F0XP4、E-cadherin> Vimentin在胃癌中的表达及意义论文

2020年10月14日14:02:09F0XP4、E-cadherin> Vimentin在胃癌中的表达及意义论文已关闭评论

F0XP4、E-cadherin> Vimentin在胃癌中的表达及意义论文

中文摘要

目的:研究胃癌及配对癌旁组织中FOXP4、E-cadherin> Vimentin的表达情况及相 关性。

方法:采用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹法分别检测FOXP4、E-cadherin> Vimentin的mRNA及蛋白在12对胃癌组织及其配对癌旁组织中的表达水平;采用免 疫组化方法检测FOXP4、E-cadherin> Vimentin蛋白在50对胃癌组织及其配对癌旁 组织中的表达,并进一步分析三者之间是否相关,三者与临床病理参数的关系。

结果:(1) FOXP4主要表达于上皮组织,细胞内定位于细胞核,在胃癌组织阳性表 达率为82%,明显高于癌旁组织(62%),差异有统计学意义(才=4.96, PV0.05)。 Vimentin主要表达于间质细胞,上皮组织表达量极低,定位于细胞浆,在胃癌组织阳 性表达率为84%,明显高于癌旁上皮组织(2%),差异有统计学意义(才=64.94, P <0.05) o E-cadherin主要表达于上皮细胞,定位于细胞膜及细胞链接处,在胃癌上 皮组织中阳性表达率为44%,明显低于正常胃上皮组织(100%),差异有统计学意 义(才=38.88, PV0.05) o (2) FOXP4的表达水平与胃癌患者浸润深度有关(P< 0.05),与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及有无淋巴结转移无关联(P>0.05) o Vimentin E-cadherin的表达水平与胃癌患者肿瘤分化程度相关(PV0.05),与年龄、 性别、肿瘤大小、浸润深度及有无淋巴结转移无关联(F>0.05) o (3) FOXP4与 Vimentin的表达呈正相关(FV0.05,0.364)FOXP4与E-cadherin的表达呈负相 关(PC0.05, r=-0.319)。E-cadherin 与 Vimentin 的表达呈负相关(FV0.05, —82)。

(4)蛋白免疫印迹法(WesteniBlot,WB)检测FOXP4、Vimentin在胃癌组织中表 达量上调,差异有统计学意义(PV0.05) o E-cadherin在胃癌组织中表达量下调,差 异有统计学意义(FV0.05) o (5)实时荧光定量PCR显示FOXP4mRNA、Vimentin 的mRNA在胃癌组织中表达量上调,差异有统计学意义(P<0.05)oE-cadherin mRNA 在胃癌组织中表达量下调,差异有统计学意义(PV0.05)。

结论:(1)胃癌组织中,FOXP4、Vimentin表达上调,E-cadherin表达下调。⑵ 胃癌组织中,FOXP4的表达水平与胃癌患者浸润深度有关,Vimentin及E・cadherin 的表达水平与胃癌患者肿瘤分化程度相关。联合检测FOXP4、Vimentin和E-cadherin 可能有助于评估胃癌患者的肿瘤浸润、分化情况。(3)胃癌组织中,FOXP4与Vimentin 的表达呈正相关。FOXP4与E-cadherin的表达呈负相关。E-cadherin与Vimentin的表 达呈负相关。

关键词:胃癌;上皮间质转化;FOXP4;

Expression of FOXP4, E-cadherin and Vimentin in gastric
cancer and their clinical significance

Abstract

Objective To study the expression of FOXP4, E-cadherin and Vimentin in gastric cancer and adjacent tissues, and the correlations between their expression.

Methods mRNA and protein expression of FOXP4, E-cadherin and Vimentin in gastric cancer and adjacent tissue was determined by real-time fluorescent quantitative PCR, Western blot, and immunohistochemistry, and the correlation among the three and their clinical significance were analyzed.

Resillts(l) FOXP4, a protein mainly expressed in the nucleus of epithelial cells, showed higher positive rate in gastric cancer tissue than in adjacent tissue (82% vs. 62%,才=4.96, P <0.05). Vimentin, a protein mainly expressed in the cytoplasm of stromal cells and rarely in epithelial tissue, showed higher positive rate in gastric cancer tissue than in adjacent epithelial tissue (84% vs. 2%,才=64.94, P <0.05). E-cadherin, a protein mainly expressed on cell surface and cell junctions of epithelial cells, showed lower positive rate in gastric cancer tissue than in adjacent epithelial tissue (44% vs. 100%,才=23.88, P <0.05). (2) Expression level of FOXP4 in the cancer tissue was correlated with depth of invasion (P <0.05), and showed no significant correlation with age, gender, tumor size, degree of differentiation, or presence of lymph node metastasis (P> 0.05). Expression levels of Vimentin and E-cadherin were correlated with degree of differentiation (P<0.05), and had no significant correlation with age, gender, tumor size, depth of invasion, or presence of lymph node metastasis (P>0.05). (3) There is a positive correlation between the expression of FOXP4 and Vimentin(P<0.05, r=0.364). The expression of FOXP4 and E-cadherin was negatively correlated(P<0.05, r= -0.319). The expression of E-cadherin and Vimentin is negatively correlated(P<0.05 / r= -0382).(4) Western blot showed significantly elevated protein expression of FOXP4 and Vimentin (P<0.05), and significantly decreased E-cadherin protein expression (P<0.05) in the gastric cancer tissue. (5) Real-time quantitative PCR also showed significantly elevated mRNA expression of FOXP4 and Vimentin (P<0.05), and significantly decreased E-cadherin mRNA expression (P<0.05) in the gastric cancer tissue.

Conclusions (1) Expression levels of FOXP4 and Vimentin are up-regulated in gastric cancer tissues, while E-cadherin expression is down-regulated. (2) Expression level of FOXP4 in gastric cancer tissue is related to depth of invasion, and Vimentin and E-cadherin levels are related to the degree of tumor differentiation. Joint detection of FOXP4, Vimentin and E-cadherin may be helpful in evaluating invasion and differentiation of gastric cancer.(3) In gastric cancer tissues, There is a positive correlation between the expression of FOXP4 and Vimentin. The expression of FOXP4 and E-cadherin was negatively correlated. The expression of E-cadherin and Vimentin is negatively correlated.

胃癌是人们耳熟能详的恶性肿瘤,根据GLOBOCAN 2018统计数据⑴,在世界肿 瘤发病统计资料中,其发病率位居第5,死亡率位居第3,高发病率及高死亡率引得 人们谈胃癌色变。胃癌早期症状不典型,发现时多为进展期胃癌,5年的生存率低2习。 治疗方案常以手术为主,辅以化疗等,但常规抗肿瘤药物疗效差,副反应大,靶向药 物研制困难⑷。靶向药物难寻的主要原因在于肿瘤的异质性,体现为蛋白、RNA多样 性表达,即便是在相似的临床表现和病理特征也同样如此⑸。综上所诉,为了进一步 探索胃癌的发生发展机制,更精确的靶向治疗,明确胃癌组织各类蛋白、RNA的表 达具有重要意义。

上皮■间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是一种促进胚胎发育的 表型转化,最初是由研究生长发育的生物学家提出⑹。EMT是一个过程,在此过程中, 上皮细胞会失去其连接和极性,转化为具有迁徙能力的间充质细胞。相关检测指标中 可见E■钙黏蛋白(E-cadherin) >细胞骨架角蛋白表达减少,波形蛋白(Vimentin) > 纤维连接蛋白、N・钙黏蛋白表达增多。在恶性肿瘤细胞中可见同时表达的上皮和间充 质标志物,这被称为部分EMT⑺,该过程使上皮细胞间链接减弱,细胞失去极性、容 易扩散等,表现为促进肿瘤细胞的运动和迁移,组织学上体现为增加肿瘤细胞的侵袭 性和远处转移能力旳0]。现有研究报道显示,EMT在胃癌发生发展中发挥重要作用Hi], 并可能导致耐药性的产生2,其标志性蛋白E-cadherin在胃癌中表达下调,Vimentin 在胃癌中表达上调〔⑶。同时,EMT的表型变化也受表皮生长因子受体(EGFR)、Wnt 和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路的调控Hl。

叉头框转录因子(fbrkheadbox, FOX)是在黑腹果蝇中被Knochel E等人首次发 现,该蛋白属于“螺旋■折叠■螺旋"类蛋白中的一种亚群QI。FOX蛋白特征为一个N 端型C2H2锌指结构和一个一端C端的“叉头框"区。FOX蛋白能够与DNA结合并调 控转录a】,涉及组织及胚胎的生长发育、糖脂代谢,还参与细胞周期调控、免疫调节 等多种生物学过程。一旦调节失控,可能导致发育缺陷、代谢疾病,甚至肿瘤的形成 [17-23]。目前人类中已发现超过50个FOX编码基因,并分为19个亚家族[24]。FOXP 蛋白(FOXP1, FOXP2, FOXP3, FOXP4)是功能多样的亚家族,除具有上诉FOX 家族的共有结构外,还在型锌指结构侧有卷曲螺旋基序,该部位能够结合DNA,属 于具有侧翼螺旋结构的亚族的转录因子[25]。FOXP4蛋白属于FOX转录因子家族P亚 家族,其编码基因位于6号染色体p21.1o现对该蛋白的研究较少,其功能尚不明确, 已有报道提示该蛋白的高表达与多种肿瘤的发展有关,例如口腔鳞癌a】、前列腺癌 [27的、肝细胞癌[29列、乳腺癌[32,33]、肺癌卩4]等,并且有细胞学实验证实FOXP4在乳 腺癌中通过靶向调控Snail促进乳腺癌EMT形成卩2]。在肝癌中旳,FOXP4通过正向 调节Slug促进肝癌细胞EMT形成,并促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。但FOXP4 在胃癌组织中表达情况,是否仍参与EMT形成并促进胃癌的发展,目前尚未见相关 报告。

