低强度聚焦超声调控小鼠学习记忆的实验研究论文

2020年9月14日11:44:56低强度聚焦超声调控小鼠学习记忆的实验研究论文已关闭评论

低强度聚焦超声调控小鼠学习记忆的实验研究论文

摘要
学习记忆功能的正常工作对人类活动非常重要。随着相关科普推进,此方面 的疾病问题日益凸显,引起了人们的关注和重视。目前学习记忆功能异常的相关 疾病如创伤性应激障碍、阿尔兹海默症等不仅致病机制不明确,在临床上也没有 明确的治疗方式,造成严重的家庭负担和社会负担。因此,探寻能够调控和治疗 相关疾病的技术是一项亟待解决的问题,并具有重要意义。现有的电极刺激、磁 刺激、光遗传学等神经调控技术对相关问题都有一定局限性和不适用性,电刺激 和光遗传方法都需要进行有创手术,而磁刺激空间分辨率差。超声神经调控作为 一种新型无创神经调控方式,能够无创、多点刺激且可以刺激到大脑深部核团。 本文将此技术应用于学习记忆功能的调控,研究超声神经调控刺激相关脑核团对 学习记忆的影响。
根据超声神经调控技术的优势,本文从超声波的基本知识和理论出发,自制 符合实验需求的超声换能器与对应的用于刺激的准直器,搭建由信号发生器、功 率放大器、超声换能器构成的用于超声刺激的超声神经调控系统,并使用超声声 束分析仪和三维声场扫描仪对声场分布及参数进行测量。随后以小鼠为实验对象 进行超声神经调控的研究。
接着本文从对普通C57小鼠进行干预入手。选择了与学习记忆相关神经环 路的下游脑核团前额叶皮层(PrefTontalCoTtex, PFC)进行超声刺激,确定能够 起到调控学习记忆功能的参数。使用脉冲超声波对小鼠(对照组:n = 36只,超 声组:ii = 36只)进行单次超声干预实验,并进行与学习记忆相关的行为学测 试,包括Freezing条件恐惧实验及Y迷宫实验,Freezing条件恐惧实验中将第二 天20次的数据进行分析,Y迷宫实验统计小鼠总进臂次数、进入新开放臂的次 数、在新开放臂中的探索时间、连续进入三个臂的次数等数据。实验证明超声神 经调控技术能够有效调控小鼠的学习记忆能力;使用超声参数一刺激小鼠前额叶 皮层对小鼠的恐惧记忆的消退有促进作用;用超声参数二刺激小鼠前额叶皮层对 小鼠的恐惧记忆的消退有抑制作用,超声刺激组小鼠恐惧记忆更加强烈;超声对 前额叶皮层的调控作用因参数不同具有双向性。
为了在阿尔兹海默症(Alzheimefs Disease, AD)疾病模型小鼠中验证超声 对学习记忆功能的调控作用,对普通C57小鼠进行了前期实验。本部分选择了 PFC的上游核团、与AD相关的脑核团海马齿状回(DentateGyrus, DG)进行超
声刺激。考虑到准直器的安装需要进行有创手术、AD模型鼠需要进行12天的 超声刺激及安全性情况,前期实验以及AD模型实验中只对小鼠头顶部进行脫毛 并将超声波基频下调。使用超声波对小鼠进行单次急性刺激,并进行了新事物识 别测试。实验结果证明超声刺激后的小鼠对新事物的探索表现比假刺激组的小鼠 更加强烈,对旧事物具备更好的记忆及辨别能力。
接着本文使用超声神经调控技术对AD模型小鼠进行相关研究,沿用C57小 鼠的超声参数进行隔天一次超声刺激,并每三天注射一次EdU溶液,在第13天 进行小鼠转棒实验、第14天进行Y迷宫实验和旷场实验,最后取脑进行EdU细 胞增殖检测。结果:超声神经调控刺激组小鼠的海马区域提高AD小鼠的平衡协 调能力、被迫运动能力以及辨别性学习、工作记忆能力;超声神经调控技术的干 预没有导致AD小鼠的焦虑情绪增加,没有影响小鼠自主探索、自主运动的能力。 海马齿状回及皮层有明显的细胞增殖情况,推测超声神经调控能够提高AD小鼠 的学习记忆能力表现的原因可能为超声刺激促进该区域神经元的增殖。
综上所述,本研究设计符合实验要求的超声换能器及准直器,搭建了超声神 经调控刺激系统。将该系统首先应用于普通小鼠的前额叶皮层、海马齿状回区以 及AD模型小鼠的海马DG区,证明了超声神经调控能够有效影响小鼠学习记忆 能力,具有双向性,还提出小鼠改善学习记忆的原因可能是其引起了神经元增殖。 本实验不仅为超声神经调控的机制提供了新的可能和实验数据,也为治疗学习记 忆相关疾病提出新的方法。
关键词:超声神经调控,聚焦超声波,学习记忆,恐惧记忆,阿尔兹海默症
Abstract
The proper functioning of learning and memory is important for human activity. With the popularization of relevant knowledge, the problem of related diseases has been increasingly prominent and attracted people's attention. At present, diseases related to learning and memory dysfunction, such as traumatic stress disorder and Alzheimer's Disease, not only have unclear pathogenesis, but also have no clear clinical treatment, causing serious family burden and social burden. Therefore, it is of great importance to find a technology that can regulate and treat related diseases. The existing neuromodulation techniques such as deep brain stimulation, transcranial magnetic stimulation, optogenetics and other method all have some inapplicability and limitations to solve the problems. Both electrical stimulation and optogenetic methods require invasive surgery, while magnetic stimulation has poor spatial resolution. As a new type of noninvasive neuromodulation, ultrasound stimulation can stimulate the deep brain nuclei noninvasively and in multiple places. In this paper, this technique was applied on the learning and memory-related cerebral nuclei to study the effect of ultrasonic neuromodulation to the learning and memory function.
According to the advantage of ultrasonic neuromodulation, ultrasound transducer and collimator based on the basic knowledge and theory of ultrasonic wave were designed and manufactured to meet the demand of experiment. An ultrasound stimulation system was composed of a signal generator, a power amplifier and an ultrasound transducer, the ultrasound beam analyzer and 3D sound field scanner were used to measure the acoustic field distribution and parameter of ultrasound. Subsequently, ultrasound neuromodulation was studied in mice.
Starts with the intervention of common C57 mice, the prefrontal cortex (PFC), a downstream nucleus associated with learning and memory circuits, was selected for ultrasound stimulation to seek the parameters that can modulate the function of learning and memory. Using pulsed ultrasound in mice (the control group, n 二 36, the ultrasound group, n 二 36) for acute single ultrasound stimulation, then doing behavior test associated with learning and memory functions, including Freezing cued fear conditioning test and Y-maze test. Fear conditioning test, the data of 20 times on the second day were analysed, and the Y-maze test statistics total times that the mice get
into the arms, the times of enter the new open arm, the time of explore the new opened arm and alternation times. The experiment proves that the ultrasound can effectively modulation the learning and memory ability of mice. Using ultrasound parameters A to stimulate the prefrontal cortex of mice can promote the regression of the fear memory of mice; While using ultrasound parameters B, the fear memory of the mice in the ultrasound stimulation group was stronger than the sham group, ultrasound stimulation can inhibit the regression of the fear memory. The regulation effect of ultrasound on prefrontal cortex is bidirectional due to different parameters.
In order to verify the role of ultrasound in modulation of learning and memory in Alzheimer's Disease (AD) model mice, a basic study was conducted in C57 mice. In this part, the dentate gyrus (DG), the upstream nucleus group of PFC and the brain nucleus associated with AD, was selected for ultrasound stimulation. Considering that the collimator installation requires surgery, the subsequent long-term ultrasound stimulation experiment are required for AD model mice, only the top of the mouse head is depilated and the ultrasound fundamental frequency is down-regulated in the basic experiment and AD model experiment. A single stimulation was performed on the mice by using ultrasound, and novel object recognition test was carried out. The experimental results showed that the mice stimulated by ultrasound showed stronger performance in exploring new things than those in the sham group, and they had better memory and discrimination ability for old object.
Then this study uses the ultrasound neuromodulation technology to research on AD model mice. The ultrasonic parameters of the basic study of C57 mice were used in this part to ultrasonic stimulate every other day, and the EdU solution was injected every three days. The rotarod test was carried out on the 13th day, the Y-maze test and open field test were carried out on the 14th day. Finally, the brain was taken for the detection of EdU cell proliferation. Results: the hippocampal region of the mice was stimulated by ultrasound neuromodulation to improve the function of balance and coordination, forced movement, ability of discriminative learning and working memory of the mice. The intervention of ultrasound stimulation did not increase the anxiety, and did not affect the ability of explore and autonomous motor function in AD mice. There was obvious cell proliferation in the dentate gyrus of the hippocampus and cortex after ultrasound stimulation. It was speculated that the reason that ultrasound neuromodulation could improve the performance of learning and memory ability in AD mice might be that ultrasound stimulation promoted the proliferation of neurons in this
area.
In summary, this study designed the ultrasonic transducer and collimator in accordance with the experimental requirements, and established the ultrasound brain stimulation system. The system was firstly applied to the prefrontal cortex, hippocampal DG area of C57 mice and then hippocampal DG area of AD model mice, which proved that ultrasound neuromodulation can effectively affect the learning and memory ability of mice with bidirectional characteristics, and suggested that the reason for the improvement of learning and memory in mice may be that it causes the proliferation of neurons. This study not only provided new possibilities and experimental data for researching the mechanism of ultrasound neuromodulation, but also proposed new methods for the treatment of learning and memory-related diseases.
Key Words: ultrasound neuromodulation, focused ultrasound, learning and memory,
fear memory, Alzheimer's Disease
1.1课题背景及研究意义
1.1.1学习记忆功能及其重要性
学习和记忆是两种大脑重要的神经功能,两者区别却又相互联系、相辅相成。 学习记忆的过程是动物在与周围环境互动中产生的识别、巩固和重现的过程,即 对输入信息的编码(encoding)>储存(consolidation)和提取(retrieval)过程(Abel和 Lattal, 2001)o信息必须首先被大脑编码为“印迹”,并随着时间的推移进行相 关的关联和重复,使“印迹”得以保持和巩固,最后才能被回忆复现,以供在其 他认知过程使用。
记忆的分类方式复杂,按照记忆内容能够储存的时间可以分为瞬时记忆 (Sensory Memory)> 短时记忆(ShoTt-Tenn Memory)和长时记忆(Long-Tenn Memory) (White, 1998)o长时记忆又分别情景记忆和语义记忆,或根据最后的 存储方式分为程序性记忆和陈述性记忆(Semantic Memory )(Hainmueller和Bartos, 2020)-
正常运作的学习记忆功能对动物及人类的生活其关键性作用。学习记忆能力 让我们能够从周围环境中获得信息和经验,再根据经验对环境的变化做出相应的 反应来适应新的环境,是保障我们能够正常进行个体活动和社会活动的重要功能 之一。同时,学习记忆功能是我们获取知识、掌握技能的途径,与人们的学业、 事业等方面息息相关,在人类的一生中发挥重要作用。
1.1.2学习记忆相关疾病
许多疾病对学习记忆功能产生影响,例如但不仅限于糖尿病、脑血管疾病、 抑郁症及失眠症等(Burt 等,1995; Gold 等,2007; Larrabee 和 Crook, 1995)。 同样,学习记忆功能异常也会直接导致多种记忆相关疾病,严重影响患者的家庭 生活与社会生活的正常进行,并增加家庭及社会的经济负担与心理负担。记忆功 能障碍引发的疾病可以分为以下几种:⑴痴呆,核心症状体现为出现记忆衰退, 最常见为阿尔兹海默症(Alzheimer's Disease, AD)、路易体痴呆等;⑵脑外伤 (Traumatic Brain Injury, TBI)引发的记忆障碍,这种记忆障碍是大脑由于外力产生 损伤造成的,症状的维持时间短期到永久不定;⑶应激所致记忆障碍,是一种患 者在应激事件下产生强烈的应激反应、损害认知功能和记忆功能的情况,最常见 为创伤性应激障碍(Posttraumatic Stress Disorder, PTSD);⑷科萨科夫综合征,是 由酒精或严重营养不良导致的综合征,不仅近期记忆缺损还伴有学习困难、谑妄 等症状。可以发现,影响学习记忆功能的因素非常多且复杂,其不仅与个体的自 身正常发育相关,还受到情绪、生活习惯、新陈代谢、生物钟节律等多方面因素 影响(Stickgold, 2005) o
创伤后应激障碍(PTSD)是一种由于经历或目睹如战争、自然灾难、突发 事故等严重事件而产生应激反应的精神障碍,PTSD最典型的症状是“重新体验”, 即不自觉地以闪回、噩梦等生动而痛苦的方式重新体验创伤事件的各个方面。回 避创伤记忆是PTSD的另一个核心症状,创伤后应激障碍患者常常试图将事件的 记忆抛诸脑后,选择回避创伤事件的相关内容,避免详细思考或谈论与事件相似 或相关的人、地点或情况。患者还存在反应过度的症状,易怒、焦虑、保持高度 警惕,难以集中注意力,甚至存在睡眠问题。PTSD患者也会表现出情绪麻木的 症状,包括感觉丧失、社交障碍、放弃以前重要的活动和遗忘事件的重要部分。 许多创伤后应激障碍患者还会出现其他相关症状,例如感到羞耻、内疚和性欲减 退(National Collaborating Centre for Mental, 2005)。而创伤性事件的发生并不罕 见,根据统计超过三分之二的一般人群经历过创伤性事件,约十分之一的创伤性 事件会导致创伤后应激障碍,约三分之一的PTSD患者症状持续3年或更长时 间,男性终生患病率为5.0%,女性则约是男性的两倍,达至(J 10.4% (Kessler等, 1995)o在战争多发地、自然灾害发生地等特殊地区及人为事故发生区域,患病率 则更高(Galea等,2005; Noiris和Fran, 1992)。三个月内应激反应减弱称为急 性型,应激反应维持超过三个月称为慢性型,患者在事件发生后的数个月后出现 症状称为迟发型(Friedman等,2011)。PTSD的风险受到与创伤相关情绪的强烈 程度的影响(Frans, 2003),并且通常患有共病,约有30%的患者伴随抑郁症,15% 的患者患有强迫症,在有治疗要求的患者中有60%〜80%合并酒精或药物依赖 (Swedo, 2014)o尽管很大比例的创伤幸存者在接下来的几年里无需治疗就能康 复,但创伤性事件的经历和记忆严重影响患者的身心健康,让患者很难正常地进 行生活活动和社会活动。目前PTSD的治疗手段仅有心理治疗和通过抗抑郁药物 进行治疗(Foa等,2000; Taylor等,2003),心理治疗的疗程长、疗效慢、成本 高,药物治疗具有副作用,因此寻找一个快速有效、安全、低成本的治疗方式具 有重大研究意义。
阿尔兹海默症(AD)也叫老年痴呆症,是一种由神经元结构出现异常或神 经元退化、死亡导致的脑功能性障碍疾病。阿尔茨海默病的临床诊断标准包括隐 匿性起病和渐进性记忆等认知功能损害,表现为对环境内的新信息的学习和记忆 能力受损;难以处理复杂任务、判断力差;视觉空间能力受损,无法识别人脸或 物体、操作简单的工具;语言功能受损;个性、行为或举止的变化,产生不典型 的情绪波动(McKharm等,2011)。根据2019年世界阿兹海默症组织的报告,在 2015年已经有超过4680万痴呆患者,2019年超过5000万,平均每三秒就会增 加一位痴呆症患者,患者数量每二十年就会增长一倍,并将在2050年达到1亿 5千万。与此同时此报告预测2030年全球关于痴呆症投入的经济成本将达到2 万亿(International, 2019)。现阶段增长的患者数量大部分来自于发展中国家,约 58%的患者来自中低收入的国家,这个比例在2050年将达到68%o在中国,老 年人口约占我国人口的30%,而AD患病率逐步升高,约有3.21%的65岁以上 老人患有阿尔兹海默症,75岁以上达8.26%o中国现已成为拥有阿尔兹海默病患 者最多的国家,预计2050年我国AD患者将超过2000万。每年9月21日被设 为世界老年痴呆日进行相关科普以引起群众的重视。阿尔兹海默症患者人口基数 大、致病原理有待明确、患病前期症状难以发现、临床上没有明确有效的治愈方 式,是影响全球的重大公共健康问题之一。明确阿尔兹海默症的致病原理、找到 安全有效的治愈手段攻克阿尔兹海默症刻不容缓。
1.2神经调控技术的发展
21世纪以来,随着人口老龄化情况加剧和社会的发展进步,越来越多的人 开始关注和重视阿尔兹海默症、帕金森等神经精神疾病和脑疾病。我国不仅人口 基数大且伴有人口老龄化问题,此类疾病患者的增长不仅增加了家庭和国家的经 济负担,还带来了一系列社会问题。然而,目前对各种脑功能疾病的发病机制并 不明确,在临床中更缺乏有效的治愈手段。在此背景下,脑科学技术研究是一项 具备重大意义和挑战的科研任务,引起了各国各地区科学家和医生的关注。探索 脑疾病和神经精神疾病的致病机制、开发先进的治疗方法迫在眉睫。
1.2.1神经调控技术的发展
神经调控是一个涉及医学、生物学与生物医学工程学等众多学科领域的技术。 神经调控治疗利用刺激来增强或者抑制神经系统的活动,达到对精神疾病的治疗 目的。
随着发电机和化学电荷存储装置的进步以及神经肌肉的电兴奋性理论的提 出,电作为治疗工具受到广泛使用。在1803年,Aldini等科学家称通过电刺激 头部成功治疗重度忧郁的病人(Aldini, 2019)o科学家发现单脉冲电刺激直接引起 运动皮层的神经反应(Adrian和Moruzzi, 1939),电随后作为一种精神疾病治疗 工具得到了确立(Gilman, 2008)o电刺激法得到了广泛的实验研究,证明可以有 效用于治疗癫痫、慢性疼痛、抑郁症等疾病中(Lewis等,2016)。而电刺激需要 将电极植入目标区域,于是非侵入性神经调控的方法随着知识与技术的进步应运 而生。19世纪90年代,科学家证明了可以通过法拉第电磁感应,在不与目标物 有任何物理接触的情况下刺激神经(Geddes, 1999)□ 1929年,Harvey发现超声对 周围神经的刺激,后来证实聚焦超声(FUS)可以调节哺乳动物体外及体内脑组 织的活动(Fry等,195& Rinaldi等,1991)。生物学的发展、技术的进步促成了 光遗传学的诞生,这种神经调控方法可以特异性地调控某一类离子通道,对致病 机制的研究、大脑工作环路的探索帮助巨大。
近年,许多国家提出了脑科学计划,目的是揭示人类大脑智能的形成和工作 原理,对人脑进行开发、调控和保护。2013年4月2日,美国宣布启动“创新性 神经技术大脑研究”计划(Brain Research through Advancing Innovative Neurotechnologies Initiative) (Martin 和 Chun, 2016),同年欧盟推出了 10 年“人 类脑计划” (Human Brain Project) (Amunts 等,2016)。在 2014 年和 2016 年, 日本和澳大利亚相继提出自己的脑计划项i (Committee, 2016; Okano等,2016)。 中国脑计划项目在国家“十三五计划''以及“科技创新2030"两个重要的文件中明 确提出,并随着相关研究中心的建成拉开帷幕(Poo等,2016)。
1.2.2常用于调控记忆的神经调控技术
发展到现在为止,当下热门的神经调控技术主要包括深部脑刺激、光遗传刺 激、经颅磁刺激以及超声刺激。
1.2.2.1深部脑刺激
脑深部电刺激(Deep Brain Stimulation, DBS)>目前在临床上应用最广泛的神 经调控技术,是有效控制帕金森、癫痫等疾病发病的手段。深部电刺激的方法是 经过外科手术将刺激电极植入在精确的目标点位,包含电源的脉冲发生器植入在 锁骨附近皮肤下,导线埋入皮下,通过可控的电流刺激调节核团靶点区域细胞的 状态,达到有效干预和治疗疾病的目的(Maybe冬,2005; Fasano, 2015; Ressler, 2007),深部脑刺激治疗难治性局灶性癫痫已通过FDA的认证,用于临床治疗。 DBS已被证实可以有效调控学习记忆能力(Hamani等,2010;Hamani等,2008), 并在PTSD动物模型和AD动物模型中进行实验研究(Koek等,2014; Laxton等, 2010) o
深部脑刺激

