长春地区遗传性耳聋高危人群聋病易感基因筛查分析论文

2020年9月21日13:51:15长春地区遗传性耳聋高危人群聋病易感基因筛查分析论文已关闭评论

长春地区遗传性耳聋高危人群聋病易感基因筛查分析论文

中文摘要

目的:

对吉林省长春地区遗传性耳聋高危人群进行聋病易感基因筛查,了解该地区 聋病基因热点突变位点和突变频率,并给予相应的生育指导及建议,以探讨减少 该地区耳聋患儿出生的防治策略。

方法:

经过知情同意后,收集长春地区的遗传性耳聋高危人群和正常对照人群,分 流程别设为高危组和对照组。高危组共109例,对照组40例。高危组中:耳聋 患者共71例,均为中重度感音神经性聋患者;听力正常者38例,均为三代以内 近亲属有耳聋遗传家族史但听力正常者(主要为上述患者家属)。对照组均听力 正常,且无耳聋家族史。收集病史,行相关检查,采集静脉血后提取DNA并扩 增,再应用基因芯片检测受试者4个耳聋相关基因上的15个热点突变位点,包 括:GJB2 (35 del G、176 del 16、235 delC、299 delAT) , SLC26A4 (IVS7-2A>G, 2168A>G, 1174 A>T, 1226 G>A, 1229 C>T, 1975 G>C, 2027 T>A, IVS15+5 G>A),线粒体 12S rRNA (1494OT, 1555A>G)和 GJB3 (538C>T)。利用 微阵列芯片扫描仪扫描读取并判别相应耳聋基因。对于检测到突变基因及位点的 家庭或个人提供遗传咨询,对检测阴性者给出相应解释和建议。最后对所得数据 进行统计及分析。

结果:

对照组共40例,共检出2例阳性结果,检出率5%(2/40), 1例携带SLC26A4 单杂合突变,1例同时携带GJB2和SLC26A4基因单杂合突变。高危组共109 例,包含耳聋患者71例和正常听力者38例,分别占65.1%和34.9%。高危组共 检出43例阳性结果,总检出率39.4%o耳聋患者中检出率45.1% (32/71)其 中,GJB2 基因突变 12 例(16.9%) : 235delC 纯合突变 7 例,235delC> 299 delAT 复合杂合突变2例,235delC单杂合突变3例;SLC26A4基因突变20例(2&1%): IVS7-2 A>G纯合突变3例,IVS7・2A>G、1229OT复合杂合突变1例, IVS7・2A>G、2168A>G复合杂合突变1例,IVS7・2A>G单杂合突变10例,2168 A>G单杂合突变2例,2027T>A单杂合突变2例,1226 G>A单杂合突变1例; 线粒体基因突变4例(5.6%) : 1555A>G同质性突变2例(2.8%) , 1494OT 同质性突变2例(2.8%) ; GJB3基因突变1例(1.4%),为538OT单杂合突 变。高危组听力正常者中阳性检出率28.9% (11/38),均为单杂合突变,具体为 GJB2基因突变4例(10.5%) , SLC26A4基因突变7例(18.4%),线粒体基 因突变1例(2.6%) o高危组总检出率显著高于对照组(pv0.05), GJB2、SLC26A4 基因突变的检出率也均显著高于对照组(p<0.05),而GJB3、12S RNA检出率 虽然高于对照组,但不具有统计学意义(p>0.05) o高危组内部:耳聋患者各基 因突变检出率均高于听力正常者,但不具有统计学意义(p>0.05)。高危组中19 个参检家庭(共49例)中有4个家庭11例检测出致聋基因,占21.1% (4/19); 15个家庭38例未检测出耳聋基因突变或虽检出携带基因突变但不能构成致病原 因,占 78.9% (15/19)

结论:

  1. 长春地区遗传性耳聋高危人群的基因突变携带率远高于正常人群。2.本研 究中,长春地区最常见的耳聋突变基因为SLC26A4和GJB2,其中SLC26A4基 因检出率高于全国平均水平。GJB2的235delC, SLC26A4的IVS7-2A>G为长春 地区热点突变位点。

关键词:耳聋,基因芯片,基因筛查,遗传咨询

ABSTRACT

Objective:

By screening common hereditary deafness gene mutation in high risk individuals of Changchun, Jilin Province, to find out the hot spot mutation site and mutation frequency in this area, and to give corresponding fertility guidance and suggestions to grope for the prevention and treatment strategies for reducing the birth rate of deaf patients in this area.

Method:

After informed consent, the high-risk individuals of hereditary deafiiess and normal individuals in Changchun were collected to set up as high-risk group and control group respectively. There were 109 cases in high risk group and 40 cases in control group. In the high-risk group, there were 71 cases of deafness who were moderately or severely sensorineural deafness and 38 cases with normal hearing whose close relatives within three generations has a history of deafness(most of them were families of the patients mentioned above).The individuals of control group had normal hearing and no family history of deafness. The related history was collected, and examination was carried out. After blood collection, the DNA was extracted and amplified. And then 15 hot spot mutation sites on four deafness related genes were detected with gene chip. The including genes and sites were: GJB2(35 del Q176 del 16,235 delC,299 delAT), SLC26A4(IVS7-2A>G, 2168A>G 1174 A>T, 1226 G>A, 1229 C>T, 1975 G>C, 2027 T>A, IVS15+5 G>A), mitochondrial 12S rRNA (1494C>T, 1555A>G) and GJB3 (538C>T). Microarray scanner was used to scan and identify the deafness genes. For those who were detected to carry mutation genes or sites, explanations and suggestions were provided for them. Finally, statistics and analysis were made on the data.

Result:

There were 40 cases in the control group, and 2 cases were positive, the detection

hirate was 5% (2 / 40). One of them carried SLC26A4 heterozygous mutation, and the other carried both GJB2 and SLC26A4 heterozygous mutations.There were 109 cases in high risk group, including 71 deaf patients and 38 normal hearing patients, accounting for 65.1% and 34.9% respectively. 43 cases were detected positive in high risk group, the total positive rate was 39.4%. The detection rate of deafness group was 45.1% (32 / 71). Among them, there were 12 cases (16.9%) of GJB2 gene mutation: 7 cases of 235delc homozygous mutation, 2 cases of 235delc and 299 del AT compound heterozygous mutation, and 3 cases had 235delc heterozygous mutation; There were 20 cases of SLC26A4 mutations (28.1%): 3 cases of IVS7-2A > G homozygous mutation, 1 case of IVS7-2A> G and 1229C>T compound heterozygous mutations, 1 case of I VS 7-2 A > G and 2168A>G compound heterozygous mutations, 10 cases of IVS7-2A > G heterozygous mutation, 2 cases of 2168A>G heterozygous mutation, 2 cases of 2027T> A heterozygous mutation and 1 case of 1226 G>Aheterozygous mutation; There were 4 cases of mitochondrial gene mutation (5.6%): 2 cases of 1555A > G homozygous mutation (2.8%), 2 cases of 1494c > t homozygous mutation (2.8%); And there were 1 case (1.4%) of GJB3 gene mutation, which was 538c > t heterozygous mutation. In the high risk group, the detection rate of the subjects with normal hearing were 28.9% (11 / 38), all of whom were heterozygous. Among them, there were 4 cases of GJB2 gene mutation(10.5%)? 7 cases of SLC26A4 gene mutation (18.4%) and mitochondrial gene mutation in 1 case (2.6%). The total detection rate of high risk group was significantly higher than that of control group (P < 0.05). The detection rate of GJB2 and SLC26A4 gene mutation in high-risk group was also significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Although the detection rate of GJB3 and 12S RNA was higher than that in the control group, but there was no statistical significance (P > 0.05). The detection rate of each gene mutations in deaf patients was higher than that in normal hearing patients, but there was no statistical significance (P > 0.05). In the high-risk group, 19 families (49 cases) were examined, 4 of them (11 cases) had deafness genes, accounting for 21.1% (4/19) ; 38 cases in 15 families were detected of no deafness gene mutation or could not explain the reason of deafness.

Conclusion:

  1. The gene mutation carrying rate of the high risk population of hereditary deafness in Changchun area is much higher than that of the normal population.
  2. In this study, the most common mutations of deafness genes in Changchun are SLC26A4 and GJB2, and the detection rate of SLC26A4 gene is at a high level in China. 235delC of GJB2 and IVS7-2A > G of SLC26A4 are the hot spot mutations in Changchun.

