PINK 1/Parkin通路介导线粒体自噬在脉冲射频治疗带状疱疹后神经痛中的作用机制研究论文

2020年9月10日13:55:33PINK 1/Parkin通路介导线粒体自噬在脉冲射频治疗带状疱疹后神经痛中的作用机制研究论文已关闭评论

PINK 1/Parkin通路介导线粒体自噬在脉冲射频治疗带状疱疹后神经痛中的作用机制研究论文

中英文略写缩列表

英文缩写 英文全称 中文全称
BDNF brain derived neurotrophic factor 脑源性神经营养因子
CCI Chronic sciatic nerve compression 慢性坐骨神经压迫损伤
  injury  
C0X-2 cyclo-oxygen-ase-2 环氧化物酶-2
DRG Dorsal root ganglion 背根神经节
ERK extra-cellular signal-regulated 细胞外信号调节激酶
  kinase  
GABA y-aminobutyrate 厂氨基丁酸
GABAB-R1 y-aminobutyrate-B-receptorl 厂氨基丁酸B受体1
  hyperpolarization activated 超极化激活的环核昔酸门
HCN cyclicnucleotide-gated cation 控阳离子通道
  channels  
IL-卩 Interleukin-P 白介素-卩
iNOS Inducible nitric oxide synthase 诱导型一氧化氮合酶
  Microtubules associated  
LC3 protein light chain 3 微管相关蛋白轻链3
NBR1 neighbor of BRCA1 gene BRCA1基因相邻结构域
NDP52 nucleardot 52 kDa protein 核昔酸52kDa蛋白质
NeuP neuropathic pain 神经病理性疼痛
NMDA N-methyl-D-aspartic acid receptor N-甲基-D-天冬氨酸受体
OPTN optineurin 光神经素
Parkin E3 ubiquitin-protein ligase Parkin E3泛素-蛋白质连接酶
PARL presenilin-associated 早衰素相关菱形蛋白
  rhomboidlike protein  
PHN postherpetic neuralgia 带状疱疹后神经痛
PINK1 PTEN-induced putative kinase 1 PTEN诱导的假定激酶1
  Paw mechanical withdrawal  
PMWT threshold 机械缩足痛阈值
PRF pulsed Radiofrequency 脉冲射频
RCTs Random Controlled Trials 随机对照试验
RTX resinifratoxin 树脂毒素
SNI sciatic nerve injury 坐骨神经分支部分损伤
SNL Spinal nerve ligation 脊神经结扎
TNF-a Tumor necrosis factor-a 肿瘤坏死因子-a
TWL thermal withdrawal latency 热性痛阈值
VZV varicella zoster virus 带状疱疹病毒

摘要

目的:利用树脂毒素(©诚幵毗(用皿1«*)腹腔注射制备带状疱疹后神 经痛(postherpetic neuralgia?PHN)大鼠模型,观察脉冲射频(pulsed radio frequency?PRF)干预对带状疱疹后神经痛模型大鼠的镇痛作用及机制,探 究PINKl/Parkin信号通路以及线粒体自噬在其治疗机制中的可能作用。

方法:SPF级健康成年雄性SD大鼠60只,体重200-220 go采用随 机数字表法,将60只SD大鼠随机分为Blank组、V-C组、PHN组、Sham PRF组、PRF治疗组,每组12只。Blank组:按照PHN组相同体积腹腔 注射生理盐水;v-C组:新鲜配制由10%吐温80、10%乙醇和80%生理盐水 组成的混合液,按照PHN组相同体积腹腔注射;PHN组、Sham PRF组和 PRF治疗组:按照RTX 200pig/kg腹腔注射。在RTX处理前2h,和RTX 处理后 1 d、4 d、7 d、10 d、14 d,以及 PRF 治疗后 1 d、4 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d分别对各组大鼠进行机械缩足阈值(pain mechanical withdrawal threshold?PMWT )和热缩足潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL)测定。Sham PRF组:给予RTX腹腔注射后,待大鼠机械缩 足阈值和热缩足潜伏期稳定后进行PRF穿刺定位,但不实施PRF治疗;PRF 治疗组:给予RTX腹腔注射后,待大鼠PMWT和TWL稳定后进行PRF 穿刺定位,并给予PRF治疗;PHN组:给予RTX腹腔注射后不给予其他 任何处理。在进行PRF治疗第42日测定PMWT和TWL后,取各组大鼠 L4〜L6节段脊髓背角组织,利用western blotting测定该节段脊髓背角组织 蛋白 PINK1、Parkin、Lc3 II、Lc3 I、Beeline-1 和P62表达水平;利用 RT-qPCR 测定该节段脊髓背角组织mRNA Beeline-1和Lc3表达情况;利用透射电 镜观察该节段脊髓背角组织自噬小体数量与线粒体形态。

结果:

  1. 机械痛阈检测结果:与Blank组比较,RTX处理后PHN组,Sham PRF 组机械痛阈出现明显降低(05);与卩助组比较,PRF治疗后1 d P RF治疗组大鼠机械痛阈开始升高,之后各时点机械痛阈均明显高于PHN 组(P<0. 05)o
  2. 热痛阈检测结果:与Blank组比较,RTX处理后PHN组和Sham PRF 组热痛阈出现明显升高(05) ^PHN组比较,PRF治疗后1 d PRF 治疗组大鼠机械痛阈开始降低,之后各时点机械痛阈均明显低于PHN组(P <0. 05)o
  3. Western blot检测结果:与Blank组比较,PHN组、Sham PRF组大鼠 脊髓背角组织中蛋白PINK1、Parkin的相对表达量明显增加(05);与PHN组、Sham PRF组比较,PRF治疗组大鼠脊髓背角组织中蛋白PIN KI、Parkin的相对表达量明显降低(PV0.05);与Blank组比较,PHN组 大鼠脊髓背角组织中Lc3II/Lc3 I比值增加,Beeline-1表达增加,SQSTM 1/P62表达降低(PV0.05),与V-C组无明显差异;与PHN组比较,PRF 治疗组大鼠脊髓背角组织中Lc3II/Lc3 I比值降低,Becline-1表达降低,P 62表达增加(PV0.05),与Sham PRF组无明显差异。
  4. RT-qPCR检测结果:与Blank组比较,PHN组大鼠脊髓背角组织中m RNA Lc3 增加,mRNA Beeline-1 表达增加(05);与 PHN 组比较, PRF治疗组大鼠脊髓背角组织中mRNA Lc3降低,mRNA Becline-1表达 降低,与Sham PRF组无明显差异。
  5. 透射电镜观察结果:Blank组大鼠脊髓背角组织细胞结构完整,未见明 显自噬小体,线粒体结构良好;与Blank组比较,PHN组大鼠脊髓背角组 织细胞出现较多完整自噬小体双膜结构,线粒体肿胀、空泡变性和极消失 等现象明显,少数出现与溶酶体融合;与PHN组比较,PRF治疗组大鼠脊 髓背角组织细胞少见自噬小体双模结构,线粒体偶见轻微肿胀和空泡变性, 未见极消失和与溶酶体融合。

结论:

  1. PHN模型大鼠机械痛阈升高,热痛阈降低,同时伴有脊髓背角组织 PINK1、Parkin表达增加,自噬活性增强,线粒体变性和凋亡和增加。
  2. PRF可能通过抑制PHN模型大鼠脊髓背角组织PINKl/Parkin信号通 路活性,调节线粒体自噬活性,改善脊髓背角组织细胞凋亡,进而对PHN 模型大鼠产生镇痛作用。

关键词:脉冲射频,带状疱疹后神经痛,PINK1, Parkin,自噬,治疗

THE ROLE OF PINKl/Parkin PATHWAY-MEDIATED
MITOCHONDRIAL AUTOPHAGY IN PULSED
RADIOFREQUENCY TREATMENT FOR
POSTHERPETIC NEURALGIA

ABSTRACT

Objectives : To prepare a rat model of postherpetic neuralgia (PHN) by intraperitoneal injection of resin toxin (RTX)? and observe the effect of pulsed radiofrequency (PRF) intervention on post-herpetic neuralgia rats. Analgesic effects and mechanisms explore the possible role of PINKl/Parkin signaling pathway and mitochondrial autophagy in its therapeutic mechanisms.

Methods: There were 60 SPF healthy adult male SD rats weighing 200-220 g. Sixty SD rats were randomly divided into Blank group, V-C group, PHN group, Sham PRF group and PRF treatment group, with 12 rats in each group.Blank group: intraperitoneal injection of normal saline according to the same volume of PHN group; V-C group: freshly prepared a mixture of 10% Tween 80,10% ethanol and 80% physiological saline, intraperitoneal injection according to the same volume of PHN group; PHN group 5 Sham PRF group, PRF treatment group: intraperitoneal injection according to RTX 200ug/kg. 2 h before RTX treatment, 1 d? 4 d? 7 d? 10 d? 14 d after RTX treatment, and 1 d? 4 d? 7 d? 10 d? 14 d? 21 d,28 d,35 d?42 d after PRF treatment The rats were subjected to mechanical mechanical withdrawal threshold (PMWT) and thermal withdrawal latency (TWL) for 42 days. Sham PRF group: After intraperitoneal injection of RTX, PRF puncture was performed after the mechanical contraction threshold and heat-shrinking latency of the rats were stabilized, but PRF treatment was not performed. PRF treatment group: after intraperitoneal injection of RTX? the rats were treated. PMWT and TWL were stabilized and PRF puncture was performed and PRF was given. In PHN group, no other treatment was given after intraperitoneal injection of RTX. After measuring PMWT and TWL on the 35th day after PRF treatment, the spinal cord tissues of L4 〜L6 segments of each group were taken, and the spinal cord tissue proteins PINK1, Parkin, Lc3II? Lc3I? Beeline-1 and the segment were determined by western blotting. The expression level of P62 was detected by RT-qPCR. The expression of Beeline-1 and Lc3 mRNA in spinal cord tissue was detected by transmission electron microscopy. The number of autophagosomes and mitochondrial morphology of spinal cord tissue were observed by transmission electron microscopy.

Results:

  1. Mechanical pain threshold test results: Compared with the Blank group, the PHN group had a significant decrease in the mechanical pain threshold in the Sham PRF group (P<0.05). Compared with the PHN group, the RTX after 1 day after the PRF treatment. The mechanical pain threshold of rats in the -PRF group began to increase, and the mechanical pain threshold at each time point was significantly higher than that in the PHN group (P<0.05).
  2. Thermal pain threshold test results: Compared with the Blank group, the PHN group had a significantly higher thermal pain threshold in the Sham PRF group (P<0.05). Compared with the PHN group, 1 day after the PRF treatment. The mechanical pain threshold of the rats in the PRF treatment group began to decrease, and the mechanical pain threshold at each time point was significantly lower than that in the PHN group (P<0.05).
  3. Western blot analysis: Compared with the Blank group, the relative expression of protein PINK1 and Parkin in the spinal cord of PHN group and Sham PRF group increased significantly (P<0.05); and PHN group, Sham PRF group The relative expression of protein PINK1 and Parkin in the spinal cord of rats in the PRF treatment group was significantly lower (P<0.05). Compared with the Blank group, the ratio of Lc3II/Lc3I in the spinal dorsal horn of rats in the PHN group was increased. Beeline-1 The expression of SQSTM1/P62 was decreased (P<0.05)?and there was no significant difference between the two groups . Compared with the PHN group5 the ratio of Lc3II/Lc3I in the spinal dorsal horn of rats in the PRF treatment group was decreased. Beeline- 1 expression decreased, P62 expression increased (P <0.05)5 and there was no significant difference with Sham PRF group .
  4. RT-qPCR results: Compared with the Blank group, the Lc3 mRNA and the expression of mRNA Beeline-1 in the spinal cord dorsal horn were increased in the PHN group (P<0.05). Compared with the PHN group, the PRF treatment group was larger than the PHN group. The mRNA Lc3 of the spinal dorsal horn was decreased, and the expression of mRNA Beeline-1 was decreased, which was not significantly different from that of the Sham PRF group .
  5. Transmission electron microscopy observation: The spinal dorsal horn cells of the blank group were intact, no obvious autophagosomes were found, and the mitochondria structure was good. Compared with the Blank group, more complete autophagy appeared in the spinal dorsal horn of the PHN group. Small body double membrane structure, mitochondrial swelling, vacuolar degeneration and extreme disappearance were obvious, and a few appeared to fuse with lysosome. Compared with PHN group, PRF treatment group had rare autophagy double-mode in spinal dorsal horn. Structure, mitochondria occasionally mild swelling and vacuolar degeneration, no significant disappearance and fusion with lysosomes.

Conclusion:

  1. The mechanical pain threshold of rats in PHN model increased, the thermal pain threshold decreased, accompanied by increased expression of PINK1, Parkin in spinal cord tissue, enhanced autophagy activity, mitochondrial degeneration and apoptosis.
  2. PRF may inhibit the autophagy activity of mitochondria and improve the apoptosis of spinal cord tissue by inhibiting the activity of PINK 1/Parkin signaling pathway in the spinal cord of rats with PHN model, and then analgesic effect on PHN model rats.

KEY WORDS : Pulsed radiofrequency, postherpetic neuralgia, PINK1? Parkin; autophagy, treatment

第一部分脉冲射频脊髓治疗对带状疱疹后神经痛
模型大鼠脊髓线粒体自噬的作用

1.引言

带状疱疹后神经痛(postherpetic neuralgia,PHN)是由水痘-带状疱疹病 毒(varicella zoster virus,VZV)感染引起的一种神经病理性疼痛(neuropathic pain?NeuP)□临床上多以皮损区异常剧烈疼痛、痛觉过敏、感觉异常和自 发性疼痛为特征有研究表明⑸,全世界范围内成年人带状疱疹患者继 而出现带状疱疹后神经痛的发病率为5%左右,并且在50岁及以上年龄组 中的发病率则高达25%〜50%,其发病率随年龄的增长而增高。而在美国 的另一项流行病学调查研究结果表明,年龄在40岁以上人群中超过99%的 人群有感染过VZV的血清学证据,这些人群具有发展为HZ的风险⑹。美 国每年约有100万例HZ患者,平均每3个人中就有1个人一生中患过HZ⑺。 据统计,5%〜20%的HZ患者将继续发展为PHNo PHN的频率和严重程度 随着年龄的增长而增加⑻引。60〜65岁人群中患有AHZ的比例是20%,而在 80岁以上老年人中则超过30%口°打除了年龄,HZ发展为PHN的危险因素 还包括存在前驱症状(如在皮疹出现前的疼痛和感觉异常)、严重皮疹以及 急性发作时疼痛严重"I最近的meta分析结果将眼部受累列为新的危险因 素血。其他可能的危险因素还包括系统性红斑狼疮、糖尿病和近期创伤史 [12]o免疫功能低下患者VZV再激活和神经并发症的风险增加血。PHN发病 机制尚不完全明确,多认为与外周神经病变和中枢敏化有关口狙,近来有研 究表明,精神因素在PHN发病机制中也发挥一定作用口5打而神经组织的损 你特别是感觉神经的损伤,在PHN剧烈疼痛和感觉异常等症状发病机制 中发挥重要作用。

PHN目前临床治疗方法主要有4类:①药物治疗,目前临床应用药物 主要为阻断痛觉神经传导联合改善损伤神经修复治疗的方式。药物在一定 程度上可改善患者的疼痛症状,但长期服用药物易出现肝肾功能损害及难 以耐受的不良反应②神经阻滞,与药物治疗类似,多以阻断疼痛神经 传导、营养修复损伤神经和抗炎性因子等药物为主,与口服和静脉药物相 比,减少了部分不良反应的发生,但受医师操作技术水平影响较大,疗效 很难保证;③物理治疗,主要包括经皮电刺激治疗和超激光照射治疗,疗 效难以确定,病人耐受性较差;④微创与介入治疗,如射频消融术治疗。 尽管有研究建议60〜75岁的人群接种灭毒疫苗预防PHN™,但却没有太多 的证据证明对免疫功能正常的人接种疫苗是比较安全的。根据适用人群、 价格及存储条件等因素,目前国内疫苗实际使用率较低问。感染VZV患 者出疹72小时内启动抗病毒治疗可有效缓解其疱疹期急性痛,而患者求医 时常已经错过了最佳的治疗时机如。综上所诉,PHN的的治疗多为对症治 疗,相关治疗方法虽多,但或因疗效不理想,或因毒副作用较大,或因医 师技术水平高低不一而导致其应用受到限制,其仍是临床工作中的难点。

脉冲射频(pulsed radiofrequency?PRF)是临床治疗带状疱疹后神经痛 的一项新技术,其作用机制仍不清楚。我们发现,PRF通过作用于背根神 经节(dorsal root ganglion?DRG)的电压门控性钠通道Navl. 8减少伤害性 疼痛信号传向疼痛中枢加。既往研究中,PRF处理后外周传入的疼痛刺激 减弱,促进脊髓背角GABAB-R1恢复。GABAB-R1恢复提示释放GABA 递质的GABA能神经元数量可能增加,而GABA能神经元数量减少是PHN 中重要的致病机制。

PHN脊髓长时间接受外周伤害性刺激,导致背角GABA能神经元退行 性病变,表现为其数量及受体均减少,对外周传入神经元突触抑制调控不 足。因GABA能神经元调控疼痛信号能力下降,导致背角伤害性神经元接 受高强度的疼痛刺激,诱导其敏感性增加,介导脊髓中枢敏化。因此,促 进GABA能神经元恢复对治疗PHN具有极其重要的意义。但外周疼痛信号 如何导致PHN脊髓背角的GABA能神经元退行性病变的机制仍未明了。