图1. 1深部脑刺激原理示意图(Rosa和Lisanby, 2012)
Fig. 1.1 Schematic diagram of deep brain stimulation・

1.2.2.2经颅磁刺激
经颅磁刺激技术是一项无创神经调控技术,将磁性线圈置于头皮,通过改变 通过线圈电流,产生垂直于线圈平面的磁场。该磁场穿透颅骨并在脑组织中产生 感应电流,使皮层区神经细胞膜电位变化(Valero-Cabre等,2017),这项技术已被 用于治疗抑郁症、中风等疾病。实验证明TMS刺激小脑会损坏工作记忆(Desmond 等,2005),而刺激前额叶皮层位置会短暂地改善有记忆障碍的老年人的认知能

图1. 3光遗传刺激原理示意图(Pastrana, 2011)
Fig. 1.3 Schematic diagram of optogenetics.

光遗传学调控技术是将遗传学与光学相结合的高精度神经调控技术,可以对 自由活动的哺乳动物生物系统进行精确的、有针对性的、快速的控制。利用病毒 遗传学的相关方法,将外源的光感基因导入,使细胞特异性表达光敏蛋白通道, 并根据光敏蛋白的种类和特点用特定波长光照辐射对光敏蛋白通道的开合进行 调控,实现细胞膜电位的变化,从而改变该神经元的发放状态(Deisseroth, 2011)。 此技术因其分辨率高及特异性强的优点,广泛应用于探索和研究脑核团功能与相 互联系、不同种类细胞的功能等神经生物学及分子生物学领域。应用此方法已经 证实并修正了人类过去在记忆相关研究中的假设,并且应用于探索皮层、杏仁核 和纹状体区与记忆过程的关系(Ciocchi等,2010; Shimizu等,2000),也是人类 目前对研究学习记忆过程的脑环路、分子机制的重要手段。
1.2.3超声神经调控的产生与研究现状
自科学家1929年发现超声能够调控神经元后,相关研究进一百年来没有间 断。2008年起,许多期刊陆续刊登了关于超声神经调控的研究结果和文章 (Landhuis, 2017; Legon 等,2014; Tufail 等,2010),这一技术引起了相关学者 们的高度关注。