Key word:deafness; gene chip; gene screening; genetic counseling

第1章引言

耳聋是临床常见的感觉障碍,虽然耳聋不会影响自然寿命的长短,但其由于 影响到患者的学习、工作和日常交流,给患者带来了极大的生活不便和心理压力, 同时也给家庭和社会造成了沉重的经济负担。我国耳聋人群占总残疾人群的 33.52%⑴2]。从病因来看,耳聋可分为遗传因素和非遗传因素,其中遗传因素导 致的耳聋约占60%,为耳聋的主要病因® 4]。

自1997年第一个耳聋致病基因被发现以来,耳聋基因的研究逐渐深入,越 来越多的耳聋基因被发现,迄今已达百余种。在戴朴等人在全国开展了耳聋基因 调查后,我国常见耳聋基因及常见突变位点得到了初步明确⑸。我国常见的4种 耳聋致病基因为:GJB2, SLC26A4,线粒体 12s rRNA 和 GJB3。GJB2 和 SLC26A4 是我国遗传性耳聋的两大主要致病基因,多数位点遵循常染色体隐性遗传。GJB3 则遵循常染色体显性或隐性遗传,目前对其各位点的遗传方式存在争议,仍有待 进一步研究⑹。而线粒体12s rRNA则为母系遗传,不遵循孟德尔遗传定律。

由于聋■聋结合是聋人群体的常见的婚配方式,此类家庭的下一代遗传到突 变耳聋基因的几率远高于正常人。携带相同突变基因的耳聋患者婚配,若为常染 色体隐性遗传,则其后代为纯合子或复合杂合突变的几率极高,即生育聋儿的风 险极大;若为常染色体显性遗传性,生育耳聋后代的风险也同样大大增加。因此, 只有通过明确耳聋突变基因并尽量避免携带相同突变基因的患者婚配,才能降低 耳聋患儿的出生率。

针对我国常见的四种耳聋基因,我国科研工作者结合基因芯片技术和多重 PCR、杂交技术⑺,开发了多种可用于临床筛查的基因芯片。如晶芯九项遗传性 耳聋基因芯片,晶芯十五项遗传性耳聋基因突变微阵列诊断芯片等。从采取的新 鲜血液、羊水或其他样品中提取DNA,再经过PCR扩增和杂交后,放入特定的 扫描仪器进行扫描,并用相应的遗传性基因检测芯片判别系统进行信号读取与判 别。实现了对耳聋基因的高效、准确、便捷的检测,适用于临床大规模筛查和辅 助诊断。目前已在多地区推广并应用于新生儿听力联合耳聋基因筛查等项目。

经过数千年历史变迁和民族融合,我国各地区人群的常见耳聋基因具有一定 程度的相似性,但各地区常见耳聋基因的突变位点、突变频率往往不尽相同。只 有了解各地区的差异,才能有的放矢,作出有针对性的高效的耳聋防控措施。长 春地区耳聋基因筛查的相关研究较少,对于遗传性耳聋高危人群的关注仍有所欠 缺。长春地区耳聋基因的突变与全国水平相比有何差异?高危人群的耳聋基因与 正常人群有何不同?基于此,本研究应用北京博奥生物有限公司的晶芯十五项遗 传性耳聋基因诊断芯片,对109例来自长春地区的遗传性耳聋高危人群和40例 正常人群的4个常见的突变基因的15个突变位点进行筛查,分析该地区有关的 耳聋基因发生频率及特点,填补该地区内此领域的欠缺,对长春地区遗传咨询及 产前诊断给予理论支持,以减少耳聋的新发与加重,减轻地区政府和耳聋家庭的 经济负担。

第2章文献综述

耳聋基因检测技术与应用

2.1我国常见的耳聋基因

  • GJB2 基因

GJB2基因,全长4804bp,染色体定位13qll-12,是最先被发现致聋的常染 色体隐性遗传基因,也是为我国最常见的耳聋突变基因。我国感音神经性耳聋 (sensorineural hearing loss, SNHL)患者中 GJB2 基因突变携带率高达 27.13%⑻。

GJB2基因负责编码Connexin 26 (Cx 26),这是一种缝隙连接蛋白,在毛细胞 缝隙连接中高表达⑼,对维持内耳毛细胞生理功能起着重要作用。GJB2基因各 位点的突变方式主要为碱基缺失后导致移码突变,突变位点后翻译的氨基酸全部 异常,多肽链的长度也可能因此改变,最终导致产生的Cx26功能和结构异常。

早年研究者认为Cx 26异常使得内耳毛细胞的K+转运异常,不能正常流入内耳 内淋巴液WE,引起K+积累,损伤毛细胞["I。但近年来有学者提出,GJB2不 同表型的耳聋机制有所不同,先天性耳聋的机制在于Cx 26异常导致Corti器隧 道打开异常,即耳蜗发育障碍2】,而迟发性耳聋的机制在于耳蜗主动放大作用异 常Ml。因为Cx26的编码序列仅在一个外显子之中,所以进行PCR分析较为容 易QI。截止到2020年1月25日,已发现GJB2有400余种突变方式

(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=GJB2),可引起常染色体隐性遗传 性聋和常染色体显性遗传性聋QI。各地区GJB2的热点突变位点不尽相同,具有 种族及地域特点。目前发现人类常见的突变位点有35 del G、176 del 16、235delC> 299 del AT> R143w突变等,我国最常见的突变位点为235delC[846]o

  • SLC26A4 基因

SLC26A4基因染色体定位7q31,我国SNHL患者中SLC26A4携带率仅次 于GJB2,是引起前庭导水管扩大(enlarged vestibular aqueduct, EVA)的主要基 因[⑺。该基因最早在Pendred综合征家系被发现并克隆[18]OSLC26A4基因较GJB2 复杂得多,共有21个外显子,开放阅读框架全长2343bp,从2号外显子开始分布 于其他外显子中。研究表明,除20号外显子外,其它外显子均有突变位点存在 问,突变形式多样,其中最常见的为错义突变,如IVS7-2A>G, 2168 A>G, 1226 G>A, 1229OT, 2027 T>A等。这21个外显子中大部分外显子均可编码Pendrin 蛋白,该蛋白为溶质转运蛋白家族的一种,在内淋巴管、内淋巴囊等处大量表达, 其结构复杂,功能丰富,负责转运并交换CI/I■或CI/HCO3■以维持内淋巴液离 子平衡的同时,还促进血管纹生成谷胱甘肽,从而防止血管纹遭受自由基的损害。 SLC26A4基因突变时可编码结构和功能异常的Pendrin蛋白,不仅破坏了内耳内 淋巴液的离子平衡,还导致血管纹受到了氧化损伤。此外,内淋巴液的平衡的破 坏还可导致前庭导水管的骨质发育异常,导致EVA,进而引起听神经和内耳毛 细胞对颅内压力的波动十分敏感,并因此容易受到损伤[20],因此在颅脑外伤、发 热、用力扌鼻鼻等刺激颅内压力增高时,可诱发患者听力下降0]。SLC26A4基因 的突变方式复杂多样,以常染色体隐性遗传为主。不同地域和人种的热点突变和 突变频率也各有不同。我国最常见的突变位点为IVS7-2A>Go

  • 线粒体 DNA (mtDNA)

由于线粒体DNA(mtDNA)的遗传物质仅来自于母亲,因此符合母系遗传。 mtDNA可导致药物性耳聋。mtDNA基因突变者不论是均质性突变还是异质性突 变在应用氨基糖昔类抗生素后均可致聋。12S rRNA是其中最常见的突变基因, 1555A>G也被认为是氨基糖昔类药物诱导的药物性耳聋的的最常见的致病原因, 其次为1494OT©]。氨基糖昔类对治疗细菌感染有着重要作用,在世界各国都 有广泛使用。但这些药物可能会聚集在内耳的内外淋巴液中,因此产生耳毒性, 且一旦产生则无法逆转。氨基糖昔类抗生素可与细菌核糖体相结合,影响氨基酸 的翻译,导致生成异常的蛋白质。有研究表明,当线粒体基因突变时,会改变 12S rRNA的三级结构(不同位点突变时改变的结构有所不同),药物的结合位 点也因此而改变,导致线粒体对氨基糖昔类药物的结合力大大增加,不仅如此, 线粒体对药物的敏感性也大幅提高,线粒体内氨基酸的翻译过程也受到干预,毛 细胞因此出现呼吸障碍,引起耳聋的发生㈡】。研究表明,我国最常见的突变位点 为 1555A>G[24]o

  • GJB3

GJB3负责编码缝隙连接蛋白Connexin 31,该蛋白与Cx26相似,也在信号 传递及物质转运中均起着重要作用。我国学者夏家辉最先定位并克隆了 GJB3基 因。GJB3基因遵循常染色体显性或隐性遗传。GJB3基因在我国检出率并不高, 多地报道未检出GJB3基因突变。538 0 T突变为其常见突变方式,临床表型 为语后高频听力下降,并伴有渐进性加重。

以上四种基因为我国最常见的耳聋突变基因,其中尤其前三者在我国SHNL 儿童群体确诊率达44%©]。因此,目前国内开展的耳聋基因筛查大多围绕这四 种耳聋基因及其常见的突变位点展开。若未能检测出致病原因,则还需检测其他 耳聋基因。其他耳聋基因包括X染色体连锁遗传的相关基因突变及导致综合征 型耳聋的多种耳聋基因等。

2.2常用耳聋基因检测方法

2.2.1 DNA测序技术

第1代DNA测序技术中以Sanger发明的双脱氧链终止法应用最为广泛。其 原理和设计严谨而巧妙:采集末梢静脉血后抗凝,提取DNA并使之达到工作浓 度,再设计引物并结合在待测模板上,利用DNA聚合酶和脱氧核昔酸 (deoxynucleotide, dNTP)原料经PCR程序使引物延伸,直到随机连接上某一 种链终止核昔酸,则不再继续反应。终止核昔酸即双脱氧核昔酸 (dideoxyribonucleoside triphosphate, ddNTP),有 A'、T\ C\ G‘四种,其与 普通的脱氧核昔酸的不同之处在于其缺少用来继续延伸的3・OH基团,且带有放 射性同位素标记。把四种ddNTP分别放在四个不同的体系中,延伸链会在某一 个对应的N碱基处随机终止,则会得到相同起点但不同终点的PCR产物。将这 四个体系的产物进行电泳实验,不同链长的产物电泳的距离不同,通过电泳的自 显影图谱即可获得待测DNA的碱基序列。Sanger法具有准确、直观的优点,其 准确率高达99.99%,不需要任何推断,为基因检测的金标准。但Sangei*测序也 具有其局限性:需要明确扩增位点的外显子和具体位置,因此对于未知基因位点 以及待测基因数量较多时,Sanger法难以检测,需要通过新一代测序才能完成。

