Ras信号通路在血管瘤内皮细胞中的表达及调控论文

2020年10月15日13:15:01Ras信号通路在血管瘤内皮细胞中的表达及调控论文已关闭评论

Ras信号通路在血管瘤内皮细胞中的表达及调控论文

中文摘要

目的:观察Ras信号通路关键信号分子在不同时期小儿血管瘤组织中的表达,调控 体外培养人血管瘤内皮细胞中Ras信号通路的表达,探讨Ras信号通路对血管瘤血管 内皮细胞的影响及机制。

方法:1.收集遵义医科大学附属医院小儿矫形外科2005-2017年间手术切除并经病理 诊断为毛细血管瘤的组织标本,结合Mulliken分类法与Ki・67表达情况重新将标本进行 分类和分期,提取增生期血管瘤和消退期血管瘤标本各30例,免疫组化检测并比较增 生期血管瘤和消退期血管瘤组织中Ras、Raf-1> TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BP1的 表达情况。

  1. 体外培养人血管瘤内皮细胞(北纳创联生物技术有限公司提供,品名:HemECs, 货号:BNCC340867)并传代至第三代,取对数生长期细胞,血清饥饿处理24小时。 分组及处理:普蔡洛尔组加入含50(imol/L普蔡洛尔的培养液4mL,雌二醇组加入含 lng/L雌二醇的培养液4mL,对照组加入完全培养基4mL,继续孵育24小时,收集细 胞。Western blot检测血管瘤血管内皮细胞中Ras、Ra&l、TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BP1 蛋白表达,RT-PCR检测Ras、Ras、Ra&l、TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BPlmRNA的 表达,同期用流式细胞仪检测血管瘤血管内皮细胞周期的分布及凋亡率,分析各组 Ras、Rafl> TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BP1表达水平与血管瘤血管内皮细胞周期 分布及细胞凋亡的关系。

结果:1.增生期血管瘤(n=30)和退化期血管瘤(n=30)中,TSC2、4E-BP1. p70s6K、 Ras、Rafi、mTOR 的 平均光 密度值 分别为 0.176±0.024/0.2373±0.030、 0.181±0.027/0.218±0.030、0.159±0.031/0.228±0.032、0.369±0.034/0.337±0.032、 0.362±0.041/0.327±0.038、0.531±0.079/0.508±0.055,增生期血管瘤Ras、Ra&l 的平均 光密度明显高于消退期血管瘤(L3.665、3.478, PV0.01) , mTOR的平均光密度高 于消退期血管瘤(t=2.252, PV0.05);增生期血管瘤TSC2、p70s6K、4E-BP1的平均 光密度明显低于消退期血管瘤(L8.636、&365、4.709, P<0.01)。

  1. 普荼洛尔组、雌二醇组和对照组血管瘤内皮细胞的总凋亡率(%)分别为41±0.75、 3.41±0.40、4.84±0.45,与对照组比较,普荼洛尔组细胞凋亡率明显增加,雌二醇组细 胞凋亡率降低,差异均有显著性(2419.30, P<0.01) o
  2. 普蔡洛尔组、雌二醇组和对照组血管瘤内皮细胞的细胞周期分布(%)为Go/Gi:

74.53±1.66/50.47±1.05/60.21±1.14, S : 22.35±0.92/42.60±0.74/32.93±1.23 , G2/M : 3.14±1.10/6.92±1.04/6.84±0.36,三组比较,差异有显著性(^=13.77, P<0.01);与 对照组比较,普蔡洛尔组细胞的生长周期停滞于Go/Gi期,S期细胞数减少;雌二醇组 Go/Gi期细胞减少,S期细胞明显增加。

  1. 与对照组比较,普蔡洛尔组(n=3) TSC2、4E-BP1, P70S6K蛋白表达倍数分别为 568±0.192、1.534±0.140、1.690±0.123 ,较对照组明显增高,差异有显著性 (F=44.4266.75、136.41,PV0.01);Ras、Ra匸l、mTOR分别为0.585±0.030、0.527±0.040、 0.430±0.045,较对照组明显降低,差异有显著性(2109.96、43.41、726.30, PV0.01)。

雌二醇组(n=3)蛋白表达变化与普蔡洛尔组相反,TSC2、4E-BPK P70S6K蛋白表 达倍数分别为0.673±0.067、0.662±0.092、0.563±0.077,较对照组明显著降低,差异 有显著性(F=44.42、66.75、136.41, P<0.01); Ras、Rail、mTOR分别为 1.530±0.131、 1.534±0.225、1.548±0.042,较对照组明显增高,差异有显著性(2109.96、43.41、726.30, P<0.01)o

  1. 与对照组相比,普蔡洛尔组(n=3) TSC2、4E-BPK P70s6KmRNA表达倍数分别 为138±0.243、3.139±0.331、2.297±0.099,较对照组明显增高,差异有显著性(F=74.92、 38.10、246.34, P<0.01);Ras、Rati、mTORmRNA表达倍数分别为0.555±0.076、 0.339±0.068、0.403±0.103,较对照组明显降低,差异有显著性(F=47.42、96.34、36.03, P<0.01)o雌二醇组(n=3)各基因mRNA表达变化与普蔡洛尔组相反,TSC2、4E・BP1、 P70S6KmRNA表达倍数分别为0.439±0.102、0.481±0.086> 0.614±0.060,较对照组明 显降低,差异有显著性(F=74.92、38.10、246.34, P<0.01); Ras、Rafl> mTORmRNA 表达倍数分别为1.849±0.214、1.604±0.094、1.434±0.127,较对照组明显增高,差异 有显著性(F=47.42、96.34、36.03, P<0.01)o

结论:1.小儿血管瘤血管内皮细胞中有Ras信号通路关键信号分子的表达,血管瘤增 生期Ras、Raf-1> mTOR表达高于消退期,TSC2、p70s6K、4E-BP1表达低于消退期。

2.普蔡洛尔通过负性调控Ras信号通路,上调TSC2,抑制mTOR/p70s6k信号通路,使 体外培养人血管瘤内皮细胞细胞周期停滞于Go/Gi期,诱发细胞凋亡。雌激素则相反。

关键词:血管瘤;血管内皮细胞;体外培养;Ras信号通路;调控

The expression and regulation of Ras signaling pathway in
hemangioma endothelial cells

Abstract

Objective To observe the expression of key signaling molecules of Ras signaling pathway in childhood hemangioma tissues at different stages, regulate the expression of Ras signaling pathway in human hemangioma endothelial cells cultured in vitro, and explore the effect of Ras signaling pathway on hemangioma vascular endothelial cells and the mechanism.

Methods: 1 .Tissue samples from the department of pediatric surgery of the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University that were surgically removed and pathologically diagnosed as capillary hemangioma between 2005 and 2017 were collected, and reclassified and divided according to Mulliken classification and ki-67 expression, then 30 proliferative hemangioma and 30 degenerative hemangioma samples were extracted, respectively. The expression of Ras, Raf-1, TSC2, mTOR, p70s6K and 4E-BP1 in proliferative and degenerative hemangiomas was detected by immunohistochemistry and compared.

2.Human hemangioma endothelial cells were cultured in vitro (provided by BeNa pioneering biotechnology co.,LTD.,product name:HemECs, article number: BNCC340867) and subcultured to the third generation. Logarithmic growth phase cells were taken and treated with serum starvation for 24 hours. Grouping and treatment: 4mL medium containing 50ymol/L of propranolol was added to the propranolol group, 4mL medium containing O.lng/L of estradiol was added to the estradiol group, and 4mL complete medium was added to the control group. Cells were further incubated for 24 hours to collect cells.Western blot was used to detect the expressions of Ras, Rati, TSC2, mTOR, p70s6K, and 4E-BP1 in hemangioma vascular endothelial cells, and RT-PCR was used to detect the expressions of Ras, Raf-1? TSC2, mTOR, p70s6K and 4E-BP1 mRNA. Meanwhile, the cell cycle and apoptosis rate of vascular endothelial cells in hemangioma were detected by flow cytometry.Finally, the relationship between the expression levels of Ras, Rati, TSC2, mTOR, p70s6K and 4E-BP1 in each group and the vascular endothelial cell cycle distribution and apoptosis was analyzed.

Results: l.In proliferative hemangioma (n=30) and degenerative hemangioma (n=30), the mean optical density (Mean OD) of TSC2 , 4E-BP1, p70s6K, Ras, Raf-1 and mTOR are 0.176±0.024/0.2373±0.030,0.181±0.027/0.218±0.030,0.159±0.031/0.228±0.032, 0.369±0.034/0.337±0.032,0.362±0.041/0.327±0.038,0.531±0.079/0.508±0.055respectively. Mean OD of Ras and Raf-1 in proliferative hemangioma was significantly higher than that in degenerative hemangioma (t=3.665, 3.478, P < 0.01), and Mean OD of mTOR was higher than that in degenerative hemangioma (t=2.252, P<0.05). Mean OD of TSC2, p70s6K and 4E-BP1 in proliferative hemangiomas were significantly lower than that in regressive hemangiomas (t=&636, &365, 4.709, P<0.01).

  1. The total apoptosis rate (%) of hemangioma endothelial cells in the propranolol group, the estradiol group and the control group werel5.41±0.75,3.41±0.40 and 4.84±0.45, respectively. Compared with the control group, the apoptosis rate in the propranolol group was significantly increased, while that in the estradiol group was decreased (F=419.30, P <0.01).
  2. The cell cycle (%) of hemangioma endothelial cells in the propanolol group, estradiol group and control group was G0/Gi(74.53±l .66/50.47±l .05/60.21±l. 14), S(22.35±0.92/42.60±0.74/32.93±1.23), G2/M(3.14±1.10/6.92±1.04/6.84±0.36) , Three comparisons, the difference was significant (%2=13.77, P< 0.01).Compared with the control group, the cells growth of propranolol group was stagnated in G°/Gi phase, and the number of cells in S phase was decreased. In estradiol group, G°/Gi phase cells were decreased while S phase cells were significantly increased.
  3. Compared with the control group, protein expression multiples of TSC2,4E-BP1 and p70s6K in the propranolol group (n=3) were 1.568±0.192,1.534±0.140 and 1.690±0.123respectively, which were significantly higher than those in the control group (F=44.42,136.41 and 66.75, P<0.01). Ras,Rati and mTOR, were 0.585±0.030、 527±0.040 and 0.430±0.045, respectively, significantly lower than the control group (F=109.96 ,43.41and726.30, P<0.01). The protein expression levels of TSC2, 4E-BP1 and p70s6K in the estradiol group (n=3) are 0.673±0.067, 0.662±0.092 and 0.563±0.077 respectively, which were significantly lower than those in the control group (F=44.42, 66.75 and 136.41 P<0.01). Ras,Ratl and mTOR, werel.530±0.131 ,1.534±0.225 and 1.548±0.042, respectively, significantly higher than the control group (F=109.96 ,43.41 and 726.30, P<0.01).
  4. Compared with the control group, the mRNA expression multiples of TSC2 ,4E-BP1 and p70s6K in the propranolol group (n=3) were 2.138±0.243, 3.139±0.331 and 2.297±0.099 and respectively, which were significantly higher than those in the control group (F=246.34, 74.92 and 38.10, P<0.01). The mRNA of Ras, Raf^l and mTOR, were 0.555±0.076, 0.339±0.068 and 0.403±0.103, respectively, significantly lower than the control group (F=47.42, 96.34 and 36.03, P<0.01). The mRNA expression multiples of TSC2,4E-BP1 and p70s6K in the estradiol group (n=3) were 0.439±0.102,0.481±0.086 and 0.614±0.060 respectively, which were significantly lower than those in the control group (F=246.34, 74.92, and 38.10, P<0.01). The mRNA of Ras, Raf^l and mTOR are 1.849±0.214, 1.604±0.094 and 1.434±0.127 respectively, significantly higher than the control group (F=47.42 ,96.34 and 36.03 ,P<0.01).

Conclusions: l.The expression of key signaling molecules of Ras signaling pathway was found in vascular endothelial cells of hemangioma in children. The expression of Ras, Rati and mTOR in the proliferative phase of hemangioma was higher than that in the degenerative phase, while the expression of TSC2, p70s6K and 4E-BP1 was lower than that in the degenerative phase.

2.Propranolol negatively regulates Ras signaling pathway, up-regulates TSC2, inhibits mTOR/p70s6k signaling pathway, and stasis the cell cycle of cultured human hemangioma endothelial cells in G°/Gi phase, and induces cell apoptosis. Estrogen was the opposite.

Key words Hemangioma; Vascular endothelial cells; In vitro culture; Ras signaling pathway; Regulation

婴幼儿血管瘤(infantile hemangioma, IH)由胚胎时期血管网增生所形成,属于 一种婴幼儿较为常见的良性肿瘤,在新生儿中的发病率可达8〜10%⑴,男女比例约 1:3〜5⑵,早产儿发病率比非早产儿高,体重低于1000g的早产儿中可达30%,部分 血管瘤早期快速增生后期又逐渐自然消退,目前对其自行消退和快速增生的机制缺乏 了解。对于大范围,生长速度迅速的血管瘤,尤其生长于特殊部位的血管瘤,譬如腮 腺区域、眼耳口鼻、肛门及生殖器等部位的血管瘤,瘤体容易破溃出血,会阴部位血 管瘤容易感染,破坏器官结构、导致疤痕、毁容及影响器官功能等,一些特殊部位的 血管瘤可能并发血小板减少综合征、脑部、肝部等血管瘤综合征甚至可能危及生命。 应积极干预治疗,预防及减少并发症发生卩句。目前临床所采用的各种治疗方法各有 其不同程度的副作用和局限性,其原因是人们对血管瘤的增殖及消退机制知之有限, 很多学者对血管瘤发病机理进行了相关研究,近些年来有研究表明血管瘤增生消退与 细胞凋亡、细胞内基因表达的变化、细胞因子的表达变化、细胞成分的变化等机制有 关。但目前其发病机制仍然未被揭示血刃。因此,对血管瘤促使其退化、特异性抑制 血管瘤及发病机理的研究将为血管瘤的临床治疗提供广阔的前景。

Ras传导通路(图1)存在于几乎所有真核细胞中,Ras为三磷酸鸟昔结合蛋白, 激活后的Ras与胞浆中的Raf・l的CR1保守区结合使Raf・l固定于细胞膜内侧,Raf・l 一旦与胞膜的脂质层相互作用即可暴露出其激酶功能区,进一步可能由其它非Ras 依赖的信号分子而激活。活化的Raf-1通过磷酸化促分裂原激活的蛋白激酶的激酶 (MEK)环上的丝氨酸残基而将其激活。活化的MEK再将细胞外信号调节激酶ERK 激活,激活的ERK通过抑制TSC2, Tsc蛋白缺失导致mTOR-p70S6K通路(图2) 本构性激活[⑼,活化的mTOR磷酸化下游p70s6k及4E-BP1促进蛋白质翻译,使细 胞周期缩短为从G1期直接进入S期,细胞大量增殖。当mTOR/p70s6k信号通路抑 制时,mTOR活化受阻,抑制p70s6k及4E-BP1磷酸化,进而抑制4E-BP1合成的起 始阶段并使蛋白合成减少,细胞周期停滞于Go/Gi期,并且诱发细胞凋亡⑴]。柯少波 等[⑵研究发现P21Ras在血管瘤组织中表达明显高于正常皮肤组织,提示Ras通路可 能与血管瘤的发生发展存在联系。我们的前期研究表明,抑制mTOR/p70s6k信号通 路后,血管瘤血管内皮细胞停滞于G0/Gi期,细胞凋亡率大大增加[1344] o但 Ras/Raf7ERK/mTOR/p70s6k信号通路与血管瘤的关系尚未见报道。

普蔡洛尔治疗IH的临床效果已广泛得到认可,但其作用方式和机制尚不清楚。 可能的作用机制包括血管收缩、通过抑制VEGF等抑制血管生成等QI。也有报道认 为,VEGF与其受体KDR结合后引发细胞内包括Ras等一系列信号通路,导致血管 内皮细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、细胞骨架重排、血管渗透等过程[⑹。因此我们 推测普蔡洛尔是否通过抑制与血管瘤增生活化密切相关的Ras、mTOR等的基因和蛋 白的表达,从而达到治疗婴幼儿血管瘤的目的。此外,相关研究表明雌激素可以通过 激活Ras信号通路导致肿瘤发病"I。

因此,本研究试图通过检测Ras、Ra&l、TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BP1在不 同时期小儿血管瘤组织中的表达,用普蔡洛尔和雌二醇正性/负性调控体外培养人血 管瘤内皮细胞中Ras信号通路的表达,探讨Ras信号通路对血管瘤血管内皮细胞的影 响及机制。

图1 Ras信号通路

mTOR Signaling

图2 mTOR信号通路

第一部分Ras信号通路在小儿血管瘤中的表达及意义

1材料与方法

1.1实验材料与仪器

1.1.1实验标本

收集遵义医科大学小儿矫形外科2005-2017年间手术切除并经病理诊断为毛细血 管瘤的组织标本,结合Mulliken分类法与Ki・67表达情况重新将标本进行分类和分期, 提取增生期血管瘤和消退期血管瘤标本各30例。其中女41例,男19例;年龄4个 月至13岁,平均年龄2.9±0.3岁。血管瘤分别位于躯干、四肢及颈部等部位的皮肤及 皮下。所有病例均因血管瘤瘤体增长迅速或瘤体破溃,患儿家长强烈要求而手术切除 瘤体,并在征得家长同意后使用切除的血管瘤标本。

1.1.2主要实验试剂

兔抗人mTOR单克隆抗体 Abeam公司
快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物

兔抗人Ras单克隆抗体

福建迈新试剂公司

Abeam公司

兔抗人Ki・67多克隆抗体 Abeam公司
兔抗人Raf-1单克隆抗体 Abeam公司
兔抗人TSC2单克隆抗体 Abeam公司
DAB试剂盒 北京中杉金桥公司
兔抗人p70s6K单克隆抗体

免疫组化SP法试剂盒

Abeam公司

北京中杉金桥公司

兔抗人4E-BP1单克隆抗体 免疫组化SP法试剂盒

1.1.3主要实验仪器

Abeam公司

北京中杉金桥公司

LICA石蜡切片机 LICA RM2245
LICA显微镜

LICA显微摄像系统

LICA DFC 280

1.2实验方法

使用中性的10%福尔马林,将全部的标本予以固定,所有切片都使用石蜡包埋, 之后将所有的石蜡切片,制成厚2pm的切片后采用HE染色。检测Ras、Raf-1> TSC2、 mTOR、p70s6K、4E-BP1 及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,Ki-67)蛋 白在血管瘤内皮细胞中的表达情况,使用的方法为免疫组织化学SP法;Ki・67、Ras、 Raf-1> TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BP1 阳性对照组织及一抗浓度见(表1) , PBS 缓冲液切片作阴性对照。

1血管瘤增殖期、消退期各指标阳性对照组织及一抗浓度

  Ki-67 Ras RaM TSC2 mTOR p70s6K 4E-BP1
阳性对

照组织

人乳腺癌 人正常

皮肤

人子宫 内膜癌 人肺组织 大鼠睾丸 人乳腺癌 人结肠癌
一抗浓度 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100

1.2.1使用HE方法染色各组组织病理切片的实验步骤(脱蜡、水化、染色)

于染色缸中放入石蜡切片,经二甲苯I和二甲苯II各脱蜡lOmin,脱蜡后在将石 蜡切片放入无水酒精I中浸泡4mim无水酒精II中浸泡4min,将其依次放入95%酒 精、80%酒精、70%酒精、50%酒精中分别浸泡4min,采用蒸憎水缓水冲洗5s,总共 3次,0.01MPBS溶液冲洗5mim总共3次,水洗10mino使用蒸憾水清洗5s,苏木 精染液5min,水洗lOmin, 1%盐酸乙醇分化10s, 95%乙醇10s,盐酸乙醇沉淀伊红 10s, 95%乙醇10s,乙醇脱水,二甲苯透明,最后中性树胶封片。

1.2.2免疫组化检测

石蜡切片脱蜡,使用二甲苯,酒精浓度梯度递减,并至水,使用3%双氧水过后, 在于室温下孵育6-10min,在使用蒸憎水浸泡,时间2min,表面抗原的修复使用柠檬 酸,用其沸水浴15min,然后保压2min,并将其冷却到室温,采用PBS冲洗3min/次, 总共冲洗3次,组织表面的水分,可以使用吸水纸吸干,并将按适量比例稀释的一抗 均匀的滴加其上,放于4°C冰箱,过夜,恢复到室温,PBS冲洗3min/次,总共冲洗3 次,组织表面的水分使用吸水纸将其吸干,之后滴加二抗,37°C的温度下孵育,时间 为20min, PBS冲洗3min,总共冲洗3次,DAB显色,在显微镜下仔细的观察,并根据 情况采用蒸憾水终止显色,然后使用流动水冲洗,时间为2min,在使用苏木素复染, 时间为4min,水洗3min,分化使用盐酸酒精,时间为10s,用流动水冲洗,时间为5min, 在使用梯度酒精脱水、并且透明、最后采用中性树胶封片。

1.3染色结果的判定

胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性染色细胞,且具有阳性颗粒定性、定位好, 清晰的细胞结构,背景明显低于着色等特点。使用PBS代替一抗进行染色与阴性对 照组对照。并采用免疫组织化学法行结果判断,出现棕黄色或棕黑色颗粒为阳性细胞 (表2),不着色为阴性细胞。

2血管瘤增殖期、消退期各指标判断(出现棕黄色或棕黑色颗粒为阳性细胞)

  Ki-67 Ras Raf-1 TSC2 mTOR p70s6K 4E-BP1
阳性颗粒

定位部位

细胞核 细胞膜 细胞膜 细胞浆 细胞核 细胞浆 细胞浆

1.4图像分析

切片用Leica DM1000图像采集系统拍照,每组随机选取30张相同放大倍数拍照 的图片,采用 IPWIN6 软件对 Ki-67> Ras、Rafl> TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BP1 蛋白阳性表达的平均水平进行测量分析,细胞质棕黄色或者棕黑色染色区域为阳性表 达区域。图片的平均光密度值(MeanOD)越大代表该图片中目的蛋白的平均表达水 平越高。

1.5统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行独立样本t检验统计分析,结果以均数士标准差(% 士s)表示,检验水准(1=0.05。

2结果

2.1血管瘤增生期和退化期的组织病理学情况

增生期血管瘤的组织中,可见血管内皮细胞呈团块状或条索状增生,其间可见完 整的血管腔和不规则的内皮间隙,血管内皮淡染且细胞核肥大(图la);退化期血管瘤 组织中,见到血管腔增大,血管内皮细胞减少,血管间结缔组织增多,血管内皮细胞 核呈偏平状(图lb)o Ki・67在增生期血管瘤中高表达,而在消退期血管瘤中表达极弱 (图 2a、b)o

a增生期血管瘤;b消退期血管瘤

1增生期血管瘤增生期和退化期的组织病理学变化(HEx400)

a增生期血管瘤;b消退期血管瘤

2 Ki-67在血管瘤中的表达情况(HEx400)

2.2 Ras> Raf-1> TSC2mTORp70s6K4E-BP1 在血管瘤组织中的表达情况。

血管瘤增生期Ras、Raf-1> mTOR表达高于消退期,TSC2、p70s6K、4E-BP1表 达低于消退期(图3)。增生期血管瘤(n=30)和退化期血管瘤(n=30)中,TSC2、 4E・BP1、p70s6K、Ras、RafKmTOR 的平均光密度值分别为 0.176±0.024/0.2373±0.030、 0.181±0.027/0.218±0.030、0.159±0.031/0.228±0.032、0.369±0.034/0.337±0.032、 0.362±0.041/0.327±0.038、0.531±0.079/0.508±0.055,增生期血管瘤Ras、Rati 的平均 光密度明显高于消退期血管瘤(L3.665、3.478, P<0.01) , mTOR的平均光密度高 于消退期血管瘤(t=2.252, PV0.05);增生期血管瘤TSC2、p70s6K、4E-BP1的平均 光密度明显低于消退期血管瘤(L8.636、&365、4.709, P<0.01)(表3)

al:增生期血管瘤Ras; a2:消退期血管瘤Ras; bl:增生期血管瘤Raf-1; b2:消退期血管瘤Raf-1;

cl:增生期血管瘤TSC2; c2:消退期血管瘤TSC2; dl:增生期血管瘤mTOR; d2:消退期血管瘤mTOR; fl:增生期血管瘤p70s6K; fl消退期血管瘤p70s6K; gl:增生期血管瘤4E-BP1; g2:消退期血管瘤4E-BP1

3 RasRaf-1 > TSC2mTORp70s6K 4E-BP1 的表达情况(免疫组化x400)

3血管瘤增殖期、消退期各指标的平均光密度值比较(无土sn=3)

  n Ras RaM TSC2 mTOR p70s6K 4E-BP1
增生期 30 0.369±0.034 0.362±0.041 0.176±0.024 0.531±0.079 0.159±0.031 0.181±0.027
消退期 30 0.337±0.032 0.327±0.038 0.237±0.030 0.508±0.055 0.228±0.032 0.218±0.030
t值   3.665 3.478 8.636 2.252 &365 4.709
P值   PV0.01 PV0.01 PV0.01 0.02 PV0.01 PV0.01

第二部分 调控Ras信号通路对体外培养血管瘤

血管内皮细胞的影响

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1细胞来源

人血管瘤内皮细胞(HemECs)(由北纳创联生物技术有限公司提供),作为本 实验细胞培养的血管瘤内皮细胞。

 BNCCBwZa Culture Uollectuxi 北纳创联生物技术有限公司4000-677-678

细胞说明书

一、细胞名称:HemECs

二、货 号 t BNCC340867

三、生长特性: ■贴壁 □悬浮 口半悬浮半贴壁

四、细胞生长条件’

培养基 90% 高糖 DMEM
血清 )0% FBS (Diagnovum)
温度 37 r
空气条件 5% CO3, 95% AIR
冻存条件 培养基5% 血清4(%DMSO 10%
1.1.2主要实验仪器设备
流式细胞仪 BD公司型号FACSVerse
YJ-875医用净化工作台 苏州净化设备厂
细胞培养箱 美国Thermo公司
CO2培养箱 日本SANYO公司
低温台式离心机 德国Eppendorf公司
低温冷冻离心机 德国Sigma公司
Milli-Q超纯水装置纯水机 香港 Millipore Trading 公司
LI-COR Odyssey(ODY-2533) LI.COR生物技术有限公司
ES-315高压灭菌消毒锅 日本Tomy公司
Real-time检测仪 德国Sigma公司
倒置显微镜 德国Leica公司
水浴锅 Leica型号HI1210水浴锅

一体式化学发光成像仪

FASCalibur流式细胞仪

BIO-RAD电泳/电转仪

电泳仪

电转仪

酶标仪

移液器

1.2主要实验试剂及耗材

1.2.1主要试剂及耗材

ECL发光液

RPMI 1640培养基

胰蛋白酶(1:250)

PBS磷酸盐缓冲液

胎牛血清

二甲双弧

Trizol试剂

25cn?塑料细胞培养瓶

CCK-8试剂盒

FITC Annexin V Apoptosis detection

兔抗人4E-BP1单克隆抗体

兔抗人p70s6K单克隆抗体

兔抗人TSC2单克隆抗体 鼠抗人P-actin单克隆抗体

兔抗人mTOR单克隆抗体

兔抗人Ras单克隆抗体

兔抗人Raf-1单克隆抗体

辣根酶标记的山羊抗小鼠(H+L)抗体 辣根酶标记的山羊抗鼠IgG

辣根酶标记的山羊抗兔IgG LI.COR生物技术有限公司
RIPA裂解液(强) 北京索莱宝有限公司
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 北京百奥思科公司
BCA蛋白定量试剂盒 上海Generay公司
彩色预染蛋白质分子量标准 北京索莱宝公司
5x蛋白上样缓冲液 北京索莱宝公司
PVDF 膜 Millopore 公司
l.OM Tris-HCl,pH=6.8 电泳缓冲液 上海国药公司
10% SDS 上海国药公司
10%过硫酸鞍 德国SIGMA公司
TEMED 德国SIGMA公司
5*蛋白上样缓冲液 日本TAKARA公司
蛋白预染Marker 美国Thermo公司
丽春红S 上海国药公司
pvdf 膜 美国Millipore公司
5%的 BSA BIOSHARP 公司
75%乙醇 无锡展望公司
PBS 上海国药公司
BCA蛋白定量试剂盒 BIOSHARP 公司
30%丙烯酰胺(29:1) 上海国药公司
雌二醇注射液 天津金耀药业有限公司
l.OM Tris-HCl pH=8.8 电泳缓冲液 上海国药公司
1.2.2主要试剂配制  

⑴普荼洛尔:称取适量普荼洛尔溶于双蒸水,配置IL 50(imol/L的心得安,按分子量 295.8计算,需要14.79mg,配制成浓度为50|imol/L储备液,过滤,4°C保存备用。

⑵青链双抗溶液:用100万单位链霉素溶解于100mL生理盐水中,再取80万单位青 霉素溶解于80mL配好的混合液中,配好为100万单位/mL的双抗混合液浓度,过滤 后,分别取ImL分装,・20。。保存备用。

⑶无血清培养基:依次将ImL双抗溶液、0.2mL肝素向100mLRPMI1640培养基中, 混匀,4。(2保存备用。

⑷完全培养基:依次将15mL胎牛血清、双抗溶液ImL、肝素0.2mL加入 85mLRPMI1640培养基中,混匀,4。(2保存备用。

⑸5%浓缩胶:0.67mL 30%Acr-Bis(29: 1)、2.7mL 双蒸水、0.04mL 10%SDS、0.5mL IM Tris(pH=6.8)> 0.004mL TEMED, 0.04mL 10%过硫酸鞍、溶液总量为 4mL。

⑹ 10%分离胶:3.3mL 30%Acr-Bis(29: 1)、2.7mL 双蒸水、O.lmL 10%SDS、3.8mL IM Tris(pH=&8)、0.004mL TEMED O.lmL、10%过硫酸鞍,溶液总量为 10mL。

⑺0.1%TBST:采用500mL TBS缓冲液溶解0.5mL Tween,混匀,4°C保存。

⑻5x电转液:75.lg甘氨酸、15.lg Tris,三蒸水定容至lOOOmLo (lx电转液:200mL 甲醇溶液,100mL5x电转液,三蒸水定容至1000mL)o

⑼5x电泳缓冲液:15.1gTris> 900mL双蒸水、5g SDS、94g甘氨酸,三蒸水定容至 lOOOmLo (lx电泳液:200mL5x电泳液,三蒸水定容至1000mL)。

1.3实验方法

1.3.1人血管瘤内皮细胞(HemECs)的复苏、培养及传代

(1)人血管瘤内皮细胞(HemECs)复苏及培养

1) 从液氮罐中取出人血管瘤内皮细胞珠人HemECs细胞冻存管一支,并在培养箱稳 定4小时左右,迅速投入37°C恒温水浴箱中,用银子夹住、不断摇动使之尽快解冻 融化,lmin内取出;再依据细胞密度,换液培养。

2) 将冻存管转至无菌台下,并用消毒酒精擦拭外表,无菌操作转移冻存管内的 HemECs细胞到无菌离心管中,2000rpm离心5min沉淀细胞。

3) 用完全培养基悬浮沉淀的HemECs细胞,并转移到无菌培养瓶中,将培养瓶组织 粘附面向上放入37°C (含5%CO2)培养箱中,8h后,加入ImL完全培养基,将培 养瓶组织粘附面向下放入培养箱中孵育,每日更换培养基,定期观察细胞状态。密切 观察,待大量梭形或不规则细胞向周围爬出,且占满培养瓶空白区域大于75%后,向 培养瓶中加入4mL完全培养基。隔日更换培养基,待细胞数占瓶底面积大于75〜80% 后,予以传代后培养。

(2)细胞传代

1) 细胞覆盖率达70〜80%左右时,吸尽细胞培养瓶内培养液,用PBS液冲洗细胞三 遍;

2) 加入力呢〜3mL 0.25% EDTA的胰酶(以覆盖瓶底为宜)消化(注意把握消

化时间,通常控制在1〜2min),镜下观察消化情况,在细胞边缘缩小,贴壁运动时 (不建议消化到细胞漂浮)去掉胰酶。

3) 弃去消化液,向瓶底加入2mLPBS液,轻轻转动培养瓶,把残留消化液洗掉,加 入6〜8mL完全培养基,轻轻吹打细胞层,尽量把细胞层吹落、吹散。

4) 用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离,形成细胞悬液,按 1:2分瓶传代后,置3代,5%CO2培养箱内培养。

5) 注意培养基pH值变化情况,定期换液,待细胞密度达到70-80%时重复传代操作 或者冻存。

1.3.2细胞同步化

获取生长状态良好的对数期细胞,弃掉培养基,并使用PBS冲洗,再加入不完 全培养基,培养箱内孵育24小时。

1.3.3细胞同步化后分组

将细胞分别分为普蔡洛尔组、雌二醇组及对照组,并按照上述分组进行加药处理, 药物作用浓度为普蔡洛尔组普蔡洛尔50giol/L、雌二醇组雌二醇0.1ng/L,对照组加 入完全培养基,24h后显微镜拍照观察细胞形态变化,并收样进行后续实验。

1.3.4流式细胞术检测血管瘤内皮细胞周期及凋亡

(1)检测血管瘤内皮细胞凋亡

1) 收集各组同步化后分组处理的细胞进行细胞凋亡检测:用不含EDTA的胰酶消化 收集后(注:胰酶消化时间不宜过长,否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合),在室温中,1500rpm离心5min,收集细胞;

2) 细胞洗涤:用预冷PBS (4°C )重悬细胞一次,1500rpm离心5min,洗涤细胞;

3 )加入300|nL的Binding Buffer悬浮细胞;

4)Annexin V-FITC标记:加入5yL的Annexin V-FITC混匀后,避光,室温孵育lmin;

5) PI标记:再加入10此 的PI染色,轻轻混匀细胞,于避光条件下室温孵育10 min;

6) 流式细胞仪检测,CELL Quest软件分析。

(2)检测血管瘤内皮细胞周期

1) 胰酶消化收集同步化处理分组各组细胞,lOOOr/min离心3min,弃去培养液;

2) 将细胞沉淀用2 mL PBS洗涤1次;

3) 离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇,4°C固定过夜;

4) 1000 r/min离心3min弃去固定液,用PBS洗细胞,lOOOr/min, 3min离心;

5) 加入 500 此的 PBS 含 100 pig/mL RNase A, 37°C孵育 30min;

6) 30min后加入PI使其浓度为50 pig/mLo避光37°C孵育30min;

7) 冷PBS溶液洗涤细胞,1000 r/min, 3min离心;

8) 取200 yL的单细胞悬液,流式上机检测,CELL Qfiest软件分析。

1.3.5 RT-PCR 检测 Ras、Raf-1> TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BPlmRNA 的表达

(1) 总RNA抽提

1) 收集同步化后分组处理各组细胞,预冷的PBS洗涤3次,离心并弃上清;

2) 加入1 mLTrizol充分混匀,冰上静置5min;

3) 加入0.2mL氯仿,剧烈振荡15s,冰上静置3min;

4) 4°C 12000 r/min 离心 10min,取上清;

5) 加入0.5 mL异丙醇,混匀,冰上静置20-30min;

6) 4°C 12000 r/min 离心 10min,弃上清;

7) 加入1 mL 75%乙醇,洗涤沉淀。4°C, 12000 r/min,离心5min,弃上清;

8) 室温放置晾干或超净台中吹干,加入适量的Rnase<freeH2O溶解。

(2) cDNA 合成

1)按逆转录试剂盒说明书配制反应体系,见表4。

4逆转录反应体系

试剂 体积(|1L)
总RNA 5.0
Random Primer p(dN)6 (0.2 ug/niL) 1.0
Rnase-free ddH2O 5.0
5 x Reaction Buffer 4.0
dNTP Mix (10 mmol/L) 2.0
Rnase inhibitor (20 U/|iL) 1.0
AMV Reverse Transcriptase (10 U/|iL) 2.0
总体积 20.0
  • 混匀后,反应条件:37°C, 5min;42°C?60min; 70°C?10min,终止反应;
  • cDNA于・200C保存。
  • Real-timePCR
  • 引物由上海生工设计、合成,以管家基因GAPDH为内参,序列见表5。

5 Real-timePCR引物序列

Sequence (5'-3‘)

ATGGTGCTGGTGGGGAACAGGTGTG

Real time-PCR反应体系,根据Real time-PCR反应体系配制反应液。在PCR反应TGGCCGAGGTCTCGATGTAGGGGAT GAAAACCCCCGTGCCAGCACAAAGA TTCCAAAAGAGCCTGACCCAATCCG CGCAGGGGCAAGAGAGTAGAGAGGG CGCCAAAGAAGGGGGAATGGTAGAG GGAGAGCGTCTGAGAGAAGAAATGG CCTGGAAACTGGTGAAGGGGGTAAT GTGCTGTGGATTGGTGGAGTTTGGG TGGCTTCTTGTGTGAGGTAGGGAGG GTCGGAACTCACCTGTGACCAAAAC ATGTCCATCTCAAACTGTGACTCTT

管中分别加入 ddH2O> SybrGreen qPCR Master Mix、Forward primer> Reverse primer> cDNA模板,充分混匀。反应体系按照表6配制。

6 Real time-PCR反应体系

Component Volume(|iL)
ddH?O 7.0
SybrGreen qPCR Master Mix (2x ) 10.0
Forward primer 10 uM 1.0
Reverse primer 10 uM 1.0
cDNA 1.0
Total volume 20.0

3) PCR 扩增条件,扩增条件:94°C 10 min, (94°C 20s, 55°C 20s, 72°C 20s) 40 个循环(4) Real-Time PCR 数据处理

采用2-aact的方法,用三次重复的平均值计算出基因的相对表达量。实验组与对 照组的相对定量之比即为改变倍数(2"),公式如下:倍数改变=2-aact, -AACT =[(CT目标基因一CT内参)实验组一(CT目标基因一CT内参)对照组],倍数改变=2・[(CT目标 基因一CT内参)实验组一(CT目标基因一CT内参)对照组]o

1.3.6 Western Blot 检测 Ras、Raf-1> TSC2、mTOR、p70s6K、4E-BP1 的 表达(1)蛋白提取及定量

1) 总蛋白提取:弃除培养液,PBS溶液洗涤2次。按RIPA裂解液:PMSF溶液: 蛋白酶抑制剂=100:10:1的比例配制裂解液,中加入200yL蛋白提取液,置于冰上裂 解lOmin,再将细胞刮下,将细胞裂解液转至离心管,离心20 min (12000 rpm, 4°C), 小心吸取上清待用。

2) 蛋白定量:

a.标准曲线的绘制:取一块酶标板,按照下表加入试剂:

孔号 0 1 2 3 4 5 6 7
蛋白标准溶液(|nL) 0 1 2 3 4 5 6 7
去离子水(|1L) 20 19 18 17 16 15 14 13
对应蛋白含量(昭) 0 5 10 15 20 25 30 35
  1. 根据样品数量,按(A溶液:B溶液)=50:1配制一定量的BCA工作液,置 于冰上待用;
  2. 每个样品孔中加入2此蛋白样品,用9%NaC 1溶液分别补至20^;
  3. 各标准品孔和样品孔分别加入BCAI作液200yL, 37°C反应30 min;
  4. 用酶标仪测定590 nm波长处各吸光值,根据蛋白标准曲线计算出各样品蛋白

的浓度。

浓度 OD OD-ODxft   蛋白定量标准曲线
0 0.065 0  
0.25 0.136 0.071 05

=04

03

 
 
0.5 0.21 0.145 y=0.2DD2K +0.0083 Ra =0:9987
0.75 0.271 0.206 g 02  
 
1 0.328 0.263 O 0.1  
1.25 0.39 0.325 0 1

(

) 0.5 1 U 2
1.5 0.457 0.392   蛋白浓度(mg'ml)
1.75 0.516 0.451    
样本名称 OD 浓度(mg/mL)
对照组 0.196 3.846394984
普蔡洛尔(0.05(imol/L) 0.223 4.692789969
雌二醇(0.1ng/L) 0.23 4.912225705

(2) Western blot 检测

1)蛋白样品的制备:在提取的蛋白中加入5x蛋白上样缓冲液,放入沸水中水浴5min

变性,置于冰上。

2)制胶:根据待检测蛋白分析量大小确定分离胶浓度,各浓度按表7配制

7分离胶和浓缩胶的配制(niL)

试剂 浓缩胶5% 分离胶8% 分离胶12% 分离胶15%
ddH2O 1.4 2.3 1.6 1.1
30%丙烯酰胺混合液 0.33 1.3 2.0 2.5
1.5MTris-HCl(pH8.8) 1.3 1.3 1.3
1.0MTris-HCl(pH6.8) 0.25
10% SDS 0.02 0.05 0.05 0.05
10%过硫酸鞍 0.02 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.002 0.002 0.002 0.002
总体积 2 5 5 5

3)上样:轻轻拔取制胶梳子后上样,上样的蛋白总量为30憾。

4)电泳:调节电压为80 V进行电泳,30 min后再调节电压为120 V继续电泳。

5) 转膜:先用甲醇浸泡PVDF膜15s,将处理好的PVDF膜放入转膜缓冲液中平衡 15 mine将凝胶平放在阴极侧滤纸上后,再将PVDF膜平整地放在胶上,除去气泡, 电转夹夹上,放入转膜槽中,倒入转移缓冲液。

6) 封闭:转膜结束后,用Western洗涤液漂洗蛋白膜(1-2 min)。除去洗涤液,加 入封闭液,放在摇床上缓慢振荡60 mino

7) 孵育一抗:根据说明书确定一抗稀释比例,用封闭液稀释抗体至合适浓度,4°C过 夜孵育。

8) 二抗孵育:待一抗孵育结束后,TBST冲洗3次,每次5min。吸除PVDF膜表面 的TBST溶液,置于用封闭液配制的二抗中,37°C孵育1 h。孵育结束后,TBST冲 洗3次,每次5min。

9) 显色:在膜上加入适量的ECL发光液,利用一体式化学发光仪拍摄照片。

1.4统计学处理

数据采用SPSS 18.0和Graphpad统计软件进行统计学分析,结果用均数士标准 差(无士s)表示,细胞实验资料数据中多组数据间比较应用单因素方差分析,细胞周 期资料组间比较差异性分析采用卡方检验,检测水准a=0.05。

2结果

2.1血管瘤血管内皮细胞体外培养的生物学特征

人血管瘤内皮细胞(HemECs)贴壁生长,3〜4天后出现细胞增殖,2周后细 胞混合成片,3周后细胞基本上铺满培养瓶底部,甚至细胞聚集处可见铺路石样排列。

(图4)

4体外培养的人血管瘤内皮细胞

2.2药物作用后三组细胞形态观察

显微镜观察三组细胞的状态:对照组和雌二醇组细胞状态很好,而普蔡洛尔组细

胞有损伤。(图5)

5对照组、普蔡洛尔组及雌二醇组作用后的细胞形态

2.3血管瘤血管内皮细胞凋亡情况

普荼洛尔组、雌二醇组和对照组血管瘤内皮细胞的总凋亡率(%)分别为 15.41±0.75、3.41±0.40、4.84±0.45,与对照组比较,普蔡洛尔组细胞凋亡率明显增加, 雌二醇组细胞凋亡率降低,差异均有显著性(F=419.30, P<0.01) o (图6)

6各组细胞凋亡散点图
对服细 蒂荼济尔细 雌一諄如

2.4血管瘤血管内皮细胞细胞周期的分布情况

普蔡洛尔组、雌二醇组和对照组血管瘤内皮细胞的细胞周期分布(%)为Go/Gi:

74.53±1.66/50.47±1.05/60.21±1.14, S : 22.35±0.92/42.60±0.74/32.93±1.23 , G2/M : 3.14±1.10/6.92±1.04/6.84±0.36,三组比较,差异有显著性(犷=13.77, P<0.01);与 对照组比较,普蔡洛尔组细胞的生长周期停滞于Go/Gi期,S期细胞数减少;雌二醇组 Go/Gi期细胞减少,S期细胞明显增加。(图7、8,表8)

8对照组、普蔡洛尔组及雌二醇组细胞周期分布比较(丘土sn=3)

细胞周期 对照组 普蔡洛尔组 雌二醇组 /值 P
G0/G1 60.21il.14 74.53±1.66 50.47±1.05    
S 32.93±1.23 22.35±0.92 42.60±0.74 13.77 PV0.01
G2/M 6.84±0.36 3.14±1.10 6.92±1.04    

2.5 RT-PCR检测各组血管瘤血管内皮细胞中RasRaf-lTSC2mTORp70s6K4E-BPlmRNA 表达情况

与对照组相比,普荼洛尔组(n=3) TSC2、4E-BPK p70s6KmRNA表达倍数分 别为2.138±0.243、3.139±0.331、2.297±0.099,较对照组明显增高,差异有显著性 (F=74.92、3&10、246.34, P<0.01); Ras、Rafl> mTORmRNA表达倍数分别为 0.555±0.076、0.339±0.068、0.403±0.103,较对照组明显降低,差异有显著性(F=47.42、 96.34、36.03, PV0.01)。雌二醇组(n=3)各基因mRNA表达变化与普蔡洛尔组相反,

TSC2、4E-BP1 > P70S6K mRNA表达倍数分别为0.439±0.102、0.481±0.086、 0.614±0.060,较对照组明显降低,差异有显著性(F=74.92、38.10、246.34, P<0.01); Ras、Rafl> mTORmRNA表达倍数分别为 1.849±0.214、1.604±0.094、1.434±0.127, 较对照组明显增高,差异有显著性(F=47.42、96.34、36.03, P<0.01)o (表9、图9)

9各基因mRNA与对照组相比的表达倍数(X+s n=3)

组别 Ras Raf-1 TSC2 mTOR p70s6K 4E-BP1
普蔡洛尔组 0.555±0.076 0.339±0.068 2.138±0.243 0.403±0.103 2.297±0.099 3.139±0.331
雌二醇组 1.849±0.214 1.604±0.094 0.439±0.102 1.434±0.127 0.614±0.060 0.48U0.086
F值 47.42 96.34 74.92 36.03 246.34 38.10
P值 PV0.01 PV0.01 PV0.01 PV0.01 PV0.01 PV0.01

注:与对照组比较,各组*表示PV0.05, **表示PV0.01

9 各组 RasRaf-1> TSC2mTORp70s6K4E-BPlmRNA 相对表达情况 2.6各组血管瘤血管内皮细胞中Ras> Raf-1TSC2mTORp70s6K 4E-BP1蛋白表达情况

与对照组比较,普蔡洛尔组(n=3) TSC2、4E-BPK P70S6K蛋白表达倍数分别 为1.568±0.192、1.534±0.140、1.690±0.123,较对照组明显增高,差异有显著性 (F=44.4266.75、136.41,PV0.01); Ras、Ratl、mTOR分别为0.585±0.030、0.527±0.040、 0.430±0.045,较对照组明显降低,差异有显著性(2109.96、43.41、726.30, P<0.01)o 雌二醇组5=3)蛋白表达变化与普蔡洛尔组相反,TSC2、4E-BPK P70S6K蛋白表 达倍数分别为0.673±0.067、0.662±0.092、0.563±0.077,较对照组明显著降低,差异 有显著性(F=44.42、66.75、136.41, P<0.01); Ras、Rati、mTOR分别为 1.530±0.131、 1.534±0.225、1.548±0.042,较对照组明显增高,差异有显著性(2109.96、43.41、726.30, P<0.01)o (表 10、图10)

10各蛋白与对照组相比的表达倍数(丘土sn=3)

组别 Ras Raf-1 TSC2 mTOR p70s6K 4E-BP1
普蔡洛尔组 0.585±0.030 0.527±0.040 1.568±0.192 0.430±0.045 1.690±0.123 1.534±0.140
雌二醇组 1.530±0.131 1.534±0.225 0.673±0.067 1.548±0.042 0.563±0.077 0.662±0.092
F值 109.96 43.41 44.42 726.30 136.41 66.75
P值 PV0.01 PV0.01 PV0.01 P<0.01 PV0.01 PV0.01

注:与对照组比较,各组*表示尸V0.05, **表示PV0.01
10 各组 RasRaf-1. TSC2mTORp70s6K4E-BP1 蛋白相对表达情况

讨论

有证据表明,儿童血管瘤细胞起源于内皮祖细胞或胎盘血管母细胞,因组织缺氧、 发育障碍,以及起源细胞内部新生血管的形成等影响,逐渐形成血管瘤[1可。一项前瞻 性研究表明,血管瘤体生长至3个月时可以达到80%左右,生长5个月时增殖停止。 消退期开始于瘤体生长6〜12个月后,一般在4岁之前且持续多年"I。血管瘤的自然 病程包括增生期、退化期和退化完成期三个阶段。增生期病理表现为血管瘤内皮细胞 过度增生,存在胚胎性内皮细胞特征,密集的新生血管在瘤体组织中形成。在未知因 素影响下,增生期转到退化期直至完成退化,血管瘤内皮细胞出现凋亡,有研究者认 为血管形成的负性和正性因子均与血管瘤的变化有关,同时提出了一些激素和生长因 子能促进血管瘤内皮细胞异常增殖,且对内皮细胞血管样结构形成、迁移及分化以及 细胞间的相互作用等都起着重要作用。研究提示:可能是细胞间的信号传递和内皮细 胞内基因表达的改变导致血管瘤由增生向退化转变曲。Kirsten大鼠肉瘤癌基因同源 物(K-ras)编码GTP-ase蛋白K-ras,该蛋白具有调节细胞周期的作用,并在发生突变 时促进不受控制的细胞分裂0】。已有证据表明,K・ras突变也与血管内稳态的改变有 关。血管内皮细胞中K-ras的持续活化促进了衰老旁路的激活,支持其细胞增殖QI。 此外,柯少波[⑵等人研究提示K・ras在血管瘤增生期及消退期高表达。上述研究提示 Ras信号通路可能在婴幼儿血管瘤的演变过程中具有重要作用。本研究中,小儿血管 瘤血管内皮细胞中有Ras信号通路关键信号分子的表达,血管瘤增生期Ras、Raf-1> mTOR表达高于消退期,TSC2、p70s6K、4E-BP1表达低于消退期。表明Ras信号通 路参与了小儿血管瘤血管的增生与退化过程。

Ras蛋白是一种小G蛋白,它介导的信号通路在血管形成和血管增殖中发挥重 要作用㈡],且在活跃的GTP结合和非活跃的GMP结合形式之间循环,并在细胞膜 中作为信号转导的分子开关发挥作用。Lim等首次在小叶血管瘤全基因组测序中发现 KRAS和NRAS的杂合突变㈣。Bao等人在血管母细胞瘤中使用Ragl-Cre条件表达 K・ras突变体,成功构建了中枢血管母细胞瘤小鼠模型,提示RAS基因突变在某些细 胞中表达时可以在新血管化过程中控制内皮细胞的增殖©J%在由TSC2突变引起的 结节硬化症中发现,TSC2可以使成纤维细胞系p70s6K及其底物S6持续磷酸化,Tsc 蛋白缺失导致mTOR-p70S6K通路本构性激活〔⑼。活化的mTOR磷酸化下游p70s6k 及4E-BP1促进蛋白质翻译,使细胞周期缩短为从G1期直接进入S期,细胞大量增 殖。当mTOR/p70s6k信号通路抑制时,mTOR活化受阻,抑制p70s6k及4E-BP1磷 酸化,进而抑制4E-BP1合成的起始阶段并使蛋白合成减少,细胞周期停滞于Go/Gi 期,并且诱发细胞凋亡[⑵。本研究发现,体外培养的人血管瘤血管内皮细胞停滞于 Go/Gi期的细胞较多、细胞凋亡高时,Ras、Raf-1> mTOR表达降低,TSC2、p70s6K、 4E-BP1增高;体外培养的人血管瘤血管内皮细胞停滞于Go/Gi期的细胞较少、细胞 凋亡低时,Ras、Rati、mTOR表达增高,TSC2、p70s6K、4E-BP1 降低。提示:Ras 信号通路被抑制(或激活)后,可能刺激TSC2表达上调(或下调),进一步抑制(或 激活)mTOR/p70s6k信号通路,诱发体外培养的人血管瘤血管内皮细胞凋亡(或增 殖)。

诱导细胞周期停滞及细胞凋亡是药物诱导血管瘤消退的重要机制"2%已有很 多普蔡洛尔治愈血管瘤的报道[29、30】。既往研究认为,普蔡洛尔通过阻断血管瘤表面P1 受体与G蛋白耦联,抑制AC/cAMP/PKA介导的Ras信号通路的活性,导致VEGF、 bFGF等促血管生成因子合成减少,抑制血管瘤的增生,促进其消退卩I】。Lin等研究 发现普蔡洛尔可以抑制PI3K/AKT和HIF-la活性,促进小儿血管瘤的消退阳。Pan 等研究证实了普蔡洛尔的体外抗血管生成特性是通过下调PI3K/Akt/eNOS/VEGF通 路,抑制细胞周期进展、侵袭和成管,进而诱导血管瘤细胞消退,同时降低NO和 VEGF水平⑴]。Wn?k等发现普蔡洛尔可通过激活内源性和外源性凋亡通路Bax、 Bcl-2, Caspase 3诱导IHECs细胞凋亡,是其治疗婴幼儿血管瘤的重要机制。另有研 究认为,雌二醇通过调节关键的血管生成因子,包括血管内皮生长因子a (VEGF-A) 和成纤维细胞生长因子2 (FGF2),在血管瘤的发展中发挥重要的作用[34-36]o亦有研究 表明,雌二醇可以诱导Src/p21ras/Erk信号通路促进肿瘤生长"网。本研究中,普蔡 洛尔(或雌二醇)作用后,体外培养人血管瘤血管内皮细胞中Ras、Raf-1> mTOR表 达降低(或增高),TSC2、p70s6K、4E-BP1增高(或降低),细胞的生长周期停滞 于G0/G1期、S期细胞数减少、细胞凋亡率明显增加(或停滞于G0/G1期的细胞数 减少、进入S期细胞数增多、细胞凋亡率明显降低)。提示普蔡洛尔可以通过负性调 控Ras信号通路,上调TSC2,抑制mTOR/p70s6k信号通路,使体外培养人血管瘤内 皮细胞细胞周期停滞于Go/Gi期,诱发细胞凋亡。雌激素则与之相反。

结论

  1. 血管瘤血管内皮细胞中有Ras信号通路关键信号分子的表达,血管瘤增生期Ras、

Raf-1> mTOR表达高于消退期,TSC2、p70s6K、4E-BP1表达低于消退期。

  1. 普蔡洛尔通过负性调控Ras信号通路,上调TSC2,抑制mTOR/p70s6k信号通路,使 体外培养人血管瘤内皮细胞细胞周期停滞于Go/Gi期,诱发细胞凋亡。雌激素则相反。

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综述

Ras信号通路与肿瘤研究进展

恶性肿瘤的形成、进展、转移与癌基因、抑癌基因的突变和异常有关。其中Ras 信号传导通路的异常与肿瘤的发生、发展密切相关联。Ras基因、蛋白、信号通路是 分子肿瘤学的研究热门,Ras基因变化涉及到的信号通路的变化目前是一个研究热点。 和通路相关的研究一方面可以探究Ras基因在肿瘤发生过程的作用机制,另一方面可 以更深入地了解每个通路上基因的活化或抑制起到的具体作用。因此,本文就Ras通 路的激活及通路中各基因的作用、活化机制、针对位点的抑制剂,Ras通路与肿瘤以 及与血管瘤的关系进行综述。

RAS蛋白是在活性鸟昔三磷酸(GTP)结合态和非活性鸟昔二磷酸(GDP)结合态之 间循环的二元分子开关。这种开关机制在GDP/GTP结合蛋白、细菌伸长因子、异三 聚体G蛋白以及无数具有不同生物学功能的小GTP酶之间高度保守。鸟卩票吟核昔酸交 换因子(GEFs)促进了稳定的、非活性的GTP结合形式向活性GTP结合形式的转化。通 过GTPase活化蛋白(GAP)介导转化回非活性形式⑴。GEFs和GAP是一种多结构域的大 蛋白质,能够与其他蛋白质、脂质和控制RAS活性和非活性水平的调节分子进行多种 相互作用⑵。

RAS和其他GTPases依赖于GEFs和GAP进行“开关"功能,这使得这两个过程都能 被高度调控,并对多个信号输入做出响应。然而,它们受到一个重要原则的支配:易 位。当GEFs和GAP被招募到质膜上并直接靠近RAS时,它们会打开或关闭RAS。这 种二维表面上的近端定位相当于自由溶液的结合常数增加了5个数量级,是理解RAS 蛋白如何调控的核心。RAS蛋白通过招募到质膜来激活效应物。事实上,对于RAF 激酶来说,易位似乎足以启动复杂的激活过程3】。质膜中RalGDS向RAS的募集导致 RalA和RalB的活化⑸。通过肉豆蔻酰化信号募集PI 3-kinaseY(PI3Ky)到达质膜,避免 了不与RAS结合的突变体的形成,提示膜的募集是活化过程中的关键步骤⑹。然而, 与其他效应物一样,RAS的直接结合也有助于激活。此外,RAS效应物的差异活化可 能由膜内的局部脂质组成决定⑺。因此,在质膜的背景下理解RAS蛋白是RAS生物学 的一个基本方面,描述这些相互作用对于针对RAS疾病的干预将是重要的。

1Ras的二元开关功能

HRAS中G・结构域的晶体结构与GppNHp结合的复合物是一种不可水解的GTP类 似物,首次揭示了RAS二元开关的功能⑹。随后对效应物GAP、GEF和RAS结合结构 域(RBDs)复合物中RAS的结构研究发现,有两个开关域:switch」(aa 30-38)和switch』 (aa 59-76),它们在蛋白■蛋白相互作用中发挥着关键作用这两个开关域在GDP和GTP 状态之间发生构象变化,并使用负载弹簧机制进行了描述⑼。GTP结合状态下,T35 与G60形成氢键结合严磷酸亚基分别参与switch■[和switch-II的活性构象。三磷酸鸟昔 水解后,严磷酸亚基释放和两个开关区域回归弹性蛋白的构象状态。

GDP的解离率非常慢(ti/2 = 6 min, koff = 2xW3/s 20°C)允许RAS蛋白保持其非活 性状态,直到信号刺激GDP/GTP交换[⑼。这就需要GEF活化加速几个数量级的交换 反应。GEF与RAS结合导致开关域和P环的构象变化(aa 10-17),肖U弱GDP的亲和力, 导致其释放和替代〔⑴。由于RAS与GDP和GTP的亲和力相似,而GEF不支持重新结合 GDP或GTP,而GTP结合RAS水平的升高主要是由于GTP细胞浓度比GDP高10倍。最 后,GTP的结合分离了GEF,导致GTP结合RAS活化的形成,进而可以结合效应物。

RAS蛋白内在的GTP水解速度非常慢(ti/2二16 min, koff = 6xW4/s 20°C) [10]o高效 的GTP水解需要与GAP的相互作用,GAP可以将裂解速度提高几个数量级。GDP和 A1F3结合HRAS的复合物与RASAl/pl20GAP的GTPase激活域(通常称为GAP相关域, GRD, aa 718-1037)的结构研究首次揭示了GAP如何刺激GTP水解〔⑵。GAP与HRAS switch-I啲相互作用稳定了Q61的位置,从而协调催化水分子。此外,残留R789 RASA1 称为精氨酸的手指,突出HRAS的活性部位和与GDP的a■和卩■磷酸亚基及A1F3相互作 用和中和严磷酸的负电荷稳定其过渡态[⑶。

RASGAP的GRDs高度保守冋。然而,RAS GAP在GRDs之外存在显著差异,反 映了在信号转导和RAS调节中不同的角色⑵。例如,RASAl/pl20 Ras GAP包含SH2 和SH3区域,这些区域与活化受体(如PDGFR)结合网。这被认为可以使RASAl/pl20 Ras GAP在信号传导过程中适当下调RAS。另一方面,神经纤维瘤蛋白(NF1基因产物) 是一种保守的生物,如酿酒葡萄球菌,缺乏酪氨酸激酶受体信号可能在对非常不同的 信号作出反应时调节RAS,其性质尚不清楚。在哺乳动物细胞中,神经纤维瘤蛋白依 赖SPRED蛋白将其招募到质膜中的RAS中问,但控制这种关键相互作用的信号尚未 被识别。

2Ras介导的信号通路研究进展

在正常哺乳动物细胞中,RAF激酶(ARAF、BRAF和CRAF)是RAS的主要效应因 子。在小鼠胚胎成纤维细胞中,RAS通过激活RAF激酶维持增殖、存活和迁移[⑹。黑 腹果蝇和秀丽隐杆线虫RAS蛋白调节的通路与哺乳动物细胞中典型的RAS- MAPK通 路十分相似2】。事实上,对果蝇和秀丽隐杆线虫RAS信号的遗传分析在哺乳动物细胞 中探寻RAS信号通路中发挥了重要作用,包括调控蛋白KSR、CBL、SHOC2和SHP2 的作用。同样,在粟酒裂殖酵母,尽管Rasl直接激活的激酶是Byr2,而不是RAF,但 是也激活了一个MAP激酶的级联反应。另外,酿酒酵母对细胞内葡萄糖反应时,RAS 蛋白(RASlp和RAS2p)激活腺昔酸环化酶,调节环AMP(cAMP)的产生。虽然它们的 效应物在哺乳动物细胞中与RAS无关,但GEFs (CDC25和SDC25)和GAP (IRA1和 IRA2)显然是哺乳动物的同源物,这表明GTP/GDP开关机制是高度保守的。令人惊讶 的是,酿酒酵母RAS蛋白在腺昔酸环化酶上相互作用的两个不同位点都不是哺乳动物 RAS效应物的RAS结合域,但是在酿酒酵母中表达哺乳动物RAS蛋白可以激活腺昔酸 环化酶。这些例子说明RAS效应器的相互作用可以是不同的,但是控制二元开关的基 本机制是高度保守的。

在人类中,由种系激活的HRAS、NRAS和KRAS等位基因,与同样由种系激活的 BRAF、CRAF、MEK1或MEK2驱动的等位基因具有相似的表型,强调RAF/MAPK级 联反应在RAS生物学中的核心重要性。然而,哺乳动物RAS蛋白还有其他重要的效应 物,其中PI3激酶(PI3K)是最有效的。例如,Castellano等⑹和Gupta等冋研究的老鼠表 达一种PI3Ka的突变无法与RAS结合,导致大多数老鼠没能活到成年,而且还存在淋 巴系统缺陷、血管生成和巨噬细胞功能障碍[⑼。因此,尽管在特定的组织类型中,这 种RAS和PI3K的相互作用是必不可少的。另外,在癌细胞中已经确定了 7个不同的RAS 效应蛋白,除了RAF激酶、PI3K、RalGDS夕卜,新RAS效应因子1 A(novel RAS effector 1A, NORE1A)、Af6、磷脂酶C(phospholipase C, PLC)、RAS和Rab互作子 1(RAS and Rab interactor 1, RIN1)、T细胞淋巴瘤入侵和迁移相关蛋白质(T cell lymphoma invasion and metastasis-inducing protein, TIAM)和生长因子受体 14(growth factor receptor 14, Grbl4)[20]o

3Ras信号通路与血管畸形及血管瘤的关系

RASopathies是一类由Ras/MAPK通路编码成分或调控因子的基因中的突变引起 的发育障碍。在肿瘤发生的背景下,Ras/MAPK通路被广泛研究,在调节细胞周期、 细胞生长、分化和衰老方面起着关键作用,而这些都是哺乳动物正常发育所必需的。 Ras在大约20%的恶性肿瘤中发生体细胞突变,BRAF在大约7%的恶性肿瘤中发生体 细胞突变0】。正因为如此,RASopathies被认为是癌症综合症。每一种RASopathy表现 出独特的表型,但由于Ras/MAPK通路失调的共同机制,它们具有许多重叠特征,包 括颅面畸形、心脏和血管畸形、皮肤和肌肉骨骼异常、神经认知障碍、张力减退、增 加患癌症的风险。1型神经纤维瘤病(Neurofibromatosis type 1? NF1)是第一个由 Ras/MAPK通路NF1基因突变引起的综合征,随后又发现了许多其他综合征。还包括 由RASA1单倍体功能不全引起的毛细血管畸形动静脉畸形综合征(Capillary Malformation-Arteriovenous Malformation Syndrome, CM-AVM) o

CM-AVM是一种常染色体显性遗传疾病,其特征是多病灶的毛细血管畸形,这可 能是与动静脉畸形和痿管相关国]。CM-AVM是由杂合的灭活突变RASA1[23],类似于 NF1编码RasGAP,特别是pl20-RasGAPo N末端包含Src(sarcoma)同源区域,C端包含 pleckstrin同源域和RasGTPase激活域。就像NF1的蛋白产物神经纤维瘤蛋白一样, RASA1将活跃的GTP结合Ras转化为不活跃的GDP结合形式。它是Ras/MAPK信号转 导通路的负调控因子,对细胞的生长、分化和增殖十分重要。该综合征的主要特征是 畸形的多灶性。血管瘤可发生在许多组织,包括皮肤、肌肉、骨骼和各种内脏器官, 包括心脏和大脑。RASA1突变也与Parkes Weber综合征和Galen静脉畸形相关〔刑。 pl20-RasGAP的单倍体缺乏降低了RasGTP的水解,从而增加了Ras/MAPK通路的信号 通路。大多数CM-AVM患者都有受影响的父母,然而,约30%的病例是由新生突变引 起的。突变的类型各不相同,大多数是无意义突变、移码突变或剪接突变。除了动静 脉畸形,个体还可能有心血管畸形,如法洛四联症、中隔缺损和瓣膜异常。有趣的是, CM-AVM患者发生肿瘤的风险可能与NF1和NF2相似,尽管目前尚不完全清楚。另外, 有研究证实CFC (Cardio-fecio-cutaneous)综合征为心脏和皮肤受累,生长发育迟缓、 智力低下的综合征,研究已证实KRas的突变和CFC的发生、进展有关。CFC使皮肤受 累的症状当中包含血管瘤,也有另一种研究结论证实血管瘤的发生与BRAF相关,和 KRAS无关肖26]。