图1.4聚焦超声刺激原理示意图(Lea-Banks, 2020)
(Q靶向大鼠右侧运动皮层的聚焦超声刺激系统;(b) MRI引导下选择3个聚焦超声
靶区
Fig. 1.4 Schematic of (a) Focused ultrasound system targeting the right motor cortex of
a supine rat with (b) MRI guidance selecting three FUS targets.
超声神经调控技术也是一项无创的神经调控技术,尽管其调控神经元的机理 并不明确,但已有大量实验证明其调控有效性。2008年,Tyler等通过低强度、 低频率的聚焦超声刺激小鼠的脑片和离体全脑后,发现了超声能够影响神经元的 钠、钙离子通道(Tyler等,2008)o随后应用在小鼠、大鼠、兔甚至人等动物模型 中进行了一系列实验,证明了超声可以穿颅刺激神经元(Deffieux等,2015; Lee 等,2016)o中国科学院深圳先进技术研究院的郑海荣团队获批重大科研仪器设 备研制专项“基于超声辐射力的深部脑刺激与神经调控仪器研制”,在国内率先 开展了在细胞、脑片、线虫、啮齿类动物和猴子等不同水平的超声神经调控研究, 并将此技术运用于多种疾病模型(Li, Guo-Feng等,2016; Zhou等,2019)。
此技术是新兴神经调控技术,有研究人员发现,低强度脉冲超声可以通过调 控TLR4 / NF-kB信号和CREB / BDNF表达来降低由脂多糖引起的炎症和记忆 损伤(Chen等,2018),但目前还没有使用低强度超声调控学习记忆并且治疗脑疾 病如阿尔兹海默症的实验及文献报道,以上的研究成果,为超声神经调控治疗脑 功能疾病提供了有力的依据。
现有的物理神经调控技术各有利弊,深部脑刺激的技术较为成熟,分辨率较 高,但是没有特异性、需要电极植入手术;经颅磁刺激无创,但空间分辨率低、 没有特异性且较难抵达深部脑区;光遗传技术具有高空间分辨率和特异性靶向离 子通道等蛋白的优点,但需要植入光电极和基因操作,难以在人类脑部实现调控 神经元的应用。相比而言,超声神经调控具有无创、空间分辨率较高、可以抵达 较深的脑区及核团的优点,是一种新兴的具有发展前景的神经调控技术。
表1・1现有物理的神经调控技术分析比较
Table 1.1 Comparison of existing physical neuromodulation technology
DBS TMS Optogenetics Ultrasound
刺激装置 电极 电磁感应线圈 光电极 超声换能器
能量传递 电 磁 光 超声
创伤性 有 无 有 无
空间分辨率 亚mm 厘米级 高 1-2 mm
刺激深度 电极植入深度 1-1.5 cm 电极植入深度 10-15 cm
刺激靶点 电极区域 电磁覆盖区域 光敏蛋白 传播路径区域
1.3本文所要解决的问题和创新点
1.3.1本文所要解决的问题
本文的主要研究是通过超声神经调控技术对普通小鼠以及AD模型小鼠的 学习记忆相关核团进行调控,并评估超声刺激对其学习记忆能力的影响。同时现 有研究表明虽然超声神经调控技术调控神经元的原理尚不明确,但不同的超声参 数影响着其对神经元的作用效果,现有的研究结果中超声调控神经元的结果既有 激发型也有抑制型,说明其调控效果具有双向性,选择合适的刺激参数对小鼠学 习记忆功能进行调控也是本文所要解决的问题之一。
1.3.2本文的创新点
传统的神经方法主要有脑深部电刺激(DBS)和经颅磁刺激等,这些技术或 需要手术,或只能作用在大脑皮层,空间分辨率较低。而本文所使用的是同时具 有无创、分辨率高、刺激深度理想、通过调节超声波靶向目标区域的优点的调控 方法,即超声神经调控。本文率先采用超声调控学习记忆能力,为研究相关疾病 的发病机制以及治愈提供了新的思路和方法。同时,本研究中选择了聚焦超声探 头。相比于平面超声探头,聚焦超声探头具有更好的空间分辨率。声场焦点大小 为毫米级别,可以有效的针对某一脑部位置进行刺激。其次,本文通过改变超声 的各种调控相关参数,找到了三组参数刺激小鼠前额叶皮层及海马能够对小鼠的 学习记忆相关行为学表现及功能产生影响,不仅证明超声刺激对学习记忆影响的 有效性,也证明了超声神经调控的双向效应。最后,本研究将此技术应用在阿尔 兹海默症动物模型中,通过阿尔兹海默症模型小鼠的行为学表现评估其学习记忆 能力的改变,并进行了细胞增殖EdU检测,证明超声改善疾病模型小鼠的可能 原因是超声刺激促进了海马区域新生细胞增多。
1.4论文的组织结构
论文以利用超声神经调控技术实现对小鼠学习记忆能力的调控,结合超声、 电子、生物学等领域知识,为超声神经调控技术的应用和学习记忆相关疾病的治 疗提供了新方法和新思路。论文的内容安排如下:
第一章介绍了学习记忆功能正常运作的重要性及其相关疾病的现状,并阐述 了神经调控技术和国内外脑科学计划的发展,重点调研了当前主流的物理神经调 控技术及其在调控学习记忆功能方面的研究进展,并介绍了超声神经调控这一新 兴神经调控技术。
第二章介绍了超声的基本原理以及超声相关的概念,包括超声波的概念、数 学描述、传播特性以及生物学效应。
第三章阐述了符合实验需求的超声换能器及准直器的设计、制作及其性能评 估。本部分首先介绍了超声换能器的工作原理及相关材料,并通过前文的基础知 识及实际实验需求设计并制作超声换能器,最后使用超声波束分析仪及水听器对 制作的超声换能器的性能及声场分布进行测量和评估。
第四章介绍了利用超声神经调控技术对正常小鼠学习记忆能力进行影响的 实验方法及实验结果。本部分首先调研并阐述了实验涉及到的生物学知识,包括 小鼠颅骨构造基本特征、学习记忆的相关脑核团及神经环路。之后采用了三种超 声刺激参数,证明超声刺激mPFC及海马区域可以影响小鼠的学习记忆功能。
第五章介绍了利用超声神经调控技术对AD模型小鼠学习记忆能力进行影 响的实验方法及实验结果。通过多种行为学方法验证其有效性,并使用EdU细 胞增殖检测对刺激区域的细胞增殖情况进行检测。
最后在第六章总结了整个实验内容及论文结果,并讨论了论文的不足和将来 的研究方向。
第2章 聚焦超声神经调控的物理与生物学背景
2.1超声物理学基础
2.1.1超声的定义
振动是普遍存在的一种现象,大至地震、海啸,小至分子的布朗运动都是振 动现象。一些振动拥有固定的波长和频率,一些振动则没有。振动的传播过程称 为波动,根据其本质可以划分为电磁波和机械波。电磁波是一种电场与磁场相互 垂直以波的形式移动的振动粒子波,机械波是机械振动在弹性介质中的传播过程 (Goubau和Schwering, 1961)。声波是一种机械波,需要依靠弹性介质进行传播, 不能存在于真空环境。介质中的某一物体或质点的振动,带动相邻的介质分子随 之振动,造成局部介质压力的增加。这样的压力随后带动相邻介质分子周围的介 质,后者又推动它临近的介质,即介质分子的运动附加了一个规律运动,使单位 体积内的介质在稠密和稀疏状态交替,如此接力振动使声音可以在介质分子中传 播。
以频率高低可以将声波区分为次声波、声波、超声波等。人类的听力频率范 围约为20-20kHz,此频率范围内的称为声波,低于此范围的称为次声波,高于则 称为超声波。大多数医学超声设备所用频率为2-15MHzo超声波按照质点振动方 向可以分为纵波、横波、表面波等,按波形分类可分为平面波、柱面波、球面波。
2.1.2超声波的描述参数
2.1.2.1声波波动方程
声波波动方程用于数学描述声波,用波动方程可以求得任何空间位置上的质 点在任何时间点的运动状态。在无限均匀的理想流体介质内,存在一个无限大平 面刚性物体沿着法线来回震动,此时产生的声场就是平面波,用小振幅声波一维 声波方程表示为:
附 1附
斎卞乔 21)
其中,*为质点或物体振动传播到的某一距离位置,〃是物体或质点振动时,在 兀位置的物体或质点离开平衡位置的垂直位移。C为声速。
对于声波向无限空间传播的情况,其解为:
〃(切=加心)+b/T (2.2)
其中,第一项表示延兀正方向行进的波,第二项代表延X负方向行进的波。
三维空间声波方程为:
(2.3)
2.1.2.2超声波的基本参数
声波的波动频率与单一质点的振动频率概念不同、数值相等。用/表示,单 位为Hz。波长用2表示,单位为mm。波速用c表示,单位为m/s。可以得到:
c = Af 24)
声速也可以由介质的可压缩性来表示,即压强改变引起的密度变化程度。声 速也受介质温度的影响,温度改变则声速大小随之改变,此时声波的传播速度可 以表示为:

其中,P、V、T为单位气体的压强、体积和绝对温度,“为气体摩尔质量。应注 意的是,声波的传播速度c与某一特定质点的振动速度V是完全不同的两个物理 量,需要区别。
超声波波速与介质的弹性模量和介质密度有关,不同介质有不同的声速。在 固体介质中,纵波声速、横波声速、表面波声速依次为:

量。Q为介质密度,2为介质泊松比。
只能承受压应力的液体气体只能传播纵波,当介质温度变化时,纵波声速也 会变化。纵波波速为:

其中,8是液体、气体介质的容变弹性模量。
表2・1超声波在介质中的传播速度和声阻抗(万明习,2010)
Table 2.1 The Speed and Specific acoustic impedance of ultrasound in medium
介质 传播速度(m/s) 声阻抗率(MPa・s/m)
空气 340 0.000439
水(20°C) 1448 1.480
大脑 1460 1.510
小脑 1470 1.514
软组织 1540 1.632
脑脊液 1522 1.523
颅骨 4080 6.184

当介质中有超声波传播,质点振动产生压强交替变化,超声声场中某一点在 某一瞬时所具有的压强为Pi,该点没有超声波存在所具备的压强为弘,二者之 差称为逾量压强,也称为该点的声压。用p表示,单位为MPao
P = Pi~PQ (2.10)
声阻抗指介质中某一点的声压几与该质点的振动速度V之比,表示超声场 中戒指对质点振动的阻碍作用,不同的介质具有不同声阻抗。常用Z表示,单位 为Pa -s/m2 ,计算公式为:
Z = g = pc (2.11)
声强是指单位时间内通过垂直于波动传播方向单位面积的能流,也称为能流 密度。常用I表示,单位为w/cm2 ,计算公式为:
I=-ZV2 =L (2.12)
2 2Z
超声波是频率很高、波长很短的机械波,波长通常为毫米量级。这样的属性 让其可以定向发射,同时能量远大于普通声波的能量。当选择的超声换能器的基
频越高,则对于同一介质其波长越短,分辨率越好,但穿透能力会相应下降。
2.1.3超声波的传播特性
2.1.3.1超声波垂直入射到水平界面上的反射和投射

超声波垂直入射到光滑水平界面时,分别在两介质中产生一个方向相反的反 射波Pr(Ir)和一个方向相同的透射波弓(厶),则界面的声压反射率和折射率分别 表示为:
Pr=z2-z{
乙+乙
(2.14)
其中厂为界面的折射率,乙是第一种介质的声阻抗,厶是第二种介质的声阻抗。
界面的声强反射率和声强透射率表示为:
9 / \ 2
Ir = pr2

(1)当Z2>ZX时,此时为硬边界,反射波与入射波质点速度相位相反、声压相
位相同,两者产生叠加;⑵当z2<zx时,此时为软边界,反射波与入射波质点速 度相位一致、声压相位相反;⑶当Z2《Z]时入射波质点速度与反射波质点速度 大小相等方向相反,此时声压几乎全反射形成驻波,分界面成为速度波节与声压 波腹;⑷当Z2=Z]时,超声波没有反射几乎全透射,即当两种介质的阻抗几乎相
同时,声波传播几乎不受影响。
2.1.3.2超声波斜入射到平界面上的反射和透射
超声波斜入射到介质界面时,会发生反射、投射和波形转换现象。波形转换 指在斜入射到异质界面时,产生与入射波不同类型的反射波和折射波,这种现象 与界面本身两侧介质性质有关。
超声波倾斜入射到平面上产生的反射波和折射波的角度由公式可得:

当声压反射率为0,声压折射率为1时,即Z2<ZX,声波不会出现反射,全 部入射进入第二介质,此时入射角称为全透射角。

图2.2超声波斜入射到平面的反射与透射示意图
Fig. 2.2 Reflection transmission of ultrasound incident obliquely.

2.1.3.3超声波斜入射到曲界面上的反射和透射
超声波斜入射到曲界面时,反射波波阵面形状取决于曲面的形状。当界面为 球面,凸球面的反射波是从虚焦点发出的球面波,凹球面的反射波是从是焦点发 出的球面波。透射波会产生聚焦或发散,波阵面形状也取决于曲面形状。波束中 心轴线上,某一点的反射波和透射波的声压分别为:
耳二 Po 亠7 (2.24)
厲=奶^7 (2.25)
其中,弘为入射平面波声压,/为焦距,厂为界面曲率半径,(为声压透射 率。
2.1.4超声波的聚焦
在超声诊断和治疗中,为了达到高分辨率、能量集中的目的,聚焦超声应运 而生并成为超声治疗的热门前沿技术。制造聚焦超声的方法以曲面换能器直接聚 焦和声透镜聚焦两种。声学聚焦原理与光学透镜聚焦原理相似,在压电晶片前加

一个声透镜就可以实现纵波聚焦探头,一般选择材料需要满足声速高于周围介质 声速且相差较大、声阻抗与周围介质相接近、声衰减小、不受水及超声耦合剂腹 时且易于加工等条件,这样获得的聚焦超声换能器像差小、成像质量高、反射损 失小。透镜的曲率半径为旷,则焦距为:

2.2超声于生物组织内的特性
超声波生物物理学是研究超声波与生物材料相互作用机理的学科。超声诱导 的生物效应集中在与超声对生物材料的影响相关的问题上。另一方面,当生物材 料对超声波产生影响时,可作为超声诊断的依据。因此,了解超声与组织的相互 作用为图像生成和风险评估提供了科学依据。
221超声波在组织中的衰减与吸收
当超声波能量传播到诸如组织之类的衰减材料中时,波的振幅随距离而减小。 这种衰减来自于吸收和声波的散射和反射。吸收是代表那部分超声波的能量在组 织中被转化为热量,而散射和反射可以被认为是波的一部分因为组织的不均匀改 变了方向带走了能量。
超声波实际在传播过程中,能量总是有损耗的,包括散射、波形变换等原因
(Chen和Ma, 2014)。使用衰减系数对超声经过介质的衰减程度进行量化,介质
幅度衰减系数可以表示为:
7)蚁 227)
a = 2O(lg«)“o (2.28)
其中,A)是波的变量在z二o的峰值;4是同样变量在z位置的峰值。"。的 单位为每厘米衰减奈培值(Np/cm ) , a的单位为每厘米衰减分贝值(dB/cm )。
生物组织中,超声发生衰减主要是由于声束反射、散射等因素产生。设介质 的散射离子尺寸为力,当d/A<d时发生衍射,散射衰减很小;当d/A^l时散射 衰减和衍射衰减都增加;当d/A^l时,超声波的衰减主要来自于反射。
⑴反射衰减
正如前一节所描述的超声波的传播特性,当超声波在传播时遇到声阻抗差异 较大的硬界面,超声波能量部分或全部反射,继续传播的投射声波能量减少,在 这一过程中所产生能量损失称为反射衰减。
⑵散射衰减
超声波在传播的过程中,在介质中的障碍物尺寸小于或与波长近似时,声束 散射或绕过障碍物,方向和路径同样会发生改变,因此而损失一部分超声能量。 由于发生散射和衍射而损失的能量称为散射衰减,生物组织作为传播媒介并不是 密度均匀的,超声波传播中遇到声阻抗发生改变且界面尺寸较小时的时候,会发 生散射现象,散射的超声波沿着新的路径继续传播,造成原方向的超声波能量衰 减。例如超声波在血液中传播受红细胞的影响等(Culjat等,2010)o
⑶扩散衰减
超声波在传播时由于声波扩散而产生的能量损失被称为扩散衰减。理想情况 下,声源发出声波后,声波会沿各方向带动周围介质分子振动开始传播,声场面 积由于声波的传播而逐渐增大,能量需要分散在这一扩大的面积上上,导致了扩 散衰减。一般声扩散不大情况下,扩散衰减系数为:
ocd u 0.61^- u 2.44—— (2.29)
rd
⑷吸收衰减
超声波的吸收衰减是当声波在介质传播的过程中,超声波的能量被组织吸收。 部分吸收的能量转化为热量,部分通过吸收体传递。转化为热量的能量相对于超 声波的能量来说就意味着衰减。吸收衰减主要有如下三种情况。其一是粘滞吸收, 这是由于超声波穿过某些具有粘滞性介质时受到摩擦力而使一部分声能转化为 热能。其二是弛豫吸收,是指产生的热能通过介质传导的方式辐射而使声能减少。 其三是热传导吸收,是指产生的热能通过在介质中传导使热量散失。超声波在穿 过某些具有粘滞性介质中,主要会因为介质本身的性质而产生吸收衰减;而在没 有粘滞性的介质中,能量的衰减程度仅与超声波本身的性质有关。
2.2.2生物组织的超声参数
目前试验者们测量了各种生物组织的超声参数,但由于测量方法和设备不统 一,其参数还不够全面和准确。吸收是引起超声衰减的主要原因,吸收系数随着 超声频率的增高而增大,衰减系数同样也会随频率增高而增大,故超声进入深部 组织不应选择过高频率。下面列出一些生物组织的声学参数供实验参考。
表2・2人体组织对超声波的吸收系数和平均衰减系数
Table 2.1 absorption coefficient and mean attenuation coefficient of human tissue to
ultrasound
人体组织 吸收系数(dB/cm ) 平均衰减系数(必)
血液 0.20 (1MHz) 0.18
肝 0.90 (1MHz ) 0.94
肾 1.00 (1MHz) 1.00
脂肪 0.60 (1MHz ) 0.68
肌肉 2.30 (1MHz) 1.30(顺纤维)
3.30(横越纤维)
脑 1.00 CIMHz ) 0.85
颅骨 13.00 (1MHz ) 20.00

2.3超声波的生物学效应
正如前两节介绍的内容,超声影响生物材料的生物物理机制,超声诱导的生 物效应一般分为热效应和非热效应,如空化效应、机械效应和化学效应,这些效 应与组织产生反应,称为超声的生物学效应。
2.3.1超声辐射力
在不含气体的组织中推断机械效应的原因具有难度。超声波的机械效应是最 基本的原发效应,无论超声声强大小都会产生。超声在介质中传播所产生的机械 效应称为行波场中的机械效应,此振动会使人体组织各点受到往复变化的收缩压 和舒张压。传播过程中因反射波和前进波干涉产生的机械效应称为驻波场中的机 械效应,会改变组织的张力和压力,让质点获得更大的加速度(Dalecki, 2004)o 不同质点速度不同产生相对运动,进而摩擦产生能量,低能量加速新陈代谢、提 高组织再生能力,高能量的超声波可引起血管麻痹等问题。
2.3.2超声波的热效应
前一节已经提到,超声波在传播过程中会损失能量,其中部分能量会被传播 路径上的生物组织吸收并转化能热量。设超声波在单位时间内对某一特定组织单 位体积产生的热量为Q,计算公式为(Obrien, 2007; Zhang等,2019):
Q = 2aITA (2.30)
其中,°是吸收系数,为超声时间平均超声强度。
设超声波导致组织温升为T,则有:
Ar = QM = 2aITAAt
C p C p
其中,Q为组织密度,C为组织比热容。
表2. 3人体组织超声热效应相关参数
Table 2.3 Relevant parameters of ultrasonic thermal effect in human tissue.
人体组织 平均衰减系数
(dB/(cm-MHz)) 密度
(kg / m3 ) 比热容
水 0.002 999.5 4200
肝 0.94 1051 3617
脂肪 0.68 947 2348
脑 0.85 1030 3640
颅骨 20.00 1912 1440
因为介质可以吸收能量产生热量,只要产生的热量能够被快速散出,那么组

织温度不会上升,但若散热速度低于吸收能量产生热量的速度,组织会发生局部
温度升高(Zeqiri, 2003)。被吸收的能量会造成局部温度升高,当温度过高时会对 酶、神经细胞、血液中的蛋白质等造成不可逆的损伤,组织的衰减系数、密度、 比热容的测量对选择刺激参数非常重要(Giering等,1996; Giering等,1995; Mueller等,2016),表2. 3列出了一些人体组织的相关参数。颅骨的衰减系数高 而比热容小,相比于其他组织,超声波经颅骨容易因为吸收能量而产生温度升高, 应该选择脉冲的方式发射超声波同时采用合适的超声参数避免颅骨的温升过高 造成损伤。
2.3.3超声波的空化效应
最受关注的非热机制是空化。声学空化,广义上是指在含有预先存在的气体 包裹体的生物材料中发生的超声诱导的气泡活动,是强超声波在液体中的特有物 理现象。空化相关的机制包括辐射力、微流、激波、自由基、微射流和应变。
超声在液体中传播,产生的负压相形成局部负压区域,当负压足够强时产生 空化气泡,气泡的产生、发展、爆破称为空化(Wesley和Nyborg, 2001)。稳态空 化是液体声场中空化气泡在正弦交变声压作用下进入共振的状态,此时振幅最大。 而当气泡在负压作用下增大到一定程度,又因正压收缩不能够维持震荡状态的情 况,称为瞬态空化。空化的发生及状态受许多因素影响,例如声压、声场分布、 是否为连续波、反射自身的能量产生驻波的情况以及边界性质。

° o ° O o O o
微泡形成 微泡变大 微泡破裂
图2.4组织空化现象中声压变化和空化泡变化示意图(Nora和Borges, 2017)
Fig. 2.4 Schematic diagram of sound pressure variation and cavitation bubble change
空化至爆破过程中会引发高温、放电、强压力和化学效应,这些效应是空化
现象产生物效应的原因。空化效应现在应用于超声打开血脑屏障、选择性切除组
织等手术中,并在溶栓以及炎症治疗方面具有运用前景。
2.4本章小结
本章介绍了超声波的基础知识,主要包括超声波的定义与其数学表达式、相 关基本参数、传播特性等,随后介绍了超声波在生物组织内的衰减和生物学效应, 为本文后续超声换能器的设计和声场标定以及超声调控小鼠学习记忆能力提供 了理论基础和支持。
第3章聚焦超声刺激装置
3.1超声换能器
通过超声换能器可以实现超声波的发射和接受。产生和接收超声波的方式有 许多,电声换能器仍然是使用最广泛的技术。
3.1.1压电效应与压电材料
一些各向异性的材料受到拉力或压力作用,压电材料内部的电偶极矩发生改 变,正负电荷具有相对位移,发生极化现象,在压电材料表面分别出现正表面电 荷与负表面电荷,电荷密度与机械外力成正比,也就是说在外部机械力作用下产 生了电场,称为正压电效应(如图3.1所示)。

图3・1正压电效应示意图・(a)压力作用情况;(b)拉力作用情况

(Safian 和 Soleimani, 2018)1
Fig. 3.1 Schematic diagram of positive piezoelectric effect.
(a)Pressure situation; (b) Tension situation
同样的,压电材料在电场的作用下,材料内部的正负电荷位移,宏观上发生 几何形变,完成电能到机械能的转化,此过程称为逆压电效应(如图3.2所示)o
压电材料均具备正压电效应和逆压电效应,可以采用同一压电材料既作为发 射探头又作为接收探头,但不可以同时进行。
我们常用压电体参数来评价压电材料的性能,其包括力学性能、电学性能以 及压电性质。其中与换能器密切相关的有:⑴品质因数0,其表示压电材料谐 振时机械损耗的大小;⑵压电系数,即压电材料对机械能和电能相互转换的转化

系数;⑶机电耦合系数S 表示机械能和电能之间的转换程度,由弹性能、压电 能、介电能组成;⑷居里点,表征压电材料可承受的温度极值,超出范围则失去 压电性能。

图3・2逆压电效应示意图・(a)外加电场;(b)外加反向电场
(Safian 和 Soleimani, 2018)1
Fig. 3.2 Schematic diagram of inverse piezoelectric effect・
(a) Applied electric field; (b) Applied reverse electric field
正如上文所介绍,压电材料存在各向异性,在不同方向压电效应的程度和性 质都可能不同,因此选择合适的压电材料对超声换能器的性能提高十分重要。下 面列出一些常用的压电材料及其部分压电体参数。
表3. 1常用压电材料及其相关参数
Table 3.1 Common piezoelectric materials and its parameters
压电材料种类 压电材料 Qm 接受系数g33
(IO-12 VjN) 发射系数〃 33
(10_12C/iV) 居里点
(°C)
压电单晶体 石英晶体 57.8 2.3 578
压电陶瓷 BaTiO3 12.6 190 115
pzt4 500 26.1 289 328
pzt5 65 147 593 198
复合压电材料 pvf2+pzt
下角标第一位表不电场和电位移方向;第二位表示受力或应变方向

压电材料是超声换能器的核心,随着新型压电材料日新月异,医学超声波换 能器的性能得到不断提高,压电材料的进步促进医学超声波的发展和进步。
目前超声换能器使用的压电材料以压电陶瓷为主,原因是其具有许多单晶材 料和复合压电材料没有的优点:⑴压电陶瓷的制造工艺成熟、成型简单、机械强 度好,可压制成各种形状、尺寸来满足不同的需求;⑵压电陶瓷可以通过极化使 垂直于极化方向的平面内是各向同性的;⑶压电陶瓷灵敏度高,可以实现多种振 动模式;⑷可通过人工控制配方制成不同的压电材料满足需求;⑸原材料成本低 廉。基于以上优点,本实验急性实验部分选用了错钛酸铅固溶体属钙钛矿型结构 的压电陶瓷(PZT)作为超声换能器材料。
3.1.2超声换能器的制备
在电信号的驱动下,压电振子开始振动产生机械波。往正方向传播的机械波 聚焦在焦点位置,而探头振子振动同时会产生向反方向传播的超声波,这个方向 的超声波不仅不能帮助成像,还可能会反射后影响正方向传播的超声波。故需要 吸声材料吸收背向辐射的声能。焦点直径的计算方法为:
〃 =2.44 低” (3.1)
从公式中可以看出,聚焦换能器的直径越大,频率越高时,可以获得较小的 焦点直径。故在进行超声神经调控实验中需要考虑刺激靶点的大小位置、刺激频 率、换能器的大小,选择合适的超声换能器。

图3.3声学聚焦换能器
Fig. 3.3 Acoustic focused transducer

我们选择了 PZT材料的曲面压电陶瓷片制作超声换能器。从图3.4(a)可以看 到PZT压电陶瓷片的背面镀导电层,用冷焊的方式将陶瓷片与射频连接线焊接。 图3.4⑹是用于封装压电振子的外壳,采用了 3D打印方式用光敏树脂材料制成, 能够起到支撑、容纳、密封及保护压电振子的作用,同时具有质量轻的优点。随 后在背面加入吸声材料填充封装。自制的聚焦超声换能器除去与功率放大器连接 的连接头,重量约为4g,小鼠可以较舒适地佩戴探头接受超声刺激,并可以不受 阻碍活动。外壳正面 外壳侧面 外壳内侧
(a) PZT压电陶瓷片的正面、背面和侧面;(b)自制超声换能器外壳;(c)封装
完成的实验使用的超声换能器设备成品
Fig. 3.4 Material and finished products for making ultrasonic transducer
(a) Piezoceramics front, back and side surfaces; (b) Front, side, and inside of the
ultrasound transducer shell; (c) finished product of ultrasonic transducer equipment used in
the experiment
3.1.3超声换能器的性能评估
正如前文压电效应所阐述,超声换能器发射超声波需由超声波信号发生器产 生信号,经由发射电路和功率放大器将信号传送至换能器,接受超声信号则需要 声信号通过声电换能器接收,产生的电信号经过处理之后进行波形和图像的显示。 本文基于此系统搭建了超声换能器性能评估的实验平台。
为了让聚焦超声的焦点位置准确覆盖目标脑区,根据靶点对于颅骨的位置设 计超声准直器辅助超声换能器进行精准刺激。图4是根据小鼠颅骨特征和目标脑 区前额叶皮层的位置及深度设计的超声准直器的立体结构示意图,底部设计了两 个孔用于在给小鼠佩戴准直器时钉入颅钉,防止准直器脱落。