为更深入了解PHN的GABA能神经元退行性病变机制,我们开展了相 关的研究。结果显示:PHN模型脊髓神经元自噬程度增加,自噬程度与 GABA能神经元数量负相关。因此,前期研究认为,线粒体自噬活性调控 可能是PHN脊髓背角GABA能神经元退行性病变的关键机制。

综上所述,PRF可促进脊髓GABAB-R1上调,线粒体自噬活性改变是 导致脊髓背角GABA能神经元及其递质受体减少的重要原因。PRF是否通 过调控线粒体自噬活性实现GABAB-R1上调及可能机制仍不清楚。据此, 我们提出假设:PRF作用于PHN的DRG后,降低GABA能神经元自噬与 凋亡程度,促进GABA递质及受体上调,改善脊髓中枢敏化进程,从而发 挥良好的镇痛效果。该研究通过基础研究探索线粒体自噬活性在PRF治疗 PHN神经调控中的作用及机制,一方面可丰富PRF的治疗学基础理论,另 外一方面将为PRF进一步临床推广提供有力的证据,具有极大的科研理论 价值与临床实用价值。

2.方法

2.1实验材料

  1. 1. 1实验动物60只SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重200-220g,由 广西医科大学动物实验中心提供,合格证号:SCXK桂-2014-0002。实验 室(SPF 级)温度 22-25°C,湿度 40%-60%,周期光照 12h (8:00-20:00), 避免强光和噪咅的刺激,大鼠自由饮水和进食。本实验经广西医科大学动 物学伦理委员会批准。
  2. 1. 2主要实验试剂
产品名称 生产厂家
树脂毒素,resiniferotoxin (货号:R8756)

超敏ECL化学发光试剂盒(货号:P0018)

二抗稀释液(货号:P0023D)

一抗稀释液P0023A

SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(货号:P0012AC)

Tris三(羟甲基)氨基甲烷(货号:T8060)

Sigma,美国 碧云天,中国 碧云天,中国 碧云天,中国 碧云天,中国

Solarbio,中国

10%SDS (货号:S1010) Solarbio, 中国
驴 Anti-Rabbit IgG H&L (货号:abl75772) Abeam, 英国
p-Actin (13E5) Rabbit mAb (货号:4970S) CST,美国
Anti-LC3B 抗体(货号:abl92890) Abeam, 英国
Anti-MAP1LC3A 抗体(货号:ab52628) Abeam, 英国
Anti-Beclin 1 抗体(货号:ab207612) Abeam, 英国
Anti-SQSTMl / p62 抗体(货号:abl09012) Abeam, 英国
BCA蛋白浓度测定试剂盒 碧云天, 中国
Glycine甘氨酸(货号:G8200) Solarbio, 中国
20XTBS (货号:T1080) Solarbio, 中国
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(货号:P0015) 碧云天, 中国
柠檬酸盐缓冲液(货号:YZ-ZLI-9064) 中杉,中国
甲醇 科龙,中国
4%组织细胞固定液(货号:P1110) Solarbio, 中国
Tween-80 Amresco: ,美国
RIPA 裂解液(P0013B) 碧云天, 中国
PMSF 碧云天, 中国
蛋白酶抑制剂 碧云天, 中国
水合氯醛 成都科隆,中国
无水乙醇 成都科隆,中国
MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (货号:9767) TaKaRa, 日本
PrimeScript™ RT Master Mix (货号:RR036A) TaKaRa, 日本
SYBR® Premix Ex Taq™ II (货号:RR036A) TaKaRa, 日本

 

2. 1. 3主要试验仪器
产品名称 生产厂家
冷热板痛觉测试仪 IITC,美国
电泳槽 Bio-Rad,美国
凝胶成像与图像采集系统 Bid-Rad,美国
电泳仪 Bio-Rad,美国
转膜槽 Bio-Rad,美国
-80°C超低温冰箱 三洋,日本
医用低温冰箱 美菱,中国
多功能酶标仪 TEC AN,瑞士
手术器械(剪刀、银子等) 上海金钟,中国
移液器 Eppendorf,德国
电子微量天平 Shimadzu,日本

 

多功能高速离心机 Eppendorf,德国
超纯水器(型号:UPH-1-20T) 成都超纯科技,中国
透射电子显微镜(型号:H7650 ) 日立,日本
ABI StepOne Plus实时荧光定量PCR仪 StepOneTM 美国
凝胶成像与图像采集系统 Bid-Rad,美国

2观察指标

观察各组大鼠机械痛阈值和热痛阈值改变;观察各组大鼠脊髓L4〜L6节 段中自噬相关蛋白Lc3II> Lc3 I、Becline-1和P62表达情况;观察各组大 鼠脊髓L4〜L6节段mRNA Becline-1和Lc3表达情况;观察各组大鼠脊髓 L4〜L6节段脊髓中自噬小体数量与线粒体形态。

  1. 3实验方法
  2. 3. 1实验动物分组

采用随机数字表法,将60只SD大鼠随机分为空白对照组(Blank组)、 溶剂对照组(V-C组)、模型对照组(PHN组)、假治疗组(Sham PRF组)和 治疗组(PRF治疗组)5组,每组12只。

动物模型

Blank组:按照RTX组相同体积腹腔注射生理盐水;V-C组:按照RTX 组相同体积腹腔注射由10%吐温80、10%乙醇和80%生理盐水组成的混合液; PHN 组、Sham PRF组、PRF治疗组:将RTX溶解于由10%吐温80、10%乙 醇和80%生理盐水组成的混合液中,浓度为40ptg/mh按照RTX 200ptg/kg腹 腔注射;Sham PRF组:给予RTX腹腔注射后,待大鼠机械缩足阈值(pain mechanical withdrawal threshold?PMWT)稳定后进行PRF穿刺定位,但不实 施PRF治疗;PRF治疗组:给予RTX腹腔注射后,待大鼠PMWT稳定后进行 PRF穿刺定位,并给予PRF治疗;PHN组:给予RTX腹腔注射后不给予其他 任何处理。

  1. 3. 2疼痛行为学测定

实验选择的电子测痛仪测量范围为:0〜800g。参照参考文献诙,使用 电子测痛仪进行测定。将大鼠置于底部为金属网的透明玻璃箱内。测试前, 将大鼠置于测试环境中适应30min,待大鼠平静后开始测试。排除环境改变 对大鼠造成恐惧和躁动。刺激部位在各组实验大鼠中保持一致。将电子测 痛仪刺激探头尖端轻柔地垂直作用于大鼠后足足底,缓慢增加刺激力度, 大鼠出现缩足、舔足等反应后,记录电子测痛仪所显示的最大值。测试全 过程保持测试环境干燥、清洁。重复3次,每次间隔5min, 3次测定结果的 平均值作为PWMT值。机械痛阈值检测装置见图2-1 o

图2T 大鼠机械痛阈检测装置

Figure 2-1 Rats PWMT detection device

参照参考文献阴,使用热板刺激方法评价热缩足潜伏期(TWL)。测试 前,将测试大鼠置于测试环境中适应熟悉环境30min,待大鼠安静状态后开 始测试。安静环境下,将大鼠置于型热板刺激热板上,用有机玻璃观察框 将其罩住。当大鼠出现缩足、舔足和异常躁动等症状时停止计时,记录时 间。测试时间上限设定为20s,以免烫伤大鼠足底。测试全过程保持测试环 境干燥、清洁。每只大鼠重复测试3次,每次间隔lOmin,记录3次测量的平 均值作为热缩足潜伏期。热痛阈检测装置见图2-2o

图2-2 大鼠热痛阈检测装置

Figure 2-2 Rats PTWT detection device

  1. 3.3脉冲射频(PRF)治疗

在进行RTX处理第14日测定PMWT和TWL后,对各组大鼠进行相 应PRF处理,以确保模型建立成功。参照参考文献⑷的方法,采用4%水 合氯醛(chloral hydrate) 10 ml/kg腹腔注射对大鼠进行麻醉。大鼠麻醉后 对其背部和腹部除毛,碘伏消毒后在腹部贴上电极片,确保电极片与大鼠 腹部和四肢皮肤接触良好。将大鼠妥善固定于固定架上,可取仰卧位。为 方便操作,可将含有温水的塑料输液瓶放在大鼠腹部下面,同时可延缓大 鼠体温降低。通过触及大鼠脊柱两侧骨性标志,确定脊柱L4〜L6节段。当 触及L6脊柱棘突,向上探及间隙即为L5-L6间隙,利用防水标记笔进行 体表标记。以L5~L6间隙为中点,沿大鼠脊柱纵轴方向切开,切口长度为 1〜2cm,之后逐层钝性分离覆盖于脊柱表面筋膜、肌肉等组织,找到骨性 标志关节突,即可在其后下方发现椎间孔。此时,将与PRF治疗仪连接好 的射频针缓慢插入到椎间孔内,深度大约为0. 5〜lcm。通过PRF治疗仪运 动测试功能,当大鼠出现后下肢以及尾部规律抽动,同时电阻在300〜400 Q之间,则可确定射频针尖端位于背根神经节内或其附近。妥善固定射频 针后即可开始治疗。PRF参数设置为治疗时间2分钟,治疗脉冲时长为20毫 秒,治疗温度为42摄氏度,治疗频率为2赫兹。之后再次进行运动功能测 试,运动功能正常即可对大鼠进行伤口缝合。Sham PRF组大鼠仅进行射频 针的穿刺定位,不进行脉冲射频治疗,射频针放置椎间孔时间为2分钟。 缝合方法与PRF治疗组相同。Blank组、V-C组和PHN组大给予任何PRF 处理。

图2-3大鼠脉冲射频治疗操作示意图

Figure 2-3 Schematic diagram of rats PRF treatment

  1. 3. 4标本收集
  2. 3. 4. 1 Western-blot与PCR标本:使用浓度为4%的水合氯醛溶液 腹腔注射麻醉大鼠,将背部皮肤沿中线剪开,暴露全部脊柱节段。在处死 大鼠后,逐层分离脊柱表面及两侧的肌肉,剪断两侧肋骨。取胸段至骼悄 水平脊柱。找到头端椎管口后,禾U用注射器将冷PBS液注入椎管内,利用 液体压力将脊髓完整吹出。利用无菌手术刀片取脊髓腰膨大部位,即L4〜 L6节段脊髓组织,立刻放入液氮中2h速冻,-80 °C储存备用。提取蛋白或 RNA前从-80°C冰箱中取出50mg脊髓组织放入离心管中并解冻。
  3. 3. 4. 2透射电镜标本:使用浓度为4%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大 鼠,之后将大鼠置于固定架上妥善固定,取仰卧位。沿腹部中线从下腹部 逐渐向头端切开,逐层分离,利用止血钳提起大鼠剑突,剥离横膈,将胸 骨右侧肋骨沿根部剪断。使用眼科银小心剥离心包,将输液针在心尖部朝 主动脉方向插入,当输液针尖端到达主动脉,固定输液针。打开输液器开 关,同时使用眼科剪将右心耳剪开。先用冷的PBS溶液300ml迅速进行灌 注,之后使用4%多聚甲酸200ml缓慢进行灌注。当大鼠出现肝脏和皮肤变 成白色,四肢剧烈抖动,则说明灌注有效。最后按照Western blot与PCR样 本提取同样的方法取出脊髓组织并低温保存。
  4. 3. 5 Western blot

每组取5只大鼠,立即断头取新鲜脊髓组织,在冰上迅速分离并提取 L4〜L6节段脊髓组织,即放入液氮中2h速冻,-80°C储存备用。提取蛋白 前从-80°C冰箱中取出50mg脊髓组织放入离心管中并解冻,按下列步骤进 行处理。

所需溶液及试剂:

  • 配制10X电泳缓冲液:取三瓮甲基氨基甲烷(Tris) 30. 25g>甘氨酸 (Glycine)187. 5g和十二烷基硫酸钠(SDS)10g加入DDHQ滴定至1000ml,

常温保存。每次使用时,取适量10X电泳缓冲液按照比例加入DDHQ,稀 释为IX电泳缓冲液。

  • 配制IX转膜缓冲液:取三轻甲基氨基甲烷(Tris) 24・2g、甘氨酸 (Glycine) 115. 2g> 十二烷基硫酸钠(SDS) 4g 和甲醇(CHQH) 160ml

加入DDH2O定容至1000ml, 4°C密闭低温保存。

  • 配制丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺混合液(Acr-Bis):取丙烯酰胺(Acr) 29・2g、甲叉丙烯酰胺(Bis) 0. 加入DDHQ定容至100ml,制备成浓度 为40%的混合溶液。4°C密闭低温保存,保质期为3周。
  • 配制清洗溶液(Washing buffer):即TBST,取三瓮甲基氨基甲烷(Tris) 1.21g> NaCl 5. 84g 和 Tween-20 1ml 加入 DDHQ 定容至 1000mlo4°C密 闭低温保存,最好现配现用。
  • 配制封闭液:取实验用脱脂奶粉2g溶于TBST(IX)定容至40mL 4°C 密闭低温保存,可重复使用。
  • 配制显色缓冲液(AP substrate buffe):取三轻甲基氨基甲烷(Tris)
  1. 21g> NaCl 5. 84g以及浓度为100mM的MgCl2lml加入DDH2O定容至 lOOmL 4°C密闭低温保存。
  • 抗体稀释:使用专用抗体稀释液对各抗体分别稀释。抗Lc3 II抗体为 1:1000,抗 Lc3 I 抗体为 1:2000、抗 Beeline-1 抗体为 1:2000,抗 P62 抗 体为 l:10000o 实验步骤:
  • 提取组织蛋白:将分离好的脊髓组织从-80°C冰箱中转移至冰盒中放 置,将冻存管中脊髓组织称重后转移至标已高压EP管中,做好标记。按照 每lmg脊髓组织加入4ul裂解液RIPA和25ul蛋白酶抑制剂的比例加入裂 解液RIPA和蛋白制剂,置于冰上反应30分钟。
  • 使用电动匀浆器将反应完全的组织蛋白充分匀浆,持续5分钟,直至 EP管中无明显絮状物。
  • 将离心机提前降至4°C, 12000转/分钟,离心15分钟。
  • 利用移液枪取上清液置于新的EP管中,做好标记。
  • 对所有组织蛋白进行浓度配平。根据BCA试剂盒说明书(P0012,碧 云天)配制标准蛋白溶液,浓度为 5mg/mlo按照说明书方法在多孔板上 加样,经过37°C孵育后进行酶标仪蛋白浓度检测,通过计算制定标准曲线, 最后将各组样本制成等体积等浓度的标准样本。
  • 加入适当比例的4X上样缓冲液,使得EP管中上样缓冲液终浓度为 IX,然后置于沸水中煮沸5分钟。之后可放置于-20°C中保存。
  • 制胶:将制胶架平放于试验台上,取薄厚玻璃板各一块小心放置于制 胶架中,在置入凝胶之前先用DDH2O检测玻璃板之间是否泄漏。如无明显 泄漏,则可开始制备电泳凝胶。根据凝胶试剂盒说明配制合适浓度的分离 凝胶。用玻璃棒将分离凝胶沿同一方向缓慢搅动5〜10次,然后用lml移 液器缓慢加到玻璃板之间。当凝胶平面距离较短玻璃板l・5cni时即可。然 后用移液器沿较长玻璃板内壁缓慢注入双蒸水,直至超过较短玻璃板上缘o 室温放置35分钟。确认凝胶已经完全凝固,轻轻将凝胶表面水分倒出,使 用吸水滤纸将剩余水分吸净。此时即可开始配制浓缩胶,配好后用移液器 加到玻璃板之间,距离较短玻璃板上缘1〜2nini即可。将制孔梳子缓慢垂直 置入玻璃板,室温放置30分钟或4摄氏度放置2小时。浓缩胶凝固后将凝 胶连同制胶玻璃板一起放入电泳槽中,沿槽壁缓慢加入事先配置好的电泳 液以没过制胶玻璃板为佳。垂直取下制孔梳子,并利用移液器将孔道内气 泡和碎胶冲出。

10% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE浓缩胶的配制(ml):

配制胶浓度/成分 10%分离胶 5%浓缩胶
DdH2O 4. 1ml 3. 5ml
30%Acr-Bis (29: 1) 3. 3ml 1. 0ml
分离胶缓冲液 2. 5ml  
浓缩胶缓冲液(4X)   1. 5ml
10%过硫酸鞍 0. 1ml 0. 06ml
TEMED 0. 004ml 0. 006ml
总体积(ml) 10ml 6ml

上样:使用10ul移液枪头进行加样。两端孔道各加入2ul marker,中 间各孔道按照分组顺序加入等体积待测蛋白样本。上样量为50〜200憾之 间,根据浓度换算成上样体积,具体情况视结果调整.