综上所述,FOXP4在肝癌及乳腺癌中通过参与EMT形成促进胃癌的发展,但其 在胃癌的表达情况及与EMT关系尚不明确。本研究利用实时荧光定量PCR、蛋白印 迹实验及免疫组织化学法检测胃癌组织及其配对癌旁粘膜组织中FOXP4>E-cadherin> Vimentin的表达情况,初步探索三者的相关性,并与临床病理资料结合作相关性分析。

1材料

1.1实验标本

WB及qRT-PCR标本均源于2018-05-01至2019・11・31就诊于遵义医科大学附属 医院并行胃癌根治术患者。于手术室取新鲜胃癌组织与相邻的癌旁组织标本(距肿瘤 边缘>5cm且无肿瘤细胞浸润的黏膜组织)各12例。免疫组化组织来源于我院病理科 库存,取胃癌及相邻癌旁组织各50例(已包含上诉12对组织),并由病理科医生协 助完成切片(至少由2名以上资深病理专家对所有病例做病理确诊)。以上所有患者 均已签署知情同意书,且经遵义医科大学附属医院伦理委员会批准。

纳入标准:1)确诊为胃癌;2)有完整的临床病理资料3)术前未行放疗、化疗。

排除标准:1)除胃癌以外肿瘤。2)术前已接受放化疗;3)临床病理资料不全 者。

1.2主要实验试剂

试剂名称 生产厂家
DAE显色试剂盒(货号ZLI-9018) 北京中杉金桥生物技术有限公司
兔抗人FOXP4多克隆抗体(货号ab251688) Abeam
兔抗人 Anti-E Cadherin 多克隆抗体(abl5148) Abeam
兔抗人Anti-Vimentin多克隆抗体(ab 16700) Abeam
SP免疫组化检测试剂盒(兔)(产品编号SP-0023)北京博奥森生物技术有限公司
BCA蛋白定量试剂盒 北京庄盟国际生物基因科技有限公司
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒 Solarbio (北京索莱宝科技有限公司)
ECL发光试剂盒 北京庄盟国际生物基因科技有限公司
内参GAPDH 北京全式金生物技术有限公司
兔二抗(WE用) 武汉三鹰
鼠二抗(WE用) 北京全式金生物技术有限公司
核酸提取液(24:1) Solarbio
异丙醇 重庆川东化工(集团)有限公司
RNAiso Plus Takara Co., Ltd.
引物合成 上海捷瑞生物工程有限公司
逆转录试剂盒 Takara Co., Ltd.
荧光扩增试剂盒 Takara Co., Ltd.

1.3主要实验仪器

仪器名称 生产厂家
高速预冷离心机 美国Thermo公司
-80°C冰箱 美国Thermo公司
全波段酶标仪 美国Thermo公司
定量PCR仪 美国Bio-Rad公司
Bio-rad iCycler iQ 扩增仪 美国Bio-Rad公司
恒温箱 中国泰斯特仪器公司
普通光学倒置显微镜 日本Olympus公司
研究级倒置显微镜 日本Olympus公司
高速组织研磨仪 武汉赛维尔生物科技有限公司
水平电泳槽 美国Bio-Rad公司
电泳仪 美国Bio-Rad公司
Western blot小型垂直电泳系统 美国Bio-Rad公司
凝胶成像及分析系统 日本奥林巴斯

2实验方法

2.1免疫组织化学染色方法及步骤

2.1.1组织切片制作

  • 选取1・2年内我院病理科保存的石蜡标本,共50对;
  • 有专业病理科医师协助完成切片、展片、捞片,并使标本片附着于粘附载玻片;
  • 于烤箱(烤切片专用)中烘烤2小时防脱片,取出后常温保存。

2.1.2脱蜡处理

将组织切片置于切片架上,依次浸泡二甲苯及酒精中,详细步骤如下:

操作步骤 试剂 时间

脱蜡 二甲苯I 12min

二甲苯 I 12min

无水乙醇 6min

95% 乙醇 6min

80% 乙醇 6min

75% 乙醇 6min

PBS 5min

PBS 5min

2.1.3阻断+抗原修复(高压锅热修复法)

  • 将切片浸泡于3%H2O2中,随后使用PBS洗涤6minX3次。
  • 按比例配置柠檬酸缓冲液(pH=6.0),并加入适量于高压锅中,使得切片完 全浸没;
  • 煮沸后保持该状态3mim切断电源,待冷却后取出切片(冷却20分钟以上);
  • PBS 洗涤 6minX3 次。

2.1.4圭寸闭+滴加一抗

  • 甩去切片上残留的PBS液体,滴加山羊血清于切片上,使得组织完全浸没, 将切片置于孵育盒中,并将盒子放入37°C恒温箱中封闭30min;
  • 甩干山羊血清,滴加一抗浸没组织(一抗按比例稀释);
  • 置于4。(2冰箱中过夜(至少大于12小时)。

2.1.5复温、滴加二抗试剂组

第二天,从冰箱取出孵育盒,置于37弋恒温箱中30mim随后PBS缓冲液洗涤 6minX3次。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗,并于37°C恒温箱中孵育30min, PBS 洗涤6minX3次。甩干后滴加链霉亲和素■过氧化物酶,继续孵育30min, PBS洗涤6 X3次。

DAB 显色

按比例配置DAB显色剂。固定显色时间(需前期摸索时间,具体为在从滴加显 色剂开始,到显微镜下观察到组织出现棕黄色颗粒的时间,记录下该时间,以确保后 续批量处理的条件相同),将切片立即置于清水中终止显色反应。

2.1.7复染+封片

(1) 滴加苏木素并浸没3min;

(2) 自来水冲洗3min;

(3) 1%盐酸酒精浸泡3s,随后继续自来水冲洗5mim

(4) 逆酒精浓度梯度及二甲苯浸泡2min(与脱蜡时相反);

(5) 切片晾干后立即使用中性树胶封片(不可晾过久)。

2.1.9结果判定

首先设立阴性试剂对照组(空白对照),使用PBS替代一抗,余步骤不变,观 察切片非特异性染色,随后开始正常试验。FOXP4主要表达于细胞核,阳性反应为 细胞核出现棕黄色、棕褐色甚至黑色。E-cadherin主要位于上皮组织,定位于细胞膜 及细胞链接处,阳性反应为上诉部位出现黄色或棕黄色。Vimentin主要表达于间质细 胞,上皮组织表达量极低。定位于细胞浆,阳性反应为细胞浆出现黄色或棕黄色(因 胞浆与细胞核可能出现重叠,导致细胞核呈现褐色)。观察胃癌组织切片时,在正常 组织中只观察并统计上皮细胞,其他组织不统计。在显微镜下观察及拍照时需固定外 部条件(手动曝光),在低倍镜下排除非特异性染色部位,并于400倍显微镜下观察 切片,每张切片随机选择5个高倍视野拍照。照片统一采用半定量计分法,其中, E-cadherin及Vimentin采用计分法,分别计数细胞染色程度(未染色为0分,淡黄色 1分,黄色2分,棕黄色甚至棕褐色为3分)及阳性细胞百分比(小于5%为0分, 5%・25%为1分,25%-50%为2分,50%-75%为3分,大于35%为4分),将上诉分 值相乘,0分为阴性,1・4分为弱阳性,5・8分为阳性,9・12分为强阳性。FOXP4因 表达于细胞核,黄色于蓝色重叠后导致染色程度难以判断,故采用阳性细胞比值。阳 性细胞比例小于5%为阴性,5%-25%为弱阳性,25%-75%为阳性,大于75%为强阳 性。最终统计时将上诉的阴性及弱阳性归属于“阴性”,阳性及强阳性归属于“阳性”。

2.2 qRT-PCR 实验

2.2.1提取总RNA (后续所有操作均在冰面上执行,枪头及EP管均为去酶材料,减 少mRNA降解)

  • 在冰箱中取出事先从手术室选取并保存的胃部组织,剪下适量组织置于去酶 EP管中,加入lml的RNAiso Plus及研磨珠,预冷后置于匀浆机中充分研磨,取出 研磨珠,静置5mino
  • 加入核酸提取液200山,剧烈震荡30s,静置lOmin,随后放入预冷的离心机 中离心(15min, 12000rnm/p, 4°C)。取上清液(无色液体层),并加入等体积的异 丙醇中,上下颠倒混匀,放入预冷的离心机中离心(lOmin, 12000rnm/p, 4°C) □
  • 弃上清,加入lml 75%乙醇(使用DEPC水配置),使用枪头吹打沉淀物,放入 离心机中(5min, 7500rnm/p, 4°C),该步骤重复3次。
  • 弃上清,将EP管倒置于滤纸上晾干,加入20ul DEPC水溶解RNA。 222测定RNA浓度及纯度并定量

移取2ylRNA溶解液,使用分光光度计测量浓度和纯度,A260/A280值处于 1.8-2.1之间,否则该样本丢弃。并根据RNA浓度将各样本稀释为统一浓度(400ng/ul) 以方便后续处理。

2.2.3逆转录

  • 根据逆转录试剂盒提供的方案,配置20ul的反应体系。
  • 放置于PCR机器中根据事先设置好的程序进行逆转录。

2.2.4扩增

  • 引物设计:请基因公司设计并合成引物。

具体如下:

目的及内参基因引物序列

序列(5'to3‘) 长度(bp)

~FOXP4 Forward Primer:AGCCTGCACAAGTGCTTCGTC ———

Reverse Primer: CTGTCATCTTTGGCGGTCTCC 21

E-cadherin Forward Primer:CAAATCCAACAAAGACAAAGAAGGC 25

Reverse Primer:ACACAGCGTGAGAGAAGAGAGT 22

Vimentin Forward Primer:AATCCAAGTTTGCTGACCTCTCTGA 25

Reverse Primer:GACTGCACCTGTCTCCGGTACTC 23

GAPDH Forward Primer:GGACCTGACCTGCCGTCTAF 20

Reverse Primer:GTAGCCCAGGATGCCCTTGA 20

  • 根据扩增试剂盒的比例配置20ul扩增反应体系(分别配置目的基因与内参基 因的体系),并设置2个复孔。
  • 于PCR机上根据程序行扩增,并导出CT值。

2.2.5结果分析:

采用相对定量法(2・Z\Z\CT法)统计分析FOXP4、E-cadherin> Vimentin的相对 表达量。

2.3蛋白印迹实验(Western-Bolt)

2.3.1提取总蛋白

取出冰箱保存的适量胃组织放入EP管中,加入RIPA 200^11,加入PMSF2yl, 加入研磨珠,用匀浆机充分研磨,取出研磨珠,静置30min,放入离心机离心(5min, 12000rnm/p, 4°C)。完毕后取上清液。

  • BCA法蛋白定量

⑴配置蛋白标准品(0.5mg/ml)并制作标准曲线(分别取0,,1,2,4,8,12,16,20ul分 别放入96孔板中,再取PBS将每个孔补足20ul)-

(2)稀释样品:从样本中取出少量液体进行稀释50倍,取20卩1加入96孔板内 (设置2个副孔)。

  • AB液按50:1配置,将配置好的液体每孔加入200^11,将96孔板放入37°C恒 温箱中孵育30min,随后放入酶标仪中测量总蛋白浓度。
  • 根据测量蛋白浓度计算原样本蛋白浓度,取蛋白原液+上样缓冲液+RIPA重新 配置成统一蛋白浓度的样品。

(4)蛋白变性:将样品放于沸水中lOmin,取出后放于・20°C冰箱保存。

2.3.3蛋白印迹实验

⑴配胶:根据FOXP4、E-cadherin> Vimentin> GAPDH蛋白质分子量,根据配 胶说明书,采用10%SDS-PAGE分离胶+5% SDS-PAGE积层胶配置胶块(注意避免 气泡形成)。

(2) 电泳:将胶板放入电泳槽中,倒入电泳液。取出定量的蛋白液(解冻后需再 次震荡摇匀),在胶板的每个槽孔中加入等量蛋白液开始上样,在其中一个槽孔加入 预染蛋白(彩虹)Marker。调节电压为80V ,待预染蛋白(彩虹)Marker颜色出现 分离后将电压改为120V继续电泳,待绿线出现并预计能够分离各蛋白或蛋白样品接 近胶板底部后停止跑胶。

(3) 切胶+转膜:PVDF膜剪成条状并做好标记,用甲醇浸泡PVDF膜备用。配置 电转液。将电泳完成的胶板浸泡于电转液中,戴好手套于电转液中切胶。将切好的胶 与PVDF膜紧贴并制成“三明治”,随后将夹板插入电转槽开始电压(周围需加冰降 温),根据蛋白分子量调整电压及时间。

(4) 封闭+—抗孵育:配置TBS-T (吐温浓度为0.1%),并用奶粉配置封闭液。将 电转完成后的PVDF膜放入TBS-T洗涤10minX3次,奶粉封闭1.5h, TBS-T洗涤 10minX3次,将PVDF膜放入已倒入1抗(TBS-T稀释)的抗原孵育盒中,4°C摇晃 过夜。

(5) 二抗孵育 取出PVDF膜,TBS-T洗涤10minX3次,将PVDF膜与一抗种属 来源相同的二抗稀释液放于抗体孵育盒中,并在摇床上孵育lh (常温下)。

(6) 显色曝光 取出PVDF膜,TBS-T洗涤10minX3次,用滤纸吸除多余液体, 配置ECL发光液,将PVDF膜放曝光机中,加入ECL发光液使膜被浸没。开始曝 光。

2.3.4结果分析

将曝光好的图片用Image!测量灰度值,将目的蛋白灰度值/内参灰度值 (GAPDH)进行校准,将校准值进行统计分析。

2.4数据处理及统计学分析

采用SPSS24进行实验数据分析。针对WB及PCR数据,采用t检验及校正t检 验(使用前需检测正态性及方差齐性,若方差齐,米用t检验,若方差不齐,改为t“检 验;不符合正态分布的数据用秩和检验)O免疫组化结果采用卡方检验计算组间差异。 相关性分析采用Spearman分析,用r表示相关系数,正值为正相关,负值为负相关。 取95%置信区间,P<0.05表示差异有统计学意义。

3实验结果

3.1免疫组化结果

  • FOXP4、Vimentin> E-cadherin在癌与配对癌旁组织中的表达情况

FOXP4主要表达于上皮组织,细胞内定位于细胞核,阳性反应为细胞核出现棕 黄色、棕褐色甚至黑色。FOXP4在胃癌组织阳性表达率为82%,明显高于癌旁组织 (62%),差异有统计学意义(力2=4.96, FV0.05)。Vimentin主要表达于间质细胞, 上皮组织表达量极低。定位于细胞浆,阳性反应为细胞浆出现黄色或棕黄色(因胞浆 与细胞核可能出现重叠,导致细胞核视觉上呈现褐色)。Vimentin在胃癌组织阳性表 达率为84%,明显高于癌旁上皮组织(2%),差异有统计学意义(力2=64.94, FV0.05)。 E-cadherin主要表达于上皮细胞,定位于细胞膜及细胞链接处,阳性反应为上诉部位 出现黄色或棕黄色。E-cadherin在胃癌上皮组织中阳性表达率为44%,明显低于正常 胃上皮组织(100%),差异有统计学意义(疋=38.88, FV0.05)。(详见表1及图 1-6)

表格1 FOXP4E-cadherin> Vimentin在癌与配对癌旁组织中的阳性表达率

Tab.l Positive expression rate of FOXP4, E-cadherin and Vimentin in cancer and paired

tissuescancer

Index Positive rate z2 P
Cancer Group Para-Carcinoma

Group

FOXP4 82%(41/50) 62%(31/50) 4.96 0.026*
Vimentin 84%(42/50) 4% (2/50) 64.94 <0.001*
E-cadherin 44% (22/50) 100% (50/50) 38.88 <0.001*

注:才检验中,P<0.05有统计学意义

Note:* P<0.05 means statistical significance.

图1 FOXP4在癌旁胃粘膜组织表达(左X200,右X400)

Fig.l The expression of FOXP4 in para-carcinoma tissues(leftx200, rightx400)

图2 FOXP4在胃癌组织中的表达(左X200,右X400)

Fig.2 The expression of FOXP4 in gastric cancer tissues(leftx200, rightx400)

Fig.3 The expression of Vimentin in para-carcinoma tissues(leftx200, rightx400)
图3 Vimentin在癌旁胃粘膜组织中的表达(左X200,右X400)

图4 Vimentin在胃癌组织中的表达(左X200,右X400)

图5 E-cadherin在癌旁胃粘膜组织中的表达(左X200,右X400)

Fig.5 The expression of E-cadherin in para-carcinoma tissues(leftx200, rightx400)

图6 E-cadherin在胃癌组织中的表达(左X200,右X400)

Fig.6 The expression of E-cadherin in gastric cancer tissues(leftx200, rightx400)

3.1.2FOXP4、Vimentin> E-cadherin阳性表达率与临床病理资料之间的关系

FOXP4的表达水平与胃癌患者浸润深度有关(FV0.05),与年龄、性别、肿瘤 大小、分化程度及有无淋巴结转移无关联(P>0.05) o Vimentin的表达水平与胃癌患 者肿瘤分化程度相关(PV0.05),与年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度及有无淋巴 结转移无关联(尸>0.05)。E-cadherin的表达水平与胃癌患者肿瘤分化程度相关(P <0.05),与年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度及有无淋巴结转移无关联(P>0.05) o (详见表2-4)

表格2 FOXP4的表达与胃癌患者临床病理特征之间的关系

Tab.2 The correlation between FOXP4 expressions and the GC

Patients* clinicopathological characteristics

Number FOXP4 Positive

clinicopathological characteristics  龙2 P

gender
  Man 37 31 6 83.8% 0.018 0.893
  Woman 13 10 3 76.9%    
Age >60 years old 27 24 3 8&9%   0.270
  <60 years old 23 17 6 73.9%    
Tumor size >5cm 15 13 2 86.7% 0.026 0.872
  <5cm 35 28 7 80.0%    
Depth of              
infiltration T1+T2 14 8 6 57.1% 5.969 0.015*
  T3+T4 36 33 3 91.7%    
Degree of tumor              
differentiation High+Medium

differentiation

24 18 6 75.0%   0.281
  Low

differentiation

26 23 3 88.5%    
Lymph node              
metastasis Yes 33 28 5 84.8% 0.117 0.732
  No 17 13 4 76.5%    

注:才检验中,P<0.05有统计学意义。分化程度与年龄统计采用费希尔精确检验结果,故无才值。

Note:* P<0.05 means statistical significance. The differentiation of degree and age use Fisher's exact, so there is no 护 value.

表格3 Vimentin蛋白的表达与胃癌患者临床病理特征之间的关系

Tab.3 The correlation between Vimentin expressions and the GC

Patients* clinicopathological characteristics

clinicopathological characteristics Number

of cases

Vimentin

+

- Positive

rate

力2 P
gender Man 37 30 7 81.0% 0.260 0.610
  Woman 13 12 1 92.3%    
Age >60 years old 27 22 5 81.5%   0.711
  <60 years old 23 20 3 87.0%    
Tumor size >5cm 15 15 0 100% 2.558 0.110
  <5cm 35 27 8 77.1%    
Depth of              
infiltration T1+T2 14 10 4 71.4% 1.172 0.279
  T3+T4 36 32 4 8&9%    
Degree of tumor              
differentiation High+Medium differentiation 24 17 7 70.8%   0.021*
  Low

differentiation

26 25 1 96.2%    
Lymph node              
metastasis Yes 33 30 3 90.9% 2.101 0.174
  No 17 12 5 70.6%    

注:才检验中,P<0.05有统计学意义。分化程度与年龄统计采用费希尔精确检验结果,故无才值。

Note:* P<0.05 means statistical significance. The differentiation of degree and age use Fisher's exact, so there is no value.

表格4 E-cadherin蛋白的表达与胃癌患者临床病理特征之间的关系

Tab.4 The correlation between E-cadherin expressions and the GC
Patients* clinicopathological characteristics

clinicopathological characteristics Number

of cases

E-cadherin Positive

rate

  P
+ -
gender Man 37 18 19 48.6% 1.248 0.264
  Woman 13 4 9 30.8%    
Age >60 years old 27 15 12 55.6% 3.180 0.075
  <60 years old 23 7 16 30.4%    
Tumor size >5cm 15 8 7 53.3% 0.758 0.384
  <5cm 35 14 21 40.0%    
Depth of              
infiltration T1+T2 14 8 6 57.1% 1.363 0.243
  T3+T4 36 14 22 38.9%    
Degree of tumor              
differentiation High+Medium differentiation 24 14 10 58.3% 3.84 0.049*
  Low

differentiation

26 8 18 30.8%    
Lymph node              
metastasis Yes 33 12 21 36.4% 2.297 0.130
  No 17 10 7 58.8%    

注:才检验中,P<0.05有统计学意义。

Note:* P<0.05 means statistical significance.

  • FOXP4、Vimentin及E・cadherin在胃癌组织中表达的相关性分析

FOXP4 与 Vimentin 的表达呈正相关(FV0.05,0.364)。FOXP4 与 E-cadherin

的表达呈负相关(PV0.05, r= -0.319)。E-cadherin与Vimentin的表达呈负相关(P<0.05, —0.382)o (详见表 5-7)

表格5 FOXP4Vimentin在胃癌组织中表达的相关性分析

T^b・5 Coirebtion Kn^lysis of FOXP4 Kild Vimentin expression in gKstric cancer

FOXP4 P
Vimentin r
  + -
+ 37   5 0.364 0.039*
- 4   4    

注:于检验中,P<0.05有统计学意义。厂表示

Note:* P<0.05 means statistical significance.

表格6 FOXP4E-cadherin在胃癌组织中表达的相关性分析

Tab.6 Correlation analysis of FOXP4 and E-cadherin expression in gastric cancer

FOXP4 E-cadherin r P
+ -
+ 15 26 -0.319 0.030*
- 7 2    

注:才检验中,P<0.05有统计学意义。

Note:* P<0.05 means statistical significance.

表格7 VimentinEdherin在胃癌组织中表达的相关性分析

Tab.7 Correlation analysis of Vimentin and E-cadherin expression in gastric cancer

Vimentin E-cadherin r P
+ -
+ 15 27 -0.382 0.021*
- 7 1    

注:才检验中,P<0.05有统计学意义。

Note:* P<0.05 means statistical significance.

3.2 qRT-PCR 结果

  • FOXP4、Vimentin及E-cadherin的mRNA在胃癌组织及配对癌旁粘膜组织中的 表达

结果显示各指标的扩增曲线呈S型,溶解曲线呈单峰,扩增特异性可(详见图

7-10) o与癌旁组织相比,FOXP4、Vimentin的mRNA在胃癌组织中表达量上调, 差异有统计学意义(FV0.05) o E-cadherin mRNA在胃癌组织中表达量下调,差异 有统计学意义(PV0.05)。(详见表8)

表格8 FOXP4Vimentin及注dherin mRNA表达量(采用2-△△CT法后的数据)

Tab.8 The expression of FOXP4Vimentin and E-cadherin mRNA.

  Number of cases FOXP4 Vimentin E-cadherin
Gastric Cancer 12 2.70±1.43 2.72±1.58 0.69±0.29
Tissues        
Para-Carcinoma 12 1.30±0.80 1.16±0.64 1.84±0.53
Tissues        
P   0.03* 0.03* 0.04*

7 E-cadherin扩增及溶解曲线

Fig.7 The amplitication curve and melting curve of E-cadherin

5000

2000

1000

    ! 1 1 1 1 I 1 1 1 1 I  
     
       
       
    K-  
    M  
0 -      
( F—―1 1—>―|>—>―1—>—>―1―>—>|>―1— D 20 3(1 40

Temperaturef Celsius

8 FOXP4扩增及溶解曲线

Fig.8 The amplification curve and melting curve of FOXP4

9 Vimentin扩增及溶解曲线

Fig.9 The amplification curve and melting curve of Vimentin

10内参GAPDH扩增及溶解曲线

Fig.10 The amplification curve and melting curve of GAPDH

3.3蛋白印迹实验结果

  • FOXP4、Vimentin及E-cadherin在胃癌组织及配对癌旁粘膜组织中的表达 结果显示与癌旁组织相比,FOXP4、Vimentin在胃癌组织中表达量上调,差异 有统计学意义(05) o E-cadherin在胃癌组织中表达量下调,差异有统计学意义 (FV0.05) o (详见表9及图11)

表格9 FOXP4VimentinE-udherin表达量(蛋白灰度值/内参灰度值校准后数据)

Tab.9 The expression of FOXP4Vimentin and E-cadherin.

  Number of cases FOXP4 Vimentin E-cadherin
Gastric Cancer 12 1.30±0.38 1.70±1.10 0.37±0.35
Tissues        
Para-Carcinoma 12 0.73±0.40 0.69±0.39 1.65±1.46
Tissues        
P   0.01* 0.04* <0.001*

11 FOXP4VimentinE・gdherin在胃癌组织及配对癌旁组织中的表达

Fig.ll Expression of FOXP4, Vimentin and E-cadherin in gastric cancer tissues and paired
adjacent tissues

注:GC:胃癌组织;PC:癌旁组织

Note: GC: Gastric Cancer Tissues; PC: Para-Carcinoma Tissues

4讨论

胃癌具高发病率及高死亡率的特点,早期症状无特异性,亦无快捷方便的筛查手 段,故发现是常已处于进展期厲]。目前胃癌以手术治疗为主,辅以化疗等[殉,但疗 效仍旧无法令人满意,5年生存率仍处于较低水平卩7,隔。因此,积极探索胃癌发病机 制,并根据发病机理设计靶向治疗药物具有重大意义卩%

FOXP4属于FOX转录因子家族P亚家族,该家族成员能够与DNA结合并调控 转录⑺,涉及组织及胚胎的生长发育、糖脂代谢,还参与细胞周期调控、免疫调节等多 种生物学过程。黄文阿指出人类FOXP4在人类胚胎发育过程各组织中广泛表达,Lu MMH1]等研究表明Foxp4在小鼠胚胎发育过程中主要表达于肺、胃肠道、大脑的新皮 层部分,成年后主要表达于心脏购、脑【42]、肺、肝和睾丸等。LiS跑等人的研究发现 Foxpl/2/4多聚体是早期肺发育的转录因子,缺失后引起气道平滑肌分化障碍。另有 报道显示Foxpl/2/4多聚体的表达会导致成年小鼠中胰腺Q细胞的数量和质量降低, 从而引起低血糖症屮】。现有报道显示FOXP4参与多种肿瘤的演变,包括口腔鳞癌、 前列腺癌、膀胱癌障46]、肝细胞癌、乳腺癌、肺癌、食管癌旳、骨肉瘤[4&49]等。FOXP4 作为一广谱癌基因,在多种恶性肿瘤中高表达,但在胃癌中的表达情况尚需要探索。 为了检测FOXP4在胃癌中的表达情况,本实验采用了实时荧光定量PCR、免疫蛋白 印迹、免疫组织化学法等检测了 FOXP4蛋白及mRNA表达水平,结果提示FOXP4 主要表达于上皮细胞,细胞内定位于细胞核。免疫组织化学中FOXP4在胃癌组织阳 性表达率高于癌旁组织。进一步探索FOXP4与临床病理资料的关联性,结果显不 FOXP4表达水平与胃癌患者浸润深度有关,与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度及 有无淋巴结转移无关联。实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹实验结果显示与癌旁组 织相比,FOXP4蛋白及mRNA在胃癌组织中表达上调,以上结果表明FOXP4可能 参与胃癌的发展,具有成为新型靶向药物的靶标的潜力。FOXP4表达较为稳定,处 于调控网络的下游,具有诸多上游分子能够调控其表达,若以此为靶点,也许能够更 稳定的影响肿瘤细胞的生物学特性。已有其他同家族成员成为肿瘤药物的直接或间接 靶点,例如,乳腺癌的靶向治疗药物曲妥珠单抗、西妥昔单抗拉帕替尼均是以 FOX-O3A作为间接靶点,其作用过程涉及Akt、JNK、EGFR和细胞凋亡等多条信号 通路[期。转染了 FOXP3的树突状细胞被用于治疗黑色素瘤和胸腺瘤,涉及机制为 FOXP3能够调控CTLs和Tregs信号通路,调节免疫力冋。

