载有光热/光动力纳米颗粒的间充质干细胞治疗黑色素转移瘤论文

2020年10月13日11:30:16载有光热/光动力纳米颗粒的间充质干细胞治疗黑色素转移瘤论文已关闭评论

载有光热/光动力纳米颗粒的间充质干细胞治疗黑色素转移瘤论文

摘要

体内循环的快速清除及瘤体渗透弱是靶向药物递送系统的两大挑战,因此 通过减少药物与血液成分和网状内皮系统(RES)的相互作用来延长体内循环 时间和增加药物在靶部位的累积是获得良好药物体内动力学的常用策略。间充 质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)是一种能主动向肿瘤细胞归巢、低免 疫原性、体外易于培养和扩增的成体干细胞,可作为药物或其颗粒的仿生递送 载体,用于肿瘤靶向治疗。光动力疗法(PDT)和光热疗法(PTT)具有创伤 小、毒副作用小、可反复使用,无多药耐药性的特点,是近年来选择性治疗恶 性病变的新方法。在本文中,我们制备了结合有二氢吓吩e6 (Ce6)的聚多巴 胺(PDA)纳米颗粒,分别作为光敏单元和光热转化单元,通过细胞内吞作用 将纳米颗粒负载到MSC中,构建载有聚多巴胺纳米光敏剂的生物靶向系统 (MSC-PDA-Ce6)。MSC表面受体受肿瘤微环境中分泌的一些炎症趋化因子或 细胞因子吸引,使MSC-PDA-Ce6向肿瘤细胞归巢,最后迁移并渗透到肿瘤深 处。在该过程中,MSC通过胞吐作用释放药物颗粒,实现颗粒在细胞间的传递 及在肿瘤组织内的广泛分布,受局部光线激发后,PDT/PTT颗粒可发挥光动力 和光热效应,杀灭肿瘤细胞,并同时实现MSC的自我清除。

我们采用溶液氧化法制备了 PDA纳米颗粒,利用酰胺键连接PDA和Ce6o 通过紫外和荧光扫谱,证明Ce6成功结合在PDA表面。透射电镜观察到PDA- Ce6形态圆整、分布均匀,得到PDA-Ce6的粒径为161.2 + 3.2nm, Zeta电位为- 35.3+0.5 mV, Ce6的载药量和包封率分别为36.28 + 4.79 %和62.0 ±5.20 %。 通过体外释放实验发现在pH 4.0-7.4范围内酰胺键稳定,体外升温及ROS产率 实验表明PDA-Ce6具备良好的光热转换能力和光动力性能。

MSC和PDA共孵育4 h后,CLSM观察到PDA-Ce6可被MSC成功摄取并 广泛分布在胞浆中,通过扫描电镜和共定位实验,证明颗粒分布在MSC的溶酶 体中。为了对PDA-Ce6细胞膜吸附情况进行定量考察,我们使用台盼蓝和胰酶 法测得约10%颗粒分布在细胞膜上,近90%分布在胞质中。MTT实验结果表明 PDA- Ce6对MSC的暗毒性较低,同时PDT /PTT联合组的光毒性最大,IC50约 为 0.247 + 0.004 pig/mL,显著低于 PDT 和 PTT 单独组(0.618 + 0.004 pig/mL 和 0.763 + 0.016 pig/mL)o使用Transwell系统证明了 MSC在髙浓度载药情况下

(0.5-10 |ig/mL),仍能保持良好的体外迁移能力。为考察MSC-PDA-Ce6释药 情况,我们对载药MSC的细胞上清培养液(CM)和细胞裂解液中Ce6的存在 形式进行了分析,发现药物以PDA-Ce6完整颗粒形式被MSC外排。胞吐动力 学曲线显示,随培养时间延长,MSC细胞内Ce6水平降低,其培养液中Ce6含 量增加。72h药物累计释放率约60%,胞内有颗粒的残留。

为评价MSC-PDA-Ce6的体外抗肿瘤效果,我们采用流式细胞仪检测肿瘤 细胞的存活率。结果表明PDT/PTT联合治疗组比PDT或PTT单一治疗组的细 胞存活率低,0.1 pig/mL的药物可造成75%肿瘤细胞死亡。通过用MTT法评价 共培养体系下总细胞的生存情况,发现细胞的光毒性有一定的剂量依赖性,在 共培养系统中髙负载量的MSC-PDA-Ce6在进行单次的PDT处理后能诱导B16- F10细胞的死亡,PDT/PTT联合处理的效果更显著,约80%的MSC和肿瘤细胞 都可以被杀灭。在体外抗肿瘤治疗过程中,用CLSM进一步探讨了颗粒的细胞 间传递过程,并在3D肿瘤体中追踪到了 MSC携载颗粒向肿瘤球渗透现象。

最后,我们在小鼠黑色素瘤肺转移的模型中评价了 MSC-PDA-Ce6的体内 分布及其抗肿瘤效果。尾静脉输注MSC-PDA-Ce6系统24 h后肿瘤区的Ce6红 色荧光强度达到峰值。在抗肿瘤实验中,MSC组与对照组之间无显著差异,说 明MSC对肿瘤生长无治愈或促进作用。三次静脉注射MSC-PDA-Ce6与三次光 治疗后,与PDT或PTT的单一治疗相比,PDT/PTT联合治疗组可显著抑制肿瘤 生长,黑色转移结节数量和肺重显著减少,小鼠存活时间明显延长。

综上所述,MSC肿瘤靶向递送PDT/PTT颗粒能发挥显著的体内外抗黑色素 转移瘤效果。

关键词:间充质干细胞,二氢吓吩e6,聚多巴胺,光动力治疗,光热治疗, 靶向治疗

Abstract

Fast clearance from the systemic circulation and poor penetrating avascular tumor tissues are two big challenges for targeted drug delivery systems. Prolonged blood circulation and effective penetration are achieved by reducing the interactions with blood components and the reticuloendothelial system (RES) and enhancement of tumor accumulation. Mesenchymal stem cell (MSC) is a stromal cell that can actively homing to tumor cells and has low immunogenicity. It also has the advantages of easy culture and expansion in vitro. MSC could be a potential biomimetic drug delivery vehicle for tumor-targeted therapy. Photodynamic therapy (PDT) and photothermal therapy (PTT), which are non-invasive, less toxic and side effects, no multidrug resistance, are new methods for selective treatment of malignant lesions in recent years. In this paper, polydopamine conjugated with chlorin e6 (PDA-Ce6) nanoparticle as photoactive units and photothermal conversion units was prepared. The nanoparticles were loaded into MSC by endocytosis to construct the biological tumor-targeting system (MSC-PDA- Ce6). Due to the receptors on the surface of MSC, MSC-PDA-Ce6 would be attracted by the chemokines or cytokines secreted in the tumor microenvironment and finally migrate and penetrate the depth of the tumor. In this process, nanoparticles released via exocytosis of MSC can transfer between cells and widespread distribution in tumor tissues. After being stimulated by local light, PDT/PTT nanoparticles can exert photodynamic and photothermal effects to kill tumor cells and realize the self-clearing of MSC. MSCs have inherent homing/targeting capacity.

PDA nanoparticles were synthesized by the solution oxidation method, and Ce6 was conjugated by forming an amide bond between PDA and Ce6. It was confirmed that Ce6 successfully bound to the surface of PDA by ultraviolet and fluorescence scanning. TEM showed that PDA-Ce6 was round and uniformly distributed. The particle size of PDA-Ce6 is 161.2 + 3.2nm, Zeta potential is -35.3 + 0.5mV, and the drug loading and encapsulation efficiency of Ce6 was 36.28 + 4.79% and 62.0 + 5.20%, respectively. The amide bond between PDA-Ce6 was stable in pH 4.0 - 7.4. The temperature and ROS generation were monitored to demonstrate that PDA-Ce6 maintained excellent photothermal conversion effect and photodynamic performance.

After incubating MSC and PDA for 4 hours, PDA-Ce6 can be successfully taken up by MSC and widely distributed in the cytoplasm. SEM and co-localization experiments proved that the nanoparticles were distributed in MSC lysosomes. Trypanblue and trypsin methods were applied to determine the membrane-associated particles, and about 10% were on the cell membrane and nearly 90% were in the cytoplasm. MTT test results showed that PDA-Ce6 had low dark toxicity to MSC. At the same time, the toxicity of the PDT/PTT combination therapy was the maximum, with an IC50 value about 0.247 士 0.004 (Lig/rnL, which was significantly lower than that of the PDT and PTT single laser irradiation (0.618 士 0.004 yg/mL and 0.763 ± 0.016 yg/mL). Then it was proved that MSC can still maintain migration ability in vitro with different drug loading (0.5-10 pg/mL). In order to investigate the release of MSC-PDA-Ce6, we analyzed the form of Ce6 in the cell culture medium (CM) and cell lysate of the drug- loaded MSC, and found that the drug was in the form of PDA-Ce6 particles. The exocytosis kinetic curve was plotted. The results showed that as the culture time prolonged, the level of Ce6 in the MSC cells decreased, and the content of Ce6 in the culture medium increased. The cumulative release rate of the drug after 3 days was about 60%. There were still particles in the cell.

To evaluate the anti-tumor effect of MSC-PDA-Ce6 in vitro, we used flow cytometry to detect the survival rate of tumor cells. The results showed that the survival rate of the cancer cells receiving the combinatory PDT/PTT was significantly reduced compared with those single PDT or PTT. Even at a low drug loading (0.1 pg/mL), MSC- PDA-Ce6 caused 75% tumor cell death. Subsequently, we evaluated the survival of total cells in the co-culture system by using the MTT method. The photocytotoxicity was dose-dependent. In the co-culture system, high-loading MSC-PDA-Ce6 subjected to a single PDT treatment can induce the death of B16-F10 cells. The effect of combined PDT/PTT treatment is more significant, about 80% of MSC and tumor cells can be killed. The cell-to-cell delivery process of the drug was further explored. The particle- to-cell transfer phenomenon was observed in CLSM, and the penetration of MSC-PDA- Ce6 into the tumor sphere was tracked in the 3D tumor spheroids.

Finally, we evaluated the in vivo distribution of MSC-PDA-Ce6 and its antitumor effect in a mouse model of melanoma lung metastasis. The Ce6 fluorescence signal in the tumor area reached the maximum 24 hours after the tail vein infusion of the MSC- PDA-Ce6 system. In antitumor experiments, after three intravenous injections and three PDT/PTT treatments, compared with the single treatment of PDT or PTT, PDA-Ce6 (PDT + PTT) combined significantly inhibited tumor growth, significantly reduced the number of black metastatic nodules and lung weight, significantly prolonged thesurvival time of mice, and there was no significant difference between MSC and control group. MSC did not affect tumor growth.

In summary, targeted delivery of PDT/PTT particles by MSC tumors can exert significant anti-tumor effects in vivo and in vitro.

Keywords: mesenchymal stem cell, Ce6, polydopamine, photodynamic therapy, photothermal therapy, tumor tropism

缩略词表
DA 多巴胺
PDA 聚多巴胺
Ce6 二氢吓吩e6
EDCHC1 1-( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
NHS N-龛基琥珀酰亚胺
ROS 活性氧物质
DPBF 1, 3-二苯基异苯并咲喃
PDT 光动力治疗
PTT 光热治疗
DLS 动态光散射仪
TEM 透射电镜
SEM 扫描电镜
CLSM 激光共聚焦显微镜
HPLC 髙效液相色谱
FBS 胎牛血清
MTT 3-(4,5-二甲基嗟坐-2)-2,5-二苯基四氮坐澳盐
B16-F10 小鼠黑色素瘤细胞
MSC 间充质干细胞
MSC-PDA-Ce6 间充质干细胞负载的聚多巴胺二氢吓吩e6纳米颗粒
PI 碘化丙噪
IC50 半数抑制率
CM 细胞培养上清液

图表清单(页码)