  • 电泳:安装电泳槽,置于冰盒中,尽量用冰将电泳槽四周完全覆盖连 接电源后,开始电泳•首先使用恒压80V进行电泳,直至将各孔道内待测样 本在分离胶与浓缩胶分离处压成一条直线•当marker开始出现分离条带时, 将电压改为100〜120V,直至漠酚蓝到达近电泳槽底部。

(9)转膜:

  • 将玻璃板从电泳槽中取出置于装有转膜缓冲液瓷盘中,取下薄板,利用 裁胶片按照marker指定位置,裁成合适大小的凝胶条带。注意全程保持凝 胶条带湿润。
  • 预先将孔径为 22pim或0. 45pim PVDF膜裁剪成与凝胶条带大小相适 应,并在甲醇中浸泡30 s,再将其转移至转膜缓冲液浸泡15分钟,然后 把滤纸、凝胶一起放到转膜缓冲液中浸泡15分钟;
  • 按照三明治法依次将各物品平整置于转膜夹中,从转膜夹黑色面开始, 依次为海绵、三层厚滤纸,凝胶条带、PVDF膜(光面朝上)、三层厚滤纸、 海绵。使用玻璃棒将各层间气泡缓慢赶出。安装转膜槽后,倒入适量转膜 缓冲液,根据待测蛋白分子量确定电流大小和转膜时间。
  • 封闭:取出PVDF膜,置于装有TBST缓冲液的玻璃皿中,摇床洗 膜3次,每次5分钟。然后将PVDF膜转移至装有5%脱脂奶粉封闭液中, 摇床室温封闭,时间为60〜120分钟。
  • 孵育抗体:将封闭好的PVDF膜取出,取出已封闭的PVDF膜,置 于装有TBST缓冲液的玻璃皿中,摇床洗膜3次,每次5分钟。将PVDF 膜轻甩三下,置于一抗孵育盒内,4°C孵育过夜(10个小时左右)。一抗孵 育结束后,取出PVDF膜,用TBST缓冲液摇床清洗,时间为5min,重复 3次。可将使用过的抗体回收重复利用。之后将PVDF膜转移至二抗孵育暗 盒中,室温摇床孵育60〜120分钟。内参条带孵育方法与待测条带孵育方 法相同,一抗为内参抗体。
  • 洗膜:取出PVDF膜,置于装有TBST缓冲液的玻璃皿中,摇床洗 膜3次,每次10分钟。
  • 条带显影:将PVDF膜至于保鲜膜上,取适量等体积的A液和B 液混合,混匀后加在膜的表面,移至凝胶成像分析仪中,曝光显影。
  • 灰度值分析:用Gel-Pro Analyzer软件对目的条带进行光密度值计 算。
  1. 6 RT-qPCR

操作前准备:1•在进行样本提取前,将所有手术器械进行高压灭菌

处理。

  1. 经过高压灭菌的手术器械,在使用前用无水乙醇和DEPC水各浸泡

5min,最后用无菌纱布擦干。

3•使用标准的无核酶处理EP管,对移液枪枪头、电动匀浆器转头、离 心管等物品进行无核酶处理后方可使用。

4.在使用实验通风橱前对其进行紫外线杀菌处理。

5•在实验过程中穿戴无菌手套、无菌口罩和无菌手术帽。

6•提取RNA前配制好引物稀释液,将引物稀释后分装保存,并

做好标记。

  1. 3. 6. 1脊髓组织标本收集

每组随机取5只大鼠,使用浓度为4%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大 鼠,将背部皮肤沿中线剪开,暴露全部脊柱节段。在处死大鼠后,逐层分 离脊柱表面及两侧的肌肉,剪断两侧肋骨。取胸段至骼悄水平脊柱。找到 头端椎管口后,利用注射器将冷PBS液注入椎管内,利用液体压力将脊髓 完整吹出。利用无菌手术刀片取脊髓腰膨大部位,即L4-L6节段脊髓组 织,立刻放入液氮中2h速冻,-80°C储存备用。提取RNA前从-80°C冰箱 中取出50mg脊髓组织放入离心管中并解冻。

  1. 3. 6. 2脊髓组织RNA提取
  • 将离心管中解冻好的脊髓组织样本快速转移至匀浆管,然后加入合适 剂量含有50倍DDT溶液的裂解液,在事先准备好的冰盒中,利用电动匀 浆器对其进行快速匀浆,当匀浆管中无明显沉淀及絮状物,呈大致透明状, 利用移液器对其缓慢抽吸数次,使得裂解液与脊髓组织充分反应。
  • 将裂解完全的脊髓组织样本转移到无核酶EP管中,做好标记。
  • 将无核酶EP管置于4°C高速离心机中,12000 rpm,离心5min。
  • 离心后使用移液器将上清液转移至另一无核酶EP管中。
  • 将试剂盒中的gDNA橡胶旋转过滤柱安装到试剂盒提供的收集管上。
  • 将无核酶EP管中的上清液转移到gDNA橡胶旋转过滤柱中, 12000rpm,离心 lmino
  • 将gDNA橡胶旋转过滤柱丢弃。收集管中的过滤液保存待用。
  • 向收集管中加入等体积的70%乙醇溶液,使用移液器将溶液充分混 匀。
  • 将混合均匀的混合液快速转移至安装有收集管的RNA过滤旋转柱中。 每次转移溶液不超过600卩1,否则应分次进行。
  • 将安装有收集管的RNA过滤旋转柱置于高速离心机,12000 rpm, 离心Imino离心后将收集管中的滤液丢弃,将RNA过滤旋转柱重新置于 收集管上。
  • 在RNA过滤旋转柱添加缓冲液RWA 500(11 , 12000 rpm,离心30s。 离心后丢弃滤液。
  • 在RNA过滤旋转柱添加缓冲液RWB 500(11 , 12000 rpm,离心30s。 离心后丢弃滤液。
  • 重复步骤12o
  • 将RNA过滤旋转柱重新放在收集管中,12000 rpm,离心2 min。
  • 离心后将RNA过滤旋转柱转移至新的无核酶EP管中。
  • 将50〜200 的无核酶水或者DEPC水加入到RNA过滤旋转柱膜

中部,室温条件下静置5min,之后12000 rpm,离心2 min。

  • 12000 rpm,离心2 min,确保洗脱全部RNA。
  • 可选择重复步骤16,以此增加RNA的数量。也可选择将之前的过滤 液重新过滤静置离心,以此增加RNA的浓度。
  1. 3. 6. 3 mRNA 逆转录 cDNA
  • 按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)
试剂 使用量 终浓度
5XPrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) 2 pil IX
Total RNA *  
RNase Free dH2O up to lOpil  

可根据具体需要调整反应体系大小。

(2)将反应体系混合液向同一方向缓慢混合均匀后,即可开始进行反转录 过程。过程包括:①反转录反应,温度为37°C,时间为15 min;②反转录 酶的失活,温度为85°C,时间为5s;③最后4°C保存。

  1. 6. 4实时定量PCR
(1)按下列表中成分在冰盒中配制PCR反应液。
试剂 使用量 使用量 终浓度
TBGreen Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) (2X) 10|il 25pil IX
PCR Forward Primer (10(iM) 0. 8|il 2 pil 0. 4|iM
PCR Reverse Primer (10 piM) 0. 8|il 2 pil 0. 4|iM
ROX Reference Dye or Dyell (50X ) 0. 4pil lpil IX
RT反应液(cDNA溶液) 2 pil 4pil  
dH2O (灭菌蒸憎水) 6|il 16|il  
Total 20pil 50pil  
PCR各引物序列:  
Detection index Forward primer   Reverse primer

 

(2)进行实时定量PCR反应。设备型号为StepOnePlus荧光定量PCR系 统。

PCR循环参数:①第一阶段:预变性反应,循环数为1次,温度为95°C, 时间为30s;②第二阶段:PCR反应,循环数为40次,温度为95°C,时间 为5s,之后温度为60°C,时间为30s,此为一个循环。重复40个循环。

  • 根据具体需要选择p-actin或GAPDH作为基因内参照,统计并分析循 环次数,采用2小ct法进行计算,对目的基因mRNA进行定量分析。
  1. 7透射电镜

在进行PRF治疗第42d取各组大鼠脊髓组织L4〜L6节段,进行透射 电镜样本制作并观察结果。

  1. 3. 7. 1透射电镜标本收集 使用浓度为4%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉 大鼠,之后将大鼠置于固定架上妥善固定,取仰卧位。沿腹部中线从下腹 部逐渐向头端切开,逐层分离,利用止血钳提起大鼠剑突,剥离横膈,将 胸骨右侧肋骨沿根部剪断。使用眼科银小心剥离心包,将输液针在心尖部 朝主动脉方向插入,当输液针尖端到达主动脉,固定输液针。打开输液器 开关,同时使用眼科剪将右心耳剪开。先用冷的PBS溶液300ml迅速进行 灌注,之后使用4%多聚甲酸200ml缓慢进行灌注。当大鼠出现肝脏和皮肤 变成白色,四肢剧烈抖动,则说明灌注有效。最后按照Western blot与PCR 样本提取同样的方法取出脊髓组织并低温保存。
  2. 3. 7. 2透射电镜样本制作
  • 修剪标本:低温下(0-4°C)利用手术刀片将大鼠L4〜L6脊髓组织修 剪为]mm*lmm*lmm 的立方体。
  • 前固定:将脊髓组织立方体置于3%戊二醛固定液中固定>2小时。
  • lmol/L磷酸缓冲液清洗,每次10〜15分钟,重复3次。
  • 后固定:1%餓酸中固定1〜2小时。
  • lmol/L磷酸缓冲液清洗,每次10〜15分钟,重复3次。
  • 逐级脱水:50%乙醇15分钟一70%乙醇过夜一90%乙醇15分钟一90%乙 醇:90%丙酮1比1混合液15分钟一90%丙酮15分钟一100%丙酮15分钟, 重复3次。
  • 浸透:将脱水完全的脊髓组织样本置于丙酮:包埋剂(1:1)混合剂 中浸透2小时以上,然后置于丙酮:包埋剂(1:3)混合剂中浸透1〜3小 时以上或过夜,最后置于全浸透纯包埋剂2小时或过夜。

(8) 包埋:纯包埋剂(环氧树脂618)包埋。

(9) 聚合反应:40°C15小时一48°C 12小时-60°C24小时。

(10) 包埋块经修整后制作半薄切片,用甲苯胺蓝染色,制作超薄切片, 饱和醋酸铀-醋酸铅双重染色,自然干燥。

(11) 透射电镜下观察组织超微结构,每张切片取10个视野,观察自噬小 体数量与线粒体形态。

  1. 4统计分析

采用SPSS16. 0统计软件对数据进行处理,正态分布计量资料以均数土 标准差(Mean土SD)表示,组间比较采用单因素方差分析,组内比较采用 重复测量设计资料的方差分析。P<0. 05为差异有统计学意义。

  1. 结果

3.1各组大鼠不同时点机械痛阈值改变

与Blank组比较,RTX处理后1 d RTX组(PHN组,Sham PRF组,

PRF治疗组)大鼠机械痛阈值开始降低,7 d时出现明显降低(PV0.05), 14 d时RTX组大鼠机械痛阈值降至最低并趋于稳定,见图1。与PHN组 比较,PRF治疗后1 d PRF治疗组大鼠机械痛阈值开始升高,之后各时点 机械痛阈值均明显高于PHN组(PV0.05)。见图、表3-1。

表3T PRF治疗前后各组大鼠不同时点机械痛阈值比较 x±s )

Table 3-1 Comparison of mechanical pain thresholds at different time points of rats in each group before and after PRF treatment (g, x± s)

组别/时点 Blank v-c PHN Sham PRF PRF治疗组
造模前2 h 48. 79±3. 28 47. 60 + 3. 53 47. 24±4. 10 45. 35 + 2. 49 45. 65±2. 92
1 d 47. 15±3. 13 45. 71 + 2. 70 44. 86+1.68 45. 64±2. 51 45. 70±2. 52
4 d 46. 30±2. 52 44. 58 ±4. 34 39.48 + 2. 15 37. 48 ±2. 22 36. 80±2. 92
7 d 46. 85±3. 51 45. 34 + 3. 56 33.20 + 2.41 34. 68 + 2. 76 29.83 + 4.93
10 d 45. 66±3. 45 43. 69+1. 19 24. 44+1. 17 24.41 + 2. 36 23. 04±2. 61
14 d 46. 95±3. 70 46. 43 + 2. 34 19.91 + 1.59 22. 04+1. 54 20.89+1.28
治疗后1 d 47. 43±3. 33 45. 31 + 3. 64 21. 25±1. 51 21.86±1.42 21. 14±1.44
4 d 45. 89±3. 47 43. 69 + 2. 52 19. 16 + 0.95 19. 28 + 2. 10 26. 78 + 2. 51
7 d 44. 75±1. 69 43. 06 + 3. 97 19. 53±1. 11 18. 55+1. 26 28.84 + 3.85
10 d 44. 50±3. 68 44. 86 + 3. 84 17. 59±1.43 18. 03+1. 80 33. 65±2. 54
14 d 43. 79±3. 04 42. 90 + 5. 85 17.84+1.06 18. 31 + 1. 39 32. 39+1. 52
21 d 43. 45±2. 30 44. 23+1. 81 24. 14±1. 51 20. 09+1. 52 32. 44±2. 16
28 d 45. 39 + 3. 54 48. 75 + 3. 78 18. 31±1. 33 17. 84±1. 06 29.68 + 2. 52
35 d 46. 95±3. 70 46. 43 ±2. 34 20. 05 + 1. 61 24. 14±1. 51 32.41 + 1.91

图3T PRF治疗前后各组大鼠不同时点机械痛阈值比较x±s )

figure 3-1 Comparison of mechanical pain thresholds at different time points of rats in each group before
and after PRF treatment (g, x± s)

3.2各组大鼠不同时点热痛阈值改变

与Blank组比较,RTX处理后1 d RTX组(PHN组,Sham PRF组,

PRF治疗组)大鼠热痛阈值开始降低,之后出现明显升高(PV0.05), 7d 时RTX组大鼠机械痛阈值升至最高并趋于稳定,见图1。与PHN组比较, PRF治疗后1 d PRF治疗组大鼠热痛阈值开始降低,4〜7 d出现明显降低, 之后各时点机械痛阈值均明显低于PHN组(PV0.05)。见图、表3-2。

表3-2 PRF治疗前后各组大鼠不同时点热痛阈值比较(g, x±s )

Table 3-2 Comparison of thermal pain thresholds at different time points of rats in each group before
and after PRF treatment (g, x±s)

组别/时点 Blank v-c PHN Sham PRF PRF治疗组
造模前2h 6. 53 + 0. 12 6. 34 + 0.23 6. 36±0. 58 6. 37±0. 63 6. 35±0. 19
Id 6. 58 ±0. 52 6. 59±0. 34 11. 50±l. 08 10. 92±0. 41 11.69+1.25
4d 6. 31 + 0. 38 6. 63±0. 49 14. 15±1. 34 14. 51 + 0. 46 13. 71±1. 11
7d 6. 71±0. 43 6. 75±0. 23 20. 69±1. 77 20. 13+1. 54 20. 76+1. 05
10d 6. 96 + 0. 19 6. 74±0. 40 20. 17±2. 03 19. 69 + 0. 84 20. 28+1.06
14d 6. 66 + 0. 39 6. 74±0. 50 20. 10±l. 75 20. 36+1. 67 20. 73±1. 69
治疗后Id 6. 33 + 0. 24 6. 36 + 0. 44 20.21 + 0. 89 19. 53+1. 11 20.42+1. 36
4d 6. 18 + 0. 49 6. 06±0. 51 20. 24±1. 06 20.83+1. 30 18. 72±0. 98
7d 6. 08 + 0. 24 6. 32±0. 37 21.04 + 2. 09 19. 55+1. 10 14. 04±l. 32
lOd 6. 22±0. 46 6. 25±0. 28 19. 79±1. 28 19. 82±1. 33 12. 75 + 0. 53
14d 6. 23 + 0. 50 6. 67±0. 64 20. 42 ±2. 04 20. 96+1. 73 11.35 + 0.80
21d 6. 54 + 0. 37 6. 84±0. 21 21. 27±1. 60 20. 19 + 0. 86 11. 37±0. 22
28d 6. 25 + 0. 70 6. 44±0. 26 19. 75±0. 94 20. 05+1. 01 11. 50±l. 08
35d 6. 74±0. 34 6. 54±0. 49 20. 44±1. 59 20. 70±0. 74 11.69+1.25

Time(days)

图3-2 PRF治疗前后各组大鼠不同时点热痛阈值比较(g, x±s )

figure 3-2 Comparison of thermal pain thresholds at different time points of rats in each group before
and after PRF treatment (g, x±s)

  1. 3 Western blot 检测蛋白 Lc3 II /Lc3 I、Beeline-1 和 P62 表达水平改变

与Blank组比较,PHN组大鼠脊髓背角组织中Lc3II/Lc3 I比值增加, Beeline-1表达增加,SQSTM1/P62表达降低(PV0.05),与V-C组无明 显差异;与PHN组比较,PRF治疗组大鼠脊髓背角组织中Lc3II/Lc3I比 值降低,Beeline-1表达降低,P62表达增加(PV0.05),与Sham PRF 无明显差异。见图、表3-3。

表3-3 各组大鼠脊髓组织中Becline-1 > P62和Lc3ll/Lc3 I比值相对表达水平比较(g, x±s )

组别/蛋白 Blank v-c PHN Sham PRF PRF治疗组
Beeline-1 0. 76 + 0. 74 0. 65±0. 08 l. 03±0. 10 l. 06±0. 09 0. 87±0. II
P62 0.81 + 0. 76 0. 80 + 0. 06 0. 49 ±0. 03 0. 4l±0. 03 0. 65±0. 06
Lc3 II /Lc3 I 0. 89 + 0.87 0.91 + 0. 02 l. 07±0. 07 l. 08±0. 07 0. 90±0. 06

Table 3-3 Comparison of relative expression levels of Becline-1, P62 and Lc3II/Lc3I in spinal cord tissue of each group (g, x± s)