第2代测序测序又称为下一代测序(next generation sequencing,NGS), NGS 有4种技术,分别为:Solexa技术,SOLiD技术,454技术和Ion proton技术。 目前市场以Solexa技术最为常见。该方法主要有以下几个步骤:1.构建测序文库: 该过程本质上是在待测DNA片段两端加上特定的序列,方便固定的同时,也给 测序引物提供了结合位点;2.桥式扩增:该过程的目的在于扩增待测DNA片段, 增强后续合成后测序时产生的荧光强度;3.边合成边测序:第2代测序与Sanger 测序相似的地方在于都使用ddNTP来终止延伸,但不同之处在于,第2代测序 的核昔酸原料都是ddNTP,且每种NTP带有不同颜色的荧光,因此在合成过程 中即可读取信号,每次读取信号结束后就会切除掉荧光基团和阻止延伸的终止基 团,使下一个ddNTP继续结合,以此实现了边合成边测序;4.测序数据分析: 由于测序仪器只能读取有限长度的DNA片段,因此,会把待测DNA片段化后 再检测,这些小片段经过构建文库、在FlowceH固定并桥式扩增后,形成数百万 个DNA簇,这些DNA片段的序列被读取后需要进行相关数据分析,寻找到突 变基因及位点师2刀。第2代DNA测序技术补足了第1代测序通量较低的不足, 效率大大提升。但其缺点在于读长较短,必须将待测DNA打断成小片段才能测 序,且运行时间较长〔28]。

此后的第3代测序、第4代测序弥补了这个缺点,但这两种技术目前应用较 少,第4代测序技术仍处于实验室研究阶段[29]。

在高通量测序技术的基础上发展出目前很多基因检测方法,包括目标耳聋基 因靶向捕获测序、全外显子组测序(whole exome sequencing, WES)及全基因组 测序(whole genome sequencing, WGS)等㈤,这些检测方法不仅可用于耳聋基因 筛查,更可用于发现新的耳聋基因或突变位点。WES可用于寻找耳聋家系中的 新基因或位点,但通过WES检测到的突变信息量巨大,大部分意义不明,因此 包括了大量的导致其他疾病的突变或无义突变,如何从中甄别出该家系的致聋基 因或位点才是真正的难点厲1。

2.2.2耳聋基因芯片技术

戴朴等人在全国开展了耳聋基因调查后,初步明确了我国常见耳聋基因及突 变位点⑸。基于此,我国学者结合基因芯片技术和多重PCR、杂交技术⑺,设计 了多种可用于临床筛查的基因芯片。其中最先被开发并应用于临床的是晶芯九项 遗传性耳聋基因芯片。该芯片可检测GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA及GJB3 基因的 9 个突变位点(具体为 GJB2: 35 del G, 176 del 16, 235delC, 299 del AT, SLC26A4: 2168 A>G, IVS7-2A>G,线粒体 12S rRNA: 1555A>G, 1494OT, GJB3: 538C>T)。该技术的取样非常便捷,人全血、干血片、口腔拭子等临床 样品均可提取DNA。其利用多重PCR杂交测序法。在芯片表面分别固定了待测 位点的野生型与突变型的探针,试剂盒中包含与之对应的引物,利用这些特异性 引物在待测DNA的相关基因位点进行多重PCR与荧光标识,再经过杂交过程, 若有与探针互补匹配的序列时,即与之结合,洗片后通过与之匹配的扫描仪即可 显影并读取判别。该产品优势显著:准确率高、操作便捷、快速方便且适应性广, 因此很快被广泛应用于临床筛查和辅助诊断。该芯片于2009年获得国家医疗器 械许可证,目前已在多地区推广并应用于新生儿听力联合耳聋基因筛查等项目 [3031]o 2014年,国家批准又通过了十五项遗传性耳聋相关基因突变诊断芯片。 该芯片比9项耳聋基因芯片多检测6个常见突变位点,为SLC26A4基因的1174 A>T, 1226 G>A, 1229 C>T, 1975 G>C, 2027 T>A 和 IVS15+5 G>A。目前,该 芯片也逐渐在临床得到了应用与推广,多地区已有用于临床筛查的报道8列。

耳聋基因芯片技术由于具有高效、准确、便捷、经济等多种特点,在临床耳聋基 因筛查工作的开展上具有其独特的优势,但该技术也存在一定的局限性:即只能 检测常见基因的常见位点,且数量十分有限,对于其他基因或其他少见突变位点 引起耳聋的患者,都只能得到阴性结果,需要行WES或WGS才能明确病因。 2.2.3限制性酶切分析法

DNA限制性内切酶酶切分析的基本原理是利用限制性内切酶对DNA上特 定序列的识别,来确定切割位点并实现切割。再使切割后的产物通过电泳得出核 酸片段分子量,最后判断有无已知类型的突变位点。利用限制性酶切法,我国科 研工作者研发出线粒体DNAA1555G突变检测试剂盒,并于2011年通过国家医 疗器械许可证。该产品可用于筛查药物敏感性耳聋,其特异性、灵敏度及准确度 都非常高厲1。限制性酶切分析法具有简便、经济、快速、准确的特点,针对某些 通过表型可推断可能基因型的患者,可以使用限制性酶切分析法进行验证,是否 确实存在此种突变。也可用于某地区的常见突变位点的筛查。但该方法的局限性 也显而易见:即检测的位点少,对于不能推断可能基因型的患者,该检测方法意 义有限。

2.2.4基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是一种新兴的简单、 高效的基因检测技术。首先使待测DNA吸附在基质上,再使用激光照射,基质 获得能量则会和待测DNA之间产生电荷转移,使待测DNA电离,不同质量的 DNA分子受到质谱仪的电场影响后在管道中飞行的速度也各异,质量越大,则 飞行到达检测器的时间越长[均利用这种方法,可以对待测DNA进行分析,从质 谱图和谱峰强度得到各个单分子的分子量并计算出待测分子的平均分子量[殉。华 大基因公司利用此技术针对我国常见的4个耳聋基因的20个突变位点设计了一 款试剂盒,较9项试 剂 盒 增力口 11个 位 点,即GJB2: 167delT, GJB3: 547G>A, SLC26A4: 281C〉T、589G>A、2162C>T、1174 A>T、1226 G>A、 1229 C>T> 1975 G>C、2027 T>A、IVS15+5 G>A。因此具有检测位点多、检测 周期短、准确率高、经济简便等特点,因此可广泛用于筛查。目前,国内已有部 分地区小规模使用MALDI-TOF-MS技术开展基因筛查工作耳-佝。

2.2.5变性高效液相色谱(DHPLC)分析

变性高效液相色谱法(DHPLC)是一种近年来发展起来的的高通量的检测基 因突变的新技术。主要原理为调节温度使DNA部分变性,再利用有机溶剂洗脫 不同双链的洗脫曲线不同来进行分析。具体步骤为:先升温使突变DNA和野生 型DNA的PCR产物解链,即预变性,再缓慢降温使DNA杂交,则会形成两种 异源双链与两种同源双链。其利用离子对把DNA双链连接在固定的色谱柱上, 在适宜温度下,使DNA链发生部分变性,部分变性的DNA由于存在一部分单 链,故比未变性的DNA携带较少的负电荷,则容易被有机溶剂乙月青从固定的柱 上洗脫。由于异源双链存在错配区,因此异源双链比同源双链更容易变性,而有 机溶剂的浓度随着部分变性的进行而线性增加,故先变性的异源双链会被较低浓 度的乙月青溶剂先洗脱出来,后变性的同源双链则会被较高浓度的乙睛溶剂后洗脫 出来,二者解离特征不同,因此在色谱图上表现为不同的峰值。该技术可用于错 义突变、移码突变等多种突变方式的检测,具有高敏感性、高特异性、高性价比、 高通量以及自动化等多种优势,其缺点在于无法确定突变的类型"Vi]。目前, DHPLC技术已应用于血液病、肾病、颅脑血管病等多个领域的基因筛查舵-44], 国内针对GJB2、SLC26A4和12S rRNA耳聋基因检测也已有报道肖4刀,但此技 术应用仍然不多。

2.2.6高分辨率熔解(HRM)

新兴的高分辨率熔解(High-resolution melting, HRM)技术的原理在于通过 PCR扩增之后升温使DNA熔解再行熔解曲线分析。由于突变的基因与野生型的 基因碱基组成不同,因此二者经过PCR扩增后在升温熔解过程使DNA变性的特 点也有所不同,则会形成不同的熔解曲线,可识别DNA片段的细微区别,从而 能够识别突变的基因和位点。HRM技术还需要进一步的技术开发,还不能广泛 用于基因筛查。Yuan等人利用HRM设计了对GJB2, SLC26A4及线粒体12S rRNA的5个常见突变位点的检测方法后应用于新生儿,并通过Sange门则序证明 了其准确性郎],证明该方法具有经济、高效、准确率高的特点。但目前HRM在 耳聋基因筛查领域还没有得到普及。

2.3基因筛查技术的应用

2.3.1耳聋患者的基因筛查

自戴朴等人在全国18省市开展聋人耳聋基因筛查已来,我国其他地区的耳 聋患者耳聋基因筛查的工作也陆续得到了开展。耳聋基因检测也已广泛用于遗传 性耳聋的诊断。对于某些通过表型可推断可能基因型的病例,可以使用限制性酶 切分析法对单基因进行检测。对于不能推断可能基因型的病例,可使用基因芯片 技术,也是目前应用最广泛的基因筛查方法。在政府支持下,利用九项遗传性耳 聋基因芯片和十五项遗传性耳聋基因芯片,北京、沈阳、安庆等11个地区共筛 查了耳聋个体逾4万例,检出率高达15.6%[49]o对这些个体进行婚育指导,可减 少携带相同基因的个体结合生育出耳聋患儿的发生;对携带线粒体基因突变者及 其母系成员给予用药指导,可减少因氨基糖昔类抗生素导致的迟发性耳聋的发 生。对于基因芯片未能检出致病原因者,可进一步采用WES或WGS技术寻找 致病基因。

2.3.2新生儿耳聋基因筛查

2007年,王秋菊等人提出将新生儿耳聋基因和听力联合筛查a】。此后,全 国各地区已陆续开展了这项工作El,应用的最广泛的仍是基因芯片技术。通过新 生儿耳聋基因与听力联合筛查,发现了大量先天性耳聋患儿的同时,还给其中一 部分患儿作出了分子诊断,明确了致病原因,可提早对这些患儿进行干预(如佩 戴助听器、人工耳蜗植入等),实现“聋而不哑”,这对患儿的身心发育是至关 重要的。此外,还检测出很多通过了听力筛查却检出携带迟发性耳聋基因(如 SLC26A4、线粒体12S rRNA)的患儿,对这些患儿的家长予以行为及用药方面 的指导。此外,对携带线粒体12S rRNA基因突变的患儿还应指导其母系成员用 药。通过这些措施可延缓甚至减少迟发性耳聋的发生。对于检测出单纯携带基因 突变的儿童,应告知其家属其未来可能生育聋儿的风险及预防策略。由此实现了 耳聋的二级预防。

2.3.3孕前及孕早期基因筛查

孕妇是一类特殊人群,对其进行基因筛查不仅可检测孕妇本身的基因突变情 况,更可对其宫内的胎儿的耳聋风险作出评估。因此对孕妇进行宣传教育及耳聋 基因筛查是至关重要的。目前在部分地区的妇幼保健医院已开展孕期基因筛查, 广州地区利用基因芯片法对7263名孕妇进行了耳聋基因检测,检出303例携带 耳聋基因突变者,携带率4.17% (303/7263)[52]长沙地区利用基因芯片法对1951 例孕妇进行耳聋基因检测,检出78例携带耳聋基因,检出率4. 00%(78/1 951)[53]; 镇江地区利用二代测序法对1737例孕妇进行基因检测,共检出126例突变者, 携带率7.25% (126/1737) [54]O对于检测出携带耳聋基因者,其配偶应对该检出 基因行全面检测,必要时需对胎儿进行羊水穿刺,若为纯合子,可予以干预措施, 以减少耳聋患儿的出生。但对孕妇进行耳聋基因筛查仍属于二级预防,袁永一等 人提出,从耳聋一级预防的理念出发,孕前是为携带者筛查的最佳时间节点[49】。 将基因筛查提早到备孕阶段,检出夫妻双方携带相同耳聋基因者,可通过胚胎植 入前诊断等措施干预[呵,实现真正意义上的耳聋一级预防。

2.4小结

耳聋给患者的学习、生活、工作带来了巨大的不便,而遗传因素占其病因的 60%[56]0我国最常见的耳聋突变基因为GJB2, SLC26A4,线粒体12S rRNA和 GJB3等。针对这些常见的耳聋突变基因,我国各地已逐步开展了听障人群耳聋 基因筛查、新生儿听力与耳聋基因联合筛查、孕期及孕前耳聋基因筛查等项目, 从病因上降低耳聋患儿的出生率,逐渐实现耳聋的一级预防。耳聋基因检测技术 中最早得到应用和普及的是基因芯片,随着全国耳聋基因筛查工作的开展,近年 来也出现了以二代测序为代表的很多新的耳聋基因检测方法,这些方法总体呈现 出高准确率、高性价比、高通量的特点,相信通过这些方法的应用,能够提高我 国耳聋人群的耳聋基因检出率,为遗传性耳聋的精准医疗提供了技术支持,为后 续的遗传咨询、婚恋指导、迟发性耳聋的早期诊断与干预等工作提供理论支持。

第3章资料与方法

3・1 •研究对象

收集长春地区遗传性耳聋高危人群共109例,其中:耳聋患者共71例,听 力正常者38例。耳聋患者纳入及排除标准:1.均为2017年10月-2019年12月 就诊于我院耳鼻喉科门诊的中重度SNHL患者;2.发病年龄45岁以下;3.无长期 中耳炎症史;4.无中耳手术史;5.无长期噪音暴露;6.无颅脑外伤史。详细询问 病史,主要内容包括发病年龄、听力变化情况、氨基糖昔类药物使用史、遗传性 耳聋家族史等。行耳鼻喉科专科查体,检查有无外耳畸形,外耳道是否通畅、有 无鼓膜内陷、有无穿孔及分泌物等。于隔音室检查纯音听阈测试(puretone auditory, PTA),确诊为中重度SNHL。部分患者行颖部高分辨率CT或核磁共 振,明确有无EVA及Mondini畸形。听力正常均者均为三代以内近亲属有耳聋 遗传家族史但听力正常者,主要为上述患者家属,询问收集家族史。

收集长春地区正常对照人群40例设为对照组,听力均正常,且经询问病史 确认无耳聋家族史。

两组共149例纳入本研究,均为长春地区人口。经过宣教及告知检测范围及 意义后,均表示知情同意接受检测。本研究的相关流程均已通过吉林大学第二医 院伦理委员会的批准。

3.2. DNA 提取

以无菌采血管采集静脉血5ml,用EDTA-k2抗凝后,放置于冰盒内4°C保存。 如果当天不能提取,则保存于・80°C冰箱,并于1周内完成提取DNA的工作。

使用上海超研生物科技有限公司的小量全血基因组DNA提取试剂盒(溶液 型)提取收集的全血标本。具体步骤如下:

  • 吸取300(11经颠倒混匀的抗凝全血加入5ml离心管中,加入红细胞裂解液 900(11,颠倒数次确保充分混匀。

2)  室温放置10分钟后,以12000 rpm离心20秒,吸弃去红色上清液,完整 地保留管底白色沉淀,并留下大约10U1的残留上清。

3)  离心管放入涡旋振荡器中15秒,使沉淀的白细胞重新在体系中分散并悬浮 后,加入300 细胞核裂解液,迅速用力吹打混匀,当混合物变得粘稠时即停 止吹打。上下颠倒离心管10次确保所有白细胞充分裂解。

4)  离心管中加入10mg/m 1的RNase A 3 u 1,上下颠倒25次混匀,37°C温育15 分钟,使RNase与管内残留的RNA充分反应,再回复到常温。

5)  吸取100『蛋白沉淀液加入离心管,置于涡旋振荡器中,高速振荡25秒使 之混匀。

6)  再放入离心机中离心5分钟,速度为13000rpm,使蛋白质沉淀。

7)  吸取上清,加入新的1.5ml离心管中,约300uL

8)  吸取300ul的常温异丙醇加入离心管,轻柔颠倒数次混匀,使DNA沉淀,呈 白色棉絮状。

9)  待白色絮状DNA自然沉淀后,吸弃上清。

10) 吸取lml70%乙醇加入离心管,颠倒混匀后离心1分钟,转速12000rpm, 倒弃上清,留下管底白色DNA团块。

11) 再吸取0.5ml70%乙醇加入离心管,重复步骤10,再使离心管倒置,晾干沉 淀。

12) 加入lOOpilDNA溶解液,轻弹离心管壁,使沉淀与溶解液充分混匀。将溶解 物放入水浴锅内以65弋温育60分钟,温浴时也需要每隔数分钟轻弹管壁,使 DNA充分溶解。

13) 吸取2(ilDNA溶液放置于的紫外分光光度计(上海美谱达公司)中检测260nm 和280nm处的OD值。以检测DNA浓度及纯度。260nm处1OD值约相当于 50(ig/mlDNA (双螺旋),由此可知DNA浓度。而260nm和280nm处OD值的 比值则为所得DNA的纯度,约为1.7-1.9o将所提取的DNA用超纯水稀释至 100ng/uL,储存于・80°C冰箱。

3・3基因芯片筛查

3.3.1原理

本研究采用的基因芯片为博奥基因有限公司研制的晶芯®十五项遗传性耳 聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)。其利用的测序原理为多重PCR杂交测序 法。在芯片表面分别固定了序列已知的四个耳聋基因的共15个突变位点野生型 与突变型的探针(见图3.1及图3.2),试剂盒中包含与之对应的引物,利用这 些特异性引物在待测DNA的相关基因位点进行多重PCR与荧光标识,再经过杂 交过程,若有与探针互补匹配的序列时,即与之结合,洗片后通过微阵列芯片扫 描仪即可显影并读取判别。这15个基因位点见表3.1。

图3. 2每个微阵列的探针排布(QC:表面化学质控探针;BC: 空白对照;PC:杂交阳性对照探针;W:野生型探针;M: 突变型探针;MC:磁珠反应对照探针;IC: PCR内对照探针; NC:杂交阴性对照探针)

3.3.2 PCR 反应

给每个待测样品准备一组3个的200pl的离心管,分别编号为An, Bn, Cno 将PCR扩增混合物A, B, C (A, B, C中有三组针对于不同位点的引物)充分 融化、振荡混匀及瞬时离心后,分别取20(11加入An, Bn, Cn,并在每个离心管 中加入5卩1的待测DNA溶液,作为PCR反应的模板。打开PCR扩增仪中,调 试好扩增程序(见表2),将三个离心管放入开始扩增。

表3. 1晶芯十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒的检测位点

3.3.3杂交

以结合缓冲液清洗磁珠后,再加入30(11结合缓冲液混匀;取An, Bn, Cn中 的PCR产物各20(11放入装有磁珠的离心管中充分混匀,使磁珠吸附DNA,静置 后放到磁力架上利用磁场使磁珠与液体分离,再吸去液体,去除少量可能残留的 蛋白质等杂质,由此实现PCR产物的纯化;在纯化后的PCR产物加入NaOH溶 液使之变性,经磁力架作用使变性的DNA分离后撤架,吸去NaOH溶液;再加 入提前预热到50°C的杂交缓冲液40卩1充分混匀,再次利用磁力架使变性的DNA 分离,撤架,吸去液体;再次加入20卩1杂交缓冲液液,混匀;再用移液器吸取, 经芯片盖片的加样孔垂直加样到芯片上。立即密封并放入50°C的水浴锅中杂交1 小时。

3.3.4洗片及结果判读

取出芯片放入洗片机。先在37°C的洗液I洗涤120s,再用37°C的洗液II洗 涤120so芯片干燥后放入预热好的晶芯®LuxScanTM 10K/B微阵列芯片扫描仪 中,并利用其配套的判别系统对15个位点进行判读。

3.4统计学分析

利用SPSS24.0进行结果的统计学分析。不同组别之间的阳性率对比为分类 变量的比较,均采用卡方检验。

表3. 2. PCR扩增程序

第4章结果

4.1.高危组基因突变检出情况

高危组共检测109例,男56例,占51.4%,女53例,占48.6%,平均年龄 (24.5±13.2)岁。包含耳聋人群71例,占65.2%,听力正常人群38例,占34.9%。 其中有19组家庭检测(49例)和60例个人检测。共检出43例阳性结果,总阳 性率39.4%o其中GJB2基因突变16例,占14.7% (16/109) ,235delC纯合突变 7例,235delC杂合突变7例,235delC> 299 del AT杂合突变型复合杂合2 例;SLC26A4基因突变27例,占24.7% (27/109),线粒体基因突变5例,占4.6% (5/109) ,GJB3基因突变1例,占0.9% (1/109),具体检测结果见表4.1。

4.1.1耳聋患者基因突变检出情况

耳聋患者共71例,男39例,占54.9%,女32例,占45.1%,平均年龄(22.3 ±13.1)岁。共检出32例阳性结果,检出率45.1%o共16人查明致病原因,占 耳聋人群的50%,受此次检测范围影响,有16人检出基因杂合突变但不构成致 病原因,余39人未检测到相关耳聋基因突变,耳聋患者阳性检出率45.1% (32/ 71)。其中:GJB2基因突变:12例,占16.9%,具体为235delC纯合突变7例 (9.9%) , 235delC> 299 del AT 复合杂合突变 2 例(2.8%) , 235delC 杂合突变 3例(4.2%) ; SLC26A4基因突变:20例,占2&1%,其中IVS7-2A>G纯合 3 例(4.2%) , IVS7・2A>G、1229OT 复合杂合突变 1 例(1.4%) , IVS7・2A>G、 2168A>G复合杂合突变1例(1.4%) , IVS7-2A>G杂合突变10例(14.1%), 2168 A>G 杂合突变 2 例(2.8%) , 2027T>A 杂合突变 2 例(2.8%) , 1226 G>A 杂合突变1例(1.4%);线粒体基因突变:4例,占5.6%,其中1555A>G同质 性突变2例(2.8%) , 1494OT同质性突变2例(2.8%) ; GJB3基因突变1例, 占1.4%,为538OT杂合突变。耳聋患者71例患者中,有2名患者同时检出 GJB2基因突变和SCL26A4基因突变,3名患者同时检出SCL26A4基因突变与 线粒体12S rRNA基因突变。

4.1.2听力正常者基因突变检出情况

听力正常者共有38例,男17例,占44.7%,女21例,占55.3%,平均年 龄(28.6+12.4)岁。共检出阳性结果11例,阳性检出率28.9% (11/38),均为 杂合突变。其中GJB2基因突变:4例,占10.5%,均为235delC杂合突变;SLC26A4 基因突变:7例,占18.4%,其中IVS7-2A>G杂合突变4例(10.5%) , 2168A>G 杂合突变、1229OT杂合突变、2027 T>A杂合突变型各1例,各占2.6%。线粒 体基因突变:1例,占2.6%,其中一例同时携带GJB2和SLC26A4基因杂合突 变。

表4. 1 :高危组中耳聋患者与听力正常者中的检出情况

4.2对照组耳聋基因检测结果

对照组共40例,男19例,占47.5%,女21例,占52.5%,平均年龄(30.9 土7.0)岁。共检出阳性结果2例,检出率5% (2/40),均为杂合突变。1例携 带SLC26A4基因的2027T>A杂合突变,1例同时携带GJB2基因的235delC杂 合突变和SLC26A4基因的IVS7-2A>G杂合突变。GJB2突变检出率2.5%( 1/40), SLC26A4突变检出率5% (2/40)未检出12S RNA基因突变或GJB3基因突变。 4.3两组人群的耳聋基因检测结果对比

高危组共109例,共检出43例阳性结果,总检出率39.4%o对照组共40例, 共检出2例阳性结果,总检出率5%。高危组总检出率显著高于对照组(卡方检 验,p<0.01) , OR=12.4o高危组GJB2检出率14.6%,对照组GJB2检出率2.5%, 高危组GJB2检出率显著高于对照组(卡方检验,pv0.05) , OR=6.7;高危组 SLC26A4检出率24.7%,对照组SLC26A4检出率5%,高危组SLC26A4检出率 显著高于对照组(卡方检验,p<0.01) , OR=6.3;高危组12SRNA、GJB3的检 出率高于对照组12SRNA、GJB3的检出率,但并无明显统计学差异(卡方检验, p>0.05) o

4.4高危组内部检测结果对比

高危组中:耳聋患者共71例,共检出32例阳性结果,检出率45.1%(32/ 71)。 听力正常者共有38例,共检出阳性结果11例,检出率28.9% (11/38),二者无 明显统计学差异(卡方检验,p>0.05) o具体基因及突变位点阳性率对比:耳聋 患者GJB2基因突变检出率16.9% (12/71),听力正常者GJB2基因突变检出率 10.5% (4/38),二者无明显统计学差异(卡方检验,p>0.05);耳聋患者SLC26A4 基因突变检出率28.1% (20/71),听力正常者SLC26A4基因突变检出率14.8% (7/38),二者无明显统计学差异(卡方检验,p>0.05);耳聋患者线粒体12S rRNA 基因突变检出率5.6%(4/71),听力正常者线粒体12S rRNA基因突变检出率2.6%

(1/38),二者无明显统计学差异(卡方检验,p>0.05);耳聋患者GJB3基因 突变检出率1.4%(1/71),听力正常者未检出GJB3基因突变,检出率0%(0/38), 二者无明显统计学差异(卡方检验,p>0.05)。总之,虽然耳聋患者各基因阳性 检出率均高于听力正常者,但不具有统计学意义。

4.5高危组19个家庭耳聋基因检测情况

本研究高危组中共有19个家庭49例参与检测。有4个家庭11例检测出致 聋基因,占21.1%(4/19); 15个家庭38例未检测出致病基因,占78.9%(15/19) o 19个家庭中有14个家庭家长无听力障碍但生育出聋儿,占73.7%,这14个家庭 中有3个家庭检测出致病基因,占15.8% (3/19),有2个家庭检测出患儿携带 单个基因的杂合突变,但不能构成致病原因,占10.5% (2/19);家长耳聋但孩 子听力正常的有4个家庭,占21.1% (4/19),其中查明耳聋原因的有1个家庭, 占5.3% (1/19) , 1个家庭检测出患者携带单个基因的杂合突变,但不能构成致 病原因;双胞胎患儿耳聋家庭1个,家长未参检,此2例均未检出携带耳聋基因。 4.6遗传咨询

1号家庭父母均听力正常,但其儿子为先天性耳聋,其父母咨询再次生育聋 儿的风险及其儿子婚后生育聋儿的风险。丈夫携带GJB2基因235delC杂合突变, 妻子同时携带有GJB2基因235delC杂合突变和SLC26A4基因IVS7-2A>G杂合 突变。告知其再次生育聋儿的概率为25%,且再次生育的孩子很大可能携带GJB2 基因235delC杂合突变或SLC26A4基因IVS7-2A>G杂合突变。患儿基因型为 GJB2基因235delC纯合突变和SLC26A4基因IVS7-2A>G杂合突变。由于该患 儿为纯合子,故婚配后生育的下一代必为GJB2基因235delC突变携带者且很可 能同时携带有SLC26A4基因IVS7-2A>G杂合突变,因此建议其婚配对象行GJB2 和SLC26A4基因全面检测或WES,以免生育耳聋后代。

10号家庭父母听力均正常,生育耳聋女儿,咨询其女儿婚后生育聋儿的风 险及如何避免。夫妻双方均为SLC26A4基因突变携带者,分别携带1229C-T 杂合突变和IVS7-2A-G杂合突变,其女儿为复杂合突变,因此致聋。告知其女

儿婚后生育的下一代很可能为SLC26A4基因突变携带者,因此建议其婚配对象 行SLC26A4基因检测,若携带相同基因,还应予以胚胎植入前诊断或产前诊断 等干预措施以避免耳聋患儿的出生。

14号家庭父母听力均正常,其儿子为后天性耳聋,咨询其儿子生育耳聋后 代的风险。该母亲和儿子均携带1555A>G同质性突变,经仔细询问病史得知其 儿子在使用氨基糖昔类药物不久后听力迅速下降,因此推测其儿子为药物性耳 聋。由于线粒体基因突变遵循母系遗传,故告知其儿子的突变基因不会继续遗传 给下一代,但其母系成员皆有药物性致聋风险,应注意避免使用耳毒性药物。

第5章讨论

耳聋是临床常见的感觉障碍,我国耳聋人群占总残疾人群的三分之一,而其 中遗传性耳聋占60%以上⑶。遗传性耳聋具有较强的遗传异质性,不同的基因及 突变位点都可带来不同的表型,不同地区及不同人群的耳聋基因分布及热点突变 位点也具有地域性的特点。据遗传性耳聋网站数据显示 (https://hereditaryhearingloss.org/),截止到 2020 年 1 月 25 日,已发现 120 种 非综合征型耳聋致病基因。我国最常见的耳聋基因为GJB2、SLC26A4、线粒体 12S rRNA和GJB3。针对这些常见的耳聋基因,我国科研工作者已研制出多种基 因筛查方法,目前应用最广泛的为耳聋基因芯片。本研究对长春地区遗传性耳聋 高危人群针对GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA和GJB3基因的15个突变位 点进行了筛查,发现长春地区遗传性耳聋的常见突变基因及位点具有其地域性特 点。

GJB2基因突变为我国最常见的耳聋突变基因。研究显示,我国SNHL患者
GJB2基因突变携带率为27.13%⑹。GJB2基因编码负责离子转运和信号传导的
缝隙连接蛋白Connexin26 (Cx26),该蛋白对维持内耳毛细胞的正常生理功能
起着重要的作用。当GJB2基因突变时,Cx 26编码异常,导致内耳毛细胞功能
障碍,从而导致神经性耳聋。早年研究者认为Cx 26异常使得内耳毛细胞的K+
转运异常,不能正常流入内耳内淋巴液WE,导致耳蜗毛细胞间隙K+积累,对
毛细胞产生毒害作用31。但近年来有学者提出,GJB2不同表型的耳聋机制有所
不同,先天性耳聋的机制在于Cx 26异常导致Corti器隧道打开异常,即耳蜗发
育障碍[⑶,而迟发性耳聋的机制在于耳蜗主动放大作用异常快]。截止到2020年
2 月, 已发现 GJB2 有 432 种突变方式
(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=GJB2),其中隐性突变为主要突变
方式,仅少数位点遵循常染色体显性遗传。各地区GJB2的热点突变位点不尽相
同,具有种族及地域差异性。高加索人种中的热点突变位点为30delG或35delG,
在欧洲不同地域该位点的突变频率也有着较大差异;而在犹太人种中的167delT
为最常见的热点突变位点。东亚人群中的最常见的突变位点则为235delCo流行
病学调查显示,我国耳聋人群的235delC携带率为6.5・22.5%[&问。本研究高危组
中耳聋患者的GJB2基因突变检出率为16.9% (12/71),致病率11.2% (8/71)
12例耳聋患者均携带235delC,检出率16.9% (12/71),致病率11.2% (8/71),
其中2例为235delC和299delAT复合杂合突变,而35delG和167delT突变均未
检出。高危组听力正常者的检出率为10.5% (4/38),携带的均为235delC,未
检出其余位点突变。由此分析,235delC为长春地区GJB2基因的热点突变,GJB2
基因为长春地区遗传性耳聋高危人群的常见突变基因。

SLC26A4为我国第二大耳聋基因,又称为PDS基因,也是引起EVA的主要 基因"I。据统计,我国耳聋人群的SLC26A4携带率为14.5%[59]o SLC26A4基因 负责编码Pendrin蛋白。该蛋白的具体功能为转运并交换Cl・/I■或C1-/HCO3-,维 持内淋巴液离子平衡的同时,促进血管纹生成谷胱甘肽,从而保护血管纹免受自 由基的损害。SLC26A4基因突变时,可导致Pendrin蛋白合成异常和功能障碍, 内耳内淋巴液的离子平衡受到破坏,血管纹也因为HCO3-堆积导致氧化损伤。 此外,由于EVA引起听神经和内耳毛细胞容易受到颅内的压力,导致听神经萎 缩和毛细胞损伤[20],因此在颅脑外伤、发热、用力損鼻等刺激颅内压力增高时, 可诱发患者听力下降01。据人类基因数据库显示,截止至2020年2月,已发现 SLC26A4 基 因 有 587 种 突 变 方 式

(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=SLC26A4),多数突变方式遵循常 染色体隐性遗传。不同地域和人种的热点突变和突变频率各有不同。据报道,高 加索人群常见的突变方式为707T>C、1246A>C和IVS8+1OA,突变频率分别 为16%、15%、14%[6。];捷克人群常见的突变方式为412G>T,突变频率18%⑹]; 日本常见的突变方式为2168A>G,突变频率为3.1%[62];韩国则以IVS7-2A>G 和2168A>G为主。我国各地报道的SLC26A4检出率也有所不同,扬州地区聋人 检出率24.4% (22/90)丽,辽宁地区聋人患者检出率23.43% (30/128) [64],南 京地区聋人检出率7.81% (10/128)[冋,大连地区语前聋患者检出率1&57% (143/770)跑,而广西壮族耳聋人群检出率仅2.61% (6/230)[33]o本研究高危组 中SLC26A4总检出率23.9% (26/109),聋人的检出率为26.8% (19/71),高 于全国平均水平,国内学者研究27省市聋哑学校聋人耳聋基因后发现SLC26A4 最常见的突变位点为IVS7-2A>G,突变频率11.52%旳。本次研究高危组中 SLC26A4最常见的突变位点为IVS7-2A>Go其中耳聋患者检出率15.5%( 14/71), 具体为 IVS7-2A>G 纯合 2 例(2.8%) , IVS7-2A>G 杂合突变 10 例(14.1%), 复合杂合突变 2 例(2.8%) , 2168A>G、1226 G>A、1229OT、2027 T>A 检出 率分别为4.2%、1.4%、1.4%、2.8% (分别检出3例、1例、1例、2例);听力 正常者中SLC26A4总检出率18.4% (7/38),其中IVS7-2A>G检出率10.5%, 2168A>G、1229OT、2027 T>A 检出率均为 2.6% (1/38) □ SLC26A4 基因为 EVA 的责任基因,本次研究中影像学检查共发现EVA9例,其中纯合突变3例,复合 杂合突变2例,杂合突变3例,仅1例未检出SLC26A4基因突变。由于EVA患 者易受头部外伤、发热、感冒等诱因导致迟发性耳聋或听力波动,故行为指导对 此类患者起着重要意义。不论是长春地区的耳聋或听力正常的高危人群, SLC26A4检出率和IVS7-2 A>G检出率均处于较高水平,说明SLC26A4为长春 地区常见的耳聋突变基因,而IVS7-2A>G为本地区的热点突变位点,因此长春 地区对SLC26A4基因突变及EVA均应加以重点诊治及防护,对已检出SLC26A4 基因突变者应加以行为指导及婚育指导,避免耳聋患者听力进一步下降的同时, 降低该地区耳聋患儿的出生率。

由于本研究中检测的GJB2和SLC26A4基因的12个位点都遵循常染色体隐 性遗传,故耳聋患者和听力正常人群均可检出携带突变位点,纯合突变和复合杂 合突变的个体表现为耳聋患者,而单杂合突变的个体为听力正常的携带者。

由于受精卵的线粒体来自于母亲,故子代的线粒体DNA (mtDNA)与母亲 的相同,故遵循母系遗传。若母亲存在线粒体基因突变,则将稳定地遗传给子女, 其女性后代会将突变继续稳定地遗传给下一代,男性后代则不会。mtDNA基因 被认为是药物性耳聋的责任基因,mtDNA基因突变者对氨基糖昔类抗生素非常 敏感,均质性突变和异质性突变均可致病。12SrRNA是其中最常见的突变基因, 1555A>G也被确定为由氨基糖昔类药物诱导的药物性耳聋的的主要突变方式, 其次为14940*22]。这些转变使人的线粒体核糖体与细菌具有相似之处,使氨 基糖昔类药物改变了结合位点,影响线粒体蛋白合成,继而使毛细胞出现呼吸障 碍,最终导致耳聋的发生砂]。我国学者对各地情况综合文献分析后,得出我国耳 聋患者中1555A>G携带率为6.62% (230 / 3473)㈣。全国各地1555A>G的检 出率不尽相同,新疆地区检出率9.28%(18/194)[7。],北京市聋校儿童检出率为 3.16% (5/158) SI,广州、广西地区则未检出1555A>G (0/188)⑺"]。本研究 中,高危组共检出5例,总检出率4.6% (5/109),其中4例是聋人,1例听力 正常,耳聋患者和听力正常者的检出率分别5.6%、2.6%,经详细询问病史,4 例聋人均有氨基糖昔类抗生素使用史,而该听力正常者为其中一患者母亲,无氨 基糖昔类抗生素使用史。戴朴等人经研究发现,每个1555A>G先证者家庭中平 均还有3个聋人及10个听力正常的携带者Bl。对于这些检测阳性但听力正常的 人群,应严格杜绝氨基糖昔类抗生素的使用。

GJB3负责编码缝隙连接蛋白Connexin 31,该蛋白在信号传递及物质转运中 均起着重要作用。我国学者夏家辉最先定位并克隆了 GJB3基因。GJB3基因遵 循常染色体显性或隐性遗传。GJB3基因在我国检出率并不高,多地报道未检出 GJB3基因突变。538 C> T突变为其常见突变方式,临床表型为语后高频听力 下降,并伴有渐进性加重。该位点的遗传方式目前仍有待进一步研究。早年研究 表明,538 C>T突变遵循常染色体显性遗传Bl;此后有学者报道,538 C> T 突变在不同性别中的表型有所不同,在成年男性表现为高频听力下降,而在成年 女性可表现为听力轻度下降乃至完全正常"叫近年来更有学者研究发现听力正常 人群中5380 T突变率与耳聋人群中5380 T突变率无明显差异,对该位点 对听力下降的作用提出质疑⑹。本研究中在耳聋患者中检出GJB3阳性1例,为 5380 T杂合突变,该患者与其妻、子共同参检,其子亦为耳聋患者,但其妻、 子均未检出基因突变,因此该患者可能除GJB3基因5380 T突变以外,还携 带其他基因突变,有待进一步检测。

基因筛查后,给患者对检出结果作出相应解读和遗传咨询是非常必要的。对 检出致病原因的患者,应告知其检测意义,解释检查结果,并给予患者及其家人 相应的婚育指导和行为指导,如避免头部外伤、发热、耳毒性药物的使用等。还 应该对这些患者制定合理的治疗方案,如人工耳蜗植入等。对于检出携带基因突 变但病因不明者和未检出致病基因的患者,应解释原因并其进一步检测查明耳聋 原因,如WES或WGS等©I。对于检出携带致病基因但听力正常的高危人群, 应给予其相应的行为指导,并建议其配偶行基因检测,若其配偶也携带有耳聋基 因,则孕期必须行胚胎植入前诊断或产前诊断,必要时采取相应措施避免聋儿出 生[25]。

本研究中,遗传性耳聋高危人群总检出率38.5%,其中耳聋患者检出率43.6%

(31/71),听力正常者检出率28.9% (11/38),而对照组完全正常的人群检出 率仅为5%,高危人群的检出率明显高于正常人群的检出率。因此,应加强对遗 传性耳聋高危人群的宣传,不论其听力正常与否,都应建议其行基因检测,对检 出有迟发性耳聋风险者应注意避免高危行为预防耳聋的发生或加重,婚育时也应 避免与携带同种基因突变者结合。

第6章结论

  1. 长春地区遗传性耳聋高危人群的基因突变携带率远高于正常人群。
  2. 本研究中,长春地区最常见的耳聋突变基因为SLC26A4和GJB2,其中 SLC26A4基因检出率高于全国平均水平。GJB2的235delC, SLC26A4的IVS7-2 A>G为长春地区热点突变位点。

参考文献

  • 第二次残疾人抽样调查办公室.全国第二次残疾人抽样调查主要数据手册[M]. 北京:华夏出版,2007:2,3
  • Chow Yock-Ping,Abdul Murad Nor Azian,Mohd Rani Zamzureena et al. Exome sequencing identifies SLC26A4, GJB2, SCARB2 and DUOX2 mutations in 2 siblings with Pendred syndrome in a Malaysian family.[J] .Orphanet J Rare Dis, 2017, 12: 40.
  • Van Camp G Willems PJ, Smith RJ. Nonsyndromic hearing im-pairment: Unparalleled heterogeneity [J]. Am J Hum Genet, 1997, 60: 758-764.
  • Ma Yalin,Xiao Yun,Bai Xiaohui et al. GJB2, SLC26A4, and mitochondrial DNA12S rRNA hot-spots in 156 subjects with non-syndromic hearing loss in Tengzhou, China.[J] .Acta Otolaryngol., 2016, 136: 800-805.
  • 徐百成,郭玉芬,王秋菊.常染色体隐性遗传非综合征性耳聋基因研究进展 [J]・中华耳科学杂志,4(2):140-145.
  • Huang Shasha,Huang Bangqing,Wang Guojian et al. The relationship between the GJB3 c.538C>T variant and hearing phenotype in the Chinese population.[J] .Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol., 2017, 102: 67-70.
  • 王国建,戴朴,韩东一,等.基因芯片技术在非综合征性耳聋快速基因诊断 中的应用研究[J]・中华耳科学杂志,2008, 6 (1) : 61-66.
  • Dai Pu,Yu Fei,Han Bing et al. GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing impairment.[J] .J Transl Med, 2009, 7: 26.
  • Jiang Hao,Shi Xi,Qiu Shiwei et al. A screening analysis of the c.176 del 16 mutation responsible for hereditary deafness in a Chinese family. [J] .J Otol, 2016, 11: 134-137.
  • Kelsell D P,Dunlop J,Stevens H P et al. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness.[J] .Nature, 1997, 387: 80-83.
  • Van Laer Lut,Cryns Kim,Smith Richard J H et al. Nonsyndromic hearing loss.[J] .Ear Hear, 2003, 24: 275-288.
  • Zong Liang,Chen Jin,Zhu Yan et al. Progressive age-dependence and frequency difference in the effect of gap junctions on active cochlear amplification and hearing.[J] .Biochem. Biophys. Res. Commun., 2017, 489: 223-227.
  • Qu Yau,Tang Wenxue,Zhou Binfei et al. Early developmental expression of connexin26 in the cochlea contributes to its dominate functional role in the cochlear gap junctions.[J] .Biochem. Biophys. Res. Commun., 2012, 417: 245-250.
  • Zhu XChen J,Liang C et al. Connexin26 (GJB2) deficiency reduces active cochlear amplification leading to late-onset hearing loss.[J] .Neuroscience, 2015, 284: 719-729.
  • Zelante L,Gasparini P,Estivill X et al. Connexin26 mutations associated with the most common form of non-syndromic neurosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans.[J] .Hum. Mol. Genet., 1997, 6: 1605-1609.
  • Zheng Jing,Ying Zhengbiao,Cai Zhaoyang et al. GJB2 Mutation Spectrum and Genotype-Phenotype Correlation in 1067 Han Chinese Subjects with Non-Syndromic Hearing Loss.[J] .PLoS ONE, 2015, 10: e0128691.
  • Azaiez Hela,Yang Tao,Prasad Sai et al. Genotype-phenotype correlations for SLC26A4-related deafness.[J] .Hum. Genet., 2007, 122: 451-457.
  • Everett L A,Glaser B,Beck J C et al. Pendred syndrome is caused by mutations in a putative sulphate transporter gene (PDS).[J] .Nat. Genet., 1997, 17: 411-422.
  • 朱庆文.部分变性高效液相色谱技术筛查中国重一极重度耳聋患者SLC26A4 基因突变方法的建立及应用研究[D].中国人民解放军军医进修学院,2007.
  • Jiang SJ. Gene diagnosis of nonsyndromic deafness [J]. Inti J Pediatr Otorhinolaryngol, 2011, 38(5): 421-425.
  • Okumura T,Takahashi H,Honjo I et al. Sensorineural hearing loss in patients with large vestibular aqueduct.[J] .Laryngoscope, 1995, 105: 289-293; discussion 293-294.
  • Nguyen Tien,Jeyakumar Anita. Genetic susceptibility to aminoglycoside ototoxicity.[J] .Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol., 2019, 120: 15-19.
  • Qian Yaping,Guan Min-Xin. Interaction of aminoglycosides with human mitochondrial 12S rRNA carrying the deafness-associated mutation.[J] .Antimicrob. Agents Chemother., 2009, 53: 4612-4618.
  • 戴朴,刘新,于飞,朱庆文,袁永一,杨淑芝,孙勅,袁慧军,杨伟炎,黄德亮,韩东一.18 个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究(I )-GJB2 235delC和线粒体 DNA 12SrRNAA1555G突变筛查报告[J]冲华耳科学杂志,2006(01):1-5.
  • 袁永一,戴朴.遗传性耳聋规范化筛查与诊断的探讨[J].中华耳科学杂 志,2019,17(05):611-615.
  • Wei Xiaoming,Ju Xiangchun,Yi Xin et al. Identification of sequence variants in genetic disease-causing genes using targeted next-generation sequencing.[J] .PLoS ONE, 2011,6:e29500.
  • 李德洋.基于新一代测序技术的肿瘤线粒体DNA突变研究[D].中国人民解放 军空军军医大学,2018.
  • Furst Daniel,Tsamadou Chrysanthi,Neuchel Christine et al. Next-Generation Sequencing Technologies in Blood Group Typing.[J] .Transfus Med Hemother, 2020, 47: 4-13.
  • 于飞,戴朴,韩东一.GJB2基因突变及语前遗传性非综合征性耳聋[J].国外医学. 耳鼻咽喉科学分册,2005(06):41-43.
  • 江泰峰,彭皎皎,郑虹,等.四川地区277例人工耳蜗植入患者耳聋基因热点突 变筛查结果分析[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2018,32(15):1177-1182.
  • 刘启珍,陈丽鸿,张应龙,等.重庆市永川地区青少年耳聋患者耳聋基因热点突 变筛查分析[J]冲华耳科学杂志,2013, (1):126-130.
  • 王国建,张冠斌,袁永一,等.十五项遗传性耳聋基因突变微阵列诊断芯片的临 床应用研究[J]冲华耳科学杂志,2014,(1):6-10.
  • 刘闽,胥亮,唐凤珠,等.广西地区耳聋人群230例SLC26A4突变结果分析[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2016,30(19):1540-1544.
  • 袁永一,戴朴,等.耳聋基因诊断——转化医学推动耳科学发展的范例[J].中 华耳科杂志,2014,12 (1) : 1-5.
  • 曾云,姜丹,冯大飞,等.飞行时间质谱检测技术在非综合征型耳聋基因检测中 的应用[J]冲华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2013,48(12):985-990.
  • 王大刚,赖春花,倪江鹏,等.MALDI-TOF MS在聚合物分析中的应用研 究进展.分析仪器,2016, 3:71-74.
  • 周永安,杨慧芳,郝子琪,等.山西省非综合征型耳聋患者常见耳聋基因的检测 分析[J]冲华医学遗传学杂志,2015,32⑵:183・
  • 兰莉,叶清,杨可婕,等.贵州省人工耳蜗植入患儿的常见耳聋基因突变位点分 析[J].中华耳科学杂志,2019,17(4):552-557.
  • 徐文华,张志成,梅金鑫,等.新生儿33321例耳聋基因筛查结果分析[J].中国儿 童保健杂志,2018,26(11):1168-1171.
  • 阙婷,李旺,耿国兴,等.广西新生儿遗传性非综合征型耳聋基因筛查[J].重庆医 学,2017,46(7):926-928.
  • 廖林川,孟海英,侯一平,等.用温度调控高效液相色谱探索基因组单核昔酸 多态性的方法研究.中华医学遗传学杂志,2000,17:204-207.
  • 汪丽萍,裘毓雯,尹爱兰,等.应用变性高效液相色谱筛查颅内静脉系统血栓形 成ATJII基因突变及多态性[J].南方医科大学学报,2009,29(10):1982-1986.
  • 张树忠,张宇红,张殿勇,等.应用变性高效液相色谱技术检测汉族人I型多囊 肾致病基因突变[J].中华医学遗传学杂志,2006,23(3):283-288.
  • 华亮,朱海,李欣荣,等.引物延伸变性高效液相色谱产前诊断B ■地中海贫血[J]. 中华医学遗传学杂志,2004,21(6):600-603.
  • 赵娟,郭玲仟,冯永,等.变性高效液相色谱法分析非综合征型耳聋人群 SLC26A4基因突变[J]冲华医学遗传学杂志,2009,26(1):21-25.
  • 吴伟锋,冯永湖浩,等.运用变性高效液相色谱(DHPLC)对中国人非综合征性 耳聋进行GJB2基因突变分析[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2006,12⑷:241・
  • 欧启水,陈添彬.线粒体耳聋及其临床表型多样性的分子诊断[J].临床检验杂 志,2012,30(10):787-792.
  • Yuan Er-Feng,Xia Wei,Huang Jing-Tao et al. A sensitive and convenient method for clinical detection of non-syndromic hearing loss-associated common mutations.[J] .Gene, 2017, 62& 322-32&
  • 袁永一,戴朴.聋病基因筛查和耳聋防控新手段[J].中国耳鼻咽喉头颈外 科,2015,22(02):57-59.
  • 王秋菊.新生儿聋病易感基因筛查的意义与策略[J].中国医学文摘(耳鼻咽喉科 学),2007(01):21-22.
  • 黄丽辉,韩德民.新生儿耳聋基因筛查的质控体系建立[J].中国耳鼻咽喉头颈 外科,2015, 22(2): 60-62.
  • Yin A, Liu C, Zhang X et al. The carrier rate and mutation spectrum of genes associated with hearing loss in South China hearing female population of childbearing age. BMC Med Genet.2013 14:57.
  • 石亮程,刘雅静,丁思意,贺骏,刘正立.长沙地区1951例孕妇耳聋基因筛查情况 分析[J].中国妇幼保健,2019,34(14):3268-3270.
  • 高敏,潘蓉蓉,戴晓云,刘克坚.1737例孕妇常见遗传性耳聋基因检测及后续服 务研究[J]冲华耳科学杂志,2019,17(05):620-624.
  • Lu Yanping,Peng Hongmei,Jin Zhanguo et al. Preimplantation genetic diagnosis for a Chinese family with autosomal recessive Meckel-Gruber syndrome type 3 (MKS3).[J] .PLoS ONE, 2013, 8: e73245.
  • Mahboubi Hossein,Dwabe Sami,Fradkin Matthew et al. Genetics of hearing loss: where are we standing now?[J] .Eur Arch Otorhinolaryngol, 2012, 269: 1733-1745.
  • Zong Liang,Chen Jin,Zhu Yan et al. Progressive age-dependence and frequency difference in the effect of gap junctions on active cochlear amplification and hearing.[J] .Biochem. Biophys. Res. Commun., 2017, 489: 223-227.
  • Zhu YChen J,Liang C et al. Connexin26 (GJB2) deficiency reduces active cochlear amplification leading to late-onset hearing loss.[J] .Neuroscience, 2015, 284: 719-729.
  • Kenneson Aileen,Van Naarden Braun Kim,Boyle Coleen,GJB2 (connexin 26) variants and nonsyndromic sensorineural hearing loss: a HuGE review.[J] .Genet. Med., 2002, 4: 258-274.
  • Campbell C,Cucci R A,Prasad S et al. Pendred syndrome, DFNB4, and PDS/SLC26A4 identification of eight novel mutations and possible genotype-phenotype correlations.[J] .Hum. Mutat., 2001, 17: 403-411.
  • Pourova Radka,Janousek Petr,Jurovcik Michal et al. Spectrum and frequency of SLC26A4 mutations among Czech patients with early hearing loss with and without Enlarged Vestibular Aqueduct (EVA).[J] .Ann. Hum. Genet., 2010, 74: 299-307.
  • Tsukamoto Koji,Suzuki Hiroaki,Harada Daisuke et al. Distribution and frequencies of PDS (SLC26A4) mutations in Pendred syndrome and nonsyndromic hearing loss associated with enlarged vestibular aqueduct: a unique spectrum of mutations in Japanese.[J] .Eur. J. Hum. Genet., 2003, 11: 916-922.
  • 彭新,李霞,徐丽,等.扬州市特教学校耳聋学生常见耳聋突变基因调查报告[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2012,26(13): 577-580.
  • 田颖,王铮,杨宁,等.辽宁地区非综合征型耳聋患者常见耳聋基因突变分析[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2014,28(16): 1244-1247.
  • 徐丽娜,高艳慧,何双八.南京地区耳聋患者常见耳聋基因突变的分析[J].山东 大学耳鼻喉眼学报,2019,33(06):45-4
  • 刘璟,牟书瑜,付敏,刘琳,崔玲,赵黎阳,柏桦,孙秀珍,别旭.常见耳聋基因在大连 地区语前聋患者与耳聋高危人群中的检测分析[J].听力学及言语疾病杂 志,2016,24(06):545-54&
  • 袁永一,黄莎莎,王国建,康东洋,韩东一,黄德亮,戴朴.27个省市聋校学生基于 SLC26A4基因IVS7-2 A>G突变的全序列分析[J].中华耳科学杂 志,2011,9(01):17-23.
  • Guan Min-Xin. Mitochondrial 12S rRNA mutations associated with aminoglycoside ototoxicity.[J] .Mitochondrion, 2011, 11: 237-245.
  • 纪育斌,王秋菊,兰兰,王卉,史伟,刘穹,满荣军,韩东一.国内线粒体 DNA12SrRNA A1555G突变的流行病学文献分析[J].听力学及言语疾病杂 志,2010,18(01):6-10.
  • 李琦,戴朴,黄德亮,等.新疆药物性耳聋相关线粒体突变研究[J].中国听力语言 康复科学杂志,2008,(5):28-30.
  • 王国建,戴朴,韩东一,等.非综合征型聋患者GJB2 235delC及线粒体DNA A1555G突变分析[J]所力学及言语疾病杂志,2007,15(2):114-115,125,插
  • 周枫,林颖,刘静,梁剑敏,罗琼,王海涛.广州市聋校听力障碍学生线粒体 DNA12S rRNAA1555G 突变调查分析[J].中华耳科学杂志,2013,11(02):272-275.
  • 刘水霞.广西壮族人群非综合征性聋常见致聋基因突变的研究[D].广西中医 药大学,2016.
  • Xia J H,Liu C Y,Tang B S et al. Mutations in the gene encoding gap junction protein beta-3 associated with autosomal dominant hearing impairment. [J] .Nat. Genet., 1998, 20: 370-373.
  • 李庆忠,王秋菊,赵立东,袁虎,李丽娜,刘穹,韩东一.国人非综合征型遗传性聋 患者GJB3基因突变分析[J].听力学及言语疾病杂志,2005(03):145-148.