图1.1 PDA-Ce6的合成路线

图1.2 PDA-Ce6的粒径与电位表征

图1.3 PDA-Ce6的紫外与荧光吸收表征

图1.4 PDA-Ce6的体外累积释放曲线

图1.5 PDA-Ce6的光动力性能表征

图1.6PDA-Ce6的光热性能表征

图2.1 MSC-PDA-Ce6的摄取情况

图2.2 MSC胞内溶酶体与PDA-Ce6共定位

图2.2 PDA-Ce6的MSC膜吸附情况

图2.3 PDA-Ce6对MSC的毒性

图2.4 MSC-PDA-Ce6体外迁移能力

图2.5 MSC-PDA-Ce6的释药情况

图2.6药物释放形式的研究

图2.7 MSC外排动力学曲线

图3.1流式检测共培养细胞凋亡情况

图3.2 MSC-PDA-Ce6体外杀伤B16-F10情况

图3.3 PDA-Ce6在MSC和B16-F10之间的传递

图3.4 MSC-PDA-Ce6在肿瘤体中的渗透

图4.1 MSC-PDA-Ce6体内治疗方案

图4.2 MSC-PDA-Ce6肺内分布情况

图4.3 MSC- PDA-Ce6的体内抗肿瘤效果

表1.1反应液介质对PDA粒径的影响

表1.2 DA浓度对PDA粒径的影响

表1.3 PDA-Ce6的粒径和电位

引言

尽管医学技术进步和新的药物发现,癌症死亡率仍然在上升,2018年研究 统计表明,全球范围内约1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例〔"I。转移 性癌是90%人类癌症死亡的主要原因,它是原发性肿瘤细胞扩散到远处组织器 官中而形成新的病灶,由于其复杂的生理环境而几乎无法治愈。在许多不同类 型的原发性肿瘤的转移性疾病患者中,肺转移瘤非常常见,如乳腺癌、肝癌、 黑色素瘤、甲状腺癌、结肠癌、胃癌等都可以向肺部转移34】。目前,手术联合 放、化疗治疗早期肺转移瘤已经属于是一种相对成熟的方式,但手术创伤大, 放、化疗法对人体其它正常器官也具有广泛的急性和长期毒副作用,所以新兴 了一些治疗手段如靶向、基因、免疫和细胞治疗等。而从事药剂学的工作者们, 通过对脂质体、纳米粒、脂质体、胶束、微球、纳米囊等纳米载体的靶向修饰 ⑸,构建肿瘤靶向递送系统,实现对肿瘤细胞的靶向递送。但是随着研究的深 入,靶向给药系统的挑战也越来越大,因为很多靶向递送载体在进入血液之后, 仍然需要克服许多生理环境的复杂性,包括网状内皮系统(RES)在内的各种 生理屏障的消除。所以会面临靶向效率不高、无法有效渗透肿瘤血管组织以及 瘤区药物释放不足、靶点药物浓度不髙等问题⑹。因此,通过减少与血液成分 和机体网状内皮系统的相互作用,来延长药物在血液中的停留时间,提髙靶向 效率及在靶组织中的累积,是实现有效的血管外渗和发挥良好药代动力学的有 用手段⑺,例如将纳米颗粒聚乙二醇化以避免免疫识别⑻,使用红细胞膜修饰以 增加血液保留时间⑼。而且已经研究了通过降低粒径〔I。】、改变颗粒形状[I】】和调 节两亲性纳米颗粒亲水亲脂平衡性质[12]的方法来最大程度降低体内循环的清除 作用,增强肿瘤靶向效率从而提髙药物到达靶细胞的浓度。但是这些靶向系统 往往只针对解决单一环节的生理屏障,对克服多环节的屏障有限。近年来,基 于细胞的药物递送系统受到越来越多的关注[⑶,因为它可以同时克服以上的生 理屏障,增强药物在肿瘤细胞中的递送和释放。

红细胞、血小板、干细胞和免疫细胞是最常用的细胞载体。其中间充质干 细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)是干细胞家族的重要成员,属于多能干细 胞,有很强大的分化潜力和自我更新能力,可以很容易地从多种结缔组织中分 离出来,包括骨骼,脂肪,软骨和肌肉,由于其易于分离和培养、具有多分化 潜能、免疫抑制、抗炎等效应,在细胞治疗/再生医学、免疫治疗等方面有广泛 的应用[⑷。MSC表面抗原多样性,免疫原性低。研究者们发现肿瘤组织通过自 分泌或旁分泌等方式产生的一系列炎症趋化因子g⑹和细胞因子可充当MSC 表面受体的配体,趋化MSC主动靶向归巢,黏附到肿瘤新生血管的内皮细胞上 并促进跨内皮细胞的输送,然后在间质中迁移并与肿瘤细胞直接相互作用阴⑼, 这使MSC成为一种有前途的生物肿瘤-靶向给药载体[20,2i]。

过去的几年里,MSC负载化学药物或药物颗粒在肿瘤靶向递送中广泛应用 [⑷。由于化学药物普遍存在非选择性细胞毒性,可能会损害载体细胞的生物学 功能,如MSC的肿瘤归巢能力。所以如何降低药物对MSC毒性及促进肿瘤部 位的MSC释放药物成为十分关键的问题。对此许多研究者尝试了共同培养MSC 与药物颗粒以包封纳米粒子[224],或者将载药颗粒锚定在细胞表面da],虽然 可以减少毒性药物分子直接暴露在MSC中的副作用,但是释放的药物还是会不 可避免影响MSC的生物活性从而妨碍肿瘤靶向效率。因此,为了克服小分子药 物对MSC的毒性作用,我们受到“刺激响应式药物递送系统讶既念的启发,打算 寻找一种对MSC毒性小,直到它们被递送到肿瘤后,在特定的刺激下,才发挥 毒性作用杀害靶细胞,所以光敏剂(PS)是一个较好的选择。

光动力疗法(PDT)是上个世纪才发展起来的,一种被用来治疗癌症和其 它疾病的治疗方法,已经成功被FDA批准用于临床肿瘤和其他恶性疾病的治疗, 与以往的疗法相比,其侵袭性较小、无长期的副作用,是一种更具有优势的非 侵入性治疗方式0,28]。目前已经有研究将光敏剂掺入MSC中以治疗骨肉瘤[29]和 乳腺肿瘤[迥。在光动力疗法(PDT)中,光敏剂(PS)在特定波长下的近红外 光线照射后,它通过转移光子的能量以产生活性氧物质(ROS), ROS可直接导 致肿瘤细胞内核酸和蛋白的损伤并间接损害肿瘤微血管⑶],从而导致细胞凋亡 或者坏死,而未被激光照射的其它组织部位几乎不受影响,这大大降低了对人 体正常组织器官的毒副作用卩現

但是PDT肿瘤抑制作用不强,通常会采用联合治疗的方式来增强抗肿瘤活 性,包括与光热、化疗、声疗等方式联合治疗[33'36]o其中光热治疗法(PTT) 是近几年发展较快的一种可以用来治疗肿瘤的技术,其治疗原理是指采用近红 外(NIR)激光照射光吸收剂产生热疗以消除肿瘤,与PDT相似,没有明显的 暗毒性和激光刺激毒性。PTT常用的热转换材料,如金属有机材料金纳米壳、 金纳米棒等研究较多,但有机物材料的研究较少,聚多巴胺(PDA)是几年来 受到大家关注的有机材料,PDA是一种黑色素合成类似物,具有与黑色素类似 的光学特征⑶],如拥有很高的近红外吸光能力,可以吸收光能将其转化为热量 以产生高温并随后破坏肿瘤细胞。除此之外,它由人体内天然存在的多巴胺自 氧化聚合形成,具有良好的生物相容性、可降解性、亲水性以及低毒性[涸。 PDT/PTT的联合作用会更加彻底的杀死肿瘤细胞,使得其可以在靶向区域发挥 最大的作用,大大提髙治疗效果。

因此,本文立足于MSC介导的PDT/PTT靶向递送系统,制备了一种可生 物降解的聚多巴胺(PDA)与二氢吓吩e6(Ce6)化学结合的纳米颗粒(PDA- Ce6),分别发挥光热和光动力学功能。然后选用骨髓来源的MSC内化包载 PDA-Ce6,构建MSC-PDA-Ce6系统,以小鼠黑色素瘤肺转移作为动物模型,尾 静脉注射MSC-PDA-Ce6之后,其大量聚集在肺部并进一步趋向肿瘤细胞,通 过MSC的胞吐作用,将其所负载的PDA-Ce6有效地递送到肿瘤细胞中。最后 在近红外光的照射后,PDA-Ce6释放高热和活性氧物质(ROS)杀伤肿瘤细胞 和MSC,实现PDT/PTT联合治疗黑色素肺转移瘤的效果。所构建的MSC-PDA- Ce6系统具以下两个独特的优点:(1)对细胞的毒性可按需被触发从而能很好 地保留MSC的肿瘤归巢能力(2)载体细胞MSC可被残余的药物颗粒杀灭,从 而避免了 MSC的潜在风险。

第一章PDA-Ce6的制备、表征及性质考察

纳米材料的快速发展促进了对多种多功能纳米载体的研究。受海洋贻贝仿 生学的启发,聚多巴胺(PDA)这种具有独特物理化学性质的新型聚合物被广 泛应用[刑。通过单体多巴胺(DA)在碱性溶液中氧化自发聚合,可人工合成 PDA纳米颗粒,具有良好的生物相容性和生物可降解性,长期保留在体内也不 会引起毒性,物理及化学性质稳定,被广泛的用作于药物的肿瘤靶向递送载体; 而且PDA具有强近红外(NIR)吸收和髙的光热转换效率(约40%),可作为 一种良好的光热治疗剂厲1,此外PDA表面的基团如氨基易于修饰可拥有更多功 能,为癌症的治疗提供了有效的途径。

二氢吓吩e6 (Ce6)是一种吓咻衍生物,具有活性氧物质(ROS)产量髙、 半衰期长、光敏副作用小的优点,是FDA批准使用的光敏剂(PS)o本章制备 了 PDA-Ce6纳米颗粒,用以进行光热与光动力联合治疗。我们先通过优化处方 得到粒径较小的PDA,再利用PDA表面氨基与Ce6分子结构中的竣基形成酰胺 键的方式来实现PS的负载,得到PDA-Ce6o随后使用髙效液相色谱法(HPLC) 来确定Ce6的载药量和包封率,采用动态光散射仪(DLS)分析仪和透射电子 显微镜对PDA-Ce6的粒径、电位和形态等进行表征,并采用紫外分光光度仪、 荧光分光光度仪等对PDA-Ce6进行性质表征,最后采用荧光探针测定ROS和体 外升温实验进一步考察PDA-Ce6的光动力与光热能力。

11仪器和材料

1.1.1仪器

仪器 型号 厂家
万分之一天平 AL204 梅特勒一托利多,瑞士
酸度计 pHS-3C 上海伟业仪器公司
恒温磁力搅拌器 HJ-3 常州国字仪器制造有限公司
低温髙速离心机 Microfoge22R 美国贝克曼公司
冷冻干燥机 ALPHA 2-4 LSC 德国Christ公司
动态光散射仪(DLS) ZEN3690 英国Malvern公司
透射电子显微镜(TEM) EM-2010HT 日本JEOL公司
激光器 808、 670nm 吉林长春新技术有限公司
C18色谱柱 Diamonsil 北京迪马公司
数控超声波清洗器 KQ-700DB 昆山市超声仪器有限公司
髙效液相色谱仪 1260 德国Agilent公司
紫外可见光分光光度计 UV-2450 日本岛津公司
荧光分光光度计 RF-5301PC 日本岛津公司
1.1.2材料
材料 规格 来源
三餐甲基氨基甲烷(Tris) AR Sigma-Aldrich
氢氧化钠 AR 国药集团有限公司
浓氨水(28%-30%) AR Sigma-Aldrich
盐酸多巴胺 AR Sigma-Aldrich
Ce6 AR 百灵威科技有限公司
NHS AR Sigma-Aldrich
EDC-HC1 AR Sigma-Aldrich
DPBF AR Sigma-Aldrich
其它试剂 AR

12实验方法

1.2.1 PDA的制备及粒径优化

采用溶液氧化法制备PDA[40]o量取一定体积的去离子水和NaOH溶液(1 M)加入到50 mL的圆底烧瓶中,50 °C水浴下磁力搅拌10 min,再加入一定浓 度的DA溶液,继续强烈搅拌反应5 h,得到PDA溶液,低温髙速(4 °C, 18,000 rmp, 15 min)离心收集,用动态光散射仪(DLS)测定粒径和Zeta电位。

为考察不同碱性缓冲体系体系对PDA粒径的影响,分别选取NaOH溶液、 Tris缓冲盐、氨水溶液作为反应液介质,按照上述溶液氧化法制备PDA,用 DLS测定粒径和Zeta电位。

为考察不同多巴胺浓度对PDA粒径的影响。选取1.0、1.5、2.0、3.0mg/mL 的DA浓度按照上述溶液氧化法制备PDA,用DLS测定粒径和Zeta电位。

  • PDA-Ce6 的制备

采用化学法合成PDA-Ce6[41]o分别称量lmgCe6、12 mg NHS. 24 mg EDC,用1 mLDMSO溶解,磁力搅拌活化4 h后,加入1 mL 1 mg/mL的PDA 溶液,于4匸摇床下反应24h后,低温高速离心(4°C, 18,000rmp, 15 min), 分别用少量乙醇和去离子水洗涤数次,直至上清液澄清,得到PDA-Ce6溶液, 洗涤液用于载药量与包封率的测定。

  • Ce6载药量和包封率的测定

用无水乙醇配置一系列梯度浓度的Ce6标准溶液(1-10 |ig/niL),按照下 述HPLC条件跑]测定Ce6标准曲线:色谱柱:C18色谱柱(Diamonsil 250 x 4.6 mm, 5(im);流动相:乙睛:水(含0.1%辛烷磺酸钠、0.2%三乙胺)二50 : 50

(v/v);进样量:20吐;流速:1 mL/min;柱温:35 °C,紫外检测波长:400 nmo将“12 2”中收集到的洗涤液,用10 mL容量瓶定容,取1 mL按上述 HPLC条件分析药物浓度。按照以下(1)和(2)公式进行Ce6载药量和包封率 的计算:投入Ce6量
包封率-投入C:量-游严6量X100% ⑵

  • PDA-Ce6 的表征

将制备得到的PDA-Ce6用DLS测定粒径和Zeta电位;再用铜网捞取少许,

晾干后于透射电子显微镜(TEM)下观察PDA-Ce6的大小和形态。

将lmg/mLPDA, Ce6, PDA-Ce6分别用去离子水稀释至一定浓度,用紫 外-可见分光光度计在波长360-900 nm范围内扫谱。

将lmg/mLPDA, Ce6, PDA-Ce6分别用去离子水稀释至一定浓度,于荧 光波长 Ex = 403 nm, Em = 600-740 nm,进行扫谱。

将PDA-Ce6纳米溶液稀释为70 pig/mL,取1 mL于3500 Mw的透析袋中,

置于装有15mLPBS缓冲液(pH二7.4)的离心管中,以相同浓度体积下的标准

Ce6乙醇溶液作为对照,避光状态下,置于37 °C恒温摇床中,分别于0.5、1、

2、4、8、12、24、36、48、72h后,吸取ImL释放液,并补充同体积介质液, 用HPLC测定累积释放量,绘制累计释放曲线。同时考察了 PDA-Ce6在pH为 4.0、5.5、6.0、7.4的PBS缓冲溶液中的释放情况。

1.2.5 PDA-Ce6的光学性能考察

体外PDT性能评价[⑻:用体外ROS的产率来评价PDA-Ce6的光动力性能。 称取5.4 mg DPBF溶于ImL的DMS O溶液中,稀释配制得到20 (imoVL的DPBF 溶液,备用;用DMSO配制相同浓度的PDA-Ce6和Ce6溶液;将一定量的PDA- Ce6 (10(iM, PBS)与DPBF (10(1M, DMSO)混合。然后将混合物溶液分别 用激光(670 mn, 50 mW/cm2)照射 0、5、10、15、20、25 和 30mino 最后, 通过荧光分光光度计在Ex = 403 nm, Em = 403-700 nm范围内进行扫谱,在Ex 二403nm, Em二660测定DPBF的荧光强度。

体外PTT性能评价:先配置含PDA浓度为0,3mg/mLPDA-Ce6溶液,考察 激光波长808nm,不同能量功率2.0、2.5、3.0、3.5 W/cm2下的升温情况;再分 别稀释配制0.1、0.2、0.4、0.5mg/mLPDA-Ce6溶液作为实验组,去离子水作为 空白对照组,相同波长下于能量功率为3 W/cm2的激光照射,每隔30 s用热电 偶探针测定温度,绘制不同浓度的PDA-Ce6纳米颗粒随光照时间变化的温度曲 线,以此来评估PDA-Ce6的光热转换能力。

1.3结果与讨论

1.3.1 PDA的制备及处方优化

PDA可以通过三种常用的的方法合成:溶液氧化法、酶促氧化法和电聚合 方法,其中溶液氧化法是最广泛使用的方法,该法自聚合过程简单,无需任何 苛刻的反应条件或复杂的仪器,即在氧气存在的情况下将DA盐酸盐溶解在弱 碱性溶液中则可以开始自聚反应形成PDAo尽管一些研究人员已经研究过PDA 的结构与其性质之间的关系,但溶液氧化法制备PDA中涉及的过程和机制仍然 不明确。目前致力于理解PDA的合成,已经报道了许多假设,一般大家所认可 的是PDA在聚合中涉及的分子机制可分为氧化阶段和聚合阶段两个部分,即在 碱性体系和好氧条件下,DA单体被氧化成DA-醍,然后通过1,4-迈克尔型进行 分子间环化转变为5,6二餐基呷噪中间体,最后经历进一步的氧化和重排以聚合 成髙分子化合物,类似于体内黑色素的合成原理归44]。而PDA的粒径高度依赖 于影响DA自发氧化速率常数的参数,根据报道,DA氧化动力学模型表明,氧 气从DA的一个餐基的去质子化形式中获取氢原子是决定速率的步骤,随后的 闭环反应比较快,因此影响DA聚合的因素有许多:反应pH、温度、氧气浓度、 反应时间等。

小粒径的颗粒容易被细胞摄取和运输,也是可注射纳米制剂比较合适的尺 寸范围。因此本文中以粒径为指标,主要考察了不同反应液介质和DA浓度对 PDA粒径的影响,以此来优化PDA的粒径。实验结果表明不同反应液介质对 PDA粒径的影响比较大(表1.1),用NaOH溶液作为反应液介质时,粒径较 小,DLS测得粒径约为lOOrnn,可能是因为使用的DA是HC1盐,一旦注入 NaOH或者氨水,则快速的使微酸性的DA酸盐溶液变为碱性,并中和盐酸形成 游离的多巴胺化合物[Q,从而促进PDA的形成,而Tris本身是一种盐酸盐缓冲 体系,可以温和的调节反应体系中的pH,所以相较之下,促进形成的速率会慢 一些,得到的粒径大一些。

表1.1反应液介质对PDA粒径的影响

Reaction medium Size (nm) Polydispersity index (PDI)
Tris 236.0+2.7 0.06+0.03
NH3H2O 180.0+8.2 0.05+0.04
NaOH 100.7+0.9 0.09+0.01

DA作为形成聚合物的单体物质,其浓度必定会影响PDA的尺寸,根据实 验结果表明,随着DA浓度的增大,PDA的粒径也在增大,如表1.2所示,DA 浓度为1 mg/mL粒径为58.9 + 1.5 nm,而由于上述机制中PDA的形成是一个氧 化聚合过程,最后所制得颗粒的大小髙度依赖于其自发氧化速率,当底物浓度 即DA浓度越大时,反应速率也会加快,从而局部引起DA物质的聚集加快,导 致PDA粒径变大。因此,在本文中选择NaOH溶液作为反应液介质,以及DA 浓度为1 mg/mL时来合成PDAo 表1.2 DA浓度对PDA粒径的影响

DA concentration (mg/mL) Size (nm) Polydispersity index (PDI)
1.0 58.9 + 1.5 0.21+0.05
1.5 86.7 + 0.8 0.16 + 0.02
2.0 137.8 + 1.5 0.18 + 0.01
3.0 200.5 + 4.0 0.19 + 0.01

1.3.2 PDA-Ce6的合成及表征

二氢吓吩e6是一种大型杂环化合物,其环外有游离的竣基存在,所以对光

敏剂的负载。具体合成路线如(图1.1):

图1.1 PDA-Ce6的合成路线

如表1.3中所示,PDA和PDA-Ce6的粒径分别为59.8 + 2.1 nm和161.2 +

  • nm,从透射电镜的结果中观察到(图2A-B) , PDA结合Ce6后,PDA-

Ce6的粒径显著变大,但形状仍旧保持圆整,图1.2C中可以看到两者粒径分布 皆为单峰,说明颗粒均一性良好。测定PDA的Zeta电位如图1.2D中所示为-

27.3 ±0.3 mV,而PDA-Ce6表面的负电位变大为-35.3 + 0.1 mV,这是因为Ce6

游离竣基上的氢离子失去之后,会带上更多的负电荷。

表1.3 PDA-Ce6的粒径和电位

NPs Size (nm) Zeta Potential (mV) Polydispersity index (PDI)
PDA 59.8 + 2.1 -27.3 + 0.3 0.15+0.01
PDA-Ce6 161.2 + 3.2 -35.3+0.1 0.18 + 0.02

图1.2PDA-Ce6的粒径与电位表征:(A-B) PDA和PDA-Ce6的TEM图(Scale bar 二 100 nm) (C) PDA 和 PDA-Ce6 的粒径分布图(D) PDA 和 PDA-Ce6 的 电位分布图
根据紫外-可见扫谱曲线和荧光扫谱曲线,在图1.3A-B种我们可以看到 PDA没有紫外特征吸收峰和荧光吸收值,而PDA-Ce6拥有了 Ce6在波长400nm 和660 nm处的特征吸收峰,并且在60 nm的发射波长下存在与Ce6样的荧光吸 收值(图1.3B),说明Ce6已经被负载在PDA,成功制备得到PDA-Ce6o

图1.3 PDA-Ce6的紫外与荧光吸收表征:(A) PDA、Ce6及PDA-Ce6的紫外-

可见扫谱曲线(B) PDA、Ce6及PDA-Ce6的荧光扫谱曲线

随后,我们采用HPLC测定了 Ce6载药量和包封率,其标准曲线为A二 154.46C+ 10.642 (R2 = 0.9993),在1-10(ig/mL浓度范围内呈良好的线性关系。 参照公式(1)和(2)测得PDA-Ce6的载药量和包封率分别为36.28 + 4.79 % 和 62.0 ±5.20 % o

为确定PDA-Ce6在体内生理条件下的存在形式,我们采用含0.1%Tween80 的PBS缓冲液作为释放介质,表面活性剂有助于提髙Ce6的溶解度,达到漏槽 条件,如图1.4所示在pH二7.4时,Ce6溶液组释放速度很快,12 h基本释放完 全,后期达到释放平衡。而PDA-Ce6组没有Ce6的释放。随后我们通过不同pH 条件下的体外释放实验来检测是否有游离Ce6的释放,根据不同时间后的取样 用HPLC分析,发现在不同pH条件下的释放液并不存在HLPC吸收峰,表明 PDA-Ce6之间的酰胺键在pH二4.0-7.4范围内几乎都是稳定存在的。

图1.4 PDA-Ce6的体外累积释放曲线

ROS产量是评价光敏剂PDT效果的重要指标。Ce6作为第三代光敏剂,其 ROS产量髙,是实现髙效治疗的最关键所在,而在通过上述的一些表征后,我 们证明了 Ce6成功负载到PDA上,如其保持着与Ce6几乎一致的荧光强度,所 以为了考察PDA-Ce6的PDT效果,在体外对PDA-Ce6进行了 ROS的产率测试。 DPBF是一种检测ROS的敏感荧光探针,其可以结合在磷脂上快速被氧化为邻 二苯甲酰苯而发出荧光,当其被加入产ROS的体系中,该荧光会慢慢淬灭,这 种荧光强度的降低与ROS的产量成正比。根据图1.5A的结果,可以看到DPBF

5 min的荧光强度随着光照时间逐渐减弱,尤其在400-500 nm范围内的荧光值急剧下 降,说明670 nm的激光照射可以触发PDA-Ce6快速产生ROS,而为进一步确 认ROS是由PDA-Ce6颗粒上的Ce6产生的,我们将同浓度的PDA-Ce6颗粒与 游离Ce6在波长670 nm的激光下进行照射,将两者在PBS中ROS的产生进行 了比较,结果如图1.5B所示,发现两者的荧光强度几乎一致,表明本文中制备 的PDA-Ce6颗粒可以产生大量的ROS且与游离Ce6的产率相当,因此可以预估 PDA-Ce6会拥有良好的PDT效果。

图1.5 PDA-Ce6的光动力性能表征:(A) PDA-Ce6在不同时间下,于670 nm (50mW/cm2)激光照射后DPBF的荧光光谱(B)在670 nm (50mW/cm2)激 光照射后,PDA-Ce6与游离Ce6的荧光强度

以上实验表明PDA-Ce6保留着良好的光动力性能,因此我们继续在体外对 PDA-Ce6的光热转换能力进行了评估,从图1.5B中可以看出,在808 nm激光 照射下,对照组去离子水组的温度略有变化,而PDA-Ce6组的温度逐渐升髙并 随着浓度的增大进一步升高,以3 W/cm2的功率强度持续照射900 s,低浓度0.1 mg/mL的PDA-Ce6温度可升髙至42.5 °C,这足以由于髙热杀死肿瘤细胞(通常 42-45°C) [46]O同时由图1.5A的结果,表明随着激光照射功率的增大,PDA-Ce6 的升温能力也增强。所以此次结果充分表明PDA-Ce6具有良好的光热转化能力。

1.4小结
图1.5 PDA-Ce6的光热性能表征:(A) 0.4 mg/mL的颗粒在不同光照强度下的 升温曲线(B)激光条件为808 nm, 3 W/cm2的光照强度下,不同浓度的颗粒升 温情况

  • 当使用氢氧化钠溶液作为碱性反应体系,DA的浓度为1 mg/mL时, 制备得到的PDA颗粒大小均一,形态圆整,粒径约为8 +2.1 nmo
  • 采用化学法合成的PDA-Ce6纳米颗粒的粒径为12 + 3.2 nm,电位 为-35.3 ± 0.1mVoCe6的载药量和包封率分别为36.28%+ 4.79%和62.0+ 5.20%。 PDA-Ce6具备Ce6的特异性紫外吸收峰及荧光光谱,在体外pH4.0-7.4条件下, 酰胺键稳定存在。

(3 ) PDA-Ce6拥有良好的ROS产生能力及光热转换效能。

第二章MSC-PDA-Ce6系统的构建及性质考察

MSC靶向系统中如何实现髙剂量药物负载、保持载体的生物学活性和有效 的药物释放是非常重要的。通常MSC负载药物的方式有两种,一种是将药物通 过共培养的方式被MSC内化;另一种是将药物通过物理或者化学作用吸附或修 饰到MSC表面。后者对细胞活性影响较小,但药物修饰过程复杂、负载量小, 且药物在传递过程中容易脱落,造成药物的损失,降低靶向效率[26,47]。相较之 下,细胞内化的方式可以通过简单的共孵育方式,实现较髙的药物负载量,能 有效地避免在运输过程中药物的被动泄露。髙负载的MSC在到达肿瘤部位之前, 是否还能保持体外迁移活力,主动靶向到肿瘤部位,以及MSC如何通过外排途 径释放药物,都是构建MSC药物靶向系统时需要考虑的问题。

本章通过细胞共孵育方式使MSC有效负载PDA-Ce6颗粒,构建MSC-PDA- Ce6系统。随后观察了 MSC摄取PDA-Ce6后的胞内分布,证明了 PDA-Ce6与 MSC溶酶体的共定位,并对PDA-Ce6在细胞膜上的吸附情况进行定量。考察了 PDA-Ce6对MSC细胞增殖的影响,选取了合适的负载量,构建MSC-PDA-Ce6o 通过Trancewell实验来评价MSC-PDA-Ce6系统的体外迁移活力;还考察了 MSC-PDA-Ce6的药物形式和释放动力学,以明确药物在细胞间的传递形式和评 估MSC的药物释放能力。希望通过以上各方面的指标考察,获得稳定有效可实 现药物释放的MSC-PDA-Ce6系统。

21仪器和材料

2.1.1仪器

仪器 型号 厂家
髙效液相色谱仪 Agilent 1260 德国Agilent公司
普通光学显微镜 Olympus CKX41 日本Olympus公司
激光共聚焦显微镜 Olympus FV1000 日本Olympus公司
流式细胞仪 FACS Calibur 美国BD公司
酶联免疫检测仪 Winooski 美国BioTek公司
激光器 808 > 670 nm 长春新产业技术有限公司
co2恒温培养箱 Hepa Class 100 Thermo Scientific

2.1.2材料

材料 规格 来源
SD大鼠 3周龄 中国上海斯莱克公司
DMEM培养基 低糖/高糖 杭州Genom生物公司
胎牛血清 500 mL Gibco公司
0.025%EDTA 胰酶 150 mL Gibco公司
MTT 100 g 上海碧云天生物公司
结晶紫溶液 50 mL 上海碧云天生物公司
DAPI染料 100 mL 上海碧云天生物公司
Typan Blue 100 mL 上海碧云天生物公司
PI 100 mg Sigma-Aldrich
绿色溶酶体荧光探针 50 pL 美国Yeasen公司
CFDA-SE 50 mg Sigma-Aldrich
Trans well 小室 8 pm pore size 美国Corning公司
葡聚糖凝胶G50 250 g Sigma-Aldrich
其他有机试剂AR

22实验方法

2.2.1细胞培养

采用差速贴壁生长法对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)进行体外扩增。

选择3周龄雄性SD大鼠脱颈处死后,分离出胫骨与股骨,用含10% FBS和1% 双抗的低糖DMEM培养液冲洗骨髓腔,过筛离心,转移继续培养。将扩增的第 二代至第五代的MSC用于实验[徊。

2.2.2 MSC摄取实验

PDA-Ce6的制备方法参照“123”。

24孔板底放置圆形盖玻片,将MSC按5 x 104 (个/孔)种板,过夜使贴壁;

加入PDA-Ce6 (5 pig/mL),摄取4 h, PBS清洗三遍,4%多聚甲醛固定, DAPI染色,PBS清洗三遍,制片,在CLSM下观察。

将MSC按1x106 (个/皿)种皿,过夜使贴壁;加入PDA-Ce6 (20 |ig/mL), 摄取4h, PBS清洗三遍,胰酶消化,离心收集,用2.5%戊二醛固定lh,制作 细胞切片,用扫描电镜(SEM)观察细胞内纳米颗粒的摄取情况。

24孔板,将MSC按2 x 104 (个/孔)种板,过夜贴壁;加入PDA-Ce6 (5 pig/mL) , MSC摄取4h, PBS清洗三遍,加入1 pimoL/mL溶酶体绿色荧光探针 35(1L (工作浓度70 nmoL/mL) , 37 °C培养箱中活染10 min , PBS清洗三遍, 4%多聚甲醛固定,DAPI染色,PBS清洗三遍,制片,在CLSM下观察。

  • PDA-Ce6的细胞内分布实验

先24孔板底放置圆形盖玻片,将MSC按密度1x105 (个/孔)种板,过夜 使贴壁;加入PDA-Ce6 (5(ig/mL),摄取4h ;实验组中加入0.4% TypanBlue 溶液,室温孵育3 min,用PBS清洗三遍,4%多聚甲醛固定,DAPI染色,PBS 清洗三遍。将未加入Typan Blue溶液作为实验对照组,同样的步骤处理后,制 片,在CLSM下观察。

将 MSC按密度1 x 106 (个/皿)种皿,过夜使贴壁;加入PDA-Ce6 (20 |Lig/mL),摄取4h;实验组中加入0.4% TypanBlue溶液,室温孵育3 min, PBS 清洗三遍,再加入1% Triton 2 mL裂解细胞,收集裂解液;将未加入Typan Blue溶液作为对照组,同样的步骤处理后,测定荧光强度。

  • PDA-Ce6 MSC 的毒性

采用MTT法测定PDA-Ce6对MSC的细胞毒性。将MSC按1 x 1()4 (个/孔)

接种在96孔板中,过夜贴壁,按以下分组进行实验:PDA-Ce6组(PDT + PTT、 PDT、PTT)、游离Ce6组、control组(n二3),加入药物孵育4h,按上述分组 进行光照处理,其中PDT条件为:激光波长=670 nm (50 mW/cm2, 5 min) , PTT 条件为:激光波长=808 nm (2.5 W/cm2, 5 min)o结束后弃掉药液,补新鲜含血清 培养液继续培养24 h后,加入20(1L MTT (5 mg/mL) , 4 h后加入160(1L DMSO,摇晃均匀后用酶联免疫检测仪测定490 nm处的OD值。细胞存活率

(Survival rate %)按照(3)公式进行计算:

Survival rate(%) = °。sample qq% (3)

OD control

OD sample:实验组的OD值

OD control:空白对照组的OD值

  • MSC-PDA-Ce6的细胞迁移实验

利用Transwell系统考察MSC-PDA-Ce6的迁移能力。将MSC与不同浓度的 PDA-Ce6 (1, 10, 20 pig/mL)孵育4 h后,胰酶消化收集3 x 1(^个接种到 Transwell上室中,下室接种1 x IO'个B16-F10肿瘤细胞 (含0.5% FBS的 DMEM培养基)。继续培养1天后,取出小室,除去上室膜上侧未通过孔移动 的细胞,PBS清洗三遍,4%多聚甲醛固定膜下表面上的细胞,加入0.1%结晶 紫溶液染色30 min,于光学显微镜下观察,观察和计算随机五个视野下迁移细 胞的个数,根据计数(样本)/计数(对照)X100%计算MSC迁移率。未负载 PDA-Ce6的MSC作为对照组,同样的步骤处理。

  • MSC-PDA-Ce6 的释药研究

药物释放形式:(1)HPLC法考察PDA-Ce6 (游离的或已负载的)在MSC 中运转出胞及其在胞内的形式。MSC (1 x 106)摄取药物4 h后,弃掉旧液, PBS清洗三遍,加入新鲜含血清培养液继续培养18 h,收集CM和细胞裂解液 并用乙睛处理以沉淀蛋白质和纳米颗粒,将样品离心后用HPLC进行分析。

(2)凝胶色谱柱法考察PDA-Ce6在MSC中运转出胞以及其在胞内的存在 形式。对照组:PDA-Ce6 (10(ig, Ce6 10(ig),两者混合均匀后,用含0.02% 吐温 80 和 0.1%的 Triton 的 PBS 补至 200(1LO 实验组:MSC 摄取 PDA-Ce6 (12.5 pig/mL) 4 h, PBS清洗三遍,胰酶消化收集,0.1%的Triton X-100裂解,得到 样品,过葡聚糖凝胶色谱柱,用含0.02%吐温80和0.1%的Triton X-100的PBS 洗脱液进行洗脱,收集流出液,并及时补加洗脱液,每次收集100 piL后更换收 集管,共收集3 mL;将收集到的洗脱液去测定荧光,绘制洗脱曲线。

药物释放动力学:为了明确MSC胞吐PDA-Ce6的情况,先通过CLSM观 察MSC-PDA-Ce6不同时间后释药情况。MSC (5 x 10°个)摄取PDA-Ce6 (20 |iig/mL) 4 h后,弃掉含药旧液,加入新鲜含血清的培养基,然后每天更换新的 培养液,分别于0、1、3天后,弃掉旧液,PBS清洗三遍、4%多聚甲醛固定、 DAPI染色,用CLSM观察。此外,在撤药后第0、1、3天,用0.1%的Triton X-100裂解细胞,收集并浓缩细胞裂解物;同时,在第1、3天时收集CM,最 后分别测定上述细胞裂解液和CM的荧光吸收光谱。

绘制释放动力学曲线。取上述MSC-PDA-Ce6 (5 x 104个,20 |ig/mL)。在 不同的时间间隔(0、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、72、100、120 h),

收集CM并同时加入0.1%的TritonX-100裂解MSC-PDA-Ce6;通过荧光分光光 度法(Ex二403nm, Em = 660nm)定量分析CM以及细胞内PDA-Ce6的浓度, 计算出相应细胞中的含量。

23结果及讨论

  • PDA-Ce6MSC胞内分布

内吞作用是细胞从外空间吸收物质分子的过程,对于维持细胞稳态、功能 至关重要。根据细胞类型以及参与该过程的蛋白质、脂质分子的不同,可以将 内吞作用分为受体蛋白介导和非受体蛋白介导的机制途径眇50],其中受体蛋白 介导的内吞过程取决于所基于的受体,如网格蛋白或小窝蛋白依赖性的内吞方 式。而大多数纳米颗粒的内吞是非受体介导的,影响纳米颗粒内吞进入细胞的 因素一般与其自身的物理化学性质有关如颗粒大小、电荷、表面特性等,同时 还与实验条件如孵育时间、温度等有关El。因此我们可以利用这种简单的纳米 颗粒内吞方式,实现MSC对PDA-Ce6的内化。

为了考察MSC对PDA-Ce6的摄取情况,我们首先将PDA-Ce6与MSC共孵 育一段时间,通过胞吞作用可将PDA-Ce6负载到MSC中,由于Ce6在一定波 长的刺激下可以发出红色的荧光,“1.3.2”的表征结果也说明了 PDA-Ce6保留 了 Ce6的光学特性,所以无需对其做特殊的标记,就以在激光共聚焦中看到其 被摄取时发出红色荧光的状态,预实验中我们发现MSC在摄取4 h后细胞中就 可以到达荧光强度的峰值,即达到对PDA-Ce6颗粒摄取的平台期,因此实验中 我们固定摄取4h作为MSC的摄取时间,随后,通过CLSM照片(图2.1A)可 以看到:红色PDA-Ce6大量被MSC摄取,在核内未观察到红色荧光,而是散 布在核的周围,而且细胞膜上没有观察到明显的吸附,这说明PDA-Ce6可被 MSC内化,并广泛分布于胞质中。而通过图2.1B SEM照片,我们发现在将 PDA-Ce6被MSC摄取后,大量的纳米颗粒位于内体样的囊泡中,而且SEM的 图像中PDA-Ce6的形态表明,囊泡中的纳米颗粒保持着完整的球形结构。所以 MSC可以对PDA-Ce6进行负载。

图 2.1 MSC-PDA-Ce6 的摄取情况:(A) MSC-PDA-Ce6 的 CLSM 图(B) MSC- PDA-Ce6 的 SEM 图

未经修饰的纳米颗粒大部分经过网格蛋白内吞途径进入细胞,然后通过溶 酶体途径释放QI,为了继续考察颗粒在胞内分布情况,我们进行了颗粒与溶酶 体的共定位实验。活细胞溶酶体染料(LysoTracker Green)与药物的共定位结 果如图2.2所示,在CLSM图像中发现PDA-Ce6 (红色荧光)与在细胞质中的 溶酶体(绿色荧光)存在共定位,呈点状分布,这证实了大多数PDA-Ce6颗粒 在MSC摄取后被运输到溶酶体中。

DAP! PDA-O6 LysoT racker Green Merged

1 20 pm 1 20 pm
Lr Lr Lr

图2.2 MSC胞内溶酶体与PDA-Ce6共定位

2.3.2 PDA-Ce6的膜内外分布

PDA在各种材料上具有优异的沉积和附着力①]。为验证PDA-Ce6是被 MSC内化,而不是在吸附在细胞膜上,用台盼蓝染色法和胰蛋白酶消化法区分 胞内的PDA-Ce6和细胞膜上吸附的[河。由于台盼蓝无法进入活细胞,可以淬灭 细胞外的荧光信号,因此可以用来猝灭细胞膜上吸附的荧光颗粒。实验组使用 台盼蓝淬灭,对照组不处理,得到结果如图2.3A所示,可以看到两组的荧光强 度几乎没有受到影响,说明在细胞膜上的药物颗粒比较少,定量后测定结果一 致(图2.3B)。胰蛋白酶是两亲性物质,可以将疏水性物质从细胞膜上洗涤下 来,将膜外的药物收集进行定量,我们对摄取了 PDA-Ce6的MSC用胰蛋白酶 消化处理,收集并分析细胞沉淀物(内在的PDA-Ce6)和上清液(吸附的PDA- Ce6),浓缩后测定两种样品的荧光强度,由图2.3B可知,膜上与膜内的药物 颗粒占比约为10%和90% ,通过两种方法的定量结果没有明显差异,说明绝大 部分PDA-Ce6被MSC内化至胞内,膜上吸附的比较少。

处理的CLSM图(B) PDA-Ce6在细胞膜上及胞内的占比情况(*pv0.05)
图2.3 PDA-Ce6的MSC膜吸附情况:(A) MSC摄取PDA-Ce6后有无台盼蓝

  • PDA-Ce6 MSC 的毒性

对于光触发系统,PDA-Ce6对MSC的暗毒性应降至最低。为了构建安全有 效的MSC-PDA-Ce6系统,我们首先考察了 PDA-Ce6对MSC的毒性,从MTT 结果(图2.4A)中可以看到在不给予光照的条件下,游离的Ce6在髙剂量下诱 导约40%的细胞死亡,而PDA-Ce6基本上对MSC细胞没有明显杀伤能力,说 明PDA具有很好的生物相容性,并且在结合后大大降低了髙剂量游离Ce6对细 胞的毒性,根据D/M等人和我们课题组S2]之前的研究认为,这可能与Ce6的毒 性位点在PDA-Ce6中被屏蔽有关,而且随着PDA-Ce6给药浓度的增大,细胞存

活率能保持在80%左右,这可以保证在无光刺激的情况下,MSC能维持其活性。 在单激光照射(670 nm或808 nm)时,用PDA-Ce6处理的MSC出现了中等的 光毒性,根据参考文献报道阿和预实验结果,激光条件:PDT为670 nm (50 mW/cm2, 5 min) , PTT 为 808 nm (2.5 W/cm2, 5 min)对 MSC 本身无伤害。 单一 PDT 和 PTT 的 IC50值分别为 0.618 + 0.004 |ng/mL 和 0.763 + 0.016 pg/mL, 而PDT/PTT联合光照比任何单一光照下对细胞的毒性都要大,IC50低至0.26 pig/mL (图2.4B),因为PDA-Ce6产生的髙温和ROS可以协同杀伤细胞。所以 结果表明PDA-Ce6具有髙度光热毒性,可诱导细胞死亡。

线(B) PDT、PTT、PDT/PTT 光照处理下 MSC 的 IC50值(*pv0.05)
图2.4 PDA-Ce6对MSC的毒性:(A)不同浓度与光照处理下MSC存活率曲

  • MSC-PDA-Ce6 的迁移能力

MSC向肿瘤细胞主动归巢,主要涉及到多种趋化因子受体的相互作用、 MSC迁移粘附到血管内皮细胞和靶向渗透到肿瘤细胞三大过程[56],其中MSC 的迁移能力是其能靶向肿瘤细胞的关键。在实验结果“2.3.3”中,我们证明了 MSC负载PDA-Ce6后,MSC可以保留其细胞活力,但本部分仍需要进一步评 估MSC在激光照射之前的迁移潜力。我们利用Transwell系统模拟MSC体外的 迁移实验,如图2.4A所示,将MSC-PDA-Ce6和B16-F10细胞分别种在小室上、 室,以上室MSC是否能穿过小室的膜层来评价MSC向肿瘤迁移的能力。从图 2.4B中可以看到,0.5-10 憾/mL浓度范围内PDA-Ce6的孵育对MSC体外迁移能 力影响很小,而与未摄取PDA-Ce6的MSC相比,MSC-PDA-Ce6的迁移数量没 有显着减少(图2.40 o说明MSC-PDA-Ce6有足够的能力向B16-F10细胞迁 移。

图2.4 MSC-PDA-Ce6体外迁移能力:(A) Transwell实验示意图(B)经不同 浓度的PDA-Ce6处理后,迁移的MSCs通过Transwell小室膜孔的光学镜下情况 (C)经不同浓度的PDA-Ce6处理后,迁移的MSC占的百分比,未负载PDA-Ce6 的MSC作为对照组MSC-PDA-Ce6 的释药研究

胞吐是内吞作用相反的过程,它利用囊泡向细胞外空间释放一些物质。真 核生物中的胞吐主要有两种类型:调节型和非调节型。调节性胞吐作用需要外 部信号的刺激,主要用于释放神经递质和分泌激素,而与调节性胞吐作用不同, 所有的细胞都进行非调节型胞吐作用,细胞利用这种胞吐作用将某些成分释放 到细胞外基质或将分泌蛋白整合到质膜中,在许多细胞中都观察到了纳米颗粒 的胞吐作用,例如干细胞,肿瘤细胞,肝细胞,成纤维细胞和上皮细胞[弘59]。 根据报道聚多巴胺涂层的介孔二氧化硅纳米颗粒可以通过细胞内体实现胞吐, 包括经典的分泌囊泡和GLUT4易位囊泡方式,来将颗粒分泌到细胞外a】,并且 在MSC分泌的微囊泡中发现了金纳米粒⑹]。

通过使用CLSM来记录和观察PDA-Ce6被MSC胞吐的过程。如图2.5A所 示,随着时间的延长,MSC内的红色荧光强度在不断下降,到第3天时,大部 分细胞内的荧光物大大减少,此外,根据图2.5B,可以清楚的看到细胞裂解物 的荧光强度降低;而对比第1天,第三天的CM荧光值要大,说明存在PDA- Ce6被释放到细胞外。

(B) 3天内CM和细胞裂解液中Ce6的荧光扫谱图
图2.5 MSC-PDA-Ce6的释药情况:(A) 3天内MSC外排药物的CLSM图

在第一章体外释放实验中,我们发现PDA-Ce6之间的酰胺键在pH 4.0-7.4 的范围内是稳定结合的,这已经涵盖了细胞外和细胞内微环境的pH范围,包括 在酸性溶酶体(pH5.0-5.5)中的环境,所以我们初步估计药物以颗粒的形式稳 定存在。为了进一步确定药物的释放形式,我们先分别收集摄取PDA-Ce6后 MSC的CM和其细胞裂解物,一方面,通过HPLC的方法来判断,因为仍然结 合在PDA表面的Ce6会比较长时间滞留在色谱柱中,而游离的Ce6可以通过色 谱柱,根据图2.6A实验结果显示在8.2 min左右未出现Ce6的特异峰,表明在 细胞内没有检测到Ce6从PDA表面游离出来;另一方面,我们还使用了葡聚糖 凝胶色谱检测是否有游离Ce6的存在,由于纳米颗粒粒径较大,在葡聚糖中没 有阻滞,会直接跟随冲洗液先出柱,游离的Ce6会通过葡聚糖交联的内部网格 然后再出来,两者前后会存在一定的洗脱时间差,所以可以利用这一原理来分 离纳米颗粒和游离的Ce6分子,从而判断Ce6的存在形式。本章中的实验结果 表明(图2.6B),在细胞裂解液中仅检测到洗脱出PDA-Ce6峰,没有洗脱出来

游离的Ce6,在对照组中,分别对应5 min和12 min的游离Ce6和PDA-Ce6峰 能很好的分离开来。

Fraction number

图2.6药物的释放形式研究:(A) CM和细胞裂解物的HPLC谱图(B) CM和 细胞裂解物的葡聚糖凝胶色谱洗脱曲线

综合以上实验结果,表明PDA-Ce6在细胞培养物中是化学稳定的,完整的

PDA-Ce6是从MSC膜上脱离以及被MSC胞吐出来的,没有游离的Ce6被释放。

在确定药物以颗粒的形式存在之后,我们进行了 MSC释放动力学的研究。

MSC摄取PDA-Ce6后,在一定的时间后更换培养液,随着培养时间的延长,胞 内药物的荧光强度显著下降.为了排除胞内荧光信号的衰减是由于细胞分裂引 起的gw],我们收集了不同时间点单个孔中所有细胞的CM以及其裂解液进行 动力学的研究。通过测定CM和细胞裂解液的荧光强度,绘制得到了 PDA-Ce6 的细胞胞吐动力学曲线(图2.7),图中可看到,随着孵育时间的延长,细胞内 的荧光强度降低,CM中却在增强,说明PDA-Ce6不断的被释放出来,而且在 最初的1 h内经历了快速释放,在“2.3.2 ”中,我们证明了有小部分PDA-Ce6 是结合在膜上的,所以短时间内在膜上结合的PDA-Ce6会迅速被释放,然后在 接下来的3天MSC持续进行着的胞吐作用,这与纳米颗粒缓慢内吞的模式一致 E65],最后,大约有60%的药物从MSC中外排出来。对于靶向肿瘤的载体, 胞吐作用一般被认为是有害的,因为它会降低到达肿瘤细胞的药物水平,所以 目前有开发出抑制胞吐作用[59],去促进药物在细胞中保留和积累的策略[66]。然 而,在基于MSC作为载体的药物递送系统中,药物外排或纳米颗粒胞吐作用是 非常有利的,此过程有助于释放药物颗粒。虽然MSC的快速释放会造成药物的 损失,但我们在后期体内分布中发现仍有大量的药物存在于靶组织中。以上的 结果充分表明,MSC是一种有效的药物载体,不仅可以有效地加载药物,还可 以释放出药物。

图2.7 MSC外排动力学曲线

24小结

  • MSC与浓度为5 |ig/mL的PDA-Ce6共同孵育4 h后,PDA-Ce6可以成功 被MSC内化,并且大部分都在胞质中分布。PDA-Ce6对MSC几乎没有暗毒性, MSC-PDA-Ce6的迁移能力在5-10 pig/mL浓度范围内不受到影响;成功构建了 MSC・PDA・Ce6系统。
  • 药物是以颗粒的形式被MSC外排的。PDA-Ce6在MSC内的释放呈先快 后慢的趋势,并在3天后可以释放约60%颗粒。

第三章MSC-PDA-Ce6体外抗肿瘤评价及药物传递过程研究

上一章我们构建了 MSC-PDA-Ce6系统并对其摄取能力、迁移能力和释药 情况与释药形式等方面进行了一定的考察,证明了 MSC-PDA-Ce6能维持良好 的迁移能力并且将药物成功释放,为接下来的体外抗肿瘤评价提供了基础。

如何利用MSC的肿瘤靶向性使之携带的药物颗粒更精确的到达肿瘤部位是 研究者们所关注的重点,也是构建MSC-PDA-Ce6系统最大的立足点。为此, 在本章中为了研究MSC-PDA-Ce6系统在体外是否表现出抗肿瘤效果以及 PDT/PTT联合治疗时是否增强抗肿瘤效果,我们先考察了 PDT和PTT处理下 MSC-PDA-Ce6系统对B16-F10细胞毒性的影响,然后评估了共培养环境下 MSC-PDA-Ce6系统对B16-F10细胞和载体细胞的杀伤能力。同时我们还在3D 肿瘤球模型上考察了 MSC-PDA-Ce6系统渗透及药物分布,为后续的体内抗肿 瘤实验提供了基础。

31仪器和材料

3.1.1仪器

仪器 型号 厂家
普通光学显微镜 Olympus CKX41 日本Olympus公司
激光共聚焦显微镜 FV1000 日本Olympus公司
流式细胞仪 FACS Calibur 美国BD公司
酶标仪 Winooski 美国BioTek公司
激光器 800、670nm 长春新产业技术有限公司
3.1.2材料
仪器 规格 来源
SD大鼠 3周龄 上海斯莱克公司
B16-F10 小鼠源 中科院上海细胞库
DMEM培养基 低糖/高糖 杭州Genom生物公司
胎牛血清 500 mL Gibco公司
0.25%EDTA 胰酶 150 mL Gibco公司
MTT 100g 上海碧云天生物公司

 

DAPI染料 100 mL 上海碧云天生物公司
CFDA-SE 染料 50 mL 上海碧云天生物公司
琼脂糖 100g 美国HydraGene公司
其他有机试剂 AR
3.2实验方法
3.2.1细胞培养

采用贴壁生长法对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCS)进行体外扩增。方法 同 “221”

用含10 % FBS和1 %双抗的DMEM髙糖培养液来培养小鼠黑色素瘤肿瘤 细胞(B16-F10) o

3.2.2流式检测细胞凋亡情况

MSC (1 x 106)摄取不同浓度的 PDA-Ce6 (0.1、0.5、1.0(ig/mL) 4 h 后, PBS清洗三遍,胰酶消化,同时B16-F10细胞先用CFDA-SE染色(10(1M)。 按MSC与B16-F10数量比例为1:4共培养3h后,弃掉旧液,加入新鲜培养液。 用 670 nm (50 mW/cm2, 5 min)和 808 nm (2.5 W/cm2, 5 min)分别以 PDT + PTT组、PDT组、PTT组、control组处理细胞,激光照射后,将细胞在37 °C培 养箱中进一步孵育过夜。收集细胞,离心,计数,得到含5-10 x 104个细胞悬液。 加入10(1L碘化丙噪(PI)染色液,混匀室温避光孵育15min, PBS清洗三遍后 用流式细胞仪进行分析[何。

3.2.3 MSC-PDA-Ce6体外抗肿瘤评价

为了考察体外MSC-PDA-Ce6对肿瘤细胞的毒性,我们先采用MTT法评价 共培养后细胞存活率并记录镜下情况。将MSC按密度1.25 x 104个/孔种板,过 夜使贴壁,分别加入不同浓度PDA-Ce6 (0.4、0.5、4、5、8、10、20、24 pig/mL),摄取4 h,消化收集转移至新24孔板中;按1:4的细胞数量加入B16- F10细胞,用适量无血清的DMEM培养基共培养3 h后,弃掉药液,加入新鲜 含血清培养液,PDT光照条件为670 nm (50 mV/cm2, 5 min) ; PTT光照条件 808 nm (2.5 W/cm2, 5 min)联合处理实验组,对照组不进行联合光照处理;结 束后继续过夜培养24 h后,先于普通光学显微镜下观察共培养系统下的细胞生 存情况,然后再每孔加入50 |1L MTT溶液(5mg/mL),继续培养4 h后,加入

500(1L DMSO,转移到96孔板中,用酶联免疫检测仪测定在490 nm处的OD 值。

随后,我们采用MTT法评价了共培养系统中总细胞的死亡情况。将MSC 按密度1.25x104个/孔种板,过夜使贴壁;加入PDA-Ce6 ( 5 pig/mL),摄取4h 后,按照1:4的细胞数量加入B16-F10细胞,用适量无血清的DMEM培养基共 培养3 h ,弃掉药液,PBS清洗三遍,进行第一次PTT/PDT联合治疗,光照条 件同上;过夜后,加入50(iL的MTT (5 mg/mL) , 4 h后弃掉液体,加入500 (1L的DMSO,转移至96孔板中,用酶联免疫检测仪测定在490nm处的OD值。 两天后,进行第二次联合光照治疗。再两天后,进行第三次关照,光照处理前 一天更换含血清的高糖DMEM培养液,对照组不进行光照处理。

  • PDA-Ce6的细胞间传递

将MSC按密度1.25 x 104 (个/孔)种板,过夜使贴壁,加入PDA-Ce6 (4 pig/mL),摄取4h,同时将B16-F10细胞用10 piM CFDA-SE染色15 min,收集 以上两种细胞,按MSC与B16-F10数量比例为1:4混合,共培养3 h后,用 PBS清洗三次,4%多聚甲醛固定,DAPI染色,CLSM下观察药物在两种细胞 之间的转移情况。

  • 3D瘤体渗透及球体内分布

悬滴法培养3D肿瘤球曲]:(1)配置含甲基纤维素(5 mg/mL)的培养基, 0.22 |im微孔滤膜过滤,备用。(2)将B16-F10按500个/20(1L细胞悬液滴在培 养皿盖子上面,加适量PBS于培养皿底部以保持球状体内的水合环境。将其盖 回皿上,成功形成吊滴;将其放置CCh恒温培养箱中培养72 h后,把小球体小 心地转移到铺有无菌琼脂糖溶液(1 mg/mL)的96孔板中,补充完全培养基, 放在CCh恒温培养箱中继续培养,约4-7天可以形成有一定体积的、圆形、致 密且组织良好的肿瘤球体。

3D球渗透实验:为了考察MSC-PDA-Ce6的肿瘤渗透能力,将培养好的3D 肿瘤球转移到24孔板中,过夜使之贴壁;MSC摄取PDA-Ce6 (20 pig/mL) 4 h 后,加入CFDA (工作浓度:10(1M)染料于371下标记15 min, PBS清洗三 遍,收集MSC-PDA-Ce6 (1 x 105个)与肿瘤球共培养24 h;用4%多聚甲醛固 定,PBS清洗三遍,在激光共聚焦显微镜下观察MSC和PDA-Ce6在球体内的 渗透和分布情况。

33结果与讨论

  • MSC-PDA-Ce6体外抗肿瘤评价

MSC可能通过促进血管生成而促进肿瘤血管的生成,这潜在的致瘤性和其 他有害作用是研究者们一直关注的问题a,®。为了体现MSC-PDA-Ce6系统对 靶细胞的杀伤作用,采用双标记法,如图3.1A所示,通过流式细胞术评估共培 养系统中MSC-PDA-Ce6对B16-F10细胞的杀伤能力。根据图3.1B和图3.1C结 果显示,与单一 PDT或PTT治疗的肿瘤细胞相比,PDT/PTT联合治疗的肿瘤细 胞存活率显著降低,而且即使在低载药量(0.1 pig/mL)下,MSC-PDA-Ce6仍 然可以导致75%的肿瘤死亡。

图3.1流式检测共培养细胞凋亡情况:(A) MSC-PDA-Ce6与绿色标记的B16-

F10共培养系统光照处理示意图(B)不同MSC-PDA-Ce6浓度下PDT、PTT、

PDT/PTT治疗时B16-F10细胞存活率(*p V 0.05) (C)共培养系统中B16-F10

细胞凋亡流式图

根据上一章的结果得知,PDA-Ce6在MSC外排后还有残留。为了研究

MSC-PDA-Ce6对载体细胞MSC的清除作用,我们将B16-F10细胞与接受PDT,

PTT或PDT/PTT联合治疗的MSC-PDA-Ce6的共培养系统通过毒性实验来评价 体外的治疗效果,MTT结果(图3.2B)显示,共培养体系中共约80%的细胞死 亡,这其中包括MSC和肿瘤细胞。从光学显微镜图可以看到MSC和B16-F10 细胞的形态都发生了改变。在图3.2A中,红色箭头表示的是MSC,其细胞形态 伸长类似纺锤形,而对照组中黑色箭头则表示的是贴壁的B16-F10细胞,其个 体较小,呈上皮样。从图中我们可看到低剂量组在激光刺激后两种细胞都没有 明显的形态变化,但是随着剂量的增加,MSC的细胞结构变得不规则,其中已 经有些开始发生细胞破裂;中剂量组的B16-F10细胞也开始收缩,许多细胞从 皿的底部分离;而在髙剂量组中,我们观察到了许多细胞碎片,形成了凋亡小 体,细胞质出现了颗粒化和边缘化,说明细胞的光热毒性是剂量依赖性的。本 次实验结果表明MSC-PDA-Ce6不仅会导致肿瘤细胞死亡,而且还会在光刺激 下导致MSC死亡。尽管存在细胞胞吐作用,但纳米颗粒还是会在MSC中保留 很长时间",在我们的“MSC外排动力学实验”中也可以观察到PDA-Ce6在 MSC中3天后还有残留,所以当在高剂量组的MSC被杀死后,就可以完全释 放出剩余的颗粒,这不仅有利于杀伤肿瘤细胞,还能实现对MSC的体内清除, 避免了 MSC潜在的安全问题。

图3.2 MSC-PDA-Ce6体外杀伤B16-F10情况:(A) MSC和B16-F10的总存活

率(B) MSC和B16-F10在不同剂量组下光照处理的光学显微镜图

3.3.2 PDA-Ce6的细胞间传递情况

根据“331”结果可知,高剂量中单次的PDT处理就会诱导B16-F10的死 亡,而PDT和PTT两者联合处理均有助于细胞凋亡(图3.10 o PDA在MSC
中产生的热量可以通过培养基或直接细胞接触转移到相邻的B16-F10细胞,但 细胞内产生的ROS表现出极小的扩散半径(v20nm) [72],这意味着光敏剂要 实现良好的治疗效果需要在空间上接近其目标作用部位。如果Ce6 一直存留在 MSC中,则产生在细胞内的ROS不足以杀死肿瘤细胞,因为大多数真核细胞的 直径约为10-100 pm。MSC-PDA-Ce6如何在激光照射下触发B16-F10细胞死亡 需要更多的数据支持。Li等推测PS通过“旁观者效应”完成MSC与癌细胞之 间药物的接收转移⑴],但是其过程不够明确。我们根据结果“2.3.5”可知,药 物以PDA-Ce6颗粒的形式被MSC外排,所以PDA-Ce6很可能从MSC-PDA-Ce6 转移到B16-F10细胞中,在光的刺激下释放ROS和产生热量,导致细胞的死亡。

因此,为了验证药物颗粒的转移,我们将CFDA-SE标记的B16-F10细胞与 MSC-PDA-Ce6共培养孵育,进行了 PDA-Ce6在细胞间传递的研究。CFDA-SE 是一种用于活细胞的绿色荧光示踪剂,可以随着细胞分裂依旧保留在胞内。在 CLSM中可以观察到B16-F10 (绿色)中PDA-Ce6 (红色荧光)的明显分散, 而且MSC内红色荧光强度(黄色箭头)几乎接近B16-F10中的(白色箭头)水 平。这证实了我们的预测,即PDA-Ce6从MSC到肿瘤细胞存在的明显转移。 通过激光触发B16-F10细胞内PDA-Ce6从而诱导其细胞凋亡。

图3.3 PDA-Ce6在MSC和B16-F10之间的传递

3.3.3 3D瘤体渗透及球体内分布情况

MSC具有向肿瘤细胞迁移的能力,但是实体瘤部位细胞细紧密生长,显示 出很髙的间质液压力汕,同时肿瘤经历快速的新血管形成,以支持癌细胞的快 速增殖,障碍了药物跨毛细血管的运输及渗透,是肿瘤治疗中需要克服的两大 难点。上一章我们在2D水平上的实验,突出了 MSC的迁移潜力,因此为了评 估MSC-PDA-Ce6是否可以渗透到肿瘤深部并进一步释放出药物颗粒,我们进 行了 MSC-PDA-Ce6对B16-F10肿瘤球体的3D渗透实验,通过CLSM断层扫 描跟踪3D肿瘤球内MSC-PDA-Ce6 (绿色)和Ce6红色荧光的共定位及分布情 况。实验结果如图3.4所示,随着球体深度的不断扫描,绿色荧光从球体边缘 到中心都有出现,说明MSC可以迁移并进一步渗透到3D肿瘤体中,甚至渗透 到球体的中心,同时红色荧光也广泛分布在整个肿瘤球体中,说明纳米颗粒有 被释放出来,此外,图中的部分黄色荧光表示MSC (绿色)和PDA-Ce6 (红色) 的共定位,而且在重叠的图像中几乎没有发现单独的绿色荧光,说明MSC- PDA-Ce6可以迁移并渗透到肿瘤体中,并且可以将药物颗粒释放出来,使之有 效渗透。而残留在MSC中的PDA-Ce6颗粒(黄色)在光照处理后,杀伤载体 细胞被释放,进一步发挥PDA-Ce6光热毒性。

3.4小结

  • 在 MSC-PDA-Ce6与B16-F10的共培养系统中,对比任何单一的PDT和 PTT, PDT/PTT联合治疗时,MSC-PDA-Ce6对肿瘤细胞的杀伤能力显著;此外, MSC-PDA-Ce6不仅可以诱导B16-F10细胞死亡,还能进一步清除MSC。
  • MSC可以将PDA-Ce6通过胞吐■摄取成功传递到B16-F10细胞中。MSC- PDA-Ce6可以渗透到3D肿瘤球内部,并释放PDA-Ce6颗粒。

第四章MSC-PDA-Ce6的体内抗肿瘤评价

肿瘤转移是一个多环节、多阶段的过程,根据原发肿瘤的不同,转移途径 各异。小鼠B16黑色素瘤,是一种极容易向肺部发生转移的肿瘤之一,也是最 常用的肺转移模型之一,通过静脉注射B16黑色素瘤细胞后随着鼠的生长自发 转移到肺部而得到肺转移模型⑴],其转移到肺部最直接的表现为肺部出现大量 不透明的黑色肿瘤结节,可以作为指标来评价抗肿瘤效果。通过上一章MSC- PDA-Ce6的体外抗肿瘤效果评价,我们证明了 MSC可以将PDA-Ce6传递到肿 瘤细胞中,并且在PDT/PTT的联合治疗中显示出MSC-PDA-Ce6对B16-F10细 胞显著的杀伤能力,有良好的体外抗肿瘤效果,因此希望在本章中也能达到有 效的体内治疗效果。

为此,本章我们先对尾静脉注射MSC-PDA-Ce6之后的小鼠进行肺部的冷 冻切片,跟踪MSC与PDA-Ce6的定位分布,确定光治疗方案。通过多次给药 和光照,完成对荷瘤小鼠的治疗。通过小鼠的肺重、肺肿瘤结节数和其生存期 等参数评价MSC-PDA-Ce6的体内抗黑色素瘤肺转移效果。

41仪器与材料

4.1.1仪器

仪器 型号 厂家
激光共聚焦显微镜 Olympus FV1000 日本Olympus公司
激光器 808 > 670 nm 长春新产业技术有限公司
4.1.2材料
材料 规格 来源
SD大鼠 200-220 g 上海斯莱克公司
ICR小鼠 三周龄 上海斯莱克公司
B16-F10 细胞 小鼠源 中科院上海细胞库
DMEM培养基 低糖/高糖 杭州Genom生物公司
胎牛血清 500 mL Gibco公司
其他有机试剂AR

42实验内容

4.2.1小鼠黑色素瘤肺转移模型的建立

收集B16-F10细胞1x106个/500(iL(PBS溶液),除健康组外,实验组每 只小鼠通过尾静脉注射上述体积的B16-F10细胞,继续饲养,约10天后用于后 续实验。

  • MSC-PDA-Ce6肺内分布实验

为了观察MSC-PDA-Ce6在瘤内的分布情况,首先制备了 PDA-Ce6,其制 备方法参照“122”部分。将MSC按细胞密度2 x 105 (个/孔),种在6孔板 中,加入PDA-Ce6 ( 20(ig/ml),摄取4 h, PBS清洗三遍。然后用CFDA-SE 对MSC进行活染标记15 min, PBS清洗三遍,收集MSC-PDA-Ce6,通过尾静 脉注射到肺转移模型成功的荷瘤小鼠中,分别在12、24. 48 h后,将荷瘤小鼠 处死取出双肺,用4%多聚甲醛固定,蔗糖脱水,包埋,制成组织切片,在 CLSM下观察肺部切片中MSC- PDA-Ce6的分布情况。

  • MSC-PDA-Ce6体内抗肿瘤实验

小鼠肺转移模型建立后,随机将小鼠分成6组(n二6),尾静脉分别注射 saline. MSC、PDA-Ce6 制剂 (PDT + PTT)、MSC-PDA-Ce6 体系 (PDT)、 MSC-PDA-Ce6 体系(PTT)、MSC-PDA-Ce6 体系(PDT + PTT) , MSC-PDA- Ce6浓度为20 |ig/mL, PDA-Ce6制剂组和MSC最后的细胞数量根据“226”部 分,PDA-Ce6制剂组的纳米粒浓度为0.378憾/只,MSC细胞数量总共为2.1 x IO:个,分为三次给药,每次7 x 104个/只,注射体积均为0.5 mL (PBS)。每 次在给药后的24 h开始激光治疗。光照治疗时,先用1%的戊巴比妥钠(0.5 mL/100 g)将小鼠麻醉,将小鼠四肢固定,去掉胸前毛发,将激光器按照光照 条件:PDT: 670 nm, 70 mW/cm2, PTT: 808 nm, 3.0 W/cm2 固定好,光照时间 为10 min,前面两次光照治疗结束后,继续饲养,直到第三次结束后,再继续 饲养4天,于第5天将小鼠处死,取出肺部,拍照,称重、计算结节数,具体 的给药和光照治疗方案如下图所示:

4.3结果与讨论

  • MSC-PDA-Ce6肺内分布情况

MSC在全身给药时,会在各种组织器官有不同程度的滞留,由于MSC体 尺寸比较大(16-53 pm),同时肺部的毛细血管十分丰富,所以在静脉注射之 后,首先会发生“肺首过效应”,即大部分MSC先被肺部血管截留[沟,从而限 制了其到达别的器官中。虽然可能细胞会自身发生变形来通过狭窄的血管通道, 但研究表明当MSC通过尾静脉注射24-48 h后会大量先集中在肺部组织,然后 扩散到转移病灶"旳。也有研究报道,除了细胞大小之外的因素,也可能与肺 细胞捕获MSC有关⑴],人的肺中具有类似MSC的成纤维样形态的细胞群,并 从肺部组织消化物中分离出了肺部MSC (Ir-MSC),与其他MSC种群相似1「 MSC能在合适的培养基中贴壁生长,并存在MSC表面蛋白CD73, CD90和 CD105的表达和一定的分化潜力甌⑶】,有利于诱导骨髓来源的干细胞在肺部募 集,这些都促进了 MSC在肺部疾病治疗中的应用。

为了确认本文构建的MSC-PDA-Ce6在肺部的经时时间,确定体内实验的 光照治疗时间,采用CFDA-SE绿色荧光探针标记MSC-PDA-Ce6,以跟踪MSC 系统的肿瘤靶向性及PDA-Ce6在肺组织中的位置。通过尾静脉注射入MSC- PDA-Ce6后12、24、48 h后处理肺部样品,观察其具体在肺部的分布情况。图 4.2分别对应的是注射12、24、48h后的分布情况,其中绿色荧光表示被标记的 MSC,红色荧光表示PDA-Ce6,而黄色表示两者重叠部分。我们的结果表明, 在静脉注射12h后,MSC-PDA-Ce6在肺组织已经有被滞留,并且荧光强度在注 射24 h后达到最大,而48 h后信号减弱,这可能与MSC-PDA-Ce6向其它器官 重新分布和体内代谢有关。图中清楚地显示了 MSC-PDA-Ce6的迁移和定位,

24 h后在肿瘤部位可以看到大量的红色荧光,并与绿色荧光标记的MSC不重叠, 说明MSC-PDA-Ce6不仅能迁移到肿瘤区还可以将PDA-Ce6有效的释放出来, 使药物有效分布在肿瘤位置。相似地,Cui等人根据小鼠体内的荧光成像结果, 采取尾静脉给药后24 h进行光疗砂]。以上结果表明,MSC可以有效的负载 PDA-Ce6到达肿瘤位置,所以在接下来的实验中我们决定在注射MSC-PDA-Ce6 后24 h进行光照治疗。

图4.2 MSC-PDA-Ce6肺内分布情况:尾静脉注射MSC-PDA-Ce6纳米颗粒12、 24、48h后,肺转移瘤内分离的MSC (绿色)和PDA-Ce6纳米颗粒(红色)分 布和共定位(黄色)情况

  • MSC-PDA-Ce6体内抗肿瘤评价

我们评估了 MSC-PDA-Ce6的联合PDT/PTT治疗抗侵袭性鼠黑色素瘤肺转 移的小鼠。首先如图4.3A所示,在对照组中,转移的肿瘤集落遍布整个肺组织, 表明B16-F10黑色素瘤细胞具有强大的肺转移潜力。按照图4.1所示的治疗时间 方案,分为 saline、MSCPDA-Ce6 (PDT + PTT)、MSC-PDA-Ce6 (PDT)、 MSC-PDA-Ce6 (PTT)、MSC-PDA-Ce6 (PDT + PTT) 6 组同时进行实验,光 照治疗结束,对各项指标进行了考察。

目前就MSC潜在的致瘤性一直受到大家的关注,研究表明输注多于106个 的MSC可以促进肺转移小鼠肿瘤细胞的生长⑴]。因此,我们每次注射的MSC 数量控制在7 x 104个/次,总计2.1 x 105个。在上一章的实验中我们证明了激光 刺激MSC胞吐释放药物后残留在细胞中的PDA-Ce6可以进一步杀死MSC,从 而进一步提髙了 MSC-PDA-Ce6应用的安全性。根据图4.3A-B的结果表明, MSC和Saline组之间转移性黑色结节的数量没有显着差异,这表明MSC对肿瘤 的生长没有治愈或刺激作用。与接受PDT/PTT联合治疗的PDA-Ce6相比, MSC-PDA-Ce6显着抑制肿瘤生长,由于机体网状内皮系统(RES)的清除作用, 外源性颗粒一般易于在肝脏和脾脏中积聚砂】,同时PDA-Ce6在体内无选择性, 导致在肿瘤中的浓度比较低,但本文中的MSC-PDA-Ce6却可以逃避体内的生 理屏障并靶向迁移到肿瘤细胞。将光敏剂掺入MSC中可以有效地抑制体外肿瘤 的扩散[29】,然而,由于PS的组织渗透率不髙,单一 PDT可能不足以在体内根 除肿瘤[30,81,84],因此,本研究对PDT与PTT的组合进行了研究。与PDT或PTT 的单一治疗相比,两者联合治疗表现出更显著的疗效,从图4.3B-C中可以看到 PDT/PTT联合治疗组的小鼠肿瘤结节数量和肺部重量都明显减少,同时在小鼠 的生存期评价中,MSC-PDA-Ce6 (PDT/PTT)联合治疗的小鼠生存时间显着增 加,其生存时间平均为55.5天,比PDA-Ce6制剂对照组25.2天延长了约20天

(图 4.3D-E) o

在体内实验过程中,我们未观察到MSC-PDA-Ce6存在明显的毒性,与对 照组的体重和生存时间无明显差异。文献报道PDA在结构和性质上都类似于生 物体内天然存在的黑色素物质,所以注射的PDA-Ce6会在小鼠体内类似于黑素 素代谢途径被降解成DA、酪氨酸及其衍生物“陶,随后可能随尿液排出,到 目前为止,我们对它们的排泄途径还没有详细的机制与实验证明,但是PDA是 生物相容的、可生物降解的材料,据报道,PDA可以在8周内在体内被完全降 解成单体化合物跑,所以可以预期PDA-Ce6将降解为DA等物质并释放Ce6o 此外,Ce6是FDA批准的治疗性光敏剂,副作用小,同时有采用类似组合的研 究结果表明,当尾静脉给药后24 h,药物颗粒几乎都是分布在肿瘤位置和网状 内皮系统区域,这也进一步表明了 PDA-Ce6的安全性阿。

3.0 W/cm2, 10 min) (B)每组在实验第15天后各肺部转移结节数(C)每组 在实验第15天后各肺组织重量(D)各组肺转移小鼠的Kaplan-Meier存活曲线
图4.3MSC-PDA-Ce6的体内抗肿瘤效果:(A)每组在实验第15天后的肺部组 织情况图(激光处理条件为 PDT: 670 nm, 70 mW/cm2, 10 min; PTT: 808 nm,

(n二6) (E)各组的中位存活时间(与MSC-PDA-Ce6组合组相比,*pv0.05)

4.4小结

  • 尾静脉注射MSC-PDA-Ce6 24h后,在肺部组织达到最大的累积量,并有 效释放药物颗粒,MSC和PDA-Ce6 t泛分布在肿瘤组织。
  • MSC联合PDT/PTT联合治疗的效果明显,肺部重量和结节数均减少,小 鼠的生存期明显得到延长,体内抗肿瘤效果显著。

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  • 致谢时光荏苒,冬去春来,新年伊始,这座杭城又开始迸发出万物复苏的光芒。 回首自己两年半的研究生生涯,心中泉涌,感概万千。

    本论文的顺利完成,首先要特别感谢我的导师孙晓译副教授。从课题的选择、 研究思路的确定、实验过程的点滴以及论文的撰写无不凝聚着孙老师事无巨细的 指引与教导。她严谨的科学态度、诲人不倦的高尚师德、谦逊和蔼的学者风范、 平易近人的人格魅力都深深地感染和激励着我。能成为孙老师的研究生,是我这 辈子的小幸运。在此,我向孙老师表示最诚挚的敬意和感谢。

    感谢同实验室的沈洁老师在科研上给予的建议和帮助。还要特别感谢亲爱的 王晓玲师姐在实验与生活中的帮助与付出,也非常感谢王蓿师姐、周碧辉师兄、 黄文斌师兄在实验相关方面的建议。感谢范苗、吴林文、邵颖、杨帆、姚佳琪、 王欣怡、王晋豪、舒敏、牛育苗等同窗在实验和生活中给予的关心和帮助,感谢 髙东若、髙颖、董淑敏、张作艳、邹东等师弟师妹的陪伴,让我的研究生旅程不 孤单,还要感谢17届毕设生林莉莉、金梦婕、林莹婷、苏正局、方雄飞,感谢18 届毕设生丁琼琼、章天成,感谢20届毕设生李哲宁、何一晨,感谢能与你们共同 走过这段美妙的旅程。

    还要感谢我的好朋友蒋诗清的关心与守护。感谢李莉、李宇峰、唐海林、胡 慧平、陈明月、丁宁、邓谦在生活中的关心与支持,是大家对我的爱护,陪伴我 度过了这无比珍贵的时光。

    在此也要感谢我的家人对我的支持与理解,无论何时他们都是我最强大的后 盾,让我拥有向前的信心与勇气,顺利的完成全部的学业。

    最后,特别感谢百忙之中抽出时间评阅本论文和参与本人论文答辩的各位老 师!

    研究生生涯无疑是我最重要的人生旅程之一,愿此去繁花似锦,不负时光, 成为最好的自己。

综述

基于间充质干细胞的仿生纳米药物递送系统

癌症一直是威胁人类生命的主要疾病之一,在癌症治疗策略中,有效的药 物递送是实现癌症理想治疗效果最为关键的一步。随着材料科学和纳米技术的 不断进展,纳米药物由于其粒径大小、表面易修饰、易改性和可调控等特性在 药物递送系统(DDS)中有非常重要的地位,也已经开发了许多纳米载体,如 银纳米粒⑴、脂质体⑵、碳纳米管⑶、金属有机框架⑷、碳点⑸等。然而,仍然 有许多缺点限制这些纳米制剂满足有效药物递送的要求,如其中的脂质体被认 为是一种有效的药物传递系统(DDS),其化学组成(磷脂)和脂质双层结构 都非常接近生物膜,有良好的生物相容性,但是脂质体的结构相对简单,难以 充分模拟细胞膜的复杂性,而且还存在易氧化、不稳定、靶向性差和药物易泄 露的缺点。此外,大多数纳米粒子能被体内的网状内皮系统、免疫系统识别当 作是异物从而进行清除⑹,从而缩短了在体内的循环时间,最后到达肿瘤细胞 的量非常少,而且由于选择性比较低,会造成在正常的器官中积累,产生毒性 作用。因此,为了更好地实现纳米颗粒靶向药物递送,我们需要寻求更安全有 效的递送策略。

目前报道知,天然的间充质干细胞(MSC)已被长期探索作为药物载体用 以药物递送⑺叫 它可以显著提髙这些药物在体内细胞的靶向传递。但是一些不 足之处依然存在,一方面是包载的药物在进入MSC后是否能避免被其自身溶酶 体消化而继续保持活性,另一方面,活细胞载体难以控制药物的释放,这可能 会造成药物的提前泄漏或者递送过程中的胞吐从而减少药物到达后的浓度。直 到最近,随着生物学和医学科学的发展,使用天然细胞来源的细胞膜或其分泌 囊泡作为药物载体的可能性受到了大家越来越多的关注Hi。】。科学家们发现了 从自然到仿生设计的线索,用这些胞膜结构包覆纳米药物去实现仿生性能的方 法得到大家的认可Z12],而与全细胞作为药物载体相比,基于上述膜结构的药 物递送系统不但可以避免因全细胞自身一些特性带来的不利影响,如MSC的潜 在致瘤性及可能的免疫反应,而且由于膜都是磷脂双分子层的组成成分,它不 仅能保持着良好的生物相容性和拥有更低的毒性,更重要的是,膜结构保留了 其亲本细胞作为载体赋予的各种生物功能或靶向特异性而无需进一步修饰,它 可以伪装成自体细胞,以逃避机体免疫系统的消除,延长在血液中的循环时间, 提升药物在组织和细胞中的生物利用度,促进药物在靶部位的有效富集,从而 提髙治疗效果。是一种有前途的纳米药物递送系统,激发研究人员积极探索。

因此,本文整理了基于间充质干细胞的仿生纳米药物递送系统的最新进展, 介绍了其背景、制备方法、独特性能和应用,以不同形式的仿生膜结构进行阐 述,简要总结其在癌症治疗中的相关应用。

  1. 基于MSC来源的细胞膜仿生递送

1.1细胞膜的功能

细胞膜是细胞之间进行物质交换和信息传递的重要结构,特别是其表面镶 嵌着各种类型的膜蛋白及糖蛋白是决定细胞自身功能与特征重要的成分。跨过 细胞膜进入胞内,是实现药物递送到细胞中后发挥疗效最重要的过程,而每种 细胞都在扮演着不同的角色,拥有其自身的功能,研究者们需要结合其特点进 行研究与利用。如红细胞是血液中最丰富的细胞,在体内的保留时间可达到 120天,因为红细胞表面有许多天然的标记物,包括CD47蛋白、各种膜蛋白、 多聚寡糖、酸性唾液酸部分,可以减少网状内皮系统和非特异性巨噬细胞对它 的清除作用2】。相比于红细胞,由于血小板的主要功能是可以聚集并黏附在出 血部位,进行伤口的修复,所以与红细胞膜相比,血小板膜更适合靶向损伤组 织和肿瘤部位,得益于这些自身特性,细胞膜仿生技术被研究者们关注,2011 年,张良方课题组首次报道了红细胞膜仿生的药物递送系统,而红细胞膜 (RBC)也是目前生物医学应用中最受欢迎的天然载体Z 15]。更多的生物原性 细胞的膜结构用来实现对药物的递送逐渐得到大家的认可与关注。

1.2细胞膜的制备方法

常用的细胞膜分离纯化方法是通过物理或者化学的方法使细胞膜破裂Ml, 然后分别除去细胞内含物,从而得到纯化的细胞膜。细胞的破碎可以采用超声、 低渗裂解、冻融裂解、去污剂渗透、化学诱导等手段,为了减少膜表面蛋白的 降解,超声与冻融是常用的比较温和的方法。然后采用差速/梯度离心法、两相 分配法等将膜分离,最后进行膜的纯度验证。制备细胞膜包覆的纳米药物可以 借鉴于脂质体的制备,采用通过多孔膜物理挤出的方法,目前来说,利用超声 技术使两者自发形成核壳的纳米结构是比较常用的方式[⑹。

1.3间充质干细胞来源的细胞膜

间充质干细胞(mesenchymal stem cell)是一种全能干细胞,免疫原性低, 已经被报道可以主动趋向到恶性组织或炎症环境。MSC对肿瘤细胞的靶向机制 很复杂"1可,主要涉及许多趋化因子受体的相互作用和迁移粘附到内皮细胞, 目前被鉴定的一些肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞可以产生大量的趋化因子,包 括血管内皮生长因子(VEGF),巨噬细胞移动抑制因子(MIF),血小板衍生的 生长因子(PDGF),基质细胞衍生因子・1 (SDF-1),转化生长因子■卩(TGF-P) 等,它们可以吸引MSC细胞膜上对应的受体,引诱MSC向靶组织趋向,MSC 的肿瘤归巢功能还与粘附分子对血管的粘附和与内皮细胞的相互作用有关,位 于膜上的分子识别位点是发挥间充质干细胞靶向迁移至肿瘤细胞的关键组成部 分,但是MSC用于癌症治疗的可能会诱导癌细胞转移或者致瘤风险,这也是研 究者们一直关注的问题,因此,与全细胞相比,MSC膜修饰后的仿生纳米颗粒 作为递送载体更为安全。

  1. 4基于MSC膜在药物递送中的应用

干细胞膜易于分离,体外可培养大量的间充质干细胞,通过物理或者化学 的方法获得细胞膜囊泡用于实验,Lan等人[⑼将人骨髓间充质干细胞(hMSC) 的细胞培养液用聚乳酸■餐基乙酸共聚物(PLGA)包裹制成微粒,然后通过反 复冻融法得到hMSC膜去涂覆它们,获得人工合成的MSC (synMSC)仿生制 剂,通过流式细胞术分析显示,与MSC —样,synMSC存在CD105, CD90, CD45, CD31,和CD34的类似表达,而且可以维持生长因子如血管内皮生长因 子(VEGF),基质细胞衍生因子・1 (SDF-1),和胰岛素样生长因・1 (IGF-1)的 释放。这些结果表明,synMSC基本上维持了 MSC分泌蛋白质和表面抗原表达 的功能。研究人员还测试了 synMSC冷冻和冻干稳定性,发现不仅没有改变结 构,而且表面抗原表达也无显著差异。在体外和体内的实验中也证明 了 synMSC有显著促进心肌细胞恢复的功能,为治疗多种疾病提供了新的策略。

已经有报道,MSC膜包覆在髙分子载药纳米粒上用于相关癌症的治疗。研 究比较多的有可生物降解的聚乳酸■餐基乙酸共聚物(PLGA)及其类似物, Yang等人㈤]使用脐带来源的MSC膜涂层在PLGA纳米颗粒的表面后递送阿霉 素(DOX)进行靶向肿瘤治疗(PM-PLGA-DOX)o实验中证明,膜修饰后的

纳米颗粒保留着膜上的功能蛋白,如趋化因子受体CRCX4,是MSC靶向肿瘤 的重要蛋白之一,对比无膜修饰PLGA, PM-NP-DOX能增强在肿瘤细胞中的积 累,而且还能够有效地在酸性环境中释放药物,显著地诱导细胞凋亡和抑制肿 瘤生长。同样的,Tian等人0]采用骨髓来源的MSC膜修饰在紫杉醇(PTX)的 PLGA纳米颗粒(SCV/PLGA/PTX )用于乳腺癌的治疗,SCV/PLGA /PTX表现 出优异的稳定性和更可控的PTX释放,体外抗肿瘤效果得到增强。体内的实验 也表明可以显著抑制原位乳腺癌的生长,并且由于靶向作用使得PTX对其他器 官组织的毒副作用降低。此外,Gao等人QI受到细胞膜伪装纳米颗粒性能的启 发,开发了骨髓来源的间充质干细胞膜包被的明胶纳米粒(SCMG),来作为髙 效靶向肿瘤的系统。SCMG具有天然干细胞膜的生物学功能,从而在体内外表 现出卓越的肿瘤靶向能力。另外,体内实验表明,当静脉内注射时,SCMG靶 向并聚集在肿瘤组织中。与明胶・DOX和游离DOX相比,SCMG-DOX的抗肿瘤 治疗效果显着增强,而且对其他的组织器官没有明显的副作用。

2•基于MSC分泌的膜囊泡仿生递送

2.1外泌体的来源及功能

细胞分泌的膜囊泡由于载有反映其原细胞病理生理状态的蛋白质和核酸, 可以作为一些疾病的生物标志物,特别是这些囊泡及其内含物可以细胞间通讯 的形式被其他细胞内化,使这些囊泡成为潜在的治疗剂或治疗剂的递送载体㈡], 从而吸引了许多研究者的目光。通常,细胞分泌的膜囊泡可大致分为两类:1) 由溶酶体囊泡的内陷形成多囊泡体并通过胞吐作用释放的囊泡;2)从质膜脱 落的囊泡。外泌体和微囊泡分别是这两个类别中两种最具代表性的膜囊泡类型, 两种囊泡均包含起源细胞的膜和细胞质成分0]。微囊泡(MVs)的尺寸范围比 较大,一般为100-1000nm,据报道,MVs主要通过细胞之间的mRNA、siRNA、 受体和相关酶的转移来促进细胞间的交流[殂26],可以作为细胞间的通讯载体, 但是由于缺乏对MVs分类的确定标准,阻碍了其标准分离和测定方法的发展, 所以应用有一定的局限性。而外泌体(Exs)是迄今为止报道的有最明确定义的 分泌囊泡类别,它们具有40-100nm的较窄大小范围,同时包含蛋白质和RNA 物质[27-28]。许多不同的细胞类型都可以分泌外泌体,而且在不同的生理液中也 发现了分泌的外泌体存在[29-31],表明分泌外泌体是细胞一种普遍的功能。除了 上述所说的囊泡可以运输内源性物质外,已有报道显示,外泌体还可以作为天 然来源的纳米囊泡,将外源性的RNA等物质递送至体内的靶细胞内,抑制小鼠 的肿瘤生长,而且这种体内介导的核酸传送短期内不会诱导先天的免疫活化, 没有明显的副作用卩2】。由于它们可以同时存在于单细胞和多细胞生物中,因此 认为它们在原核生物和真核生物中都是髙度保守的卩习,所以这些外泌体或囊泡 共同拥有一组进化保守的蛋白质分子,基本的生物活性相似,但它们也具有独 特的组织或细胞类型特异性的蛋白,可以反映其细胞来源和生理功能。

2.2外泌体的获得及载药方式

目前,可以采用两种方法在外泌体中负载药物,每种方法各有优缺点。外 源方法在从体液或细胞培养基中分离出囊泡,然后一般采用蔗糖梯度/差速离心 法或者免疫亲和力法理均,来获得纯度比较髙的外泌体,纯化之后将药物进行 负载,其药物负载过程类似于脂质体,这种方法可以应用于疏水和亲水分子药 物,疏水性药物的包封是在直接混合后实现的:亲脂性小分子被动扩散通过EV 膜,而其他分子(例如PTX)则被包裹在EV双脂质双层中,EV磷脂层的疏水 尾与疏水药物之间发生疏水相互作用,从而实现了物理包封并保护了包封的药 物免受细胞外环境中的降解现象的影响。而内源方法是基于Exs生物生成的过 程中进行,可以用来负载不同性质的分子,包括蛋白质、脂质、DNA/RNA等 [36],主要是通过将Exs源细胞与目标物质共培养,细胞内化药物后,在一定的 诱导或刺激下,正常地通过外泌体的形式释放到细胞外。当然这些方法避免不 了存在局限性,但是目前还没有特别理想的、低成本的和髙效益的方法来纯化 外泌体,需要研究者们继续开发与优化。

2.3 MSC外泌体的功能及特性

使用外泌体作为药物递送的重要因素是考虑外泌体的细胞来源,因为,不 同细胞来源的外泌体具有不同的生物学功能。MSC来源的外泌体具有理想的药 物递送载体的特征,首先,多项研究表明,MSC发挥功能的机制与其旁分泌/内 分泌性质有关卩刀,由于MSC拥有先天性的免疫调节和归巢于肿瘤细胞的内在能 力,这些功能可以被MSC转移至其外泌体與1,所以不仅可以提髙MSC外泌体 作为递送载体在细胞内的耐受性,延长其作用时间,还能靶向到目的细胞从而 提髙药物货物的生物利用度,而且MSC外泌体还可以来源于患者自身的细胞, 这极大地减低了机体对它的免疫消除机率。其次,MSC外泌体本质上是自然来 源的脂质体,可以潜在的克服合成脂质体的某些局限性,如体内半衰期短等, 而且外泌体中蛋白质和核酸物质的存在暗示此类生物物质可以被装载到外泌体 中,并进一步保护它们不在细胞内被破坏而降解或失活,从而能拥有更长的体 内循环效果,同时天然的小尺寸使外泌体可以避免体内吞噬细胞的吞噬作用, 有利于它们渗出肿瘤血管及在肿瘤组织中的扩散;最后,用于产生外泌体作为 药物递送载体的细胞源的必要条件是其具备外泌体的无限产生能力,先前我们 已经描述了 MSC的特征与功能,它不仅拥有主动归巢肿瘤细胞的能力,还易于 在体外大量扩增培养,而且已有报道,MSC具有强大的旁分泌活性,并分泌大 量的膜囊泡。为了避免原代MSC的有限扩增能力,有研究者采用了基因工程技 术减低MSC分化潜能使之永生化,这并未影响外泌体的分泌数量和治疗质量卩9】, 目前,MSC是已知的具有大规模生产外泌体能力的唯一人类细胞类型㈤]。因此, MSC衍生的外泌体在药物癌症的治疗中,拥有很大的优势,是一种比较理想的 药物递送载体。

2.4基于MSC外泌体的药物递送

Grange等人通过使用小分子荧光团,直接标记从骨髓来源的间充质干细 胞来源的外泌体,注射24小时后,在受损的肾脏中观察到了强而稳定的荧光, 说明聚集在受损的肾脏组织中,而大家都认可MSC主要通过膜上受体的介导作 用募集到损伤部位的,这就表明MSC衍生的Exs与MSC有相同的膜受体。此 外,据报道,Ruenn将MSC外泌体输注到具有免疫功能的急性心肌缺血的小鼠 模型中是有效的,可以显著降低硬塞面积,而且没有明显的不良反应與1。等人 的研究说明MSC来源的外泌体可以直接靶向心肌细胞,减少心肌梗死面积,而 且他们还进一步证明外泌体可以通过增加ATP的产生,降低心肌细胞的氧化应 激作用并诱导PI3k/Akt信号传导,发挥治疗效果陀]。所以MSC外泌体与MSC 一样,可以对受损组织进行修复与再生,保留着与亲代细胞相同的部分。

Pascucci等人⑷],成功分离得到了载有紫杉醇(PTX)的MVs (PTX-MVs), 首次证明了载有PTX的MSC细胞系SR4987产生的膜囊泡(MVs)在体外具有 非常强的抑制肿瘤细胞增殖的活性。通过TEM和SEM观察到了圆形的膜结合 囊泡,直接说明了 MSC能够通过其MV包装和递送药物。此外,他们还进一步 通过使用荧光素标记的PTX,发现了药物存在和积累于来自髙尔基体的囊泡中。 Fattore等人屮]先从MSC条件培养基中分离纯化得到外泌体,然后将其负载长春 新碱,在流式实验中发现了明显的U87MG细胞死亡,而且还观察到骨髓间充质 干细胞和脐带间充质干细胞来源的外泌体(MSGEx)在体外均可以降低胶质母 细胞的增殖并诱导其凋亡,此外,Perteghella等人[呵开发了一种基于载丝素蛋 白和姜黄素纳米胶束的MSC外泌体的载药递送系统,纳米颗粒被MSC摄取后 分泌出载有上述纳米胶束的MSC-EV,通过热分析证实了丝素蛋白的稳定构型, 还得到了比较高的姜黄素包裹量,有利于提高治疗效果。以上的研究均表明, 通过囊泡递送化学抗癌药可以使其避免向正常的组织分布,克服化疗药物带来 的毒性作用,进一步扩展了化疗药物在癌症治疗中的应用。

3 •前景与展望

MSC是最有前途的开发新药物递送媒介的细胞来源,因为MSC不仅是一 种可以从几乎所有人体组织中衍生的细胞类型,而且还具有髙度增殖性,不管 是利用来源MSC的细胞膜还是其分泌的外泌体作为新的递送载体系统,其可获 得性、易载药性、生物相容性、肿瘤靶向性及安全性已经吸引大家的关注,而 且对于同属膜结构的它们,都是通过表面受体或整联蛋白或与质膜融合(内吞 作用)与靶细胞相互作用,所以也很适合对其进行膜表面的修饰,使之获得更 髙的靶向效率,从而拥有更丰富更多的功能。而且它们的双分子层结构对于保 护生理性药物免受体内生物酶的降解至关重要,对未来生物药的递送也提供了 新的手段。如今看来,基于MSC的仿生递送载体比MSC具有更出色的表现, 可以代替MSC用于相关疾病的治疗,拥有成为靶向递送载体的巨大潜力。

 

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