图3-3 各组大鼠脊髓组织中Becline-1 > P62和Lc3 11 /Lc3 I比值相对表达水平比较(g, x±s )

Figure3- 3 Comparison of relative expression levels of Becline-1, P62 and Lc3II/Lc3I in spinal cord

tissue of each group (g, x± s)

  1. 4 RT-qPCR检测mRNA Lc3和Becline-1表达水平改变

与Blank组比较,PHN组大鼠脊髓背角组织中mRNA Lc3表达增加,

mRNA Becline-1 表达增加(PV0.05),与 Sham PRF组无明显差异(P>0.05);
与PHN组比较,PRF治疗组大鼠脊髓背角组织中mRNA Lc3表达降低, mRNABecline-1表达降低,与Sham PRF组无明显差异。见图、表3・4。

表3-4 各组大鼠脊髓组织中mRNA Becline-1 > mRNA Lc3相对表达水平比较 x±s )

Table 3-4 Comparison of relative expression levels of mRNA Becline-1 and Lc3 in spinal cord tissue of
each group (g, x±s)

图3-4 各组大鼠脊髓组织中mRNA Becline-1 > mRNALc3相对表达水平比较(g, x±s )

Figure 3-4 Comparison of relative expression levels of mRNA Becline-1 and Lc3 in spinal cord tissue of
each group (g, x±s)

3.5透射电镜观察线粒体形态和自噬小体数量结果

Blank组大鼠脊髓组织细胞结构完整,未见明显自噬小体,线粒体结构 良好,未见线粒体肿胀、空泡变性和极消失等现象;与Blank组比较,PHN 组大鼠脊髓组织中出现较多完整自噬小体双膜结构,线粒体肿胀、空泡变 性和极消失等现象明显,少数出现与溶酶体融合;与PHN组比较,PRF治 疗组大鼠脊髓组织中少见自噬小体双模结构,线粒体偶见轻微肿胀和空泡 变性,未见极消失和与溶酶体融合。见图3-5。

注:A为Blank组,箭头示线粒体;E为V-C组,箭头示线粒体;C为PHN组,箭头示自噬小体;

D为Sham PRF组,箭头示自噬小体;E为PRF治疗组,箭头示线粒体。

图3-5各组大鼠脊髓电镜超显微结构变化

Figure 3-5 ultrastructural changes of spinal cord electron microscopy in each group

  1. 讨论

作为典型的人类慢性神经性疼痛,带状疱疹后神经痛(PHN)是急性 带状疱疹感染最常见的后遗症。临床上PHN患者的特征在于自发或诱发类 型的疼痛综合征(例如锐痛,刺痛和灼痛),以及各种异常感觉症状(例如 痛觉过敏,异常性疼痛和感觉丧失)的出现。此外,PHN患者通常并存严 重和长期的心理生理问题,包括睡眠障碍,厌食和抑郁。因此,这种慢性 神经性疼痛对患者的功能和生活质量具有深远的影响。更重要的是,该病 对当前的医学治疗具有抵抗性,特别是在发展中国家。尽管其具有公认的 病因,但是PHN表现出具有明显个体差异的感觉体征和症状。具体存在以 下几种PHN患者亚型,包括:(1)患有急性伤害性感受器刺激患者出现机 械性异常性疼痛的刺激诱发症状,部分患者并存热痛觉过敏;(2)患有自 发性疼痛和部分感觉缺陷的传入神经病变患者;(3)出现机械性异常性疼 痛和感觉缺陷的中枢重组患者。尽管存在多种病因机制,但PHN的核心病 理机制是传入传递系统中可能的病变,这可能导致躯体感觉迟钝,部分或 完全丧失。此外,PHN与各种心理生理障碍密切相关。例如,PHN患者在 急性带状疱疹阶段表现出比没有发生PHN的带状疱疹患者更明显的焦虑, 抑郁,病态心理和更低的生活满意度。这一观察结果强烈暗示了心理因素 对PHN发展的影响。同时,由于长期心理压力的影响,慢性疼痛患者常表 现为下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能障碍。由于多种因素决定了 PHN 的严重程度,慢性疼痛的管理需要采用综合方法。基于对促成因素的评估, 通过以合理的,患者为中心的方式提供药理学和非药理学的多种疗法,可 以最佳地实现疼痛缓解。该策略不仅应评估和治疗原发性病理损伤,还应 识别和消除可能导致PHN综合征的心理生理因素。

维持带状疱疹后神经痛慢性疼痛的重要机制之一即为中枢敏化翻,其 机制为通过增强中枢神经系统伤害性感觉神经元细胞膜的兴奋性,提高神 经突触之间的传递功能,降低抑制性神经元的兴奋性,如GABA能中间神 经元,调节相关神经元可塑性改变等。PHN维持慢性疼痛的重要原因之一 就是脊髓中枢与脊髓上中枢的敏感化程度增大,但其形成与维持的机制复 杂,至今未明。伤害性感受神经元敏化是脊髓中枢神经系统敏化的根本原 因。存在于脊髓背角的伤害性感受传导通路与外界损伤信息相互联系,从 而初步汇总外界伤害性信息说。在脊髓背角的表面分布着A5和C神经纤维, 并伴有伤害性感受神经元,外界神经损伤引发疼痛刺激,当脊髓中枢神经 系统接收到疼痛刺激信号,神经细胞被伤害性感受信号激活从而引发内级 联反应,同时使得若干伤害性感受信息传导通路激活,并将伤害性信号传 递到细胞核,增加核内环磷酸腺昔(cAMP)和细胞外蛋白调节激酶(ERK) 活性,进而增加肿瘤坏死因子(TNFf)、白介素卩(IL-B)、诱导型一氧化 氮合酶GNOS)以及环氧化酶-2 (C0X-2)等细胞因子的产生和释放,细 胞因子调节功能紊乱,增加脊髓中枢神经系统敏感化趋势如。不仅如此, 细胞外因子也可参与伤害性感受神经元的功能调节。当脊髓背角A5纤维和 C纤维的疼痛感受器受到外界较强伤害性刺激并激活,可大量产生多种细 胞因子,如P物质、三磷酸腺昔(ATP)、降钙素(calcitonin谷氨酸等, 这些细胞因子可作用与伤害性感受神经元的NMDA受体,激活神经细胞内 的CQ+依赖信号传导通路,从而增加伤害性感受神经元的兴奋性阴。另外, 外周神经损伤可使分布于脊髓背角的GABA能中间神经元出现数量减少, 而作为抑制性神经元,其释放的GABA或甘氨酸等神经递质以及其作用受 体相应减少,导致GABA-谷氨酸盐-谷氨酰胺循环平衡紊乱,神经细胞膜 K+电流调节功能失调,无法维持正常静息电位,从而增加伤害性感受神经 元的兴奋性型鳥综上可知,GABA与伤害性神经元疼痛敏化之间关系十分 密切。GABA去抑制机制主要包括功能性和结构性。造成脊髓背角兴奋-抑 制失衡的主要原因是中间能释放GABA递质减少,而通过补充外源性拟 GABA物质(加巴喷丁)可有效改善PHN临床症状抄,所以,GABA递质 数量的变化是脊髓功能性去抑制的原因之一。但研究发现,GABA能中间 神经元的退行性改变可能是造成GABA释放减少的主要因素皿。尽管目前 有学者对此持不同观点,可能与其选择不同的动物模型有关网。此外,通 过GABA能中间神经元鞘内移植产生良好的镇痛,也说明GABA能中间神 经元数量减少是PHN疼痛敏化的关键因素閃。因此,GABA能中间神经元 数量减少导致脊髓结构性去抑制在PHN脊髓伤害性神经元敏化过程中可能 发挥了至关重要的作用。

PRF在临床慢性疼痛治疗中取得了良好的治疗效果。临床随机对照

(Randomized controlled trials.RCTs)研究发现,在 PRF 治疗 PHN 后可有 效改善患者的症状,减少阿片类药物的使用童。对难治性PHN的老年患者 进行3次PRF治疗,有效率也可提高到55%[35]o在临床治疗时,将脉冲射 频针尖端靠近DRG或者神经干后进行射频治疗,前者的镇痛效果明显优于 后者閃,可视技术的发展进一步提高了 DRG解剖定位的准确性及治疗的安 全性昭。PRF作为治疗PHN的新颖、非毁损的疼痛介入治疗技术,目前其 具体作用机制尚未明确。另一项RCTs临床研究中,作者发现PRF可抑制 PHN 患者血清脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor.BDNF) 的释放J而BDNF可通过突触调控昭和磷酸化细胞外信号调节激酶

(extra-cellular signal-regulated kinase?ERK) I/II[40]等信号转导通路介导 疼痛发生。在其他疼痛动物模型的观察中,当PRF近距离刺激DRG或相邻 神经干后,脊髓背角浅层的突触传递⑷、生物活性细胞阴和c-fos[43]等表达 变化,抑制脊髓背角对兴奋性氨基酸递质释放崗,激活环核昔酸门控阳离子 通道(hyperpolarization activated cyclicnucleotide-gated cation channels?HCN) 亚型HCNT和HCN-2丽,通过调控ERK实现炎症因子水平降低阴,下调小 胶质细胞活性⑷。文献提示,PRF对大量含有Navi. 8的C类神经纤维显微 结构改变最大屈,在我们的研究中同样证实了 Navl・8的改变介导PRF对 疼痛的治疗作用丽,而C类神经纤维对伤害性疼痛信号向脊髓背角突触传 递与调节,促进神经病理性疼痛的脊髓中枢敏化m51o因此,PRF治疗神经 病理性疼痛可能与改善脊髓中枢敏化进程有关。尽管对PRF治疗PHN后 DRG和脊髓水平的病理生理改变缺少相应研究,但值得关注的是,PRF治 疗SNI模型后,在脊髓组织中检测到GABAB-R1表达上调悶,提示可能 GABA抑制性神经递质得以恢复。然而,PHN致病机制比SNL SNL及CCI 等神经病理性疼痛更为复杂,是由水痘-带状疱疹病毒(VZV)感染皮损恢 复后遗留下的神经病理性疼痛,与病毒潜伏导致神经损伤有关悶,尽管在 患者血液中不能检测到VZV,但其潜伏在脑脊液中的VZV仍可导致无皮疹 性PHN[54]o VZV激活和迁移免疫/炎症反应导致中枢或外周神经损伤閃, 受损神经表现为兴奋性阈值降低。大量的外周疼痛信号经DRG传入中枢, 诱导伤害性感受神经元疼痛易感性增加岚,促进脊髓中枢敏化与脊髓上中 枢敏化。

脊髓中枢是处理疼痛信号的关键部位,其敏化机制仍未明了。脊髓的 微环境与外部联系组成局部环路,共同参与伤害性信息的初级整合⑸打神 经元接受A5和C神经传入的疼痛刺激信号传入,刺激神经细胞内级联反应, 内部调控系统失衡阴。同时,A5和C神经纤维分布大量痛觉感受器,释放 出大量的谷氨酸、P物质、降钙素、ATP等,导致神经元细胞兴奋性增加化 此外,PHN脊髓背角GABA能神经元选择性丢失,导致GABA/甘氨酸递 质及作用于伤害性神经细胞表面的受体均减少,促进伤害性神经元兴奋性 增加化文献认为皿,GABA能中间神经元的退行性改变可能是造成GABA 释放减少与PHN脊髓疼痛敏化的关键因素。本课题组前期研究发现,PHN 模型脊髓神经元自噬程度增加,自噬水平与GABA能神经元数量呈负相关, 且PINKl/Parkin通路上游蛋白PINK1出现高表达,提示PINK1调控线粒 体自噬介导GABA能神经元退行性病变在PHN脊髓中枢敏化中可能起到了 关键作用。前文已提及,PRF作用于DRG后减少C类神经纤维对伤害性疼 痛信号传入、上调了 GABAB-R1,提示对GABA能神经元有良好的恢复作 用。

线粒体是真核生物细胞内重要的产能场所,具有调节细胞能量、新陈 代谢和细胞死亡等重要作用。线粒体具有自我调节功能,其过程称为线粒 体内稳态,可维持其自身功能和活性阴。其中线粒体自噬是线粒体维持其 自身稳态的重要途径之一昭。当线粒体出现损伤、衰老和失去功能等,细 胞将启动线粒体自噬机制,对其进行选择性清除。自噬这一生理过程普遍 存在于真核生物细胞内,其功能为将细胞可利用成分进行分解回收,同时 清除无用细胞成分,包括细胞质、蛋白和细胞器等。目前已知的自噬过程 主要分为3种,分别为巨自噬、微自噬以及分子伴侣介导的自噬嗣。其中 巨自噬是线粒体自噬的主要方式[65'66],通过双层膜结构包饶孤立细胞成分, 进而形成自噬体,后者与溶酶体结合,形成自噬■溶酶体,利用其内部存在 的溶酶体酶将细胞成分分解回收,以供给其他正常功能细胞所需原材料和 营养物质。当受损线粒体外膜表面泛素化蛋白不断增加,形成线粒体聚集 体丽,进而通过自噬-溶酶体的降解机制,使得受损线粒体选择性地得以清 除附。生理情况下,神经细胞通过线粒体自噬控制线粒体的质量,清除受 损的线粒体,进而发挥保护神经细胞的作用間。然而,过度的线粒体自噬 将导致细胞线粒体缺陷,影响细胞的正常功能,甚至引起细胞的程序性死 亡[70, 71]

树脂毒素(ResinifbtoxiaRTX)是辣椒素(Capsaicin)的超能类似物日 2]o有研究表明[73'74], RTX处理成年大鼠将出现与PHN临床表现极为相似 的症状(热痛阈升高,机械痛阈降低),是研究PHN的一种较为理想的动 物模型。在本实验中,参照文献加,采用腹腔注射RTX 0. 2ug/g的方法制 备PHN模型。结果显示,与Blank组大鼠比较,PHN组、Sham PRF组 和PRF组大鼠在RTX腹腔注射处理后第3d、7d和10d均出现PWMT明 显降低和TML延长;同时,Western blotting和RT-qPCR结果显示,与B1 ank组比较,PHN组大鼠脊髓背角组织中pLc3 II/Lc3 I比值、pBecline-l> mRNA Lc3和mRNA Beeline-1表达增加,pSQSTMl/P62表达降低,提示 PHN大鼠模型复制成功。

自噬可通过与溶酶体融合清除受损蛋白质和线粒体,促进细胞组分再 利用和能量保存W 水溶性LC3I经脂化形成LC3 II,聚集于自噬体膜, 从而参与自噬-溶酶体的形成皿。LC3II/LC3 I反映了自噬-溶酶体形成程 度。Becline-1通过活化后参与自噬体膜形成,从而调节姿势水平研究 表明,细胞内SQTAM1/P62的表达与自噬流相关,可反映细胞内自噬活性 [79]

o

疼痛行为学结果显示,在经过PRF治疗后,PRF组大鼠PWMT和TML 均出现明显逆转,而PHN组和Sham PRF组则无明显改变,提示PRF后处 理对PHN模型大鼠发挥镇痛作用。同时,与PHN组比较,PRF组大鼠脊 髓背角 组织中 pLc3 II /Lc3 I 比值、pBecline-1 > mRNA Lc3 和 mRNA

Beeline-1表达降低,pSQSTMl/P62表达增加,自噬小体数目减少,线粒 体肿胀、空泡变性等现象改善,线粒体数目增多,提示PRF后处理可抑制 PHN模型大鼠脊髓背角组织细胞自噬活性,同时对线粒体损伤具有改善作 用。在本研究中,PRF治疗后PHN模型大鼠脊髓背角组织细胞自噬活性改 变与大鼠疼痛行为学改变恰呈相反趋势,同时伴有线粒体数目和形态改变, 由此可以认为,PRF可能通过调控脊髓背角组织细胞线粒体自噬活性,改 善线粒体损伤,从而参与对PHN模型大鼠的镇痛作用机制。

  1. 结论
  • 大鼠腹腔注射树脂毒素(RTX)可以产生类似与临床带状疱疹后神 经痛(PHN)类似的疼痛行为学表现,即机械痛阈降低、热痛阈反而升高。
  • 脉冲射频(PRF)可能通过抑制脊髓背角组织线粒体自噬活性,改 善线粒体功能,从而对PHN模型大鼠产生良好的镇痛作用。
  1. 参考文献
  • Kim HJ, Ahn HS, Lee J乂 et al. Effects of applying nerve blocks to prevent post

herpetic neuralgia in patients with acute herpes zoster: a systematic review and m eta-analysis. Korean J Pain 2017;30:3-17.

  • Darsow U, Lorenz J, Bromm B, et al.Pruritus circumscriptus sine materia: a seque

1 of postzosteric neuralgia.Evaluation by quantitative psychophysical examinational! d laser-evoked potentials. Acta Derm Venereol, 1996,76(1):45-47.

  • Dworkin RH, Gnann JW, Oaklander AL,et al. Diagnosis and assessment of pain as

sociated with herpes zoster and postherpetic neuralgia. J Pain, 2008, 9(1 Suppl 1): 37-44.

  • Jung BF, Johnson RW Griffin DR,et al. Risk factors for postherpetic neuralgia in patients with herpes zoste匚Neurology, 2004, 62(9): 1545-1551.
  • Alicino C,Trucchi C,Paganino C,et al.Incidence of herpes zoster and postherptic ne

uralgia in Italy:Results from a 3-years population-based study [J] .Hum Vaccin Imm unother?2017?13(2):399-404.

