蟾毒灵联合顺钳对骨肉瘤143B细胞凋亡的实验论文

2020年10月14日13:49:18蟾毒灵联合顺钳对骨肉瘤143B细胞凋亡的实验论文已关闭评论

蟾毒灵联合顺钳对骨肉瘤143B细胞凋亡的实验论文

摘要

目的:

观察以骨肉瘤143B细胞为研究对象,单独使用蟾毒灵、顺钳和联合对骨肉 瘤143B细胞的增殖和凋亡的影响,探究其可能的机制。

方法:

取对数生长期的骨肉瘤143B细胞株,采用MTT法分别在24、48、72h下 检测蟾毒灵浓度(0, 6.25, 12.5, 25, 50, lOOnmol)和顺钳浓度(0, 50, 100, 200, 400ng/ml)作用于143B细胞,分别计算出蟾毒灵和顺钳的半数抑制浓度IC5o 值;分别选取蟾毒灵和顺钳的1/4IC50, 1/2IC50, IC50值和联合两者同水平IC50浓度 作用于143B细胞,在干预48h后通过金氏公式计算出q值,评价两者联合用药 效果,并进行后续实验的分组;用倒置显微镜观察干预48h后各组细胞形态学变 化;用荧光倒置显微镜观察干预48h后Hoechst33258染色下各组细胞凋亡形态 变化;用细胞分选仪分别检测干预48h后各组的Annexin V-FITC/PI双染细胞凋 亡情况;用流式细胞仪分别检测干预48h后各组的PI单染细胞周期阻滞情况; 用Western blot检测干预48h后各组的Bcl-2, Bax, Caspase-3凋亡相关蛋白表达 情况。

结果:

  1. MTT结果显示:在单用蟾毒灵药物浓度组(0, 25,12.5,25, 50, lOOnmol) 和顺钳药物浓度组(0, 50, 100, 200, 400ng/ml)作用于143B细胞,随药物浓 度增高,对细胞增殖的抑制率也增加,随作用时间延长,对细胞增殖的抑制率也 增强,蟾毒灵IC50值为15nmol和顺钳IC50值为150ng/mlo
  2. 金氏公式评价联合用药效果:分别单用蟾毒灵浓度为75nmol, 7.5nmol, 15nmol组和顺钳浓度为37.5ng/ml, 75ng/ml, 150ng/ml组,以及联合同水平IC50 值浓度组分别(3.75nmol+37.5ng/ml), (7.5nmol+ 75ng/ml)和(15nmol+150ng/ml) 组,在干预48小时后测OD值计算各组抑制率,蟾毒灵联合顺钳仅有

(15nmoL+150ng/ml)组通过金氏公式计算q值为1.29大于1.15,两药联合具有 协同效应。因此将实验分组为:空白对照组,蟾毒灵(15nmol)组,顺ffi(150ng/ml) 组和蟾毒灵联合顺钳(15nmol+150ng/ml)组。

  1. 倒置显微镜下观察:空白对照组143B细胞生长较好,蟾毒灵组,顺钳

组和联合组可见143B细胞生长速度减缓,联合组较蟾毒灵组和顺钳组更为显著, 脱落细胞和细胞贴壁情况较单药组更明显,细胞间距也明显增加。

  1. Hoechst33258染色荧光检测:空白对照组143B细胞呈淡蓝色荧光,蟾 毒灵组和顺钳组143B细胞核呈致密浓染的荧光数量增加,联合组更明显。
  2. 细胞分选仪Annexin V-FITC/PI凋亡双染检测:联合组、蟾毒灵组、顺钳 组的细胞凋亡率分别为:(62.75±4.26) %、(43.35±4.27) %、(43.51±3.10) %, 显著高于对照组(17.80±2.36) %,差异均具有统计学意义(01)。
  3. 流式细胞仪PI细胞周期检测:蟾毒灵组与对照组相比,143B细胞在S 期、G2期比例增加(05),顺钳组较对照组在S期、G2期比例细胞也增加,

(PV0.01),联合组较对照组S期、G2期比例细胞更明显,差异均具有统计学 意义(FV0.01)。

  1. Western blot检测:蟾毒灵组、顺钳组、联合组的Bax, Caspase-3表达量 明显增加,而较对照组,各组Bcl・2表达量降低,均具有统计学意义(01), 联合组更明显(FV0.01)。

结论:

  1. 蟾毒灵与顺钳均可抑制骨肉瘤143B细胞增殖,呈时间-浓度依赖性,两 者具有协同作用,联合效果更明显。
  2. 蟾毒灵与顺钳可导致骨肉瘤143B细胞细胞形体学和细胞凋亡形态学的 改变,联合组效果更明显。
  3. 蟾毒灵与顺钳均可使骨肉瘤143B细胞的细胞凋亡率增加,联合组高于 单药组,而细胞周期在S期、G2期阻滞,联合组效果更明显。
  4. 蟾毒灵协同顺钳诱导骨肉瘤143B细胞凋亡,可能通过Bax, Caspase-3 蛋白上调表达,下调Bcl・2蛋白的表达有关。

关键词:细胞凋亡;细胞周期;骨肉瘤;蟾毒灵;顺钳

Abstract

Objectives:

The effects of osteosarcoma 143B cells on the proliferation and apoptosis of osteosarcoma 143B cells were investigated by using 143B cells of osteosarcoma, and the possible mechanisms were explored.

Methods:

Using logarithmic growth of osteosarcoma 143B cell line, the concentration of bufalin(0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100nmol)and cisplatin(0, 50, 100, 200,400ng/ml)were used to 143B cells at 24, 48, 72h by MTT method, calculate the IC50 values of the hal匸inhibitory concentration of bufalin and cisplatin respectively; Selecting I/4IC50, I/2IC50 and IC50 values and the same level of IC50 values of bufalin and cisplatin were combined individually, after interfering with 143B cells for 48 hours, the effect of combination was calculated by the Jin's formula, and the subsequent experiments were grouped. The cells of each group were observed by inverted microscope for 48 hours morphological changes were observed. Morphological changes of cells in each group stained with Hoechst 33258 after 48h intervention by fluorescence inverted microscope. The apoptosis of Annexin V-FITC/PI double stained cells was detected by cell sorting instrument. Flow cytometry was used to detect the cell cycle arrest of PI staining cells in each group after 48 hours of intervention. The expression of Bcl-2, Bax and Caspase-3 apoptosis-related proteins in each group were detected by Western blot.

Results:

  1. MTT results showed that 143B cells were intervened in the bufalin drug concentration group (0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 nmol) and cisplatin drug concentration group (0, 50, 100, 200, 400 ng/ml). The cell proliferation inhibition rate increased, and the cell proliferation inhibition rate increased with the prolongation of the intervention time, and the IC50 value of bufalin was 15nmol and the IC50 value of cisplatin was 150ng/ml.
  2. JiiTs formula evaluates the effect of combination therapy: the concentration ofbufelin alonely is 3.75nmol, 7.5nmol, 15nmol group and cisplatin alonely concentration is 37.5ng/ml, 75ng/ml? 150ng/ml group, and combined with the same level IC50 concentration group was (3.75nmol+37.5ng/ml), (7.5nmol+75ng/ml) and (15nmol+150ng/ml) respectively. The inhibition rate was calculated after 48 hours of intervention.The bufelin was combined with cisplatin only (15nmoL+15Ong/ml) group ,it is calculated the q value to be 1.29 greater than 1.15 by the Jin's formula, and the combination of the two drugs had a synergistic effect. Therefore, the experiments were divided into: blank control group, bufalin (15 nmol) group, cisplatin (150 ng/ml) group and bufalin combined with cisplatin (15 nmol + 150 ng/ml) group.

3.Observed under an inverted microscope: 143B cells in the blank control group grew well, and the growth rate of 143B cells was slowed down in the bufalin group, cisplatin group and the combined group. The exfoliated cells and adherence cells were more obvious than the single drug group, and the cell spacing was also significantly increased.

  1. Hoechst33258 staining fluorescence detection: 143B cells in the blank control group showed light blue fluorescence, and the amount of fluorescence in the bufalin group and cisplatin group 143B increased densely, and the combined group was more obvious.
  2. Apoptosis double staining assay of cell sorting instrument Annexin V-FITC/PI: The apoptosis rates of the combination group, bufalin group and cisplatin group were: (62.75±4.26)%, (43.35±4.27)%, (43.51±3.01)%, significantly higher than the control group (17.80±2.36)%, the combination group was more obvious, the difference was statistically significant (P<0.01).
  3. Flow cytometry PI cell cycle assay: Compared with the control group, the bufalin group ratio of 143B cells in S phase and G2 phase increased (P<0.05), and the ratio of cisplatin group in S phase and G2 phase increased,(^<0.01), the combined group was more significant than the control group in S phase and G2 phase increased ,the difference was statistically significant (P<0.01).
  4. Western blot analysis showed that the expression of Bax and Caspase-3 in bufalin group, cisplatin group and combination group increased significantly,Compared with the control group, the expression of Bcl-2 in each group decreased, which was statistically significant (P<0.01). The combined group was more obvious (P<0.01).

Conclusions:

  1. Both bufelin and cisplatin can inhibit the proliferation of osteosarcoma 143B cells in a time-concentration-dependent manner, and the two drugs has synergistic effects, and the combined group effect is more obvious.
  2. Bufelin and cisplatin can cause changes in cell morphology and apoptosis morphology of osteosarcoma 143B cells, and the combined group effect is more obvious.
  3. Both bufelin and cisplatin can increase the apoptotic rate of osteosarcoma 143B cells, the combination group is higher than the single drug group, and the cell cycle is blocked in the S phase and G2 phase, and the combined group effect is more obvious.
  4. Bufelin combined with cisplatin induced apoptosis of osteosarcoma 143B cells, which may be related to the up-regulation of Bax, Caspase-3 protein and down-regulation of Bcl-2 protein expression.