图3・5超声准直器

(a)超声准直器内侧结构图;(b)超声准直器外侧结构图;(c)超声准直器实物图;(d)佩 戴准直器及超声探头的实验小鼠
Fig.3.5 Ultrasound collimator
(a) Inside structure of collimator; (b) Outside structure of collimator; (c) Real object of ultrasonic collimator; (d)mice with collimator and ultrasound transducer・
使用 Option®超声光束分析仪(Option® UltTasound Beam Analyzer, Onda, 美国)对超声换能器的声场及聚焦情况进行评估。此设备可以以秒或分钟为单位

实时可视化测量,做到动态实时观察并且具有50pn分辨率,能够直观测量封装 后的超声换能器产生声场的形状及声束的传播路径。图3.6(a)是该设备测得的聚 焦超声换能器的超声发射情况和声场,可以直接观察到超声聚焦换能器成功聚焦, 根据比例尺焦点位置在距离超声换能器表面约1.2cm处;为了让焦点处的超声声 场覆盖到刺激靶点,我们设计了超声准直器用于调整焦点穿颅的深度,图3.6(b) 是将刺激前额叶皮层的准直器装配在超声换能器上后的声场分布,超声波的聚焦 效果仍然理想,超声波焦点距离准直器平面表面约3-4mmo综上,制作的超声换 能器通过准直器的辅助可以准确作用到目标脑区。

图3.6在超声光束分析仪下的声场分布
(a)超声探头声场的分布;(b)穿颅后声场的分布
Fig.3.6 Sound field distribution in ultrasound beam analyser (a) distribution of sound field
of ultrasound probe; (b) distribution of sound field
随后采用超声强度测量系统对探头进行声场的扫描及超声参数的测量。图 3.7(a)是3D超声强度测量系统的工作示意图。此声场扫描系统配有水缸,测量前 48小时注入水并静止48小时,防止水中体气的干扰。测试时,水听器连接至示波 器,信号发生器发射的同步信号连接在示波器的另一通道,水听器将声信号转化 为电信号后,在示波器上以波形的方式显示。水听器固定在具有三位定位移动功 能的支架上,通过示波器的结果使用UMS软件将水听器移动至与超声换能器中 心在一条直线上,找到各个方向的声压最大值,将该点设置为原点。随后由软件 记录各坐标的声学参数,分析得到声场强度分布图。
图3.7⑹是聚焦超声探头的声场分布图,分别为X-Y平面(发射方向的截面)和 Y-Z(沿发射方向的平面)。焦点处X-Y截面上的焦斑近似半径为0.2mm的圆形,Y-

Z界面上的焦斑为椭圆形,长度约为2mmo图3.7(c)是聚焦超声通过装有准直器的 颅骨后的声场分布图,使用牙科水泥将新鲜的小鼠颅骨与准直器固定在一起,测 得穿颅后的声场分布与图3.7(b)基本一致,但声场强度因为颅骨的吸收产生衰减。 根据小鼠脑谱图和上述结果,超声穿出颅骨后的焦斑可以准确覆盖要刺激的目标 脑区。图3・7超尸换冃总器的尸场分布
(a)超声强度测量原理图;(b)超声换能器的声场分布;(c)穿颅后的声场分布
Fig.3.7 Acoustic field distribution of ultrasound transducer (a) Schematic diagram of
ultrasound intensity measurement; (b) Acoustic field distribution of ultrasound transducer;
(c) Acoustic field distribution of ultrasound transducer after passing through skull
3.2超神神经调控刺激装置和参数
超声波通过信号发生器、功率放大器和超声换能器发出,而通过设置不同的 强度(Intensity)、脉冲重复频率(Pulse Repetition Frequency)、脉冲宽度(Pulse Length)、脉冲持续时间(Sonication Duration)、占空比(Duty cycle)等参数以
及选择不同基频(Fundamental FTequency)的探头,调节超声对神经元兴奋性或 抑制性作用。占空比定义为:
DC = TBDPRF
下图为超声神经调控中超声波的波形及相关参数的含义示意图。

如前文提到,超声波对生物组织有多种生物学效应,在超声成像和治疗中应 该注意超声波的强度和能量。目前,超声神经调控技术常用脉冲超声进行相关研 究,生物医学超声的超声强度参数主要包括:
(1)空间峰值脉冲平均强度(Spatial-peak pulse-average intensity, Isppa);
(2)空间峰值时间平均强度(Spatial-peak temporal-average intensity, Ispta);
(3)空间平均脉冲平均强度(Spatial-average pulse-average intensity, Isapa^ ;
(4 )空间平均时间平均强度(Spatial-average temporal-average intensity, Isata)。
设在t时刻该点测得的输出电压为%(小 声压波形为曲),则脉冲声压平方 积分(Pulse Pressure Squared Integral, PPI) (Szabo, 2004)为:

其中,M厶为水听器灵敏度,单位为V/Pa o脉冲强度积^(Pulse Intensity Integral,
PII)为:

PII = PPI/pc (3.4)
其中,°为介质密度,心为超声波在介质中的传播速度。空间峰值脉冲平均强度 和空间峰值时间平均强度可由下面公式算得:ISPTA ~ ISPPA ' DC
其中,DC为脉冲占空比。空间平均脉冲平均强度和空间平均时间平均强度可由 以下公式求得:
屮 (3.7)
二 Js【SPPA^S 二 ISATA
SAPA~ \ dS ~~DC
Js
其中A是声束的横截面。
表3.2 2017年美国食品与药品管理局规定诊断超声设备最高声强(Food and Drug
Administration Center for Devices and Radiological Health, 2019)
Table 3.2 Some diagnostic acoustic intensities limited by FDA in 2019
临床应用 Ispta (mW/cm2) Isppa (W/cm2) MI
心脏 430 190 1.9
外周血管 720 190 1.9
眼科 17 28 0.23
胎儿 94 190 1.9

3.3本章小结
本章首先介绍了压电效应与压电材料,为超声换能器的设计和制造提供理论 基础,随后设计并制造了一种小鼠头戴式超声刺激器,包括超声换能器和可固定 在小鼠颅骨上的超声准直器。该超声换能器配合超声准直器能够准确刺激到小鼠 脑中不同的目的区域,因其质量轻的优点还可以用于对自由活动的小鼠进行超声 刺激。随后使用超声光束分析仪和三维声场扫描系统对超声换能器的声场分布和 声强等参数进行了测量,得到了穿颅前后的声场分布、焦点位置、焦斑大小及超 声相关参数的值。结果表明,该头戴式超声换能器发射的超声波能够顺利穿颅作 用在本实验的目标核团。此超声换能器具有质量轻、易制作、成本低、穿颅效果 好、焦斑小等优点,是进行超声神经调控较理想的设备。

第4章 低强度聚焦超声对正常小鼠学习记忆的调控
4.1引言
超声神经调控技术改变神经元兴奋性或抑制性的作用原理尚未明确,但大量 数据证明低强度聚焦超声能够改变神经元的状态。新兴的神经调控技术应当作为 一种新的治疗脑疾病的手段进行研究,但目前国内外还没有关于使用超声神经调 控技术调控学习记忆能力、治疗相关疾病的报道。本章将使用前一章设计的低强 度聚焦超声换能器,根据目标脑区位置及聚焦超声波的声场结果设计超声准直器, 刺激正常C57/6J小鼠的前额叶皮层(PFC),探究超声神经调控对小鼠恐惧记忆形 成、巩固、提取过程的影响,为下一章研究超声神经调控对AD模型鼠学习记忆 能力的影响提供数据支持。
4.2小鼠大脑相关结构、脑区和神经环路
4.2.1小鼠大脑的尺寸及基本结构

(a)小鼠颅骨;(b)小鼠大脑
Fig. 4.1 Schematic diagram and photograph of mouse skull
(a)Mouse skull; (b)Mouse brain
大脑的解剖结构主要包括头皮、颅骨、硬脑膜和大脑软组织等。颅骨厚度随
坐标和小鼠年龄不同略有变化。脑膜位于颅骨之下,其质地柔软且厚度极薄,硬 脑膜下方为脑组织。经颅超声的衰减主要是由于颅骨的衰减系数大。
4.2.2学习记忆相关脑核团及神经环路
学习和记忆是大脑最基本最重要的两大神经功能,对其参与脑区和神经环 路的研究将有助于探索大脑的奥秘,并为治疗相关疾病提供理论依据,是神经疾 病的研究热点之一。几十年的研究已经确定了大脑中学习记忆的产生、消退、巩 固和再提取行为的有关区域。遗传和病毒工具、光遗传学和先进的体内成像技术, 现在已经能够在复杂的神经回路中描述特定细胞类型的活动、连接和功能。
杏仁核是边缘系统的一部分,是情绪产生、识别、调节的重要脑区,并与大 脑中的许多脑区和核团有直接或间接的联系,如海马体、丘脑、纹状体、额叶内 侧等。去甲肾上腺素能够调节调节肾上腺素和糖皮质激素等肾上腺应激激素,这 些激素和神经递质通过调节杏仁核的活动对情绪记忆的巩固起增强作用 (McGaugh等,2002)o基底外侧杏仁核的活动会影响其他脑区的记忆巩固和神经 可塑性,其与海马体和前额叶皮质的相互作用也参与了应激性记忆恢复和工作记 忆损伤。慢性固定应激条件导致基底外侧杏仁核主要神经元的树突生长和棘突形 成,揭示了杏仁核结构可塑性的独特特征,说明杏仁核很可能与人类情绪障碍和 创伤后应激障碍有关。(Cahill等,1995)。
前额叶皮层即前额叶(PFC),包含了额叶中除去初级运动皮层及次级运动 皮层意外的所有额叶皮层,与动物的思维、记忆、情绪等活动息息相关。前额叶 皮层通常分为三个区域:背侧前额叶皮层、腹侧前额叶皮层和眶额皮层。相关研 究证明,背侧区域参与了工作记忆、前瞻性记忆等活动,腹侧前额叶皮层则与情 景记忆、自体性回忆有关。前额叶皮层与其他脑区有着广泛的神经联系、复杂且 丰富的功能相互联系,如丘脑、海马、杏仁核等。(Koseki等,2009; Li, Yuzhe 等,2016)o
基底核主要功能为控制自主运动、意识活动,由纹状体(包括尾状核和壳核)、 腹侧纹状体(包括伏隔核、尾状核和壳核的大部分腹侧)、苍白球、黑质核丘脑 底核构成,同时也是程序性记忆学习和奖励学习的重要脑核团(Nolte, 1999)o尾 状核和壳核是基底核的主要输入核,接收除了初级视觉、听觉和嗅觉皮层之外的 几乎所有皮层区域的输入,同时纹状体还被发现与海马、杏仁核具有功能联系。 基底核大部分输出经黑质和苍白球输出到丘脑最后回到大脑皮层或通过脑干产
生运动状态(Alexander 等,1986; Packard 和 Knowlton, 2002)。

图4.2恐惧记忆与消退的神经环路。(Tovote等,2015)
(时与恐惧记忆相关的脑区;(b)脑区之间的相互作用
红色代表促进恐惧记忆形成的环路、蓝色代表抑制恐惧记忆的环路、黑色代表需要继续研
究的脑区关系。箭头代表两者是兴奋性关系、线段代表两者是抑制性关系。
Fig. 4.2 The fear and extinction network.
(a) Fear states are mediated by multiple brain areas; (b) Interactions between brain areas・
Red line represents the circuits that promote the formation of fear memories, blue
represents the circuits that inhibit fear memories, and black represents the circuit that need
further study・ The arrows indicate that excitatory and the line indicate inhibitory・
间脑由5部分组成,分别为背侧丘脑(丘脑)、后丘脑、上丘脑、底丘脑和 下丘脑,间脑的主要功能为控制情感、调节节律和日常行为。实验证明,当下丘 脑的乳头提、丘脑的背内侧损伤,患者会产生遗忘症的症状(Nadeau, 2008),由 此可见丘脑与下丘脑参与学习记忆活动。同样的,这些结构也与其他脑区存在密 切联系,丘脑与乳头体、海马、前额叶皮层等有往返联系,下丘脑则与垂体、海 马、杏仁核、脑干及脊髓存在往返联系。
颖叶解剖学中有四个面,其中颖叶内侧面最为复杂,也是与记忆相关的部分。 颖叶内侧区前部主要由海马钩和内嗅区皮质组成;中部有海马旁回、齿状回和穹 窿伞以及下托;后部由海马旁回后端组成。大脑内侧颖叶记忆系统由海马体和邻 近的、解剖学上相关的皮质组成,即海马体(海马、齿状回以及下托复合体)、 内嗅皮层、旁嗅皮层和海马旁回等,海马可以分为C1-C4四个区域。内侧颖叶记 忆系统是陈述性记忆神经回路的重要环节,在陈述性记忆巩固方面起重要作用。 此系统与大脑感觉皮层存在广泛而相互的联系,用来达到存储记忆和启动回忆的 目的。但科学家发现随着时间的推移,早期已巩固的记忆独立于内侧颖叶结构, 不会因颖叶损伤而受损(Scoville 和 Milner, 1957; Squire 和 Zola-MoTgan, 1991)。
小脑是运动的重要调节中枢,对维持身体平衡、调节肌肉张力至关重要。其 与大脑、脑干和脊髓都有丰富的相互联系,大脑皮层的一部分传出纤维投射到小 脑;小脑的传出纤维通过齿状核投射到丘脑腹外侧部分,最后投射到大脑皮层; 同样肌肉、关节的信息也通过脊髓、脑干整合至小脑(Abel和Lattal, 2001)。另 外科学家发现小脑同样参与条件反射、动作学习和自动记忆等方面(Gao等,2018; Kim 和 Thompson, 1997)。
综上所述,颖叶及海马结构、丘脑及下丘脑、杏仁核、基底核、小脑和皮层 都是参与学习记忆过程的脑核团,不同的脑核团在学习记忆中有各自的分工。他 们之间丰富而复杂的相互联系形成了学习记忆行为的神经环路。对这些脑区以及 中间神经环路的异常都会导致学习记忆功能的异常。
在本研究的急性实验部分,选择了前额叶皮层和海马区域作为刺激靶点。前 额叶皮层与记忆和情绪相关,是参与恐惧记忆形成的重要脑核团。而阿尔兹海默 症的一大病理表现就是海马区域淀粉样蛋白的沉积和Tau蛋白异常磷酸化导致 的神经纤维缠结,前额叶皮层作为学习记忆神经环路和海马结构的下游核团,用 于对普通小鼠学习恐惧记忆调控的刺激脑区。使用超声刺激调节前额叶皮层和海 马结构的实验对研究超声神经调控对学习记忆功能的影响至关重要,也是为下一 步对AD模型小鼠海马区域进行超声刺激研究提供实验支持。
4.3材料与方法
4.3.1实验动物
本章使用雄性7-8周龄C57/6J小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限 公司,体重约为22勿动物房室温保持在(23±1)°C,湿度为(50+5)%, 4〜5只/笼 饲养,给予12h昼夜循环的照明,光照强度适宜小鼠正常生活活动,饮水饲料均 不限制。本章使用8周龄C57小鼠共72只平均随机分配至两组,对照组也称假 刺激组(Sham, n二43)与超声组(US, n二43)。其中42只(对照组21只,超 声组21只)用于Freezing条件恐惧记忆行为学实验,14只(对照组7只,超 声组7只)用于Y迷宫行为学实验,16只(对照组8只,超声组8只)用于新 事物识别实验。
对于所有刺激前额叶皮层的小鼠均用2.0%异氟醸麻醉,脱毛后用碘伏和消 毒酒精消毒皮肤,用剪刀剪开头皮暴露颅骨。准直器使用医用牙水泥固定在小鼠 刺激位置对应的颅骨表面,选择前额叶皮层的刺激位置在bregma前1. 60至 1. 75mm,左 0. 30 至 0. 60mm,深部 2. 50 至 2. 70mm(Paxinos 和 Franklin, 2019)", 最后使用颅钻在准直器两孔在颅骨上的对应位置轻钻两点,使用两颗3mm颅钉对 使用牙科水泥固定在颅骨上的准直器进行加固,颅顶转入3-4圈即可,避免伤害 小鼠脑内部。在牙水泥固化后,等待小鼠清醒恢复正常状态,送回鼠笼内,经过 3天恢复期后开始进行试验。
对于所有刺激海马结构的小鼠均用2.0%异氟醸麻醉,使用剪刀修剪小鼠头 部毛发后,使用稀释过后的脱毛膏进行脱毛,防止脱毛膏伤及小鼠脑部暴露皮肤 造成皮肤外伤。
4.3.2实验方案设计
本章实验均采用急性神经调控实验,包括⑴Freezing条件恐惧记忆实验;⑵ Y迷宫实验;⑶新事物识别实验。所有行为学实验流程符合熟悉实验环境及设备、 学习记忆获得过程、超声/假刺激进行干预、对学习记忆结果再提取的测试四个部 分。

行为学实验:适应环境 超声干预+行为学实验:评估阶段
行为学实验:学习记忆获取
图4・3行为学实验概括流程

图4・4 PFC实验超声刺激系统以及刺激区域示意图(Paxinos和Franklin, 2019)17^53
心)超声辐射力刺激前额叶皮层装置;(b)超声在颅骨上的入射位置;(c)脑图谱中前额叶
皮层位置;(d)HE染色脑片中前额叶皮层刺激区域位置
Fig. 4.4 Schematic diagram of stimulation system and brain area in the prefrontal cortex.
(a) Experimental device of ultrasound radiation force for prefrontal cortex; (b) The
incidence position of ultrasound on the skull; (c) Prefrontal cortex position in the brain
atlas; (d) The stimulation area of the prefrontal cortex in the HE stained brain・
本章实验中的超声刺激系统如图4.4(a)所示,由信号发生器发出脉冲超声信 号,通过功率放大器与超声换能器相连,准直器由牙科水泥和颅钉固定在小鼠的 颅骨上,准直器底部的超声出射孔以图4.4(b)红点位置为中心,在bregma前为 1. 60至1. 75mm,左为0. 30至0. 60mm,深部为2. 50至2. 70mm位置,透过颅骨 刺激的PFC脑区位置如图4. 4(c) (d)所示。
选用了两组超声参数对普通小鼠的前额叶皮层进行超声调控,并进行了

Freezing条件恐惧实验及Y迷宫实验,参数分别为:⑴3.68MHz基频、500Hz PRF、50%占空比,刺激Is停4s,刺激时长30min,电压幅值350mv, Isppa=7.94 W/cm2; (2) 3.68MHz基频、100Hz PRF> 5%占空比,刺激Is停4s,刺激时长 30min,电压幅值 350mv, IsppA=7.94W/cm2□

图4.5皮层及海马实验超声刺激系统以及刺激区域示意图(Paxinos和Franklin, 2019)47^83
(a)超声辐射力刺激海马装置;(b)超声在颅骨上的入射位置;(c)脑图谱中前额叶皮层位
置;(d)HE染色脑片中前额叶皮层刺激区域位置
Fig. 4.5 Schematic diagram of stimulation system and brain area in the hippocampus・
(a) Experimental device of ultrasound radiation force for hippocampus; (b) The collimator
designed for 1MHz transducer; (c) Hippocampus position in the brain atlas; (d) The
stimulation area of the hippocampus in the HE stained brain.
随后为了下一步对AD疾病模型小鼠进行超声调控的实验,使用普通小鼠进 行基础实验。没有对小鼠进行准直器的安装,只进行了脫毛处理以让小鼠保持更 佳的身体状态和精神状态,并更改探头使用更低频率的超声波对小鼠海马结构进 行刺激,坐标为bregma后1. 95至2. 10mm,左0. 90至1. 10mm,深部1. 40至 1. 80mm,参数为1MHz基频、lOOHzPRF、5%占空比,刺激0.5s停5.5s,刺激时 长30min,电压幅值300mv, Isppa二12.6W/cn?,随后进行新事物识别的行为学实 验。

(a)Freezing条件恐惧实验设备整体;(b) Freezing条件恐惧实验设备电击板;(c)实验方案参考
(Tovote 等,2015)
Fig.4.6 Equipment fear conditioning experimental equipment.
(a) Total equipment of fear conditioning test; (b) Shock board of fear conditioning test
equipment; (c) Experimental scheme reference・
Freezing条件恐惧实验可以分为三个阶段:条件恐惧记忆的获得、消退和唤 醒三部分。本实验设定以声音为提示进行条件恐惧训练,即声音作为恐惧经历来 到的线索,电击配合声音进行训练。实验设备如图4.6(a)所示,内部如图4.6(b)所 示。实验箱正上方为摄像头用于录制小鼠的表现,为了清晰拍摄小鼠的行为学表 现,实验箱内部为白色,底部为金属杆组成的足板,可以通直流电对小鼠足部进 行电击,电流可以通过硬件调节。
实验第0天,将所有小鼠单独放入箱内自由探索5分钟,让小鼠熟悉实验环 境,减弱小鼠的心理负担和焦虑情绪。
Freezing条件恐惧实验第1天是小鼠恐惧记忆的获取阶段,将动物暴露在A
箱内适应180 s后在第180s、300s、420s、540s、660s分别给予持续30 s的70dB 白噪声刺激,在 780s、900s、1020s、1140s、1260s、1380s 和 1500s 时分别给予 持续30 s的70dB白噪声刺激,并在每次白噪声刺激最后Is同时给予持续1 s的 足部电击(0.2mA),即自由探索三分钟后每90s给予一次30s的白噪声作为声音 线索12次,在后7次的噪声最后Is设备底板通直流电刺激小鼠足底,给与小鼠
创伤性事件刺激,整个实验持续27分钟。
Sham/US:开始测试前20min进行假刺激/超声干预,结束后立即进入测试阶段。
图4.7条件恐惧实验刺激方案
Fig. 4.7 Protocol of fear conditioning test.
在Day2开始测试的前30分钟分别给予两组小鼠假刺激/超声刺激,干预结 束后立刻进行消退情况测试。Freezing条件恐惧实验第2天是小鼠恐惧记忆的消 退阶段,小鼠须更换实验场景,即第2天测试在B箱中进行,使用稀释的醋酸溶 液擦拭实验箱内部、增加透明玻璃板覆盖,改变箱内的气味信息和小鼠足部感受。 在180s适应后,每隔90s给予一次30s的70dB白噪声作为恐惧记忆线索,重复 20次,小鼠此阶段的所有活动被摄像机记录下来,实验方案图4.7所示。
熟悉环境、学习、测试阶段每次使用实验箱都需要使用酒精进行清洁,防止 之前小鼠实验中留下的气味干扰。
所有小鼠实验结果通过Smart软件进行分析每次声音刺激的30s内小鼠表现 出僵住(Freezing)行为时间,此行为定义为动物除了呼吸运动外,全身其他躯体运
动全部停止不动的状态,本实验中这里超过0.1s的僵住行为才被统计入结果中。 以第二天小鼠进入实验箱内的最初3min的平均冻结不动时间作为基线,计算第 二天每次声音刺激30s内小鼠的僵住行为时间,并对两组小鼠二十次的数据进行 独立样本t检验。图4.8Y迷宫实验设备及实验流程(Kraeuter等,2019)

Fig. 4.8 Equipment and protocol of Y-maze test.
Y迷宫实验也是关于测试动物学习记忆的实验,主要应用于测试动物辨别性 学习、工作记忆。Y迷宫因设备的通道成形的命,三个臂各自成120度夹 角,每一条臂的尺寸为30cmx8cmxxl5cm (分别为长、宽、高),三个臂的细节 也完全完全一致,且靠近中央处均有一个可拆卸的挡板,如图4.8(a)所示。
学习过程中,先用挡板挡住其中一条臂,在剩余两条臂中选择一条臂的尽头 作为固定入口,所有小鼠在学习时都从固定入口背对中心区域进入Y迷宫,自
由探索5分钟。5小时后,进行30分钟超声刺激紧接着进行测试阶段。测试过 程中,学习阶段被挡板挡住的臂开放,所有小鼠仍然从学习阶段时选择的固定入 口进入Y迷宫,允许自由探索5分钟。
熟悉环境、学习、测试阶段每次使用实验箱都需要使用酒精进行清洁,防止 之前小鼠实验中留下的气味干扰。
淘汰一分钟内没有离开入口臂的小鼠实验数据,记录每只有效实验小鼠总进 臂次数、进入新开放臂的次数、在新开放臂中的探索时间、连续进入三个臂的次 数等数据(Tang等,2019)。定义连续进入三个臂(如132,321等)定义为Alternation, 最大Alternation为总进臂次数减2。计算Alternation百分比,即实际Alternation 与最大 Alternation 的比值(Melnikova 等,2006)。
4.3.5新事物识别实验