  • Kilgore PE, Kruszon-Moran D, Seward JF, et al. Varicella in Americansfrom NHA NES III: implications for control through routine immunization. J Med Virol. 200 3;70(l):lll-118.
  • Harpaz R, Ortega-Sanchez IR, Seward JF; Advisory Committee on Immunization P ractices (ACIP) Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Prevention of herpes zoster: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Pract ices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 2008;57(5):l-30.
  • Gharibo C, Kim C. Neuropathic pain of postherpetic neuralgia. Pain Med News. 2 011;9:84-92.
  • Klompas M, Kulldorff M, Vilk Y, Bialek SR, Harpaz R. Herpes zoster and posthe rpetic neuralgia surveillance using structured electronic data.Mayo Clin Proc. 2011; 86(12):1146-1153.
  • Fashner J, Bell AL. Herpes zoster and postherpetic neuralgia: prevention and man agement. Am Fam Physician. 2011;83(12): 1432-1437.
  • Nagasako EM, Johnson RW, Griffii DR, Dworkin RH. Rash severity in herpes zo ster: correlates and relationship to postherpetic neuralgia.J Am Acad Dermatol. 20 02;46(6):834-839.
  • Forbes HJ, Thomas SL, Smeeth L, Clayton T, Farmer R, Bhaskaran K,Langan S M. A systematic review and meta-analysis of risk factors for postherpetic neuralgi a. Pain. 2016;157(l):30-54.
  • Nagel MA, Gilden D. Complications of varicella zoster virus reactivation. Curr Tr eat Options Neurol. 2013; 15(4):439-453.
  • 张爱民,蒋宗滨,周增华,陈云婷,陈婷婷,潘剑.带状疱疹后神经痛模型小鼠脊髓的自噬 变化[J].中国康复医学杂志,2018,33⑶:286・
  • Kaiz J,McDenmott MP,Cooper EM,et al.Psychosocial risk factors for postherpetic neuralgia:a prospective study of patients with herpes zoster.J Pain,2005,6(12):782-9 0.
  • Jones J. Postherpetic neuralgia[J] .Journal of pain & palliative care pharmacotherap y. 2015,29(2):180-181.
  • Taguchi T, Igarashi A, Watt S, Parsons B, Sadosky A, Nozawa K, et al. Effectiv eness of pregabalin for the treatment of chronic low back pain with accompanyin g lower limb pain (neuropathic component): a non-interventional study in Japan[J]. Journal of pain research. 2015,8:487-497.
  • De Boer PT, Pouwels KB, Cox JM, Hak E, Wilschut JC, Postma MJ. Cost-effect iveness of vaccination of the elderly against herpes zoster in The Netherlands [J]. Vaccine. 2013,31(9):1276-1283.
  • Mullane KM, Winston DJ, Wertheim MS, Betts RF, Poretz DM, Camacho LH, P ergam SA, Mullane MR, Stek JE, Sterling TM, Zhao Y Manoff SB, Annunziato PW. Safety and immunogenicity of heat-treated zoster vaccine (ZVHT) in immuno compromised adults [J]. The Journal of infectious diseases. 2013,208(9):1375-1385.
  • Jeon YH. Herpes Zoster and Postherpetic Neuralgia: Practical Consideration for P revention and Treatment[J]. The Korean Journal of Pain. 2015,28(3):177-184.
  • 李燕尧,张爱民,蒋宗滨,等.脉冲射频对保留性神经损伤大鼠8 mRNA表达的 影响[J]冲国疼痛医学杂志,2015,21(12):903-907.
  • 徐静,鲁玉刚,俞卫锋.慢性坐骨神经结扎大鼠前扣带皮层对脊髓痛觉信息传递的调 节[J].临床麻醉学杂志,2016, 4(32): 393-397.
  • Nakamoto K,Nishinaka T,Sato N,et al. Hypothalamic GPR40 Signaling Activated by Free Long Chain Fatty Acids Suppresses CFA-Induced Inflammatory Chronic Pain.PLoS One. 2013; 8(12):1256-1263.
  • 吕时甲,窦智,蒋宗滨,等.脉冲射频对坐骨神经分支损伤模型大鼠机械痛阈的影响 [J] 实用疼痛学杂志,2014, 10(5): 329-333.
  • Schlereth T,Heiland A,Breimhorst M,et al. Association between pain,central sensitization and anxiety in postherpetic neuralgia. [J]・European Journal of Pain,2014,19(2): 193 ・
  • Wu SX, Wang W, Li H, Wang YY,Feng YP, Li YQ. The synaptic connectivity that underlies the noxious transmission and modulation within the superficial dorsal horn of the spinal cord [J]. Progress in neurobiology. 2010,91(1):38-54.
  • 张志谦,赵宝明,耿学斯.痛觉敏化的分子生物学研究进展[J].上海医学. 2012(10):914-917.
  • Basbaum Al, Bautista DM, Scherrer G, Julius D. Cellular and molecular mechanisms of pain[J]. Cell. 2009,139(2):267-284.
  • Moore KA, Kohno T, Karchewski LA, Scholz J, Baba H, Woolf CJ. Partial peripheral nerve injury promotes a selective loss of GABAergic inhibition in the superficial dorsal horn of the spinal cord[J]. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2002,22(15):6724-6731.
  • 何睿林,蒋宗滨,阳旭峰,冯梅,黄剑锋,冼海燕.加巴喷丁、卡马西平治疗带状疱 疹后神经痛的临床观察[J].临床麻醉学杂志.2007(10):870-871.
  • Wang X, Zhang J, Eberhart D, Urban R, Meda K, Solorzano C, Yamanaka H, Rice D, Basbaum Al. Excitatory superficial dorsal horn interneurons are functionally heterogeneous and required for the full behavioral expression of pain and itch [J]. Neuron. 2013,78(2):312-324.
  • Braz JM, ShariSNaeini R, Vogt D?Kriegstein A, Alvarez-Buylla A, Rubenstein JL, Basbaum Al. Forebrain GABAergic neuron precursors integrate into adult spinal cord and reduce injury-induced neuropathic pain[J]. Neuron. 2012,74(4):663-675.
  • Jergova S, Hentali ID, Gajavelli S, Varghese MS, Sagen J. Intraspinal transplantation of GABAergic neural progenitors attenuates neuropathic pain in rats: a pharmacologic and neurophysiological evaluation [J]. Experimental neurology. 2012,234(1):39-49.
  • Pi Z B, Lin H, He G D, et al. Randomized and controlled prospective trials of Ultrasound-guided spinal nerve posterior ramus pulsed radiofrequency treatment for lower back post-herpetic neuralgia.[J]. La Clinica Terapeutica, 2015,166(5):301-305.
  • Kim Y H, Lee C J, Lee S C, et al. Effect of pulsed radiofrequency for postherpetic neuralgia[J]. Acta Anaesthesiologica Scandinavica, 2008, 52(8):1140-1143.
  • 张广建,刘恒,李仁淑,等.背根神经节脉冲射频与神经干脉冲射频治疗带状疱疹后 神经痛效果的比较[J].中华麻醉学杂志,2014⑶:383-384.
  • 邱鹏程,潘略韬,刘剑芬,等.B超引导下脊神经根脉冲射频治疗颈部及上肢带状疱 疹神经痛[J].实用医学杂志,2016, 32(12):1999-2001.
  • Saxena A K, Lakshman K, Sharma T, et al. Modulation of serum BDNF levels in postherpetic neuralgia following pulsed radiofrequency of intercostal nerve and pregabalin.[J]. Pain Management, 2016, 6(3):217.
  • Zaki Y Weerawardane T, Hauth S, et al. Persistent inflammation-induced up-regulation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) promotes synaptic delivery of:amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor GluAl subunits in descending pain modulatory circuits.[J]. The Journal of biological chemistry, 2014,289(32):22196.
  • 王丽娜,杨建平,许期年,等.脑源性神经营养因子在大鼠炎性痛中的作用[J].中华 麻醉学杂志,2010, 30(6):712-714.
  • Cahana A, Vutskits L, Muller D. Acute differential modulation of synaptic transmission and cell survival during exposure to pulsed and continuous radiofrequency energy.[J]. Journal ofPain, 2003, 4(4):197-202.
  • Van Z J, de Louw A J, Joosten E A, et al. Pulsed and continuous radiofrequency current adjacent to the cervical dorsal root ganglion of the rat induces late cellular activity in the dorsal horn.[J]. Anesthesiology, 2005, 102(1):125.
  • Protasoni M, Reguzzoni M, Sangiorgi S, et al. Pulsed radiofrequency effects on the lumbar ganglion of the rat dorsal root: a morphological light and transmission electron microscopy study at acute stage [J]. European Spine Journal, 2009, 18(4):473-478.
  • Yang C H, Chen K H, Huang H W, et al. Pulsed radiofrequency treatment attenuates increases in spinal excitatory amino acid release in rats with adjuvant-induced mechanical allodynia.[J]. Neuroreport, 2013, 24(8):431-436.
  • 刘益鸣,张挺杰,冯艺.脉冲射频对CCI大鼠背根神经节HCN通道的影响[J]. 中国疼痛医学杂志,2013, 19(6):323-329.
  • Crown E D. The role of mitogen activated protein kinase signaling in microglia and neurons in the initiation and maintenance of chronic pain.[J]. Experimental Neurology, 2012, 234(2):330-339.
  • Cho H K, Cho Y W, Kim E H, et al. Changes in pain behavior and glial activation in the spinal dorsal horn after pulsed radiofrequency current administration to the dorsal root ganglion in a rat model of lumbar disc herniation: laboratory investigation. [J] .Journal of Neurosurgery Spine, 2013, 19(2):256-263.
  • Erdine S, Bilir A, Cosman E R, et al. Ultrastructural changes in axons following exposure to pulsed radiofrequency fields.[J]. Pain Practice, 2009, 9(6):407.
  • 李燕尧,张爱民,蒋宗滨,等.脉冲射频对保留性神经损伤大鼠8mRNA表达 的影响[J].中国疼痛医学杂志,2015, 21(12):903-907.
  • Liu X G, Zhou L J. Long-term potentiation at spinal C-fiber synapses: a target for

pathological pain.[J]. Current Pharmaceutical Design, 2014, 21(7):895-905.

  • Matson D J, Hamamoto D T, Bregman H, et al. Inhibition of Inactive States of Tetrodotoxin-Sensitive Sodium Channels Reduces Spontaneous Firing of C-Fiber Nociceptors and Produces Analgesia in Formalin and Complete Freund's Adjuvant Models ofPain[J]. Pios One, 2015, 10(9):138-140.
  • Vallejo R, Tilley D M, Williams J, et al. Pulsed radiofrequency modulates pain regulatory gene expression along the nociceptive pathway. [J]. Pain Physician, 2013, 16(16):601-613.
  • Forbes H J, Thomas S L, Smeeth L, et al. A systematic review and meta-analysis of risk factors for postherpetic neuralgia[J]. Pain, 2016, 157(1):30.
  • Nagel M A, Gilden D. Complications of Varicella Zoster Virus Reactivation [J]. Current Treatment Options in Neurology, 2013, 15(4):439-453.
  • Woolf C J, Mannion R J. Neuropathic pain: aetiology, symptoms, mechanisms, and management.[J]. Lancet, 1999, 353(9168):1959-1964.
  • Vadini F. Postherpetic neuralgia[J]. Lancet, 1987, 2(8562):1352-1354.
  • Wu S X, Wang W, Li H, et al. The synaptic connectivity that underlies the noxious transmission and modulation within the superficial dorsal horn of the spinal cord.[J]. Progress in Neurobiology, 2010, 91(1):38-54.
  • 张志谦,赵宝明,耿学斯.痛觉敏化的分子生物学研究进展[J].上海医学, 2012,35(10):900-903.
  • Basbaum A I, Bautista D M, Scherrer G, et al. Cellular and Molecular Mechanisms of Pain[J]. Cell, 2009, 139(2):267.
  • Moore K A, Kohno T, Karchewski L A, et al. Partial peripheral nerve injury promotes a selective loss of GABAergic inhibition in the superficial dorsal horn of the spinal cord.[J]. Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience, 2002, 22(15):6724.
  • Wang X. Excitatory superficial dorsal horn interneurons are functionally heterogeneous and required for the full behavioral expression of pain and itch. [J]. 2013,78(2):312-324.
  • Groenewoud MJ,Zwartkruis FJ.Rheb and mammalian target ofrapamycin inmitochondrialhomoeostasis [J].Open Biol,2013,3( 12): 130-185.
  • Zhu J, Wang KZ, Chu CT.After the banquet: mitochondrial biogenesis, mitophagy and cell survival [J].Autophagy,2013,9( 11): 1663-1676.
  • Mrschtik M,Ryan KM.Lysosomal proteins in cell death and autophagy FEBS J[J].2015,282( 10):1858-1870.
  • Springer MZ,Macleod KF.In brief: Mitophagy: mechanisms and role in human disease[J].J Pathol,2016,240 ( 3 ) :253-255.
  • Campos JC,Bozi LH, Bechara LR, Lima VM, Ferreira JC. Mitochondrial quality control in cardiac diseases[J].Front Physiol,2016,7: 479.
  • Vives Bauza C, Zhou C, Huang Y, et al. PINK 1 -dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010:107.
  • Wild P, Dikic I. Mitochondria get a Parkin1ticket[J]. Nature cell biology, 2010:12.
  • Li MX, Mu DZ. Mitophagy and nervous system disease[J]. Chinese journal of contemporary pediatrics, 2017(19):724-729.
  • Galluzzi L, Vitale I, Abrams JM, et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012[J]. Cell death and differentiation, 2012(19):107-120.
  • Shi R, Weng J, Zhao L, et al. Excessive autophagy contributes to neuron death in cerebral ischemia[J]. CNS neuroscience & therapeutics, 2012(18):250-260.
  • Hsieh YL, Chiang H, Lue JH, et al. P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy [J]. Experimental neurology, 2012(235):316-325.
  • Chen SR, Pan HL. Effect of systemic and intrathecal gabapentin on allodynia in a new rat model of postherpetic neuralgia[J]. Brain research, 2005(1042):108-113.
  • Pan HL, Khan GM, Alloway KD, et al. Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action[J]. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, 2003(23):2911-2919.
  • Lei XSun YLu C,et al. Activated glia increased the level of proinflammatory cytokines in a resiniferatoxin-induced neuropathic pain rat model [ J] .Reg Anesth Pain Med,2016,41(6):744-749.
  • Wei H,Wang C,Croce CM,et al.P62/SQSTMl synergizes with autophagy for tumor growth in vivo [J].Genes Dev,2014,28(l 1):1204-1216.
  • The role of the Atgl, ULK1 complex in autophagy regulation[J]・curr Opin ceu Biol,2010,22(2): 132-139.
  • Tassa A,Roux MP,Attaix D,et al.Class III phosphoinositide 3-kinase-Beclinl complex mediates the amino acid一dependent regulation of autophagy in C2C12 myotubes[J].Biochem J,2003,376(3):577-586.
  • 赵远波,洪杜北琦,陈英玉.基于P62/SQSTMl-luciferase的细胞自噬水平检测方法建 立及鉴定[J]冲国生物工程杂志,2016,36(1):55-62.