上皮■间质转化(Epithelialmesenchymal transition, EMT)是一个过程,在此过程 中,上皮细胞会失去其连接和极性,转化为具有迁徙能力的间充质细胞。在恶性肿瘤 细胞中可见同时表达的上皮和间充质标志物,这被称为部分EMT,该过程使肿瘤的 侵袭性和远处转移能力增加,并促进肿瘤的发展。有报道FOXP4在乳腺癌中通过靶 向调控Snail促进乳腺癌细胞上皮■间质转化㈤。在肝癌中[20], FOXP4通过正向调节 Slug促进肝癌细胞的上皮■间质转化,并促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。但FOXP4 在胃癌组织中是否参与EMT形成,与E■钙黏蛋白及波形蛋白等EMT指标是否仍旧 呈相关性,目前尚未知晓,需进一步研究。为了初步探讨三者之间的相关性,在同一 胃癌组织中同时检测FOXP4、Vimentin及E-cadherin的表达,并统计三者间有无相 关性。结果显示,Vimentin主要表达于间质细胞,上皮组织表达量极低,定位于细胞 浆,Vimentin在胃癌组织阳性表达率明显高于癌旁上皮组织。E-cadherin主要表达于 上皮组织,定位于细胞膜及细胞链接处,E-cadherin在胃癌上皮组织中阳性表达率明 显低于正常胃上皮组织。Vimentin在胃癌组织中表达上调,E-cadherin在胃癌组织中 表达下调,与已发表论文结果相符。Vimenti> E-cadherin的表达水平与胃癌患者肿瘤 分化程度相关,与年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度及有无淋巴结转移无关联。FOXP4 与Vimentin的表达呈正相关。FOXP4与E-cadherin的表达呈负相关。E-cadherin与 Vimentin的表达呈负相关性。

综合本实验中FOXP4在胃癌中的表达情况及与EMT指标的相关关系,再结合 已有文献中在肝脏及乳腺癌细胞学实验的结果,推测FOXP4在胃癌中参与EMT形 成,并促进肿瘤的发展,为进一步探索胃癌的发病机制及靶向药物的研发提供了思路。 但本研究样本量仍旧较少,以胃癌组织做做实验时无法避免的采集到非目标组织(上 皮组织),导致行定量或半定量统计时结果粗糙,故在行组织WB及PCR时仅统计 表达量,未进一步结合临床资料。下一步可进一步扩大样本量,做细胞及动物实验来 探索FOXP4的生物学特性及与EMT的关系。

5结论

  • 胃癌组织中,FOXP4、Vimentin表达上调,E-cadherin表达下调。
  • 胃癌组织中,FOXP4的表达水平与胃癌患者浸润深度有关,Vimentin及

E-cadherin的表达水平与胃癌患者肿瘤分化程度相关。联合检测FOXP4、Vimentin和 E-cadherin可能有助于评估胃癌患者的肿瘤浸润、分化情况。

  • 胃癌组织中,FOXP4与Vimentin的表达呈正相关。FOXP4与E-cadherin的表 达呈负相关。E-cadherin与Vimentin的表达呈负相关。

参考文献

  • Bray F, Ferlay J, Soeijomataram I, et al. Global cancer statistics 201& GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 394-424.
  • Hashad D, Elbanna A, Ibrahim A, et al. Evaluation of the Role of Circulating Long Non-Coding RNA H19 as a Promising Novel Biomarker in Plasma of Patients with Gastric Cancer. J Clin Lab Anal, 2016, 30(6): 1100-1105.
  • Guo J, Miao Y, Xiao B, et al. Differential expression of microRNA species in human gastric cancer versus non-tumorous tissues. J Gastroenterol Hepatol, 2009, 24(4): 652-657.
  • 刘婉婷,顾康生.胃癌术后辅助化疗的研究进展•临床肿瘤学杂志,2018, 23(06): 569-572.
  • Yari F, Abiri R, Aryan E, et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification as a Fast Noninvasive Method of Helicobacter pylori Diagnosis. J Clin Lab Anal, 2016, 30(5): 464-470.
  • Greenburg G, Hay ED. Epithelia suspended in collagen gels can lose polarity and express characteristics of migrating mesenchymal cells. J Cell Biol, 1982, 95(1): 333-339.
  • Pasquier J, Abu-Kaoud N, Al Thani H, et al. Epithelial to Mesenchymal Transition in a Clinical Perspective. J Oncol, 2015, 2015: 792182.
  • 向姝霖,刘芳,夏红,二烯丙基二硫下调p-catenin抑制人胃癌MGC803细胞EMT.中 南医学科学杂志,2015, 43(05): 487-492+514.
  • Shibue T, Weinberg RA. EMT, CSCs, and drug resistance: the mechanistic link and clinical implications. Nat Rev Clin Oncol, 2017, 14(10): 611-629.
  • Saitoh M. Involvement of partial EMT in cancer progression. J Biochem, 2018, 164(4): 257-264.
  • Diepenbruck M, Christo fori G. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) and metastasis: yes, no, maybe? Curr Opin Cell Biol, 2016, 43: 7-13.
  • Du B, Shim JS. Targeting Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) to Overcome Drug Resistance in Cancer. Molecules, 2016, 21(7).
  • Cevenini A, Orru S, Mancini A, et al. Molecular Signatures of the Insulin-like Growth Factor 1-mediated Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast, Lung and Gastric Cancers. Int J Mol Sci, 2018, 19(8).
  • Yu S, Yan C, Yang X, et al. Pharmacoproteomic analysis reveals that metapristone (RU486 metabolite) intervenes E-cadherin and vimentin to realize cancer metastasis chemoprevention. Sci Rep, 2016,6:22388.
  • Kaufmann E, Knochel W. Five years on the wings of fork head. Mechanisms of Development, 1996, 57(1).
  • Ikeda T, Uno M, Honjoh S, et al. The MYST family histone acetyltransferase complex regulates stress resistance and longevity through transcriptional control of DAF-16/FOXO

transcription factors. EMBO Rep, 2017.

  • Benayoun BA, Caburet S, Veitia RA. Forkhead transcription factors: key players in health and disease. Trends Genet, 2011, 27(6): 224-232.
  • Saavedra-Garcia P, Nichols K, Mahmud Z, et al. Unravelling the role of fatty acid metabolism in cancer through the FOXO3-FOXM1 axis. Mol Cell Endocrinol, 2018, 462(Pt B): 82-92.
  • Barger CJ, Zhang W, Hillman J, et al. Genetic determinants of FOXM1 overexpression in epithelial ovarian cancer and functional contribution to cell cycle progression. Oncotarget, 2015, 6(29): 27613-27627.
  • Fu SH, Yeh LT, Chu CC, et al. New insights into Blimp-1 in T lymphocytes: a divergent regulator of cell destiny and effector function. J Biomed Sci, 2017, 24(1): 49.
  • Szafranski P, Herrera C, Proe LA, et al. Narrowing the FOXF1 distant enhancer region on 16q24.1 critical for ACDMPV. Clin Epigenetics, 2016, &
  • Medema RH, Kops GJ, Bos JL, et al. AFX-like Forkhead transcription factors mediate cell-cycle regulation by Ras and PKB through p27kipl. Nature, 2000, 404(6779): 782-787.
  • 何航,张蕊,李艳.FOXN3蛋白在恶性肿瘤中的研究进展.现代肿瘤医学,2018, 26(05): 804-809.
  • Jackson BC, Carpenter C, Nebert DW, et al. Update of human and mouse forkhead box (FOX) gene families. Hum Genomics, 2010, 4(5): 345-352.
  • 黄文.人类癌症相关基因FoxP4的结构、功能及其调控研究.In:湖南师范大学,2006.
  • Xu Y, Liu Y, Xiao W, et al. MicroRNA-299-3p/FOXP4 Axis Regulates the Proliferation and Migration of Oral Squamous Cell Carcinoma. Technol Cancer Res Treat, 2019, 18: 1533033819874803.
  • Li XH, Xu Y, Yang K, et al. Association of THAD A, FOXP4, GPRC6A/RFX6 genes and 8q24 risk alleles with prostate cancer in Northern Chinese men. J buon, 2015, 20(5): 1223-1228.
  • Huang C, Deng H, Wang Y, et al. Circular RNA circABCC4 as the ceRNA of miR-1182 facilitates prostate cancer progression by promoting FOXP4 expression. J Cell Mol Med, 2019, 23(9):6112-6119.
  • Zhang G, Zhang G. Upregulation of FoxP4 in HCC promotes migration and invasion through regulation of EMT. Oncol Lett, 2019, 17(4): 3944-3951.
  • Gang W, Yubei S, Yifu H, et al. MicroRNA-338-3p inhibits cell proliferation in hepatocellular carcinoma by target forkhead box P4 (FOXP4). International journal of clinical and experimental pathology, 2015, 8(1).
  • Qi W, Gao C, Zhang L, et al. MiR-3196, a p53-responsive microRNA, functions as a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma by targeting FOXP4. Am J Cancer Res, 2019, 9(12): 2665-2678.
  • Ma T, Zhang J. Upregulation of FOXP4 in breast cancer promotes migration and invasion through facilitating EMT. Cancer Manag Res, 2019, 11: 2783-2793.
  • Wang N, Gu Y, Li L, et al. Circular RNA circMYO9B facilitates breast cancer cell proliferation and invasiveness via upregulating FOXP4 expression by sponging miR-4316. Arch Biochem Biophys, 2018, 653: 63-70.
  • Yang T, Li H, Thakur A, et al. FOXP4 modulates tumor growth and independently associates with miR-138 in non-small cell lung cancer cells. Tumour Biol, 2015, 36(10): 8185-8191.
  • Tan KK, Quek TJ, Wong N, et al. Emergency surgery for perforated gastric malignancy: An institution's experience and review of the literature. J Gastrointest Oncol, 2011, 2(1): 13-18.
  • 李海强,蒋小华.胃癌新辅助治疗的研究进展•临床肿瘤学杂志,2020, 25(01): 75-80.
  • Karimi P, Islami F, Anandasabapathy S, et al. Gastric cancer: descriptive epidemiology, risk factors, screening, and prevention. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2014, 23(5): 700-713.
  • Ma J, Shen H, Kapesa L, et al. Lauren classification and individualized chemotherapy in gastric cancer. Oncol Lett, 2016, 11(5): 2959-2964.
  • 吴长安,赵三鹏.胃癌治疗新进展.中国中西医结合外科杂志,2013, 19(06): 720-722.
  • 黄文.利用模式动物斑马鱼研究基因FoxP4在心脏发育中的作用.In:湖南师范大学,
  • Lu MM, Li S, Yang H, et al. Foxp4: a novel member of the Foxp subfamily of winged-helix genes co-expressed with Foxpl and Foxp2 in pulmonary and gut tissues. Meeh Dev, 2002, 119 Suppl 1: S197-202.
  • Co M, Anderson AG, Konopka G. FOXP transcription factors in vertebrate brain development, function, and disorders. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol, 2020: e375.
  • Li S, Morley M, Lu M, et al. Foxp transcription factors suppress a non-pulmonary gene expression program to permit proper lung development. Developmental Biology, 2016, 416(2).
  • M SJ, S HC, Lauren B, et al. The FOXP1, FOXP2 and FOXP4 transcription factors are required for islet alpha cell proliferation and function in mice. Diabetologia, 2015, 58(8).
  • Liang H, Huang H, Li Y, et al. CircRNA_0058063 functions as a ceRNA in bladder cancer progression via targeting miR-486-3p/FOXP4 axis. Biosci Rep, 2020, 40(3).
  • Xiong Y, Zhang J, Song C. CircRNA ZNF609 functions as a competitive endogenous RNA to regulate FOXP4 expression by sponging miR-138-5p in renal carcinoma. J Cell Physiol, 2019, 234(7): 10646-10654.
  • Li Y, Li T, Yang Y, et al. YY1-induced upregulation of FOXP4-AS1 and FOXP4 promote the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma cells. Cell Biol Int, 2020.
  • Yin Z, Ding H, He E, et al. Up-regulation of microRNA-491 -5p suppresses cell proliferation and promotes apoptosis by targeting FOXP4 in human osteosarcoma. Cell Prolif 2017, 50(1).
  • Yin Z, Ding H, He E, et al. Overexpression of long non-coding RNA MFI2 promotes cell proliferation and suppresses apoptosis in human osteosarcoma. Oncol Rep, 2016, 36(4): 2033-2040.
  • Real PJ, Benito A, Cuevas J, et al. Blockade of epidermal growth factor receptors chemosensitizes breast cancer cells through up-regulation of Bnip3L. Cancer Res, 2005, 65(18): 8151-8157.
  • Nair S, Boczkowski D, Fassnacht M, et al. Vaccination against the forkhead family transcription factor Foxp3 enhances tumor immunity. Cancer Res, 2007, 67(1): 371-380.

综述

F0XP4在恶性肿瘤中的研究进展

1前言

恶性肿瘤是人类死亡的常见原因,根据GLOBOCAN2018报告估计,全球预计 有1810万新发恶性肿瘤患者,并有960万死亡死于恶性肿瘤⑴。然而目前恶性肿瘤 的发病机制仍尚不明确,靶向治疗药物稀缺,常规抗肿瘤药物疗效差,副反应大。因 此,积极探索肿瘤发病机制,并根据发病机理设计靶向治疗药物具有重大意义oFOXP4 蛋白属于FOX转录因子中的P亚家族,表达于上百种真核生物中,近年多项研究提 示该蛋白与恶性肿瘤密切相关,本文简要阐述FOXP4在恶性肿瘤中的研究进展。

2 FOX蛋白家族及F0XP4的简介

叉头框转录因子(forkhead box, FOX)是在黑腹果蝇中被Knochel E等人首次发 现,该蛋白属于“螺旋■折叠■螺旋"类蛋白中的一种亚群⑵。FOX蛋白特征为一个N端 型C2H2锌指结构和一个一端C端的“叉头框它。“叉头框"区含有约100个氨基酸,该 结构域的核心部分由3个Q螺旋(H1、H2、H3)及2个特征性环路结构组成,形成特 征性翼状螺旋结构的DNA结合域,因此又称为“翼状螺旋"蛋白阳]。FOX蛋白能够与 DNA结合并调控转录⑸,涉及组织及胚胎的生长发育、糖脂代谢,还参与细胞周期调控、 免疫调节等多种生物学过程。一旦调节失控,可能导致发育缺陷、代谢疾病,甚至肿 瘤的形成41]。目前人类中已发现超过50个FOX编码基因,并分为19个亚家族Wo FOXP蛋白(FOXP1, FOXP2, FOXP3, FOXP4)是功能多样的亚家族,除具有上诉 FOX家族的共有结构外,还在型锌指结构侧有卷曲螺旋基序,该部位能够结合DNA, 属于具有侧翼螺旋结构的亚族的转录因子[⑶,因其在胚胎发育(包括脑发育)中的协 同作用而闻名,即FOXP1、FOXP2、FOXP4可以彼此形成二聚体甚至多聚体,从而 发挥复杂的作用网,并与肿瘤的发生发展有关Wil其中,FOXP1和FOXP2与中枢 系统的语言形成有关El% FOXP3和调节性T细胞功能失调会导致自身免疫性疾病 [20]。

FOXP4蛋白属于FOX转录因子家族P亚家族,其编码基因位于6号染色体p21.1o 现已测出有274个生物体存在人类FOXP4的同源蛋白,并且FOXP4蛋白在黑猩猩、 恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼和青蛙等物种中是保守的,提示该蛋白可 能有重要生物学意义。

  • F0XP4的正常表达

黄文指出人类FoxP4在人类胚胎发育过程各组织广泛表达,如心脏、大脑、肺、 肝脏和肠等0]。LuMM〔22]等研究表明Foxp4在小鼠的多种组织中表达,胚胎发育过 程中主要表达于肺、胃肠道、大脑的新皮层部分,成年后主要表达于心脏0],脑㈡], 肺,肝和睾丸等。CoM〔23]等人的报告指出,FOXP1、FOXP2和FOXP4在多个区域 (包括皮质,海马,杏仁核,基底神经节,丘脑和小脑)以特异的顺序表达。LiSB] 等人的研究发现Foxpl/2/4多聚体是早期肺发育的转录因子,下调Foxpl/2/4多聚体 会导致肺的各类转录因子表达下降,同时非肺细胞谱系(包括Hox和Pax基因家族 的成员)的关键转录调节因子被显著上调,引起气道平滑肌分化障碍。另有研究表明 下调Foxpl/2/4多聚体的表达会导致成年小鼠中胰腺a细胞的数量和质量降低,从而 引起低血糖症©J

  • F0XP4和恶性肿瘤
    • FOXP4和乳腺癌

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤,发病率在所有恶性肿瘤发病率中位居第二,在女 性患者中位居第一,全球每年约有200万新发病例,并有60万人因此死亡⑴。目前, 乳腺癌治疗以手术为主,严重影响女性外观,术后易导致女性心理障碍。故充分研究 乳腺癌的发病机制,开发相应的靶向药物,阻断肿瘤的发生发展具有重要意义oMaT^ 发现FOXP4在乳腺癌组织和细胞系中表达上调,与肿瘤大小和临床分期相关,能够 促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。双重荧光素酶报告基因测定法结果提示Snail 是FOXP4的下游靶标,过表达Snail能够拮抗FOXP4的促癌效果。此外,FOXP4通 过靶向调控Snail促进乳腺癌细胞上皮■间质转化。另有报道指出©], circMYO9B / miR-4316 / FOXP4轴在调节乳腺癌进展中具有重要作用。circMYO9B通过抑制乳腺 癌细胞中的miR-4316来促进FOXP4表达,并促进乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭。 以上表明FOXP4具有成为治疗乳腺癌的靶标的潜力。

  • FOXP4和膀胱癌

膀胱癌是最常见的泌尿系恶性肿瘤,在男性恶性肿瘤发病率中排名第7^0 Liang^ 发现circRNA_0058063/ miR-486-3p/FOXP4轴能够调节膀胱癌增殖和侵袭能 力。对比正常膀胱组织,FOXP4、circRNA_0058063在膀胱癌细胞系和组织中的表达 显著增加,miR・486・3p的表达明显下降。miR・486・3p通过靶向抑制FOXP4的表达起 抑癌作用,circRNA_005806通过充当miR・486・3p的海绵来促进FOXP4的表达。另 有报道eoiCircRNA ZNF609/ miR-138-5p/FOXP4轴能够调节癌细胞侵袭和增殖。以上 表明FOXP4具有成为治疗膀胱癌的靶标的潜力。

  • FOXP4和前列腺

前列腺癌发病率位居男性肿瘤发病率第二位,与西方国家相比,我国发病率相对 较低 但呈持续上升趋势⑴。LiXH^i]采用高分辨率熔解曲线检测出FOXP4与前列腺 癌关系密切,Huang CQ]研究发现,CircABCC4通过调节miR・l 182 / FOXP4信号途 径来调节前列腺癌的进展。circABCC4和FOXP4在前列腺癌中上调,而miR-1182 在前列腺癌中下调。CircABCC4能够上调被miR-1182抑制的FOXP4的表达,增加 肿瘤增殖力和侵袭力。以上表明CircABCC4/miR-l 182 /FOXP4可以作为前列腺癌的 发病机制之一,为靶向药物的研发提供依据。

  • FOXP4和食管癌

食管癌发病率位居中国恶性肿瘤发病率的第六位,治疗困难,并严重影响患者生 存质量,积极探寻发病机制,寻找新的靶向治疗点至关重要⑴】。LiY®]发现转录因 子YY1诱导FOXP4-AS1和FOXP4的上调,促进食管癌细胞的增殖,敲低FOXP4-AS1 或FOXP4可以有效抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。其中,FOXP4-AS1与FOXP4两 者间呈正相关,FOXP4-AS1通过与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2CIGF2BP2) 相互作用来稳定FOXP4mRNA,从而正向调节FOXP4。另外,FOXP4-AS1可以通 过海绵作用使miR-3184-5p沉默,并上调FOXP4的表达。以上表明FOXP4可能具有 作为治疗食管癌的新型治疗靶标的潜力。

  • FOXP4和肝癌

肝癌死亡率位居恶性肿瘤死亡率第3位,早期发现困难,5年生存率低于5%更]。 Zhang G^36]等发现肝癌中,FOXP4表达量明显升高,与肿瘤大小,TNM分期和转移 密切相关。细胞学实验表明FOXP4通过正向调节Slug促进肝癌细胞的上皮■间质转 化,并促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。FOXP4异位表达后,E-cadherin的mRNA 和蛋白水平较对照组显著下调,N-cadherin的mRNA和蛋白水平较对照组显著上调。 相反,在抑制FoxP4后,上诉变化呈相反趋势。QiWR]发现miR-3196的过表达抑制 了内源性FOXP4蛋白水平,而将miR・3196抑制剂引入肝癌细胞可提高FOXP4表达。 ECU*]发现LOC105372579通过靶向作用于miR・4316/FOXP4信号途径促进肝癌细胞 增殖、迁移、侵袭和上皮■间质转化。WangG发现㈤],异位表达的miR-338-3p抑制 了肝癌细胞的增殖和集落形成,并导致细胞周期停滞。而FOXP4正是miR-338-3p的 靶标,敲低FOXP4具有与HCC中miR・338・3p过表达类似的作用。以上表明以FOXP4 为中心的信号传导网络能够为靶向药物的研发提供依据。

  • FOXP4和骨肉瘤

骨肉瘤是年轻患者中最常见的恶性骨肿瘤HO】,治疗疗效较差,揭露骨肉瘤的发生 发展机制,对制定有效的治疗方案必不可少。Yin 发现FOXP4mRNA与蛋白表 达量均较正常组织增高,敲低FOXP4会抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭,并促进 骨肉瘤细胞凋亡。miR・491・5p通过抑制FOXP4起抑癌作用。另有报道称,lncRNA MFI2可以通过调节FOXP4的表达来促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移H2]。以上表明, FOXP4可以作为人类骨肉瘤的潜在预测标志物进行进一步研究。

  • FOXP4和肺癌

肺癌发病率及病死率均排名全球第1,每年约新增200万患者,死亡170万患者 ⑴。Yang「43]发现FOXP4在非小细胞肺癌组织及细胞中高表达。miR・138能够靶向 抑制FOXP4表达,降低癌细胞的生长和侵袭能力,并诱导癌细胞的细胞周期停滞。 因此,MIR-138、FOXP4是靶向药物在肺癌的潜在靶向目标。

  • FOXP4和口腔鳞状细胞癌

口腔鳞状细胞癌是发病率位居实体恶性肿瘤第六位,估计每年有30万新病例屮】。 因此,提高对口腔鳞状细胞癌发病机制的认识,对改进治疗方案有积极意义°XuYH5] 等研究发现,FOXP4在癌细胞中表达上调。萤光素酶报告基因检测表明,miR・299・3p 可以直接与FOXP4的37TR结合,抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。 5以F0XP4为靶标治疗肿瘤的潜在方案

5.1 RNA 干涉(RNAi)

RNA干涉是由双链RNA引发的特异性基因沉默,常作为基因研究的工具。RNAi 特异性强,具有精确度高和下调基因表达的高功效的优势,但前期研发的药物副作用 大,并未用于临床。随着药物的不断研发,最近已有基于RNAi的疗法获得美国食品 和药物管理局的批准,更多及更好的基于RNAi的治疗药物将可能出现。目前实验报 道已显示出RNAi抑制癌相关基因(包括FOX蛋白)表达的可行性H6]。例如,转染 了小分子干扰RNA的肺腺癌细胞中FOXM1表达降低,并显著抑制肿瘤细胞DNA 复制和有丝分裂旳。在乳腺癌中,FOXM1被RNAi沉默后,能够有效减少他莫昔芬 的耐药性,阻断肿瘤细胞的增殖跑。这些发现表明将RNAi靶向应用于FOX蛋白是 一种治疗癌症的潜在方法[49】。

5.2蛋白酶抑制剂

蛋白酶抑制剂已开始进行广泛的临床试验,其特殊之处在于可以选择性地抑制肿 瘤细胞的生长而对正常细胞影响较小。然而,它们的抗癌机制尚未研究透彻。现有研 究结果提示这些蛋白酶抑制剂可以通过调节FOX蛋白来抑制癌细胞增殖及迁移等。 例如硼替佐米可以抑制FOXM1的转录活性和表达,FOXM1的过表达也可以使肿瘤 细胞免受硼替佐米引起的凋亡a】。另外,在出现bcr/abl基因重排的白血病中,蛋白 酶抑制剂硼替佐米可上调了 FoxO3a的表达水平并诱导肿瘤细胞凋亡Bl。因此,蛋白 酶抑制剂可能通过与FOX蛋白结合而发挥抗癌作用。

6展望

FOXP4蛋白是一种在进化上极度保守的转录因子,在众多肿瘤中异常表达,提 示其在肿瘤的发生发展中起重要作用,有望成为恶性肿瘤的标志物和靶向治疗点,为 肿瘤的诊断及治疗提供新的思路。但目前FOXP4的研究较少,仍需大量实验探索其 上下游的靶点,形成以FOXP4位核心的局部关系网。

参考文献

  • Bray F, Ferlay J, Soeijomataram I, et al. Global cancer statistics 201 & GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 2018, 68(6): 394-424.
  • Kaufmann E, Knochel W. Five years on the wings of fork head. Mechanisms of Development, 1996, 57(1).
  • Zhang W, Duan N, Song T, et al. The Emerging Roles of Forkhead Box (FOX) Proteins in Osteosarcoma. J Cancer, 2017, 8(9): 1619-162&
  • Weigel D, Jurgens G, Kuttner F, et al. The homeotic gene fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the Drosophila embryo. Cell, 1989, 57(4): 645-658.
  • Ikeda T, Uno M, Honjoh S, et al. The MYST family histone acetyltransferase complex regulates stress resistance and longevity through transcriptional control of DAF-16/FOXO transcription factors. EMBO Rep, 2017.
  • Benayoun BA, Caburet S, Veitia RA. Forkhead transcription factors: key players in health and disease. Trends Genet, 2011, 27(6): 224-232.
  • Saavedra-Garcia P, Nichols K, Mahmud Z, et al. Unravelling the role of fatty acid metabolism in cancer through the FOXO3-FOXM1 axis. Mol Cell Endocrinol, 2018, 462(Pt B): 82-92.
  • Barger CJ, Zhang W, Hillman J, et al. Genetic determinants of FOXM1 overexpression in epithelial ovarian cancer and functional contribution to cell cycle progression. Oncotarget, 2015, 6(29): 27613-27627.
  • Fu SH, Yeh LT, Chu CC, et al. New insights into Blimp-1 in T lymphocytes: a divergent regulator of cell destiny and effector function. J Biomed Sci, 2017, 24(1): 49.
  • Szafranski P, Herrera C, Proe LA, et al. Narrowing the FOXF1 distant enhancer region on 16q24.1 critical fbrACDMPV. Clin Epigenetics, 2016, &
  • 何航,张蕊,李艳.FOXN3蛋白在恶性肿瘤中的研究进展.现代肿瘤医学,201& 26(05): 804-809.
  • Jackson BC, Carpenter C, Nebert DW, et al. Update of human and mouse forkhead box (FOX) gene families. Hum Genomics, 2010, 4(5): 345-352.
  • 黄文.人类癌症相关基因FoxP4的结构、功能及其调控研究.In:湖南师范大学,2006.
  • Sin C, Li H, Crawford DA. Transcriptional regulation by FOXP1, FOXP2, and FOXP4 dimerization. J Mol Neurosci, 2015, 55(2): 437-44&
  • Katoh M, Igarashi M, Fukuda H, et al. Cancer genetics and genomics of human FOX family genes. Cancer Lett, 2013, 328(2): 198-206.
  • Jia H, Qi H, Gong Z, et al. The expression of FOXP3 and its role in human cancers. Biochim Biophys Acta Rev Cancer, 2019, 1871(1): 170-17&
  • Herrero MJ, Gitton Y. The untold stories of the speech gene, the FOXP2 cancer gene. Genes Cancer, 2018, 9(1-2): 11-38.
  • Meerschaut I, Rochefort D, Revencu N, et al. FOXP1-related intellectual disability syndrome: a recognisable entity. J Med Genet, 2017, 54(9): 613-623.
  • Bowers JM, Konopka G. The role of the FOXP family of transcription factors in ASD. Dis Markers, 2012, 33(5): 251-260.
  • Tao JH, Cheng M, Tang JP, et al. Foxp3, Regulatory T Cell, and Autoimmune Diseases. Inflammation, 2017, 40(1): 328-339.
  • 黄文.利用模式动物斑马鱼研究基因FoxP4在心脏发育中的作用.In:湖南师范大学,
  • Lu MM, Li S, Yang H, et al. Foxp4: a novel member of the Foxp subfamily of winged-helix genes co-expressed with Foxpl and Foxp2 in pulmonary and gut tissues. Meeh Dev, 2002, 119 Suppl 1: S197-202.
  • Co M, Anderson AG, Konopka G. FOXP transcription factors in vertebrate brain development, function, and disorders. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol, 2020: e375.
  • Li S, Morley M, Lu M, et al. Foxp transcription factors suppress a non-pulmonary gene expression program to permit proper lung development. Developmental Biology, 2016, 416(2).
  • M SJ, S HC, Lauren B, et al. The FOXP1, FOXP2 and FOXP4 transcription factors are required for islet alpha cell proliferation and function in mice. Diabetologia, 2015, 58(8).
  • Ma T, Zhang J. Upregulation of FOXP4 in breast cancer promotes migration and invasion through facilitating EMT. Cancer Manag Res, 2019, 11: 2783-2793.
  • Wang N, Gu Y, Li L, et al. Circular RNA circMYO9B facilitates breast cancer cell proliferation and invasiveness via upregulating FOXP4 expression by sponging miR-4316. Arch Biochem Biophys, 2018, 653:63-70.
  • Cumberbatch MGK, Noon AP. Epidemiology, aetiology and screening of bladder cancer. Transl Androl Urol, 2019, 8(1): 5-11.
  • Liang H, Huang H, Li Y, et al. CircRNA_0058063 functions as a ceRNA in bladder cancer progression via targeting miR-486-3p/FOXP4 axis. Biosci Rep, 2020, 40(3).
  • Xiong Y, Zhang J, Song C. CircRNA ZNF609 functions as a competitive endogenous RNA to regulate FOXP4 expression by sponging miR-138-5p in renal carcinoma. J Cell Physiol, 2019, 234(7): 10646-10654.
  • Li XH, Xu Y, Yang K, et al. Association of THAD A, FOXP4, GPRC6A/RFX6 genes and 8q24 risk alleles with prostate cancer in Northern Chinese men. J buon, 2015, 20(5): 1223-1228.
  • Huang C, Deng H, Wang Y, et al. Circular RNA circABCC4 as the ceRNA of miR-1182 facilitates prostate cancer progression by promoting FOXP4 expression. J Cell Mol Med, 2019, 23(9):6112-6119.
  • Chen W, Zheng R, Zhang S, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2013. Cancer Lett, 2017, 401: 63-71.
  • Li Y, Li T, Yang Y, et al. YY1-induced upregulation of FOXP4-AS1 and FOXP4 promote the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma cells. Cell Biol Int, 2020.
  • Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108.
  • Zhang G, Zhang G. Upregulation of FoxP4 in HCC promotes migration and invasion through regulation of EMT. Oncol Lett, 2019, 17(4): 3944-3951.
  • Qi W, Gao C, Zhang L, et al. MiR-3196, a p53-responsive microRNA, functions as a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma by targeting FOXP4. Am J Cancer Res, 2019, 9(12): 2665-2678.
  • E C, Yang J, Li H, et al. LncRNA LOC105372579 promotes proliferation and epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via activating miR-4316/FOXP4 signaling. Cancer Manag Res, 2019, 11: 2871-2879.
  • Gang W, Yubei S, Yifu H, et al. MicroRNA-338-3p inhibits cell proliferation in hepatocellular carcinoma by target forkhead box P4 (FOXP4). International journal of clinical and experimental pathology, 2015, 8(1).
  • Chicon-Bosch M, Tirado OM. Exosomes in Bone Sarcomas: Key Players in Metastasis. Cells, 2020, 9(1).
  • Yin Z, Ding H, He E, et al. Up-regulation of microRNA-491 -5p suppresses cell proliferation and promotes apoptosis by targeting FOXP4 in human osteosarcoma. Cell Prolif 2017, 50(1).
  • Yin Z, Ding H, He E, et al. Overexpression of long non-coding RNA MFI2 promotes cell proliferation and suppresses apoptosis in human osteosarcoma. Oncol Rep, 2016, 36(4): 2033-2040.
  • Yang T, Li H, Thakur A, et al. FOXP4 modulates tumor growth and independently associates with miR-138 in non-small cell lung cancer cells. Tumour Biol, 2015, 36(10): 8185-8191.
  • Chi AC, Day TA, Neville BW. Oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma-an update. CA Cancer J Clin, 2015, 65(5): 401-421.
  • Xu Y, Liu Y, Xiao W, et al. MicroRNA-299-3p/FOXP4 Axis Regulates the Proliferation and Migration of Oral Squamous Cell Carcinoma. Technol Cancer Res Treat, 2019, 18: 1533033819874803.
  • Huang C, Du J, Xie K. FOXM1 and its oncogenic signaling in pancreatic cancer pathogenesis. Biochim Biophys Acta, 2014, 1845(2): 104-116.
  • Kim IM, Ackerson T, Ramakrishna S, et al. The Forkhead Box ml transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells during development of lung cancer. Cancer Res, 2006, 66(4):2153-2161.
  • Millour J, Constantinidou D, Stavropoulou AV, et al. FOXM1 is a transcriptional target of ERalpha and has a critical role in breast cancer endocrine sensitivity and resistance. Oncogene, 2010, 29(20): 2983-2995.
  • Bach DH, Long NP, Luu TT, et al. The Dominant Role of Forkhead Box Proteins in Cancer. Int J Mol Sci, 2018, 19(10).
  • Bhat UG, Halasi M, Gartel AL. FoxMl is a general target for proteasome inhibitors. PLoS One,

2009, 4(8): e6593.

  • Jagani Z, Song K, Kutok JL, et al. Proteasome inhibition causes regression of leukemia and abrogates BCR-ABL-induced evasion of apoptosis in part through regulation of fbrkhead tumor suppressors. Cancer Res, 2009, 69(16): 6546-6555.

致谢

时光荏苒,三年的研究生学习生活即将结束,在毕业之际,我谨向我 的老师、同学、家人及朋友献上最真挚的谢意!

首先,由衷的感谢我的导师吴会超教授,感谢您给我了求学的机会, 感谢您三年来在生活及学习上的关心和照顾,感谢您对科研和论文的指 导,感谢您在胃镜上细致的教学。能成为您的学生,是我一生的荣幸; 我不是一名优秀的学生,但您是我心中最棒的老师,无论是品德或是医 术,都无可挑剔。在此我谨向导师表达我最诚挚的敬意和最衷心的感谢, 谢谢您,吴老师,三年来您辛苦了!

衷心感谢消化内科廣必光教授、赵逵教授、王红教授、刘模荣教授、 陈安海教授、石国庆教授、高原教授及周元昆、牟海军等老师在临床学 习中的指导。衷心感谢消化内科实验室文国荣老师、金海老师、安加兴 老师的指导。感谢我的同门胡露丽、何存存、成邵敏、罗林艳、唐加、 徐颖的帮助。感谢三年来一起规培轮转的同学及实验室的小伙伴的帮助。

还要感谢我的家人和朋友在求学路上的默默支持,你们是我动力的 源泉,也是我最坚实的后盾,因为有你们,我才能一步步走向自己的梦 想,谢谢你们!

最后,衷心感谢参加本对论文评阅、答辩和对本论文提岀宝贵意见 各位专家及教授!