Keywords: Apoptosis; Cell cycle; Osteosarcoma; Bufelin; Cisplatin

中英文缩略词表

英文简称 英文全称 中文全称
143B Human osteosarcoma cell line 143B 人类骨肉瘤细胞株143B
APS Ammonium Persulfate 过硫酸鞍
BF Bufelin 蟾毒灵
BCA Bicinchoninic Acid 二卩奎卩林甲酸
Caspase Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase 半胱天冬氨酸蛋白酶
DDP Cisplatin 顺钳
DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚枫
ddH2O Double diatilled water 双蒸水
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸
FBS Fetal bovine serum 胎牛血清
FCM Flow cytometry 流氏细胞仪
g Gram
h Hour 小时
IC50 Inhibitory Concentration 50 半数抑制浓度50
min Minute 分钟
ml Milliliter 毫升
mA Milliampere 毫安
MEN Minmum Essential Medium 基础培养液
MTT (4,5-Dimethylium-2-yl)-2,5-diphen 二甲基四氮卩坐兰
itetrazolium bromide thiazoly blue
nmol Nano millimole per liter 纳摩尔每升
ng Nanogram 纳克
OD Optical Density 光密度
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰氨凝胶电泳
PVDF Polyvinylidene Fluoride 聚偏二氟乙烯
P/S Penicillin/streptomycin 青/链霉素
PI Propidium Iodide 碘化丙唏
PBS Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液
rpm Rounds Per Minute 转/分
SDS Sodium Dodecyl Sulphate 十二烷基硫酸钠
Tris Trishydroxymethyl aminnomethane 三轻甲基氨基甲烷
TBS Tris buffered saline 三轻甲基氨基甲烷盐缓冲 液
TBST Tri Buffered Saline Tween 洗膜缓冲液
TEMED Tetramethylethylenediamine 四甲基乙二胺
(11 Micro liter 微升
V Voltage 电压伏特
P-actin P-actin antibody 卩■链蛋白

骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)来源于骨原始间充质细胞,其组织学特征为大 量梭形肉瘤细胞直接形成不成熟骨及类骨质样组织,好发于长骨干干肪端,如胫 骨近端、肱骨近端、股骨远端为其好发部位,是最常见的高度原发性骨恶性肿瘤, 在恶性骨肿瘤的比例约为20%,又称成骨肉瘤>4打据国内以及国外流行病学相 关报道,OS在世界各地发病率约为3-8/100万人,其中发病多倾向于亚洲人种⑸ 6]o在20世纪70年代以前骨肉瘤的主要治疗手段仅以考虑单纯性截肢手术,其 5年生存率仅仅为15-20%7-9\患者术后满意度较差。在新辅助化疗技术和外科 保肢手术结合运用于治疗骨肉瘤,骨肉瘤患者的5年生存率提高到50-75%10],但 骨肉瘤具有早转移、高复发、较差预后的特点,骨肉瘤患者5年生存率和肿瘤细 胞转移有密切联系,未发生转移的OS患者5年生存率可以维持在50-75%, 一 旦转移OS患者5年生存率降至20%"引o目前骨肉瘤的治疗手段主要围绕新辅 助疗法术前化疗、手术切除治疗、术后辅助化疗为主,而且大部分OS的治疗方 案都包含术前化疗,常规OS—线化疗优选方案基础药物有顺钳(Cisplatin, DDP)、阿霉素(Adriamycin, ADM)、甲氨蝶吟(Methotrexate, MTX)、异环 磷酰胺(Ifosfamide, IFO) 口4灯。然大剂量的化疗药物在治疗骨肉瘤上已经有明 显的毒副作用和多重耐药性,这其实也是导致骨肉瘤治疗失败的重要因素口8切。 祖国传统中医药在防治肿瘤有其独特的优势,大量的中药和其提取在实验基础研 究和实际应用中被发现有明显的抗肿瘤作用,因此中医药是一个尚在开发的抗肿 瘤治疗的试验场。

祖国传统中医药在认识骨肉瘤方面,未明确提出“骨肉瘤”病名的明显记载, 但探究其病因病机和临床症候当属于中医之“骨瘤”,或“恶疮”,或“胫阴疽”, 或“肉瘤”,或“石痈”,或“石疽”和“骨蚀”等范畴。骨肉瘤的病因病机始终 以本虚标实为其特点,以“内虚”为本,“癌毒”为实,肾虚气弱,正气不足, 阴阳失和,脏腑功能失稳,“癌毒”乘虚而入,气滞血瘀痰凝,蓄积成块,结而 成瘤,黏着难清,根深蒂固,“癌毒”陷深,非攻不克,在骨肉瘤早期采用扶正 的同时,运用“以毒攻毒”治法理念,阻止骨肉瘤患者疾病的发生发展型如。

顺式二氯二氮合钳 II (Cis-dichlorodiam-minoplatinum II, CDDP)的简称为 顺钳(Cisplatin, DDP),其首要抗肿瘤机制是在肿瘤细胞的DNA链间,能形成 DDP-DNA复合物去干扰其DNA的复制,进而能产生对肿瘤细胞增殖抑制作用, 是一种非特异性细胞周期高效广谱抗肿瘤药販。DDP在各种恶性肿瘤的化疗和 化疗联合用药的治疗方案中运用达到70-80%26]oDDP在各种肿瘤的治疗如肺癌、 肝癌、睾丸癌、膀胱癌、阴茎癌、卵巢癌、乳腺癌和全身各部位等恶性低分化肿 瘤具有肯定的疗效,但因其使用剂量问题带来的不良反应如对肾、耳及神经毒性 和其耐药性等限制其在临床的推广旳28\因DDP抗肿瘤的高效性及其广谱性, 交叉耐药性较小,与其他种类抗肿瘤联合应用有协同作用,通过降低DDP剂量 为焦点的联合用药研究成为骨肉瘤治疗的重点方向旳。

蟾毒灵(Bufhlin, BF)是从中药蟾酥(Bufonis Venenum)提取的蟾酥提取 物中抗肿瘤作用力最强的當体类化合物,蟾酥源于《本草衍义》,始载《药性赋》, 有毒,味辛、苦,性温,归心经,具有解毒、止痛、开窍和醒神等功效,历版国 家官方药典均记载。BF属于细胞的拓扑异构酶II抑制剂,可对增殖的肿瘤细胞 产生抑制、阻止肿瘤细胞分裂和促其凋亡作用⑶吨,对各种恶性肿瘤如胃癌、胰 腺癌、肝癌、白血病、肺癌、肠癌等有明显抗瘤和逆转药物耐受性的效果33_37]o 前期国内外学者应用BF对骨肉瘤U-2OS> MG・63、SaoS-2> HOS细胞进行抗肿 瘤实验提示BF抗肿瘤作用明显,但对骨肉瘤143B细胞的干预未曾报道。本研 究采用DDP和BF联合应用对骨肉瘤143B细胞进行实验,完善BF和DDP在 骨肉瘤细胞系的前期基础实验研究,为骨肉瘤的治疗提供理论依据。

第一章理论研究

1 •中医对骨肉瘤的研究

1.1中医对骨肉瘤病名病位的认识

祖国传统中医药在认识骨肉瘤方面,未明确提出“骨肉瘤”病名的明显记载, 但探究其病因病机和临床症候当属于中医之“骨瘤”,或“恶疮”,或“胫阴疽”, 或“肉瘤”,或“石痈”,或“石疽”和“骨蚀”等范畴。“瘤”字病名最早现于 夏商周时期的甲骨文上,并认识到了 “留聚不去”。在《黄帝内经•灵枢》已经 开始对“瘤”的分类和症状进行了描述,如《灵枢•刺节真邪》曰“虚邪之于身,…… 久留而内著,……则骨疼肉枯,……内伤于骨为骨蚀,……有所结,深入骨,…… 则为骨疽”。《短剧方》曰“有石痈,……便极坚如石”详细描述了 “石痈”的临 床表现。《千金要方》曰:“……十年不差,……令人骨消肉尽,……寤寐不安” 描述了古代恶性肿瘤病人的明显恶病质症状。《外科枢要》曰“……按之坚硬名 曰肿瘤”。《洞天奥旨》曰“骨瘤、石瘤, 按之, 一骨生于中, 如石 之坚”也描述了 “骨瘤”的症状,《证治准绳》曰“小肚(胫骨)内侧,坚硬如 石……痛楚难禁”描述“胫阴疽”的症状。

1.2中医对骨肉瘤病因病机的认识

1.2. 1中医对骨肉瘤病因的认识

祖国传统中医将骨肉瘤的的病因可为内、外因两大类。人体的精神、年龄、 体质、遗传等内因与骨肉瘤的发生密切相关。《素问•阴阳应象大论》曰:“…… 怒伤肝,……喜伤心,……思伤脾,……忧伤肺,……恐伤肾”描述情志引起机 体功能失调,而“能知七损八益, 年四十而阴气自半也, 年五十,  年六十,……阴痿,……气大衰”说明年龄的差异与体质与疾病的关系。《医门 补票》曰:“……一童同身生骨瘤,……由母肾虚,……胎感其气而成”和“…… 正虚邪入,……搏结伤骨成瘤”说明骨肉瘤的发病与先天遗传有关,正气亏虚导 致邪毒侵犯形成骨肉瘤。《外科正宗》曰:“……肾主骨,……悠欲伤肾,……骨 无荣养而为肿,……曰骨瘤”说明肾水劳伤和骨肉瘤的发病也存在关联。外因是 自然界物理、化学、生物等外在致病因素导致骨肉瘤的的发生,如外感六淫,饮 食不洁、癌邪毒戾等。《医学入门》曰:“……郁结伤脾,……外邪搏而为肿 曰肉瘤”和《诸病源候论》“此由寒气客于经络,……血涩结而成,……坚如石, 故谓之石疽也”描述骨肉瘤的发生与其感受外感六淫有关联。《正体类要》曰:

“……肢体损于外,……营卫有所不贯,脏腑由之不和”说明外伤致人体气血经 络瘀滞是骨肉瘤发生的病理机制。

1.2.2中医对骨肉瘤病机的认识

  • 肾虚气弱

肾者主骨生髓,肾精亏虚,正气虚弱,其卫外之气无以生,正气和邪气的相 互抵抗制约最终决定疾病的转归,正如《外科正宗》曰:“……肾气弱而骨无荣 养”和《景岳全书》曰:“……肾不足,……及虚弱失调之人,……多由积聚之 病”,对于骨肉瘤也是如此,《灵枢•百病始生篇》曰“……不得虚,邪不能独伤 人。……两虚相得,乃客其形,……参以虚实,大病乃成……”和《医宗必读》 曰:“……正气不足,而后邪气踞之”说明正气在疾病中起决定而关键作用。《素 问•经脉别论篇》曰:“……勇者气行则已,怯者则着而为病也”说明正气不足 易生疾病。《诸病源候论》曰:“……阳虚寒客,气血不畅,……结而为瘤”和《外 科心法要诀》曰:“……瘤证属阴,……坚硬如石,……昂昂坚贴于骨者”描述 了阳气虚弱,影响气血运行,而生肿瘤。

  • 气滞血瘀

古代众多名医名家认为在肿瘤的治疗上特别注重气血的运行通畅与否,气血 不畅,致血行瘀滞,日久成块或成瘤。《素问•调经论》曰:“……气血不和,百 病乃变化而生……”和《普济方》曰:“……瘤之为义,……及郁结壅塞,…… 瘤所以生”说明气血运行失常也可以致其肿瘤的发生或发展。《医林改错》曰: “……气无形不能结块,……结块者,……必有形之血”。

  • 气滞痰凝

百病多由痰作祟,怪病多痰,肿瘤的发生发展也不例外,痰走形不定变化多 端与肿瘤的转移性很相似,《医学入门》曰:“……复被外邪,……生其痰而聚 瘀,……故又曰瘤”和《丹溪心法曰》曰:“……凡人身或上、或中、或下有块 者,……多是痰”肿瘤组织的形成中痰也是其中一部分,痰的黏着之性和难以去 除肿瘤组织的特性相类似。《杂病源流犀烛》云“……痰之为物,……周身内外 皆到,五脏六腑俱有”说明痰和肿瘤的发生一样人体全身上下均可出现。

  • 癌毒蕴结

《中藏经》曰:“痈疽疔疮之所作也,皆五脏六腑蓄毒不流则生矣”说明其 蓄毒和痈疽或疔疮(含恶性肿瘤)是存在关联,癌毒滞留是肿瘤发生的机制,《医 宗金鉴》曰:“……皆有毒气闭塞经络,……营卫瘀滞之故”。《仁斋直指方》曰:

“……癌者,……如岩穴之状,……毒根深藏”说明癌毒蕴结,根深蒂固是肿瘤 重要致病特点。

骨肉瘤的病因病机始终以本虚标实为其特点,以“内虚”为本,“癌毒”为 实,肾虚气弱,正气不足,阴阳失和,脏腑功能失稳,“癌毒”乘虚而入,气滞 痰凝血瘀,蓄积成块,结而成瘤,黏着难清,根深蒂固,“癌毒”深陷,非攻不 克。在采用扶正的同时,运用“以毒攻毒”治法理念,阻止早期骨肉瘤患者疾病 的发生发展②如。

1 ■ 3中药医对骨肉瘤的治疗

1.3. 1中药单体及活性成分对骨肉瘤的治疗

中药单体及其提取的活性成分治疗骨肉瘤主要聚集对骨肉瘤细胞上应用,研 究已经涉及到骨肉瘤U・2OS、MG・63、SaoS-2> HOS各个细胞系。邹敏等冏发 现苦参碱在干预骨肉瘤MG-63,较对照组而言实验组的细胞在S期阻滞随药物 浓度的增加表现明显增加,Go/Gi和G2/M期细胞明显减少,抑制骨肉瘤MG-63 增殖,实验高、中、低剂量组较对照组MMP・2、MMP-9的蛋白表达量明显减少, 骨肉瘤MG-63明显抑制其侵袭和转移能力。张静玲等血研究榊皮素干预骨肉瘤 MG-63,榊皮素各处理组较对照组,其细胞凋亡率随药物浓度的增加而进一步增 加,Caspase-3、Bax和细胞色素C的mRNA表达量和其蛋白表达明显高于对照 组,Bcl・2蛋白的表达明显低于对照组,榊皮素通过激活Caspase-3的信号通路进 而促进MG-63细胞的凋亡。直彦亮等凹发现白藜芦醇能够上调MG-63细胞的 miR-34a和LC3-I/II,促进p53的表达抑制MG-63细胞的生长,促进自噬的发生。 陆建红等山刀发现丹参酮IIA激活JNK通路上cleaved caspase-3 > Bax蛋白的表达, 同时抑制Bcl-2蛋白的表达进而来促进骨肉瘤HOS细胞的凋亡。陈艳阳等丽发 现雷公藤红素上调CHOP、c-caspase-12> c-caspase-3表达,激活其通路来促进骨 肉瘤HOS细胞的凋亡。范全等嗣发现姜黄素通过上调Caspase-3/8/9蛋白表达, 激活Caspase的级联反应促进骨肉瘤U-2OS细胞凋亡。魏强强等嗣研究野菊花总 黄酮干预Saos-2细胞发现,实验组的Caspase-3和Bax表达较对照明显增加,而 Bcl-2蛋白则降低从而激活凋亡通路致骨肉瘤U-2OS细胞凋亡。

1-3.2中药复方对骨肉瘤的治疗

中药复方治疗骨肉瘤应遵循中医整体观念和辨证论治的特征,尤其在辨证论 治上采用同病异治、异病同治原则辨病选方和辨证选方。苏海涛等陶在肾气虚弱 型骨肉瘤患者,用加味六味地黄汤治疗骨肉瘤化疗患者,治疗后六味地黄试验组 和白介素・2对照组较单纯化疗空白组细胞CD3+和CD8+分子显著升高,但两组无 差异,而体液CD19和CD20中药组较白介素组有显著性差异,说明加味六味地 黄试验组刺激T淋巴细胞增强机体免疫。陈嬪等沮"对正气亏虚型骨肉瘤患者, 应用八珍汤联合化疗试验组较单纯化疗组患者Karnofsky积分和CD4+/CD8+下降 幅度明显减小,且使用升血小板和白细胞的药物用量也相应降低,在一定程度上 减缓骨髓抑制作用,患者生存和生活质量有较明显提升。俸道荣等阴对气滞血瘀 型骨肉瘤伴股性关节炎患者,用桃红四物汤联合高压氧治疗组总有效率较单药组 高,血清中肿瘤坏死因子和白介素・6显著下降,患者关节运动和疼痛也明显缓解, 可以改善生活质量。古建立等期对气滞痰凝型骨肉瘤患者,化岩胶囊治疗实验组 较对照组患者疼痛明显减少,生活质量有所提高,5年生存率明显提高。黄聪超 ㉚对癌邪蕴结型骨肉瘤患者,用止痛散治疗骨肉瘤转移癌性疼痛总有效率达 95%, ALT显著下降,临床疗效显著。

2•现代医学对骨肉瘤的研究

  1. 1现代医学对骨肉瘤流行病学的认识

OS来源于骨原始间充质细胞,其组织学特征为大量梭形肉瘤细胞直接形成 不成熟骨及类骨质样组织,好发于长骨干干師端,如胫骨近端、肱骨近端、股骨 远端为其好发部位,是最常见的高度原发性骨恶性肿瘤,在恶性骨肿瘤的比例约 为20%,又称成骨肉瘤据国内以及国外流行病学相关报道,OS在世界各地 发病率约为3-8/100万人,其中发病多倾向于亚洲人种⑸厲。男性OS发病率比女 性高,儿童青少年期男性OS发病率为5.4/100万人,女性为4/100万人,男女 OS发病率比例为1.35:1⑸品。骨肉瘤的发病率在年龄各阶段呈现出双峰性规律, 6・18岁儿童青少年期为第一个高峰,60岁以上老年期为第二个高峰,其中遗传 和环境对儿童青少年影响较大,而老年人发病则与Pagefs骨病关联密切齢541 o 在20世纪70年代以前骨肉瘤的主要治疗手段仅以考虑单纯性截肢手术,其5 年生存率仅仅15-20%[79],患者术后满意度较差。在新辅助化疗技术和外科保肢 手术结合运用于治疗骨肉瘤,OS患者的5年生存率提高到50-75%[10],但骨肉瘤 具有早转移、高复发、较差预后的特点,骨肉瘤患者5年生存率和肿瘤细胞转移 有密切联系,未发生转移的OS患者5年生存率可以维持在50-75%, 一旦有转 移发生的OS患者5年生存率降至20%[11_13]o

  1. 2现代医学对骨肉瘤病因和发病机制的认识
  2. 1现代医学对骨肉瘤病因的认识

骨肉瘤发病的病理生理机制现代医学尚未彻底清楚认识,起病原因复杂多 样,主要集中在外在的物理、化学、生物、环境和内在的基因、遗传、营养、免 疫、炎症等因素在非正常条件下导致正常组织出现异常增生生长而成骨肉瘤。大 部分骨肉瘤并非染色体变异导致,而是基因的散发突变引起的,如P53、Rb和 RECQL4等基因结构性变异悶,一些在发病前在环境因素下的物理损伤如放射线 也是危险因素岚,一些信号通路如Wnt和Notch信号通路与骨肉瘤的发生存在 关联⑸甌,目前研究较多的microRNAs和参与转录后基因调控非编码RNA也产 于骨 肉瘤的形成,如 miRNA-35 > miRNA-21 > miRNA-140 > miRNA-143 和 miRNA-215 等画。

  1. 2. 2现代医学对骨肉瘤发病机制的认识
  • 染色体异常:在缺失RecQue解螺旋基因的染色体遗传综合征如Bloom syndrome征导致DNA复制之前双螺旋的解开失败,导致恶性肿瘤的发生。骨肉 瘤最常见的基因突变的染色体有9、10、13、17号和同源染色体6q21、8q24、 12ql4扩增以及杂合子1的丢失齡60\
  • 原癌基因的失控:原癌基因属于转录因子中的一员,在DNA的翻译过 程中能促启动子与特定基因结合,这个过程非常保守,一旦失控将引起其他疾病 或肿瘤的发生,骨肉瘤发生也是如此,如由c-fos和c-jun基因编码的Fos和Jun 蛋白在骨肉瘤中的表达明显上调販。
  • 抑癌基因的失调:人体原癌基因的突变或DNA的损伤均可引起肿瘤的 发生,但存在抑癌基因控制很少导致肿瘤的发生。人体两个比较常见的抑癌基因 P53和Rb基因,Rb基因是细胞周期调控的关键基因,与E2F转录因子相结共同 对细胞周期的调控。P53抑癌是通过激活Bax和p21起作用。抑癌基因Rb和P53 的突变使其失去抑癌作用,肿瘤细胞不断增值失控,两者和骨肉瘤的发生存在明 显关联関。
  • 生长因子的紊乱:生长因子是OS细胞在旁分泌或者自体分泌产生并能 够发挥作用。生长因子如转化生长因子(TGF)、结缔组织生长因子(CTGF) 和胰岛素生长因子(IGF-I/II)的失调将引起骨肉瘤细胞的增殖,这些配体的紊 乱导致受体信号通路激活有明显相关联系盼陶。
  • WW域氧化还原酶失调:OS的发生与RUNX2、EZRIN和ERBB4有关, RUNX2、EZRIN和ERBB4属于WW域氧化还原酶,是多种蛋白偶配体,这些 蛋白的高表达均提示骨肉瘤患病的高风险。骨祖母细胞的生长均需要WW域氧 化还原酶和RUNX2的调节,而RUNX2表达OS中严重失调閔。
  • miRNAs的异常表达:OS的发生和miRNAs的表达改变密切联系,任 何mRNA都有与之相对应的miRNA,骨肉瘤的相关功能蛋白都能和原癌基因和 抑癌基因编码的mRNA相互作用,即使微小的表达改变都可能对细胞造成显著 影响,其改变miRNAs表达可能导致骨肉瘤的发生。目前大量的实验证实miRNA 参与了骨肉瘤的发生和发展,miRNA过度表达和低表达均可对骨肉瘤的发生起 作用。miRNA-23a、miRNA-543的表达在骨肉瘤组织显著增加,miRNA・143、 miRNA-34a、miRNA・145、miRNA-200b/c 是降低或者缺失⑹呦。
  1. 3现代医学对骨肉瘤的治疗

随着现在外科手术的进步、新辅助化疗理念的更新,术后放化疗治疗手段跟 进,以及快速康复理念的提出,传统的单纯性截肢手术已经逐渐被新的辅助药物 化疗联合现代保肢手术取代,其生存得到了提升,但近年来循证医学研究表明使 用过新辅助化疗联合保肢手术的患者5年生存率还是为70%左右,并未有显著改 变加,目前要提高骨肉瘤患者的疗效一方面还是要改进手术技术和进行新化疗药 物的开发,另一方面要深入研究骨肉瘤发病的机制和相关转移的细胞、分子和信 号传导机制,进而研发有效的基因治疗和靶向治疗方案。骨肉瘤的治疗策略有以 下几种:

  • 手术治疗:骨肉瘤手术治疗分为传统截肢手术和现代保肢手术,传统截 肢手术治疗的目的是切除病灶,提高生存率,而现代保肢手术不仅提高了生存率 而且还在功能和外观上保留患者外形的完整性。骨肉瘤手术理论上应彻底病灶全 切除,避免其转移扩散和复发,一切手术操作都是在正常组织视野中进行,保肢 手术的关键点是要充足的手术病灶切除范围,保肢手术较截肢手术也有其缺点病 灶处切除不彻底,有较多的手术后并发症,后续的维持医疗成本相应增加,同时 随着假体技术的发展两者之间的差距会越来越小九。
  • 化疗:骨肉瘤化疗分为术前和术后化疗,DDP、IFO、ADM和MTX堪 称四大经典化疗药物,这些药物相互联合应用于骨肉瘤的术前治疗和术后治疗, 但骨肉瘤的化疗副作用如骨髓抑制、肝肾功能损伤、神经毒性等不良反应也不能 忽视[72】。据COSS[73]和纪念斯隆■凯特琳癌症中心"4] (Memorial Sloan Kettering Cancer Center)的回顾性分析证实化疗的目的:①化疗期间争取充足时间进行手 术方案设计;②化疗使得肿瘤组织边界与正常组织清晰化,让外科手术视野清晰 和病灶分离更加容易进行;③让手术更好的进行,有效化疗将减低术后复发和其 转移率;④能够对手术后的标本进行坏死率何预后的评估。
  • 放疗:骨肉瘤的形成来源于间充质细胞的恶性病变,已经存在耐受性, 放射线其实也是一种危险因素对骨肉瘤的形成,由于放射增敏剂在对正常组织在 不产生伤害的前提下,可以提升肿瘤细胞对其放射性药物治疗的敏感性,使得放 射线能够有效对骨肉瘤细胞进行杀伤"5打放疗在无手术指征和手术禁忌症的情况 下缓解患者病情,减少骨肉瘤细胞的增殖丽,作为手术前、后的一种辅助姑息性 治疗手段"6
  • 新辅助术前、术后化疗联合切除肿瘤保肢手术标准化治疗:术前化疗和 术后化疗是新辅助化疗的特点,该标准化治疗能够将隐匿的全身肿瘤微小病变灶 消除,有利于对术后的指导治疗,同时术前可以缩小肿瘤水肿带,对肿瘤的坏死 率进行评估,术前化疗疗效也可以有效指导术后的化疗,降低骨肉瘤转移和复发 率,提升其保肢率“。新辅助化疗联合切除肿瘤保肢手术能够在降低肿瘤转移和 复发的同时实现有肢体关节功能"引。新的辅助药物术前、术后化疗联合切除肿瘤 保肢手术已经取代传统的单纯性截肢手术,目前已经在临床上推广,也得到广大 患者满意和认可,已经成为骨肉瘤治疗的标准化操作。
  • 免疫治疗:免疫治疗的目的是利用人体自身激发自身机体免疫反应来恢 复机体紊乱的免疫功能,从而抑制肿瘤生长,选择性的对肿瘤细胞进行杀伤网。 免疫治疗可分为被动免疫和主动免疫两大类治疗方式,被动免疫治疗有特异性免 疫如细胞毒T细胞等和非特异性免疫如自然杀伤细胞等两类,主动免疫也可以分 特异性主动免疫如肿瘤疫苗和非特异性主动免疫如细胞因子等两类販。OS的免 疫治疗已经成在手术治疗、放疗和化疗后第四种优选治疗方案网。
  • 基因治疗:基因治疗是主要针对恶性骨肉瘤的遗传学背景和发病机制的 分子生物学研究,通过导入外源带治疗目的基因到骨肉瘤细胞或者其他肿瘤细胞 中,来弥补和纠正缺陷基因来达到其治疗效果。基因治疗主要涉及到免疫、抑癌、 反义和自杀基因以及各种基因联合治疗的研究,如常见的抑癌基因有Rb、p53、 pl6和p21等,其p53的缺失或失活和骨肉瘤的发生、发展和耐药性有关,p53 表达增强可以使得骨肉瘤细胞的周期阻滞和其凋亡,同样也能降低遗传错误信息 的复制和恶变机率,Nakase[82]等在体外和动物实验研究中将p53基因导入到骨肉 瘤细胞可使其生长受到抑制,但其他学者研究提示对于p53的补偿疗法仅仅只是 适合某一种亚型的骨肉瘤,并非使用于所有骨肉瘤各亚型均有效圖。骨肉瘤的基 因治疗目的从分子机制的角度根治骨肉瘤的发生,而基因联合治疗不仅可以避免 治疗单基因的不足和其缺陷,而且配合其他骨肉瘤治疗方法产生联合协同作用提 高对骨肉瘤的治疗效果,但从目前研究情况来看在临床上推广还存在一定差距。
  • 分子靶向治疗:骨肉瘤的分子靶向治疗是针对骨肉瘤发病的发展阶段中 骨肉瘤细胞生长需要的特别目的分子,选用亲和力高选择性强的分子药物或者抗 体对其进行干预,从而阻止骨肉瘤细胞的生长,延缓骨肉瘤发展进程,达到治疗 骨肉瘤的作用,既能够提升骨肉瘤患者5年或10年总生存率,而且能治疗改善 患者生活质量。分子靶向主要涉及到关于环氧化酶抑制剂、IGF-1R、金属蛋白 抑制剂、VEGF通道因子、破骨细胞、端粒酶等研究。如端粒作为一种天然末端 存在于真核生物染色体上,随细胞分裂增殖而变短,然端粒酶能够有效抑制端粒 在细胞分裂过程中的短缩现象,端粒酶在骨肉瘤组织中处于高表达,在正常人中 却以一种低表达或不表达存在。其中Hu等两利用HSP90抑制因子alvespimycin, 能够有效提升端粒酶抑制因子imetalstat抑制骨肉瘤细胞中端粒酶活性,这也从 侧面说明为骨肉瘤的靶向疗法提供可能性。

3•“以毒攻毒”法治疗骨肉瘤的理论依据

中医的“以毒攻毒”治法最早源自于孙思邈的眼科著作《银海精微》,曰“…… 突起睛高,旋螺尖起,……将锋针针入三分,……为以毒攻毒”,“以毒攻毒”治 法的意思有狭义和广义之别,“以毒攻毒”的广义之意是指非常理的治疗方法和 手段以及非常规的用药和治法,针对于“毒”的病机如重笃迁延暴烈之病而施治。

“以毒攻毒”的狭义之意是指用猛烈或剧烈的药物如有毒的药物或烈性药治疗猛 烈的疾病。不论是狭义之意和广义之意的“以毒攻毒”都是最终是治疗重笃、迁 延、暴烈、猛烈之病,而当今的肿瘤也是如此,骨肉瘤也不再之外。骨肉瘤的病 因病机始终以本虚标实为其特点,以“内虚”为本,“癌毒”为实,肾虚气弱, 正气不足,阴阳失和,脏腑功能失稳,“癌毒”乘虚而入,气滞痰凝血瘀,蓄积 成块,结而成瘤,黏着难清,根深蒂固,“癌毒”深陷,非攻不克。《卫济宝书》 曰“……猛烈之疾以猛烈之药,……此所谓以毒攻毒也”。郭晓东等跖表明“癌 毒”和肿瘤特性同气相吻,“癌毒”更能够揭示其肿瘤内在实质,所以对于“癌 毒”的治疗才是治疗肿瘤的关键问题。近现代以来众多的实验基础研究及临床试 验都证实了 “以毒攻毒”治法理论的科学性。从众多的有毒中药中提取众多抗肿 瘤药物如藤黄酮、喜树碱、长春新碱等被用来对于对肿瘤的治疗,开始从治疗疾 病的机制和药物作用机理上来揭示“以毒攻毒”治法理论,在现代科学研究的各 种新技术和方法推广下中药提取物对肿瘤治疗的深入研究,是当前寻找新药抗肿 瘤的研究方向和热点。

4.顺钳在肿瘤治疗的研究

顺钳的首要抗肿瘤机制是在肿瘤细胞的DNA链间,能形成DDP-DNA复合 物去干扰其DNA的复制,进而能产生对肿瘤细胞增殖抑制作用,是一种非特异 性细胞周期高效广谱抗肿瘤药诙。DDP在各种恶性肿瘤的化疗和化疗联合用药 的治疗方案中运用达到70-80%26]o DDP在各种肿瘤的治疗如肺癌、肝癌、睾丸 癌、膀胱癌、阴茎癌、卵巢癌、乳腺癌和全身各部位等恶性低分化肿瘤具有肯定 的疗效,但因其使用剂量问题带来的不良反应如对肾、耳及神经毒性和其耐药性 等限制其在临床的推广帀昭。因DDP抗肿瘤的高效性及其广谱性,交叉耐药性 较小,与其他种类抗肿瘤联合应用有协同作用,通过降低DDP剂量为焦点的联 合用药研究成为骨肉瘤治疗的重点方向浙。

沈云飞等昭应用槐耳清膏联合DDP对肺癌A549细胞和耐DDP的A549实 验,联合组较实验组Bax的表达随槐耳清膏浓度的上升而上升,而Bcl-2. Survivinde的表达则下降,说明两者联合能够增强DDP诱导A549细胞的凋亡。 陈伟达等叫使用青藤碱联合DDP对纤维肉瘤HT-1080细胞进行干预,发现联合 组可以使肉瘤HT-1080细胞的凋亡明显增加,联合组Bax较单药组的表达增加, 而Bcl-2则降低。说明青藤碱能够增强DDP对其HT-1080细胞凋亡的诱导。

5.蟾毒灵在肿瘤治疗的研究

蟾毒灵是从中药蟾酥提取的蟾酥提取物中抗肿瘤作用力最强的當体类化合 物,蟾酥源于《本草衍义》,始载《药性赋》,有毒,味辛、苦,性温,归心经, 具有解毒、止痛、开窍和醒神等功效,历版国家官方药典均记载。BF属于细胞 的拓扑异构酶II抑制剂,可对增殖的肿瘤细胞产生抑制、阻止肿瘤细胞分裂和 促其凋亡作用⑶吨,对各种恶性肿瘤如胃癌、胰腺癌、肝癌、白血病、肺癌、肠 癌等有明显抗瘤和逆转药物耐受性的效果33-37]o

李静昭在使用BF对乳腺癌MDA-MB-231细胞干预发现,实验组浓度增加 较对照组活性氧增加,BaxmRNA表达增加,Bcl-2 mRNA表达的下降,从而诱 导其MDA-MB-231细胞凋亡。郑亦胡等昭用BF对胆总管癌QBC-939细胞实验 发现,实验组较对照组Caspase-3表达随BF浓度增加表达增加,QBC-939细胞 的凋亡也明显增多,而致其线粒体膜电位则下降,说明BF激活了线粒体凋亡通 路导致QBC-939细胞的凋亡。杨瑞琨等用BF对舌癌Tca8113细胞干预发现较 对照组而言,实验组随浓度增加,Bax、Caspase-3表达明显增加,而Bcl・2表达 则下降,说明BF能够促进Tca8113细胞凋亡。李静汕用BF对肺腺癌SPC-A-1 细胞实验,实验组相对于对照随浓度的增加对SPC-A-1细胞凋亡越明显,PCNA 基因的呈表达下降,说明BF可致SPC-A-1细胞凋亡。暴蕾他等用BF干预卵巢 癌SKOV-3细胞发现,实验组较对照组Bax、Caspase-3表达随浓度增加而增加, Bcl・2则降低,BF能促进SKOV-3细胞凋亡。

第二章实验研究

  1. 实验材料

1.1细胞株

本次实验采用的人骨肉瘤143B细胞是订购于上海中乔新舟生物科技有限公 司,源购于美国模式菌种收集中心 由三峡大学的张伟老师前期保存。

1 ■ 2试剂和材料

1.2. 1主要试剂

名称

蟾毒灵

顺钳

囈卩坐蓝(MTT)

二甲基亚枫(DMSO)

胎牛血清(FBS)

MEN培养基

PBS溶液

青-链霉素溶液

0.25%胰蛋白酶

Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒

BCA蛋白浓度测定试剂盒

RIPA裂解液

PMSF 液

蛋白酶抑制剂A液

蛋白酶抑制剂B液

牛血清白蛋白(BSA)

飞克特超敏ECL液

PVDF 膜

SDS-PAGE凝胶试剂盒

Prestained Protein Marker 美国 Thermo Fisher Scientific 公司
P-Actin Rabbit Antibody 美国 Cell Signaling Technology 公司
Caspase-3 Antibody 美国 Cell Signaling Technology 公司
Bax Rabbit Polyclonal Antibody 美国Proteintech公司
Bcl-2 Rabbit Polyclonal Antibody 美国 Sabta Cruz Technology 公司
Goat anti Rabbit IgG 美国Jackson公司
1.2.2器材和设备  
名称 生产厂家
二氧化碳细胞培养箱 日本SANYO公司
超净工作台 康路设备有限公司
纯水仪MILLI-Q 美国Milipore公司
XS205DU电子分析天平 上海托利有限公司
CKX31/41倒置显微镜 日本OLYMPUS公司
恒温水浴锅 长风仪表公司
台式禺心机 Eppendorf (中国)公司
移液枪 Eppendorf (中国)公司
全波长酶标仪 俄罗斯Thermo分公司
FM70制冰机 上海比朗仪器有限公司
・80。(2低温冰箱 日本SANYO公司
-20°C/4°C低温冰箱 海尔公司
水平摇床 江苏太仓器材厂
电泳槽 美国Bio Rad公司
电转膜仪 美国Bio Rad公司
化学发光成像分析仪 美国通用电气医疗集团
流式细胞仪 美国 Becton Dickinson 公司
LE-SH800SEP细胞分选仪 日本SONY公司
1.2.3主要实验试剂的配置  

BF的配置:称取BF白色结晶粉末865mg溶解在1ml DMSO中即浓度

为lOmmol母液备用,实验中用细胞培养基稀释到相应浓度,使得DMSO终浓 度在0.1%以下,在4。(2冰箱避光保存。

  1. DDP的配置:称取DDP棕黄色结晶粉末lmg溶解在lml DMSO中即浓 度为lmg/ml母液备用,实验中实验中用细胞培养基稀释到相应浓度,使得DMSO 终浓度在1%以下,在4。(2冰箱避光保存。
  2. 细胞培养基的配置:取P/S溶液500卩1、胎牛血清5ml加入到MEN培养 基45ml中,实验按此比例混合摇匀保存于4。(2冰箱。
  3. 细胞冻存液的配置:取MEN培养基、FBS、DMSO按7:2:1的比例混匀 配制,避光保存于4弋冰箱备用。
  4. MTT溶液的配置:称取lOOmgMTT粉末加入到20ml的PBS溶液中,均 匀搅拌后置于4。(2冰箱待充分溶解,用22|im滤膜在超净工作台过滤,灭菌分 装存放4。(2冰箱避光备用。
  5. 电泳缓冲液的配置:称取06gTris-base> 37.6gGly> 2gSDS放置于2L的 烧杯中,ddH2O定容到2L,搅拌溶解存放备用于4。(2冰箱。
  6. 转膜缓冲液的配置:称取06gTris-base> 28.8gGly放置于2L的烧杯中, ddH2O定容至1600ml,搅拌溶解存放4。(2冰箱,用前再加400ml甲醇混匀使用。
  7. TBST 缓冲液的配置:称取 84gTris-base> 17.6gNack lml Tween-20 放置 于2L的烧杯中,ddHzO溶解,PH值调至7.4, ddHzO定容到2L,搅拌混匀存放 4。(2冰箱。
  8. 5x凝胶上样缓冲液的配置:取25ml的1.0MTris・basePH6.8、0.5g SDS、 2.5ml丙三醇、0.025g漠酚蓝放置于15ml离心管中,ddHzO定容到5ml,摇混匀 分装lmlEP管,用前加50山卩■毓基乙醇摇匀,用时lx工作液稀释,存放4。(2冰 箱待用。
  9. 实验方法

2.1细胞复苏

(1) 复苏前开紫外灭菌超净工作台30min,加ddHzO入水浴锅温度调制于 37°Co

(2) 从・80弋冰箱取143B细胞冻存管,快速置于水浴锅解冻融化完全,转 移至超净工作台操作。

(3) 将有细胞的冻存液轻吹打3・4次,转移至加4ml细胞培养基的25cm2 细胞培养瓶,轻吹打3・4次使143B细胞摇混匀,置于调摄为37°C> 5%CO2、95% 湿度的细胞培养箱,等143B细胞贴壁稳定,一般12h后更换培养基。

  1. 2细胞培养传代
  • 传代前将75%酒精喷洒后的细胞培养基瓶、25%胰蛋白酶瓶、PBS 瓶置于超净工作台内,紫外灭菌超净工作台30mino
  • 镜下观察143B细胞生长和细胞形态,待细胞生长融合到80%-85%时, 吸出细胞培养瓶培养基,PBS冲洗2・4次,用含EDTA的胰酶lml消化细胞,待 细胞皱缩变圆,速取细胞培养基终止消化,吸入到15ml的离心管,置于调摄为 1000rmp> 5min离心机离心。
  • 取离心管,吸出143B细胞上层培养液,加入2ml细胞培养基重悬, 按照1:2的比例传于置有4ml细胞培养基的25cm2细胞培养瓶,至培养箱培养。
  1. 3细胞冻存
  • 冻存前将75%酒精喷洒后的细胞冻存液、25%胰蛋白酶、PBS瓶和 冻存管置于超净工作台内,紫外灭菌超净工作台30mino
  • 镜下观察143B细胞生长和形态,待143B细胞生长融合到80%-85% 时,吸出培养基,PBS冲洗2・4次,用含EDTA的胰酶lml消化细胞,待细胞皱 缩变圆,速取细胞培养基终止消化,吸入到15ml离心管,置于调摄为lOOOrmp、 5min离心机离心。
  • 取离心管吸出143B细胞上层培养液,加入5ml细胞冻存液重悬,计 数板行细胞计数后,装入2ml的冻存管,存放冻存管于冻存盒,装入・80。(2冰箱 保存备用。
  1. 4 MTT法检测143B细胞的增殖抑制率
  • 收集对数生长的143B细胞,细胞培养传代消化制备成2x104个/ml的 细胞悬液,以200(11/孔置于96孔板,将孔板置于培养箱继续培养12h,弃除细胞 培养基进行用药处理。
  • 将BF lOmmol母液用细胞培养基稀释到浓度到200nmol X作液,将 DDP lmg/ml母液用细胞培养基稀释到浓度到800ng/ml工作液,则DMSO浓度 远低于1%,按倍比稀释BF的用药浓度为:6.25, 12.5, 25, 50和1 OOnmol, DDP的用药浓度为:50, 100, 200和400 ng/m 1加入孔板,以未加细胞的细胞培 养基为空白对照组,加入细胞和最大剂量的0.1% DMSO细胞培养基为阴性对照 组,每组设置6个复孔,孔板在细胞培养箱进行24h、48h、72h培养。
  • 用药处理后取96孔板,依次加20山/孔MTT溶液,置于培养箱继续 培养4h,吸除上清,依次加DMSO 150(11/孔,置于摇床避光缓慢震荡15min,待 结晶溶解充分后,将孔板置于调设为490nni波长的酶标仪检测其OD值,公式: 细胞存活率二(OD药物组一OD空白组)/ (OD阴性组一OD空白组)xlOO%和细胞抑制率=1 —细胞存活率,计算单用BF和DDP各浓度对143B细胞抑制率,再分别求BF 和DDP的IC50值。

本实验采用金氏公式阴评价48h联合用药效果,通过取得BF IC50值和DDP IC50值,BF设置3个浓度组1/4IC50, 1/2IC50和心,DDP设置3个浓度组1/4 IC50,1/2 IC50和 IC5o,BF 和 DDP 联合用药 3 个浓度组(BF 1/4 ICso+DDP 1/4 IC50),

(BF 1/2 IC50+DDP I/2IC50)和(BF IC50+DDPIC50),行 MTT 检测求 OD 值,计 算143B细胞增殖抑制率,用金氏公式计算q值评价其联合效果,在进行后续实 验的分组。公式:q=lAB/(lA+IB-lAXlB), IAB代表两药联合细胞抑制率,【A、b分别 代表单药细胞抑制率,其中联合拮抗作用为qV0.85,相加作用为0.85-1.15,协 同作用为q>1.15。

  1. 5倒置显微镜观察143B细胞形态学

收集对数生长的143B细胞,细胞培养传代消化制备成6x104个/ml的细胞悬 液,以3ml/孔接种30于六孔板,设置空白对照组、BF组、DDP组、BF+DDP 组,以下所有实验空白对照组均是加入最大剂量的0.1%DMSO细胞培养基培养 细胞,待12h后143B细胞贴壁完全各药物组加药分别处理48h,在倒置显微镜 下观测各组143B细胞生长和形态改变。

  1. 6 Hoechst33258染色观察143B细胞凋亡形态变化

收集对数生长的143B细胞,细胞培养传代消化制备成6x104个/ml的细胞悬 液,以3ml/孔接种于六孔板,待12h后143B细胞贴壁完全分别加药BF组、DDP 组、BF+DDP组,并设置空白对照组,均处理48h后弃除培养基,加Hoechst 33258 染液充分覆盖细胞,再将六孔板放入培养箱培养30分钟,弃除染液,PBS洗涤 3-4次,置于带荧光功能显微镜下观察。

  1. 7细胞分选仪检测143B细胞凋亡
  • 收集对数生长的143B细胞,细胞培养传代消化制备成6x104个/ml的 细胞悬液,以3ml/孔接种于六孔板,待12h后143B细胞贴壁完全分别加药BF 组、DDP组、BF+DDP组,并设置空白对照组,培养箱培养48h。
  • 待培养48h后,吸取各孔培养基于对应15ml离心管,用PBS清洗各 孔,装入各离心管,胰酶消化各组,细胞培养基终止其消化,吸入离心管,2000rpm 离心5min,弃上清。

(3 )用1.5ml PBS清洗2次后lml PBS重悬,装入1.5ml对应EP管弃上清, 加 500ul Binding Buffer 入 EP 管,按检测分组依次加 5(il Annexin V-FITC 和 5(il PI 混匀,室温避光反应15min, 2000rpm离心5min,弃上清,加500pl PBS重悬, 2000rpm离心5min,弃除上清,加入500pl Binding Buffer重悬细胞装入各组流 式管待机检测。

  1. 8流式细胞仪检测143B细胞周期
  • 收集对数生长的143B细胞,细胞培养传代消化制备成6x104个/ml的 细胞悬液,以3ml/孔接种于六孔板,待12h后143B细胞贴壁完全分别加药BF 组、DDP组、BF+DDP组,并设置空白对照组,培养箱培养48h。
  • 待培养48h后,弃除各组上清液装入对应15ml离心管,用PBS洗涤 2・3次,回收入各组对应离心管,各组用胰酶消化,细胞培养基终止其消化,吹 匀转移至对应离心管,lOOOrmp离心5min,弃上清,PBS清洗一次,lOOOrmp 离心5min,再弃上清,用5ml含PBS的75%乙醇重悬细胞,置于4。(2冰箱固 定过夜。
  • 离心管中固定液lOOOrmp离心5min,弃用上清,用5ml的PBS重悬 后置于2ml EP管,lOOOrmp离心5min,弃上清,加500卩1含Rnase和TritonX-100 的混合液和PI液20(11, 37。(2水浴锅内避光30min,尼龙膜过滤至流式管上机检 测。
  1. 9 Western blot检测143B细胞相关凋亡蛋白表达
  2. 9. 1 143B细胞蛋白质的提取和定量
  • 蛋白质的提取:收集对数生长期143B细胞,细胞培养传代消化制备 成6x104个/ml的细胞悬液,以3ml/孔接种于六孔板,待12h后143B细胞贴壁 完全分别加药BF组、DDP组、BF+DDP组,并设置空白对照组,培养箱培养 48ho弃除孔板培养基,预冷PBS 2ml洗涤1・2次,在冰上按RIPA:PMSF:蛋白 酶抑制剂A:蛋白酶抑制剂B为500(il:5pil:5pil:5pil配置细胞裂解液,各100(11/孔各 组裂解细胞30min,将细胞刮刮取各组细胞形成黏稠液转至对应组5ml EP管, 在调设为4。。12000rmp的离心机离心15min,取蛋白上清装入对应1.5ml EP 管。
  • 蛋白质浓度测定:按BCA工作液A:B为1600(11:32(11混匀,取200(11/ 孔加到平行4支比色管中,同时取与实验组对应5ml EP管4支,分别加ddH2O 45山,再分别加各组蛋白上清5山混匀于ddH2O 45pil中,从每组0.5mlEP管各取 25卩1加入到两平行对应组比色管,将各组比色管置于37弋烤箱培养30min,再 到波长562nm的酶标仪中测OD值,根据蛋白上样量为50憾,用BCA标准曲线 求得每组上样体积后续实验。
  • 蛋白质的保存:取各组蛋白上清100(11分装到对应5ml EP管,各组 EP管加5x上样缓冲液25山混匀,EP管置于10(TC水浴锅煮沸lOmin,标记保存 于・20。(2冰箱。
  1. 9. 2 SDS-PAGE电泳和灰度值测量
  • 分离胶的配置
成分名称 12% 15%
ddH2O 2.45ml 2.7ml
30%Acr-Bis (29:1) 2.475ml 3.75ml
1.5MTri-Hcl(PH&8) 1.9ml 1.88ml
10%SDS 75(11 75(11
10%APS 75(11 75(11
TEMED 3 pl 5 pl
(2)浓缩胶的配置    
成分名称 5%  
ddH2O 2ml  
30%Acr-Bis (29:1) 0.5ml  
  • 制胶:清洗玻片将其晾干,垂直卡紧固定于制胶器上,移液枪轻缓地 注入分离胶于两玻片间,胶液面达短玻片3/4高度,用异丙醇压线封口,等分离 胶凝固,滤纸吸去异丙醇,移液枪轻快注入凝缩胶至短玻片板缘,插入梳子等浓 缩胶凝固,将其安装于电泳槽,倒入电泳液,拔梳准备上样。
  • 上样和电泳:根据标准曲线计算各组蛋白上样体积,移液枪将蛋白样 注入浓缩胶样槽孔内,边孔加入Marker 3)li1指示,浓缩胶内90v调摄恒压电泳 30min,分离胶内120v调摄恒压电泳90分钟,待达到凝胶底部停止电泳。
  • 转膜:准备滤纸、海绵和PVDF膜,滤纸、海绵在转膜液中浸泡30min, 根据Marker指示带切出目的蛋白的胶带置于转膜液中,剪切合适的PVDF膜在 甲醇中活化5mim用转膜夹按黑负极、海绵、4层滤纸、目的胶、PVDF膜、4 层滤纸、海绵、红正极组装,放于冰围转膜槽,倒入转膜液,恒流调摄200mA 转膜2ho
  • 封闭及抗体孵育:将转膜夹打开,取目的蛋白的PVDF膜,根据分子 量做标记,将蛋白朝上PVDF膜置于BSA封闭液中封闭2h。取出PVDF膜,用 TBST溶液缓慢洗膜3次,每次25min,将PVDF膜置于稀释一抗体液中孵育, Bax抗体浓度稀释为1:3000, Bcl・2抗体浓度稀释为1:1000, caspase-3抗体浓 度稀释为1:5000, P-actin抗体浓度稀释为1:5000,摇床4。(2过夜。取PVDF膜, 用TBST溶液缓慢洗膜3次,每次25min,将PVDF置于稀释二抗体液中孵育, 二抗浓度稀释为1:10000,室温摇床2h孵育。
  • ECL曝光:取PVDF膜,用TBST溶液缓慢洗膜3次,每次25min, 用滤纸吸干PVDF膜残余液体,在避光显影室用ECLA液和B液按800:800比 例混合,PVDF膜在混合液中浸湿,置于凝胶成像系统显影成像保存。
  • 灰度值定量:用Image J软件检测目的蛋白条带和P-actin内参的灰度 值,目的蛋白比内参蛋白,求目的蛋白相对表达量。

2.10统计学分析

本实验采用SPSS 22.0软件进行数据分析,各实验均独立重复3次,对数据 行正态分布检验采用One-Sample Kolmogorow-Smirnov Test,正态分布数据均采 用{士s,各组间差异采用One wayANOVA, FV0.05或FV0.01表示有统计学意 义,绘图软件采用GraphPad Prism &0。

  1. 实验结果
  2. 1 MTT法检测BF和DDP单用对骨肉瘤143B细胞增殖的影响

采用 MTT 法检测 BF 浓度(0, 6.25, 12.5, 25, 50,和 1 OOnmol)和 DDP 浓 度(0, 50, 100, 200和400 ng/ml)在24、48、72h下对骨肉瘤143B细胞进行 干预,如表2・1和图2・la所示,BF在24、48和72h的范围内对143B细胞可表 现明显的抑制性作用,随药物浓度越高143B细胞活力越低(FV0.01),且特别 在72h下浓各药物浓度对143B细胞的抑制较明显(FV0.01)。同时如表2・2和 图2・lb所示,DDP在24、48和72h的范围内对143B细胞可表现明显的抑制性 作用,随药物浓度越高143B细胞活力越低(FV0.05),且特别在72h下浓各药 物浓度对143B细胞的抑制较明显(FV0.01),通过SPSS软件分别计算出BF和 DDP在药物干预143B细胞48h后的IC50值为15nmol和150ng/mL由于本研究 侧重点在BF联合DDP干预骨肉瘤143B细胞的效果研究,所以后续研究均采用 药物干预48小时这个时间点进行实验。

表2-1蟾毒灵在24、48、72小时下不同浓度对骨肉瘤143B细胞活力的影响(x±s,n=3)

Table 2-1 Effects of different concentrations of bufalin on osteosarcoma 143B cells at 24, 48 and 72 hours ( x±s,n=3 )

蟾毒灵 24h (%) 48h (%) 72h (%)
Onmol 100±0.00 100±0.00 100±0.00
6.25nmol 70.31±5.43” 67.61±6.74八 60.84±6.36^
12.5nmol 58.91±4.83" 54.06±5.81" 40.29±8.09**
25nmol 31.85±6.38" 28.62±6.47" 20.47±7.07**
5 Onmol 21.76±7.89" 11.86±2.66" 4.48±2.37"
1 OOnmol 4.77±3.22" 1.19±0.70" 0.54±0.21**

注:与Onmol蟾毒灵组比较,"P<0.05, *3<0.01。

表2・2顺钳在24、48、72小时下不同浓度对骨肉瘤143E细胞活力的影响(x±s,n=3)

Table 2-2 Effects of different concentrations of cisplatin on osteosarcoma 143B cells at 24, 48 and

72 hours ( x±s,n=3 )
顺钳 24h (%) 48h (%) 72h (%)
Ong/ml 100±0.00 100±0.00 100±0.00
5 Ong/ml 94.95±9.73* 86.70±9.47* 79.24±6.92心
lOOng/ml 84.39±6.38* 73.44±6.24” 53.62± 8.19**
200ng/ml 59.15±3.14** 30.76±3.91" 18.21±6,17**
400ng/ml 35.76±4.71" 18.95±5.11** 1.25±0.65**

图b)各实验组与Ong/ml顺钳组比较,SV0.05,八FV0.01。注:与 Ong/ml 顺钳组比较,\PV0.05, ^FVO.Ol。

图2.1 MTT法检测不同浓度蟾毒灵和顺钳在24、48、72小时对骨肉瘤143E细胞的影响

Fig.2.1 Effects of different concentrations of bufalin and cisplatin on osteosarcoma 143B cells at

24, 48 and 72 hours by MTT

  1. 2 BF联合DDP对骨肉瘤143B细胞增殖的效果评价

采用金氏公式对BF和DDP联合干预143B细胞增殖效果进行评价,BF的 IC50值为15nmol, DDP的IC50值为150ng/ml,则BF设置3个浓度组分别为 3.75nmoK 7.5nmol 和 15nmol, DDP 设置 3 个浓度组 37.5ng/mk 75ng/m 1 和 150ng/ml, BF 和 DDP 联合用药 3 个浓度组为(3.75nmol+37.5ng/ml), (7.5nmol+ 75ng/ml)和(15nmol+150ng/ml),分别对骨肉瘤143B细胞干预48h后行MTT 实验,计算143B细胞各组浓度对143B细胞的增殖抑制率,采用金氏公式计算q 值评价联用效果。公式:q=lAB/(lA+lB-lAXlB), IAB代表两药联合细胞抑制率,IA、 Ie分别代表单药细胞抑制率,其中联合拮抗作用为qV0.85,相加作用为 0.85-1.15,协同作用为q>1.15。如表2・3所示,本研究药物干预48h后BF联合 DDP抑制浓度为(15nmol+150ng/ml)时q值为1.29, q值大于1.15,说明两者 此联合浓度对骨肉瘤143B细胞的抑制具有协同作用,所以后续实验的分组为空 白对照组、BF (15nmol)组、DDP (150ng/ml)组、BF+DDP (15nmol+150ng/ml) 组,各药物实验组和空白对照组均干预时间为48h。

表2・3蟾毒灵和顺钳联合作用143E细胞效果的金氏q值

Table 2-3 The Jin's q value of bufalin and cisplatin combined effect on 143B cells

BF DDP
37.5ng/ml 75ng/ml 150ng/ml
3.75nmol 0.53+
7.5 nmol 0.87++
15nmol 1.29+++

注:+示:拮抗作用」+示:相加作用;+示:协同作用。

  1. 3倒置显微镜观测各组对骨肉瘤143B的细胞形态学影响

在空白对照组和BF组、DDP组、BF+DDP组用药物处理48h后,使用倒置 显微镜(lOOx)观测对照组、BF组、DDP组和BF+DDP组143B细胞生长状况, 如图2・2所示,对照组143B细胞增殖速度快,生长旺盛,细胞贴壁和生长密集 程度较好。BF组和DDP组单药组较对照组143B细胞密度均降低,细胞开始变 形皱缩,细胞贴壁不良,漂浮细胞数明显增加。BF+DDP组和BF组、DDP组相 比较,细胞数明显减少,细胞间距明显拉大,细胞皱缩变圆,贴壁情况极差,可 见大量漂浮细胞聚堆。

4 Hoechst33258染色观察骨肉瘤143B细胞凋亡形态学的影响

在空白对照组和BF组、DDP组和BF+DDP组用药物处理48h后,使用 Hoechst33258染色后经荧光倒置显微镜(100x)观测对照组、BF组、DDP组和 BF+DDP组,如图2・3所示,对照组143B细胞细胞形态正常,视野中均可见微 弱均匀的淡蓝色荧光,而BF组和DDP组单药组较对照组而言,两组分别都可 以见到少量143B细胞稍强的散在致密浓染,细胞数目也有减少。BF+DDP组较 单药组,细胞数目明显减少,细胞呈斑块或呈碎块状致密浓染的细胞核明显增加, 细胞透亮且部分细胞出现核碎裂、固缩的典型性凋亡形态改变。

a)对照组 b) BF组

  1. c) DDP 组 d)BF+DDP 组

图2-3 Hoechst33258荧光染色法检测BF和DDP单用及联合对143B细胞凋亡形态学的影响 (lOOx)

Fig.2-3 Effect of BF, DDP or BF+DDP groups on the apoptotic morphological changes of 143
cells by Hoechst 33258 staining assay (100x)

  1. 5细胞分选仪检测各组骨肉瘤143B细胞凋亡率

为进一步证明各组细胞的死亡与凋亡存在关联,在空白对照组和BF组、DDP 组和BF+DDP组用药物处理48h后,继续用Annexin V-FITC/PI染色处理后,使 用细胞分选仪检测对照组、BF组、DDP组和BF+DDP组细胞凋亡率,如表2・4 和图2・4所示,对照组的143B细胞的凋亡率为(17.80±2.38) %,和对照组相比 BF组143B细胞凋亡率为(43.35±4.27) %,差异具有统计学意义(PV0.01), 和对照组相比DDP组143B细胞凋亡率为(43.51±3.10) %,差异具有统计学意 义(FV0.01), BF+DDP 组 143B 细胞凋亡率为(62.75±4.26) %较 BF 组和 DDP 组差异有统计学意义(FV0.01),说明蟾毒灵联合顺钳能显著诱导143B细胞的 凋亡。

表2・4蟾毒灵和顺钳组以及联合组对骨肉瘤143E细胞凋亡率的影响(x±s,n=3)

Table 2-4 Effect of bufalin,cisplatin and bufalin combined with cisplatin groups on apoptosis rate of osteosarcoma 143B cells ( x±s,n=3 )

组别 活细胞(%) 凋亡细胞(%)
空白对照组 81.61 + 2.91 17.80 + 2.38
EF组 55.33 + 4.19** 43.35 + 4.27**
DDP组 55.10 + 3.63** 43.51±3.10**
BF+DDP 组 34.42±4.76“# # 62.75 ± 4.26 F #

注:与对照组比较,><0.05, *><0.01;与单药组比较,#FV0.05, ##FV0.01。

图2-4细胞分选仪检测BF, DDP和BF+DDP组对骨肉瘤143B细胞凋亡率的影响

Fig.2-4 Effect of BF, DDP and BF+DDP groups on apoptotic rate of osteosarcoma 143B cells by
cell sorter

  1. 6流式细胞仪检测各组骨肉瘤143B细胞的细胞周期

在空白对照组和BF组、DDP组和BF+DDP组用药物处理48h后,使用PI 染色后经流式细胞仪检测对照组、BF组、DDP组和BF+DDP组,如表2・5和图 2・5所示,较对照组而言,BF组和DDP组的143B细胞均阻滞在S、G2期,BF 组主要以阻滞S、G2期为主,S期细胞阻滞由(31.94±5.77) %增加到了 (35.64±4.24) %, G2期细胞阻滞由(8.17±1.37) %增加到了(16.49±3.21) %, 差异均有统计学意义(FV0.05),而DDP组则以阻滞在S、G2期为主,差异均 具有统计学意义(PV0.01), S期细胞阻滞由(31.94±5.77) %增加到了 (43.03±5.07)%,G2期细胞阻滞由(8.17±1.37)%增加到(22.89±2.94)%, BF+DDP 组143B细胞也主要阻滞于S、G2期,S期细胞阻滞由(31.94±5.77) %增加到了

(47.23±4.44) %, G?期细胞阻滞由(8.17±1.37) %增加到(23.49±4.15) %,差 异均具有统计学意义(FV0.01),表明BF和DDP联合使用作用于143B细胞, BF+DDP组对细胞的周期阻滞主要是以DDP占据主导位置。

表2・5蟾毒灵和顺钳组以及联合组对骨肉瘤143E细胞周期的影响(x±s,n=3)

Table 2-5 Effect of bufalin,cisplatin and bufalin combined with cisplatin groups on cell cycle of osteosarcoma 143B cells ( x±s,n=3 )

组别 细胞周期
Gi 期(%) S 期(%) G2 期(%)
空白对照组 59.89 + 6.93 31.94 + 5.77 8.17+1.37
EF组 47.87 + 4.02** 35.64 + 4.24* 16.49±3.2 广
DDP组 34.08 + 7.66** 43.03 + 5.07** 22.89 + 2.94**
BF+DDP 组 29.27 + 0.98** 47.23 ±4.44" 23.49 + 4.15**
注:与对照组比较, SV0.05, “FV0.01。    

图2・5流式细胞仪检测EF, DDP和BF+DDP组对骨肉瘤143E细胞周期的影响
注:与对照组比较,><0.05, *><0.01 o

Fig.2-5 Effect of BF, DDP and BF+DDP groups on cell cycle of osteosarcoma 143B cells by flow
cytometry

  1. 7 Western blot检测各组骨肉瘤143B细胞的蛋白表达

细胞发生凋亡不仅仅是特征性的形态学发生改变,在分子蛋白水平上也会有 明显的特征性表达,为了从分子蛋白水平上验证本研究BF和DDP单用和联合 作用于骨肉瘤143细胞的凋亡,本研究采用分子蛋白技术Western blot来进一步 检测标志性经典蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3 □如表2-6和图2-6a和b所示,较 对照组而言,BF组、DDP组和BF+DDP组Bax的表达均增加,其中BF组Bax 的表达显著升高(FV0.01), DDP组Bax的表达也显著升高(FV0.01), DDP 在促进骨肉143B细胞Bax蛋白表达较BF升高强,但BF+DDP联合组提升Bax 的表达效果优于BF和DDP各单药组(FV0.01)。如表2・6和图2・6a和c所示, 与对照组相比BF组、DDP组和BF+DDP组Bcl・2的表达均减少(FV0.01),其 中BF组Bcl-2的表达显著降低(PV0.01),而DDP组Bcl-2的表达也有所降低 (FV0.01),但DDP在促进骨肉143B细胞Bcl-2的表达较BF弱,同时BF+DDP 联合组在降低Bcl・2的表达比BF组和DDP组强(PV0.01)。如表2・6和图2・6a 和d所示,和对照组比较BF组、DDP组和BF+DDP组Caspase-3的表达均显著 增加(P<0.01),BF虽能升高Caspase-3的表达,但与DDP组比依旧较弱,BF+DDP 联合组较BF、DDP各单药组均高(PV0.01)。

表2・6蟾毒灵和顺钳组以及联合组对骨肉瘤143E细胞凋亡蛋白Bax, Bcl-2和Caspase・3表
达的响的影响(x±s,n=3)

Table 2-6 Effect of bufalin,cisplatin and bufalin combined with cisplatin groups on the expression
of apoptosis proteins Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in osteosarcoma 143B cells ( x±s,n=3 )

组别 Bax Bcl-2 Caspase-3
空白对照组 0.35±0.07 0.82±0.01 0.60±0.05
BF组 0.62±0.06"* 0.59±0.04" 0.85±0.06**
DDP组 0.71±0.03** 0.64±0.05" 1.03±0.06**
BF+DDP 组 0.93±0.02**## 0.43±0.02“# # 1.24±0.04"##

注:与对照组比较,P<0.05, *><0.01;与单药组比较,#FV0.05, ##FV0.01。

注:与对照组比较,><0.05, *><0.01;与单药组比较,#FV0.05, ##FV0.01。

图 2-6 Western blot 检测 BF, DDP 和 BF+DDP 组对骨肉瘤 143B 细胞 Bax, Bcl-2 和 Caspase-3
蛋白表达的影响

Fig.2-6 Effects of BF, DDP and BF+DDP groups on the protein expression of Bax, Bcl-2 and
Caspase-3 in osteosarcoma 143B cells by Western blot

  1. 讨论

金代医家张子和在《儒门事亲》中指出:“……夫病之一物,非人素有,…… 自外而入, 自内而生,皆为邪气也, 速攻之可也, 速去之可也。”骨 肉瘤的病因病机始终以本虚标实为其特点,以“内虚”为本,“癌毒”为实,肾 虚气弱,正气不足,阴阳失和,脏腑功能失稳,“癌毒”乘虚而入,气滞痰凝血 瘀,蓄积成块,结而成瘤,黏着难清,根深蒂固,“癌毒”深陷,非攻不克。《卫 济宝书》曰“……猛烈之疾以猛烈之药,……此所谓以毒攻毒也”。郭晓东等阴 表明“癌毒”和肿瘤特性同气相吻,“癌毒”更能够揭示其肿瘤内在实质,所以 对于“癌毒”的治疗才是治疗肿瘤的关键问题。《医权初编》曰:“……攻邪必以 毒药,……脏气之偏者为病,……药气之偏者为毒,……以毒制毒,……但使归 于中正。”

BF是从有毒中药蟾酥中提取的抗肿瘤作用最强的化合物,BF属于细胞的拓 扑异构酶II抑制剂,可抑制增殖的肿瘤细胞、阻止肿瘤细胞分裂和促其凋亡作 用,对各种恶性肿瘤如胃癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、白血病、肠癌等有明显抗瘤 和逆转药物耐受性的效果3°-37]o DDP也是一种有毒副作用如其肾毒性、耳毒性、 神经毒性和耐药性等的化疗药物,但在临床上对肿瘤的应用广泛,非但未丢弃而 是以一种非特异性细胞周期广谱性高效抗肿瘤药,其抗肿瘤机制是在肿瘤细胞的 DNA链间,形成DDP-DNA复合物干扰其DNA的复制,进而能产生肿瘤细胞的 增殖抑制作用[25 27]oDDP在各种恶性肿瘤的化疗和化疗联合用药的治疗方案中运 用达到70-80%, DDP在各种肿瘤的治疗如肺癌、肝癌、睾丸癌、膀胱癌、阴茎 癌、卵巢癌、乳腺癌和全身各部位等恶性低分化肿瘤具有肯定的疗效27;28]o因 DDP抗肿瘤的高效性及其广谱性,交叉耐药性较小,与其他种类抗肿瘤联合应 用有协同作用,通过DDP为焦点的联合用药研究成为肿瘤治疗的重点方向旳。 闰顺朝盟等使用BF和DDP联合作用乳腺癌MCF-7细胞发现Src和Met的活化 受到抑制,PARP的表达明显上升,通过逆转DDP的耐药性,增加对DDP的敏 感性协同促进MCF-7细胞的凋亡。王晶晶阴等应用BF和DDP在低氧环境下对 食管癌ECA109细胞研究发现,联合组较单药组的Bcl・2表达明显下降,Bax蛋 白明显增加,同时逆转DDP的耐药性,增加ECA109细胞对抗肿瘤药物DDP的 敏感性从使而细胞活力明显得到抑制促进其凋亡。所以在理论上BF联合DDP 促进143B细胞的凋亡是可行的,其联合用药“以毒攻毒”治疗骨肉瘤理论上也 是可行的。

抗肿瘤药物的研究作用于肿瘤细胞,最为关键的是使其肿瘤细胞发生凋亡, 这也是目前抗肿瘤药物治疗肿瘤的作用机制之一。本研究分别单独使用不同浓度 BF和DDP作用于骨肉瘤143B细胞24、48和72h,经MTT法检测可知,BF和 DDP分别对骨肉瘤143B细胞的抑制和促进其凋亡呈时间和浓度依赖性,时间作 用越长143B细胞凋亡越明显,浓度作用越高143B细胞凋亡越多,BF对143B 细胞IC50值为15nmol, DDP对143B细胞的IC50值为150ng/ml, BF和DDP均 有对骨肉瘤143B细胞抑制增殖和促进其凋亡的作用。因实验主要考察BF和DDP 两者的联合作用抑制骨肉瘤143B细胞,故分别单用BF和DDP的l/4IC5o> l/2IC5o 和IC50值,和两两联合作用于143B细胞,采用金氏公式评价联用效果发现,在 48h干预后BF和DDP联合(15nmol+150ng/ml)时q值为1.29大于1.15,说明 此浓度BF和DDP联合有协同作用,后续实验分组为空白对照组、BF (15nmol) 组、DDP (150ng/ml)组和 BF+DDP (15nmol+150ng/ml)联合组。在药物干预 48h进行实验发现,BF和DDP单药组较对照组而言,显微镜下可见143B细胞 明显得到抑制,其联合组较单药组对抑制143B细胞更为明显。Hoechst 33258荧 光染色和细胞分选仪分别对各组染色和凋亡率的检测相互印证表明,BF+DDP联 合组较各单药组对143B细胞的凋亡率更显著。同时流式细胞仪对各组细胞周期 的检测也表明,较各单药组而言,联合组对143B细胞S和G2期的阻滞更明显。 这说明体外BF和DDP联合作用于骨肉瘤143B细胞促进其凋亡是作为骨肉瘤治 疗的重要机制。

细胞凋亡是机体细胞在面对来自人体各种各样的生理和病理信号产生的应 答反应,通过内在基因控制来维持人体内环境的稳定,调控细胞自主有序性的死 亡,来保证正常细胞数量和其质量,以及维持人体正常发育和生理功能隔。细胞 凋亡可以依据Caspase是否参与,可分为依赖Caspase的凋亡途径和非依赖 Caspase的凋亡途径两大类,依赖Caspase的凋亡途径可分为死亡受体、线粒体 和内质网介导三类,而非依赖Caspase的凋亡途径则包括类凋亡、自体吞噬、有 丝分裂和程序样、凋亡样坏死等。其中外源性死亡受体介导和内源性线粒体介导 的细胞凋亡途径是两个研究较多而较为清楚的细胞凋亡机制,而内质网介导的凋 亡途径目前研究机制尚未明确时刚。Bcl-2和Bax是线粒体凋亡途径中两个重要 成员,其中Bax有促进细胞凋亡的作用,而Bcl・2则为抑制细胞凋亡,对于肿瘤 细胞而言,Bcl・2则为其增殖的“保护伞” [100]o而Caspase-3是外源性死亡受体 和内源性线粒体介导有“凋亡执行者”之称的节点,Caspase-3的激活将会引起 肿瘤细胞不可逆的级联反应性凋亡口曲。本研究发现,与对照组比较而言,BF和 DDP单药组Bcl・2表达减少,Bax表达则增加,Caspase-3的表达也增加,从而 抑制143B细胞的增殖,促使143B细胞的凋亡,而联合组较单药组,促凋亡蛋 白Bax、Caspase-3增加和抑制凋亡蛋白Bcl-2减少更显著。

综上所述,本研究单用BF和DDP以及联合用药对骨肉瘤143B细胞生长进 行了抑制和促进其凋亡,初探是通过调控Bax、Bcl・2和Caspase-3蛋白的表达引 起,其作用可能是与激活了线粒体凋亡途径中Bax/Bcl-2和Caspase-3通路来实 现的。因Caspase-3作为多条凋亡信号通路的交汇节点,可能还有其他凋亡途径 参与其中,所以对于骨肉瘤143B细胞的凋亡研究又提供下一步方向。

结论和展望

  1. 蟾毒灵与顺钳均可抑制骨肉瘤143B细胞增殖,呈时间-浓度依赖性,两 者具有协同作用,联合效果更明显。
  2. 蟾毒灵与顺钳可导致骨肉瘤143B细胞细胞形体学和细胞凋亡形态学的改 变,联合组效果更明显。
  3. 蟾毒灵与顺钳均可使骨肉瘤143B细胞的细胞凋亡率增加,联合组高于单 药组,而细胞周期在S期、G2期阻滞,联合组效果更明显。
  4. 蟾毒灵协同顺钳诱导骨肉瘤143B细胞凋亡,可能通过Bax, Caspase-3 $ 白上调表达,下调Bcl-2蛋白的表达有关。

本研究只是在细胞水平上初步探讨蟾毒灵联合顺钳对骨肉瘤143B细胞凋亡 可能与线粒体介导的凋亡途径有关系,其具体机制尚未彻底阐明清楚,Caspase-3 作为多个凋亡途径的汇聚节点,其激动可能也受到其他凋亡途径的刺激和参与, 在日后的研究中可以从外源性死亡受体和内质网受体介导的凋亡途径进一步阐 明和研究,为蟾毒灵联合顺钳在临床上治疗骨肉瘤推广使用提供更多的实验理论 依据。

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致谢

本课题从开始选题、开题、中期考核、实验实施到论文最后撰写,其各阶段 都凝聚我的导师王嘉军教授和三峡大学刘朝奇教授的耐心指导!此论文完成之 时,谨先向第一导师王嘉军教授、第二导师杨朝晖教授、刘朝奇教授和袁林教授 致以诚挚的敬意和衷心感谢!同时非常感谢在三峡大学做实验期间师母张伟老师 对我的照顾和实验启蒙!导师王嘉军教授严谨的治学态度、广博的学识、精益求 精的敬业精神,是我临床和科研前进路上学习的楷模和指引明灯!

感谢硕士毕业课题开题专家组向阳教授、袁德培教授、何本鸿教授、黄德斌 教授、黄琼教授的指导和思路建议!感谢湖北民族大学各老师以及医学部学生建 设科田春漫老师、樊莎莎老师、涂星老师、黄胜老师对我在读研期间的培养与帮 助!感谢湖北民族大学研究生处各老师和同学对我的帮助!感谢班长王文晟和兰 秀同学对班级无私的奉献和对我帮助!感谢我的同门师弟刘强和李占鹰以及同门 师妹解燕晨的对我的关心和帮助!

感谢湖北民族大学及其附属民大医院风湿病重点实验室和三峡大学肿瘤微 环境与免疫治疗湖北省重点实验室的各老师及同学对我的帮助和照顾!感谢师妹 郝润璇和师弟宋雪成在民大医院风湿病实验室做实验那段陪伴的日子里的关心 和帮助!

感谢湖南省邵阳市中心医院罗参香主任医师和骨科病区的各老师以及湖北 民族大学附属民大医院骨科病区各位老师对我在临床上的指导和帮助!

感谢本论文涉及到的各位学者和专家,感谢你们前期的研究!

感谢我的父亲张先生、母亲龙女士和弟弟以及那个她对我的关心、照顾和理 解!

在此对各位能在百忙之中评阅本论文的各位专家和教授以及论文答辩委员 会的各位专家和教授,致以诚挚的感谢!