第二部分PINK1 /Parkin通路在脉冲射频脊髓治疗对带状
疱疹后神经痛模型大鼠中的作用

1.引言

为更深入了解PHN的神经元退行性病变机制,我们开展了相关的研 究。结果显示:PHN模型脊髓神经元自噬程度增加,自噬程度与GABA 能神经元数量负相关,PINKl/Parkin通路中PINK1出现高表达。线粒体 自噬(mitophagy)是选择性自噬的一种,主要参与受损细胞器的清除⑴。 线粒体自噬功能紊乱可能会导致许多系统功能紊乱,如肿瘤化 心血管⑷与 肌肉⑷等相关疾病。PINKl/Parkin作为主要的信号转导通路,参与细胞调 控线粒体自噬。既往认为,Parkin在细胞线粒体自噬中扮演主要角色⑸。但 最新的研究发现,PINK1是线粒体损伤的标志,是帮助细胞清除功能失调 的线粒体的关键蛋白⑹。文献复习可知,PINKl/Parkin调控线粒体自噬活 性,在帕金森综合征等疾病中发挥了重要作用。因此,前期研究认为,PI NKl/Parkin通路调控线粒体自噬可能是PHN脊髓背角相关神经元退行性 病变的关键机制。综上所述,PINKl/Parkin调控线粒体自噬是导致脊髓背 角GABA能神经元及其递质受体减少的重要原因。

在第一部分研究中我们发现,PRF可通过抑制PHN模型大鼠脊髓自噬 的活性,促进受损线粒体结构和功能的恢复,从而发挥镇痛作用。但目前 已知介导线粒体自噬的通路很多,PRF是否通过PINKl/Parkin通路从而 调控PHN脊髓相关神经元线粒体自噬活性仍不清楚。据此,我们提出假设: PRF作用于PHN的DRG后,抑制脊髓PINKl/Parkin通路活性,降低 相关神经元线粒体自噬与凋亡程度,促进相关神经元数量和功能的恢复, 改善脊髓中枢敏化进程,从而发挥良好的镇痛效果。

2.方法

2. 1实验材料

2. 1. 1实验动物48只SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重200-220g,由 广西医科大学动物实验中心提供,合格证号:SCXK桂-2014-0002。实验 室(SPF 级)温度 22-25°C,湿度 40%-60%,周期光照 12h (8: 00-20: 00), 避免强光和噪咅的刺激,大鼠自由饮水和进食。本实验经广西医科大学动 物学伦理委员会批准。

2. 1. 2主要实验试剂

产品名称 生产厂家
树脂毒素,resiniferotoxin (货号:R8756) Sigma,美国
超敏ECL化学发光试剂盒(货号:P0018) 碧云天,中国
二抗稀释液(货号:P0023D) 碧云天,中国
一抗稀释液P0023A 碧云天,中国
SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(货号:P0012AC) 碧云天,中国
Tris三(疑甲基)氨基甲烷(货号:T8060) Solarbio,中国
10%SDS (货号:S1010) Solarbio,中国
驴 Anti-Rabbit IgG H&L (货号:abl75772) Abeam,英国
p-Actin (13E5) Rabbit mAb (货号:4970S) CST,美国
BCA蛋白浓度测定试剂盒 碧云天,中国
Glycine甘氨酸(货号:G8200) Solarbio,中国
20XTBS (货号:T1080) Solarbio,中国
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(货号:P0015) 碧云天,中国
柠檬酸盐缓冲液(货号:YZ-ZLI-9064) 中杉,中国
甲醇 科龙,中国
4%组织细胞固定液(货号:P1110) Solarbio,中国
Tween-80 Amresco, 美国
RIPA 裂解液(P0013B) 碧云天,中国
PMSF 碧云天,中国
蛋白酶抑制剂 碧云天,中国
水合氯醛 成都科隆,中国
无水乙醇 成都科隆,中国
MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (货号:9767) TaKaRa,日本
PrimeScript™ RT Master Mix 货号:RR036A) TaKaRa,日本
SYBR® Premix Ex Taq™ II (货号:RR036A) TaKaRa,日本
  1. 1. 3主要试验仪器
产品名称 生产厂家
冷热板痛觉测试仪 IITC,美国
电泳槽 Bio-Rad,美国
凝胶成像与图像采集系统 Bid-Rad,美国
电泳仪 Bio-Rad,美国
转膜槽 Bio-Rad,美国
-80°C超低温冰箱 三洋,日本
医用低温冰箱 美菱,中国
多功能酶标仪 TEC AN,瑞士
手术器械(剪刀、蹑子等) 上海金钟,中国
移液器 Eppendorf,德国
电子微量天平 Shimadzu,日本
多功能高速离心机 Eppendorf,德国
超纯水器(型号:UPH-1-20T) 成都超纯科技,中国
透射电子显微镜(型号:H7650 ) 日立,日本
ABI StepOne Plus实时荧光定量PCR仪 StepOneTM 美国
凝胶成像与图像采集系统 Bid-Rad,美国

2观察指标

观察各组大鼠机械痛阈值和热痛阈值改变;观察各组大鼠脊髓L4〜L6节 段中蛋白PINK1和Parkin表达情况。

  1. 3实验方法
  2. 3. 1实验动物分组

采用随机数字表法,将48只SD大鼠随机分为溶剂对照组(V-C组)、 模型对照组(PHN组)、假治疗组(Sham PRF组)和治疗组(PRF治疗组 组)4组,每组12只。

动物模型

溶剂对照组:按照RTX组相同体积腹腔注射由10%吐温80、10%乙醇和8 0%生理盐水组成的混合液;PHN组、Sham PRF组、PRF治疗组:参照参 考文献⑺,将RTX溶解于由10%吐温80、10%乙醇和80%生理盐水组成的混合 液中,浓度为40|ig/mh按照RTX 200|ig/kg腹腔注射;Sham PRF组:给予 RTX腹腔注射后,待大鼠机械缩足阈值(pain mechanical withdrawal thres hold?PMWT)稳定后进行PRF穿刺定位,但不实施PRF治疗;PRF治疗组: 给予RTX腹腔注射后,待大鼠PMWT稳定后进行PRF穿刺定位,并给予PRF 治疗;PHN组:给予RTX腹腔注射后不给予其他任何处理。

  1. 3.2机械痛阈测定

实验选择的电子测痛仪测量范围为:0~800go参照参考文献⑻,使用 电子测痛仪进行测定。将大鼠置于底部为金属网的透明玻璃箱内。测试前, 将大鼠置于测试环境中适应30min,待大鼠平静后开始测试。排除环境改变 对大鼠造成恐惧和躁动。刺激部位在各组实验大鼠中保持一致。将电子测 痛仪刺激探头尖端轻柔地垂直作用于大鼠后足足底,缓慢增加刺激力度, 大鼠出现缩足、舔足等反应后,记录电子测痛仪所显示的最大值。测试全 过程保持测试环境干燥、清洁。重复3次,每次间隔5min, 3次测定结果的 平均值作为PWMT值。机械痛阈值检测装置见图2-1 o

  1. 3.3脉冲射频(PRF)治疗

在进行RTX处理第14日测定PMWT和TWL后,对各组大鼠进行相 应PRF处理,以确保模型建立成功。参照参考文献⑷的方法,采用4%水 合氯醛(chloral hydrate) 10 ml/kg腹腔注射对大鼠进行麻醉。大鼠麻醉后 对其背部和腹部除毛,碘伏消毒后在腹部贴上电极片,确保电极片与大鼠 腹部和四肢皮肤接触良好。将大鼠妥善固定于固定架上,可取仰卧位。为 方便操作,可将含有温水的塑料输液瓶放在大鼠腹部下面,同时可延缓大 鼠体温降低。通过触及大鼠脊柱两侧骨性标志,确定脊柱L4〜L6节段。当 触及L6脊柱棘突,向上探及间隙即为L5-L6间隙,利用防水标记笔进行 体表标记。以L5~L6间隙为中点,沿大鼠脊柱纵轴方向切开,切口长度为 1〜2cm,之后逐层钝性分离覆盖于脊柱表面筋膜、肌肉等组织,找到骨性 标志关节突,即可在其后下方发现椎间孔。此时,将与PRF治疗仪连接好 的射频针缓慢插入到椎间孔内,深度大约为0. 5〜lcm。通过PRF治疗仪运 动测试功能,当大鼠出现后下肢以及尾部规律抽动,同时电阻在300〜400 Q之间,则可确定射频针尖端位于背根神经节内或其附近。妥善固定射频 针后即可开始治疗。PRF参数设置为治疗时间2分钟,治疗脉冲时长为20毫 秒,治疗温度为42摄氏度,治疗频率为2赫兹。之后再次进行运动功能测 试,运动功能正常即可对大鼠进行伤口缝合。Sham PRF组大鼠仅进行射频 针的穿刺定位,不进行脉冲射频治疗,射频针放置椎间孔时间为2分钟。 缝合方法与PRF治疗组相同。Blank组、V-C组和PHN组大给予任何PRF 处理。

  1. 3. 4标本收集

使用浓度为4%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠,将背部皮肤沿中线 剪开,暴露全部脊柱节段。在处死大鼠后,逐层分离脊柱表面及两侧的肌 肉,剪断两侧肋骨。取胸段至骼悄水平脊柱。找到头端椎管口后,利用注 射器将冷PBS液注入椎管内,利用液体压力将脊髓完整吹出。利用无菌手 术刀片取脊髓腰膨大部位,即L4〜L6节段脊髓组织,立刻放入液氮中2h 速冻,-80°C储存备用。提取蛋白前从-80°C冰箱中取出50mg脊髓组织放入 离心管中并解冻。

  1. 3. 5 Western blot

每组取5只大鼠,立即断头取新鲜脊髓组织,在冰上迅速分离并提取 L4〜L6节段脊髓组织,即放入液氮中2h速冻,-80°C储存备用。提取蛋白 前从-80°C冰箱中取出50mg脊髓组织放入离心管中并解冻,按下列步骤进 行处理。

所需溶液及试剂:

  • 配制10X电泳缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷(Tris) 30. 25g,甘氨 酸(Glycine) 187. 5g和十二烷基硫酸钠(SDS) 10g加入DDH2O滴定至 1000ml,常温保存。每次使用时,取适量10X电泳缓冲液按照比例加入 DDHQ,稀释为IX电泳缓冲液。
  • 配制IX转膜缓冲液:取三羟甲基氨基甲烷(Tris) 24・2g、甘氨酸 (Glycine) 115. 2g> 十二烷基硫酸钠(SDS) 4g 和甲醇(CHQH) 160 ml

加入DDH2O定容至lOOOmh 4°C密闭低温保存。

  • 配制丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺混合液(Acr-Bis):取丙烯酰胺(Acr) 29・2g、甲叉丙烯酰胺(Bis) 0. 加入DDHQ定容至100ml,制备成浓度 为40%的混合溶液。4°C密闭低温保存,保质期为3周。
  • 配制清洗溶液(Washing buffer):即TBST,取三轻甲基氨基甲烷(Tris) l・21g、NaCl 5. 84g 和 Tween-20 1ml 加入 DDHQ 定容至 1000mlo4°C密 闭低温保存,最好现配现用。
  • 配制封闭液:取实验用脱脂奶粉2g溶于TBST (IX)定容至40ml。 4°C密闭低温保存,可重复使用。
  • 配制显色缓冲液(AP substrate buffe):取三轻甲基氨基甲烷(Tris) 1. 21g、NaCl 5. 84g以及浓度为100mM的MgCl2lml加入DDH2O定容至 lOOmL 4°C密闭低温保存。
  • 抗体稀释:使用专用抗体稀释液对各抗体分别稀释。抗PINK1抗体 为 1:10000,抗 Parkin 抗体为 1:5000.

实验步骤:

  • 提取组织蛋白:将分离好的脊髓组织从-80°C冰箱中转移至冰盒中放 置,将冻存管中脊髓组织称重后转移至标已高压EP管中,做好标记。按照 每lmg脊髓组织加入4pil裂解液RIPA和25卩1蛋白酶抑制剂的比例加入裂 解液RIPA和蛋白制剂,置于冰上反应30分钟。
  • 使用电动匀浆器将反应完全的组织蛋白充分匀浆,持续5分钟,直至 EP管中无明显絮状物。
  • 将离心机提前降至4°C, 12000转/分钟,离心15分钟。
  • 利用移液枪取上清液置于新的EP管中,做好标记。
  • 对所有组织蛋白进行浓度配平。根据BCA试剂盒说明书(P0012,碧 云天)配制标准蛋白溶液,浓度为 5mg/mlo按照说明书方法在多孔板上 加样,经过37°C孵育后进行酶标仪蛋白浓度检测,通过计算制定标准曲线, 最后将各组样本制成等体积等浓度的标准样本。
  • 加入适当比例的4X上样缓冲液,使得EP管中上样缓冲液终浓度为 IX,然后置于沸水中煮沸5分钟。之后可放置于-20°C中保存。
  • 制胶:将制胶架平放于试验台上,取薄厚玻璃板各一块小心放置于制 胶架中,在置入凝胶之前先用DDH2O检测玻璃板之间是否泄漏。如无明显 泄漏,则可开始制备电泳凝胶。根据凝胶试剂盒说明配制合适浓度的分离 凝胶。用玻璃棒将分离凝胶沿同一方向缓慢搅动5〜10次,然后用lml移 液器缓慢加到玻璃板之间。当凝胶平面距离较短玻璃板l・5cni时即可。然 后用移液器沿较长玻璃板内壁缓慢注入双蒸水,直至超过较短玻璃板上缘。 室温放置35分钟。确认凝胶已经完全凝固,轻轻将凝胶表面水分倒出,使 用吸水滤纸将剩余水分吸净。此时即可开始配制浓缩胶,配好后用移液器 加到玻璃板之间,距离较短玻璃板上缘1〜2nmi即可。将制孔梳子缓慢垂直 置入玻璃板,室温放置30分钟或4摄氏度放置2小时。浓缩胶凝固后将凝 胶连同制胶玻璃板一起放入电泳槽中,沿槽壁缓慢加入事先配置好的电泳 液以没过制胶玻璃板为佳。垂直取下制孔梳子,并利用移液器将孔道内气 泡和碎胶冲出。

10% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE浓缩胶的配制(ml):

配制胶浓度/成分 10%分离胶 5%浓缩胶
DdH2O 4. 1ml 3. 5ml
30%Acr-Bis (29: 1) 3. 3ml 1. 0ml
分离胶缓冲液 2. 5ml  
浓缩胶缓冲液(4X)   1. 5ml

 

10%过硫酸鞍 0. 1ml 0. 06ml
TEMED 0. 004ml 0. 006ml
总体积(ml) 10ml 6ml

上样:使用10卩1移液枪头进行加样。两端孔道各加入2卩1 marker, 中间各孔道按照分组顺序加入等体积待测蛋白样本。上样量为50〜200遽 之间,根据浓度换算成上样体积,具体情况视结果调整.

  • 电泳:安装电泳槽,置于冰盒中,尽量用冰将电泳槽四周完全覆盖•连 接电源后,开始电泳•首先使用恒压80V进行电泳,直至将各孔道内待测样 本在分离胶与浓缩胶分离处压成一条直线当marker开始出现分离条带时, 将电压改为100〜120V,直至漠酚蓝到达近电泳槽底部。

(9)转膜:

  • 将玻璃板从电泳槽中取出置于装有转膜缓冲液瓷盘中,取下薄板,利用 裁胶片按照marker指定位置,裁成合适大小的凝胶条带。注意全程保持凝 胶条带湿润。
  • 预先将孔径为 22pim或0. 45pim PVDF膜裁剪成与凝胶条带大小相适 应,并在甲醇中浸泡30 s,再将其转移至转膜缓冲液浸泡15分钟,然后 把滤纸、凝胶一起放到转膜缓冲液中浸泡15分钟;
  • 按照三明治法依次将各物品平整置于转膜夹中,从转膜夹黑色面开始, 依次为海绵、三层厚滤纸,凝胶条带、PVDF膜(光面朝上)、三层厚滤纸、 海绵。使用玻璃棒将各层间气泡缓慢赶岀。安装转膜槽后,倒入适量转膜 缓冲液,根据待测蛋白分子量确定电流大小和转膜时间。
  • 封闭:取出PVDF膜,置于装有TBST缓冲液的玻璃皿中,摇床洗 膜3次,每次5分钟。然后将PVDF膜转移至装有5%脱脂奶粉封闭液中, 摇床室温封闭,时间为60〜120分钟。
  • 孵育抗体:将封闭好的PVDF膜取出,

取出已封闭的PVDF膜,置于装有TBST缓冲液的玻璃皿中,摇床洗膜3 次,每次5分钟。将PVDF膜轻甩三下,置于一抗孵育盒内,4°C孵育过夜

(10个小时左右)。一抗孵育结束后,取出PVDF膜,用TBST缓冲液摇床 清洗,时间为5min,重复3次。可将使用过的抗体回收重复利用。之后将 PVDF膜转移至二抗孵育暗盒中,室温摇床孵育60〜120分钟。内参条带 孵育方法与待测条带孵育方法相同,一抗为内参抗体。

  • 洗膜:取出PVDF膜,置于装有TBST缓冲液的玻璃皿中,摇床洗 膜3次,每次10分钟。
  • 条带显影:将PVDF膜至于保鲜膜上,取适量等体积的A液和B 液混合,混匀后加在膜的表面,移至凝胶成像分析仪中,曝光显影。
  • 灰度值分析:用Gel-Pro Analyzer软件对目的条带进行光密度值计 算。

3.结果

3.1各组大鼠不同时点机械痛阈值改变

与V-C组比较,RTX处理后1 d PHN组,Sham PRF组,PRF治疗组大 鼠机械痛阈开始降低,7 d时出现明显降低(PV0.05) , 14 d时机械痛阈 改变趋势趋于稳定,见图4。与PHN组比较,PRF治疗后1 d PRF治疗组大 鼠机械痛阈开始升高,之后各时点机械痛阈均明显高于PHN组GPV0.05), 见表、图3-1。

表3T RTX给药前后各组大鼠不同时点机械痛比较 x±s )

Table 3-1 Comparison of mechanical pain at different time points of rats in each group before and after RTX administration (g, x ± s)

组别/时点 v-c PHN Sham PRF PRF治疗组
造模前2 h 50. 94±2. 37 49.32 + 3.83 50. 78 + 1. 52 49.40 + 2. 52
1 d 50. 41±2. 33 44. 81±2. 30 47. 01±2. 98 46.21±1.87
4 d 49. 58±2. 78 41.25 + 4. 04 44. 31±2. 04 44. 11 + 1.98
7 d 50. 62±2. 05 31.84 + 2. 70 34. 99 ±2. 48 34. 22 + 3. 06
10 d 51. 20±2. 23 20. 60 + 2. 89 20. 47 ±4. 27 19. 23±3. 42
14 d 52. 46 + 2.09 18. 36 + 3. 04 17. 75 + 2. 89 15.62+1.91

* 線射鞠 ♦ 假紡组 *

注:与溶剂对照组(v-C组)比较,apvo. 05。

图3T RTX给药前后各组大鼠不同时点机械痛阈比较

Figure 3-1 Comparison of mechanical pain thresholds at different time points in rats

in each group before and after RTX administration

表3-2 PRF治疗前后各组大鼠不同时点机械痛比较(g, x±s )

Table 3-2 Comparison of mechanical pain thresholds at different time points of rats in eachgroup before and after PRF treatment (g, x± s)

组别/时点 v-c PHN Sham PRF PRF治疗组
治疗前 50. 94±2. 37 15.62±1.91 18. 36 + 3. 04 18. 17±2. 75
1 d 50.41 + 2.33 18.91 + 2. 47 19. 75 + 2. 29 22. 51 + 2. 92
4 d 49. 58±2. 78 19.43 + 2. 45 20. 02 ±2. 16 25. 06±1.91
7 d 50. 62 + 2. 05 19.09+1.43 20. 18±1. 69 26.91 + 1.95
10 d 51. 20±2. 23 19. 86±3. 15 19. 13 + 2. 49 28. 51±1.49
14 d 52. 46 + 2.09 20. 16+1. 52 21. 17 + 2. 68 33.86 + 2. 17
21 d 50. 25±2. 52 19.70 + 0.85 21. 50±3. 20 35. 53±1. 27
28 d 50. 38±3. 19 21.93 + 3. 04 25. 17+1. 33 35.89+1.86
35 d 50. 80±2. 40 23. 43±3. 26 25. 22±1. 45 36. 38±1.43

注:与模型对照组(PHN组)比较,apvO. 05。

注:与模型对照组(PHN组)比较,apvo. 05。

图3-2 PRF处理前后各组大鼠不同时点机械痛阈比较

Figure 3-2 Comparison of mechanical pain thresholds at different time points in rats

in each group before and after PRF administration

  1. 2 Western blot检测蛋白PINK1和Parkin表达水平改变

与V-C组比较,PHN组、Sham PRF组大鼠脊髓PINK1、Parkin $白 的相对表达量增加(P<0. 05);与PHN组比较,PRF治疗组大鼠脊髓PINK1、 Parkin蛋白的相对表达量降低(PV0. 05),与Sham PRF组比较差异无统计 学意义。见图、表3-4。

表3-3 各组大鼠脊髓组织中PINKR Parkin相对表达水平比较(g,x±s )

Table 3-3 Comparison of relative expression levels of PINK 1 and Parkin in spinal cord tissue of

each group (g, x±s)

组另u 只数 PINK1/GAPDH Parkin/GAPDH
v-c 12 0. 47 + 0. 06 0. 72 + 0. 08
PHN 12 0.80 + 0. 05 1.09 + 0. 14
Sham PRF 12 0. 84 + 0. 03 1. 04±0. 25
PRF治疗组 12 0. 52±0. 06 0. 74 + 0. 08

figure 3-3 Comparison of relative expression levels of PINK 1 and Parkin in spinal cord tissue
图3-3 各组大鼠脊髓组织中PINKK Parkin相对表达水平比较(g,x±s )

of each group (g, x±s)

  1. 讨论

在本实验中,给予RTX处理后,与V-C组大鼠比较,PHN组、Sham

PRF组 和PRF治疗组 组大鼠在RTX腹腔注射处理后4d、7d和10d均出 现PWMT的明显降低,提示PHN大鼠模型复制成功。PRF干预后,与PH N组比较,PRF治疗后1 d PRF治疗组大鼠机械痛阈开始升高,之后各时 点机械痛阈均明显高于PHN组,提示PRF后处理对PHN模型大鼠发挥明 显镇痛作用。同时,PRF治疗后35 d时PRF治疗组大鼠脊髓PINK1、Par kin蛋白表达下调,表明PRF能够降低PINKl/Parkin信号通路活性。在本 研究中,PRF治疗后大鼠脊髓PINK1、Parkin蛋白表达的变化与大鼠PWM T值改变恰呈相反趋势,由此可以认为PINKl/Parkin信号通路活性的调控 可能参与PRF对PHN模型大鼠的镇痛作用机制。

Parkin ( E3 ubiquitin-protein ligase Parkin)与线粒体外膜蛋白 PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1)信号转导通路是目前已知介导线粒体自噬 的重要途径,对维持线粒体功能与代谢发挥重要作用他。研究已经证实, PINK1和Parkin是帕金森病的主要致病蛋白,其编码基因已成为神经退 行性疾病的主要遗传性危险因子PINK1是由581个氨基酸组成的多肽 类物质,其结构中包含线粒体靶定留信号、线粒体内膜转移终止信号和线 粒体外膜滞留信号等。正常情况下PINK1含量极低,很难被检测到,只有 当内源性PINK1表达水平增加到一定程度才可被检测到,且其主要定位于 线粒体外膜。这是因为正常线粒体中的PINK1会被不断转移至线粒体内膜, 然后由线粒体内膜蛋白酶 PARL ( presenilin-associated rhomboidlike protein) 分解和清除血。有研究表明,PINK1被不断转移至线粒体内膜这一机制可 能是通过TOM/TIM复合体形成来完成的血。而当线粒体膜电位受到损伤 性刺激后,PINK1不能顺利进入线粒体内膜,而是在线粒体外膜堆积,但 具体机制尚未可知。聚集在线粒体外膜的PINK1具有募集Parkin的作用皿。 Parkin是E3泛素连接酶,当线粒体发生损伤时,Parkin的RINGO功能区域 作用失活,从而无法遮掩泛素蛋白受体位点半胱氨酸,半胱氨酸具有催化作 用,可将Parkin转化为活性状态 W PINK 1与Parkin之间相互作用共同 调控线粒体自噬活性,从而维持线粒体的数量和功能。研究证实,PINK1 与Parkin呈单向调控模式,即PINK1位于Parkin上游发挥作用口"。正常情 况下,PINK 1可抑制线粒体自噬的诱导过程当线粒体受损发生膜电位 去极化改变时,PINK1通过自磷酸化以及促使Parkin发生磷酸化而将Parkin 从细胞质募集至受损的线粒体外膜,并进一步磷酸化泛素蛋白位点,从而 激活Parkin泛素连接酶功能血,从而介导受损线粒体的清除。当Parkin的 募集和活化程度进一步增加,Parkin可发挥其泛素化作用,将线粒体外膜蛋 白不断泛素化,从而进一步诱导线粒体自噬过程。受损线粒体通过多种自 噬受体与其泛素蛋白的结合从而介导线粒体自噬的发生,其中较为明确的 自噬受体包括 SQSTM1 /P62、NBR1 ( neighbor of BRCA1 gene)、NDP52 (nucleardot 52 kDa protein)和 OPTN ( optineurin)[20] o 近年来 p62 与 OPTN引起了众多学者的关注。研究认为p62作为自噬受体将自噬底物运输 到自噬小泡,同时也被自噬途径降解皿。而泛素连接酶HACE1介导自噬受 体Optineurin的泛素化,促进Optineurin与p62的相互作用,增加自噬途径 降解底物阴。由此可见,在自噬受体中Optineurin对底物清除效率有着极为 重要的功能。Lazarou等诙研究中也提出,在自噬受体的细胞中,恢复 Optineurin或NDP5可获得自噬功能,其他自噬受体却无法实现。由此可见, Optineurin在PINK 1/Parkin通路中的关键作用就是清除功能异常的线粒体。 研究表明,NBR1与P62在PINK1 /Parkin介导的线粒体自噬过程中主 要发挥协同作用加,而发挥主要作用的自噬受体为NDP52和OPTN受体 25]o损伤线粒体外膜表明含有大量的NDP52和OPTN受体,两者可引起 Lc3不断在受损线粒体中聚集,从而通过自噬溶酶体快速吞噬和清除损伤线 粒体。Youle等霜人的研究发现,通过去除线粒体分解蛋白Drpl可引起 Parkin转移到受损线粒体,从而促进线粒体自噬进程;另外,Youle认为, 通过将损伤线粒体组分分解,可有效保留线粒体组分中正常的结构组分, 这一机制有益线粒体稳态的维持。然而PINK1介导的线粒体自噬途径除 Parkin这一磷酸化位点外,仍存在其他PINK1依赖性磷酸化位点,可从不 同途径介导线粒体自噬的发生如o

在本部分实验中,在经过PRF治疗后,与PHN组比较,PRF治疗组大 鼠各时点机械痛阈均明显高于PHN组,同时,与PHN组、Sham PRF组比 较,PRF治疗组大鼠脊髓组织中蛋白PINK1、Parkin的相对表达量明显降 低。结合第一部分研究结果,我们可以推测,PINKl/Parkin通路活性的降 低,从而介导脊髓组织细胞线粒体自噬水平改变,进而发挥其对模型大鼠 PHN的镇痛作用,可能是PRF对PHN模型大鼠发挥治疗作用的机制之一。 但是否通过促进GABA能神经元的数量和功能的恢复,有待进一步深入研 究。

  1. 结论
  2. PHN模型大鼠机械痛阈升高,热痛阈降低,同时伴有脊髓组织PINK1、 Parkin表达增加,自噬活性增强,线粒体变性和凋亡和增加。
  3. PRF可能通过抑制PHN模型大鼠脊髓组织PINKl/Parkin信号通路活 性,调节线粒体自噬活性,改善脊髓组织细胞凋亡,进而对PHN模型大鼠 产生镇痛作用。
  4. 参考文献
  • 带状疱疹后神经痛诊疗共识编写专家组.带状疱疹后神经痛诊疗中国专家共识[J].中 国疼痛医学志.2016,22(3):161 -
  • Liu YQ, Ji Y, Li XZ, Tian KL, Young CY, Lou HX?et al. Retigeric acid B-ind uce mitophagy by oxidative stress attenuates cell death against prostate cancer cell sin vitro [J]. Acta pharmacologica Sinica. 2013,34(9):1183 -
  • Andres AM, Hernandez G, Lee P, Huang C, Ratliff EP, Sin J, et al. Mitophagy is required for acute cardioprotection by simvastatin[J]. Antioxidants & redox sig aling. 2014,21(14):1960 -
  • Mitsuhashi S, Nishino I. Phospholipid synthetic defect and mitophagy in muscle disease [J]. Autophagy. 2011,7(12):1559 -
  • Haddad DM, Vilain S, Vos M?Esposito G, Matta S, Kalscheuer VM, et al. Mut aions in the intellectual disability gene Ube2a cause neuronal dysfunction and imp air Parkin-dependent mitophagy[J]. Molecular cell. 2013,50(6):831 -
  • Lazarou M, Sliter DA, Kane LA, Sarraf SA, Wang C?Burman JL, et al. The ub iquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy[J]. Nature. 2015,524(7565):309 -
  • Lei Y, Sun Y, Lu C, et al. Activated glia increased the level of proinflammato ry cytokines in a resiniferatoxin-induced neuropathic pain rat model [J].Reg Anest h Pain Med, 2016, 41(6).
  • 徐静,鲁玉刚,俞卫锋.慢性坐骨神经结扎大鼠前扣带皮层对脊髓痛觉信息传递的调 节[J].临床麻醉学杂志,2016, 4(32): 393 -
  • 吕时甲,窦智,蒋宗滨,等.脉冲射频对坐骨神经分支损伤模型大鼠机械痛阈的影响 [J].实用疼痛学杂志,2014, 10(5): 329 -
  • Springer MZ,Macleod KF. In brief: Mitophagy: mechanisms and role in human diseases[J]. J Pathol,2016,240(3):253 -
  • Klein C,Westenberger A. Genetics of Parkinson?s disease [J]. Cold Spring Harb P erspect Med,2012,2(1):008888.
  • Deas E,Plun-Favreau H,Gandhi S,Desmond H,et al. PINK1 cleavage at position A

103 by the mitochondrial protease PARL[J]. Hum Mol Genet,2011,20(2):867 -879.

  • Jin SM,Lazarou M,Wang C,et al. Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL [J].J Cell Biol,2010,191(5): 933 -
  • Geisler S,Holmstr m KM,Skujat D,et al. PINK1 /Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62 /SQSTM1[J]. Nat Cell Biol,2010,12(12): 119 -
  • Riley BE,Lougheed JC,Callaway K,et al. Structure and function of Parkin E3 ubiquitin ligase reveals aspects of RING and HECT ligases [J]. Nat Commun,2013,4: 1982.
  • Trempe JF,Sauve YGrenier K,et al. Structure of Parkin reveals mechanisms for ubiquitin ligase activation[J]. Science.2013,340( 6139): 1451 -
  • Clark IE, Dodson MW Jiang C, et al. Drosophila pinkl is required for mitochondrial function and interacts genetically with Parkin [ J]. Nature, 2006, 441( 7097) : 1162 -
  • Fedorowicz MA, de Vries-Schneider RL?Riib C, et al. Cytosolic cleaved PINK1 represses Parkin translocation to mitochondria and mitophagy[J]. EMBO Rep, 2014, 15(1): 86 - 93.
  • Park S, Choi SG, Yoo SM, et al. Pyruvate stimulates mitophagy via PINK1 stabilization]J]. Cell Signal, 2015, 27( 9): 1824 -
  • Wong YC, Holzbaur EL.Temporal dynamics of PARK2/Parkin and OPTN/optineurin

recruitment during the mitophagy of damaged mitochondria[ J] .Autophagy.

2015,11(2):422-424.

  • Komatsu M, Ichimura Y.Physiological significance of selective degradation of p62 by autophagy [J] .FEBS Letts. 2010,584(7):1374 - 137&
  • Liu Z, Chen P, Gao H, et al. Ubiquitylation of autophagy receptor Optineurin by HACE1 activates selective autophagy for tumor suppression[J].Cancer Cell. 2014,26(1):106 -
  • Imai Y Lu B. Mitochondrial dynamics and mitophagy in Parkinson's disease: disordered cellular power plant becomes a big deal in a major movement disorder[J]. Current opinion in neurobiology. 2011,21(6):935 -
  • Kirkin V Lamark T, Johansen T, et al. NBR1 cooperates with p62 in selective autophagy of ubiquitinated targets [J]. Autophagy, 2009, 5(9) : 732 -
  • Wong YC, Holzbaur EL. Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in Parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111( 42): 4439 -
  • Burman JL, Pickles S, Wang C, et al. Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates[J]. J Cell Biol, 2017, 216 (10):3231 -
  • Dave KD, de Silva S, Sheth NP, et al. Phenotypic characterization of recessive gene knockout rat models of Parkinson's disease[J]. Neurobiol Dis, 2014, 70: 190 -

带状疱疹后神经痛发病机制中背根神经节的研究进展

王峰综述蒋宗滨审校

摘要:带状疱疹后神经痛(postherpetic neuralgia, PHN)是一种由水痘-带 状疱疹病毒(varicella zoster virus, VZV)引起的基于感觉神经系统损伤的 神经病理性疼痛(neuropathic pain, NeuP)o PHN的发病机制尚未完全明确, 极大影响了其临床治疗及预防。大多数研究表明,潜伏于背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)的VZV在老年人或免疫力低下的人群中重新激活,从 而导致感觉神经系统退行性变和神经病理性疼痛。VZV在DRG中的潜伏 与激活与其基因及蛋白表达调节、细胞凋亡调节、免疫细胞浸润、引起神 经元结构功能改变以及病理改变相关。本文将就PHN发病机制中DRG的 研究进展作一简要综述,为研究PHN的发病机制提供线索。

关键词:带状疱疹后神经痛;背根神经节;水痘-带状疱疹病毒;机制;综 述

RESEARCH PROGRESS OF DORSAL ROOT
GANGLION IN THE PATHOGENESIS OF
POSTHERPETIC NEURALGIA

WANG FENG JIANG ZONG BIN

ABSTRACT: Postherpetic neuralgia (PHN) is a neuropathic pain (NeuP) based on sensory nervous system injury caused by varicella zoster virus (VZV). The pathogenesis of PHN has not been fully defined, which has greatly affected its clinical treatment and prevention. Most studies have shown that VZV which is lurking in the dorsal root ganglion (DRG)? is reactivated in the elderly or in immunocompromised populations, leading to degenerative changes in the sensory nervous system and neuropathic pain. The latency and activation of VZV in DRG is related to its gene and protein expression regulation, apoptosis regulation, immune cell infiltration, neuronal structural changes and pathological changes. This article will provide a brief review of the research progress of DRG in the pathogenesis of PHN? and provide clues for studying the pathogenesis of PHN.

KEY WORDS: postherpetic neuralgia; dorsal root ganglion; varicella zoster virus; mechanism; review

带状疱疹(herpes zoster, HZ)是由致病性人类a疱疹病毒VZV从原发 感染期间建立的DRG潜伏状态重新激活进而引起的感觉神经损害和皮肤病 变,常伴有疼痛⑴。目前可通过血清学证据证实VZV感染,但仍无法预测 VZV的重新激活⑵。

带状疱疹后神经痛(PHN)是HZ最常见的并发症,通常表现为皮损区 域烧灼样或针刺样的剧烈疼痛,同时可伴有自发性疼痛、痛觉过敏和感觉 异常⑶。年龄是PHN最重要的危险因素。初步统计在所有年龄±50岁的带 状疱疹患者中大约有12. 5%的人群将发展为PHN,并且其发病率随年龄增 长而呈上升趋势⑷。另外,明显的前驱症状、剧烈的疼痛、严重的皮肤损伤 以及HZ爆发的密度也是PHN的危险因素和预测因素⑴。有报道表明,免 疫抑制和糖尿病与PHN的发生发展显著相关⑷。PHN长期持续的剧烈疼痛 严重影响患者的身心健康和生活质量,同时,目前临床中可应用的药物及 其他治疗方法疗效的欠佳,导致家庭和社会巨大的经济负担。

PHN的致病机理十分复杂,其中VZV在感觉神经节中的潜伏和重新激 活被认为是PHN的始动机制。DRG位于脊神经孔内椎弓根的内、外侧之间, 是负责转导和调节感觉信息并将其传递至脊髓的重要感觉神经节之一。近 年来大量研究显示,DRG在感觉信息的转导、加工和调节等方面发挥重要 作用,包括伤害感受性疼痛、神经病理性疼痛的形成,加之其临床干预的 解剖可行性臥役使得DRG成为临床疼痛控制的重要靶点。背根神经节作为 VZV常见的潜伏和重新激活的位点,在PHN的发病机制中扮演重要角色, 近年来受到许多科研工作者的极大关注,并取得一定的研究进展。

1.背根神经节(DRG)

人体大约含有31对脊神经,负责外周和脊髓中枢之间自主神经和感觉 运动神经的信息传导。脊神经由感觉传入神经背侧轴突(背根)和运动传 出神经轴突(腹侧跟)组成,位于相邻椎骨节段之间的椎间神经孔中⑺。当 背侧感觉神经根离开椎间孔所形成的膨大组织,即为DRGo尽管DRG的 解剖位置大多相似,但其在椎管和神经孔内的具体解剖位置仍存在一定差 异。Moon等人在腰椎不同水平DRG解剖位置的研究中发现,在第4腰椎 水平,DRG 48%位于椎间孔内侧(intraforaminal, IF), 41%位于硬膜外腔和 蛛网膜下腔 (intraspinal, IS) , 6%位于椎间孔边缘和外侧

(extraforaminal, EF)。在第5腰椎水平,75%位于椎间孔内侧,10%位于硬膜 外腔和蛛网膜下腔,6%位于椎间孔边缘和外侧。在第1紙骨水平,则8%位 于椎间孔内侧,83%位于硬膜外腔和蛛网膜下腔⑻。DRG由两部分组成,一 部分为胶质细胞环绕神经元形成的双极细胞体,另一部分为形成初级传入 感觉神经的DRG感觉细胞的轴突。DRG中主要含有A、B两种类型的神经 元胞体。A型DRG神经元胞体,数量较少,体积较大,由其组成的神经元 具有低阈值、传导迅速和具有有髓鞘的Aa和A卩纤维等特征,主要负责传 递触觉、振动觉和本体感觉等感觉信息。B型DRG神经元胞体,数量较多, 体积较小,由其组成的神经元具有高阈值、传导较慢和具有薄髓鞘A5纤维 或无髓鞘c-纤维等特征,主要功能为接收来自外周伤害性感受器的信号, 并将其传递给中枢神经系统。A、B两种类型DRG神经元胞体数目比例约 为29:71團。卫星胶质细胞层(satellite glial cells, SGCs)作为DRG中感 觉神经元的功能单位,将DRG神经元的胞体彼此分离,致使胞体之间不相 互作用。SGCs薄层隔离DRG神经元形成胞体三聚体,又称为“三明治突 触” (sandwich synapse, SS)这种特征性结构使得一个DRG神经元接收的 刺激通过神经胶质细胞之间的通路触发延迟或持续性反应胶质细胞向 DRG神经元信息传递的明确为DRG-SS传导途径提供了证据。同时,SGCs 接收来自其他细胞以及神经元所处环境的信号通过其自身携带的针对 参与神经元活性调节物质的受体,如趋化因子、细胞因子、腺昔-5'-三磷 酸(ATP)和缓激肽等,参与DRG内传导过程,进而引导DRG对外周和 中枢神经系统的生理、病理过程做出相应反应,从而对DRG的生理和病理 过程发挥重要作用血。如已知PAF损伤通过影响DRG中的SGCs而参与 NeuP的形成血。DRG神经元轴突具有双独立分支,通过轴突分支与胞体之 间的“T-连接”关联。为将其与单级神经元区别,称其为伪单级神经元, 含有许多神经递质受体。伪单极神经元轴突的其中一个分支通过T形接头 延伸到外围,另外一个分支通过T形接头延伸到脊髓。DRG神经元的这种 T形接头可以阻碍从伤害感受器到到背根入口区的电脉冲,可以参与电冲动 的传播,或者作为来自外周电信息的低通滤波器叫

DRG的神经胶原细胞和施万细胞具有分泌功能。在组织损伤后,神经 胶质细胞和施万细胞被激活并释放一系列促炎性介质^和细胞因子,包括 类二十烷酸、缓激肽、血清素、神经营养因子、白细胞介素[伺、TNF-a[17\ 干扰素⑯、生长因子血、趋化因子如、ATP和活性氧等,导致炎症和疼痛, 同时影响邻近细胞的功能。另外,这些细胞的活化还导致疼痛介质的产生, 降低神经胶质细胞对动作电位(Action potential, AP)的反应阈值,从而导 致外周和中枢神经系统敏化[21'23]o

2.背根神经节(DRG)与带状疱疹后神经痛(PHN)

带状疱疹后神经痛(PHN)发病机制尚未完全明确。目前普遍研究认 为,VZV在感觉神经节中的潜伏感染和重新激活是PHN发生、发展的始动 环节。

DRG为初级传入神经元的胞体,当发生VZV感染时,DRG首先受到 损伤。VZV通常通过皮肤感染并引起特征性水痘囊泡。由于感觉神经系统 传入纤维终止于皮肤,水痘囊泡中的VZV沿着感觉神经轴突运输到神经元, 直接进入DRG、颅神经节和自主神经系统神经节,并建立潜伏24,25]o 1972 年Esiri和Tomlinson通过带状疱疹患者尸体DRG的组织学分析首次揭示了 VZV复制的迹象,包括核内包涵体,病毒抗原和颗粒,以及病毒向神经元、 卫星胶质细胞和支持成纤维细胞的神经节扩散圖。VZV在神经节中的相邻 神经元和非神经元细胞中发生神经节内扩散和病毒复制,从而实现多轴向 周围传递。由此产生针对VZV复制的宿主免疫应答,包括淋巴细胞侵润和 炎症,最终导致组织损伤。动物模型实验表明,病毒首先从潜伏的神经元 中部分激活,病毒重新激活的神经元与临近卫星胶质细胞形成合胞体,并 进入用于进一步激活的神经元细胞如。VZV神经节复制涉及局灶性出血、 脱髓鞘、轴突变性以及感觉神经纤维和支持细胞的坏死等病理过程。

初次感染VZV后,VZV DNA存在于感染个体的整个神经轴的感觉和 自主神经节中,潜伏并局限于神经元。来自人尸体DRG的研究证据表明, VZV潜伏感染与有限的裂解基因表达谱有关。VZV潜伏期间,即刻早期蛋 白(immediate early protein, IE)基因首先表达,随后参与VZV复制的早 期基因被激活顺序表达,包括在人类DRG部分神经元中表达的VZV基因 的 mRNA (ORF4, ORF21, ORF29, ORF62, ORF63, ORF66) [28_30]0 Cohrs 等人还发现ORF62, ORF63, ORF66基因的蛋白表达皿。目前尚未明确VZV 潜伏期的分子蛋白特征谱。动物实验研究结果显示,特异性病毒基因是VZV 基因在DRG中持续存在的必要条件。Chelsea G等函人通过构建人鼠嵌合 感染模型对IE进行了深入研究,结果发现,在机体出现潜伏感染后,出现 明显IE62和IE63表达活性增强,由于IE抗神经元细胞凋亡特性,能够有 效保护初次感染的DRG神经元细胞内的VZV存活和复制继。IE62和IE63 蛋白都是已知的病毒和宿主基因表达的调节剂,并且立即早期表达。IE63 参与基因调控閃,染色质调节童,以及阻断IFN反应和信号介导的翻译停 止[35]o IE62是病毒颗粒的组成部分,是VZV在DRG中感染的标志。IE62 在VZV潜伏感染期间即有表达,不仅是病毒基因表达的主要转录激活因子 :36\在激活病毒基因进入下一步转录中起重要作用,还通过干扰素调节因 子 3 (interferon regulatory factor 3, IRF3)的细胞质保留调节 IFN 应答皿。

Kress等人通过体外神经元移植模型实验证实,VZV感染以及IE62和IE63 调节蛋白的表达导致神经元对去甲肾上腺素刺激的敏感性增高昭o VZV ORF63是潜伏感染神经元中表达最常见和最丰富的转录产物和蛋白质。

Chantelle等人首次证实了 VZV基因ORF63在生产性感染期间人神经元中 编码发挥抗细胞凋亡功能昭。由于细胞死亡将终止病毒复制,VZV推迟其 复制的细胞死亡可以使其能够产生更多的病毒颗粒,有助于其本身在神经 元中的潜伏和复制。另外,VZV调节蛋白在DRG神经元中的表达表明, VZV可能影响神经元中宿主基因表达以促成神经病理性疼痛状态。Garry 等人检测DRG中神经病理性疼痛相关特异性标记物以及肽类物质的表达发 现,神经肽Y(NPY)、甘丙肽、ATF3、电压门控性钙通道a21通道和NaVl. 3 和NaVl. 8在VZV感染神经节中表达上调丽。其中神经肽Y是几种差异性 表达的神经肽之一,通常呈低水平表达,神经损伤时表达水平改变。通过 电压门控性钙通道活性调节,是临床中加巴喷丁治疗PHN的重要机理。钠 通道的上调是VZV感染后神经元病理性损害的进一步表现。综上所述,表 明VZV感染和VZV基因表达参与神经病理性疼痛状态形成。但应该注意, 存在潜伏感染神经节中VZV基因表达具有明显变异性,并非所有VZV ORF 转录产物和蛋白质都存在于所有被感染神经节中3。

目前普遍认为miRNA不仅在细胞增殖、发育、凋亡等生命过程中发挥 重要作用,同时在病毒复制、激活和潜伏等反应过程同样发挥重要调控作 用。目前针对VZV感染对机体miRNA变化影响的研究,通过检测血清中 特定miRNA的变化已经取得一定进展。一些具有特异性活性的miRNA通过 调控特定的目的基因,从而影响疾病的发生和进展。在潜伏感染阶段的三 叉神经节中未发现任何相关miRNA的表达,说明VZV在潜伏感染阶段可 能不表达相关miRNA羁。但是,在VZV潜伏感染阶段或重新激活机制中, VZV在DRG中是否表达相关miRNA以及是否影响宿主miRNA表达,有 待进一步研究。

原发性VZV感染主要涉及两方面免疫机制。一方面是VZV特异性抗 体的产生。然而其水平的增加并不能防止带状疱疹和PHN的发生,相反, 由于更高水平的VZV特异性抗体可能反映VZV在外周神经或DRG中更广 泛的复制,因此其水平与带状疱疹严重程度以及PHN发病风险呈正相关嗣。 另一方面是VZV特异性T细胞介导免疫。不同于VZV特异性抗体,VZV 特异性T细胞介导免疫对机体具有保护作用剧。VZV特异性T细胞介导免 疫维持VZV在DRG中的潜伏状态,随后可以通过潜伏VZV的亚临床再激 活或者环境暴露增强免疫应答。虽然随着年龄的增长或病理性原因使得细 胞介导的免疫力降低从而导致VZV再激活丽,但在潜伏感染VZV的人类 神经节中很少见到病毒特异性T细胞阴。通过分析VZV携带者DRG神经 元发现,DRG神经元中存在VZV糖蛋白E和非细胞溶解性CD8+T细胞浸 润。但是,在VZV糖蛋白E阳性DRG神经元中并未发现主要组织相容性 复合物I以及T细胞包围,提示VZV再激活的免疫控制可能不依赖T细胞 的直接接触切。

有证据表明,脊髓背角GABA能抑制性中间神经元丢失以及下行抑制 功能的丧失,将引起脊髓DRG中伤害感受性神经元的过度反应,致使中枢 神经系统(CNS)维持于慢性致敏状态沮8。本课题组近来研究结果证实,PHN 动物模型脊髓背角存在GABA能抑制性中间神经元的丢失,并且该机制涉 及神经元细胞自噬过度激活屈。

3.小结

带状疱疹(HZ)是带状疱疹后神经痛(PHN)发生、发展的先决条件。 水痘-带状疱疹病毒(VZV)在机体中的潜伏感染和重新激活是形成PHN 的始动环节。背根神经节(DRG)作为VZV潜伏感染和重新激活的重要感 觉神经节靶点之一,涉及病理改变、免疫调节、小分子物质结构功能改变 以及基因调控等多个方面,积极参与PHN的发病机制。近年来,PHN的机 制研究和临床诊疗均取得一定的研究进展,高危人群的预防仍然是重中之 重。探索VZV在DRG中潜伏感染与重新激活的具体机制,特别是基因调 控和小分子物质的结构和功能调节,将有利于针对抗病毒药物以及预防 PHN药物的研发。

参考文献

  • Mohamed YM・Prevention of post-herpetic neuralgia from dream to r eality: A ten-step model. Pain Physician, 2017, 20 (2) : 209-220.
  • Jeffrey LC. Herpes zoster. N Engl J Med, 2013, 369(3) : 255-263・
  • 带状疱疹后神经痛诊疗共识编写专家组带状疱疹后神经痛诊疗中国 专家共识[J]・中国疼痛医学志.2016, 22 (3) : 161-167.
  • Harriet JF, Sara LT, Liam S, et al. A systematic review and meta-anal ysis of risk factors for postherpetic neuralgia. Pain,
  • Torn H, Howard SA, Victor MH. Imaging anatomy of the lateral lumb ar spinal canal. Seminars in Ultrasound, CT and MRI, 1993, 14(6) :404 -413.
  • Torn H, Yoshihiro M, Ryo W, et al. Morphometric analysis of the lum bosacral nerve roots and dorsal root ganglia by magnetic resonance i maging [J]. Spine, 1996, 21 (9) : 1005-1009.
  • Sheng SR, Wang XY, Xu HZ,et al. Anatomy of large spines and its c omparison to the human spine: a systematic review [J]・ Eur Spine J, 2

010, 19:46-56・

  • Hyum SM, Yeon DK, Bang HS, et al. Position of dorsal root ganglia i n the lumbosacral region in patients with radiculopathy・Korean J Ane sthesiol, 2010, 59(6) : 398-402・
  • Motoko K, James T, James DS, et al. Morphometry of dorsal root gan glion in chronic experimental diabetic neuropathy・Diabetes, 2002, 51:8 19-824.
  • Gabriela MR, Li Q, Elise FS, et al. Transglian transmission at the dor sal root ganglion sandwich synapse: glial cell to postsynaptic neuron c ommunication. European journal of Neuroscience, 2012:1-8・
  • Menachem H・Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to fu nction. Brain Research Reviews. 2005, 48:457-476・
  • Maiken N, Bruce R, Steven AG. New roles for astrocytes: Redefining the functional architecture of the brain. Trends in Neuroscience, 2003,

26(10):523-530.

  • Hogan QH. Labat lecture: the primary sensory neuron: where it is, wh at it does, and why it matters. Reg Anesth Pain Med, 2010, 35 ⑶:306 -311.
  • Geza G, Andrew K, Marcel R, et al. Failure of action potential propa gation in sensory neurons: mechanisms and loss of sflerent filtering in

C-type units after painful nerve injury. J Physiol, 2013, 591 (4) : 1111 -1131・

  • Iain PC, Jonathan PG, Chas B, et al. Disruption of the P2X7 purinoce ptor gene abolishes chronic inflammatory and neuropathic pain. Pain, 2 005,114:386-396.
  • Marek Z, Maria S, Claudia S・Intraneural injection of interleukin-ip a nd tumor necrosis factor-alpha into rat sciatic nerve at physiological doses induces signs of neuropathic pain. Pain, 2005, 116:257-263・
  • Toshio N, Mitsuo O, Kjell O・Pharmacological inhibition of tumor ne crosis factor may reduce pain behavior changes induced by experimen tai disc puncture in the rat. Spine, 2011, 36 (4) : 232-236.
  • Cielito CRG, Margaret RS, Sriram Y, et al. The role of inflammation gene polymorphisms on pain severity in lung cancer patients. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2009, 18 (10) : 2636-2642.
  • Alexander B, Heike LR, Halina M, et al. Mobilization of opioid-conta ining polymorphonuclear cells by hematopoietic growth factors and in fluence on inflammatory pain. Anesthiology, 2004, 100:149-157・
  • Gao YJ, Ji RR・Chemokines, neuronal-glial interactions, and central pr ocessing of neuropathic pain. Pharmacology & Therapeutics, 2010, 126:5 6-68.
  • Joyce AD, Flobert YT, Viviannel T・Neuroimmune activation and neur oinflammation in chronic pain and opioid tolerance/hyperalgesia. Neur oscientist, 2004, 10 (1) : 40-52.
  • Vasudeva R, Flobert T, Joyce AD. Inhibition of microglial activation attenuates the development but not existing hypersensitivity in a rat model of neuropathy・Pharmacology and Experimental Therapeutics, 20 03, 306(2) : 624-630.
  • Claudia S, Michaela K. Recent finding on how proinflammatory cyto kines cause pain: peripheral mechanisms in inflammatory and neuropat hie hyperalgesia・Neuroscience Letters, 2004, 361:184-187・
  • Sarah EA, Gregory AS. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. Journal

of Virology, 2010, 84 (3) : 1504-1512.

  • Bearer EL, Breakefield XO, Schuback D, et al. Retrograde axonal tran sport of herpes simplex virus: evidence for a single mechanism and a

role for tegument. PNAS, 2000, 97 (14) : 8146-8150.

  • Margaret ME, Tomlinson AH. Demonstration of virus in trigeminal n erve and ganglion by immunoflurescence and electron microscope・Ne urological sciences, 1972, 15:35-48・
  • Mike R, Leigh Z, Ann MA. Mechanisms of varicella-zoster virus neu ropathogenesis in human dorsal root ganglia・Journal of Virology, 2008, 82(8):3971-3983.
  • Yevgeniy A, Lars D, Maria N, et al. Synthesis and decay of varicella zoster virus transcripts・Neurovirol, 2011, 17:281-287・
  • Gilden D, Mahalingam R, Nagel MA, et al. Review:the neurobiology of varicella zoster virus infection. