高血压患者肠道菌群变化特点的研究论文

2020年10月10日11:05:20高血压患者肠道菌群变化特点的研究论文已关闭评论

高血压患者肠道菌群变化特点的研究论文

摘要

高血压是一个全球性的公共卫生问题,全球每年大约有1700万人死于心血管疾 病,约占总死亡人数的三分之一,在这些死于心血管疾病的人中,有940万人死于 高血压并发症。高血压导致至少45%的心脏病死亡和51%的脑卒中死亡⑴,如何早 期预防和治疗高血压,开辟基于机制的新的治疗策略,寻找药物治疗的有效靶点, 成为该领域的研究热点与难点。近年来,大量研究结果表明,肠道菌群及其代谢产 物通过影响机体的代谢、免疫、神经系统和内分泌稳态等,在高血压的发生发展中 扮演着重要角色经彳、41 o

目的:

本研究旨在通过16S rRNA测序技术探讨高血压患者肠道菌群变化特点及相关 性,为进一步研究高血压患者肠道菌群变化的特点以及肠道菌群作为高血压治疗靶 点的潜力提供了理论依据。

方法:

  1. 研究对象:选取2018年12月-2019年5月于陕西省人民医院心血管内一科住 院的高血压患者及门诊健康体检者共14人。
  2. 分组:高血压患者9人,作为观察组,所有高血压组对象均满足2017年中国 高血压防治指南制定的高血压诊断标准且排除糖尿病以及冠心病、心律失常、心力 衰竭等其他心血管疾病;门诊健康体检者5人,作为对照组。
  3. 排除标准:14例入选者均满足排除标准:①被采集者近4周内使用过任何益 生菌、制酸剂、抗生素或抗微生物制剂;②患有炎症性肠、肠易激综合征等影响肠 道菌群的疾病;③消化系统患有任何器质性疾病或曾进行过手术;④有长期吸烟史、 酗酒史、服药史等影响肠道菌群的其他问题;⑤年龄〈18岁及〉75岁者。
  4. 方法:采集粪便标本后于2小时内送往实验室-80摄氏度冰箱内储存,后送至 深圳微科服技有限公司进行DNA提取,并利用16STRNA测序技术获得基因序列, 然后在Illumina Miseq测序平台对样本进行双端测序,分析两组肠道菌群的物种组 成、两组间OTU差异、Alpha多样性和Beta多样性,从而获得生物学信息。在两 组之间的比较中,利用ANCOM分析、LEfSe分析反映两组的物种多样性、丰度; 利用Kruskal Wallis检验、PERMANOVA检验方法反映两组的组间菌群结构差异, 以q (矫正过的p值)05认为有显著差异性。

结果:

  1. 高血压组和对照组肠道菌群均以四个门为主,依次为厚壁菌门(Finnicutes)、 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及放线菌门(Actinobacteria), 其中厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门为优势菌。在门以下水平,高血压组中丰度显 著高于对照组的柯林斯氏菌属(属于红蜻菌纲),研究发现其与类风湿关节炎、2型 糖尿病、动脉粥样硬化疾病相关,为致病菌。而对照组中丰度较高的乳酸球菌属和 韦荣氏球菌属,均属于厚壁菌门,前者属于乳酸菌属中的一种重要模式菌,可维持 肠道菌丛平衡,帮助其他益生菌生长,维护人体肠道健康。后者属于乳酸利用菌, 被发现可调控口腔健康并维持肠道内乳酸动态平衡。二者均属于正常菌群。
  2. 本研究还对样本的OTU进行了 Alpha多样性和Beta多样性分析,结果显示 两组研究对象在肠道菌群丰富度、多样性及群落结构方面均没有显著差异。

结论:

本研究结果提示高血压患者存在肠道菌群的改变,且高血压患者肠道内致病菌 多于健康人群,肠道菌群参与了高血压的发生发展。

关键词:高血压,肠道菌群,16S rRNA测序

Abstract

Background:

Hypertension is a global public health problem. Hypertension can increase the burden of diseases such as heart disease, stroke, kidney failure, early death and disability, which seriously affects the fragility of the health system People in low- and middle-income countries [11 .How to prevent and treat hypertension at an early stage, open up a new therapeutic strategy based on mechanism, and find effective targets for drug therapy, has become a research hotspot and difficulty in this field. In recent years, a large number of studies have shown that intestinal flora and its metabolites affect the body's metabolism, immunity, nervous system and endocrine homeostasis [2' * 41.

Purpose:

The aim of this study is to explore the characteristics and correlation of intestinal flora in patients with hypertension by 16S rRNA sequencing technology, and provide a theoretical basis for further study of the characteristics of intestinal flora changes in hypertensive patients, the mechanism of intestinal flora acting on blood pressure regulation, and the potential of intestinal flora as a therapeutic target for hypertension. Methods:

  1. Research objects: a total of 14 hypertensive patients and out patient health examiners hospitalized in the Department of cardiovascular internal medicine of Shaanxi People's Hospital from December 2018 to May in -2019 were selected.
  2. Grouping: 9 patients with hypertension. As the observation group, all hypertensive subjects met the diagnostic criteria of hypertension formulated by the Chinese hypertension prevention and control guidelines in 2017 and excluded other cardiovascular diseases such as coronary heart disease, arrhythmia, heart failure and so on. 5 healthy people in out-patient clinic served as control group.
  3. Exclusion criteria: 14 patients met the exclusion criteria: ①those who had been used for more than 1 months had used any probiotics, antacids, antibiotics or anti microbial agents;② suffering from inflammatory bowel, irritable bowel syndrome and 4other diseases that affect the intestinal flora; ③ digestive system has any organic disease or has undergone surgery;④ there were other problems affecting the intestinal flora, such as long history of smoking, history of alcohol abuse and medication history;⑤ those who were <18 years old and >75 years old.
  1. Method: after collecting fecal specimens, they were sent to the laboratory -80 degrees Celsius refrigerator for storage within 2 hours, then sent to Shenzhen Microtech Clothing Technology Co., Ltd. for DNA extraction, and 16S rRNA sequencing technology was used to obtain the gene sequence. Then, the Illumina Miseq sequencing platform was used to carry out two terminal sequencing of the samples.The species composition of the two groups of intestinal flora, the OTU difference, the Alpha diversity and the Beta diversity among the two groups were analyzed, and the biological information was obtained. In the comparison between the two groups, ANCOM analysis and LEfSe analysis were used to reflect the species diversity and abundance of the two groups; Kruskal Wallis test and PERMANOVA test method were used to reflect the difference of microbial community structure between the two groups.<0.05 was considered significant difference by Q (corrected p value).Result:
  1. The intestinal microflora of the hypertension group and the control group are mainly composed of four phylums, followed by the Firmicutes (Firmicutes), Proteobacteria (Proteobacteria), Bacteroidetes (Bacteroidetes) and Actinobacteria (Actinobacteria) ), Of which the thick-walled phylum, Proteobacteria, and Bacteroidetes are the dominant bacteria. At the level below the phylum, the abundance in the hypertension group is significantly higher than that of the control group of genus Collins (belonging to the red aspergillus), the study found It is associated with rheumatoid arthritis, type 2 diabetes, and atherosclerotic disease, and is a pathogenic bacteria. The control group has higher abundance of Lactococcus and Veillonella, which belong to the thick-walled phylum, the former It is an important model bacteria in the genus of lactic acid bacteria, which can maintain the balance of intestinal flora, help other probiotics to grow, and maintain human intestinal health. The latter belongs to lactic acid-utilizing bacteria, both of which belong to normal flora and are found to be regulated Healthy oral cavity and maintain the homeostasis of lactate in the intestine.
  2. This study also conducted Alpha diversity and Beta diversity analysis on the OTU of the samples, and the results showed that there were no significant differences in the intestinal flora richness, diversity and community structure between the two groups of research subjects.

Conclusions:

In summary, the results of this study suggest that there is a change in the intestinal microflora in patients with hypertension, and that there are more pathogenic bacteria in the intestine of patients with hypertension than healthy people, and the intestinal flora is involved in the occurrence and development of hypertension.

Key words Hypertension, Intestinal flora, 16S rRNA sequencing technology

我们生活在微生物世界中,微生物在地球上的居住时间比人类长了数亿年。在 过去的二十年中,微生物组学的研究以惊人的速度发展,并且揭示了这些微观生物 影响我们日常生活的多种方式。已有多项研究证明了微生物群落的改变与疾病有关, 包括肥胖,糖尿病,哮喘,风湿性疾病和胃肠道炎症性疾病等⑸。近年来,我们逐 渐认识到人类微生物群在维持人类健康方面的重要作用。胃肠道是宿主和环境之间 的主要通路,在那里发现了必需的微生物群。过去十多年来,不断增加的数据已经 形成了这样的概念,即肠道微生物群是一种在胃肠道中具有独特功能的超器官,是 人类健康和疾病的关键决定因素,也是宿主生理的关键调节因子⑵。

人类微生物群的发育在出生前就开始了,已经在胎盘和胎儿胎粪中检测到细菌 微生物组的存在,这表明在分娩前可能发生初始接种。这种定植过程继续通过分娩 和母乳喂养获得母体微生物,并且在衰老过程中受到饮食,卫生,抗生素使用,疾 病和运动等因素的影响。饮食,特别是通过母乳喂养提供的饮食,不仅被认为是肠 道定植的另一条途径,而且作为已经建立的细菌群体的重要营养,已成为新生儿体 内第一个益生菌的低聚糖来源,并刺激健康微生物组的发展。随着时间的推移,早 期的定植种群被更好地适应肠道环境的微生物所代替,在2岁左右达到了一个与成 人相似的繁荣昌盛的状态。在成年期,肠道微生物群保持相对稳定,但易受日常事 件的影响,如长期抗生素治疗。健康的成年肠道微生物群主要由拟杆菌和厚壁菌门 组成,但也包括小比例的放线菌门,变形杆菌和疣微菌门。此外,其他微生物结构 域也可以在健康的微生物组中找到,例如古细菌,真核生物和病毒。尽管其相对稳 定,但微生物群落存在显着的个体差异。有几个因素驱动这种变量,包括饮食,早 期暴露,环境微生物暴露,药物和遗传。微生物组成的差异可能不会显著影响微生 物功能,因为有数据表明,在不改变主要门的情况下,不同种系型之间存在功能相 似性,微生物能够调节对环境变化的代谢反应©7】。尽管我们的遗传基因组在宿主 的整个生命周期内基本稳定,但微生物组具有巨大的多样性与动态性,并且对外部 输入有反应,从而增强了其作为治疗干预目标的潜力。

我们的身体是细胞和许多共生微生物的集合体。微生物可以在人体的几个部位 发现,包括皮肤,口腔,鼻子,肺和胃肠道。就数量而言,微生物群的绝对规模是 巨大的。测序技术的进步与微生物组生物信息学管道的发展相结合,正在使微生物 群组成的分析更便宜,更复杂。实际上,最初估计我们的微生物细胞比人类细胞多10 倍,最近已从10: 1的比例下调至1.3: 1⑻,但这仍然是一个令人敬畏的数字。 在遗传水平上更是如此,我们体内超过99%的基因是微生物,数量超过1000万。 经过多年的人类基因组测序项目,能够开发新的策略来计算单独存在于人类细菌群 落中的基因总数,从而估计我们的基因组在大约20,000 - 25,000个蛋白质编码基因 ⑼。而在胃肠道定植的原核细胞是近9,000,000个基因的携带者"°】。它们在共生条 件下识别宿主及其微生物组的协同进化,提供了人类基因组本身不具备的特征。通 过这种方式,微生物群组不仅可以影响宿主生物的发育,还可以影响对人类健康至 关重要的营养和代谢途径。由于存在大量基因,人类细菌群落现在被认为是由哺乳 动物宿主及其微生物群组成的超级生物的重要组成部分,它们共同构建了一种有利 的关系,以维持所有系统的健康状态。

利用无菌技术进行的几项研究揭示了肠道微生物群在宿主结构、代谢和免疫功 能的发展和维持中的关键作用,如下所述。①无菌动物的肠道结构和功能出现了一 些与微生物群缺乏相关的异常,包括小肠质量减少,粘蛋白和绒毛结构的上皮细胞 表达改变,肠蠕动减少,粘膜表面积减少以及大肠吸收水分受损。除此之外,无菌 条件导致肠道和全身免疫系统发育不全,其特征是固有层中淋巴细胞密度低,Peyer 氏斑块发育不良,成熟淋巴滤泡数量减少以及免疫球蛋白水平降低⑴】。②微生物群 还是未消化膳食成分的强力清除剂,并产生一些对宿主健康至关重要的代谢产物, 包括胆汁酸、胆碱、维生素和短链脂肪酸等【⑵,比如盲肠和大肠中的厌氧细菌对难 消化的碳水化合物进行有效降解,产生的短链脂肪酸是微生物群落和宿主的能量来 源⑴】。微生物群与肠道之间的持续相互作用,有效地调节了肠道局部以及宿主体内 的生理内环境平衡。③肠系膜淋巴系统,又称为肠相关淋巴组织(GALT),是血液 和肠淋巴液之间的界面,免疫应答在此启动并向肠上皮和固有层提供活化的免疫细 胞,在那里它们与肠道微生物群相互作用。即使在没有疾病的情况下,大量的淋巴 细胞和其他免疫效应细胞也会穿过肠组织,对肠道微生物群作出反应和耐受。因此, 肠道微生物群在决定宿主细胞中各种信号传导的免疫结果水平方面起着至关重要的 作用。肠道和各系统的动态平衡不可避免地受到调节性免疫机制的严格控制,这些 免疫机制是由数以万亿计的微生物、微生物基因产物和模式识别受体之间的相互作 用建立起来的,破坏这种平衡会产生重大后果,可能导致大量疾病的发生。

高血压是一个全球性的公共卫生问题,也是全球疾病负担中最重要的危险因素。 高血压是一种以体循环动脉血压升高为主要特点的常见临床综合征,原发性高血压 被认为是一种由多种因素共同作用的多因素疾病,包括遗传、环境、行为、解剖、 神经、内分泌等多种因素,它们共同促进并改变血压水平和血管阻力。高血压不但 是缺血性心脏病、心力衰竭、心房颤动等心血管疾病最重要的危险因素之一,在疾 病的发展过程中,还会损伤脑、心脏、肾脏等器官的结构和功能,也是卒中、慢性 肾病、外周血管疾病和认知功能下降等疾病的主要危险因素。根据《中国心血管病 报告2018》概要报道,我国从1958年到2002年间进行过4次全国范围内的高血压 抽样调查,结果显示年龄N15岁的居民,高血压患病率呈现上升趋势【⑷。2012〜2015 年,中国高血压调查(CHS)采用多阶段、分层、随机抽样的方法,在我国大陆31个 省的262个农村和城市,共抽取451755名,年龄N18岁的居民开展调查,结果显示,有 27.9%的中国成年人患有高血压,男性较女性占优势,且随着年龄的增长,患病率逐 年升高【⑷。

2015年,在许多关于肠道菌群定性或定量变化,胃肠道细菌种类重组,甚至微 生物代谢改变与多种疾病发展相关的文章发表后,一组研究人员旨在评估肠道失调 在高血压中的作用⑴】,他们通过研究盐敏感大鼠和盐抵抗性大鼠的盲肠微生物组分, 发现两组之间肠道菌群存在差异。同年,Yang等还发现自发性高血压大鼠(SHR) 的肠道微生物组成的丰富度和多样性与正常血压WistarKyoto大鼠不同。2017年, Li等对健康、高血压前期(pHTN)和高血压(HTN)人群的队列分析支持上述 研究结果,即人类肠道细菌组成的丰富性和多样性也发生了变化。他们还发现, pHTN患者中的肠道菌群已与健康对照组不同,前者与HTN个体中的群落具有相似 的群落,表明肠道菌群的改变可能先于高血压临床表现的出现。基于此,作者强调 了通过微生物生物标志物方式分析肠道微生物群及其代谢物来检测高血压的新视 角。该研究还发现,将高血压患者的粪便样本提取物通过粪便移植到无菌小鼠后, 与健康对照组相比,接受高血压粪便移植的小鼠体内肠道菌群发生显著变化,且观 察到与对照组相比,受体小鼠的平均动脉压、舒张压及收缩压均明显升高,说明高 血压可通过肠道菌群进行“传递” [9]o

通过在高血压动物模型甚至人类模型中观察到细菌组成变化,随后的研究进一 步发现了血液中细菌代谢产物水平的改变。SHR中肠道微生物组产生的SCFAs量减 少,这可能导致宿主的代谢、免疫和生理变化,这些与血压水平的变化有关【⑻。另 一方面,与正常盐饮食的盐敏感大鼠相比,高盐饮食的盐敏感大鼠引发高血压后, 其粪便中乙酸、丙酸和异丁酸的含量增加,而丁酸盐的含量没有增加。在正常盐饮 食或HSD喂养的高血压小鼠模型中,盐的消耗量是导致菌株之间细菌负荷变化的原 因。观察到的最重要变化与乳酸杆菌属有关,在HSD动物中乳酸杆菌属减少【19】。 此外,HSD小鼠表现出较高频率的Thl7细胞,在一组接受乳酸杆菌补充的HSD动 物中,Thl7细胞的频率降低了。这种益生菌方法能够减少HSD动物肠道和脾脏淋巴 细胞中Thl7细胞的数量,也导致收缩压的降低。这项研究强调了微生物如何参与肠 道环境中的免疫变化,这可能有助于高血压的发展⑵】。与此同时,这些实验也为高 血压的新治疗方法提供了思路,比如益生菌补充剂的使用,是否可以降低高血压患 者的炎症和血压。

另一个涉及肠道菌群影响血压调节的概念被称为“菌群-肠-脑轴S微生物代谢 产物可以直接影响血压控制中心。肠道微生物群参与神经递质的产生,如5-瓮色胺、 广氨基丁酸、去甲肾上腺素和乙酰胆碱,可能调节中枢和外周神经系统。自主神经系 统的调节和神经炎症的发生也与耐药性高血压的发病机制有关。临床前研究表明, 自主神经系统可能影响肠道微生物群落。Santisteban等⑵】报道了室旁核和肠道之间 交感神经通讯的增强,并认为肠道交感神经和副交感神经活动的不平衡导致了高血 压相关的肠道病理生理学、生物失调和免疫系统的激活。通过这种方式,肠道菌群 失调也可以被归类为高血压的另一个原因,随着时间的推移,可能导致其他心血管 和肾脏疾病。如Andradeoliveria[221等发现,SCFAs通过减少局部和全身炎症、氧化 应激以及损伤引起的细胞凋亡来改善肾功能不全。因此,SCFAs的减少可能影响高 血压的发展,损害肾功能,减弱机体对炎症过程的控制,并有助于肾脏疾病的发生。

微生物世界作为一个天然资源库,分子多样性巨大。最早开展的分离培养技术 是在菌株水平进行的,虽然为我们了解微生物的多样性开辟了新天地,但是想要获 得纯培养的微生物进行更深入的了解,自然界中约有99%的微生物都不能通过这种 传统的分离培养技术实现,因此从而导致环境微生物中的我们将很难识别许多重要 的微生物,更别说发现环境中各种微生物的多样性基因资源。但是,随着技术手段 的不断进步,微生物的活性产物现在已被广泛深入的研究和开发利用了,再筛选出 的新活性物质的几率会逐渐下降,这使得如何对环境中的微生物新资源进行开拓和 利用正在成为微生物研究的重要课题。如今出现了多种高通量测序方法,是以特定 环境的微生物作为研究对象。因细菌的基因组相对比较小,通常只有一条环状DNA 及质粒,其全部遗传信息都可以通过高通量测序法获得。我们可以将获得的微生物 遗传信息用于分析细菌的遗传进化,并在疾病的预防与治疗以及抗生素与疫苗的开 发及利用方面起到很好的帮助作用。因此,高通量测序技目前是微生物研究领域的 重要手段之一。

16srRNA测序技术,是最常用的高通量测序依赖的组学技术之一,是对肠道菌 群群落菌种的组成的分析。为了研究军中的特异性,以及菌种之间的亲缘关系远近, 我们发现细菌16S rRNA基因的特点为保守区和可变区间隔排列,可变区既拥有特异 性,还可以反映菌种之间的亲缘关系远近,是得到细菌分类学特征的有效可分析区 域。而16S rRNA基因序列就有9个可变区以及10个保守区,这使得16StRNA高 通量测序技术既拥有高通量的优势,又结合了 16S rRNA基因序列在菌种鉴定及分 析亲缘关系方面的优势,使我们能够鉴定复杂样品中混合菌种的菌种分类以及对其 进行精确的定量。实验基本流程包括,首先将实验样本中提取出的DNA进行扩增, 直至16SrRNA的某个可变区,随后选用高通量测序仪Miseq/Hiseq对该可变区进行 测序,再经过一些质控去燥等环节得到有效序列,最后可以进行各种生物信息分析, 从而得到该实验样品中细菌的物种组成、物种丰度、物种多样性等许多信息。

综上所述,肠道菌群及其代谢产物通过影响机体的代谢、免疫、神经系统和内分 泌稳态等,在高血压的发生发展中扮演着重要角色。因此,本课题通过利用16S rRNA 测序技术研究高血压患者及健康患者肠道菌群构成并分析两组在物种构成、菌群丰 度,菌群结构方面有无为显著差异,从而为解释高血压发生机制与肠道菌群之间的 联系提供理论基础。

高血压是一个全球性的公共卫生问题,也是全球疾病负担中最重要的危险因 素。高血压加重了心脏疾病、脑卒中以及肾衰竭等许多疾病的负担,严重影响着 全世界的人类⑴o预计到2025年,全球高血压患者总数将增加到15.6亿⑵】。尽 管采取了积极的措施来影响生活方式的改变,降压药物也在不断发展,但在世界 范围内仍有很大比例的患者难以将血压控制到推荐的目标值。因此,如何早期预 防和治疗高血压,开辟基于机制的新的治疗策略,寻找药物治疗的有效靶点,成 为该领域的研究热点与难点。近年来,大量研究结果表明,肠道菌群及其代谢产 物通过影响机体的代谢、免疫、神经系统和内分泌稳态等,在高血压的发生发展 中扮演着重要角色。本文就肠道菌群参与高血压形成机制的研究进展进行综述, 并探讨未来高血压治疗中肠道菌群作为潜在新靶点的可能性。

  1. 肠道菌群的概况

早在2000年时,里德伯格曾提出,细胞和所有共生微生物共同构成了我们的身 体,可以被称为是一个“超级生物体”,这是一个很复杂的生态系统⑵】。最新研究 表明,成人体内的细菌(3.8xl013)数量约为细胞(3.0x10®的1.3倍⑻,其携带 的基因比我们自己的基因组多150倍⑵】,它们与人体自身基因共同作用,影响着人 体的免疫、营养和代谢过程。人体中与外界环境接触的部位,如皮肤、呼吸道、肠 道、生殖道等,均有一定数量的菌群定植。但人体内细菌数目最多、最复杂的定殖 环境当属肠道,据估计大约有150克的微生物定殖于此【26】,构成了人体的肠道菌群, 是目前微生态研究的核心。肠道菌群由种类不同、数量庞大的微生物群体组成,它 们从出生开始建立,彼此相互联系,并与宿主细胞之间不断进行信息交换,互利共 生,在消化、生物拮抗、维持和增强肠道屏障、免疫防御、神经系统调节、营养和 代谢等多个方面起着至关重要的作用,因此有学者将它比喻为人体内部的“微生物 器官”⑵。总的来说,肠道菌群对机体的整体健康起着基础性的作用,其与机体之 间的平衡一旦被破坏,即肠道菌群失调,必然会影响多种疾病的发生发展。

  1. 肠道菌群参与血压调节的相关证据

(1)与健康对照组相比,高血压患者/大鼠有不同的肠道微生物组:①2015年, Yang等研究了自发性高血压大鼠模型、An g II诱发高血压大鼠模型以及一小群高 血压患者粪便中微生物的变化,发现与健康对照组相比,它们的肠道微生物丰富度、 多样性和均匀度均显著下降,Firmicutes/Bacteroidetes比率增加,同时也发现无菌小 鼠在Angll存在下不会发生高血压和血管功能障碍,以及口服米诺环素能够调节 Angll诱发高血压大鼠的血压【⑹。②2017年,李静等对56名高血压患者、99名新 诊断或未治疗的原发性高血压患者和41名健康对照组成员的粪便样品进行了全面的 宏基因组及代谢组学分析,发现高血压前期患者和高血压患者的肠道菌群比健康对 照组具有较低的基因丰富度和Q多样性。他们还发现从高血压受试者到无菌小鼠的 粪便移植可导致无菌小鼠的血压显著增加。③2018年,Shan Sun等调查了中青 年人冠状动脉危险因素研究(Coronary Artery Risk Development in Young Adults, CARDIA)中529名参与者的肠道微生物多样性测量及分类组成与血压之间的横断面 关联,认为为生物多样性与高血压和收缩压呈负相关,这是第一个基于人群的有关 肠道菌群与高血压相关性的队列研究⑵】。④2019年,第一个在肠道菌群领域基于 24小时动态血压监测的研究也支持肠道微生物与血压稳态之间的关联[281 o (2)从 SHR-SP (自发性高血压-易卒中型)大鼠模型到血压正常小鼠的粪便移植,可在正常 血压小鼠中诱导高血压【29】。(3)抗生素的使用能够调节动物模型中的血压【16、紗31】。

(4)益生菌微生物发酵产生的肠道代谢产物如短链脂肪酸具有改善心血管健康与功 能的作用且与较低的血压有关[32'331 o (5)肠道微生物组及其代谢产物的变化导致 肾脏和心脏的转录组范围发生变化,支持肠-心肾轴[331和潜在的脑-肠-骨髓轴⑵】o

  1. 肠道菌群作用于高血压的相关机制

高血压的发病机制很复杂,目前认为是在一定遗传易感性基础上多系统、多因 素综合作用的结果,包括交感神经系统活性亢进,肾素-血管紧张素-醛固酮系统 (Renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)激活,钠过多,以及免疫功能异常, 内皮功能障碍等的影响。肠道菌群及其代谢产物通过如下相关机制参与了血压的调 节。

3.1肠道菌群与中枢血压调控

血压受中枢调节的机制十分复杂,心血管中枢分布在脊髓到大脑皮层的各个水 平,在整体情况下,主要是依靠中枢神经系统(central nervous system,CNS)的整合 作用并通过自主神经系统来调节血压的。而“脑肠-轴”的概念最早由哥伦比亚大学 的神经学家迈克•格尔松教授提出,即由神经系统、肠道、肠道菌群共同配合,形 成的人体“第二大脑” o脑肠一轴是胃肠道功能和CNS进行相互作用的双向调节 轴,而肠道菌群的代谢产物以及由肠道菌群直接或间接产生的各种神经递质则构成 了其发挥双向调控的物质基础⑶,可被称为“菌群-肠-脑轴”。

3.1.1 短链脂肪酸(short-chain fatty acids , SCFAs)

人类缺乏能降解大部分膳食纤维的酶,这些不易消化的碳水化合物不受影响地 通过上消化道,在盲肠和大肠中经过厌氧微生物进行发酵并产生多组代谢物,其中 短链脂肪酸(SCFAs)是肠道菌群最主要的代谢产物⑶】。SCFAs包括甲、乙、丙、 丁、戊酸,其中乙、丙、丁酸占据总量的80%皿】,也是目前研究最广泛的三种脂肪 酸。

(1) SCFAs作用于短链脂肪酸受体

  • 了解高血压中宿主-微生物群相互作用的一个进步是确认了肾脏和血管中存 在特定的短链脂肪酸受体。Natarajan等【⑻证明了 G-蛋白偶联受体41 (G-protein coupled receptor 41,GPR-41)在血管内皮中表达,SCFAs通过调节内皮GPR-41降低 血压,与野生型小鼠相比,GPR-41基因敲除小鼠呈现收缩期高血压。另一种受体(在 小鼠中被称为OLFR78,在人类中被称为OR51E2)被发现定位于肾传入小动脉和外 周血管系统中的血管平滑肌细胞氐】。丙酸盐作用于OLFR78引起肾小球旁器分泌肾 素,导致血压升高【⑻。同样,OLFR78基因敲除小鼠在体内注入丙酸盐后表现为低 血压综上所述,SCFAs作用于GPR-41和OLFR78分别产生了降低血压和升高 血压两种相反的生理作用,这两种彼此平衡以避免血压的剧烈波动。
  • SCFAs受体OLFR78、GPR-43以及GPR-41也被发现存在于交感神经节上, SFCAs可以通过作用于交感神经节上表达的受体直接调节交感神经系统⑶、泅,并 可能通过迷走神经上表达的受体影响肠道的神经反馈,从而参与血压的神经调节机 制⑶】。
  • 丁酸盐还能够通过特定的转运蛋白穿过血脑屏障【4。、41、42】,这表明它有直接 作用于中枢的可能性。最近一项研究证明了下丘脑室旁核中SCFAs受体的存在,通 过侧脑室内注射丁酸盐可以显著降低自发性高血压大鼠和正常血压对照组大鼠的血 压【妙。另外,从血压正常的动物到高血压动物的粪便移植降低了血压,因血压正常 动物的粪便内富含丰富的产生短链脂肪酸的细菌,这一过程也增加了室旁核中 SCFAs受体Gpr41和Gpr43的表达,这些受体的激活与降低血压有关⑶】。

3.1.2血清素(5-HT)的释放

肠道交感神经系统活动(sympathetic nervous system, SNS)的增加导致上皮功能 障碍从而引起肠道失调,与生态失调相关的细菌代谢物失衡一一肠道菌群及其代谢 物(尤其是SCFAs)产生的变化及其在肠腔中的积累,使肠嗜銘细胞产生5-HT增加。 肠道中的5-HT能够通过5-HT R (5-HT受体)调节肠道迷走神经传入的活性,可 能抑制迷走神经肠-脑神经轴,而5-HT释放到循环中会影响脉管系统引起血管收 缩。此外,循环5-HT可以通过血液循环到达大脑的心脏调节区域,并穿过血脑屏 障。因此,增加的肠道SNS与减弱的迷走神经传入神经周围神经系统(peripheral nervous system , PNS)共同驱动肠-脑心脏调节区域(例如孤束核),有助于高血压 的持续存在⑶】。

  • 硫化氢(H2S)

H2S已被证明参与许多生物系统中的生物信号传导,还具有心脏保护,促血管 生成和细胞保护作用,并且H2S稳态的紊乱被认为与心血管疾病和代谢疾病的病因 相关【44、45、46】。硫酸盐还原菌(SRB)在哺乳动物的体内普遍存在,结肠微生物群代 表了体内H2S的最大来源。肠源性H2S穿过肠血屏障,绕过肝脏(直肠从),以心 脏和血管为目标,还可以刺激肠神经系统的感觉纤维,通过自主神经系统投射到控 制循环系统的大脑中枢,参与血压血压的调节【46】。但目前不能确定微生物来源的 H2S在多大程度上有助于人类血压的调节,该领域仍需进一步研究。

3.2肠道菌群参与免疫系统和炎症反应

全身免疫系统失调是高血压动物模型和人体中高血压的标志性变化,血压相关 脑区的神经炎症已在高血压动物模型中得到证实⑷】。大量临床和实验研究也已确定 全身炎症和高血压之间的联系欣】,固有免疫和适应性免疫系统促进单核细胞、T细 胞活化,渗入肾脏和血管周围空间并释放炎症因子,造成肾脏和血管功能障碍以及 上调的交感神经活动,从而进一步导致血压升高⑷。而肠道是体内最大的免疫器官, 肠道微生物群通过不同机制影响免疫系统和炎症反应来调控血压。

3.2.1 SCFAs影响肠道屏障

肠上皮,粘膜和紧密连接蛋白共同构成了肠道物理屏障,限制病原体和有害分 子进入体循环。肠道微生物群组成的变化会消耗粘液而不是纤维,导致上皮完整性 的丧失,从而造成管腔和邻近血管之间不受控制的渗透性【49】,诱导全身炎症,参与 高血压的发病机制。自发性高血压大鼠肠道生态失调的特征在于产生乙酸盐和丁酸 盐的细菌较正常血压对照组大鼠减少【⑹。已有研究表明,SCFAs除了向肠上皮和外 周组织提供能量之外,还可通过激活Gpr43促进肠上皮完整性并助于修复损伤的上 皮。Kim等发现给予A n g II诱发的高血压小鼠组丁酸盐治疗,可降低平均动脉 压并逆转微生物失调及肠屏障功能障碍⑸】。肠道细菌代谢产物通过调节粘膜屏障和 免疫机制发挥局部保护作用来促进宿主健康。丁酸盐等短链脂肪酸具有强大的免疫 抑制活性。在中枢,它们能在小胶质细胞和星形胶质细胞中产生抗炎和代谢作用, 其激活与高血压的中枢神经调节/神经炎症作用有关。

3.2.2高盐饮食

大量证据表明,高盐饮食是高血压和心血管疾病的主要危险因素⑴、53】,临床和 实验研究已确定炎症和高血压之间的联系©、55】——在高血压刺激下,T细胞渗入肾 脏和血管周围空间并释放炎症因子,促进肾脏和血管功能障碍,从而进一步导致血 压升高氐、57、58】。最近研究表明,过量的盐可能通过作用于肠道微生物组而促进炎 症反应并诱导高血压的发生⑼、20】。Jane F等人为了确定高盐饮食是否与人类的生态 失调和伴随的血压升高有关,以美国心脏协会推荐的每日最大2.3g钠摄入量为参考, 分析了正常及高钠饮食受试者的肠道微生物组成,以及喂食正常盐饮食及高盐饮食 小鼠的肠道菌群,发现高盐饮食增加Firmicutes细菌的肠道定植,导致Firmicutes / Bacteroidetes比例的升高。据报道,该比例在肥胖和代谢综合征的实验动物和人 类受试者中也均有增加⑹、61】。在Firmicutes fl的成员中,高盐富集的细菌主要为 Lachnospiraceae科,属于梭菌目和梭菌纲,这个细菌家族与肥胖和糖尿病有关⑹】。 同时,在老鼠和人类的肠道中,还发现高盐饮食导致普雷沃菌(Prevotella spp)的定 植,此菌与慢性炎症相关,包括牙周病心】和类风湿性关节炎心】,上诉疾病都是高 血压和心血管疾病的重要危险因素。Jane F等人还发现,高盐饮食会显著消耗肠道中 的乳酸杆菌,而这种细菌被证实具有免疫调节特性,一项用鼠乳杆菌治疗小鼠的研 究发现其可预防盐敏感性高血压⑵】。同时,肠粘膜作为饮食中钠的主要吸收部位, 摄入过量的钠通过胃肠壁直接吸收,通过磷酸化及酶的激活等过程形成IsoLG蛋白 加和物并直接激活树突状细胞,这些被激活的树突状细胞驱动T细胞产生细胞因子, 这些细胞因子可以改变肠道菌群,并以前反馈的方式导致炎症和高血压a】。

  • 氧化型低密度脂蛋白(Oxidized Low density Lipoprotein,Ox-LDL)
  • 除调节各种受体外,肠道菌群失调还通过Ox-LDL介导的血管收缩而导致 高血压。菌群失调具有促进促炎性细胞因子表达的潜力并诱导氧化应激,导致较高 水平的Ox-LDL产生【⑹。血管舒张剂NO由NO合成酶作用于L-精氨酸形成,Ox-LDL 通过抑制NO合酶的从而降减少NO的产生来降低血管舒张程度,导致高血压欣】。
  • Ox-LDL还可刺激内皮素-1的产生增加,不过内皮素-1在血管上的活性与 Ox-LDL浓度有关。低浓度时,内皮素-1是血管扩张剂,通过激活内皮素受体B促 进NO的释放从而促进血管舒张。然而当Ox-LDL积累表现为高浓度时,会刺激较多 的内皮素-1产生,作用于内皮受素体A而诱导血管收缩,产生高血压作用⑷】。
  • 氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide,TMAO)

人体内的肠道微生物菌群以卵磷脂、肉碱、胆碱等为原料,可生成三甲胺 (trimethylamine,TMA),TMA通过门静脉进入肝脏后,被黄素单加氧酶活化成TMAO。 研究发现TMAO加重小鼠心力衰竭,通过调节胆固醇和固醇代谢在动脉粥样硬化的 发展中发挥作用[681 o Marcin等[691研究发现,单独注射TMAO的SD大鼠未出现血 压升高,但当与低剂量的血管紧张素II联用时可延长血管紧张素II的高血压效应。 但TMAO与高血压的直接关系仍有待进一步证实。

  1. 未来展望

在很短的时间内,关于肠道微生物群在高血压发病机制中的作用有了令人兴奋 和迅速的进步。菌群失调的治疗可以作为传统降压治疗方法的补充。一项荟萃分析 表明,当食用多种益生菌、治疗持续时间至少为8周或每日食用量至少为IO"个菌 落形成单位时,它们可以适度降低血压,在高血压的情况下效果更大【70】。此外,在 高血压模型中,宿主饮食中摄入纤维或补充纤维发酵产生的肠道代谢物可以调节血 压。尽管益生菌,如乳酸杆菌的摄入,甚至粪便微生物群移植似乎是一个有吸引力 的血压替代疗法,但目前尚不清楚它们是否会使患者受益⑺】。特定的益生菌物种可 能对某些患者有益,但并非对所有人都有好处。几乎100%的亚洲人和非洲人携带乳 酸杆菌,而在西方社会人口中很少见到乳酸杆菌匕2】。然而,饮食、肠道菌群和宿主 之间的相互作用正在成为帮助克服高血压和心血管疾病的全球负担的潜在治疗选 择。因此,应该详细了解肠道微生物与血压、种族等诸多因素的关系,全面了解益 生菌在高血压治疗学的发病机制和治疗中的作用。总之,研究肠道菌群开辟了一种 全新的方法来理解和治疗高血压,这一新兴领域需要进行更多的研究及大规模临床试验。

第一部分

1材料

1.1研究对象

1.1.1病例选择

选取2018年12月-2019年5月于陕西省人民医院心血管内一科住院的高血压患 者及门诊健康体检者共14人。

  • 纳入标准:

高血压组:高血压患者9人(男性5例、女性4例,年龄分布在45-75岁之间)。 高血压诊断标准:根据WHO诊断标准,收缩压(SBP) 140mm Hg和/或舒张压

(DBP) ^90mm Hgo

对照组:门诊健康体检者5人(男性2例、女性3例,年龄分布在45-75岁之间)。

  • 排除标准:
  • 被采集者近4周内使用过任何益生菌、制酸剂、抗生素或抗微生物制剂;
  • 患有炎症性肠、肠易激综合征等影响肠道菌群的疾病;
  • 消化系统患有任何器质性疾病或曾进行过手术;
  • 患有糖尿病及冠心病、心律失常、心力衰竭等其他心血管疾病;
  • 有长期吸烟史、酗酒史、服药史等影响肠道菌群的其他问题;
  • 年龄V18岁及>75岁者。

1.1.2基本资料米集

病史采集资料包括年龄、性别、个人史、居住地、患病史及临床症状、药物使 用史。

1.1.3医学伦理注册

本课题经陕西省人民医院伦理委员会审核同意,在收集患者医疗信息及粪便标 本时已与患者及家属充分沟通表示同意,详细告知患者获益与风险。

2方法

2.1样品采集

经研究对象同意后,嘱其在排便前先排尽尿液,保证新鲜粪便免受尿液、消毒 剂等污染,分别收集高血压组和对照组研究对象住院后第一天清晨成形粪便(样本 量约5g),置于50ml无菌粪便采集器中,取材过程为无菌操作。粪便标本放置在无 菌低温环境下,并于2小时内送往实验室-80摄氏度冰箱内储存,以便后续分析。

2.2DNA提取和检测

  • 总 DNA 提取:采用 Z.N.A.® Soil DNA Kit 试剂盒。
  • DNA检测
  • DNA纯度和浓度检测:采用NanoDrop2000超微量分光光度计。
  • DNA完整性检测方法:1%琼脂糖凝胶电泳,电压5V/cm,时间为20 min。
    • PCR扩增

引物对应区域:16SV3-V4区

上游引物 338F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG

下游引物 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT

  • PCR产物鉴定、纯化及定量

2.5构建PE文库及Illumina测序

  • Miseq文库构建

使用 NEXTFLEX® Rapid DNA-Seq Kit 进行建库。

  • Illu mina 测序

利用Illu mina公司的Miseq PE300平台进行测序。

2.6生物信息分析

测序完成后,每例样品的测序序列可达几万条,如果每条都进行物种注释,工 作量大且易出现错误,因此,在微生物多样性研究中,为了方便分析,引入了 OTU (Operational Taxonomic Units)的概念,即操作分类单元。并且我们会对原始测序 数据进行相关处理,得到的数据将再次进行相关过滤,从而保证OTU聚类和后续分 析的精准性,然后基于得到的有效数据进行OTU聚类以及去噪。我们使用的是 QIIME2推荐的DADA2方法来去噪去嵌合,相较QIIME1的UPARSE等聚类方法得 出来的结果,DADA2比上一代分析的结果更准确。因为不再按相似度聚类,所以生 成的代表序列不再是OTU。更准确的来说,在本论文中提到OTU应被称为扩增特征 序列(ASV:Amplicon Sequence Variant 或者 Feature sequence)但为了方便理解, 我们在论文中将以OTU来代表这个扩增特征的代表序列,这也是目前研究扩增子领 域研究人员通用的做法。

随后,选取OTU的代表性序列,按99%序列相似性聚类与核糖体RNA数据库 (Greengenes Database 13_8版本)进行比对,以此获得物种注释信息,并在此基础上去 除无法注释到界级别以及注释为线粒体、叶绿体的OTU及其包含序列。根据得到的 OUT注释信息以及绝对丰度,统计在界(Kingdom)、门(Phylum) >纲(Class)、 目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(Species) 7个分类上的序列数占总 体的比例,以此评估样本的物种注释分辨率,并绘成物种丰度谱。最后,根据上述 得到的OUT物种丰度谱,我们通过对各分类水平上群落结构进行统计分析,并通过 Alpha多样性、Beta多样性分析、系统进化分析以及关联统计分析等方式对OUT物 种丰度谱(数据均一化后)进行分析统计,评估样本间物种丰富度、多样性以及结 构差异,该可以对肠道菌群的群落功能进行预测分析。

3.结果

3.1 般资料统计

两组间一般资料在SPSS 19操作系统中利用独立样本t检验和卡方检验,以P< 0.05表示有显著统计学差异。表中P>0.05,表明两组在年龄、性别间无显著差异。

表1.基本信息统计结果
  高血压组(n=9) 健康对照组(n=5) P值
年龄(岁) 53.89 土 7.96 58.00 土 7.51 0.364
性别(男/女) 5/4 2/3 0.577

3.2测序结果

3.2.1生成OUT结果

我们对两组样本中的原始序列(input)是用Qiime2软件中的DADA2插件进行 质量控制(filtered),去噪(denoised),拼接(merged),然后去除嵌合体(non-chimeric), 形成OTU。表2中的数据为使用DADA2对原始序列进行上述各个步骤之后剩余序 列数目统计表格。

表2.序列数目统计表格

sample-id input filtered denoised merged Non-chimeric
B1028770 39691 35196 35196 32294 26598
B1032728 49710 43923 43923 39997 30911
B1032866 50268 44628 44628 42556 32389
B1038570 50400 44844 44844 43218 41560
B1038952 48122 42668 42668 41656 37760
B1039600 67213 58721 58721 53210 40190
B1039857 51304 46032 46032 43425 34620
B1040049 53988 48277 48277 43288 33999
B1040883 56908 50550 50550 44925 35511
B787942 62222 55174 55174 50016 37020
C1028345 58288 51848 51848 45913 34743
C1028380 47988 42418 42418 41767 38427
C1036618 52098 46199 46199 44444 36712
C1039921 42790 38109 38109 37766 36543

322肠道菌群稀释性曲线

随机从某个样本中得到的所有序列中抽取序列,数目同样也是随机的,然后统

计抽取出来的序列有多少个OTU,这代表了有多少个物种,然后绘制曲线(横坐标

为抽取的序列数目,纵坐标为相应的OTU数目),被称为稀释性曲线。其可用来对
测序不同的样本中的物种丰富度进行比较,并且可以评估样本中测序数据的量是否 足够,还需不需要再加测数据。稀释性曲线的尾端接近平缓,则说明对该样本来说, 测序的数据量合理,反之,则说明测序深度不足以覆盖大多数菌,继续进行测序还 有产生更多新OTU的可能。图1为评估本次测序量是否达到分析要求所绘制的样品 稀释性曲线。可以看出,随着取样量增加,曲线末端趋向平坦,说明测序数据量合 理,基本达到样本测序深度,可满足后续生物学分析。

—B1032728—B1028770

—B1032866

—B1038570

—B1038952

—B1039600

—B1039857

—B1040049

—B1040883

—B787942

—C1028345

—C1028380

—C1036618

—C1039921

(B1039857及C开头样本为对照组;其余为高血压组)图1.稀释性曲线

3.2.3样品共有物种韦恩图分析

如图2所示,高血压组(A)和对照组(C)共14个样品,共产生748个OTU, 其中共有的OTU为192个,两组特有的OTU分别为383和173个,两组之间具 有差异性,达到归类分析的要求。

图2.样品共有物种韦恩图

3.3物种组成及其丰度分析

图3代表各个样品在各分类水平上的序列注释程度。该柱状图以样品名(Sample Name)为横坐标,以表示注释到该水平的序列数目占总注释数据的比率为纵坐标 (Sequence Number Percent),从上到下的颜色顺序对应右边的图例颜色顺序。每个分 类水平最高值为1,代表100%的序列都至少得到了这个级别的注释。我们在本文的 微生物分析中主要以门水平和属水平级别分析为主。

3.3.1高血压组与对照组肠道菌群在门水平上的比较
图3:各个样品在各分类水平上的序列注释程度柱形图

3.3.1.1门水平物种组成分析

结果见图4,图5。以样本名/分组名为横坐标,以注释到该门水平的序列数目占 总注释数据的比率为纵坐标,从上至下的颜色顺序对应于右边图例的颜色顺序。该 图中只显示最优势的20个菌种,在门水平,没有注释的序列被归为unclassified类。 从图中可得出,高血压组和对照组均以厚壁菌门(Firmicutes )、变形菌门 (Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及放线菌门(Actinobacteria)为主, 还包括少量的疣微菌门(Vermcomicrobia)、软壁菌门(Tenericutes)、TM7门、梭 杆菌门(Fusobacteria)、互养菌门(Synergistetes)> 蓝细菌门(Cyanobacteria)、酸杆
困门(Acidobacteria)、绿弯困门(Chloroflexi)以及Themii门。由图可见,咼血压 组的厚壁菌门(Firmicutes)丰度大于对照组,而对照组的变形菌门(Proteobacteria)、 拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度高于高血压组。

uncl35si^d

IhMii

rafted

A冈曲比隔

CyanobaciBna

Synergisieies

Fusobaderia

TM7 lenericutes

WucoffiitTfibia

Actinobadsiia 翩脚闔则$ PnHeabacteria

图5.门水平物种组成分析 (横坐标为A:高血压组;C:对照组)Sample

图4.门水平物种组成分析图(横坐标为样品名)

3.3.1.2门水平组间OTU差异显著性分析

为了比较组间物种是否具有显著性差异,在微生物领域,我们常用 ANCOM(Analysis of composition of microbiomes)分析方法。ANCOM 分析因其不受相 对丰度分析的限制,并且不依赖数据的分布假设,因此可以有效地降低结果中的假 阳性。在ANCOM分析中,W值是一个衡量组间差异显著性的统计量(类似t值或 f值),W值与该物种在组间的差异显著性成正比。以ck值(组间样本的丰度差异 程度)为横坐标,以W值为纵坐标绘图,每一个被比较的物种都显示在图中的每一 个点上,数字越高代表相对丰度差异越大。所以,越接近右上角的点,则代表着该 物种与其他物种(大部分集中在左下角)相比,更具有显著性差异,如图6所示。 ANCOM分析中,W值为动态标准,程序会进行动态调整自动生成有显著差异的物 种列表,如图7所示。门分类水平上,高血压组和对照组之间没有存在有显著差异 的物种。

-1.0 -0.8 -0 6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 08 1.0- 1.2 1.4

clr

图6:门水平ANCOM分析图

ANCOM statistical results

No significant features found

图7:门水平ANCOM分析结果

3.3.2高血压组与对照组肠道菌群在门以下水平上的比较

3.3.2.1门以下水平物种组成分析

门以下水平物种(以属水平为例)组成结果见图8,因分类种类过多,在此不一 一列出。结合3.2.2.2中组间OTU差异显著性分析寻找有无在高血压组和对照组中存 在显著差异的纲/目/科/属水平的微生物。

图8.属水平物种组成分析(A:高血压组;C:对照组)

3.3.2.2门以下水平组间OTU差异显著性分析

组间OTU差异显著性分析有多种方法,除3.2.1.2中门水平所用ANCOM分析

方法以外,还可用LEfSe的统计方法,其寻找每一个分组的特征微生物(默认为

LDA>2的微生物),也就是相对于其他分组,在这个组中丰度较高的微生物,LEfSe 是非参数检验和线性判别分析的结合,适合菌群丰度差异检验。这两种显著性差异 比较方法各有优劣并且对结果可能会有不同的解释,是属于合理的现象。

图9为属水平ANCOM分析图,W值为动态标准,程序会进行动态调整自动生 成有显著差异的物种列表,如图10所示。根据ANCOM分析,属分类水平上,高血 压组和对照组之间没有存在有显著差异的物种。

ANCOM statistical results

No significant features found

图10.属水平ANCOM分析结果

图11为属水平LEfSe分析LDA柱形,每一横向柱形体代表一个物种,柱形的

颜色对应该物种是哪个分组的特征微生物,柱形体的长度对应LDA值,LDA值越

高(LDA>2)则差异越大。由此可得出,高血压组中,红蜡菌纲(Coriobacteriia)、 红虫春菌科(Coriobacteriaceae )、红蜻菌目(Coriobacteriales )、柯林斯氏菌属 (Collinsella) > Alistipes菌属、理研菌科(Rikenellaceae)丰度显著高于对照组,对 照组中,乳酸球菌属(Lactococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Finegoldia菌 属、肠球菌属(Enterococcus)、肠球菌科(Enterococcaceae)、组织菌科(Tissierellaceae) 丰度显著高于高血压组。

图11.属水平LEfSe分析LDA柱形

3.4多样性分析

3.4.1 Alpha多样性分析

为了研究某个特定区域,或者生态系统内的生物多样性,我们常用Alpha多样 性分析来评估其物种丰富度以及均匀度。丰富度通过种类数目来反映,而多样性可 通过群落中个体分配上的均匀性来类比。通常,我们用Shannon (样品中的分类总数 及每个分类所占的比例)和Simpson (某个区域的定量生物多样性)指数来评估某个 样本的物种多样性,指数越高,表示样本的多样性越复杂。用ObservedOTU (样本 中实际测定得到的OTU数量)和chaol (物种的种类数量)指数来反映物种丰富度, 指数越大,表明群落的丰富度越高。两组样本的Alpha多样性分析指数列表如表3 所示。

表3. Alpha多样性分析指数列表

  observed otus chaol shannon simpson
B1028770 129 129 4.777687 0.899136
B1032728 131 131 4.352294 0.872123
B1032866 67 67 4.059405 0.889081
B1038570 170 170 5.528891 0.962714
B1038952 80 80 4.134039 0.8665
B1039600 171 171 5.710127 0.965595
B1039857 99 99 5.202475 0.958182
B1040049 154 154 5.589652 0.960081
B1040883 121 121 5.165026 0.948131
B787942 145 145 5.067064 0.939312
C1028345 155 155 5.251468 0.945757
C1028380 78 78 3.67541 0.858661
C1036618 86 86 4.582295 0.921112
C1039921 77 77 3.774589 0.861951

在得到整体的Alpha多样性指数之后,接下来结合分组信息来用Kruskal Wallis 方法比较在各个样品分组之间Alpha多样性指数是否有显著性差异,以P<0.05表示 有显著统计学差异,可推断组间菌群多样性存在显著差异。结果如表4所示,表中P 值均>0.05,表明高血压组和对照组在肠道菌群丰富度及多样性方面均没有显著差异。

表4.组间Alpha多样性指数统计表

  Group1 Group2 H P
Chaol A (n=9) C (n5) 1.604444 0.205275
ObservedOTU A (n=9) C (n5) 1.604444 0.205275
Shannon A (n=9) C (n5) 1 0.317311
Simpson A (n=9) C (n5) 1 0.317311

3.4.2 Beta多样性分析

接下来我们还需要对两组样本间的微生物群落构成进行比较,这需要用到Beta 多样性分析。其是基于样本的OUT丰度信息来计算Bray Curtis, Weighted Unifrac 和Unweighted Unifrac距离,从而评估不同样品间的微生物群落构成差异。并通过上
述计算出的3个距离来进行PcoA分析,即选取贡献率最大的主坐标组合进行作图, 结果如图12所示,图中样本的距离越接近,表示样品的物种组成结构越相似。

表5.组间Beta多样性指数统计表
在得到整体的Beta多样性指数之后,接下来结合分组信息来用PERMANOVA 方法比较在各个样品分组之间的微生物组成结构是否有显著性差异,以P<0.05表示 有显著统计学差异,可推断组间菌群结构存在显著差异。得到的结果如表5所示, 表中P>0.05,表明高血压组和对照组在肠道菌群结构方面没有显著差异。

Group1 Group2 Sample size Permutations pseudo-F P
A C 14 999 1.373313 0.211

4.讨论

本研究中,对高血压组和对照组粪便样本进行16S rRNA测序,共得到730990 条原始数据,使用Qiime2软件中的DADA2插件对全部原始序列进行质量控制、去 噪、拼接以及去嵌合体后,共得到496983条有效序列,随后对所有样品的全部的有 效序列进行聚类/去噪,共得到748个OUT,其中两组共有的OUT为192个,两 组特有的OUT分别为高血压组383个,对照组173个,两组之间具有差异性,达 到归类分析的要求。同时,根据肠道菌群稀释性曲线分析可得出,随着取样量增加, 曲线末端趋向平坦,说明测序数据量合理,基本达到样本测序深度,可满足后续生 物学分析。

通过分析比较高血压组和对照组的物种组成及其丰度,我们发现在门水平,高 血压组和对照组均以四个门为主,依次为厚壁菌门(Finnicutes)、变形菌门 (Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及放线菌门(Actinobacteria),同 时还包含少量的疣微菌门(Verrucomicrobia)、软壁菌门(Tenericutes)、TM7门、 梭杆菌门(Fusobacteria)、互养菌门(Synergistetes)> 蓝细菌门(Cyanobacteria)、 酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及Thenni门。高血压组与对 照组两组中厚壁菌门和拟杆菌门为两组优势菌门,这与目前有关人类肠道菌群的相 关研究结果,即厚壁菌门与柠菌门占绝对优势,且厚壁菌门占主导,拟杆菌门次之 一致。其中高血压组的厚壁菌门(Firmicutes)丰度大于对照组,对照组的变形菌门 (Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度高于高血压组,不过差异均无统 计学意义。

而在门以下水平我们发现,高血压组中,丰度显著高于对照组的肠道菌群依次 为:红虫春菌纲(Coriobacteriia)、红虫春菌科(Coriobacteriaceae )、红虫春菌目 (Coriobacteriales)、柯林斯氏菌属(Collinsella) 、 Alistipes 菌属、理研菌科 (Rikenellaceae)在对照组中,丰度显著高于高血压组的肠道菌群依次为:乳酸乳 球菌属(Lactococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、Finegoldia菌属、肠球菌属 (Enterococcus)、肠球菌科 (Enterococcaceae)、组织菌科 (Tissierellaceae)。

4.1高血压组菌群分析

在高血压组中丰度显著高于对照组的柯林斯氏菌属,属于红蜻菌纲。一项有关 类风湿关节炎患者肠道菌群特征的研究发现类风湿关节炎患者肠道菌群中柯林斯氏 菌丰度增加,其参与疾病发病的一个机制是通过降低紧密连接蛋白的表达而增加肠 道通透性。此外,柯林斯氏菌还影响IL-17A和趋化因子CXCL1和CXCL5的上皮生 成,这可能导致中性粒细胞的募集和NFkB的激活,而NFkB被观察到与肠道病理 生物的病理效应有关。柯林斯氏菌诱导Thl7细胞因子的系统性表达有助于阐明其在 关节炎中的作用,此项研究的数据还表明,柯林斯氏菌通过直接降低紧密连接蛋白 ZO-1的表达,以及通过产生特定的代谢物,导致肠道通透性增高。支持这一点的是, 柯林斯氏菌的丰度与高水平的丙氨酸、Q-氨基己二酸和天冬酰胺密切相关。a- 氨基己二酸是人类胶原自身免疫和年龄相关变化的标志,天冬酰胺则是参与三按酸 循环和阻止细胞凋亡的非必需氨基酸⑴]。已有研究表明,全身免疫系统失调正是高 血压动物模型和人体中高血压的标志性变化,柯林斯氏菌诱导炎性因子的生成和释 放,以及增加肠道通透性,都会激活固有免疫和适应性免疫系统,促进单核细胞、T 细胞活化,造成肾脏和血管功能障碍以及上调的交感神经活动,最终导致血压升高 [37]o另外,相关研究发现,柯林斯菌属在2型糖尿病患者的肠道内的含量较糖尿病 前期和非糖尿病人群高。还有研究通过鸟枪测序鉴定肠道基因组,发现柯林斯氏菌 属在有症状的动脉粥样硬化患者中富集。

4.2对照组菌群分析

在对照组中,丰度与高血压组相比有显著差异的是乳酸乳球菌属和韦荣氏球菌 属,这两个属均归属于厚壁菌门。乳酸乳球菌属为球形的革兰氏阳性G(+)细菌,是 乳酸菌属中的一种重要模式菌。部分菌株可分泌细菌素(Bacteriocin)抑制害菌生长, 维持肠道菌丛平衡,帮助其他益生菌生长,维护人体肠道健康。而韦荣氏球菌在人 和动物的与外界相通的管腔中(如口腔、咽部、呼吸道、消化道以及阴道)大量存 在,是革兰氏阴性厌氧菌,属于正常菌群。相关研究发现,如果革兰氏阳性菌移植 在牙齿上,韦荣氏球菌将随之移居并消耗乳酸,故推测该菌可能在减少鯛齿方面起 到了有益作用。一项有关乳酸利用菌的研究通过从人类粪便中分离到的一株可以高 效利用乳酸的菌株FY8,在对其进行鉴定后,发现该菌株的16S rRNA基因序列与 小韦荣球菌亲缘关系最近。对菌株FY8进行纯培养时,发现其可以有效地消耗乳酸, 并生成乙酸和丙酸等短链脂肪酸;当将菌株FY8与肠球菌进行共通培养时,发现肠 球菌产生的乳酸可以被其高效地利用,因此显著地减缓了乳酸在培养基内的聚积。 在这项研究中,菌株FY8有着与口腔中的可韦荣氏球菌相似的基因序列以及代谢特 征,故推测在肠道内大量存在的韦荣球菌以及相关乳酸利用菌可以有效地消耗乳酸 来防止其在肠道内的堆积,从而维持了肠道内乳酸动态平衡阳]。

4.3两组菌群多样性分析

为了研究两组实验对象在肠道菌群的丰富度、多样性以及群落结构上有无显著 差异,我们对样本的OUT进行了 Alpha多样性和Beta多样性分析,结果显示两组研 究对象在肠道菌群丰富度、多样性及群落结构方面均没有显著差异。这与目前动物 实验及临床试验中发现的高血压大鼠/患者肠道菌群与健康对照组相比,在丰度、多 样性群落结构上均有显著差异的研究结果不一致。

分析原因可能为:①本研究纳入样本量较小,不排除结果偏倚;②体重指数低 于或高于某个范围(由于微生物组和肥胖症之间的关联,通常V18或〉30)以及种 族等因素未纳入排除标准;③与降低血压相关的主要饮食因素包括减少钠的摄入, 增加钾的摄入,体重减轻,以及食用富含水果、蔬菜、全谷类、谷类和坚果的食物, 除了钾以外,所有其他食物都会改变肠道菌群的组成。除了一般的饮食摄入,这些 因素需要在肠道菌群研究中密切监测。因此,选择合适的测量工具来评估饮食摄入 是很重要的,本研究对于两组研究对象的饮食情况并未做过多调查或干预;④在粪 便标本的收集及储存方面,因为粪便标本一旦收集,储存条件便构成了一个菌群可 变性的环境来源,为了避免这种情况,应将样品快速冷冻并储存在-80。C,直到提 取出DNA,与此不同的情况可能会导致微生物分布的差异。

综上所述,本研究结果提示高血压患者存在肠道菌群的改变,且高血压患者肠 道内致病菌多于健康人群,肠道菌群参与了高血压的发生发展,为进一步研究高血 压患者肠道菌群变化的特点,肠道菌群作用于血压调节的相关机制以及肠道菌群作 为高血压治疗靶点的潜力提供了理论依据。

结 论

  1. 研究结论

本研究通过对9例高血压患者及5例健康对照组患者的肠道菌群进行16S rRNA 测序技术分析来研究高血压患者肠道菌群变化的特点,得出以下结论。

  • 高血压组和对照组肠道菌群均以四个门为主,依次为厚壁菌门(Firmicutes)、 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及放线菌门(Actinobacteria), 其中厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门为优势菌。
  • 高血压组中丰度显著高于对照组的柯林斯氏菌属(属于红蜻菌纲),为致 病菌。而对照组中丰度较高的乳酸球菌属和韦荣氏球菌属,均属于厚壁菌门,为正 常菌群,维护人体肠道健康。高血压患者存在肠道菌群的改变,且高血压患者肠道 内致病菌多于健康人群,肠道菌群参与了高血压的发生发展
  • 两组研究对象在肠道菌群丰富度、多样性及群落结构方面均没有显著差异。
  1. 研究展望

有大量证据表明,饮食、肠道微生物群和免疫系统在高血压的发病机制中都有 作用⑵,但这些潜在的保护性(即纤维)或高血压(即脂肪和钠)因素之间复杂的 相互作用仍不清楚。未来的干预研究需要解决组合可能是添加剂的膳食元素的效果, 例如,通过增加抗性淀粉或其有益的肠道代谢物,来减少钠的摄入以及它对炎症、 免疫和微生物的影响。目前,我们缺乏证明高血压表型之间微生物特征的证据,比 如白大衣、原发性高血压和隐性高血压,以及在这种情况下,降压治疗和性别如何 影响肠道微生物群,但是想要得出这样的结论需要大量的队列研究,类似于全基因 组关联研究,需要全球共同努力招募高血压患者,并对其肠道微生物群进行正确完 善的检测,从而确定微生物群对血压调节的贡献以及微生物群在免疫调节中的作用。 最后,我们只触及高血压患者肠道微生物群的表面,因为大多数研究只分析细菌 16srRNA基因。毫无疑问,未来的研究将不仅确定特定的细菌株和群落,而且还将 确定古细菌、病毒(特别是噬菌体)和真菌在高血压发病中的作用。

肠道菌群失调的治疗可能是传统降压治疗的有益补充。益生元和益生菌与胆固 醇的产生、炎症、血糖水平、降低血压的肾素-血管紧张素系统以及随后的高血压风 险有关。使用益生元和益生菌调控肠道微生物群对于传统抗高血压药物治疗可能是 一个有价值的工具。一项荟萃分析表明,当食用多种益生菌、治疗时间至少为8周 或每日食用量至少为IO】】个菌落数时,可适度降低血压,并在高血压的情况下效果 更大灯0】。很显然,重要的是更好地了解人群中肠道菌群的可变性以及这种可变性与 特定微生物活动的关系。特定的益生菌物种可能对某些患者有益,但并非对每个人 都有好处。几乎100%的亚非人口携带乳酸杆菌,而生活在西方社会的人体内则很少 发现乳酸杆菌⑺】。然而,要全面了解益生元和益生菌在高血压的发病机制和治疗中 的作用,就必须对与血压、种族和其他许多因素有关的肠道微生物组成进行详细的 了解,并辅以动物实验加以验证。

总之,研究肠道菌群开辟了一种全新的方法来理解和治疗高血压,这一新兴领 域需要进行更多的研究及大规模临床试验。

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致谢

在论文完成之际,三年的研究生生活即将结束了,回想三年来的学习和生活, 收获颇丰。在此向所有关心、帮助和支持我的老师们和同学们表示最真挚的感谢。

感谢我的导师姬新才老师。三年来姬老师在学习、生活和工作中给了我很大的 帮助。导师学识渊博、医术精湛、医德高尚,谦虚的为人,都是我以后为人处世的 楷模。在此表示我真挚的敬意和衷心的感谢。

感谢陕西省人民医院心内一科的王军奎老师和刘富强老师。从选题、开题到论 文的顺利完成都凝聚着王老师和刘老师的心血,指引我们研究方向的同时培养我们 独立思考问题的能力和严谨的科学态度。

感谢陕西省人民医院各科的全体老师,感谢他们不遗余力地授予我知识,在学 习、工作和生活上的无私帮助和支持。

感谢我的同窗王琳、杨芾,还有各位师姐、师妹们,感谢她们在日常生活中的 帮助和包容,在我困难的时候给予我帮助,我会铭记咱们在一起的学生时代。

感谢我的家人们,感谢他们对我无条件的关心、理解和支持,我将会带着家人 们的希望继续前进。

最后,我要感谢百忙之中参与我论文答辩的各位老师,感谢各位老师给我上完 研究生期间的最后一课,为我的硕士生涯画上了圆满的句号。