图4.9新事物识别实验方案(Lueptow, Lindsay, 2017)
Fig.4.9 Protocol of novel object recognition test
新事物识别是一种简单判断动物记忆能力的行为学实验。新事物识别实验选 用了 50cmx50cni长宽的正方形箱,箱无盖,壁高约50cm。具体实验方案如图4.9 所示,第0天须将小鼠放入实验箱内自由探索8分钟适应环境。第1天训练阶 段,选两个一致的直径约为3cni的物体A、B,固定在对角线前后两边,距离两 侧墙壁留有5cm左右的距离,保证小鼠可以顺利穿过。训练过程中,将小鼠从中 心位置放入,允许自由探索10分钟。第2天测试阶段的前30分钟进行超声刺 激,实验箱内B物体换为与A、B不同的另一物体C,允许小鼠自由探索10分 钟(Leger等,2013; Lueptow,LindsayM., 2017)。训练阶段及测试阶段小鼠行为 均用录像机记录,统计小鼠探究新事物的时间,探究行为包括触碰、嗅物体等。
熟悉环境、学习、测试阶段每次使用实验箱都需要使用酒精进行清洁,防止 之前小鼠实验中留下的气味干扰。
在第二天的测试阶段的整个过程中,定义小鼠探索旧事物的时间为S探索 新事物的时间为t2,定义总探索时间为t, t=ti+t2,则绝对辨别度e (Absolute discrimination measure ) 定义为:
e = t2-tx (4.1)
鉴别系数 d (discrimination index, DI)定义为:
d=-― =- (4.2)
‘1 + ‘2 t
4.4结果
4.4.1 Freezing条件恐惧实验结果
4.4.1.1参数一实验结果
参数一:500HzPRF、50%占空比,刺激Is停4s,刺激时长30min,电压幅 值 350mvo
由统计结果可以看出,使用超声参数一刺激小鼠前额叶皮层对小鼠的恐惧记 忆的消退有促进作用。将两组小鼠的冻结时间占一次声音线索时长(30s)的百 分比进行统计,每组n=7。如图4.10(a)所示,第一天恐惧记忆获得阶段,前五次 只给予声音未给予电击刺激的小鼠的冻结行为较低,前五次数据中冻结时间在全 部声音线索时间段占比最高在Sham组23.2467% 土7.4825,最低在US组7.6540% ±1.8760o从第六次开始的后7次给与电击刺激之后,小鼠在声音刺激时间段内 的冻结行为逐渐增加,自由活动的时间减少,且随着次数的增加,每次30s噪声 刺激时间内Freezing僵住时间明显增加。后7次数据中Sham组和US组在给予 声音线索时最高冻结时间占比为44.4883 + 4.3214和43.5117±3.9053。以上数据 说明在小鼠的第一天训练阶段,小鼠逐渐将白噪声声音线索与电击的恐惧经验联 系起来,达成了恐惧记忆的形成。
如图4.10(a)所示,第二天超声刺激/假刺激干预过后进入测试阶段,只有声 音线索无电击的实验结果中,两组小鼠的Freezing僵住时间在30s噪声线索时间 内的占比从开始测试阶段就显著高于第一天的最高值,证明小鼠经历前一天噪声
配合电击的创伤性事件已经明显形成恐惧记忆。

图4.10 Freezing条件恐惧实验结果
(a)超声参数一实验结果;(b)超声参数一测试阶段统计结果(*pV0・05) ; (c)超声参数二实
验结果;(d)超声参数二测试阶段统计结果(和*pVO.OOl)
Fig.4.10 Result of fear conditioning test
(a) Experimental results of ultrasound parameters A; (b) Statistical results of ultrasound
parameters A (*pV0・05) ; (c) Experimental results of ultrasound parameters B;
(d)Statistical results of ultrasound parameters A (***p V0.001)
将第二天20次的数据使用SPSS21.0进行分析,如图4.1(Xb)所示,假刺激 Sham组平均的冻结时间占比为45.2412%土 1.7664,超声刺激US组平均的冻结 时间占比为38.5582%±1,7792, p二0.011 V0.05。虽然图4.10(b)中超声刺激组的 小鼠与对照组的小鼠曲线表现上并不明显,但经过统计分析可得,两组的恐惧记 忆消退表现存在差异。证明了参数一的低强度聚焦超声刺激确实对小鼠恐惧记忆 的消退起到了一定促进作用。
4.4.1.2参数二实验结果
参数二:3.68MHz基频、lOOHzPRF、5%占空比,刺激Is停4s,刺激时长 30min,电压幅值350mv。
由统计结果可以看出,使用超声参数二刺激小鼠前额叶皮层对小鼠的恐惧记 的消退有抑制作用。如图4.10(c)所示,与参数一的实验结果相同的是,第一天的 前五次冻结行为时长百分比相对较低,从第六次开始的后7次给与电击刺激之 后,小鼠在声音刺激时间段内的冻结行为逐渐增加,自由活动的时间减少。数据 说明在小鼠的第一天训练阶段,小鼠逐渐将白噪声声音线索与电击的恐惧经验联 系起来,达成了恐惧记忆的形成。
第二天干预过后,使用SPSS21.0将第二天20次的数据进行分析,结果如图 4.10(d)所示,假刺激Sham组平均的冻结时间占比为53.5193% +1.7173,超声刺 激US组的冻结时间占比为66.8711%±1.4899, pVO.OOl。数据分析证明了参数 二的低强度聚焦超声刺激确实对小鼠恐惧记忆的消退起到了明显的抑制作用,超 声刺激组小鼠恐惧记忆更加强烈。
4.4.2 Y迷宫实验结果
表4. 1 Y迷宫实验结果
Table 4.1 Result of Y-maze test
序号 lmin 内
离开入口臂 第一次是否
探索新臂 Alternation
比例(%) 新臂中探索
时长 新臂中探索时
间占比(%)
Sham-1 是 0 58.82 132.22s 41.97
Sham-2 是 0 50.00 51.11s 16.23
Sham-3 是 0 58.33 147.73s 46.90
Sham-4 是 0 61.11 53.05s 16.84
Sham-5 是 0 70.59 69.66s 22.11
Sham-6 是 1 63.64 49.75s 15.79
Sham-7 是 1 50.00 70.39s 22.35
US-1 是 1 50.00 52.23s 16.58
US-2 是 1 63.64 30.83s 9.79

US-3 是 I 68.75 37.14s 11.79
US-4 是 0 86.67 64.24s 20.39
US-5 是 I 63.64 42.71s 13.56
US-6 是 I 55.56 46.58s 14.79
US-7 是 I 75.00 42.73s 14.24
图4.11 ¥迷宫实验结果(*pV0・05),超声刺激提高了小鼠的辨别性学习能力。
Fig. 4.11 Results of Y-maze test. (*pV0.05)
Ultrasound stimulation improved the discriminative learning ability of the mice
使用超声参数二进行刺激,从行为学结果中可以看出US组的小鼠经过超声 刺激后,在第一次选择探索臂时具有较高比例选择新开放的臂,而Sham组则相 反,选择训练是探索过的臂的比例更高,图4.11(4)o US组选择新臂的比例为0.86 ±0.14, Sham组选择新臂的比例为0.29 + 0.18, p二0.031 V0.05,故两者具有显著
性差异。而对于在新臂中探索的时间占比,US组平均达到14.24%±1.31, Sham 组平均为26.03%±4.89, p二0.053>0.05,两者没有明显差异,图4.11(b)。超声刺 激组Alternation百分比为66.18%±4.61,假刺激组为58.93%±2,力。
从实验结果中可以看出,超声刺激提高了小鼠对于新臂的辨别性学习能力, 经过低强度聚焦超声刺激前额叶皮层的小鼠在第一次探索中率先进入新开放臂 中进行探索。但两组小鼠在Alternation比例及在新臂中探索时长均没有明显差 异,说明超声刺激在本实验中并不影响小鼠的工作记忆能力,两组小鼠在新臂的 探索实践均较短,说明两组小鼠的好奇情绪及探索行为较低,但没有差异。
4.4.3新事物识别实验结果
由新事物识别实验的结果可以看到(图4.12), US组的小鼠经过超声刺激后, 绝对辨别度明显较Sham组得到提升。US组小鼠在第二天的测试过程中,探索 新事物的时长占探索两事物总时长比例更高,如图4.12。US组绝对辨别度达到 58.124%±6.181, Sham 组绝对辨别度为 29.514%±3.448, p二0.0015V0.01,两者 具有显著性差异。说明超声刺激后小鼠比假刺激组的小鼠对新事物的探索表现更 加强烈,对旧事物具备更好的记忆及辨别能力。

图4.12新事物识别实验结果(**pV0.01)
Fig.4.12 Results of novel object recognize test. (**p V0.01)
Ultrasound stimulation improved the discriminative learning ability and memory function of
AD model mice
4.5本章小结
本章针对普通小鼠进行了超声神经调控对学习记忆的影响的实验,首先调研 了与学习记忆相关的脑核团及环路,并配合设计的准直器和自制的超声换能器刺 激小鼠的前额叶皮层(PFC)。然后通过对比实验的方式,对假刺激组的小鼠和 超声刺激组的小鼠进行学习记忆的相关行为学实验,包括Freezing条件恐惧实 验、Y迷宫实验、新事物识别实验。实验结果证明低强度聚焦超声能够调控小鼠 的学习记忆能力,同时通过不同的探头参数证明超声神经调控对神经元的调控具 有双向性,不同的刺激参数会影响该区域神经元在小鼠学习记忆过程中的作用。
接着,为了下一步将超声神经调控技术运用在阿尔兹海默症疾病模型的小鼠 上且不进行去头皮手术,改用了频率更低的探头对普通小鼠进行了基础研究,证 明该参数下刺激正常小鼠的海马结构及皮层区域可以改善小鼠的学习记忆功能, 为下一章针对阿尔兹海默症模型的小鼠进行学习记忆调控的实验提供支持。
第5章 低强度聚焦超声对AD模型小鼠记忆的调控
5.1引言
继上一章发现低强度聚焦超声能够有效影响普通小鼠的学习记忆功能的实 验结果,并存在参数能够改善小鼠的学习记忆功能,本章将该技术用于APP/PS1 双基因敲除小鼠模型,探究超声神经调控技术是否可以有效改善阿尔兹海默症模 型小鼠学习记忆功能下降的情况。此模型鼠表达突变的人类早老素和人鼠淀粉样 前蛋白融合体,是一种被广泛应用于AD疾病研究的小鼠模型。
5.2材料与方法
5.2.1实验动物
本章使用雌性约15周龄APP/PS1双转基因小鼠共15只,动物房饲养条件 与上一章一致。15只平均随机分配至三组,空白对照组(Control, n = 5)、假 刺激组(Sham, n二5)与超声组(US, n二5)。其中28只(对照组21只,超声 组21只)用于Freezing条件恐惧记忆行为学实验,14只(对照组7只,超声 组7只)用于Y迷宫行为学实验,30只(对照组15只,超声组15只)用于新 事物识别实验。
5.2.2实验方案设计
考虑到阿尔兹海默症病理症状存在淀粉样蛋白的沉积,本章实验采取较长期 进行干预和超声刺激的实验方案,每两天进行一次超声刺激/假刺激,即第1、3、 5、7、9、11天进行超声刺激/假刺激,第1、4、7、10、13天注射EdU溶液,在 第13天进行小鼠转棒实验、第14天进行Y迷宫实验和旷场实验,最后取脑灌 流进行脑组织切片,进行EdU细胞增殖检测。
刺激区域坐标和超声波参数与上一章的刺激海马结构与皮层的基础实验部 分抑制为 bregma 后 1.95 至 2.10mm,左 0.90 至 1.10mm,深部 1.40 至 1.80mm, 超声波参数为1MHz基频、lOOHzPRF、5%占空比,刺激0.5s停5.5s,刺激时长 30min,电压幅值 300mv, ISPPA=12.6W/cm2o

每两天进行一次超声刺激
1 MHz FF, 100 Hz PRF, 5% DC,30 min / 次
每三天注射一次EdU溶液
7 9 11 13 14
转棒实验
图5・1 AD模型小鼠的实验方案
Fig.5.1 Experimental procedure of AD mouse model
5.2.3旷场实验
旷场实验是评价动物在新环境中的探究行为、自主探索和紧张情绪的实验。 实验选用了 50cmx50cm长宽的正方形箱,箱无盖,壁高约50cm□允许小鼠在内 自由探索10分钟,使用摄像机对小鼠的行为进行记录,后用Smart软件对实验 结果进行处理。处理时将正方向区域平均分为9块同等大小的区域,数据的前5 分钟是小鼠适应箱内环境,主要统计小鼠穿梭、停留在中心区域的时间用于评估 小鼠的焦虑情绪是否明显,后5分钟数据主要统计小鼠在整个区域内的运动路程 评估小鼠的运动能力。
5.2.4转棒实验
转棒实验是评价动物运动能力的实验。实验设备如图,小鼠以隔板为界各自 隔开。首先小鼠放置在设备的对应位置后,设备以&/min匀速转动一分钟,期间 掉落的小鼠仍然放回继续学习。间隔10分钟后进行第一次测试,小鼠放置在对 应位置后,速度从零开始,以8r/min的加速度均匀加速5分钟随后匀速转动转 棒,即0-5分钟匀加速从Or/min速度加速至40r/min速度,随后6-10分钟以 40r/min匀速转动转棒,记录小鼠在转棒上停留的时间,掉落或抓紧转棒跟随转 棒转动三周均视为停止。

图5・2转棒实验的实验装置与实验中转棒速度
(a)转棒实验的实验装置;(b)转棒速度设计
Fig.5.2 Equipment of rotarod test and the rotarod speed of experiment・
(a) Equipment of rotarod test; (b) rotarod speed protocol of experiment・
525 Y迷宫
Y迷宫的实验方案与上一章一致,仅改变超声刺激的时间提前至Y迷宫实 验的前13天,每两天刺激一次。
5.2.6 EdU细胞增殖检测
检测细胞增殖是评价细胞活性、代谢及生理情况的重要手段。传统免疫荧光 染色的方法需要进行抗原抗体孵育等操作,步骤繁琐,同时DNA变性操作容易 造成结果错误或变性不充分导致检测不到EdU(5-ethynyl-29-deoxyuridine, 5-乙烘 基-2,脱氧尿卩密噪核昔)是一种胸腺卩密噪核昔类似物,能够在DNA复制时能够代 替胸腺卩密噪插入新合成的DNA链,通过检测EdU能够检测细胞的增殖情况、 DNA的活性等细胞状况。其大小仅为免疫荧光抗体大小的1/500,更易于在细胞 内扩散,EdU检测无需进行DNA变性操作和抗原抗体孵育,避免样品损伤,具
有操作简单、更快速、更准确的优势。
在超声刺激过程中每三天进行EdU的注射,即第1、4、7、10、13天根据 小鼠体重腹腔注射使用PBS进行稀释的EdU溶液(100mg/kg),
脑片准备:在小鼠腹腔注射戊巴比妥钠,躺姿固定小鼠四肢在灌流板上,用 银子及剪刀剪开胸口的皮肤,利用止血钳固定肋骨位置,使心脏、肝脏位置暴露。 将注射针头插入心尖偏右位置,并在左心室位置剪开一个小口,利用PBS溶液 开始灌注,随后用4%多聚甲醛继续灌注至小鼠四肢、尾部僵硬。将灌流后的小 鼠断头,小心取出脑组织,浸泡在注满4%多聚甲醛的10mL离心管内过夜。随 后依次使用10%、20%、30%浓度的蔗糖溶液进行脫水处理,每次均须保留过夜 至脑组织沉于底部利用刀片修切脑组织,保留完整海马及周围组织,加OCT
(Optimal cutting temperature compound)包埋,放置于-80°C冰箱,使用冰冻切片 机对组织进行冠状切片,切片厚度20 pim,切片保存于-20°Co
染色:将冷冻脑片取出解冻至室温,然后用4%多聚甲醛固定15分钟,随后 使用PBS清洗3次,每次5分钟。清洗过后使用0.5% Triton X-100透化20分 钟。脑片使用3%牛血清蛋白溶液(BSA)清洗两次后使用Click-iT™反应混合液 避光孵化30分钟,反应混合液中由去离子水、Click-iT™反应缓冲液,催化剂 CuS04, Alexa Fluor@ 488以及缓冲添加剂配置。再次使用3%牛血清蛋白溶液清 洗一次,随后进行DNA染色。使用去离子水按照100: 1稀释Hoechst 33342配 成溶液,避光保存。脑切片用PBS清洗一次,然后用100 uL的Hoechst 33342 溶液孵育30分钟,然后用PBS洗去反应液。
图片采集与数据统计:利用激光共聚焦油镜显微镜观察染色结果,低倍镜下 找到海马DG区及皮层,采集皮层及海马区的荧光结果。通过DAPI荧光记录皮 层和海马区细胞数,观察Edu荧光标记的细胞核数量并进行统计。
5.3结果

图5.3AD小鼠行为学实验结果
(a)旷场实验前5分钟结果;(b)旷场实验后5分钟结果;(c)Y迷宫实验结果(**pV0・01);
(d)转棒实验结果(*pV0・05, **pV0・01)
Fig.5.3 Behavioral experiment results of AD mice.
(a) Result of the first 5 minutes of the open-field test; (b) Result of the last 5 minutes of the open-field test; (c) Y-maze test results(**p<0.01); (d) Results of rotarod test(*pV0・05, **pV0・01)
5.3.1旷场实验
从旷场的实验结果来看,Control组小鼠前五分钟在中央区域活动的时间占 比为8.23%±2.0L Sham组在中心活动的时间占比为9.62%±2.47, US组在中 心活动的时间占比为8.43%土 1.67,各组之间均无显著性差异。后五分钟Control 组的运动距离平均为1936.92cm土339.66, Sham组的运动距离平均为1953.64cm ±244.93, US组的运动距离平均为1761.38cm±211.982,各组之间均无显著性 差异。
根据旷场实验的统计结果,超声神经调控技术的干预没有导致AD小鼠的焦
虑情绪增加,且超声神经调控没有明显增强小鼠自主探索、自主运动的能力。
5.3.2 Y迷宫实验
Y迷宫实验结果证明,超声神经调控增强FAD小鼠自主学习记忆能力,小 鼠的辨别性学习、工作记忆得到了提升。Control组、Sham组和US组在新臂中 的探索时间分别为31.43s±7.61、54.63s±7.72和66.80s±6.13,占总时长的百分 比分别为10.47%土2.54、18.32%±2.57、22.27%±2.04,超声刺激组的小鼠与AD 模型空白对照组与假刺激组都存在显著性差异。根据Y迷宫实验结果,超声神 经调控提高了 AD模型小鼠的辨别性学习能力和工作记忆能力。
5.3.3转棒实验结果
转棒实验结果显示,超声神经调控刺激小鼠的海马区域能够提高小鼠的平衡 协调能力、被迫运动能力以及学习与工作记忆能力。数据分析得到,Control组在 转棒上所维持时长三次平均为121.67s± 14.19, Sham组的三次平均时长为 160.50s土8.11, US组为206.40s± 17.05o相较空白对照组的AD模型小鼠,超声 刺激组的小鼠的运动能力、平衡能力以及学习和工作记忆能力有明显的提升。
5.3.4 EdU细胞增殖检测结果
超声刺激后对小鼠的超声刺激区域进行了 EdU细胞增殖检测,实验结果显 示超声干预的区域存在细胞增殖的数量更多的现象。如图5.5所示,分别为空白 对照组、假刺激组及超声刺激组皮层区域的EdU检测荧光结果,因EdU标记的 是新合成的DNA链,故只有与细胞核重合的EdU结果被计数。
皮层的EdU检测实验结果显示,在放大400倍情况下,与空白对照组(1.20 ±0.970, p二0.013V0.05)和假刺激组(1.75±0.479, p二0.004V0.01)相比,超声 刺激组的新增殖神经元明显增加(5.25 + 0.630),超声刺激组与空白对照组与假 刺激组具有显著性差异。

图5・4 AD小鼠皮层区域EdU检测结果
(a)超声刺激后,皮层中免疫荧光:EdU (绿色),DAPI标记细胞核(蓝色);(b) AD小鼠经
超声刺激后皮层神经元细胞存在明显增殖现象(*pV0・05, **pV0・01)
Fig.5.4 The Edu test results of AD mice cortex・
(a) Fluorescence images of EdU in mice cortex after transcranial ultrasound stimulation:
EdU (green), nuclein labeled with anti-DAPI (blue); (b)The proliferation of cortical neurons
in AD mice was obvious after ultrasound stimulation. (*pV0・05, **pV0・01)

DAPI EdU Merge

图5・5 AD小鼠海马DG区域EdU检测结果

(a)超声刺激后,海马齿状回中免疫荧光:EdU (绿色),DAPI标记细胞核(蓝色);(b)AD
小鼠经超声刺激后海马神经元细胞存在明显增殖现象(**pV0・01)
Fig.5.5 The Edu test results of AD mice dentate gyrus.
(a) Fluorescence images of EdU in mice dentate gyrus after transcranial ultrasound
stimulation: EdU (green), nuclein labeled with anti-DAPI (blue); (b) The proliferation of
neurons in AD mice dentate gyrus was obvious after ultrasound stimulation. (**pV0.01)・
海马齿状回(DG)的EdU检测实验结果显示,在放大400倍情况下,与空 白对照组(1.00土0.316, p二0.004V0.01)和假刺激组(2.00±0.707, p二0.045V 0.01)相比,超声刺激组的新增殖神经元明显增加(5.20±1.02),超声刺激组与 空白对照组与假刺激组具有显著性差异。
EdU增值细胞检测结果证明,小鼠接受超声刺激后,海马齿状回及皮层有明 显的细胞增殖情况。可以推测,超声神经调控能够提高AD小鼠的学习记忆能力 表现的原因可能为超声刺激促进该区域神经元的增殖。
5.4本章小结
本章针对AD模型小鼠进行了超声神经调控对学习记忆和运动能力影响的 实验,首先设计了配合新的探头刺激小鼠海马区域的准直器。然后通过疾病模型 空白对照、假刺激与超声刺激之间进行的学习记忆与运动能力相关的行为学实验, 包括Y迷宫实验、转棒实验、旷场实验等。实验结果证明低强度聚焦超声能够有 效提升AD模型小鼠的学习记忆能力,最后通过组织免疫荧光和免疫组化的方式 研究超声神经调控刺激海马区域提升AD小鼠学习记忆能力的原因可能是超声 刺激促进了海马DG区域及皮层的细胞增殖,为超声神经调控技术治疗阿尔兹海 默症等脑疾病提供实验及数据支持。
第6章总结与展望
6.1本文工作总结
本文从超声波的定义及基本知识出发,结合现代工业常用的压电材料,设计 并制造了用于刺激小鼠脑核团的超声聚焦换能器及准直器。通过超声光束分析仪 和三维声场扫描系统确定了此换能器的声场分布情况以及相关参数的数值。此设 计在后续的其他关于超声神经调控的实验中同样可以使用,通过凹面换能器的构 造及准直器的设计就可以达到准确刺激小鼠脑中某一毫米级别的脑区域。
随后针对正常小鼠进行了不同参数的低强度聚焦超声的刺激并通过学习记 忆相关的行为学实验来判断超声波的作用,实验发现超声波经颅刺激小鼠前额叶 皮层能够有效改变小鼠的学习记忆能力,并且不同的参数的效果不同,目前已有 两组参数分别可以达到促进恐惧记忆消散效果和抑制恐惧记忆消散的效果,此结 果同样说明了超声神经调控对于神经元的作用具有双向性。接着,使用聚焦超声 刺激AD模型鼠,同样进行了学习记忆相关行为学实验。实验证明,超声波能够 改善AD模型鼠的学习记忆能力缺陷,提高AD模型鼠的辨别性学习能力、工作记 忆能力、运动平衡能力等。最后进行了 EdU细胞增殖检测,发现超声能够促进刺 激区域的细胞增殖,这可能是改善小鼠学习认知的原因之一。
超声神经调控作为一种新兴的神经调控技术,尽管尚未完全掌握其调控原理, 但其有效性、安全性、无创性使其成为一种理想的神经调控手段。本实验为超声 神经调控用于治疗阿尔兹海默症等脑功能相关疾病提供了一些实验数据的支持 以及新的思路和想法。
6.2未来展望
⑴本研究虽然发现了不同参数对学习记忆功能的影响不同,超声神经调控技 术具有双向性,但却未能深入探讨究竟是哪一或哪几个参数在其中起主导作用。 后续要基于之前的实验数据,深入分析和研究超声刺激参数对学习记忆功能的影 响,总结各类参数在其中的作用,为今后超声神经调控的参数选择提供更加完整 的理论基础。
⑵后续研究需要进一步在正常动物或疾病动物模型中研究超声对学习记忆 功能的影响,并针对学习记忆相关的蛋白进行检测。
⑶后续研究需要进一步探究超声神经调控在影响学习记忆的过程中是直接 作用于何种神经元或其他蛋白质分子,又或者说研究低强度聚焦超声能够调控学 习记忆的直接原因。
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致谢
时光飞逝岁月如歌,三年长的研究生阶段即将结束,
回顾硕士研究生的三年求学经历,首先要感谢我的导师郑海荣研究员。郑老 师自2015年获国家重大科研仪器研制项目资助以来,致力于打造拥有完全自主 知识产权的超声辐射力的深部脑刺激与神经调控仪器。我很荣幸也很庆幸能够加 入郑老师带领的团队,开展超声辐射力用于神经调控的相关研究。三年中,郑老 师不仅在学业上鼓励学生要有学术自信并且对待科研踏实勤勉,同时也督促我们 保持身心健康、乐观积极。在学术与生活方面,都深深受益于郑老师的指导与关 心,能够师从郑老师,我感到非常庆幸。在此向郑老师表示我诚挚的敬意与感谢!
特别感谢牛丽丽老师。结束了一年的集中教学后,我来到了新的环境与新的 领域开始我的科研生活。从选择并了解超声神经调控方向,到开始进行相关的动 物实验,到后来的能够有机会参与学术会议、撰写与发表相关学术文章,感谢牛 老师的悉心指导和帮助,让我能够快速融入到这一学科和研究当中,并培养了我 的科研能力!感谢孟龙老师两年来在学业上的指导与帮助!同时2020年开年因 疫情原因未能回家,感谢牛老师和孟老师在生活上的关怀!
同时感谢中国科学院大学、中国科学院深圳先进技术研究院对我的培养,无论是集中学习的经历还是在先进院进行实验的经历,都是无比充实的时光,借助 大平台,我在许多方面都有了新的收获。感谢中国科学院大学!感谢深圳先进技 术研究院!感谢影像中心以及所有的老师、同事、同学们!
还要感谢牛丽丽老师课题组全体同学们!有你们,在科研中遇到的难题我能 够有人讨论;在生活中遇到的烦恼我能够有人倾诉。感谢各位师兄师姐师弟师妹 们,让我的科研生活和休闲生活都非常丰富充实!
感谢我的家人给予我的关心和支持!