示出优异的疗效(图4)㈣。

Figure 4. Schematic illustration of the step-by-step H2O2/GSH-activatable inorganic nano-prodrug TeNWs
for highly selective cancer therapy〔&勺.
(二)基于纳米材料的光动力治疗与光热治疗
除了上述化学疗法和化学动力学疗法,研究人员还致力于研究基于纳米医学的其他 疗法。例如,光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT),它利用光激活外源性光敏剂(PSs) 产生的ROS造成核内DNA的受损进而诱导癌细胞死亡仗‘ 66]。PDT通常涉及三个主要 组成部分:特定光源为光动力反应提供动力;PS可以收集这种光并进行光动力反应; 以及含氧分子(例如分子氧、水)作为底物。这种疗法实现了非侵入性及选择性的疗效 图5.光动力治疗机制。依据分子能级图展开描述:PS是光敏剂,ISC是系间窜越,So是光敏剂的 基态,Si是光敏剂的激发单线态,Ti是光敏剂的激发三线态[67】。

Figure 5. PDT mechanism. PDT mechanism described based on the molecular energy level diagram. PS, photosensitizers; ISC, intersystem crossing; So , ground state of PS; Si, excited singlet state of PS; Ti, excited triplet state of PS
包括二氢吓酚e6 (Ce6)、亚甲基蓝(MB)和口引嗥菁绿(ICG)在内的许多有机PS 主要通过依赖氧气的II型PDT (能量转移)过程产生单重态氧「Ch)。阴特定PS也可 以通过I型PDT (电子转移)过程生成超氧阴离子(-Of)和羟基自由基(-OH) a/]。 III型PDT是指激发态的光敏剂直接将电子转移给生物分子如DNA并诱导细胞死亡, 这一过程并不需要氧气。然而,传统的PDT面临若干挑战,包括光依赖性活化、光穿 透深度、PS和Ch依赖性、PS的富集以及肿瘤细胞内过表达的GSH〔7i]。纳米技术的最 新进展为PDT的发展提供了一个通用平台,经过精巧地优化后,已经制备了许多可以 增加肿瘤微环境中氧含量或降低GSH含量的纳米材料SI。例如图6所示:在这项研究 中,作者首次合成了铜-胰蛋白月东纳米粒子(Cu-TryNPs),并证明了它们可以通过消耗 GSH增加光动力治疗过程中ROS的能力。将光敏剂MB加载到Cu-Try NPs上形成 Cu-Try/MB NPs用于增强的光动力治疗⑺】。

图6.构建了一种基于载有亚甲基蓝的铜-胰蛋白豚新型纳米平台,实现可消耗还原型谷胱甘肽以增
强光动力疗法⑺]。
Figure 6. A new glutathione-consumption nanoplatform was constructed based on methylene blue loaded
Cu-tryptone complex nanoparticles for enhancing photodynamic therapy "习.
采用产热杀死癌细胞的热疗可以通过磁场、微波或光照射来触发。其中,光热治疗 (photothermal therapy, PTT)因其卓越的治疗癌症能力而受到广泛研究,对周围健康组 织的损害最小。PTT依靠光热剂在近红外(NIR)激光照射下产生高热,是消融肿瘤组 织的有效手段。理想的PTT试剂应该在NIR区域表现出强吸收,同时荧光量子产率低, 因此吸收的光能可以通过非辐射跃迁有效地转化为热量而不是荧光发射。光热治疗可以有效消除原发肿瘤以及转移性肿瘤。然而,细胞的热休克蛋白会在治 疗过程中一定程度地上调,导致细胞的耐热性提高,使治疗的热效应降低。因此PTT 的疗效很大程度上取决于光热材料的光热转换率。目前为止,多种光热试剂如贵金属纳 米材料(Au、Ag> Pt、Pd)、过渡金属(半导体量子点、金属氧化物、金属硫化物)纳 米材料、碳纳米材料(碳纳米管、石墨烯、碳量子点)、有机纳米材料等都得到广泛研 究。
(三)基于纳米材料的声动力治疗
近年来,由于PDT中受到使用光源的穿透限制El,因此超声(US)辐射触发的声 动力学疗法(sonodynamic therapy SDT)迅速发展⑺戶]。然而,尽管SDT可以产生ROS 并进一步实现抗肿瘤作用已被广泛证明,其确切的治疗机制仍不清楚。目前被广泛认可 的解释是超声的空化会导致声致发光或热解,这可能有助于声敏剂产生ROS。所谓的空 化现象是指超声波照射后产生的气泡,气泡的快速生长和破裂。更为有趣的是,超声波 还可以激活传统的声敏剂分子(如血口卜卩林),通过穿孔、声化学和声致发光产生ROS, 然后杀死癌细胞BE]。然而,传统的有机声敏剂的生物利用度和稳定性低"I"],肿瘤缺 氧极大地限制了 SDT的效率和预期的临床应用[阿。
为了解决上述问题,已经基于二氧化钛,一些金属有机骨架(MOF)和负载有机 PS分子的纳米材料构建了不同的产氧纳米药物。如图7所示,Shi等人通过将MnOx与 中空介孔有机硅NPs结合,然后与原吓卩林(声敏剂)和环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五 肽(靶向肽)结合,成功开发了多功能PMR纳米超声敏化剂。MnOx可以充当无机过 氧化氢酶样纳米酶,用于消耗TME中过表达的H2O2产生氧气,这有助于降低HIF-la 的表达水平。丰富产生的氧气可以促进由SDT诱导的O的产生㈣。

(四)基于纳米材料的其他治疗方式
此外,研究人员开发了基于纳米材料的其他治疗方式,女口:免疫治疗、饥饿治疗以 及协同治疗等。
免疫治疗就是通过活化机体的免疫系统对肿瘤进行治疗。它可以通过以下三种方式 实现:一是设计单克隆抗体来促进免疫应答以破坏癌细胞,二是使用免疫检查点抑制剂 来帮助免疫系统识别并攻击肿瘤细胞,三是合成癌症疫苗以激活免疫应答来预防与治疗 肿瘤。最近,包括癌症疫苗和免疫检查点封锁(ICB)疗法在内的癌症免疫疗法已成为 治疗各种恶性肿瘤的有效临床方法血]。免疫疗法己经成为晚期癌症的有希望的治疗方法, 因为它作用于免疫系统,而不是肿瘤本身。到目前为止,相关研究已逐渐从实验室研究 转向临床实践。此外,一些免疫治疗药物,如抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、 程序性死亡受体1 (PD-1)及其配体PD-L1的单克隆抗体,对临床治疗有很大希望,并 已获得FDA批准[冏。免疫疗法被认为是一种独特而有前景的癌症治疗策略,迄今为止, 已设计出许多刺激性响应的纳米级药物递送系统用于免疫治疗叫旳。
饥饿治疗是基于葡萄糖氧化酶(GOx)催化反应设计的一种治疗方式。GOx是一种
内源性氧化还原酶,广泛分布于生物体内。可从一系列不同的真菌来源中纯化,例如,
黑曲霉和青霉菌⑻]。GOx催化葡萄糖分解的反应可以用下列方程式来表示:
图& GOx催化葡萄糖反应的化学方程式。

Figure 8. Chemical equation of GOx catalyzed glucose reaction.
对于该氧化还原反应的两个半反应来说,在还原半反应中,GOx催化葡萄糖氧化成 D-葡糖酸-d-内酯,然后将该产物水解成葡糖酸,而GOx-FAD(FAD:辅酶)还原成H2FADO 在氧化半反应中,H2FAD被氧气再氧化,得到FAD和H2O2o通过GOx催化肿瘤内氧 气和葡萄糖消耗,阻断肿瘤营养供应,为癌症饥饿治疗提供了一种非侵入性策略[陶;在 肿瘤组织中快速生长和扭曲的血管导致肿瘤微环境缺氧的特征。而GOx介导的氧消耗 进一步增加了缺氧程度,因此可以通过激活缺氧前药例如二恶烷酮二盐酸盐(AQ4N), 可以在低氧条件下选择性地还原成所需的细胞毒性物质用于癌症化疗,同时在正常组织 中保持无毒无活性的状态留】;葡萄糖酸的产生还增强了肿瘤微环境(TME)的酸性可引 发pH响应性药物释放,可用于构建pH敏感和葡萄糖敏感的药物递送系统[90】; H2O2的 产生不仅显著增加肿瘤氧化应激,而且还可以在光照或通过芬顿反应转化为羟基自由基 杀死癌细胞,实现肿瘤氧化治疗的策略Hl。

图9.纳米技术用于癌症多模式协同治疗[9习。
Figure 9. Nanotechnology for multimodal synergistic cancer therapy 凹习.
而随着研究的发展,使用单一治疗方法受到肿瘤复杂性、多样性和异质性的阻碍。 因此,多模式协同治疗的发展已成为重要的研究焦点。目前已经开发了多种多模式协同 癌症治疗策略,通过将酶、前药、热敏剂、光敏剂或芬顿试剂整合到单个纳米平台中用 于肿瘤多模式协同治疗。更重要的是,几种类型的单一疗法之间的协同增强相互作用促 成了多重协同疗法的兴起,具有显著的超加性效应(即“1+1>2”),即比任何单一疗法
或它们的理论组合都强,具有更明显的治疗效果[9244]。
1.3双氢青蒿素的介绍
近年来从天然植物提取和筛选出来的药物凭借其独特的生理活性、高效以及毒性低
的显著优势,受到人们的广泛关注a】。
1.3.1双氢青蒿素的来源
黄花蒿为菊科植物的地上干燥部分,如图10所示为黄花蒿的形貌邸]。我国科学家 屠呦呦教授团队在20世纪70年代首次采用乙醸作溶剂从黄花蒿中萃取分离出的一种化 合物,将其命名为青蒿素(Artemisinin, ART)。屠教授凭借对青蒿素类药物的研究获得 2015年诺贝尔生理学或医学奖,青蒿素类药物再度成为举世瞩目的明星分子[97】。双氢 青蒿素是青蒿素的衍生物,经硼氢化钠(NaBHj的还原作用即可制得坐]。

图10.黄花蒿(Artemisia arnrna)于8月初在华盛顿特区生长(左),并于9月中旬开花(右)。花小
(直径1至2毫米),呈浅黄色。叶子和花朵具有令人愉悦的芳香气味[96】。
Figure 10. Artemisia annua growing in the Washington, D.C., area in early August (left) and flowering in
mid-September (right). Flowers are small (1 to 2 mm in diameter) and pale yellow in color. Leaves and
flowers have a pleasant aromatic odor ^96\
1.3.2双氢青蒿素结构与性质
图11.青蒿素(左)与双氢青蒿素(右)的分子结构简式。

Figure 11. Molecular structure of artemisinin (left) and dihydroartemisinin (right).
如图11所示,图左为青蒿素的分子结构简式,其分子式为C15H22O5,青蒿素经NaBH4 的还原,可将环端酮基获得两个质子,即官能团转化为羟基的双氢青蒿素 (Dihydroartemisinin, DHA),其分子结构简式如右图所示,属含过氧桥键基团的倍半菇 内酯类化合物。纯净DHA具有白色针状结晶形貌,无臭味苦。DHA在CHCls中易溶, 可溶解在丙酮中,在甲醇或乙醇中溶解度较小。熔点145〜150°C。研究发现,相比ART, DHA在水溶性上有些许提高,但水溶性仍比较差。并且人体对DHA的吸收能力较为明 显。此外,其本身毒性较低,因此用于临床上显示出更明显的药效。青蒿素类药物分子 含有内过氧桥基团(Endoperoxide bridge group)结构,可在具有类Fenton反应的离子(例 如斤2+、Mn2+和Ni2+)介导下发生断裂,生成游离态自由基〔99]。从而将DHA用于生物 医学应用。
1.3.3双氢青蒿素的在生物医学上的应用
来源于草本植物的DHA在治疗疟疾、消炎、肿瘤等生物医学上面的应用效果有一 定明显的疗效,是近年来具有良好的开发前景的药物之一a。】。
1、 抗疟治疗
尽管疟疾自古以来就以各种形式为人类所知,但它仍然是包括美国在内的100多个 国家认为的最危险的寄生虫病之一UM。与ART作用机理相同,DHA对疟疾有极好的 治疗效果。它通过DHA分子结构中的内过氧桥基团氧化产生活性氧自由基,其可以与 疟原虫膜蛋白结合,影响虫体表膜、线粒体功能,破坏泡膜、核膜、质膜三种膜结构, 线粒体肿胀且内、外膜脱落,最终虫体结构瓦解。DHA还会使疟原虫吸收异亮氨酸的 能力减少,抑制虫体体内蛋白质的合成。因此可以说,DHA的抗疟机理与过氧基的分 解反应密切相关。除消灭疟原虫外,DHA对其它寄生虫也有一定的抑制效果。
2、 消炎作用
炎症反应是临床常见一种复杂的生物病理反应过程,存在于机体各部位的组织和器 官,例如扁桃体、毛囊、肺、肾、肝等。近年来研究发现,DHA有效抑制多种促炎细 胞因子的释放并介导人体的免疫调节a?]。
3、抗肿瘤治疗
DHA产生的自由基可有效杀死疟原虫。通过相似的机理,研究人员在上世纪末首 次发现ART对乳腺癌等肿瘤细胞具有很强的杀伤作用,而低剂量下对正常组织没有明 显毒性作用[1°习。随后国内外的研究人员相继发现,青蒿素及其衍生物分子对55种癌细 胞系有明显的抑制作用图12.青蒿素作用机制的假设a。】。
Figure 12. Proposed mechanism of action of artemisinins 口切.
目前ART/DHA抗肿瘤作用具体机制尚不完全清楚,主要观点认为该类药物的抗肿 瘤作用可能与细胞内的铁离子有关如图12所示,即该类药物可以与亚铁离子反 应产生大量的自由基(ROS)从而进一步破坏肿瘤细胞的细胞结构,胞内物质大量外漏, 从而杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞表面转铁蛋白受体水平明显高于正常细胞,因此相对正常 细胞对铁摄取能力较高,且肿瘤细胞内还原型谷胱甘肽的含量更高,可将三价铁离子转 化为二价铁离子,由此产生特异性。
4、其他作用
此外,DHA还可以用来治疗病死率较高的肺纤维化疾病。国内外研究学者通过大 量实验还发现,DHA对血吸虫、蓝氏贾第鞭毛虫、阴道毛滴虫等寄生虫有一定的杀伤 效果,且致死率与DHA的浓度具有相关性。DHA除上述药理作用外,还具有免疫调节 等作用[106〕。
1.4本论文的选题目的及研究意义
癌症的防治与研究正成为全世界科学家日益关注的课题。对于癌症的各种治疗方式 来说,化疗以其高效性引入临床已有60多年的历史,因而被人们视为一种理想的选择。 目前化疗药物大多以化学合成药物为主,例如顺氯胺钳(DDP)、阿霉素(DOX)和紫 杉醇(PTX)等传统药物以其独特的抗癌机制在化疗中发挥着重要作用。然而传统药物 也存在许多缺点,例如较为明显的毒副作用、长期治疗过程中耐药性的出现或药物价格 过高等等,从而阻碍其在临床上普遍有效应用。因此,我们希望开发一种疗效好、选择 性高的化疗策略来克服这些缺陷。
近年来从天然植物提取和筛选出来的药物凭借其独特的生理活性、高效以及毒性低 的显著优势,受到人们的广泛关注。青蒿素(Artemisinin,ART)作为一种有效的抗疟药 物,自1972年被屠呦呦教授等人从天然菊科植物——黄花蒿中分离出来后得以广泛应 用,其主要成分为一种具有过氧桥的倍半菇内酯类化合物。作为ART的半合成衍生物 和活性代谢物,双氢青蒿素(DHA)兼具抗疟活性及代谢率高的优点。近年来,研究发 现DHA可作为一种新兴的肿瘤治疗剂,其分子内含有内过氧桥结构,能够在具有类 Fenton反应的离子(例如F^、Mn2+^ Ni2+)介导下发生断裂,生成游离自由基而具有 抗癌活性。研究人员提出了 DHA的不同抗癌机制,均表明DHA对肿瘤细胞的杀伤作 用可来源于亚铁离子介导的活性氧(ROS)产生,进而氧化脂质、破坏细胞膜、蛋白质 和DNA,最终诱导肿瘤细胞凋亡。迄今为止青蒿素类药物还没有实现临床应用,主要 受以下几个方面的限制:(1)由于DHA的水溶性差,限制了其尾静脉注射使用;(2) DHA的毒性一定程度上依赖过渡金属离子催化产生ROS,而细胞内金属离子的含量处 于一个极低的水平,这限制了 ROS的产量;(3) DHA分子在体内可以通过自由扩散的 方式进入到肿瘤细胞和正常细胞,导致了对正常组织潜在的毒性,降低了对肿瘤细胞的 治疗效率。因此,研究一种提高肿瘤细胞铁浓度和DHA摄取的可行方法是目前研究的 热点与难点。
为了提高药物的药理和治疗性能以及给药效率,在过去几年中人们成功地设计了基 于纳米材料的药物给药系统(DDSs),它们显示出优异的维度结构、可调谐的纳米尺寸 以及基于增强渗透和保留效应(EPR)的被动肿瘤靶向能力。然而,材料有限的药物负 载率或对复杂的生物系统细胞毒性的不确定性限制了进一步发展,且大多数的研究结果 表明复杂的合成步骤同样限制了药物递送系统的应用。因此,设计合成简单而有效的含 过渡金属离子基纳米载体负载DHA治疗癌症是必要的。
本论文涉及合成三种纳米药物载体负载并递送天然药物衍生物DHA,解决了金属 离子和DHA不易共同递送至肿瘤细胞并响应性释放的关键性问题,增强了化疗效果。 因此本论文将解决以下两个关键科学性问题:(1)提高肿瘤细胞内过渡金属离子的含量,
进而与DHA作用增强抗癌效率;(2)实现材料在肿瘤细胞的选择性释放,诱导产生ROS。
论文研究的意义在于针对细胞内过渡金属离子浓度低导致DHA抗肿瘤效果差、其 本身水溶性不佳且在肿瘤区域积累量少的缺点,拟利用含过渡金属离子的纳米载体负载 DHAo这种含过渡金属离子的纳米材料响应肿瘤微环境,可生物降解并释放金属离子。 设计合成的纳米粒子既充当了药物载体,同时也提供了金属离子,金属离子与DHA反 应产生大量自由基,起到很好的化疗作用。其次,我们设计的材料原料丰富、制备过程 易操作且治疗效果明显,即充分利用纳米尺寸MOF、中空聚多巴胺纳米球等材料的高 负载能力、生物相容性好及可降解性来负载DHA,通过材料设计可同时实现DHA与过 渡金属离子的体内输送,增强DHA药物的药效并降低对机体的毒副作用。
IwllW離多
Ew・ G・ Kreyling" M・ Semmler-Behnke and Q・ Chaudhry〉Nano Today「JL 2010" 5" 165—168, 「2」A・ s・ Arie* p. BrucpB scrosaF J・ M・ Tarascon and w・ van schalkwijrNai. 「JL 2005〉4"
366—37S
sE・ Roduner〉chem. soc・ Rev「JL 2006〉35" 583—59Z E0- Tap x・ capx・ J・ WF Q・ HPL Yang〉x・ Zhang J chep w・ zhaps・ Hap G Nam" M・ Sindoro and H・ zhang〉chem. Rev「JL 2017" 117" 6225—633L
3 >• Albanespp・ s・ Tang and w・ c・ w・ chap Armu. Rev Biomed. Eng.39 2012" 14〉一—16・ sw・工 LL 0- Yang, F. Tsao and K・ LepPhys. Rev B 3. 200H 60 18450S 3 Y VolokifinJ Sinzig〉L J・ de Jongh〉G・ Schmid" M・ N・ Vargaftik and L L Moiseevi" Natuve「JL 1996"
384〉621—623 •
sL. YpK.HYong" L. Lip I. Roy" R Hu J Zhu" H. c# w. c. LawJ LiF K. Wang J LiF Y LiF Y HF x・ zhang〉M・HSwiharf and p. N・ Prasad" Nai. NcmoiechnoL 2012〉7〉453—45?°

「9」NYip Y L Zhou〉M・ Zeng and M・ KurmopDcdion Paws「JL 2015〉44〉5258—5275,
「10」Y B zhang〉H・ Furukawp N・ Kpw・ NipH・ J・ park" s・ okajimp K・ E cordovp H・ DengvL Kim and o- M・ Yaghi〉J. Am. chem. soc.「JL 2015" 137" 2641—2650.
「11」p・ HorcajadpHCh 巴 aF-c. Sen-9 B GiloL c. sebripHBaa尸 J・ F. Eubank" D" Heultaux" p. clayefpc・ Kreuz J s・ Chang〉Y K・ Hwang" V Marsaud" R N・ Bories" L cynober" s・ GFG・ Ferey" p・ Couvreur and R Gref Nai.管金k「JL 2010〉9〉172—17?°
=2」J. B 巴"X. Jip w・ zhep w. Cheng and X. Jiang" J. Am. chem. soc.s201 产 14®106—109.
「13」K・ E・ uhrich〉s・ M・ Cannizzaro〉R・ s・ Langer and K・ M・ shakeshencrM Rev「JL 1999〉99〉 31OO1—319OO.
「14」Y BapN・ Nishiyama and K・ Kaiaokp wocowfgafe chem.「JL 2007" 10 1131 — 1139,
=5」H・ weihup s・ X Cheng and R x・ zhupprog. powm. sci.」JL 2009, 34, 893—919
=6」s・ Yang" N・ F u- chep X. QL Y XF Y XF Q XF Li and J・ LF J. Maier, chem. B」JL 2013〉厂 4628—4636.
〔17」c. Tassp s. Y. Shaw and R. weisslederkcc. chem. Res.「JL 2011" 44" 842—852.
=8」w・ s・ chpM・ chpL Jeong, M・ ch2.H1Y chpB Hap s・ Kim〉H・ Kim, Y Lim, B Chung and J・ Jeong〉ToxicoL AppL pharm.sv 2009〉236〉16—24・
19IwllW離多
=9」Y. Lip K・ Ai andL LF chem. Rev」JL 2014. IIP 5057—5115.
「20」M・ Shi J Lu and M・ shoichaJ Matep. 」JL 2009" 19, 5485—549产
「21」M・ Hamidi" >• Azadi and p. Raflei" Adv Dmg DeHvei: Rev39 200产 6®1638—1649,
「22」M・ HamidL p・ RafleL >• Azadi and s・ Mohammadi Sama5-J pharm. sci.「JL 2011〉1 1702—171L
「23」L XingyL X Zheng, X. W2.G. GupM. GOF 0- Gong, X. Wang, M・ D# L. chep Y Wei and Qiap J. Ncmosci. Nanoiechno, £ 2009〉9〉4586—459Z
「24」R Sawam and V Torch三p MoL Membp. BoiL」JL 201P2N 232—246,
「25」>• Lukyanov and V Torchilip Adv Drug De=v Rev「JL 2004〉56〉1273—1289, 「26」s・ Grayson and J・ Frechachem.>Qev「JL 2002" lol" 3819—386?°
「27」K・ Riehemanp s・ Schneider"HLuger" w- Godip M・ Ferrari and F Harald〉Nsgew chem. Ini. Ed. 2009, 48, 872—897.
「28」T. M. A=en and p. R. Cu 三 0 Science39 2004, 309 1818—1822.
「29」E・ Boisselier and u- Asfrupchem. soc. Rev39 2009" 30 1759—178Z