婴儿血管瘤(IH)继发于内皮细胞(EC)的增生。EC异常增殖的原因尚不清楚旳。有 两种理论:基于胎盘标志物共享,如GLUT1、LewisY抗原、merosin,参与栓塞性胎 盘成血管细胞;以及血管瘤Fcg受体II异常〔绚。胚胎内皮前体理论的基础是检测血管 瘤中循环的祖细胞和干细胞CD133+/CD34S以及血管瘤患者的血液循环此外, 将这种血管瘤干细胞注入裸鼠体内会导致血管瘤样病变的发生。Bao等人在血管母细 胞瘤中使用Ragl-Cre条件表达Kras突变体,可使皮质和小脑的中枢神经血管母细胞瘤 小鼠出现与人类血管母细胞瘤类似的血管瘤和基质细胞,这是RAS基因突变首次被证 明可以刺激恶性肿瘤中的非细胞自主增殖,并提示RAS基因突变在某些细胞中表达时 可以在新血管化过程中控制内皮细胞的增殖㈤]。Anand课题组发现miR-132在人类肿 瘤和血管瘤的内皮细胞中高度表达,miR-132通过抑制内皮pl20RasGAP表达,发挥血 管生成开关的作用,导致Ras激活并诱导新生血管形成,而anti-miR-132的应用则通过 维持血管处于静息状态来抑制新生血管形成9】。更直接的证据表明,Young等人为了 识别驱动小叶血管肿瘤形成的体细胞突变,对两名患者的血液和血管瘤组织进行了全 外显子组测序,发现KRAS c.35G>A,p.G12D和NRAS C.181OA, p.Q61K杂合突变卩习。

虽然RAS的体细胞突变在人类血管肿瘤中尚未见报道,但RAS信号通路与血管生 成和血管增殖有关⑴】。目前Ras信号通路与血管瘤发生、进展的研究数目逐年上升。 有研究报道对比增生期和退化期血管瘤中ERK和p・ERK的蛋白表达,增生期p-ERK蛋 白表达高于消退期,而另一种蛋白无显著差异,说明ERK蛋白的激活与血管瘤的增生 甚至细胞的迁移有关联,提示Ras与血管瘤发生、进展密不可分"3。P38MAPK作为 经典的MAPK通路,被证实参与血管瘤的消退与凋亡两个过程[殉。表达活化KRAS的 肿瘤细胞通过稳定VEGF mRNA或增加VEGF转录因子HIF-la的磷酸化,显示VEGF合 成增加卩习。转基因KRAS G12D小鼠自发形成多种血管肿瘤,内皮细胞显示VEGF和 Flk-1 mRNA的ras依赖性增加a】°RAS突变内皮细胞获得血管生成表型,包括膜皱折、 分支形态发生、DNA合成增加和细胞迁移卩7]。具有组成活性的HRAS G12V成纤维细 胞和KRAS突变的肠上皮细胞表现出COX-2的表达增强,COX-2的表达增加了促血管 生成细胞因子和前列腺素的合成,并通过正反馈进一步刺激这些因子卩习。对于没有 RAS突变的PG病灶,它们可能在血管生成的不同调控因子或RAS通路中的其他基因 中存在突变。

4、血管瘤的治疗及潜在干预靶点

早年,糖皮质激素是治疗IH的首选药物。近年来,受体阻滞剂,尤其是普蔡洛尔, 意外地被证明是一种有效的药理学治疗方法。当儿茶酚胺、肾上腺素和去甲肾上腺素 与卩■肾上腺素能受体相互作用,该受体与异三聚鸟昔三磷酸结合蛋白Gs结合的发生, 导致G-GTP与G旳亚基解离。后者进而导致腺昔酸环化酶的活化和单磷酸腺昔(cAMP) 的产生。cAMP的下游效应物包括cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)和cAMP门控离子通道。 普蔡洛尔是卩1和卩2■肾上腺素能受体的拮抗剂艮]。VEGF-A是IH生长的关键因子。因 此,普蔡洛尔对VEGF-A的抑制可能是其活性的机制。去甲肾上腺素已被证明可通过 几种细胞类型,包括正常细胞和癌变细胞,增强VEGF-A的生成[39'40]0此外,在卵巢 癌动物模型中,儿茶酚胺上调肿瘤VEGF并增加血管生成⑷】。这些影响的儿茶酚胺介 导卩1和卩2肾上腺素能受体,被普蔡洛尔卩刃。然而,在一些细胞系中,PKA的下游效 应物Src酪氨酸激酶并不通过丝裂原活化蛋白(MAP)激酶Erkl/2的激活而参与其中円习。

Ras/Raf/MEK/ERK信号通路在细胞增殖、存活、分化、凋亡、运动和代谢等诸多 过程的调控中发挥核心作用。它被包括整合素、生长因子受体在内的多种细胞外信号 激活。Ras、Raf和MEK的活性似乎只局限于一类底物,而ERK则激活包括核转录因 子在内的70多种底物。对血管肿瘤中RAS基因突变的鉴定具有重要的临床意义。本项 目研究发现普蔡洛尔亦通过Ras信号通路可以在血管瘤中抑制增殖,促进细胞停滞, 达到消退血管瘤的作用。据报道,阻断RAS上游或下游信号传导的法尼酰基转移酶抑 制剂(FTIs)或靶向Ras/Ra^MEK/ERK通路的药物可以抑制肿瘤细胞中的致癌信号⑷呦。 这一通路成为了科学家重要的治疗靶点,目前许多药物针对这一通路进行临床试验。 据报道,该类中只有小分子索拉非尼被批准用于癌症治疗,但它不是一种纯Ras激酶 抑制剂。AZD6244是近期进入II期临床试验的相对选择性Raf激酶抑制剂⑷切。曲马 替尼是MEK、MAPK/ERK激酶的口服生物利用抑制齐U,具有潜在的抗肿瘤活性。它 与MEK 1和MEK2特异性结合,在各种癌症中抑制生长因子介导的细胞信号和细胞增 殖。MEK 1和MEK 2的双特异性苏氨酸/酪氨酸激酶在多种癌细胞类型中经常上调, 在调节细胞生长的Ras/Raf7MEK/ERK信号通路的激活中发挥关键作用。2013年5月, 根据一项名为METRIC的大型临床试验的结果,FDA批准了这种药物用于晚期黑色素 瘤患者的BRaf突变。RAS突变驱动血管肿瘤的发现为开发针对当前耐药病变的靶向治 疗提供了潜在的机会[佝。

5、小结

Ras蛋白及其相关效应分子是人类癌症中突变最频繁的驱动因素之一,仍然是 一个难以捉摸的药物靶向阙。本综述详细阐述了 Ras蛋白二元开关的功能结构、Ras 介导的效应分子和信号通路,并概述了 Ras信号通路参与血管畸形及儿童血管瘤的研 究进展,为抑制Ras功能治疗血管瘤开辟了新的可能性。但是,由于Ras蛋白及效应 分子与其他信号通路之间存在错综复杂的联系a】,Ras蛋白的激活对下游因子的影响 也存在差异,因此,以Ras信号通路为靶点的临床干预措施,需要从个体宏观的整体 水平进行研究和分析,才能够更精准的防治血管瘤及其他肿瘤。

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致谢

欢娱不惜时光逝。研究生阶段的学习即将结束,在将近三年的学习 生涯里,曾经得到过许许多多老师、同学和同事的热情关怀和无私帮助, 在此谨向他们表示最衷心的感谢和最诚挚的谢意!

首先要感谢我的研究生导师俞松教授,三年来,导师敏锐的思维、 渊博的学识、果断干练的作风、诚挚谦虚的品格和宽厚善良的处世方式, 永远值得我学习和效仿。老师在我的学业上尤其是在论文的撰写过程中, 小到标点符号,大到论文的结构都浸透着您的心血。您不惜休息时间, 细致、耐心的提出宝贵的修改意见,论文才得以顺利完成。老师倾注了 大量的心血,您对我们孜孜不倦的耐心教诲和无微不至的关怀令我难以 忘怀,将使我终生受益。多年来,导师还在生活方面给予了我诸多慈父 般的关怀和爱护,使我在感激之余常常感到心有不安。我将更加努力, 不辜负恩师的期望。

您将您丰富的人格魅力潜移默化的改变着我。您树立的榜样形象, 将指引我去做一个严于律己、尽心尽责的社会人。是我永远学习的楷模。 导师高尚的人格情操和坦荡无私的胸怀,更令我终身敬仰。师恩深重, 终生难忘,能做您的学生,是我的荣幸,谢谢您的教导,俞老师!在此 表示最衷心的感谢!

与此同时,我还要感谢小儿外科杨小红老师,刘远梅老师,张天久、 曹江、王凯、吕欣、李堂江、罗宇、徐艳鹏、甘永桥等师兄,肖日春护 士长及全体护士老师在临床工作中给予的帮助及指导。

感谢同窗好友张启明、黄露、鲁强、段泽猛在学习中给予的关心和 支持。

感谢我的家人对我学习和生活上的全力支持和关怀,支持我顺利完

成学业。

毕业之际,祝愿母校遵义医科大学、遵义医科大学附属医院及我们

小儿外科团队欣欣向荣、蓬勃发展!