「30」Y Wang, X DF N- LiF s・ Shi and Lv・ J. Mater. Chem A」JL 2019" N 5111—515Z
「31」0- Wang" F capY Ruap x・ Jip w・ Zhen and X Jiang" Awgew chem. Im. Ed.「JL 2019〉5®° 9846—9850.
「32」G. Liu〉J. zhF H. Guo" >• sup p. chep L XL w. Huang" X. Song and X. Dong〉XMgew chem. Im. 00」JL 2019, 50 1864r18646・
「33」N- song" wany Y Wu J GF s・ Li and Hap ACS Omega」JL 22产 9 14517—14525,
「34」s・ s・ QL J・ sup H・ Yu and s・ Yu" Drug Dem.」JL 2017, 24" 1909—1926, 「35」R w・ Johnssnp>• >• Ruefli and s・ w・ Low® CM二=2002, 108 二 53—164,
「36」R. L. so-geL K. D. Mi=er and A. Jen^L CA Cancer J Ch 三 201 产 6®°7—30.
「37」B Herranz-BlancpD. LiF E. MAkilp:M. A. shahbazi〉E. GinesfM H. zhang〉V Aseyev〉V B 巴 asubramaB.ap J・ Salonen" J・ Hirvonen and H・ A・ Samos" Adv Funct. 石&汽」JL 201H 2® 1488—1497.
「38」R. N. Kje=beg Sciences二972" 176二071.
「39」Y. poimreaF p. Garaud" s. chapel c. sirpc. Tuchaiy J. Tortochaux〉s. Faivrps. GuerriEM. Alfbnsi and G Calais" JNCL J・ NaiL ccmceFI.39 2009" 101〉498—506, 「40」L smith〉s・ Heys〉>• Huicheop L Milled s・ paynpF. Gilbert〉>• Ah—sepp・ Eremip L walker〉H
20IwllW離多 sarkar" p. Egglefon and K. ogsfop J. Qin. Omco 二 J」" 2002" 2®1456—1466. 「41」w・ Tang〉B LiF s・ Wang" H- LiF c・ Fu" x・ Rep L Tap w・ Duan and X Meng〉RSC 「JL 2016"
p 32434—32449
「42」G・ MascherN・ savaraj" w・ priebpp. BraunschweigeJ K・ Hami+op G Tidmarsh" L De Young and
T. Lampidis" cancel Res.「JL 2004〉64〉31—34・
「43」p. Laskar〉s・ soma5-s・ J・ Campbe-L M・ Mu=ip p. Keafing〉R J・ Tapc・ Irving〉H Y Leung and 0-
Dufes, Nanosccde」JL 2019, 一 厂 2005?°2007r 「44」K・ conklip Num Cawce二J」〉2000〉37" 1—18・ 「45」J* Fang》Wor 一dj. P0i§zs201" 4 二 68—171. 「46」V Torchi一ip Adv Dwg De 一 Nep. Revs, 22厂 63 二 31 — 13W 「47」L RapL L BF w- Cai J XF >• Li, WF zhang" N- J・ sup s・ s・ Gupw・ LiF H Wang and
X z・ zhaok}石卷二 J」9 2016" 2®°3460—3466. 「48」V buf chem. soc.力 ev」JL 224, 49 744—76P
「49」M・ Karimi" >• GhasemL p. Sahandi zangabad〉ef 旦•" chefn. soc.建 v「JL 2016〉45〉1457—150r

〔50」PHchop Y. J. Tseng, s. w. Chou J J* shyups. Y Lin and J. K. Hsg XCS3OS" 2016, 1® 5809—5822.
「51」G Yang〉L XF Y chapL XF X. sup Y WF R Peng and N- Liu" Nai. CCWW7MA「JL 2017〉?°902. 「52」N- Liu" K・ chep c・ Davis〉s・ sherlocrQ・ Cao" x・ Chen and Dai" Cancer Res. 3- 200产 60 6652—666P
「53」s・ zhang, N- chF c・ Yip G Lin and Q LL J. Am. Chem Soos" 201H 13® 5709—571P
「54」s・ some" >• R Gwop E Hwang" G・ Bahp Y Yoop Y Kim〉K・ seovHeps・ BarJ・ Yang〉D・ G・ Jo and H. Lepsci.>3兮32014" 4" 6314.
「55」Q・ XF Y Tanaka and J・ czemuszkp Bs-wme's-ZSLJL 2007〉20 2687—2694,
「56」N- Tang" Y Liu〉M・ He and w・ Bu〉XMgew chem・ Im. Ed.「JL 2019〉5?°946—956・
「57」W KpJ・FF Mohammg Y Wang, K・ TOF X LiF p. wep H KinoFY AmakF chep K・ Ka^oka and N- GpACS Nemo」JL 2019,19 2357—2369,
「58」0- zhang" L Yap x・ Wang〉x・ Dong" R Zhou〉N- Gu and Y Zhao" Nano Le斗.「JL 2019〉19" 1749—175S
「59」B MP s・ Wang〉F LiF s・ Zhang J Duap N- Li〉Y Kong〉Y sang" LiF w・ Bu and L. Li" J. Am. chem. Soo」JL 2019, 141, 849—857・
21「60」Y Liu〉w・ zhep Y Wang〉J・ LiF L Jip T・ zhang" s・ zhang" Y Zhao" s・ song〉0- Li〉J・ Zhu〉Y Yang and H. zhang" Asgew. chem. Iru. Ed.「JL 2019" 5®°2407—241Z
「61」N・ Gong" x・ MP X YpQ・ zhoF x・ chep x・ Tap s・ Yao" s・ HupHzhang〉s・ chep x・ Teng〉X. Hu J Yu" Y Gap Jiang J Li and x・ J・ Liang" Nai. Ncmoiechnol. s- 2019〉14" 379—387・ 「62」F・ Li〉Y dfj・ LiF H・ sup J・ Wang" R Li" D・ Kim〉T. Hyeon and u- Ling〉Adv 3- 2018" 3® 1802808.
「63」L s. LipJ. song, L. song, K. KpY Liu" N. Zhou" z. Shen Jpz. Yang, w. HI. G. NS-H. H. Yang and x・ chenLwgew chem. M. Ed.「JL 2010 57" 4902—4906,
「64」Y WFHGupY QiF Y Lip Y Yapw・ LEP L LipL Song and Yang, chem. sci.」JL 2019,1® 706?°7075・
〔65」B. Yang, Y. Chen and J. SFchem. Feus" 2299119, 4881—4985.
「66」w・ Fap p. Huang and X chep chem. soc. Rev s- 2016" 45〉6488—6519.
「67」QGUapYALL W・Y Li and YB Dong, c0ew;4ss-= J」JL 201 产 19 3122—3149,
「68」z. Yang" Q. chep J. chep z. Dong" R Zhang J Liu andNLirm2二 J」〉201®°14" 180326Z「69」Y Liu〉w・ zhep L・ Jip s・ zhang" G・ sup T. zhang" x・ XF s・ song" Y Wang" J・ Liu and H・ zhang" ACS Nemo」JL 22产 IN 4886—489W
「70」w・ zhep Y LiF x・ Jip L WF 0- Wang and x・ Jiang〉Ncmosccde Horiz. s- 2019〉4" 720—726,
「71」z・ Zhou〉J・ song〉L Nie and X. chep chem. soc. Fev「JL 2016〉45〉6597—6626,
「72」H・ TiapNLuo" L LiF M・ Zheng" N- chep >• MP R Liang" N- Hap 0- Lu and L Cai》Adv Flmci. 石sLolr 27 二 703197,
「73」Y Ruap x・ Jip 0- Wang〉w・ Zhen and x・ Jiang" ACS Biomagl: sci. 「JL 2019" 5〉1016—102Z 〔74」z. Wang〉Y. zhang" E JF z. LiF E capz. chep J” Ren and X. QF Nai. comnrnn.「JL 201®°9" 3334.
「75」J・ E・ Kennedy〉Nai. Rev casce二J」9 2005〉5" 321—327.
「76」s・ MitTagarL Nai. Rev Dmg Discov「JL 2005" 4〉255—26P
「77」0- DaL s・ zhang, N- LiF R・ Wu and Y chep ACS Nemo」JL 2017" 11, 9467—9489
「78」X pap L H・ Wang" Q WF H・ Wang, s・ LiF w- XF x・ Shi and H・ LiuL} 3. 201产 3®180018P
「79」Y Huang J Ren and x・ QF chem. Rev 三 2019, 119, 4357—441Z
&0」c. MCEWap c. Fovdey〉N. NomikoF B Mccaughap A. p. McHale and J. F. ca=ap Lcmgmid二二"•寸9690ZJ0Z•弘 UWZOOI.OIIOCI Z3Z CEPH El.喜o .M 必—汽甘上 OSPH Y pue pppso .N .AWOUmsKW .Ao一X」三 op.Ho乂 .M.gA .M .Aoo .z gpssCTV06」
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[103]H. Lai andN. Singh, Cancer Lett. [J], 1995,91, 41-46.
[104]P. M. O'Neill, V. E. Barton and S. A. Ward, Molecules [J], 2010, 15, 1705-1721.
[105]H. Zhang, Y. Ji, Q. Chen, J. Xiaojing, L. Hou, X. Zhu and 乙 Zhang, J. Drug Target. [J], 2015, 23,
1-16.
[106]D. Yang, W. Yuan, C. Lv, N. Li, T. Liu, L. Wang, Y. Sun, X. Qiu and Q. fu, Inter. J. Clin. Exp. Patho. [J], 2015, 8, 1270-1281.
第二章双氢青蒿素负载的金属有机框架纳米平台的构建用于化
疗与声动力协同治疗
摘要:我们设计合成了负载DHA的金属有机框架(MOF)纳米复合材料 ——DHA@PCN-224-Fe纳米粒子。材料在肿瘤微环境下响应性释放Fe离子,协同化疗 (CT)与声动力治疗(SDT),从而实现被动但特异性的肿瘤靶向性治疗。材料除了具 有可以通过超声辐射MOF产生单线态氧(1。2)的强大能力外,纳米粒子中还原的亚铁 离子还将通过与DHA反应产生活性氧自由基,并消耗肿瘤细胞中的谷胱甘肽(GSH) 以降低肿瘤细胞的抗氧化能力,从而增强化疗效果。并且材料中的Fe离子能够与H2O2 反应生成02,以缓解肿瘤的缺氧特征。我们认为,肿瘤微环境的低pH、高浓度GSH与 H2O2含量以及局部超声(US)辐射特性,可在很大程度上避免治疗所带来的副作用。
关键词:DHA、肿瘤、ROS、化疗、声动力治疗、纳米材料、MOF
2.1引言
众所周知,癌症是过去几十年来人类出现的高风险和死亡率的疾病之一,每年导致 全球约800万患者死亡⑴。由于非特异性和过度辐射等因素,包括化学疗法、放射疗法 和外科手术在内的传统疗法的表现岀不可忽视的严重副作用⑵。而随着新型微创或无创 癌症治疗方法的广泛研究,例如光触发光热疗法(PDT)和光动力疗法(PTT),可以在 一定程度上抑制肿瘤的生长®5】。不幸的是,即使研究人员已经使用了近红外(NIR)光 作为光源,这些治疗仍然受到潜在的光毒性和低组织穿透深度的影响®叭因此,迫切 需要开发具有更深组织穿透能力的癌症治疗策略。
声动力疗法(SDT)是由超声(US)触发并激活声敏剂产生可诱导癌细胞凋亡的活 性氧(ROS)的治疗方式,具有更深的肿瘤组织穿透力和降低正常组织损伤的效果Mi]。 声敏剂可分为有机分子和无机分子。例如MnWOx和TiCh等无机材料,由于其独特的 能带结构和相对较高的化学/生理稳定性,已被证明可有效提高SDT功效M2]。但由于其 生物降解困难及未知生物安全性的问题仍未解决[13J4]o目前,传统的有机吓卩林及其衍生 物(如血吓卩林)是SDT中广泛使用的声敏剂,其通过超声空化作用激活以产生局部细 胞毒性卩问。然而,有机声敏剂分子的低生物利用度和化学/生物不稳定性导致SDT的 治疗功效较弱,阻碍了其进一步的临床转化VW。因此,将声敏剂分子整合到纳米材料 中显得尤为重要。例如,通过将MnOx与中空介孔有机二氧化硅NPs结合,然后与原吓 卩林和环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五肽结合,可以成功开发出多功能PMR纳米声敏剂, 用作无机类过氧化氢纳米酶用于分解在肿瘤微环境中过表达的H2O2而产生02,丰富的 氧气促进SDT诱导的1。2的产生㈤]。
为了解决将足够剂量的化学治疗药物递送到肿瘤部位的问题,目前已经开发了药物 递送系统(DDS)实现将药物靶向肿瘤组织。尤其是纳米级金属有机框架5MOF)具 有高存储容量和出色的生物相容性,使其成为DDS的杰出候选者0,22]。例如,由于具 有丰富的化学功能,可以将大量的抗肿瘤药物盐酸阿霉素(DOX)封装到 AS 1411 @PEGMA@GQDs@Y -CD-MOF中,形成pH响应的DOX递送系统,持续释放 下可达到89.1%更高的DOX负载量[23】。基于MOF的治疗剂Fe3O4@UiO-66核-壳复合 材料是通过在Fe3O4核上生长UiO-66 MOF壳而构建的,用于同时进行药物输送和磁共 振(MR)成像Bl。最近,由Z「6和含竣基的吓卩林组成的构建体对溶液相的催化反应大 有前景,这取决于Z*和竣基之间的强相互作用©I。目前已开发了一系列的多孔吓卩林- 错MOF。值得注意的是,在PCN-222 (PCN代表多孔配位网络)中,连接到簇的 四个周围的竣酸酯基被D4h对称的羟基取代必]。通过改变原料的投入比例和调节剂的量, 他们获得了一系列新的多孔口卜卩林-错MOFs,如基于具有D3d对称性的表示为PCN-224[27]o
据报道,与传统的抗肿瘤药物不同,双氢青蒿素(DHA)作为一种新型且有效的肿 瘤治疗剂,通过离子的类Fenton反应(例如F/+, Mi?+和Ni2+)介导该化合物的内过氧 化物桥裂解产生自由基活性氧(ROS),最终诱导癌细胞凋亡[殂29]。
肿瘤的异质性、多样性和复杂性严重破坏了治疗的治疗潜力。因此,当前临床研究 的趋势已逐渐从专注于单一疗法转向协同疗法以提高治疗效果。例如Dong等人在温和 条件下合成Mo2C衍生的多金属氧酸盐(POM)作为PTT/CDT双模式治疗试剂。Mo5+ 氧化为M06+可通过Russell机理大量生成有毒的O。此外,CDT过程通过光热转化得 以提高,并通过耗竭GSH而得以维持,这在消融肿瘤和预防复发上显示出优异的疗效凶。 因此,几种类型的单一疗法之间的协同增强相互作用促成多峰协同疗法的产生,从而产 生了显著的超加性(即“1+1>2”)效应,比任何单一疗法或它们的理论组合都强卩I】。
癌细胞的内部生理障碍包括缺氧和过高的H2O2和GSH浓度。低氧可导致耐药性和 肿瘤转移阳。因此,我们设计合成了 DHA@PCN-224-Fe NPs用于肿瘤细胞的声动力学 和增强的化学协同治疗。具体而言,通过纳米颗粒上的铁离子和肿瘤环境中较多含量的 谷胱甘肽的相互作用,从而产生并释放亚铁离子。DHA@PCN-224-Fe NPs可通过超声 (US)辐射产生单线态氧(〔Ch),而被还原的亚铁离子与DHA反应将产生自由基增强 CT效应,提供额外的肿瘤消融方式。此外,肿瘤部位纳米粒子上的三价铁可以与H2O2 反应生成02,在一定程度上缓解局部缺氧增强药物的化疗效果。所设计的材料为癌症 治疗提供了一种新的思路。

示意图DHA@PCN-224-Fe的形成及其抗肿瘤机制的图解。

Scheme Illustration of DHA@PCN-224-Fe formation and its anticancer mechanism in vivo.
2.2实验部分
2.2.1材料表征
透射电镜(TEM)图像是在加速电压为75 kV的H-600透射电镜仪器上获得的
(Hitachi,日本)。扫描电子显微镜(SEM)通过XL30 ESEM FEG显微镜进行测量, 加速电压20kVo动态激光散射(DLS)由ZEN3690 Zetasizer完成测量(Malvem,英国)。 采用N2多层吸附(BET)对材料的比表面积、孔体积进行分析(MicromeriticsASAP 2020, 美国)。通过紫外可见(UV-vis)光谱仪(Shimadzu,日本)和荧光光谱仪 美国)对材料的光学性能进行了表征(配套1 xl cm2的样品池)。在Nicolet 6700傅里叶 变换红外光谱(FTIR)仪上记录FTIR光谱,该光谱仪配备了 DTGSKBr探测器和KBr 分束器(Bmker,德国)。在PANalytical X射线衍射仪上使用Cu-Ka辐射(入= 0.15405 nm)进行X射线衍射(XRD)图像测量,用于获取样品晶体学信息。X射线光电子能 谱(XPS)分析使用的是带有300WA1 Ka辐射的ESCALab220i-XL电子能谱仪。采用电 感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES, Thermo Scientific Xseries II, Thermo Fisher Scientific,美国)准确测定铁离子的浓度。细胞图像由激光共聚焦扫描荧光显微镜(CLSM, Leica,德国)拍摄。MTT和小鼠血液生化分析使用Versamax酶标仪(Bio-Tek,美国)。 所有声动力的实验均使用超声换能器(ChattanoogaCo.,美国)进行。
2.2.2药品与试剂
分析纯的四(4-竣基苯基)吓卩林(TCPP)、六水合氯化铁(FeCh6H2O)、原硅酸四 乙酯(TEOS)、苯甲酸、丙酮、氯化错购买自Aladdin试剂有限公司。双氢青蒿素(DHA) 购自J&K科技有限公司(中国,北京)。三(4,7-联苯-1,10-菲罗卩林)(RDPP)、钙黄绿 素(Calcein AM)、2\ 7「二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、碘化丙噪(PI)、3- (4, 5-二甲基卩塞卩坐-2) -2, 5-二苯基四氮卩坐漠盐(卩坐卩塞蓝,MTT)购自美国Sigma公司。
DMEM培养基购买于北京鼎国生物技术公司。标准胎牛血清(FBS)购自天津市康元生 物技术制造有限公司。血液生化检测试剂盒从江苏南京建城生物工程研究所购买。整个 实验中使用超纯水(Millipore milliq system)。所有的化学试剂都没有经过额外的纯化。
2.2.3合成 PCN-224 NPs
我们通过一步法合成了多孔网络配合物224 (PCN-224)。典型的合成过程如下,将 50.0 mg TCPP> 1.4 g苯甲酸和150.0 mg ZrCl4溶解在DMF (45 mL)溶液中,超声处理 15 mine之后,将所得溶液在90°C下搅拌5 h。最后,通过离心(8000 rpm)获得PCN-224 NPs,用DMF洗涤3次,并保存在新鲜的DMF中以备后用。
2.2.4PCN-224-Fe NPs 的制备
为了获得 PCN-224-Fe NPs,将 67.6 mg 的 FeCh • 6H2O 溶解在 PCN-224 的 DMF 溶 液(30 mg)中,于120°C下反应7 h,然后离心收集并用DMF洗涤3次,得到PCN-224-Fe NPs。收集全部离心和洗涤的上清液,通过ICP检测Fe的配位效率。
2.2.5DHA@PCN-224-Fe NPs 的制备
我们采用了稍加改动的纳米沉淀法制备DHA@PCN-224-Fe NPs〔28'32]。一般地,将 10.0 mg PCN-224-Fe分散在DHA的丙酮溶液(5mL, 2 mg mL1)中,并在37°C下水浴 搅拌5 h,直到蒸发掉大部分溶剂。然后在持续匀速搅拌状态下缓慢滴加超纯水,继续
搅拌24h,以确保有机溶剂完全挥发。分别用乙醇和D.I.水洗涤产物。收集所有上清液 用于测量DHA的药物负载量。通过在55±1°C下与0.2% NaOH水溶液混合加热处理上 清液30 min,以将上清液中的DHA转化为吸收紫外光的化合物,并且通过UV-vis光谱
仪检测288 nm处的吸收值。DHA的负载效率和载药量分别根据等式(1)和(2)计算:

2.2.6体外检测PCN-224-Fe NPs的GSH消耗特性。
DTNB溶液用于检测PCN-224-Fe NPs的谷胱甘肽消耗特性。将样品分为7组:DTNB (25(ig mL1)组、PCN-224-Fe NPs 组(lOOfigml/)、游离 GSH 水溶液(100(1M)、 GSH+DTNB 组、PCN-224-Fe NPs+DTNB 组、PCN-224-Fe NPs+GSH 组、PCN-224-Fe NPs+GSH+DTNB组,其他组在均匀混合lOmin后测试样品的UV-vis光谱,最后一组进 行如下操作:GSH和PCN-224-Fe NPs首先反应4 h,然后离心处理以收集上清液。之后 添加DTNB溶液并再混合10 min,进行UV-vis测量。
2.2.7材料中铁离子释放的测试
将 PCN-224-Fe NPs (1 mg mL1, 1 mL)悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS, 10 mM, pH 7.4、5.5和5.5+GSH)溶液中不同时间(1、4、12、24和48 h)。离心后,用抗坏血 酸(20 mM, 0.5 mL)还原0.5 mL上清液30 min,然后将混合物与邻-菲咯卩林溶液(0.1%, ImL)共培养6h。生成最终红色络合物,然后检测其在512 nm波长处的吸光度值,根 据Fe离子“吸光度-浓度”的标准曲线定量计算Fe离子的释放量。
2.2.8细胞培养
在DMEM培养基(补充10% (v/v)胎牛血清(FBS),青霉素(lOOUmL1)和链 霉素(100 ^ig mL1))中培养人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)。在5% CCh下于37°C下通 常使用0.25% (wt%)的胰蛋白酶收集细胞,然后重悬于新鲜培养基中以进行下一次种 植。
2.2.9 检测 PCN-224-Fe NPs 胞内生成 Ch 用RDPP探针通过CLSM成像检测细胞内O2的生成。将HeLa细胞与5 piM RDPP 孵育 4 h,再与 PCN-224 NPs 或 PCN-224-Fe NPs (100(ig mL1)孵育 12 或 24 h。CLSM 激发波长为488 nm,并收集600 - 700 nm发射带的RDPP荧光。
2.2.10体外和细胞水平检测单线态氧的生成
对于细胞外ROS检测,使用商用探针DPBF通过紫外可见光谱法检测其在410 nm 处的吸收强度来确定单线态氧的产生。将10(1LDPBF的乙醇溶液(lOmM)添加到1 mL 含 60%乙醇(pH 7.4)的 PCN-224-Fe NPs 悬浮液(0、10、25、50(ig mL1)中,将其 转移到10毫米比色皿。然后将比色皿在黑暗中超声辐射(1.0 MHz, 1.0 W cm'2, 50% 占空比)10 mino每2 min记录一次410 nm处DPBF的吸收强度。不加材料的小组作为 对照组。
为了检测材料在细胞内产生的1。2,将HeLa细胞(每个培养皿约5X105个细胞) 接种到培养皿中培养24 ho然后将它们小心地用PBS洗涤3次,与PCN-224-Fe NPs或 DHA@PCN-224-Fe NPs孵育12 h。在DMEM中孵育的细胞用作对照。将细胞用5(1M SOSG处理30 mine特定的皿用US辐射(1.0 MHz, 0.8 W cm3 50%的占空比)1 min。 使用CLSM在488 nm激发并在500-560 nm波长发射下对细胞进行荧光成像。在成像之 前,应再次用PBS清洗皿3次,然后在每个皿中加入1 mLPBSo
2.2.11细胞内总体活性氧水平的检测
采用DCFH-DA探针检测细胞内总体ROS含量。将HeLa细胞(每个培养皿5 X 105 个细胞)接种到共聚焦皿中。将细胞用2mLDCFH-DA 处理30mino然后,
将所有共聚焦皿用PBS仔细清洗3次,分为7组:对照组、SDT、PCN-224-Fe NPs、 DHA、DHA@PCN-224-Fe NPs> PCN-224-Fe NPs+SDT> DHA@PCN-224-Fe NPs+SDTo 未经任何处理的细胞用作对照。通过CLSM进行细胞的荧光成像。
2.2.12材料细胞毒性测试
我们采用MTT法检测HeLa细胞对合成的PCN-224-Fe NPs>DHA@PCN-224-Fe NPs 和游离DHA的细胞毒性。将HeLa细胞接种到96孔板中(每孔约5X104个细胞),并 在5% CCh气氛下于37°C培养24 ho然后将200此不同浓度的溶液添加到各个孔中, 继续孵育24 h。向每个孔中添加MTT溶液之前,应先用PBS仔细清洗细胞。MTT孵育
4 h后,弃去上清液,将100 yL DMSO依次添加到每个孔中。然后将板摇动10 min以 完全溶解蓝紫色的甲脇。用酶标仪测定每个孔在570 mn的吸光度值。为进一步评估材 料的毒性我们进行了活/死细胞分析。将HeLa细胞以每培养皿5X105个细胞的密度播种 到20 mm玻璃底培养皿中培养24 h。接下来,将材料添加到指定皿中,使其暴露或不 暴露于超声辐射。之后,将细胞小心地用PBS洗涤3次,以确保将细胞外其他物质洗掉, 然后用2 mL含钙黄绿素AM (20 nM)和PI (4 |1M)的PBS染色30 min。最后,将细 胞再次用PBS洗涤3次,在CLSM成像之前,将培养皿中加入另外1 mLPBS。
2.2.13数据统计及分析
所有数据来自至少三组平行实验得到的平均值及标准偏差(SD)。
2.3结果与讨论
2.3.1DHA@PCN-224-Fe NPs 的合成与表征
DHA@PCN-224-Fe NPs的制备过程如示意图所示。首先,PCN-224 NPs是通过文 献方法©I将TCPP、苯甲酸和ZrCb加入DMF溶剂中一步合成的,其DMF样液如图3A 所示。从PCN-224 NPs的TEM和SEM图像(图1A (a)和(c))中观察,每个粒子均 具有均匀的球形形态,平均尺寸约为103.8 nmo随后,加入FeCh并将溶液加热到120°C 后,制备了铁掺杂的 PCN-224 NPs (称为 PCN-224-Fe NPs)o

图 1. (A)所制备的 PCN-224 NPs (a)和 PCN-224-Fe NPs (b)的 TEM 图像。PCN-224 NPs (c)和
PCN-224-Fe NPs(d)的SEM图像。(B)PCN-224-Fe NPs中的三个粒子的STEM图像以及相应的C、
N、0、Fe和Zr元素映射。(C) N?吸附-解吸等温线和PCN-224-Fe NPs的相应孔径分布。(D)纯
DHA、所制备的 PCN-224 NPs>PCN-224-Fe NPs 和 DHA@PCN-224-Fe NPs 的 FTIR 光谱°(E)DHA、 PCN-224 NPs、PCN-224-Fe NPs 和 DHA@PCN-224-Fe NPs 在 850-1250 cm1 波数范围内放大的 FTIR 光谱。(F) PCN-224 NPs和PCN-224-Fe NPs粉末的X射线衍射光谱。
Figure 1. (A) TEM images of as prepared PCN-224 NPs (a) and PCN-224-Fe NPs (b) NPs. SEM images of
PCN-224 NPs (c) and PCN-224-Fe NPs (d). (B) STEM images of three particles ofPCN-224-Fe NPs and
corresponding elemental mapping for C, N, O, Fe, and Zr. (C) Nitrogen adsorption-desorption isotherms
and the corresponding pore size distribution of PCN-224-Fe NPs. (D) FTIR spectrums of pure DHA and the
as prepared PCN-224 NPs, PCN-224-Fe NPs and DHA@PCN-224-Fe NPs. (E) Enlarged FTIR spectra of
DHA, PCN-224 NPs, PCN-224-Fe NPs and DHA@PCN-224-Fe NPs in the ranges of850-1250 cm1
wavenumber. (F) Powder X-ray diffraction spectra of PCN-224 NPs and PCN-224-Fe NPs.
从图lA(b)和(d)中PCN-224-Fe NPs的TEM和SEM可以看出,由于Fe杂化, 颗粒的表面形态从光滑变为粗糙,表明与铁离子成功反应。通过电感耦合等离子体(ICP) 测量材料中的Fe含量为13.8 wt%。测量所得PCN-224-Fe NPs的DLS大小为106.7 nm, Zeta电位为29.8 mV(图3B)。如X射线光电子能谱(XPS)分析所示(图3E),PCN-224-Fe NPs主要由C、N、O、Zr和Fe组成。在PCN-224-Fe NPs的光谱中揭示了 Fe三价态的 典型Fe 2pi/2和2p3/2结合能峰(图3F)。暗场STEM对应的元素映射进一步表明,所有 这些元素均均匀分布(图1B)。
Before loading
After loading
250 300 350 400
Wavelength (nm)
图2负载到PCN-224-Fe NPs前后DHA的紫外可见吸收光谱。
Figure 2. UV-vis absorption spectra of DHA before and after loading to PCN-224-Fe.
PCN-224-Fe NP 的 Brunauer-Emmett-Teller (BET)表面积为 677.7 m2 g1,平均孔径 为2.61 nm,适合载药(图1C)。因此,DHA被负载到PCN-224-Fe NPs的孔中。为了 确认DHA的成功封装,我们进行了 FTIR测量。如图1D所示,与PCN-224-Fe NPs相

比,DHA@PCN-224-Fe NPs在800-1200 cm"范围内显示了新的峰,这可以归因于来自 纯DHA结构中O-O-C的0-0和C-O振动模式峰(过氧化物)。此外,从DHA与 DHA@PCN-224-Fe的FT-IR谱图中可以发现,在〜2850 cm1的甲基(-CH3-)和〜2940 cm1 的乙基(-CH2-)的投射峰也表明DHA已成功地掺入PCN-224-Fe NPs的孔中⑴】。而且, 从图1E放大的FTIR光谱中可以看出,PCN-224-Fe NPs在大约1000 cm1处出现的对称 Fe-N拉伸振动峰证明了 FJ+与吓卩林的配位厲,35]。XRD测试结果表明,与PCN-224 NPs 相比,PCN-224-Fe NPs的结晶度变差(图IF),但是SEM和DLS结果表明了 NPs形态 的完整性©I。DHA的负载量和负载效率分别计算为750 mg家和75% (图2)昭。

图3. (A)禺心管中所制备的PCN-224和PCN-224-Fe NPs的DMF溶液照片。(B)去禺子水(D.I.) 水中PCN-224-Fe的流体力学尺寸和Zeta电位(插图)。(C)分别在PBS、FBS (80%), 0.9%盐水 和 DMEM 中制备的 DHA@HPDA-Fe 的流体力学尺寸。(D) DHA@HPDA-Fe 在 PBS、FBS (80%)、 0.9%盐水和DMEM中孵育1、2、4和7天时的流体动力学大小。(E) PCN-224-Fe NPs的XPS光谱。
(F) PCN-224-Fe 的 Fe 2p 光谱。
Figure 3. (A) A photograph of DMF solutions of PCN-224 and PCN-224-Fe NPs in centrifugation tubes,
respectively. (B) Hydrodynamic size and Zeta potential (insert) of PCN-224-Fe in D.I. water. (C)
Hydrodynamic size of as prepared DHA@HPDA-Fe in PBS, FBS (80%), 0.9% saline, and DMEM,
separately. (D) Hydrodynamic size of DHA@HPDA-Fe incubation in PBS, FBS (80%), 0.9% saline, and
DMEM for 1, 2, 4, and 7 days. (E) XPS spectrum of PCN-224-Fe NPs. (F) Fe 2p spectrum for
PCN-224-Fe.
此外,所制备的DHA@PCN-224-Fe NPs可以很好地分散在去离子(D.I.)水、0.9% 盐水、PBS、80% FBS和DMEM中。并且经过一周培养处理,没有任何可检测到的团 聚和明显的尺寸变化,证明了其在体内应用的稳定性(图3C和3D)。
2.3.2GSH和pH响应性降解

图 4. (A)检测 DHA@PCN-224-Fe NPs 的 GSH 消耗特征。DTNB、GSH、GSH+DTNB 和
GSH+DHA@PCN-224-Fe NPs (50、100 和 200 mL1) +DTNB 的紫外可见光谱。(B)在各种微
环境(pH 7.4、pH 5.5 # pH5.5+GSH)中从DHA@PCN-224-Fe释放的Fe的定量分析。数据代表3
次独立实验平均值土SDo(C) DHA@PCN-224-Fe NPs 在 10 mM PBS(pH 7.4、pH 5.5 和 pH 5.5+GSH)
中于37°C培养12、24、48和72 h的TEM降解图像。
Figure 4. (A) Detection of GSH consumption characteristics of DHA@PCN-224-Fe NPs. The UV-vis
spectra of DTNB, GSH, GSH+DTNB, and GSH+ DHA@PCN-224-Fe NPs (50, 100, and 200 jig mL1) +
DTNB. (B) The quantitative analysis of the Fe release from DHA@PCN-224-Fe in various
microenvironment (pH 7.4, pH 5.5, and pH 5.5+GSH). The data represents the mean + SD of 3 independent
experiments. (C) TEM images of DHA@PCN-224-Fe NPs degradation in 10 mM PBS (pH 7.4, pH 5.5,
and pH 5.5+GSH) at 37°C for 12, 24, 4& and 72 h.
降低肿瘤细胞内GSH含量可以削弱肿瘤细胞的抗氧化能力从而增加活性氧(ROS) 的相对含量,因此我们评估了 NPs消耗GSH的特性。图4A表明,DTNB在323 nm处 具有明显的UV-vis吸收峰。加入GSH后,323 nm处的峰信号值明显降低,取而代之的 是408 nm波长处形成的氧化产物的峰旳。然而,如果将GSH首先与不同浓度的 PCN-224-Fe NPs反应10 min再与DTNB混合,我们发现随着NPs浓度的增加,408 nm 处吸收峰逐渐下降,表明我们的材料可以消耗GSH。由于F尹对S寡肽的亲和力比对N 的亲和力强,因此在PCN-224-Fe NF中添加GSH会触发NPs降解以及FJ+的释放和进 一步还原。更重要的是,大多数纳米MOF在弱酸性条件下都容易水解师],其框架遭到 破坏使金属离子(铁离子)释放出来。因此,我们评估了在不同条件下的铁释放:pH=7.4 PBS代表正常的生理环境、pH=5.5 PBS和pH=5.5 PBS+GSH代表肿瘤酸性微环境。数 据显示,在pH 7.4下,48 h内可实现35.94%铁的释放(图4B)。与生理条件相比,随 着pH的下降和培养时间的延长,Fe的释放量更高(48 h达到57.38%),这与PCN-224-Fe NPs在酸性环境下的瓦解有关。此外,在PCN-224-Fe NPs的pH 5.5 PBS缓冲体系中加 入GSH反应48h后,上清液中的Fe含量进一步增加,达到67.70%。因此,我们认为 微环境pH和GSH是导致铁从NPs降解的两个重要因素,可以通过直观的表征方法TEM 观察。从TEM图像(图4C)可以看出,在pH 7.4 PBS溶液中孵育DHA@PCN-224-Fe NPs 12h后,即使孵育时间增加到48 h,大多数NPs仍稳定并保持其原始形貌。毫不奇怪, 将NP在pH 5.5的PBS缓冲液中孵育时,大多数NPs发生降解致使其形状变得不规则。 体系中加入GSH后,可以看到纳米载体更明显的结构塌陷。孵育48h后,几乎所有NPs 降解,表明DHA@PCN-224-Fe NPs随着培养时间的延长而发生严重降解过程。这种独 特的性能使我们的材料适用于药物输送和释放。
2.3.3纳米粒子催化产生02

图 5.细胞内 02生成的检测。使用 02探针与(A) DMEM、(B) PCN-224、(C) DHA@PCN-224-Fe
NPs孵育12 h和(D) DHA @ PCN-224-Fe NPs孵育24 h的HeLa细胞测试其中。2的浓度,和相应 的曲面表面图像(比例尺:75 |im) o
Figure 5. Detection of O2 generation intracellular. The evolution of O2 within HeLa cells incubated with (A)
DMEM, (B) PCN-224, (C) DHA@PCN-224-Fe NPs for 12 h and (D) DHA@PCN-224-Fe NPs for 24 h
with O2 probe and corresponding surface plot images. (Scale bar: 75 |im).
此外,肿瘤细胞中的H2O2浓度可高达100 piM,远远超过正常细胞中的浓度(小于 20 nM)㈤]。因此,通过使用Ch探针[Ru(dpp)3]C12 (RDPP)在活的Hela细胞中证实H2O2 触发NPs产生O2的实验,探针荧光可以被02淬灭。如图5所示,用DHA@PCN-224-Fe NPs处理细胞12 h后,细胞绿色荧光被淬灭,处理24 h后RDPP的荧光几乎没有。相 反,在用PCN-224NPs处理细胞后,与对照组相比,细胞中绿色荧光的强度没有任何变 化。这清楚地表明,DHA@PCN-224-Fe NPs中的FJ+催化了 H2O2触发细胞内。2的产 生,不仅克服了肿瘤的缺氧以增加DHA化疗的效果,而且可以通过US辐射来产生1。2。
2.3.4通过产生1。2及DHA和Fe反应产生自由基增加ROS水平 图6. (A)由于1。2的产生而随时间推移消耗的DPBF的变化:仅US辐射(黑色)、10 pig mL1 (红 色)、25 pig mL1 (蓝色)、50 pig mL1 (粉红色)PCN-224-Fe+US辐射。(B)在不同条件下SOSG染 料培养 HeLa 细胞的 CLSM 图像:(a) PCN-224-Fe、(b) US、(c) PCN-224-Fe+US、(d) DHA、(e) DHA @ PCN-224-Fe 和(f) DHA@PCN-224-Fe+USo 比例尺=75 |imo (C)用 DCFH-DA 探针检测

(a) DMEM、(b) PCN-224-Fe、(c) US、(d) PCN-224-Fe+US、(e) DHA、(f) DHA@PCN-224-Fe 和(g) DHA@PCN-224-Fe+US处理的HeLa细胞的并通过CLSM检测的图像。比例尺=75艸。
Figure 6. (A) Consumption of DPBF over time due to 1C)2 generation: US irradiation only (black), 10 jig
mL1 (red), 25 jig mL1 (blue), 50 pig mL1 (pink) ofPCN-224-Fe with US irradiation. (B) CLSM images of
SOSG stained HeLa cells cultured in different conditions: (a) PCN-224-Fe, (b) US, (c) PCN-224-Fe + US,
(d) DHA, (e) DHA@PCN-224-Fe, and (f) DHA@PCN-224-Fe + US. Scale bar = 75 |im. (C) CLSM
images of HeLa cells treated with (a) DMEM, (b) PCN-224-Fe, (c) US, (d) PCN-224-Fe + US, (e) DHA, (f)
DHA@PCN-224-Fe, and (g) DHA@PCN-224-Fe + US and detected by DCFH-DA. Scale bar = 75 屮n.
我们将制备的PCN-224-Fe NPs用作声敏剂,使用DPBF作为指示剂对超声产生的
1。2进行定性测试。这是基于这样的事实,即DPBF在捕获O后在410 nm处吸收峰降 低。图6A显示,在US射线照射下,对照组DPBF的信号在10 min内保持强度不变。 相比之下,我们发现NPs产生的1。2具有超声时间依赖性和浓度依赖性的特征,表现出 优异的声动力效果。SDT来自所谓的空化效应,这是指超声辐射后产生气泡,并且气泡 的快速增长和破裂是空化现象。更为有趣的是,超声波还可以通过能量转移激活传统的 声敏剂分子(如:吓卩林)以产生ROS。这种现象可以通过以下过程来解释:作为声敏剂 的PCN-224-Fe NPs会将能量转移给O2分子,导致生成 O[叭 基于PCN-224-Fe介导 的ROS生成,使用SOSG探针评估了 US辐射下细胞中1。2的产生。图6B显示,未被 US辐射或NPs (包括PCN-224-Fe和DHA@PCN-224-Fe)处理的细胞,没有明显由 与SOSG反应出现的荧光。毫不奇怪,当同时使用NP和US辐射处理它们时,绿色荧 光信号大量增多,表明细胞中产生了 1。2。

图7检测Hela细胞中亚铁离子浓度的增加。
Figure 7 Detection the increasing concentration of ferrous ions in Hela cells.
由于在肿瘤微环境中DHA@PCN-224-Fe的降解会释放出Fe和DHA,释放出的铁 离子将在GSH和其他一些还原剂的作用下转化为FL增强DHA产生的自由基。此外, 借助US辐射,PCN-224-Fe NPs可以产生 O以增加ROS的量。为了检验该假设,基 于CLSM的测量,使用HeLa细胞比较不同组中ROS的含量。仅将HeLa细胞与 PCN-224-Fe孵育或经US辐射处理后,在细胞质中几乎未观察到DCF的绿色荧光,表 明细胞内ROS水平可忽略(图6C)。用游离DHA处理后,ROS可能在细胞中轻微升高, 这可能是由于细胞内固有的一些亚铁离子所致。相比之下,用DHA@PCN-224-Fe培养 细胞后,DCF在HeLa细胞中的平均荧光强度显著增强,这表明ROS的突然产生是由 于亚铁离子与DHA的相互作用引起的。可以看出,将细胞与DHA@PCN-224-Fe孵育 并同时用US辐射处理后,荧光强度最高。由于FL在PCN-224 NPs ±具有配位作用, 我们推断所递送的Fe”可以在肿瘤细胞中还原为亚铁离子,然后与DHA相互作用以产 生ROS增强细胞毒性。因此,我们证明了 PCN-224-Fe和DHA@PCN-224-Fe可以在肿 瘤细胞中还原为FL。从图7可以看出,控制组用DMEM处理的HeLa细胞显示出固有 的低浓度亚铁离子。然而,将细胞与NPs孵育12 h后,细胞中FJ+的浓度明显增加, 表明该材料中的铁离子可以成功地还原为肿瘤细胞中的亚铁离子。更重要的是, DHA@PCN-224-Fe组中的亚铁离子浓度略低于PCN-224-Fe组中的亚铁离子浓度,可能 是由于它们与DHA反应生成ROS所消耗。
2.3.5细胞水平抗肿瘤测试
生物相容性是纳米材料在癌症治疗中的重要指标⑷]。我们首先对材料进行了细胞水

平MTT毒性评估。如我们预期的那样,在孵育24 h后,即使不进行任何处理、浓度高 达500(igmL「i, PCN-224-Fe本身对HeLa细胞的毒性也微不足道(图8A)。此外,细胞 活力与SDT处理的强度和时间有关(图8B)。细胞即使在0.8 W cm'2的功率下暴露于超 声辐射120 s也显示出极高细胞存活率。但是当功率达到1.0 W cm-?时,生存力下降至 75.5%,表明US辐射对细胞有潜在的危险损伤。

图&细胞水平抗肿瘤效率。在HeLa细胞系上以不同浓度处理的(A) PCN-224-Fe、(B)仅US辐
射、(C) PCN-224-Fe+US 辐射、(D)游离 DHA、(E) DHA@PCN-224-Fe 和(F) DHA@HPDA-Fe+US
辐射。(G)与 DMEM、HPDA-Fe、US、PCN-224-Fe+US、DHA、DHA@PCN224-Fe>
DHA@PCN224-Fe+US孵育24 h后的HeLa细胞的共聚焦荧光图像。活/死染色显示死细胞为红色,
活细胞为绿色。比例尺:50 |im0
Figure 8. In vitro antitumor efficiency. Cell viability of (A) PCN-224-Fe, (B) US irradiation only, (C)
PCN-224-Fe + US irradiation, (D) free DHA, (E) DHA@PCN-224-Fe, and (F) DHA@HPDA-Fe + US irradiation at various concentrations on HeLa cell lines. (G) Confocal fluorescence images of DMEM, HPDA-Fe, US, PCN-224-Fe+US, DHA, DHA@PCN224-Fe, DHA@PCN224-Fe+US-incubated HeLa cells for 24 h. Live/dead stain shows dead cells as red and viable cells as green. Scale bar: 50 |im. 因此,我们采用0.8W cm'2进行进一步的细胞实验。相比PCN-224-Fe处理组,US 放射线治疗组的PCN-224-Fe显示随着PCN-224-Fe浓度的增加,细胞存活率降低,这说 明PCN-224-Fe作为SDT的潜在声敏剂可促进肿瘤细胞凋亡(图8C)。我们测试了游离 DHA的细胞毒性。从图8D中可以看出,当DHA的浓度低于75piM时,其表现出良好 的生物相容性,而在添加150(1M或更高浓度的DHA后,HeLa细胞的活力却下降了, 这可能是由于其高浓度固有的毒性所致。相比之下,负载DHA后制备的 DHA@PCN-224-Fe对HeLa细胞显示岀强大的细胞毒性(图8E)。在100 pig mL“或更 高的浓度下,DHA@PCN-224-Fe将Hela细胞的活力降低至约42.1%,低于当量游离DHA 组的59.7%o DHA与F0之间的反应产生ROS。与未经SDT处理的组(71.8%, 200(ig mL1)相比,DHA@PCN-224-Fe联合SDT处理的组(图8F)显示出大规模细胞死亡, 占83.1%,表明DHA化疗和SDT的协同治疗显示出增强的治疗效果。
钙黄绿素AM和碘化丙噪(PI)共同染色实验直接验证了以上结果(图8G)O在 PCN-224-Fe组中,几乎所有细胞都被染成绿色,表明其良好的生物相容性。经过US辐 射处理的PCN-224-Fe出现一些细胞死亡(红色荧光),因为纳米颗粒在US下会产生1。2, 这可能会损伤细胞的结构。此外,DHA@PCN-224-Fe组中的大量HeLa细胞被染成红色, 表明DHA具有良好的化疗效果。毫无疑问,接受SDT处理的DHA@PCN-224-Fe组中 几乎所有细胞死亡。这些结果与MTT的实验高度一致。初步证明材料联合CT及SDT 对HeLa细胞具有明显的杀伤效果。
2.4小结
综上所述,我们已经成功开发了一种纳米药物递送系统,用于协同SDT和CT高效 对抗肿瘤,其目的是克服传统化学治疗药物的缺点,并使用更有效的癌症治疗方式。这 种策略利用了可生物降解的PCN-224金属有机框架的纳米系统的优势,来制备具有高治 疗性能的声敏剂。过渡金属Fe离子通过nMOF金属吓卩林(Fe-N键)螯合,介孔结构促 进了 DHA的高负载。有趣的是,高SDT和CT效率已在细胞水平得到全面证明,可诱 导癌细胞死亡。DHA@PCN-224-Fe可通过超声(US)辐射产生单线态氧OCh)而具有 强大SDT的能力,NPs被GSH还原而得到的亚铁离子与DHA反应将产生自由基增强 CT效应,从而提供额外的肿瘤消融方式,同时消耗GSH和H2O2产生02,不仅可以摆 脱抗氧化防御系统的困扰,还可以缓解肿瘤缺氧的特征。我们希望基于纳米技术设计的 DHA@PCN-224-Fe NPs增强SDT和CT策略的开发,将在生物医学领域得以应用,其 无创伤且具有被动靶向输送药物的优势,为癌症的有效治疗提供了一种方案。
参考文献
[1]Y. Liu, P. Bhattarai, Z. Dai and X. Chen, Chem. Soc. Rev. [J], 2019, 48, 2053-2108.
[2]P. Zhu, Y. Chen and J. Shi, ACS Nano [J], 2018,12, 3780-3795.
[3]R. Mrowczynski, ACSAppl. Mater. Interfaces [J], 2018, 10, 7541-7561.
[4]J. L. Counihan, E. A. Grossman and D. K. Nomura, Chem. Rev. [J], 2018, 11& 6893-6923.
[5]L. Cheng, C. Wang, L. Feng, K. Yang and Z. Liu, Chem. Rev. [J], 2014,114, 10869-10939.
[6]Y. W. Chen, Y. L. Su, S. H. Hu and S. Y. Chen, Adv. Drug Deliver. Rev. [J], 2016, 105, 190-204.
[7]X. Han, J. Huang, X. Jing, D. Yang, H. Lin,乙 Wang, P. Li and Y. Chen, ACS Nano [J], 2018, 12, 4545-4555.
[8]P. Huang, X. Qian, Y. Chen, L. Yu, H. Lin, L. Wang, Y. Zhu and J. Shi, J. Am. Chem. Soc. [J], 2016, 139, 1275-1284.
[9]F. Gong, L. Cheng, N. Yang, O. Betzer, L. Feng, Q. Zhou, Y. li, R. Chen, R. Popovtzer and 乙 Liu, Adv. Mater. [J], 2019, 31, 1900730.
[10]Wang, Y. Liu, H. Wu, J. Zhang, Q. Tian and S. Yang, Adv. Funct. Mater. [J], 2018, 29, 1805764.
[11]J. Zhu, C. Chu, D. Li, X. Pang, H. Zheng, J. Wang, Y. Shi, Y. Zhang, Y. Cheng, E. Ren, J. Cheng, X.
Chen and G. Liu, Adv. Funct. Mater. [J], 2019, 29, 1904056.
[12]K. Buettner and A. Valentine, Chem. Rev. [J], 2011, 112, 1863-1881.
[13]V. G. Deepagan, D. G. You, W. Um, H. Ko, S. Kwon, K. Y. Choi, G. R. Yi, J. Y. Lee, D. S. Lee, K.
Kim, I. C. Kwon and J. H. Park, Nano Lett. [J], 2016, 16, 6257-6264.
[14]L. Wang and T. Sasaki, Chem. Rev. [J], 2014,114, 9455-9486.
[15]X. Pan, L. Bai, H. Wang, Q. Wu, H. Wang, S. Liu, X. Bolong, X. Shi and H. Liu, Adv. Mater. [J], 2018,30, 1800180.
[16]M. Raj ora, J. Lou and G. Zheng, Chem. Soc. Rev. [J], 2017, 46, 6433-6469.
[17]C. McEwan, C. Fowley, N. Nomikou, B. Callan, A. McHale and J. Callan, Langmuir [J], 2014, 30, 14926-14930.
[18]C. McEwan, J. Owen, E. Stride, C. Fowley, H. Nesbitt, D. Cochrane, C. C. Coussios, M. Borden, N. Nomikou, A. P. McHale and J. F. Callan, J. Control. Release [J], 2015, 203, 51-56.
[19]N. Yumita, Y. Iwase, K. Nishi, H. Komatsu, K. Takeda, K. Onodera, T. Fukai, T. Ikeda, S.-I.
Umemura, K. Okudaira and Y. Momose, Theranostics [J], 2012, 2, 880-888.
[20]P. Zhu, Y. Chen and J. ACS Nano [J], 201& 12, 3780-3795.
[21]J. Wen, K. Yang, F. Liu, H. Li, Y. Xu and S. Sun, Chem. Soc. Rev. [J], 2017, 46, 6024-6045.
[22]W. Liu, Y. Pan, W. Xiao, H. Xu, D. Liu, F. Ren, X. Peng and J. Liu, MedChemComm [J], 2019, 10, 2038-2051.
[23]Q. Jia,乙 Li, C. Guo, X. Huang, Y. Song, N. Zhou, M. Wang,乙 Zhang, L. He and M. Du, Nanoscale [J], 2019, 11,20956-20967.
[24]H. X. Zhao, Q. Zou, S. K. Sun, C. Yu, X. Zhang, R. J. Li and Y. Y. Fu, Chem. Sci. [J], 2016, 7, 5294-5301.
[25]T. Li, P. Hu, J. Li, P. Huang, W. Tong and C. Gao, Colloid. Surface. A [J], 2019, 577, 456-463.
[26]D. Feng,乙 Y. Gu, J. R. Li, H. L. Jiang,乙 Wei and H. C. Zhou, Angew. Chem. Int. Ed. [J], 2012, 51, 10307-10310.
[27]D. Feng, W. C. Chung,乙 Wei,乙 Y. Gu, H. L. Jiang, D. Darensbourg and H. C. Zhou, J. Am. Chem. Soc. [J], 2013, 135, 17105-17110.
[28]L. Dong, C. Wang, W. Zhen, X. Jia, S. An,乙 Xu, W. Zhang and X. Jiang, J. Mater. Chem. B [J], 2019, 7,6172-6180.
[29]L. Liu, Y. Liu, L. Ma, F. Mao, A. Jiang, D. Liu, L. Wang, Q. Jia and J. Zhou, ACS Appl. Mater. Interfaces [J], 2018,10,6155-6167.
[30]G. Liu, J. Zhu, H. Guo, A. Sun, P. Chen, L. Xi, W. Huang, X. Song and X. Dong, Angew. Chem. Int. Ed. [J], 2019, 58, 18641-18646.
[31]W. Fan, B. Yung, P. Huang and X. Chen, Chem. Rev. [J], 2017, 117, 13566-1363&
[32]J. Bai, X. Jia, W. Zhen, W. Cheng and X. Jiang, J. Am. Chem. Soc. [J], 2017,140, 106-109.
[33]Y. Ding, J. Wan,乙 Zhang, F. Wang, J. Guo and C. C. Wang, ACS Appl. Mater. Interfaces [J], 2018, 10, 4439-4449.
[34]B. Yao, C. Peng, W. Zhang, Q. Zhang, J. Niu and J. Zhao, Appl. Catal. B: Environ. [J], 2015, 174-175, 77-84.
[35]L. Shi, L. Yang, H. Zhang, K. Chang, G. Zhao, T. Kako and J. Ye, Appl. Catal. B: Environ. [J], 2018, 224, 60-68.
[36]D. Wang, J. Zhou, R. Chen, R. Shi, G. Xia, S. Zhou,乙 Liu, N. Zhang, H. Wang,乙 Guo and Q. Chen, Biomaterials [J], 2016, 107, 88-101.
[37]A. Munoz, D. Petering and C. Iii, Inorg. Chem. [J], 1999, 3& 5655-5659.
[38]G. Cheng, W. Li, L. Ha, X. Han, S. Hao, Y. Wan,乙 Wang, F. Dong, X. Zou, Y. Mao and S. Y. Zheng, J. Am. Chem. Soc. [J], 2018,140, 7282-7291.
[39]Y. Wu, T. Guo, Y. Qiu, Y. Lin, Y. Yao, W. Lian, L. Lin, J. Song and H. Yang, Chem. Sci. [J], 2019,10, 7068-7075.
[40]S. Qe§meli and Q. Biray Avci, J. Drug Targeting [J], 2018, 27, 762-766.
[41]W. Zhen, Y. Liu, L. Lin, J. Bai, X. Jia, H. Tian and X. Jiang, Angeyv. Chem. Int. Ed. [J], 2018, 57, 10309-10313.
第三章 具有可生物降解性能的铁配位中空聚多巴胺纳米球在增
强肿瘤细胞杀伤效果中的应用
摘要:我们通过简便而有效的方法制备了一种基于铁配位且负载DHA的中空聚多巴胺 纳米球(DHA@HPDA-Fe)材料。所制备的纳米试剂具有生物可降解性,在肿瘤微环境 中可控释放DHA和Fe,被肿瘤中还原性物质还原得到的亚铁离子通过与DHA作用产 生的活性氧(ROS),从而有效地杀死肿瘤细胞。活体治疗实验表明,DHA@HPDA-Fe 的抗肿瘤疗效约为当量游离DHA的3.05倍,肿瘤抑制率为88.7%,且对小鼠产生副作 用小,证明该纳米载药体系具有良好的抗肿瘤应用前景。
关键词:中空结构、DHA、聚多巴胺、ROS、肿瘤化疗、可控释放
3.1引言
近年来,癌症被认为是世界上致死率最高的疾病之一,因此人们越来越重视对癌症 的治疗。在众多的癌症治疗方法中,化疗因为其高效性而成为临床治疗的理想选择⑴。 众所周知,传统抗癌药物如阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)由于其独特的抗癌机制而在化 疗中发挥着重要作用。虽然这些药物对肿瘤细胞具有明显的杀伤效果,但是它们的多重 耐药性或过高的价格阻碍了它们的治疗效果和进一步的应用2現 因此,我们希望开发 一种理想化疗策略来克服这些缺陷。
青蒿素(Artemisinin, ART)是一种目前广泛使用的有效抗疟药物。1972年屠呦呦 的研究组比5]从天然植物青蒿中将其分离出来。最近研究表明,在现有ART的耐药性得 到控制后,它将在抗疟治疗方面发挥更大的作用⑹。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin, DHA) 是ART的半合成衍生物和活性代谢物,具有抗疟活性强和代谢率高的优势79】。近年来, DHA作为一种新兴的肿瘤治疗剂已被广泛研究和报道,其治疗机理是基于产生活性氧 自由基来杀灭癌细胞。研究人员提出了 DHA不同的抗癌机理,均表明DHA对肿瘤细 胞的细胞毒性来源于铁离子介导的活性氧(ROS)的产生ZE, ROS进一步氧化脂质, 损伤细胞膜、蛋白质和DNA,最终诱导癌细胞凋亡[2 1习。然而,这种铁依赖特性和癌 细胞中亚铁离子的供应不足之间存在悖论。尽管科学家们发现,在大多数肿瘤细胞中, 转铁蛋白受体的浓度是远高于正常细胞的,因此通过这种方式增加了细胞对铁的摄入Ml, 不幸的是,由于肿瘤细胞的快速增长致使其快速消耗,细胞内铁含量仍然保持在一个较 低水平。同时,由于DHA水溶性差的特点限制了其进一步的临床应用。因此,开发一 种切实可行的方法来提高癌细胞的铁浓度和DHA摄取具有重要意义。
为了提高药物的治疗效果以及递送效率,在过去几年科学家成功设计了纳米药物传 递系统(DDSs) ""I。到目前为止,人们已经研究开发了种类繁多的纳米载体,包括 共辘聚合物、碳基、有机或金属化合物材料等等[18'22],它们表现出卓越的空间结构、可 调的纳米尺寸和基于高通透性和滞留效应(EPR)的被动肿瘤靶向能力GJ®。为了将 ART和FJ+共同传递到肿瘤细胞中,文献曾报道作者设计了氧化铁纳米颗粒的DDSso 但是铁离子不容易从高结晶度的纳米颗粒中释放出来旳。此外,也曾报道了富勒烯(C60) 和氧化石墨烯(nGO)分别作为药物纳米载体运输ART或DHA用于肿瘤治疗,但有限 的药物负载效率和复杂的材料构筑条件也表现出了材料本身细胞毒性的不确定性褪29]。 最近,基于纳米尺度金属-有机框架(nMOF)的纳米复合材料与ART或DHA相结合, 实现了癌症诊断和治疗的结合。然而,大多数的递送系统受到复杂合成步骤的限制抄⑶]。 因此,设计一种简单而有效的铁基纳米载体负载DHA实现肿瘤治疗是必要的。
聚多巴胺(PDA)是一种新兴的软物质,在能源、环境、生物医学等领域都有广泛 的应用[辺。截止目前,科学家们已经研究了几种用于传感、成像和工程相关生物应用的 PDA基纳米复合材料⑴]。特别是,由于其良好的生物相容性、内聚性、生物降解性、 金属离子螯合性和简单的合成工艺,PDA被认为是一种理想的药物递送材料厲]。
在本节工作中,我们首次成功合成了可实现高DHA负载率的铁配位空心聚多巴胺 纳米球(DHA@HPDA-Fe)(示意图)。肿瘤细胞中的铁还原酶或其他还原剂可将三价铁 离子进一步还原为亚铁离子,其与DHA相互作用产生细胞毒性ROS,最终有效杀伤肿 瘤细胞。活体治疗实验表明,DHA@HPDA-Fe的抗肿瘤效果是当量游离DHA的3.05 倍,表明我们所提出的纳米药物平台具有肿瘤化疗的应用前景。示意图纳米材料DHA@HPDA-Fe的合成步骤与其抗肿瘤机制的说明。

Scheme 1 Illustration of DHA@HPDA-Fe formation and its anticancermechanism in vivo.
3.2实验部分
3.2.1实验试剂与材料
分析纯的盐酸多巴胺(DA)、六水合氯化铁(FeCb6H2O)、原硅酸四乙酯(TEOS) 和氢氟酸(HF)购买自Aladdin试剂有限公司。双氢青蒿素(DHA)购自J&K科技有 限公司(中国,北京)。钙黄绿素(Calcein AM)、2\ 7「二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA)、碘化丙噪(PI)、3- (4, 5-二甲基卩塞卩坐-2) -2, 5-二苯基四氮卩坐漠盐(卩坐 卩塞蓝,MTT)购自美国Sigma公司。DMEM培养基购买于北京鼎国生物技术公司。分 析级别乙醇和氨水(NH3 H2O, 25 wt%)购买于北京化工有限公司。标准胎牛血清(FBS) 购自天津市康元生物技术制造有限公司。血液生化检测试剂盒从江苏南京建城生物工程 研究所购买。整个实验中使用超纯水(Millipore milliq system)。所有的化学试剂都没有 经过额外的纯化。
3.2.2实验仪器及表征
TEM、SEM、DLS、UV-vis、荧光(FL)、FTIR、XPS、ICP 表征同 221。采用 N? 多层吸附(BET)对材料的比表面积、孔体积进行分析(Micromeritics ASAP 2020,美 国)。细胞图像由激光共聚焦扫描荧光显微镜(CLSM, Leica,德国)拍摄。MTT和小 鼠血液生化分析使用Versamax酶标仪(Bio-Tek,美国)。
3.2.3合成HPDA・Fe纳米球 采用三步法合成了铁配位的空心聚多巴胺纳米球。首先,根据Liu等人的文献合成 SiO2@PDA[35]o典型的实验步骤如下:称取100.0 mg的盐酸多巴胺(DA)溶于乙醇(40 mL)和水(16 mL)的混合溶液中,超声处理10分钟。然后在磁子的剧烈搅拌下缓慢 滴加0.30 mL的正硅酸四乙酯(TEOS),所得溶液继续搅拌10 min以上。接着向烧杯中 加入1 mL氨水溶液(NH3HO, 25 wt%),室温下继续搅拌24 h。最后,将生成的 SiO2@PDA纳米粒子产物离心(10000 rpm, 10 min),弃去上清液,于37°C真空干燥保 存备用。
为了获得中空聚多巴胺(HPDA)纳米粒子,称取25 mg SiO2@PDA溶解于15 mLHF 溶液(1.67wt%)中,刻蚀反应6h。离心收集离子,并用超纯水洗涤3次,得到具有空腔 结构的纳米球HPDA。为了制备Fe配位的HPDA-Fe,将200(1L的FeCh6H2O溶液(2 mg mL1)与5mL的HPDA溶液(1 mg mL1)在Tris缓冲液(pH 8.5 )中搅拌混合5 h。 收集离心和洗涤后的上清液,通过电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)检测 Fe的配位效率。
3.2.4 Fe释放量的测试
将HPDA-Fe纳米球(1 mg mL1,1 mL)溶解于不同磷酸盐缓冲溶液中(PBS, 10 mM, pH 7.4, 6.5, 5.5和4.0),培养不同时间长度(1、4、12、24和48 h)。到时间点后离心 对应试管,取0.5 mL上清液用抗坏血酸(20 mM, 0.5 mL)还原30 min。向混合液中加 入邻-菲咯卩林溶液(0.1%, 1 mL)反应过夜,从而生成红色络合物。使用紫外可见分光 光度计检测混合液在512 nm处的吸光度,并使用Fe的标准曲线定量计算释放出的Fe 离子的含量。
3.2.5负载抗肿瘤药物DHA
为了将DHA装载到HPDA-Fe的空腔中,我们采用了纳米沉淀法㈤。首先将5 mg HPDA-Fe分散在DHA的丙酮溶液(5mL, lmgmL1)中,并在37°C下搅拌5h,直到 大部分溶剂蒸发为止。然后在搅拌状态下缓慢滴加超纯水,并继续搅拌24 h以确保丙酮 溶剂蒸发完全。分别用乙醇和超纯水来洗涤产物。收集所有洗涤过程中产生的上清液用 于测量DHA的负载效率和载药量。通过在55±1°C下与0.2% NaOH水溶液混合加热处 理上清液30 min,以将上清液中的DHA转化为吸收紫外光的化合物,并且通过UV-vis 光谱仪检测288 nm处的吸收值。DHA的负载效率和载药量的计算公式同225。
3.2.6材料中DHA的释放
为了测量DHA@HPDA-Fe在不同pH缓冲液中DHA的释放量,将DHA@HPDA-Fe 纳米球(lmgmlA 1 mL)溶解在 PBS (pH 7.4、6.5、5.5 和 4.0)中,于 37°C下孵育 不同的时间(1、4、12、24和48 h),并通过离心收集上清液。使用与上述相同的方法 测量并定量计算DHA的释放量。
3.2.7细胞的培养
在DMEM培养基中培养HeLa细胞,在1640培养基中培养小鼠成纤维细胞(L929 细胞),培养条件在37°C恒温及含5%CO2的培养箱中。使用0.25% (wt%)的胰蛋白酶 消化并收集细胞,然后重新转移至新鲜培养基中以进行下一次使用及传代。
3.2.8体外细胞毒性测试
使用HeLa细胞和L929细胞通过MTT分析法检测所合成的HPDA-Fe和 DHA@HPDA-Fe纳米球以及游离DHA的细胞毒性。将HeLa细胞和L929细胞接种到 96孔板中(每孔〜5x104个细胞),并在供有5% CO2中的37°C恒温细胞培养箱中培养24 ho然后用200(1L浓度不同的HPDA-Fe、DHA和DHA@HPDA-Fe纳米球溶液(12.5、 25、50、100 和 200(ig mL1 HPDA-Fe 或 DHA@HPDA-Fe;向各孔中分别加入 12、30、 60、119和238(1M的当量DHA的DMEM溶液),继续孵育24 h。在将200(1LMTT溶 液(0.5 mg mL"的PBS溶液)添加到每个孔中前,用PBS小心地洗涤细胞。孵育4 h 后,用1 mL注射器吸出所有PBS溶液,将100(1L二甲基亚砚(DMSO)依次添加到每 个孔中。然后,将板摇动10分钟以完全溶解紫红色的甲膜。用酶标仪测定每个孔在570 nm的吸光度。
DHA@HPDA-Fe对HeLa细胞的化疗作用通过活/死细胞分析实验进一步评估。将 HeLa细胞以每培养皿5xl05个细胞的密度种植到20 mm尺寸的玻璃底培养皿中孵育24 小时。接下来将材料(HPDA-Fe、游离的DHA、DHA@HPDA-Fe)添加到培养皿中, 并在37°C下继续孵育24小时。之后将细胞小心地用PBS洗涤3次,以确保将细胞外物 质洗掉,然后用2 mL含钙黄绿素AM (20 nM)和PI (4(1M)的PBS染色30 min。最 后,将细胞再次用PBS洗涤3次,通过共聚焦激光扫描荧光显微镜(CLSM)成像之前, 再向培养皿中加入1 mL PBSo
3.2.9体外活性氧(ROS)检测
使用2. 7「二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)体外检测ROS的产生。简而言 之,通过将NaOH溶液(10mM, 2mL)与DCFH-DA (500(1L, 1 mM)的乙醇溶液混 合并避光搅拌30 min,然后与PBS (pH 7.4, 10 mM, 10 mL)混合生成DCFHo测试样 品分为 6 组:DCFH、DCFH + FJ+、DCFH + Fe2+> DCFH + DHA、DCFH + DHA + Fe3+ 和 DCFH + DHA + FX十,其中 DCFH、DHA、Fe^和 Fe3+ 的浓度分别为 1、100、100 和 100(1M,反应介质为PBS缓冲液(10mM, pH 5.5)。激发波长为490 nm, Ex/Em狭缝 宽度为3 nmo
3.2.10细胞内ROS的检测
为了检测材料在细胞内产生ROS,我们将HeLa细胞(每个培养皿约5xl05个细胞) 接种到培养皿中,并在培养箱中培养24 ho接着将细胞用2 mL DCFH-DA (在DMEM 中为10(1M)处理30 mine然后将它们小心地用PBS洗涤3次,并在不同的时间分别与 Fe2+> DHA、Fe2+ + DHA> HPDA-Fe 和 DHA@HPDA-Fe 的 DMEM 溶液一起孵育。纯 DMEM中孵育的细胞作对照。通过CLSM在488 nm激发下收集510-560 nm波长的发 射光,对细胞进行荧光成像。成像前,需将培养皿再用PBS洗涤3次,然后在各培养皿 中力口入ImLPBS。
3.2.11细胞内亚铁离子的检测
将HeLa细胞分别与浓度为200 pig mL1的HPDA-Fe和DHA@HPDA-Fe孵育12 h。 接着通过胰蛋白酶消化、收集细胞并离心10分钟(1000rpm),除去各组的上清液。将 细胞重新分散在2 mL含邻-菲咯卩林(0.1%)的PBS中,并用细胞破碎仪超声破碎5 mine 最后将液体离心收集上清液,通过测量其在509 rnn波长下的吸光度定量二价铁离子的 含量。仅使用DMEM培养的细胞作为对照组。
3.2.12活体抗肿瘤研究
所有动物实验均获得吉林大学实验动物中心的批准,所有实验均遵守相关法律和机 构指南。为了进行化学研究,使用40只雌性昆明小鼠(8周)通过在右翼区皮下注射
U14细胞(每100 pL生理盐水约IO。个)来建立异种移植宫颈癌模型。当肿瘤长到约 70mn?时,将荷瘤小鼠随机分为四组(n= 10): (a)对照组(生理盐水),(b) HPDA-Fe,
(c) DHA和(d) DHA@HPDA-Feo然后,每隔一天对小鼠静脉注射(a)盐水,(b) HPDA-Fe, (c) DHA 和(d) DHA@HPDA-Fe,共 15 天。注射剂量为 200(1L 浓度为 1.3 mg kg1 的 DHA, HPDA-Fe 和 DHA@HPDA-Fe 的浓度为 6.0 mg kg"。使用公式(3) 计算肿瘤体积:
肿瘤长度X肿瘤宽度
相对肿瘤体积计算式为V/Vo,其中Vo和V分别是初始和实际测量的肿瘤体积。在 实验的第15天,对所有小鼠实施安乐死,切除肿瘤组织并称重。同时,摘取将(a)和 (d)组小鼠的主要器官(心脏,肝脏,脾脏,肺和肾脏),固定在4%中性福尔马林缓 冲液中,并加工包埋成石蜡块。将主要器官和肿瘤切成4毫米厚的切片,以进行苏木精 和伊红(H&E)染色,然后用数字显微镜(Leica QWin)观察拍照。
3.2.13检测肿瘤组织中ROS的生成
为了验证对肿瘤杀伤的原因来源于材料在其区域内ROS的生成,CLSM捕获了 DCFH-DA染色的肿瘤组织图像。在此过程中,从每组安乐死的小鼠中随机选择切除掉 的肿瘤,并将组织切片与DCFH-DA (lOmM)在37€下孵育30 min,然后用PBS洗涤 3次。通过CLSM用488 nm氮离子激光激发,并通过490-600 nm波段滤光片进行记录, 来检测DCF的荧光。
3.2.14 DHA@HPDA-Fe的组织分布和血液循环
为了获得血液循环数据,将荷瘤小鼠5 = 3)静脉注射DHA@HPDA-Feo在特定 的时间点(10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h禾口 24h)用注射器抽取尾静 脉血,称重并用提取液消化(含60%乙醇的4.8 mM HC1)O通过ICP检测血样中Fe的 含量。
为了进行组织分布研究,在注射DHA@HPDA-Fe 24 h后处死小鼠。收集主要器官 (心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)和肿瘤,并将其分别溶于4.0 mL王水(HNCh: HC1 = 1: 3)中48h。然后,收集上清液,并通过ICP检测每个器官或肿瘤样品中Fe的含量。

3.2.15数据统计分析
数据来自至少三组平行实验得到的平均值及标准偏差(SD)O使用t检验法对两组 进行统计学差异分析。PV0.05被认为具有显著性差异的统计学意义。
3.3结果与讨论
3.3.1 DHA@HPDA-Fe纳米球的合成与表征

图 1. DHA@HPDA-Fe 的制备和表征。所依次制备的 SiO2@PDA>HPDA>HPDA-Fe和 DHA@HPDA-Fe (用红色箭头随机选择的破碎HPDA)的TEM (A-D)和SEM (E-H)图像。(I) HPDA-Fe的暗场 STEM图像以及相应C (红色),N (橙色),O (黄色)和Fe (绿色)元素的EDX映射。(J)所制 备的 HPDA、HPDA-Fe 和 DHA@HPDA-Fe 的 FTIR 光谱。(K) SiO2@PDA 与 HPDA 关于 DHA 和 铁负载效率的比较。
Figure 1. Preparation and characterization of DHA@HPDA-Fe. TEM (A-D) and SEM (E-H) images of
prepared SiC)2@PDA, HPDA, HPDA-Fe, and DHA@HPDA-Fe (a purposely selected broken HPDA with
red arrow). (I) Dark-field STEM image of HPDA-Fe and corresponding EDX elemental mapping for C
(red), N (orange), O (yellow), and Fe (green). (J) FTIR spectra of as prepared HPDA, HDPA-Fe and
DHA@HPDA-Fe. (K) The DHA and Fe loading efficiency ofSiO2@PDA and HPDA.
示意图1展示了 DHA@HPDA-Fe纳米球的制备方法。将TEOS和DA溶解在乙醇 和超纯水的混合溶液中,通过一锅法常温合成了 SiO2@PDA纳米球厲]。SiO2@PDA纳 米球的透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)图像(图1A和E)显示,

每个粒子均具有均匀的球形形态,平均尺寸为-200.8 nmo动态激光散射(DLS)实验显 示SiO2@PDA的水合粒径和Zeta电位分别约为213.2 nm和-40.9 mV (图2A和B)。随 后,将SiO2@PDA纳米球溶解在HF溶液中蚀刻来制造中空的PDA (HPDA),刻蚀后 粒子的平均粒径变化可忽略不计,但最终HPDA的Zeta电位降到-28.5 mV,这可能是 由于HF蚀刻过程中表面基团的质子化(图1B和F)。加入FeCl3-6H2O形成Fe配位的 HPDA-Fe纳米球(图1C和G) [36], Zeta电位从-28.5 mV变为-21.2 mV,表明铁离子已 成功配位到HPDA上,Fe含量通过电感耦合等离子体(ICP)测得为6.05%。

图 2. D.I.水中 SiO2@PDA> HPDA、HPDA-Fe 和 DHA@HPDA-Fe 的流体力学尺寸(A)和 Zeta 电势
(B)o (C)制备的 DHA@HPDA-Fe 在 DMEM、D丄水、PBS、NS (生理盐水)和 FBS (80%)中
的照片。(D) DHA@HPDA-Fe分别在DI.水、PBS、DMEM、NS和FBS中放置五天所测得的流体
力学尺寸。
Figure 2. Hydrodynamic sizes (A) and Zeta potentials (B) of SiCh@PDA, HPDA, HPDA-Fe, and
DHA@HPDA-Fe in D.I. water, respectively. (C) Photographs of as prepared DHA@HPDA-Fe in DMEM,
D.I. water, PBS, NS (saline), and FBS (80%). (D) Hydrodynamic size of DHA@HPDA-Fe in D.I. water,
PBS, DMEM, NS, and FBS for five days.
如X射线光电子能谱(XPS)分析所示(图3A和D), HPDA-Fe纳米球主要由C、
N、O和Fe元素组成:HPDA纳米球没有Fe的2p峰(图3E),但是HPDA-Fe纳米球 的光谱中显示了典型的Fe 2pi/2和2p3/2结合能的峰(图3B)。此外,Fe 2p3/2的结合能在 Fe (III)价态的结合能范围内,这与先前文献的报道一致卩7】。据报道,Fe配位会导致O Is结合能左移朗。实际测得HPDA的O Is带的结合能约为533.5 eV,而与Fe配位后, 其结合能移至约531.6 eV (图3C),表明三价铁离子可以与O键合形成Fe-O-C键阴。
以上结果表明Fe (III)在HPDA表面成功配位。能量色散X射线光谱(EDXS)和暗 场STEM对应的元素映射进一步表明,所有这些元素均存在且均匀分布在纳米球壳上
(图II和图3F)O

图 3. HPDA-Fe (A)和 HPDA (D)纳米球的 XPS 光谱。HPDA-Fe (B)和 HPDA (E)纳米球的 Fe 元素的2p光谱。(C) HPDA和HPDA-Fe的Ols光谱。(F) HPDA-Fe纳米球的能量色散X射线光 谱。
Figure 3. XPS spectrum of HPDA-Fe (A) and HPDA (D) nanospheres. Fe 2p spectrum for HPDA-Fe (B)
and HPDA (E) nanospheres. (C) Ols XPS spectra of HPDA and HPDA-Fe. (F) Energy dispersive X-ray
spectrum of HPDA-Fe nanospheres.
由于具有空腔结构,HPDA-Fe纳米球应成为装载DHA的理想药物输送工具。通过 纳米沉淀法©I,可将DHA装载到HPDA-Fe的腔中。为了确认DHA的成功负载,进行 了傅立叶变换红外(FTIR)分析。如图1J所示,与HPDA相比,DHA@HPDA-Fe纳米 球在800-1200 cm1的范围内显示出新的峰,可以将其归属为来自纯DHA过氧化物 O-O-C结构中的0-0和C-O振动峰。此外,DHA对甲基(-CH3-)(〜2850 cm1)和乙 基(-CH2-)(〜2940 cm1)的强吸收振动峰也表明DHA已成功整合到HPDA-Fe的空腔 中阳。
另外通过测试表明,装载DHA后HPDA-Fe的比表面积从〜89.37 m2 g1减小到〜43.44 m2 g1,平均孔径也从〜53.4 nm减小到〜28.8 nm,这更加表明DHA已成功负载到HPDA 腔中(图4)。根据TEM, SEM和DLS测量(图1D和1H),与HPDA-Fe的尺寸相比, 制备的DHA@HPDA-Fe纳米球的尺寸没有变化(图2A),而由于DHA负载,Zeta电 位略微移至-24.8 mV (图2B)。

图4. HPDA-Fe (A)和DHA@HPDA-Fe (C)的N2吸附-脱附等温线以及HPDA-Fe (B)和
DHA@HPDA-Fe (D)的相应孔径分布。
Figure 4. N2 adsorption-desorption isotherms of HPDA-Fe (A) and DHA@HPDA-Fe (C) collected at 77 K
and the corresponding pore size distribution of HPDA-Fe (B) and DHA@HPDA-Fe (D).
值得一提的是,由于其空心结构,HPDA与PDA相比可以分别负载5.7倍的DHA 和1.3倍的Fe (图1K)O DHA的负载量和负载效率经计算分别为557.8 mg亡和55.78% (图1K,图5和图6)。这结果进一步证明,HPDA在负载更多DHA和Fe量方面显示 出优异的效率。

图5. DHA负载到SiO2@PDA和HPDA后上清液的UV-Vis吸收光谱。
Figure 5. UV-Vis absorption spectrum of DHA after loading to SiO2@PDA and HPDA.
而且,DHA@HPDA-Fe纳米球可以良好地分散在包括去离子水、生理盐水、PBS、
10% FBS和DMEM的溶剂中。经五天混合培养,没有任何可检测到的聚集或尺寸变化, 证明它们在活体应用时可具有理想的稳定性(图2C和D)。
3.3.2pH引发的Fe离子和DHA的释放

图6. (A)通过UV-vis方法定量测量DHA负载效率:290 nm处的吸光度与DHA浓度具有相关性。
(B) 所得标准曲线为j/ = 6.81x +0.00370, A2 = 99.955 (y: 290 nm处的吸光度值;x: DHA的浓度)。
(C) 使用邻-菲咯卩林制成的不同浓度的Fe (III)的紫外可见吸收光谱。(D)得到的标准线性方程为
7=0.00800—0.00936,心 99.827 (尹:512 nm 处的吸光度值;兀:Fe (III)的浓度)。
Figure 6・(A) Quantitative measurement of DHA loading efficiency through UV-vis method. The
absorbance intensity at 290 nm was correlated with the DHA in concentration. (B) The obtained standard
curve isy = 6.81x + 0.00370, R2 = 99.955 (y: absorbance value at 290 nm; x: concentration of DHA). (C)
UV-vis absorbance spectra with different concentrations of Fe (III) by using o-phenanthroline. (D) The
obtain standard linear equation isy= 0.00800x - 0.00936, A2 = 99.827 (y: absorbance value at 512 nm; x:
concentration of Fe (III)).
理想的DDS在正常生理条件下(pH 7.4)应保持稳定,而在肿瘤微酸性环境中可生 物降解。因此,我们研究了在不同pH的PBS缓冲液中DHA@HPDA-Fe纳米球中Fe 和DHA的释放特性(图7),分别代表了正常组织(pH 7.4)的生理环境、肿瘤微酸性 环境(pH 6.5)和肿瘤细胞/溶酶体内(pH 4.0-5.5)的环境肌小。结果表明,在pH 7.4 的情况下,材料在48 h内仅释放了 21.47%和21.58%的Fe和DHA(图8A和B)。然而, 在pH 4.0时,Fe和DHA的释放分别显著增加了 2.28和2.75倍,这与HPDA结构的瓦 解有关。

图7.在特定时间点用不同pH (4.0、5.5、6.5和7.4)的PBS处理后,测试红色络合物在512 nm的 吸收光谱。
Figure 7. The absorbance spectrum of the red complex after certain time points treated with different pH
(4.0, 5.5, 6.5, and 7.4) of PBS, which absorbance was at 512 nm.
据报道,PDA通过与铁离子的配位作用形成稳定的络合物,但在酸性条件下容易发 生部分解离申42]。因此,在酸性环境下,苯环上与Fe配位的两个相邻羟基可能竞争性 地与质子结合,刺激铁离子的释放。HPDA在酸性环境中稳定性较弱可能因此导致其结 构降解。从图8C的TEM图像可以看出,在PBS缓冲液(pH 5.5)中孵育lh后,一些 DHA@HPDA-Fe纳米球解聚,其形状变得不规则。当培养时间延长至24 h时,可以直 观看到纳米载体更明显的瓦解。孵育48h后,几乎所有的纳米球分解了,这直观反映了 微酸性环境中DHA@HPDA-Fe随培养时间的延长其自身的降解过程。这种性能使纳米 复合材料适用于药物的输送和释放。

图&在各种pH微环境下,DHA@HPDA-Fe中的DHA(A)和Fe(B)释放曲线。(C)DHA@HPDA-Fe
在 10 mM (pH 5.5) PBS 中于 37°C 孵育 1、12、24 和 48 h 的 TEM 图像。
Figure 8・ The DHA (A) and Fe (B) release curve from DHA@HPDA-Fe in various pH microenvironment.
(C) TEM images of DHA@HPDA-Fe degeradation in 10 mM (pH 5.5) PBS at 37°C for 1, 12, 24, and 48 h.
3.3.3细胞外和胞内ROS产生的检测10、20、30、40、50和60 min)的荧光光谱强度。
Figure 9・(A-F). Detection of ROS generation in vitro, the fluorescence spectra in each group shows theintensity at different time point (0, 10, 20, 30, 40, 50, and 60 min) with 10 mM PBS buffer (pH 5.5).
释放的铁离子将通过与DHA作用而提高ROS的产生。为了验证该假设,使用经处 理过的DCFH探针在体外检测ROSo ROS可以将其氧化形成具有亮绿色荧光的DCF。 如图9和图10A所示,随着反应时间的延长,DHA+F0组的荧光强度逐渐升高,而单 独DHA、Fe3\ F0或FL+DHA几乎没有变化,表明ROS只能通过DHA与FJ+之间
的反应产生。

图10.在体外和细胞水平检测ROS的产生。(A)体外检测ROS的产生,在lOmMPBS缓冲液(pH 5.5)中不同时间点(0、10、20、30、40、50和60 min)测试各组的荧光强度。(B) CLSM记录了 用DCFH-DA预处理HeLa细胞30 min后的荧光图像,然后分别与Fe2+、DHA或DHA + Fe2+孵育6 ho (比例尺为75 jim) (C)图10B中每组图像的相对荧光强度。(D)在与HPDA-Fe、DHA和 DHA@HPDA-Fe孵育12 h后,用DCF荧光检测到ROS生成,并绘制了相应的曲面表面图。(比例 尺:75屮n)
Figure 10. Detection of ROS generation in vitro and intracellular. (A) Detection of ROS generation in vitro,
the fluorescence intensity was shown from each group at different time point (0, 10, 20, 30, 40, 50, and 60
min) in 10 mM PBS buffer (pH 5.5). (B) Fluorescent images recorded by CLSM for HeLa cells pretreated
with DCFH-DA for 30 min, followed by incubation with Fe2+, DHA, or DHA + Fe2+ for 6 h. (Scale bar 75
|im). (C) Relative fluorescence intensity of each group images in Figure 10B. (D) ROS generation detected
with DCF fluorescence after incubation for 12 h with HPDA-Fe, DHA and DHA@HPDA-Fe and
corresponding surface plot images. (Scale bar: 75 |im).
之后,使用CLSM应用DCFH-DA探针检测HeLa细胞通过亚铁离子与DHA相互 作用,确认可在细胞内产生ROS。可以看出仅将HeLa细胞与亚铁禺子一起孵育后,几 乎未在细胞质中观察到DCF的绿色荧光,这表明细胞内自身的ROS水平可忽略(图10B)。 用游离DHA处理后,细胞中的ROS含量略有增加,这可能是由于一些细胞内原生亚铁 离子所致。相反,将细胞与亚铁离子和DHA共培养后,HeLa细胞中DCF的平均荧光 强度显著增强(比游离DHA组高3.1倍),这证明了源自亚铁离子与DHA之间的相互 作用爆发产生ROS (图10C)o从图11中的图像可以看出,将细胞与FJ+和DHA同时 孵育6 h后,荧光强度最高。从用F0和DHA处理细胞的明场图像中可以看出,当孵 育时间增加到24h时,HeLa细胞开始皱缩,这可能是产生的ROS引起细胞凋亡所致。

Figure 11. The CLSM images of DCFH at different time point in 24 h incubating with Fe2+ (24 |1M) and
DHA (120 |1M) which concentrations are equivalent with 100 jig mL 1 DHA@HPDA-Fe, DCFH group
served as control. (Scale bar: 75 |im).
接着,我们研究了所制备的DHA@HPDA-Fe是否在被肿瘤细胞内吞后能产生ROS。 如图12所示,将细胞与DHA@HPDA-Fe共孵育12h后,可以观察到最亮的绿色荧光,
2 h 6h 12 h 24 h
这来源于DCFH的氧化。而依次用DCFH和HPDA-Fe纳米球处理或仅用DCFH处理的 细胞中几乎没有观察到绿色荧光,这表明DHA和铁离子的共同递送对于产生ROS是必 需的,而单独递送铁离子或DHA无法产生足够的ROS。实验结果表明,随着孵育时间 延长至24 h, DCF荧光强度逐渐减弱,表明ROS的产生已经完成,伴随着诱导肿瘤细 胞凋亡(图12)o
图12. Hela细胞与100 jigmL1 DHA @ HPDA-Fe孵育不同时间点(2、6、12和24 h)的DCFH的
CLSM图像,以DCFH组作为对照。(比例尺:75 pirn)
Figure 12. The CLSM images of DCFH incubating with 100 jig mL 1 DHA@HPDA-Fe at different time
point (2, 6, 12, and 24 h), DCFH group served as control. (Scale bar: 75 |im).
由于FL在HPDA的表面上具有配位作用,因此我们推断递送至肿瘤细胞内的Fe3+ 可以被细胞中的铁还原酶和/或其他还原剂还原为Fe2+,进而与DHA相互作用产生具有 细胞毒性的ROS。为了证明肿瘤细胞中的HPDA-Fe和DHA @ HPDA-Fe可被还原为F0, 我们对有无材料处理的HeLa细胞中F0的浓度进行了比较测试。

图13.检测Hela细胞中亚铁禺子的浓度。(A)用邻-菲咯卩林处理后各组细胞上清液的UV-vis吸收光
谱。(插图:每组相应的样本照片)。(B)分别用DMEM、HPDA-Fe和DHA@HPDA-Fe处理后的细
胞中Fe?+的相对含量。
Figure 13. Detection the increasing concentration of ferrous ions in Hela cells. (A) The UV-vis absorbance spectrum of the cells supernatant of each group after treated with o-phenanthroline. Inset: a corresponding 61
samples photograph of each group). (B) The relative concentrations of Fe2+ in the cells after they were treated with DMEM, HPDA-Fe and DHA@HPDA-Fe, respectively.
从图13可以看出,用DMEM处理的HeLa细胞(控制组)显示出固有的低浓度亚 铁离子。然而将细胞与HPDA-Fe和DHA@HPDA-Fe孵育12 h后,细胞中的FJ+浓度 显著增加。如插图所示,使用邻菲咯卩林溶液作为指示剂(EP管中上清液的颜色)直观 地反映了经过材料处理后细胞内亚铁离子数量的增加,表明材料中的铁离子可以成功地 在肿瘤细胞中还原为亚铁离子。此外,我们可以发现,DHA@HPDA-Fe组中的亚铁离 子浓度低于HPDA-Fe组中的亚铁离子浓度,这可能是由于DHA消耗其以产生ROS。
3.3.4体外抗肿瘤效果测试
众所周知,DDS的细胞毒性是对其在生物体内能否应用的关键评价因素。为了评估 我们材料的生物相容性和细胞毒性,首先进行了 MTT分析。正如我们预期的那样, HPDA-Fe纳米球对HeLa和L929细胞系产生的细胞毒性是微不足道的,即使在孵育时 间为24 h且材料浓度高达200(ig mL1时也是如此。然而,当负载DHA后,与用当量 的游离DHA处理的细胞相比,我们所制备的DHA@HPDA-Fe显示出增强的细胞毒性 效果(图14A)。在100(ig mL1或更高浓度下,DHA@HPDA-Fe所处理的HeLa细胞存 活率显著降低至约27.09%,这是由于ROS水平升高导致肿瘤细胞致死率的增加。但是 在相同浓度材料作用下,L929细胞的细胞存活率(图14B)仍保持80%,甚至在材料 浓度高达200(ig mL1,细胞也保持78.87%的存活率,这些数据表明材料对肿瘤细胞的 选择性治疗。由于与癌细胞相比,像L929细胞这样的正常细胞的内环境表现出中性pH, 并且相对肿瘤细胞其胞内还原酶和其他还原剂(例如谷胱甘肽)的含量更低[43'45], DHA 的释放和FJ+离子的产生将受到显著性抑制,从而大大降低了 ROS的产生。值得注意 的是,随着浓度的升高,游离DHA对正常细胞表现出明显的细胞毒性,这明显高于当 量DHA时DHA@HPDA-Fe的毒性,进一步证明了 DHA@HPDA-Fe的选择性细胞毒性 作用,而游离DHA则具有潜在暗毒性。

14.细胞水平考察材料的抗肿瘤效率。在HeLa细胞系(A)和L929细胞系(B)上不同浓度的
HPDA-Fe、游离 DHA 和 DHA@HPDA-Fe 的细胞存活率。(c [HPDA-Fe] = 10、25、50、100 和 200 jig
mL1, c [DHA] = 12、30、60、119 和 238 |1M, c [DHA @ HPDA-Fe] = 10、25、50、100 和 200 pig mL1,
平均值士sem, n = 6,NS(无显着性差异),p>0.05, *P<0.05, **P<0.01, ***P 0.001)。(C)DMEM、
HPDA-Fe> DHA或DHA@HPDA-Fe孵育的Hela细胞激光共聚焦荧光图像24 h。活/死染色显示死
细胞为红色,活细胞为绿色。(比例尺:75 |im)
Figure 14. In vitro antitumor efficiency. Cell viability of HPDA-Fe, free DHA and DHA@HPDA-Fe at
various concentrations on HeLa cell lines (A), and L929 cell lines (B). (c [HPDA-Fe] =10, 25, 50, 100, and
200 jig mL1, c [DHA] = 12, 30, 60, 119, and 238 piM, and c [DHA@HPDA-Fe] =10, 25, 50, 100, and 200
gg mL_1, mean 士 sem., n = 6, NS (no significant difference), p > 0.05, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
(C) Confocal fluorescence images of DMEM, HPDA-Fe, DHA or DHA@HPDA-Fe-incubated Hela cells
for 24 h. Live/dead stain shows dead cells as red and viable cells as green (Scale bar: 75 |im).
我们进行了钙黄绿素AM和碘化丙锭(PI)的共染色实验,以通过反射绿色/红色荧 光直观地对活/死细胞进行分类。图14C显示,在对照组和HPDA组中几乎所有的HeLa
细胞都被绿色荧光染色。相比之下,游禺DHA组中的一些细胞被染成红色,表明它们 正处于凋亡状态。毫不奇怪,与DHA@HPDA-Fe (100 pig mL1)孵育后,大多数细胞 死亡,呈皱缩小球形。这些结果与MTT分析相符,进一步证实了我们的材料对肿瘤细 胞的高死亡率是来源于细胞毒性ROS的产生。
3.3.5小鼠活体肿瘤抑制效率和毒性评估
由于材料在细胞水平表现岀良好的选择性杀伤效果,我们进一步详细研究了材料在 活体水平抗肿瘤治疗的有效性。将荷瘤小鼠随机分为四组(n = 10),即作为对照组的 生理盐水组、HPDA-Fe组、游离DHA组和DHA@HPDA-Fe组。每隔一天给所有治疗 组给予相等浓度的DHA或HPDA-Feo当肿瘤大小达至(J〜70 mn?时,通过尾静脉注射特 定的治疗药物。在第15天治疗后,每组小鼠及其肿瘤的照片如图15A和B所示。每隔 一天用卡尺测量相对肿瘤体积(V/Vo)作为时间的函数。

图15.通过化学疗法的活体肿瘤抑制效率实验。(A)实验治疗后第15天,从不同小鼠组切除的肿瘤。
(B)在治疗后第15天从每组中随机选择的小鼠的照片。(C)各组小鼠肿瘤相对体积的变化。(D) 在不同组治疗后15天解剖小鼠肿瘤组织的重量。(E) 15天实验内不同组中小鼠的体重变化。(F) 在静脉注射DHA@HPDA-Fe后,DHA@HPDA-Fe在雌性昆明小鼠体内的药代动力学概况。(G)不 同组处理后肿瘤切片的H&E染色:生理盐水(对照)、HPDA-Fe、游离DHA和DHA@HPDA-Fe。 比例尺:100 jimo (H)是否使用DHA@HPDA-Fe处理的小鼠主要器官的H&E染色图片。比例尺:
100 Limo 数据表示为平均值士SD (n= 10)o *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。
Figure 15. In vivo tumor inhibition efficiency by chemotherapy. (A) Excised tumors from different mice
groups at 15th day after experimental treatments. (B) Photograph of mice selected from each group
randomly at 15th day after treatment. (C) Tumor inhibition ratio of the corresponding group. (D) Weights of
dissected tumor tissues 15 days after the different treatment. (E) Body weight changes of mice in different
groups in 15 days. (F) Pharmacokinetics profiles of DHA@HPDA-Fe in female Kunming mice after
intravenous injection of DHA@HPDA-Fe. (G) H&E staining of tumor slices after different treatments:
saline (control), HPDA-Fe, free DHA and DHA@HPDA-Fe. Scale bar: 100 屮n. (H) H&E staining of main
organs from mice treated with or without DHA@HPDA-Fe. Scale bar: 100 |im. Data are expressed as mean
± SD (n = 10). *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.
如所预期的,从图15C可以观察到仅用盐水或HPDA-Fe溶液处理的小鼠肿瘤体积 迅速增长。与上述控制组相对比,游离DHA治疗组的小鼠肿瘤仅轻微抑制了生长,表 明其抑制肿瘤生长的效果较差。与之形成鲜明对比的是,DHA@HPDA-Fe治疗的小鼠 的肿瘤生长得到了显著抑制,而没有观察到复发。治疗15天后,对照组和游离DHA组 的平均相对肿瘤体积是DHA@HPDA-Fe组的&81倍和4.92倍,表明对照组相比 DHA@HPDA-Fe组的肿瘤具有明显抑制作用,抑制率计算约为88.7%o此外, DHA@HPDA-Fe组的肿瘤重量比其他组小得多(图15D)。在整个实验期间,所有小鼠 的体重均未表现岀任何明显变化(图15E)。
Control HPDA-Fe DHA DHA@ HPDA-Fe

图16.分别使用生理盐水、HPDA-Fe>游离DHA和DHA@HPDA-Fe处理小鼠之后,DCFH-DA染
色小鼠的肿瘤切片来表征ROS的产生。比例尺二600 |im0
Figure 16. ROS stained tumor slices of the mice after the treatment of saline, HPDA-Fe, free DHA, and
DHA@HPDA-Fe, respectively. Scale bar = 600 屮n.
为了进一步证明肿瘤细胞被破坏的原因来自ROS的爆发,我们使用CLSM对肿瘤 组织切片的DCF荧光进行了表征。如图16所示,对照组和HPDA-Fe治疗组的荧光强 度可忽略,表明这些组肿瘤中的ROS含量相对较低。同时,DHA治疗的肿瘤中DCF 的荧光略有增强,这可能是由于DHA与细胞内亚铁离子之间的反应产生了 ROS。令人 兴奋的是,DHA@HPDA-Fe组的肿瘤切片显示出更强的荧光,这是由于DHA和Fe共 同递送至肿瘤部位及其反应产生ROS所致。因此,可以通过细胞毒性ROS有效杀死肿 瘤细胞。

图17.小鼠静脉注射后24 h,通过ICP测定Fe禺子含量来评估DHA@HPDA-Fe纳米球在主要器官 和肿瘤组织中的生物分布。
Figure 17. Biodistribution of DHA@HPDA-Fe nanospheres in major organs and tumor tissues at 24 h post
intravenous injection evaluated by the content of Fe ions measuring with ICP.
我们还测量了 DHA@HPDA-Fe在小鼠主要器官中的生物分布和血液循环。如图17 所示,由Fe相对含量测算大多数纳米球分布在网状内皮系统中,例如小鼠的肝脏和脾 脏,且材料由于EPR效应而在肿瘤中积累。DHA@HPDA-Fe纳米球的血液循环半衰期 为2.10 h(图15F),这表明大多数异质纳米球可能通过网状内皮系统清除,最重要的是, DHA@HPDA-Fe可以用作有效抑制肿瘤生长的理想DDS。
u ' ・ u 1 1 Control DHA@H PDA-^Fe
Control DHA@HPDA-Fe Control DHA@HPDA^Fe
OOM
Control DHA@HPDA.Fe Control DHA@HPDA>Fe Control DHA@HPDA-Fe
图1&健康小鼠(对照)与DHA@HPDA-Fe纳米球治疗小鼠的血液生化分析。结果显示天冬氨酸转 氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、AST/ALT比值、总蛋白(TP)、肌酹(CRE)和血尿素氮(BUN) 的平均值和标准差。
Figure 1& Blood biochemistry analysis of healthy mice (Control) or mice treated with DHA@HPDA-Fe
nanospheres. The results showed the mean and standard deviations of aspartate aminotransferase (AST),
alanine aminotransferase (ALT), AST/ALT ratio, total protein (TP), creatinine (CRE) and blood urea
nitrogen (BUN).
处死小鼠后,我们将每组小鼠的肿瘤切成切片进行苏木精和伊红(H&E)免疫染色 实验,以确认不同治疗方法的抗癌疗效。如图15G所示,与游离DHA组相比,在 DHA@HPDA-Fe组图片中可以观察到更严重的细胞凋亡或死亡,表现为具有细胞核皱 缩的特征,而用盐水或HPDA-Fe处理的细胞在很大程度上保持了其正常形态。另外, 用DHA@HPDA-Fe和盐水处理的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的主要器官同样 进行了 H&E染色。从图15H可以推断,实验组小鼠的主要器官没有明显的组织病理学 异常,这进一步证实了 DHA@HPDA-Fe在体内的生物相容性和低副作用。同时我们也 通过血液生化实验测试了实验组与控制组小鼠的肝和肾功能(图18)。结果表明,正常 小鼠和DHA@HPDA-Fe给药小鼠之间血液生化指标没有明显差异。因此可以得出结论, DHA@HPDA-Fe纳米球具有良好的生物相容性,也表明其在活体上应用的可行性。
3.4小结
综上所述,我们在温和的条件下成功制备了具有生物相容性和可生物降解性的 DHA@HPDA-Fe纳米球用于抗癌治疗。由于中空聚多巴胺具有良好的分散性、低细胞 毒性、良好的铁离子螯合能力和较高的载药量,因此适合与Fe离子配位并负载DHA从 而用于肿瘤治疗的生物医学应用。在酸性肿瘤微环境下,螯合的铁离子会被相关Fe还 原酶和还原剂还原为亚铁离子,然后活化DHA产生自由基,同时发生材料降解,从而 显示出其选择性。体外研究表明,DHA@HPDA-Fe通过产生ROS导致癌细胞的明显死 亡。活体实验结果进一步表明,与游离DHA相比DHA@HPDA-Fe纳米球的抗肿瘤作 用显著增强。此外,活体毒性评估实验以及血液生化分析表明,在治疗组和未治疗组的 小鼠之间没有明显的组织学改变。基于以上所有内容,我们认为实用的中空纳米复合材 料不仅可以为肿瘤治疗提供一种方法,而且可以为其他临床和生物医学应用提供启发。
参考文献
[1]R. W. Johnstone, A. A. Ruefli and S. W. Lowe, Cell [J], 2002,108, 153-164.
[2]C.-H. Heldin, K. Rubin, K. Pietras and A. Ostman, Nat. Rev. Cancer [J], 2004, 4, 806-813.
[3]B. Herranz-Blanco, D. Liu, E. Makila, M. A. Shahbazi, E. Ginestar, H. Zhang, V. Aseyev, V. Balasubramanian, J. Salonen, J. Hirvonen and H. A. Santos, Adv. Fund. Mater. [J], 2015, 25, 1488-1497.
[4]Y. Tu, Ange^v. Chem. Int. Ed. [J], 2016, 55, 10210-10226.
[5]Y. Tu, Nat. Med. [J], 2011, 17, 1217-1220.
[6]J. Wang, C. Xu, F. L. Liao, T. Jiang, S. Krishna and Y. Tu, N. Engl. J. Med. [J], 2019, 380, 2087-2089.
[7]D. Chaturvedi, A. Go swami, P. P. Saikia, N. C. Barua and P. G. Rao, Chem. Soc. Rev. [J], 2010, 39, 435-454.
[8]S. Krishna, L. Bustamante, R. K. Haynes and H. M. Staines, Trends Pharmacol. Sci. [J], 2008, 29, 520-527.
[9]D.L. Klayman, Science [J], 1985, 228, 1049-1055.
[10]R. K. Haynes, W. C. Chan, C. M. Lung, A. C. Uhlemann, U. Eckstein, D. Taramelli, S. Parapini, D.
Monti and S. Krishna, ChemMedChem [J], 2007, 2, 1480-1497.
[11]H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura and K. Hori, J. Controlled Release, 2000, 65, 271-284.
[12]R. K. Haynes and S. C. Vonwiller, Tetrahedron Lett. [J], 1996, 37, 253-256.
[13]R. K. Haynes, H. H. O. Pai and A. Voerste, Tetrahedron Lett. [J], 1999, 40, 4715-471 &
[14]T. A. Rouault, Nat. Chem. Biol. [J], 2006, 2, 406-414.
[15]T. M. Allen and P. R. Cullis, Science [J], 2004, 303, 1818-1822.
[16]C. Peng, J. Xu, M. Yu, X. Ning, Y. Huang, B. Du, E. Hernandez, P. Kapur, J. T. Hsieh and J. Zheng, Angew Chem. Int. Ed. [J], 2019, 5& 8479-8483.
[17]C. Liu, H. Qin, L. Kang, Z. Chen, H. Wang, H. Qiu, J. Ren and X. Qu, J. Mater. Chem. B [J], 2018, 6, 7908-7915.
[18]J. Liu, X. Zheng, L. Yan, L. Zhou, G. Tian, W. Yin, L. Wang, Y. Liu,乙 Hu,乙 Gu, C. Chen and Y. Zhao, ACS Nano [J], 2015, 9, 696-707.
[19]W. Wang, D. Cheng, F. Gong, X. Miao and X. Shuai, Adv. Mater. [J], 2012, 24, 115-120.
[20]K. Yang, L. Feng, X. Shi and Z. Liu, Chem. Soc. Rev. [J], 2013, 42, 530-547.
[21]H. Liu, T. Liu, X. Wu, L. Li, L. Tan, D. Chen and F. Tang, Adv. Mater. [J], 2012, 24, 755-761.
[22]J. Bai, X. Jia, W. Zhen, W. Cheng and X. Jiang, J. Am. Chem. Soc. [J], 2018,140, 106-109.
[23]V. Biju, Chem. Soc. Rev. [J], 2014, 43, 744-764.
[24]L. Cheng, C. Wang, L. Feng, K. Yang and Z. Liu, Chem. Rev. [J], 2014,114, 10869-10939.
[25]D. Peer, J. M. Karp, S. Hong, O. C. Farokhzad, R. Margalit and R. Langer, Nat. Nanotechnol. [J], 2007, 2,751.
[26]E. K. Lim, T. Kim, S. Paik, S. Haam, Y. M. Huh and K. Lee, Chem. Rev. [J], 2015,115, 327-394.
[27]J. Chen,乙 Guo, H. B. Wang, J. J. Zhou, W. J. Zhang and Q. W. Chen, Biomaterials [J], 2014, 35, 6498-6507.
[28]H. Zhang, L. Hou, X. Jiao, Y. Ji, X. Zhu and 乙 Zhang, Biomaterials [J], 2015, 37, 353-366.
[29]L. Liu, Y. Wei, S. Zhai, Q. Chen and D. Xing, Biomaterials [J], 2015, 62, 35-46.
[30]D. Wang, J. Zhou, R. Chen, R. Shi, C. Wang, J. Lu, G. Zhao, G. Xia, S. Zhou,乙 Liu, H. Wang,乙 Guo and Q. Chen, Chem. Mater. [J], 2017, 29, 3477-3489.
[31]D. Wang, J. Zhou, R. Chen, R. Shi, G. Xia, S. Zhou,乙 Liu, N. Zhang, H. Wang,乙 Guo and Q. Chen, Biomaterials [J], 2016, 107, 88-101.
[32]Y. Liu, K. Ai and L. Lu, Chem. Rev. [J], 2014, 114, 5057-5115.
[33]M. Liu, G. Zeng, K. Wang, Q. Wan, L. Tao, X. Zhang and Y. Wei, Nanoscale [J], 2016, & 16819-16840.
[34]X. Zhou, T. L. Chang, S. Chen, T. Liu, H. Wang and J. F. Liang, Mol. Pharm. [J], 2019, 16, 2511-2521.
[35]G. Li, J. Li, Z. Zhou, C. Li, C. Cai, B. Guo, R. D. Priestley, L. Han and R. Liu, Dalton Trans. [J], 2017, 46, 16419-16425.
[36]D. Hu, C. Liu, L. Song, H. Cui, G. Gao, P. Liu,乙 Sheng and L. Cai, Nanoscale [J], 2016, & 17150-1715 &
[37]乙 Ma, M. Zhang, X. Jia, J. Bai, Y. Ruan, C. Wang, X. Sun and X. Jiang, Small [J], 2016, 12, 5477-5487.
[38]S. Kim, T. Gim and S. M. Kang, Prog. Org. Coat. [J], 2014, 77, 1336-1339.
[39]K. Y. Ju, J. W. Lee, G. H. Im, S. Lee, J. Pyo, S. B. Park, J. H. Lee and J. K. Lee, Biomacromolecules [J], 2013, 14, 3491-3497.
[40]L. Palanikumar, M. T. Jeena, K. Kim, J. Yong Oh, C. Kim, M. H. Park and J. H. Ryu, Sci. Rep. [J],
2017, 7, 46540.
[41]L. Zhang, Y. Wang, Y. Yang, Y. Liu, S. Ruan, Q. Zhang, X. Tai, J. Chen, T. Xia, Y. Qiu, H. Gao and Q. He, ACS Appl. Mater. Interfaces [J], 2015, 7, 9691-9701.
[42]J. Han, W. Park, S. J. Park and K. Na, ACS Appl. Mater. Interfaces [J], 2016, & 7739-7747.
[43]Y. Ruan, X. Jia, C. Wang, W. Zhen and X. Jiang, ACS Biomater. Sci. Eng. [J], 2019, 5, 1016-1022.
[44]T. Hirayama, H. Tsuboi, M. Niwa, A. Miki, S. Kadota, Y. Ikeshita, K. Okuda and H. Nagasawa, Chem. Sci. [J], 2017, & 4858-4866.
[45]B. Feng, F. Zhou, B. Hou, D. Wang, T. Wang, Y. Fu, Y. Ma, H. Yu and Y. Li, Adv. Mater. [J], 2018, 30, 1803001-1803010.
第四章构建二氧化锚涂层包覆的空心聚多巴胺纳米球载药体系
用于癌症有效诊疗
摘要:根据前人报道DHA可以与Mn2+反应可生成更多活性氧自由基,从而引起肿瘤细 胞的生长抑制和增强细胞凋亡。在此,我们合成了具有良好生物相容性且高效性的基于 二氧化猛纳米涂层包覆的中空聚多巴胺纳米球用于肿瘤治疗。DHA载入HPDA的空腔 内,形成最终的纳米药物DHA@HPDA@MnO2 □作为一种独特的纳米平台, DHA@HPDA@MnO2在到达肿瘤部位后显示出DHA和Mi?+的可生物降解和可控释放 的性质。值得一提的是,被还原的Mn2+进一步与DHA作用,产生具有细胞毒性的活性 氧(ROS),有效地破坏细胞内蛋白质和核酸,从而诱导肿瘤细胞死亡。更重要的是, 从MnO2中还原出来的Mi?+具有肿瘤微环境响应而选择性进行体内磁共振成像的能力。 体外和活体治疗实验表明,DHA@HPDA@MnO2的肿瘤抑制作用比游离DHA更有效, 且副作用可忽略不计,这为纳米药物平台在肿瘤化学疗法中的应用提供了一种方案。
关键词:DHA、GSH、ROS、MnO2>中空结构、聚多巴胺、肿瘤治疗
4.1引言
癌症是当今人类死亡的主要原因之一。由于衰老以及致癌风险的日趋上升丄2],全 球癌症疾病在很大程度上继续增加。随着科学技术的发展,已经出现了各种癌症疗法, 包括一些新兴的癌症疗法以治疗这种严重疾病®6】。在各种疗法中,由于其疗效高,传 统化学疗法被认为是临床中不可缺少的候选方案⑺。尽管化疗方案可行,由于它严重的 副作用、生理和精神上的痛苦,高昂的价格或对多种药物的耐药性阻碍了化疗疗效。例 如,阿霉素(DOX)表现出严重的心脏毒性,可在一定程度上诱发充血性心力衰竭和心 肌病,其他药物则可能引起神经毒性或肾毒性。因此,迫切需要开发具有弱副作用的化 学疗法新药MH。
与化学合成药物不同,从草药中提取的天然药物通常显示出对生物体较弱的毒副作 用[12]。诺贝尔奖获得者屠呦呦教授于1972年发现青蒿素(ART)并将其用来治疗疟疾[⑶, 近期她提出了新的治疗计划以控制现有的抗药性[14】。双氢青蒿素(DHA)是青蒿素的半 合成衍生物和活性代谢产物,它显示岀许多优势,例如原料分布广泛,新陈代谢速度快 以及毒性较低[回。值得一提的是,DHA已被证实可以杀死肿瘤细胞。通过与亚铁离子 相互作用产生具有细胞毒性的活性氧自由基(ROS)来诱导细胞凋亡[⑹。据文献报道, 诱导细胞凋亡的原因包括诱导脂质氧化、膜和蛋白质损坏以及细胞核破坏2,18]。然而, 癌细胞中铁的含量不足以使其与DHA反应产生大量的活性氧自由基[19]。另一个关键问 题是DHA的水溶性差,造成其在人体中随意分布但肿瘤组织区域富集量低㈤]。
为了解决上述问题,研究人员合理设计了新型基于纳米材料的药物递送系统(DDS) BQ],可以将药物掺入并封装到纳米载体中,用作化学治疗剂以解决抗癌效果差的难题。 例如研究人员提出了具有生物活性的MIL-100 (Fe)纳米金属有机框架(nMOFs) [24], 介孔二氧化硅㈤,多孔磁铁矿颗粒a】和梭形FeOOH[27]已经用于ART或DHA负载的铁 介导的癌症治疗方法。然而,转铁蛋白(Tf)接枝的Tf-C60/GO来提供Fe的DDS表明 铁离子介导不是促进ART在临床上应用的最佳方法[殂29]。
随后,陈等人首次有力地报道了活性代谢物在碳酸氢根离子存在下DHA与Mn2+ 反应生成更多自由基所引起的生长抑制和增强细胞凋亡,与FJ+相比具有更高的抗肿瘤 效率,因此他们设计了 Fe3O4@MnSiO3-FA纳米药物并将疏水性ART传递到小鼠的肿瘤 模型中㈤]。美中不足的是,据报道计算得出的ART的负载量为219 mg g1,这仍然需要 通过开发其他载体来提高药物负载量。
聚多巴胺(PDA)是一种新兴的软物质,其已被证明是贻贝衍生物中的重要组成部 分。迄今为止,已经报道了基于PDA的多种类型的纳米复合材料“巩 它们的应用也 得到了广泛介绍,并且在能源、环境和生物医学等领域的中也引起科学家们的极大兴趣 8 34]。例如通过模板法去除二氧化硅纳米颗粒,可以获得空心PDA基(HPDA)纳米 球,由于其优异的特性:出色的生物相容性、生物可降解性、内聚性、金属离子螯合性 能好、合成工艺简单等,可将其用作化学药品的载体[35'38]o
受以上这些优点的启发,本工作首次制备了具有高效生物相容性的基于外层包覆二 氧化猛的中空聚多巴胺纳米球(HPDA@MnO2)载体用于肿瘤诊断和治疗。将DHA加 载到HPDA的空腔中,形成化学治疗剂DHA@HPDA@MnO2 (示意图1)。作为一种独 特的纳米平台,DHA@HPDA@MnO2在到达肿瘤部位后显示DHA和Mn离子的可生物 降解且可控制的pH响应性释放。值得一提的是,所制备的材料在细胞内显示出MnO2 消耗GSH的能力,因此削弱了癌细胞的抗氧化能力并增加了氧化应激。还原的Mi?+可 以与DHA相互作用,产生具有细胞毒性的活性氧(ROS),从而有效诱导肿瘤细胞死亡。 考虑到由于肿瘤微环境诱导Mn2+释放,含MnCh的纳米粒子经常被用作磁共振成像(MRI) 造影剂,因此我们还探索了纳米球的MRI性能,并检测到了令人满意的T1图像信号。 此外,体外细胞和活体治疗实验表明,与游离DHA相比,DHA@HPDA@MnO2对肿瘤 的抑制作用大大增强,且副作用可忽略不计,平均肿瘤抑制率经计算约为83.34%,从 而赋予了所提出的DHA@HPDA@MnO2纳米平台在肿瘤化疗中具有广阔的医学应用前 景。

示意图.纳米材料DHA@HPDA@MnO2在细胞水平的抗肿瘤机制说明。

Scheme. Illustration of DHA@HPDA@MnO2 formation and it anticancer mechanism intracellular.
4.2实验部分
4.2.1实验试剂与材料
分析纯的盐酸多巴胺(DA)、高猛酸钾(KMnCU)、四水合氯化猛(MnCbHO)、 碳酸氢钠(NaHCCh)、原硅酸四乙酯(TEOS)、硫酸(H2SO4)和氢氟酸(HF)购买自 Aladdin试剂有限公司。双氢青蒿素(DHA)购自J&K科技有限公司(中国,北京)。 N-乙酰半胱氨酸、钙黄绿素(CalceinAM).2\7,-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA). 碘化丙噪(PI)、3- (4, 5-二甲基卩塞卩坐-2) -2, 5-二苯基四氮卩坐漠盐(卩坐卩塞蓝,MTT)购 自美国Sigma公司。DMEM培养基购买于北京鼎国生物技术公司。分析级别5, 5「二 硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、乙醇和氨水(NH3・H2O, 25 wt%)购买于北京化工 有限公司。标准胎牛血清(FBS)购自天津市康元生物技术制造有限公司。血液生化检 测试剂盒从江苏南京建城生物工程研究所购买。整个实验中使用超纯水(Millipore milliq system)o所有的化学试剂都没有经过额外的纯化。
4.2.2实验仪器与设备
TEM、SEM、DLS、UV-vis、荧光(FL)、FTIR、XPS、ICP 等表征同 322。超声 波细胞粉碎仪(JY92-IIN)购买自宁波新芝生物科技有限公司。
4.2.3合成中空HPDA纳米球
通过如下步骤合成直径约200 nm的单分散空心聚多巴胺(HPDA)纳米球。首先, 用Liu课题组报道[均的方法制备SiO2@PDAo简而言之,将盐酸多巴胺(100.0 mg)溶 解在乙醇(40 mL)和水(16 mL)的混合溶液中,超声处理10 min。接着,在剧烈搅 拌下将0.30 mL原硅酸四乙酯(TEOS)缓慢滴加到混合溶液中。将所得体系连续搅拌 20 mine然后,加入1 mL氨水溶液25 wt%)。将混合物在室温下搅拌24 h。 通过离心(10000 rpm)方法收集产物SiO2@PDA,并在37°C下真空干燥12 h。为了获 得中空聚多巴胺(HPDA),将50 mg SiO2@PDA通过15 mL HF溶液(1.67wt%)重新 溶解并蚀刻6 h,最后,通过离心收集并用去离子水洗涤3次后,获得HPDA中空纳米 球。
4.2.4合成 DHA@HPDA
为了将DHA装载到HPDA的空腔中,我们采用了经过改良的纳米沉淀法QI。首先 将5 mg HPDA分散在DHA的丙酮溶液(5mL, 1 mg mL1)中,并在37°C下搅拌5h, 直到大部分溶剂蒸发为止。然后在搅拌状态下缓慢滴加超纯水,并继续搅拌24 h以确保 丙酮溶剂蒸发完全。分别用乙醇和超纯水来洗涤产物。收集所有洗涤过程中产生的上清 液用于测量DHA的负载效率和载药量。通过在55 士 1°C下与0.2%NaOH水溶液混合加 热处理上清液30 min,以将上清液中的DHA转化为吸收紫外光的化合物,并且通过 UV-vis光谱仪检测288 nm处的吸收值。DHA的负载效率和载药量计算公式同225。
4.2.5合成 DHA@HPDA@MnO2 纳米球
为了制备DHA@HPDA@MnO2,将20 mL KMnO4溶液(3 mM)与 5 mL DHA@HPDA 水溶液(lmgmL-i)充分混合。然后在剧烈搅拌下逐滴加入50 piLH2SO4 (ImM)从而 获得 DHA@ HPDA@MnO2o DHA@ HPDA@MnO2 的猛含量通过 ICP-AES 测定。 HPDA@MnO2由相同的试剂材料合成,没有添加DHA作为对照。
4.2.6对酸性环境引发的Mn释放的定量检测
将DHA@HPDA@MnO2纳米球(0.5 mg mL1)溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)(10 mM, pH 7.4、6.5和5.5)中,并在37°C下孵育不同的时间(12 h、24 h和48h)。在特定的培 养时间,将混合液离心,然后收集上清液。Mn的释放量可通过ICP定量计算。
4.2.7对酸性环境引发的DHA释放的定量检测
为了测量DHA@HPDA@MnO2在不同pH缓冲液中DHA的释放量,将 DHA@HPDA@MnO2 纳米球(lmgmL", 1 mL)溶解在 PBS (pH 7.4、6.5 和 5.5)中, 于37°C下孵育不同的时间(1、4、12、24和48 h),并通过离心收集上清液。使用与上 述相同的方法测量并定量计算DHA的释放量。
4.2.8体外测试HPDA@MnO2消耗谷胱甘肽(GSH)的性质
5, 5匸二硫代双(2-硝基苯甲酸XDTNB)用于检测HPDA@MnO2消耗GSH的能力。 采用紫外可见吸收光谱测量,将样品分为七个组:DTNB (25 pig mL1)组、HPDA@MnO2 纳米球组(100 |igmL「i)、游离 GSH 溶液(100(1M)、GSH+DTNB 组、HPDA@MnO2 纳米球+DTNB 组、HPDA@MnO2纳米球+GSH 组以及 HPDA@MnO2纳米球 +GSH+DTNB组。实验中使用的PBS缓冲溶液pH为7.4 (10 mM)。除HPDA@MnO2 纳米球+GSH+DTNB组外,其他组在均匀溶质混合10 min后进行紫外可见光谱测试, 而该组的操作如下:GSH和HPDA@MnO2纳米球首先反应2h,然后通过离心处理以收 集上清液。之后,添加DTNB溶液继续混合10 min,最后进行UV-vis测量。
4.2.9实验中使用的细胞的培养
在DMEM培养基中培养HeLa细胞,在1640培养基中培养小鼠成纤维细胞(L929 细胞),培养条件在37°C恒温及含5%CCh的培养箱中。使用0.25% (wt%)的胰蛋白酶 消化并收集细胞,然后重新转移至新鲜培养基中以进行下一次使用及传代。
4.2.10细胞内GSH含量的测试
通过使用商业化GSH检测试剂盒测试细胞内GSH的浓度。将Hela细胞在恒温37°C 且含5% CO2的细胞培养箱中接种到四个培养瓶中培养24 h。将它们分为四组:“对照”、 “HPDA@MnO2”、“NAC预处理”和“NAC+HPDA@MnO2”。其中,将两个培养瓶用
NAC处理过夜,然后加入5 mL含HPDA@MnO2的DMEM溶液进一步孵育24 h。用 DMEM处理的组用作对照。用PBS洗涤细胞3次后,加入1 mL的胰蛋白酶(2.5 mg mL1) 处理3 min,然后加入5 mL的PBS来收集细胞,接着将细胞转移至15 mL的离心管中。 使用离心机离心(3000 rpm, 10 min)后,除去上清液。将离心后的细胞重新分散在测 定试剂盒中的0.5 mL PBS和2mL试剂(1)中,并用超声细胞破碎仪(300 W, 50%) 破碎5 mino最后,根据说明书使用每组的上清液通过UV-vis光谱法测量420 nm处的 吸光度,进一步对细胞中的GSH定量。
4.2.11细胞毒性测试
MTT法检测合成的HPDA@MnO2> DHA@HPDA@MnO2纳米球和游离DHA溶液 对Hela细胞和L929细胞产生的细胞毒性。将Hela细胞和L929细胞分别接种到96孔 板中(每孔约5X104个细胞)并培养24 ho然后用含有特定浓度的HPDA@MnO2> DHA 和 DHA@HPDA@MnO2 的 DMEM 溶液处理细胞(12.5、25、50、100 和 200 憾 mL1 HPDA@MnO2 和 DHA@HPDA@MnO2> 16、40、80、160 和 320 |1M 的等效浓度 DHA, 溶剂为DMEM)持续24 ho接着用PBS洗涤细胞3次。之后将200此MTT溶液(0.5 mg mL1 MTT,溶解于PBS中)添加到每个孔中。再孵育4小时后,弃去每个孔中的PBS, 然后向每个孔中依次添加100 yLDMSO,摇床混匀10 min以溶解蓝色甲騰。用酶标仪 在570 nm波长处测定每个细胞孔中的吸光度。
DHA@HPDA@MnO2对HeLa细胞的化疗作用通过活/死细胞分析实验进一步评估。 将HeLa细胞以每培养皿5xl05个细胞的密度种植到20 mm尺寸的玻璃底培养皿中孵育 24小时。接下来将材料(HPDA@MnO2、游离的DHA、DHA@HPDA@MnO2)添加到 对应培养皿中,并在37°C下继续孵育24小时。之后将细胞小心地用PBS洗涤3次,以 确保将细胞外物质洗掉,然后用2 mL含钙黄绿素AM (20 nM)和PI (4卩M)的PBS 染色30 min。最后,将细胞再次用PBS洗涤3次,通过共聚焦激光扫描荧光显微镜(CLSM) 成像之前,再向培养皿中加入1 mLPBSo
4.2.12体外活性氧(ROS)检测
使用h, 7「二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)体外检测ROS的产生。简而言 之,通过将NaOH溶液(10mM, 2mL)与DCFH-DA (500(1L, 1 mM)的乙醇溶液混 合并避光搅拌30 min,然后与PBS (pH 7.4, 10 mM, 10 mL)混合生成DCFHo测试样 品分为 5 组:DCFH、DCFH + Mi?+、DCFH + DHA、DCFH + DHA + Mi?+和 DCFH + DHA + Mn2++HCO3',其中 DCFH、DHA、F&+和 FJ+的浓度分别为 1、100、100 和 100(1M, 反应介质为PBS缓冲液(10 mM, pH 5.5)。激发波长为490 nm, Ex/Em狭缝宽度为3 nmo
4.2.13细胞内ROS的检测
为了检测材料在细胞内产生ROS,我们将HeLa细胞(每个培养皿约5xl05个细胞) 接种到培养皿中,并在培养箱中培养24 ho接着将细胞用2 mL DCFH-DA (在DMEM 中为10(1M)处理30 mine然后将它们小心地用PBS洗涤3次,并在不同的时间分别与 HPDA@MnO2> 游离 DHA、Mn2+ + DHA> 和 DHA@HPDA@MnO2 的 DMEM 溶液_起 孵育。纯DMEM中孵育的细胞作对照。通过CLSM在488 nm激发下收集510-560 nm 波长的发射光,对细胞进行荧光成像。成像前,需将培养皿再用PBS洗涤3次,然后在 各培养皿中加入1 mLPBSo
4.2.14磁共振成像(MRI)实验
使用临床磁共振扫描仪(荷兰Philips, 3.0 T)采集MRI。实验记录了在水性介质中 具有不同浓度 Mn2+ (0.01 mM, 0.02 mM, 0.04 mM, 0.08 mM 和 0.16 mM)的 DHA@HPDA@MnO2的纵向(Tl)造影成像以及弛豫时间(T1)。我们测试了小鼠静脉 注射DHA@HPDA@MnO2 (6 mg kg1)后的两个时间点(0和24h)肿瘤的MRI。通过 快速旋转三个回波序列获取T1加权MRI,实验中使用的参数如下:TR/TE = 5310ms/99 ms, FreqxPhase = 256x256 矩阵。
4.2.15活体抗肿瘤研究
所有动物实验均获得吉林大学实验动物中心的批准,所有实验均遵守相关法律和机 构指南。为了进行化学研究,使用40只雌性昆明小鼠(8周)通过在右翼区皮下注射 U14细胞(每100 piL生理盐水约IO。个)来建立异种移植宫颈癌模型。当肿瘤长到约 70 mm3时,将荷瘤小鼠随机分为四组(n = 10): (a)对照组(生理盐水),(b)HPDA@MnO2,
(c) DHA和(d) DHA@HPDA@MnO2o然后,每隔一天对小鼠静脉注射(a)盐水, (b) HPDA@MnO2, (c) DHA 和(d) DHA@HPDA@MnO2,共 15 天。注射剂量为
200(1L 浓度为 2.0 mg kg1 的 DHA, HPDA@MnO2 和 DHA@HPDA@MnO2 的浓度为 9.0 mgkg_1o使用公式(3)计算肿瘤体积:
2
口 4希从钿肿瘤长度X肿瘤宽度
肿瘤体积=
相对肿瘤体积计算式为V/Vo,其中Vo和V分别是初始和实际测量的肿瘤体积。在 实验的第15天,对所有小鼠实施安乐死,切除肿瘤组织并称重。同时,摘取将(a)和 (d)组小鼠的主要器官(心脏,肝脏,脾脏,肺和肾脏),固定在4%中性福尔马林缓 冲液中,并加工包埋成石蜡块。将主要器官和肿瘤切成4毫米厚的切片,以进行苏木精 和伊红(H&E)染色,然后用数字显微镜(LeicaQWin)观察拍照。
4.2.16 DHA@HPDA@MnO2的组织分布和血液循环
为了获得血液循环数据,向荷瘤小鼠(n = 3)静脉注射DHA@HPDA@MnO2o在 特定的时间点(10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h禾口 24h)用注射器抽取 尾静脉血,称重并用提取液消化(含60%乙醇的4.8 mM HC1)O通过ICP检测血样中Fe 的含量。
为了进行组织分布研究,在注射DHA@HPDA@MnO2 24 h后处死小鼠。收集主要 器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)和肿瘤,并将其分别溶于4.0 mL王水(HNOs: HC1= 1: 3)中48h。然后,收集上清液,并通过ICP检测每个器官或肿瘤样品中Mn 的含量。
4.3结果与讨论
4.3.1 DHA@HPDA@Mn O2纳米球的合成与表征
具有生物相容性和pH响应的药物传递系统DHA@HPDA@MnO2纳米球的制备在 图1A中进行了示意性说明。根据先前报道的方法进行了一些修改,通过HF蚀刻所合 成的直径约为200 nm的单分散SiO2@PDA纳米球制备HPDA[35]。刻蚀后所制备的HPDA 的尺寸没有任何变化(图2A),但Zeta电位发生了变化:从-41.1 mV到-32.8 mV (图 2B),这可能是由于PDA表面的质子化作用。HPDA纳米球由于其潜在的载药能力而被 用作体系的核心。相应地,我们将前药DHA加载到HPDA的腔体中㈤]。

图l.(A)DHA@HPDA@MnO2的形成过程。(B)形态测试:分别测试了所制备的SiO2@PDA.HPDA>
HPDA@MnO2和 DHA@HPDA@M 11O2纳米球的 TEM (a-d)和对应的 SEM (e-h)图像。(C)
HPDA@MnO2的暗场STEM以及相应EDX元素映射:C (红色)、N (橙色)、0 (黄色)和Mn (蓝
色)。
Figure 1. (A) Formation process of DHA@HPDA@MnO2. (B) Morphology measurement: TEM (a-d) and
SEM (e-h) images of prepared SiO2@PDA, HPDA, HPDA@MnO2, and DHA@HPDA@MnO2
nanospheres, respectively. (C) Dark-field STEM of HPDA@MnO2 and corresponding EDX elemental
mapping for C (red), N (orange), O (yellow), and Mn (blue).
然后,通过稍加修饰的模板表面还原方法跑将MnO2涂覆在DHA@HPDA纳米球的 外层表面上:只需将KMnO4溶液添加到HPDA纳米球溶液中并在H2SO4溶液的存在下, 几分钟内即可快速获得MnO2中空球。TEM图像清楚地表明,所制备的 DHA@HPDA@MnO2纳米球的平均尺寸约228.3 nm,每个颗粒都有明显的M11O2外层 (图1B )。通过DLS进一步测量,发现DHA@HPDA@MnO2纳米球的水合粒径约为276.3 nm (图2A),这是由于材料的水合效应,使得该尺寸比TEM测量的尺寸要大一些。

图2分别测试SiO2@PDA、HPDA、HPDA@MnO2和DHA@HPDA@MnO2在D.I.水中的流体力学李 晶(A)和 Zeta 势(B)o
Figure 2. Hydrodynamic sizes (A) and Zeta potentials (B) of SiC)2@PDA, HPDA, HPDA@MnO2, and
DHA@HPDA@MnO2 in D.I. water, respectively.
未负载DHA的MnO2涂层包裹的HPDA作为对照组(HPDA@MnO2)之一。图1C 显示了 HPDA@MnO2的扫描TEM (STEM)图像和相应的元素映射图,揭示了 HPDA@MnO2纳米球球面上C、N、O和Mn元素的均匀分布。HPDA表面涂覆MnCh 后,平均Zeta电位从-32.8 mV转变为-12.7 mV(图2B),表明MnO2已成功修饰在HPDA 的表面上。

我们测试了 HPDA@MnO2的XPS谱图(图3),其中对Mn元素有两个典型的自旋 轨道结合能峰,分别位于653.8和642 eV (图4A),分别对应于Mn (IV) 2pi々和Mn (IV) 2p3/2[41L并且在383 nm处的UV-vis吸收峰可以归因于M11O2的表面等离激元带 (图4B),进一步证实了 MnCh涂层的存在[何。

图 4. (A) HPDA@MnO2 的 Mn 2p XPS 谱图。(B) HPDA 和 HPDA@MnO2 的 UV-vis 光谱。(C)所 制备的 DHA、HDPA、HDPA@MnO2 和 DHA@HPDA@MnO2 的 FTIR 光谱。(D) DHA 负载到 HPDA@MnO2中之前(蓝色曲线)和之后(粉红色曲线)上清液的UV-vis吸收光谱。
Figure 4. (A) XPS spectrum of Mn 2p spectrum for HPDA@MnO2. (B) UV-vis spectrum of HPDA and
HPDA@MnO2. (C) FTIR spectra of as prepared DHA, HDPA, HDPA@MnO2 and DHA@HPDA@MnO2.
(D) UV-vis of absorbance spectra of free DHA before (blue curve) and after (pink curve) loading into
HPDA@MnO2.
同时,DHA的负载也可以通过FTIR光谱确定(图4C)。DHA@HPDA@MnO2纳 米球在800-1200 cm1范围内显示岀新的吸收峰,还显示出了 DHA分子结构当中甲基v (-CH3-)(〜2850 cm")和乙基v (-CH2-) (-2940 cm1)凶产生的较强的拉伸振动峰, 这证实了 DHA已成功整合到我们材料的空腔中。DHA负载效率经光谱测试后计算结果 为58.4% (图4D)。此外,我们测试了 DHA@HPDA@MnO2的溶解性和稳定性(图5)。 我们通过实验发现DHA@HPDA@MnO2在D.I.水、PBS和DMEM溶液中分散良好且无 任何可见的团聚。孵育一周后,每组中纳米球的大小没有明显变化,表明我们所合成纳 米材料具有良好的溶解性和稳定性。

图5所制备的DHA@HPDA@MnO2在D.I.水、PBS、DMEM中孵育一周后的水合粒径(插图:材
料溶解在三种溶剂当中的图片)。
Figure 5. Hydrodynamic size of as prepared DHA@HPDA@MnO2 in D.I. water (DI), PBS, and DMEM.
(Insert: photographs of DHA@HPDA@MnO2 in DI, PBS, and DMEM) for a week.
4.3.2酸性微环境调控DHA和Mn2+的释放
通常,合成的纳米材料应在正常的生理条件下(pH 7.4)保持稳定,而在较低pH 的肿瘤酸性微环境中可实现自身降解。因此,我们考察了 DHA@HPDA@MnO2纳米球 在不同的pH条件下的分解情况。从图6A中可以看出,将DHA@HPDA@MnO2纳米球 分别溶解在不同pH (lOmM, 4.0、5.5、6.5和7.4)的PBS中,在特定时间点定量检测 材料中DHA的释放。释放曲线表明,培养环境为pH 7.4的PBS条件下,在12 h内 DHA@HPDA@MnO2中DHA的释放约为8.9%,孵育48 h后,DHA的释放略有增加, 可达到16.43%,表明在材料在正常的生理状态条件下DHA的释放相对较小。而在低pH 条件下持续培养48 h后,材料中DHA的释放显著增加特别是在pH 4.0的PBS中其释 放量可高达68.4%o

图6. (A-B) DHA@HPDA@MnO2纳米球在不同pH的PBS缓冲溶液中释放的DHA (A)和Mn (B)
的定量测定。(C) DHA@HPDA@MnO2纳米球在不同pH PBS溶液下特定时间点(12h、24h和48h)
的TEM图像。
Figure 6. (A-B) The quantitative analysis of DHA (A) and Mn (B) release from DHA@HPDA@MnO2
nanospheres in various pH (4.0, 5.5, 6.5, and 7.4) environment. (C) The TEM images of the
DHA@HPDA@MnO2 nanospheres under various pH PBS solutions for different time (12h, 24h, and 48h).
对应地,我们通过ICP检测Mn的释放,其释放趋势与DHA相似(图6B)。此外, 图6C的TEM图像显示DHA@HPDA@MnO2的形貌在中性条件下(pH 7.4)基本上保 持完好无损,而一些孵育在pH 6.5的PBS中的纳米粒子会发生结构塌陷。毫不奇怪, 大多数纳米球在pH 5.5的PBS条件下孵育48 h后会发生明显瓦解。以上所有结果表明 我们的材料具有响应酸性环境释放药物及降解的性质。
4.3.3体外及细胞水平表征材料消耗GSH的特性
为了证明我们设计的材料具有消耗GSH的能力,我们使用了毓基化合物DTNB作 指示剂。据报道,还原型谷胱甘肽可以与DTNB反应,形成黄色的5-硫代2硝基苯甲 酸阴离子,使得UV-vis吸收光谱谱峰发生移动:由原来的323 nm移动到408 nm⑷冲]。 首先,我们测试了 HPDA@MnO2消耗GSH的动力学过程。如图7A所示,随着时间的

推移,体系中的GSH含量在一小时内降至初始浓度的60.37%,最终在反应6 h后降至 47.35% (图7B)。接着,我们测试并描绘了 GSH消耗的UV-vis吸收曲线。从图7C可 以看出,当向体系中加入GSH后,在323 nm处DTNB的吸收峰明显下降,而在408 nm 波长处出现了新的峰,表明GSH的加入促使DTNB形成了其还原产物。然而,当GSH 与HPDA@MnO2溶液孵育2 h并离心后,将上清液与DTNB混合。我们惊讶地发现, 在408nm处出现的是一个小峰,被DTNB自身在323 nm处的明显吸收峰所取代,这表 明体系中大部分GSH被MnCh通过氧化还原反应所消耗。对于对照组,GSH、 HPDA@MnO2> GSH+HPDA@MnO2 和 DTNB+HPDA@MnO2 的 UV-vis 吸收曲线证明它 们对检测没有干扰。

图7,(A)HPDA@MnO2反应6h过程中在几个时间点测得GSH的消耗量。(B)是否加入HPDA@MnO2 的GSH相对含量。(C)检测材料(HPDA@MnO2)的GSH消耗特性。DTNB、GSH、材料、DTNB +材料、DTNB + GSH、GSH+材料以及DTNB + GSH +材料的UV-vis光谱。(D)是否用NAC处理 以及加入HPDA@MnO2前后Hela细胞中的GSH水平。
Figure 7. (A) GSH consumption by reacting HPDA@MnO2 at several time points for 6 h. (B) Relative
content of GSH with addition of HPDA@MnO2 or not. (C) Detection of GSH consumption characteristics
of material (HPDA@MnO2). The UV-vis spectra of DTNB, GSH, Material, DTNB + Material, DTNB
GSH, GSH + Material, and DTNB + GSH + Material. (D) GSH level in Hela cells after the HPDA@MnO2
treated with NAC or not.
为了进一步证明HPDA@MnO2纳米球消耗GSH的能力,我们随后在细胞水平进行 了实验。首先用HPDA@MnO2处理Hela细胞24 h,然后使用GSH检测试剂盒测试细 胞中的GSH含量。未经HPDA@MnO2处理的细胞用作对照。如图7D所示,用
HPDA@MnO2纳米球处理后,细胞内GSH的含量降低了 39.3%,表明它们具有消耗细 胞内GSH的能力。为了进一步证实该结果,NAC被用作GSH促进剂以增加细胞内GSH 水平。用NAC处理细胞后,GSH含量增加至1.1 mM。令我们惊讶的是,用HPDA@MnO2 纳米球处理后,细胞中的GSH含量下降了 45.9%,这可能是由于GSH与HPDA@MnO2 的反应之间存在平衡,GSH水平的升高将促进HPDA@MnO2纳米球消耗更多的GSH。 以上所有结果表明,HPDA@MnO2可以在体外及细胞水平消耗GSHo
4.3.4体外及细胞水平检测ROS的产生
由于DHA@HPDA@MnO2在肿瘤酸性环境中降解会释放Mi?+和DHA,并且它们 之间的相互作用将在体内固有碳酸氢根的帮助下很容易地产生自由基。首先,DCFH用 于体外检测Mi?+和DHA反应产生的ROSo如图8所示,随着反应的进行,Mn2++DHA 组和Mn2++DHA+HCO3「组都反映出荧光强度的增加。然而,与Mn2++DHA组相比, Mn2++DHA+HCO3-组DCF的荧光强度在反应时间增加至1.5 h后提高了 1.5倍,这可能 归因于碳酸氢根离子的存在促进了更多ROS的产生。Mn2+组和DHA组作为对照。

图8.CA-E)体外检测ROS的产生:分别为对照组、M/+组、DHA组>DHA+Mn2+组和DHA+Mn2++HCO3 组,每组显示在10 mM PBS缓冲液(pH 5.5)中特定时间点下的荧光强度(0、0.5、1.0和1.5 h)。
Figure 8・(A-E) Detection of ROS generation in vitro, control group, Mn2+ group, DHA group, DHA +
Mn2+ group, and DHA+Mn2+ + HCO3 group, each group showed the fluorescence intensity at different
time point (0, 0.5, 1.0, and 1.5 h) in 10 mM PBS buffer (pH 5.5).
然后,使用DCFH-DA荧光探针在细胞水平检测ROS的产生。首先,将每个培养 皿中的细胞分别加入含 HPDA@MnO2、DHA>Mn2++DHA 和 Mn2++DHA+HCO3-的 DMEM 溶液孵育12 h。仅用DMEM处理的细胞作为对照组。如图9所示,对照组中几乎没有 DCF荧光信号出现,而HPDA@MnO2组中有微弱荧光信号出现,可能是由于Mi?+和细 胞内H2O2相互作用而产生了 ROSH5]。而在游离DHA预处理的组中,绿色荧光强度增 加,这归因于它与细胞中固有F0的反应跑。令我们感到惊讶的是,用 DHA@HPDA@MnO2处理的Hela细胞的荧光强度比Mn2++DHA组强。尽管Mn2++DHA 组中的Mn和DHA浓度相当于DHA@HPDA@MnO2组,但是由于细胞膜的保护,细胞 不能有效地摄取Mn2+,因此它们无法在细胞内产生足够的ROSo相比之下, DHA@HPDA@MnO2可以通过细胞的内吞作用被细胞有效吸收,进而在肿瘤酸性环境 下其结构被破坏,随后释放Mi?+和DHA,反应产生ROS。

图 9. Hela 细胞分别与 DMEM (对照)、HPDA@MnO2> DHA、DHA+Mn2+ 以及 DHA@HPDA@MnO2 孵育12 h后,通过CLSM测试DCF荧光强度表征ROS生成以及相应的曲面图图像(比例尺:75艸)。
Figure 9. ROS generation detected with DCF fluorescence by CLSM after incubation for 12 h with DMEM

(Control), HPDA@MnO2, DHA, DHA and Mn2+ and DHA@HPDA@MnO2 and corresponding surface
plot images (Scale bar: 75 屮n).
4.3.5细胞水平考察材料的抗肿瘤效果
为了确保材料在生物体中的成功应用,我们首先需要研究其毒性。我们通过使用 MTT测定法评估DHA@HPDA@MnO2纳米球的体外细胞毒性。将HPDA@MnO2和游 离DHA组作为对照。结果表明,HPDA@MnO2对Hela和L929细胞系均具有良好的生 物相容性(图10A和10B),甚至当材料浓度高达200 pig mL1, Hela细胞的存活率为 88.39%, L929细胞的为90.15%。然而,随着游离DHA浓度的增加,两种细胞均会出 现不同程度的凋亡,特别是当DHA浓度达到316 pig mL1时,L929细胞的细胞凋亡率 高达71.2%,反映了高浓度DHA具有细胞毒性以及对肿瘤细胞的非选择性。有趣的是, 在Hela细胞中,DHA@HPDA@MnO2表现岀比同等剂量的游离DHA高得多的毒性作用。然而,对于L929细胞,DHA@HPDA@MnO2孵育24 h后的细胞存活率为76.0%, 是游离DHA的2.7倍,表明肿瘤细胞可以有效吸收DHA@HPDA@MnO2,过提供Mn2+ 和DHA相互作用产生ROS来提高抗癌效率。

图10.体外细胞水平上的抗肿瘤效果测试。(A) Hela细胞系中培养不同材料:不同浓度下
HPDA@MnO2> 游离 DHA 以及 DHA@HPDA@MnO2 的细胞存活率。(c [HPDA@MnC)2] =10、25、 50、100 和 200 pig mL1, c [DHA] = 16、40、79、158 及 316 piM, c [DHA@HPDA@MnO2] =10> 25、
50> 100以及200 jig mL_1, mean ±SD, n = 3) . (B) L929细胞系中培养不同材料:不同浓度下
HPDA@MnO2> 游离 DHA 以及 DHA@HPDA@MnO2 的细胞存活率。(c [HPDA@MnC)2] =10、25、 50、100 和 200 pig mL1, c [DHA] = 16、40、79、158 及 316 piM, c [DHA@HPDA@MnO2] =10、25、 50、100以及200 jig mL1, mean ±SD, n = 3 ) . (C)活/死细胞染色:在Hela细胞中分别加入DMEM,
HPDA@MnO2, DHA, or DHA@HPDA@MnO2孵育24 h的激光共聚焦荧光图像。活/死染色显示死细
胞为红色,活细胞为绿色(比例尺:75艸)。
Figure 10. In vitro antitumor efficiency. (A) Cell viability of HPDA@MnO2, free DHA and
DHA@HPDA@MnO2 at various concentrations on HeLa cell lines, (c [HPDA@MnO2] =10, 25, 50, 100,
and 200 jig mL1, c [DHA] = 16, 40, 79, 158, and 316 jig mL1, and c [DHA@HPDA@MnO2] =10, 25, 50,
100, and 200 jig mL_1, mean 士 SD, n = 3). (B) Cell viability of free DHA and DHA@HPDA@MnO2 at
various concentrations on L929 cell lines, (c [DHA@HPDA@MnO2] =10, 25, 50, 100, and 200 jig mL_1, c
[DHA] = 16, 40, 79, 158, and 316 jig mL_1, mean 士 SD, n = 3). (C) Confocal fluorescence images of
DMEM, HPDA@MnO2, DHA, or DHA@HPDA@MnO2-incubated Hela cells for 24 h. Live/dead stain
shows dead cells as red and viable cells as green. Scale bar: 75 屮n.
此外,我们使用钙黄绿素-AM和PI共染色荧光成像(由CLSM拍摄)直观材料对 观察肿瘤细胞杀伤效率。从图10C可以清楚地看出,与对照组(DMEM)相比,用 HPDA@MnO2处理的细胞也明显细胞死亡。但是,用游离DHA处理的细胞显示出明显 的红色荧光,表明部分肿瘤细胞已经被杀死。值得注意的是,与游离DHA组相比,用 DHA@HPDA@MnO2处理后,Hela细胞几乎全部被破坏死亡,证实了 Mi?+和DHA之 间的协同作用和增强的抗肿瘤效果。以上所有结果表明DHA@HPDA@MnO2在正常生 理条件下表现出良好的生物相容性,而在肿瘤微环境下是癌细胞有效的化学治疗剂。
4.3.6MRI 实验
除了用作抗肿瘤治疗试剂外,还通过临床MRI扫描仪(3.0 T)研究了 DHA@HPDA@MnO2作为Ti-MRI造影剂的潜力,材料在肿瘤微环境中释放的Mn (II) 离子将极大地改善Ti-MRI信号性能用于肿瘤成像和检测。图11A显示了 DHA@HPDA@MnO2 水溶液在不同条件下(pH 7.4 PBS>pH 5.5 PBS 和 pH 5.5 PBS+GSH) 的MR图像。pH 7.4组MRI的信号可忽略,因为几乎无Mi?+从MnCh表面释放岀来。 然而,借助于酸性PBS产生更多的Mn2+, MRI信号明显改善,纵向(n)弛豫值也从 0.205 mM1 s'1 增加到 2.46 mM1 s'1 (图 11B)。此外,通过在 pH 5.5 PBS 中添加 GSH, 二者对MnCh壳层产生的协同效应进一步改善了 MRI信号,门值增加至4.71 mM1 s"。 DHA@HPDA@MnO2溶液在孵育48小时后显示出浓度依赖性的MRI亮度(图11C), 表明我们所制备的材料是潜在的Ti造影剂。

图11. (A) DHA@HPDA@MnO2样液在不同Mn浓度和pH下的Ti-MRIo (B)纵向弛豫率(n)与
DHA@HPDA@MnO2浓度(以Mn计)的关系。(C)纵向(门)弛豫率与M/+浓度的标准曲线。(D) 在静脉内注射DHA@HPDA@MnO2材料0和24h后,对U14荷瘤小鼠的活体MRI。白色圆圈中的 区域代表肿瘤。
Figure 11. (A) Ti-MR phantom images of DHA@HPDA@MnO2 suspensions at different Mn
concentrations and pH values. (B) The longitudinal (ri) relaxation rate versus the concentration of
DHA@HPDA@MnO2 (in terms of Mn). (C) The standard curve of longitudinal (ri) relaxation rate versus
the concentration of Mn2+. (D) In vivo MRI of U14 tumor bearing mice after the intravenous injection of
DHA@HPDA@MnO2 at 0, and 24 h. The areas in white circles represent the tumors.
然后将DHA@HPDA@MnO2采用尾静脉注射小鼠体内,在0和24 h固定时间点表 征肿瘤的体内Ti加权MRI(图11D)。注射前,肿瘤与正常组织之间信号无显著性差异, 而注射后24 h,肿瘤区域的信号强度明显增加,相对信号强度(RSI)为2.35 (图12)o 图12.由图11D中的标记区域计算出的肿瘤与正常组织的相对信号强度。相对信号强度由肿瘤区域 和正常组织区域中信号之间的比率计算得出,并在注入我们的材料之前通过比率进行标准化。 Figure 12. The relative signal intensity of tumor to normal tissue calculated from the marked region in Figure 11D. The relative signal intensity is calculated from the ratio between signal in tumor area and in normal tissues areas and normalized by the ratio prior to injection of our materials.

这些结果表明,DHA@HPDA@MnO2可通过EPR作用在肿瘤区域积聚,这种作用 可能会延长Mn (II)离子在肿瘤中的停留时间,从而导致24 h的RSI值更高。肿瘤区 域的微环境使DHA@HPDA@MnO2具有更高的选择性,从而增强了实体瘤的MRI对比 度,显示出其在诊断应用上面的巨大潜力。
4.3.7DHA@HPDA@MnO2的活体抗肿瘤测试
基于材料DHA@HPDA@MnO2的高度生物相容性和选择性,它被用于雌性昆明小 鼠的抗肿瘤研究。首先我们探讨了材料在小鼠体内的血液循环和生物分布。 DHA@HPDA@MnO2纳米球的血液循环半衰期经计算为4.75 h (图13A)。至于其生物 分布结果,图13B表明DHA@HPDA@MnO2纳米球主要分布在网状内皮系统中,例如 小鼠的肝脏和脾脏,并且还通过EPR效应积累在肿瘤组织中。我们进一步研究了 DHA@HPDA@MnO2纳米球的抗肿瘤作用。每隔一天分别向U14细胞异种移植小鼠(n 二10)尾静脉注射四组试剂:生理盐水、HPDA@MnO2纳米球、游离DHA、 DHA@HPDA@MnO2纳米球。如图13C所示,小鼠治疗15天内不同组的肿瘤相对体积 的生长曲线,HPDA@MnO2组对肿瘤治疗几乎没有积极影响,Mn2+释放过程会消耗细 胞内GSH并与肿瘤细胞中的H2O2反应产生ROS,但是由于肿瘤的快速生长而徒劳无功, 因此在这一组中肿瘤尺寸的增加速率与在对照组中相比几乎没有减小。相反,游离DHA 组在治疗开始时显示出抑制肿瘤生长的潜力,但随后未能抑制住肿瘤。毫不奇怪, DHA@HPDA@MnO2纳米球在抑制肿瘤生长方面发挥了很大作用。治疗15天后,切除 每组小鼠所有肿瘤并表征其形态变化。图13D显示了随机选取的各组小鼠的照片及其解 剖的肿瘤:与其他组相比,用DHA@HPDA@MnO2纳米球治疗的小鼠的肿瘤体积显然 最小。此外,根据肿瘤重量计算,DHA@HPDA@MnO2纳米球治疗组的平均肿瘤抑制 率经计算约为83.34%,是游离DHA (〜41.38%)的3.55倍(图13E)。在整个治疗过程 中,没有发现小鼠体重发生明显变化(图13F)O

图13.通过化学疗法测试活体水平小鼠的肿瘤抑制效率。(A)静脉注射DHA@HPDA@MnO2后不
同时间点小鼠血液中Mn元素含量。(B)在静脉注射24 h后,通过ICP测定Mn元素含量评估
DHA@HPDA@MnO2纳米球在主要器官和肿瘤组织中的生物分布。(C)不同治疗后各组(对照(生 理盐水)、HPDA@MnO2>游离DHA和DHA@HPDA@MnO2)小鼠的肿瘤体积变化。(D)在治疗 第15天随机地从各组中选择并拍摄小鼠及其肿瘤的照片。(E)不同组治疗15天后解剖小鼠的肿瘤 组织的重量。(F) 15天内不同组小鼠的体重变化。结果为平均值士SD (n = 3)o Error bar是平均值的 标准偏差。
Figure 13. In vivo tumor inhibition efficiency by chemotherapy. (A) The content of Mn ion in the mice
blood at different time points after intravenous injection of DHA@HPDA@MnO2. (B) Biodistribution of
DHA@HPDA@MnO2 nanospheres in major organs and tumor tissues at 24 h post intravenous injection
evaluated by the content of Mn ion measuring with ICP. (C) In vivo tumor volume changes on different
groups (saline for control, HPDA@MnO2, free DHA, and DHA@HPDA@MnO2)after different treatments.
(D) Photograph of mice with tumor selected from each group randomly at 15th day after treatment. (E)
Weights of dissected tumor tissues 15 days after the different treatment. (F) Body weight changes of mice
in different groups in 15 days. Results are expressed as mean ± SD (n = 3). Error bars are standard error of
the mean.
为了进一步研究材料对荷瘤小鼠治疗效果,对每组肿瘤切片进行H&E染色。从图 14A中可以看岀,在DHA@HPDA@MnO2组中可以发现更明显的细胞收缩以及细胞核 浓缩,表明我们材料良好的抑制效率。DHA@HPDA@MnO2纳米球抗肿瘤能力的显著 性改善可归因于以下原因:首先,DHA@HPDA@MnO2纳米球可解决DHA的水溶不佳 的问题并延长血液循环时间,从而通过EPR途径将更多药物转运到肿瘤部位。另一方

面,在通过内吞作用将材料吞入肿瘤细胞后,MnCh的外层与细胞内GSH反应,从而削 弱了癌细胞的抗氧化能力旳。此外,由于DHA@HPDA@MnO2纳米球在肿瘤细胞内、 外酸性环境中具有同时释放DHA和Mi?+的能九 通过DHA和Mn2+之间的相互作用产 生ROS杀死癌细胞,可以提高DHA的抗癌效率。

图14. (A)不同试剂处理后肿瘤H&E染色的切片:生理盐水(对照)、HPDA@MnO2>游离DHA 和DHA@HPDA@MnO2o (比例尺:100 pirn) (B)是否使用DHA@HPDA@M 11O2处理的小鼠的主 要器官(从左至右:心脏,肝,脾,肺和肾)的H&E染色。(比例尺:100屮n) (C)健康小鼠(对 照)或用DHA@HPDA@MnO2纳米球治疗小鼠的血液生化分析。结果显示了天冬氨酸转氨酶(AST), 丙氨酸转氨酶(ALT), AST/ALT比,总蛋白(TP),肌酹(CRE)和血尿素氮(BUN)的平均值和
标准差。
Figure 14. (A) H&E staining of tumor slices after different treatments: saline (control), HPDA@MnO2,
free DHA and DHA@HPDA@MnO2. Scale bar: 100 |im. (B) H&E staining of main organs (from left to
right: heart, liver, spleen, lung, and kidney) from mice treated with or without DHA@HPDA@MnC)2. Scale
bar: 100 |im. (C) Blood biochemistry analysis of healthy mice (Control) or mice treated with
DHA@HPDA@MnO2 nanospheres. The results showed the mean and standard deviations of aspartate
aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), AST/ALT ratio, total protein (TP), creatinine
(CRE) and blood urea nitrogen (BUN).
对于纳米材料的生物医学应用,其生物安全性一直是首要考虑问题之一。为了证明 材料在小鼠体内的安全性,我们记录了小鼠治疗过程中的体重,并测量了对照组和 DHA@HPDA@MnO2组中不同组织器官(心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏)的H&E染色。 结果表明,两组的主要器官均未表现出明显的异常和病理变化(图14B)。此外,在治 疗组和健康小鼠之间对比,血液生化分析的参数没有发现明显差异(图14C)。以上所 有这些结果证明了我们所提出的材料具有有效的肿瘤治疗效果和良好的生物相容性。
4.4小结
总之,我们成功制备了具有良好生物相容性、pH响应性的DHA@HPDA@MnO2 纳米球药物递送系统用于提高抗癌疗效。高度肿瘤细胞杀伤效率归因于释放的Mn2+和 DHA之间相互作用产生的ROS以及同时通过MnO2消耗GSH来削弱肿瘤细胞抗氧化能 力,从而协同杀死肿瘤细胞。与市售的抗癌药相比,我们所制备的药物递送体系(DDS) 对正常组织显示出可忽略的副作用。活体结果表明,DHA@HPDA@MnO2的抗肿瘤效 率是当量游离DHA的3.55倍,平均肿瘤抑制率约为83.34%,这为临床肿瘤治疗提供了 一种有希望的方法。我们认为,未来有必要探索更多的纳米载体使其在生物医学领域得 以广泛应用。
参考文献
[1]A. Jemal, F. Bray, M. M. Center, J. Ferlay, E. Ward and D. Forman, CA Cancer J. Clin. [J], 2011, 61, 69-90.
[2]R. Lozano, M. Naghavi, K. Foreman, et al., The Lancet [J], 2012, 380, 2095-212&
[3]J. Zhou, X. Du, N. Yamagata and B. Xu, J. Am. Chem. Soc. [J], 2016,138, 3813-3823.
[4]乙 Ma, M. Zhang, X. Jia, J. Bai, Y. Ruan, C. Wang, X. Sun and X. Jiang, Small [J], 2016, 12, 5477-5487.
[5]T. Wang, D. Wang, H. Yu, B. Feng, F. Zhou, H. Zhang, L. Zhou, S. Jiao and Y. Li, Nat. Commun. [J], 2018, 9, 1532.
[6]Y. Zhang, Y. Yang, S. Jiang, F. Li, J. Lin, T. Wang and P. Huang, Mater. Horiz. [J], 2019, 6, 169-175.
[7]M. Ferrari, Nat. Rev. Cancer [J], 2005, 5, 161-171.
[8]Y. Chen, Y. Wan, Y. Wang, H. Zhang and 乙 Jiao, Int. J. Nanomedicine [J], 2011, 6, 2321-2326.
[9]A. M. Florea and D. Busselberg, Cancers [J], 2011, 3, 1351-1371.
[10]H. K. Chan and S. Ismail, Asian Pac. J. Cancer Prey. [J], 2014, 15, 5305-5309.
[11]C. H. Heldin, K. Rubin, K. Pietras and A. Ostman, Nat. Rev. Cancer [J], 2004, 4, 806-813.
[12]Y. Tu, Nat. Med. [J], 2011, 17, 1217.
[13]D.L. Klayman, Science [J], 1985, 228, 1049-1055.
[14]J. Wang, C. Xu, F. L. Liao, T. Jiang, S. Krishna and Y. Tu, New Engl. J. Med. [J], 2019, 380, 2087-2089.
[15]D. Chaturvedi, A. Goswami, P. P. Saikia, N. C. Barua and P. G. Rao, Chem. Soc. Rev. [J], 2010, 39, 435-454.
[16]R. K. Haynes, W. C. Chan, C.-M. Lung, A. C. Uhlemann, U. Eckstein, D. Taramelli, S. Parapini, D. Monti and S. Krishna, ChemMedChem [J], 2007, 2, 1480-1497.
[17]R. K. Haynes, H. H. O. Pai and A. Voerste, Tetrahedron Lett. [J], 1999, 40, 4715-471 &
[18]R. K. Haynes and S. C. Vonwiller, Tetrahedron Lett. [J], 1996, 37, 253-256.
[19]T. A. Rouault, Nat. Chem. Biol. [J], 2006, 2, 406-414.
[20]Y. Chen, X. Lin, H. Park and R. Greever, Nanomed. Nanotechnol. Biol. Med. [J], 2009, 5, 316-322.
[21]C. Argyo, V. Weiss, C. Brauchle and T. Bein, Chem. Mater. [J], 2014, 26, 435-451.
[22]E. Blanco, H. Shen and M. Ferrari, Nat. Biotechnol. [J], 2015, 33, 941.
[23]S. Mura, J. Nicolas and P. Couvreur, Nat. Mater. [J], 2013, 12, 991.
[24]D. Wang, J. Zhou, R. Chen, R. Shi, C. Wang, J. Lu, G. Zhao, G. Xia, S. Zhou,乙 Liu, H. Wang,乙
Guo and Q. Chen, Chem. Mater. [J], 2017, 29, 3477-3489.
[25]X. Qin, H. Zhang,乙 Wang and Y. Jin, New J. Chem. [J], 2019, 43, 8761-8773.
[26]Y. Ding, J. Wan,乙 Zhang, F. Wang, J. Guo and C. Wang, ACS Appl. Mater. Interfaces [J], 2018, 10, 4439-4449.
[27]乙 He, H. Su, Y. Shen, W. Shi, X. Liu, Y. Liu, F. Zhang, Y. Zhang, Y. Sun and D. Ge, RSC Adv. [J], 2019, 9, 9968-9982.
[28]L. Liu, Y. Wei, S. Zhai, Q. Chen and D. Xing, Biomaterials [J], 2015, 62, 35-46.
[29]H. Zhang, L. Hou, X. Jiao, Y. Ji, X. Zhu and 乙 Zhang, Biomaterials [J], 2015, 37, 353-366.
[30]J. Chen, W. Zhang, M. Zhang,乙 Guo, H. Wang, M. He, P. Xu, J. Zhou,乙 Liu and Q. Chen, Nanoscale [J], 2015, 7, 12542-12551.
[31]D. Hu, C. Liu, L. Song, H. Cui, G. Gao, P. Liu,乙 Sheng and L. Cai, Nanoscale [J], 2016, & 17150-1715 &
[32]C. Wang, J. Bai, Y. Liu, X. Jia and X. ACS Biomater. Set Eng. [J], 2016, 2, 2011-2017.
[33]R. S. Ambekar and B. Kandasubramanian, Biomater. Sci. [J], 2019, 7, 1776-1793.
[34]M. Liu, G. Zeng, K. Wang, Q. Wan, L. Tao, X. Zhang and Y. Wei, Nanoscale [J], 2016, & 16819-16840.
[35]G. Li, J. Li, Z. Zhou, C. Li, C. Cai, B. Guo, R. D. Priestley, L. Han and R. Liu, Dalton Trans. [J], 2017, 46, 16419-16425.
[36]X. Zhou, T. L. Chang, S. Chen, T. Liu, H. Wang and J. F. Liang, Mol. Pharm. [J], 2019, 16, 2511-2521.
[37]Y. Liu, K. Ai and L. Lu, Chem. Rev. [J], 2014, 114, 5057-5115.
[38]J. Han, W. Park, S. J. Park and K. Na, ACS Appl Mater Interfaces [J], 2016, & 7739-7747.
[39]D. Wang, J. Zhou, R. Chen, R. Shi, G. Zhao, G. Xia, R. Li,乙 Liu, J. Tian, H. Wang,乙 Guo, H. Wang and Q. Chen, Biomaterials [J], 2016, 100, 27-40.
[40]J. Yan, L. Yang, M. F. Lin, J. Ma, X. Lu and P. S. Lee, Small [J], 2013, 9, 596-603.
[41]Q. Chen, L. Feng, J. Liu, W. Zhu, Z. Dong, Y. Wu and Z. Liu, Adv. Mater. [J], 2016, 28, 7129-7136.
[42]乙 Ma, X. Jia, J. Bai, Y. Ruan, C. Wang, J. Li, M. Zhang and X. Jiang, Adv. Funct. Mater. [J], 2017,
27.
[43]Y. Ruan, X. Jia, C. Wang, W. Zhen and X. Jiang, ACS Biomater. Sci. Eng. [J], 2019, 5, 1016-1022.
[44]A. Munoz, D. H. Petering and C. F. Shaw, Inorg. Chem. [J], 1999, 3& 5655-5659.
[45]C. Liu, D. Wang, S. Zhang, Y. Cheng, F. Yang, Y. Xing, T. Xu, H. Dong and X. Zhang, ACS Nano [J], 2019, 13, 4267-4277.
[46]J. Bai, X. Jia, W. Zhen, W. Cheng and X. Jiang, J. Am. Chem. Soc. [J], 2018,140, 106-109.
[47]J. Li, A. Dirisala,乙 Ge, Y. Wang, W. Yin, W. Ke, K. Toh, J. Xie, Y. Matsumoto, Y. Anraku, K. Osada and K. Kataoka, Angew Chem. Int. Ed. [J], 2017, 56, 14025-14030.
[1]L. Dong, C. Wang, W. Zhen, X. Jia, S. An,乙 Xu, W. Zhang, and X. Jiang, Biodegradable Iron-coordinated Hollow Polydopamine Nanospheres for Dihydroartemisinin Delivery and Selectively Enhanced Therapy in Tumor Cells. Journal of Materials Chemistry 5, 2019, 7,6172-6180.
[2]L・ Dong, Z. Xu, S. An, X. Jia, W. Zhang, and X. Jiang, Glutathione-depleted Prodrug Platform of MnO2-coated Hollow Polydopamine Nanospheres for Effective Cancer Diagnosis and Therapy. New Journal of Chemistry. 2020, 44, 7838-784&
[3]W. Zhen, W. Hu, L・ Dong, S. An, and X. Jiang, Nanomaterials for Regulation of Tumor Microenvironment and Theranostics. Nanoscale Advances. 2020, 2, 1395-1409.
[4]Y. Lai,乙 Xu, X. Hu, L. Lei, L. Li, L. Dong, H. Yu, and W. Zhang, Peptide Nanotube-Templated Biomineralization of Cu2-xS Nanoparticles for Combination Treatment of Metastatic Tumor. Small, 2019, 15, 1904397.
[5]L・ Dong, Z. Xu, W. Zhang, and X. Jiang, Dihydroartemisinin Encapsulated Metal-organic Framework Nanoplatform for Enhanced Chemo and Sonodynamic Synergetic Therapy to Tumor Cells. Prepared.
[6]L・ Dong, Z. Xu, W. Zhang and X. Jiang, Construction of Dihydroartemisinin Based Nanospheres Nanoplatform for Biodegradable and Efficient Tumor Chemotherapy. The Seventeenth International Symposium on Electroanalytical Chemistry & the Third International Meeting on Electrogenerated Chemiluminescence (17th ISEAC & 3rd ECL), 2019, Changchun, China.
[7]姜秀娥,董亮,王超,贾潇丹,一种含青蒿素类药物的纳米复合材料及其制备方法 与应用,申请专利。(申请号:CN201910668913.3)
致谢
三十六月过去,弹指一挥间。回首三年,有收获、失去,有痛苦、快乐,有感动、 悲伤。穿梭在这些辞藻间,我又长了三岁,从二十一世纪10年代跨越到了 20年代。三 年间,无数个晚归的夜,无数次失败的惆怅,无数想不出答案的绞尽脑汁,这种过程的 感受,只有经历过才能体会也只有自己才最懂。而这三年,就是有着这一群群我尊敬的、 爱我的人陪伴在我的身边,指导我、激励我、帮助我、呵护我、照顾我,才换来了我所 收获的回报,在这里我都要对他们致以我最真挚的谢意:
“令公桃李满天下,何用堂前更种花”,感谢我的三位导师:张文教授、徐志爱教 授及姜秀娥研究员。
张老师在我看来是一位桃李满天下的严师,尽管与他接触的机会不多,但仍能感受 到他对我们整个课题组大家庭的关心。实验室许多硬件和软件设备张老师都是费尽心血 争取来的,他会时常关心我们的生活与学习,而他在我整个三年的研究生生涯的过程中 一直以严谨的治学态度深深影响着我做事、做人。我要对我的导师张老师感激地说一声: 谢谢您。
我要感谢我的导师,徐志爱教授。我记得第一次见到徐老师的时候是在2016年的 秋天,参加硕士推免,感觉她像姐姐一样,温柔、细腻,宛若古时江南女子一般,转眼 间已是四年前。徐老师无论在科研上还是学习上是不会和我们发脾气的,但她却又是一 位严谨而认真负责的老师:在我们研一科研起步的时候,她在每周五下午都会抽出时间 和我们一起学习,指导我们如何一步一步做科研。我是我们三个同级学生中科研能力相 对最弱的,因此会多布置我一些看文献的任务,我每次找她讨论问题的时候,徐老师都 很耐心地引导我找到答案。在去长春学习的阶段,徐老师也关心着我的科研进展与生活 情况,会为我提供一些想法和文献,为我加油鼓劲。而她每天早出晚归,要照顾我们大 家还要照顾小家,她的辛苦我看在眼里。“春蚕到死丝方尽,蜡炬成灰泪始干”,深深地 对徐老师说一声:徐老师,您辛苦了!
我还感谢我的联合培养指导老师姜秀娥研究员。在应化所学习的这一年半时间,姜 老师在科研和生活上都给予我无微不至的照顾和关爱。姜老师不仅在科研上严格要求我 们,她自己也是以身作则,她那种不断追求与超越、充满激情与热爱的精神深深感染着 我,对我以后的工作、生活都产生巨大的影响。她经常会关心我们心理、感情等问题, 组会上也会对我们强调低调做人、踏实做事的道理。虽然有时候她会严肃批评我们,但 是我们都会理解她的初衷。姜老师一直在追梦的路上,祝福她的梦想早日实现!当然也 要注意身体,同时也感谢姜老师的指导!
其次,我要感谢母校华东师范大学与中国科学院长春应用化学研究所。感谢化学与 分子工程学院的领导和老师们,感谢分析学科组:何品刚老师、叶建农老师、田阳老师、 鲜跃仲老师、王清江老师、程圭芳老师、张中海老师、楚清脆老师、张帆老师、裴昊老 师、李丽老师、张立敏老师、郑婷婷老师等为我们创造的良好学术与科研条件、带来的 一节节精彩的课程;感谢电分析化学国家重点实验室的董绍俊先生、汪尔康先生和杨秀 荣先生,电分析的今天所取得的所有成就都是您们毕生心血打造而来的,也很荣幸能听 到前辈们的教诲与关心。向三位先生致以崇髙的敬意,祝您们身体健康、万事如意。感 谢测试平台的王晓丹师姐、王磊师姐和李斐师姐。感谢分析测试中心的各位老师、吉林 大学柳怀玉老师以及吉林大学中日联谊医院的王微师姐。
“桃花潭水深千尺,不及汪伦送我情”,我要感谢我的同门兄弟姐妹,感谢课题组 的王亚师姐、雷莉师姐、徐杰师姐、朱潼潼师姐、何绍英师姐、曹洪帅师兄、侯博师兄、 李敏师妹、刘瑾师妹、周丰琦师妹、尚欣师妹、邹志凤师妹、阮栋婷师妹、李凤麟师妹 和赵婉师妹对我学习上和生活上的帮助,感谢王凤阳师姐、来旖师姐、党一菁师姐、耿 瑞师姐带给我的快乐和关心。特别感谢李苓菱和胡献丽同学对我生活、工作和学习上的 帮助!感谢我的室友吴洲同学,感谢李晓林、董有贤、路晴、周羽婷等同学,尤其是他 们在我不在学校这段日子帮助我解决了很多困难,认识你们是我三年来的一笔财富。
感谢长春应化所课题组的武烈师兄、曹凤娟师姐、贾潇丹师姐、阮瑜迪师兄、张晓 菲师姐、甄文瑶师姐、李姗姗同学、程晓伟师妹、朱曼毓师妹、安尚洁师妹、王淑奇师 妹、胡文雪师妹。特别感谢课题组王超师兄对我课题工作的指导和帮助!与你们相处的 时光我很快乐。
我要感谢我的亲人们、朋友们,感谢姥姥、舅舅、姑妈以及哥哥、姐姐们对我的爱, 感谢曾经在我生命中陪伴我成长,教会我做人、做事却已逝去的亲人们,每当晚归路上 抬头仰望星空,就仿佛感觉那是你们在目送我回家。感谢我的如同亲人般的挚友:周正 萌、李思雨、张帆、王聪、于业伟、王帅、宋阔(Ana).徐泽洲、王炫宜、于姗平、柴 永恒等人在生活上和学习上对我的照顾,带给我无数的快乐、感动和陪伴。我要感谢自 己,勇敢闯过重重难关,自己的三年有了进一步的提髙!
感谢伟大的祖国和党的领导,才使得我们生活在和平的年代,可以在实现中国梦的 路上贡献自己的一份力! 2020年“新冠肺炎疫情”的防控救治中,我再一次为国家的正 确抉择而自豪,为发生的一件件感人的故事而落泪。这年春天,终生难忘。希望疫情彻 底控制,早日重返校园,漫步樱桃河畔,静待樱花满天。
最后,我要感谢我的爸爸妈妈:“谁言寸草心,报得三春晖”,每当心灰意冷或是跚 躅迷茫之时,是爸爸妈妈一直牵挂我、呵护我、照顾我,鼓励我,没有他们就没有我取 得的任何成果。不知不觉间,成为他们的孩子已经25年,从幼儿、少年到青年,是他 们见证了我的成长,分享着我最近距离的喜怒哀乐,我为此感到幸福及满足。他们也从 青年到中年,从满头黑发到鬓角微霜。我想对爸爸妈妈说一声:我爱你们!你们辛苦了 !
纸短情长,我的故事还将继续……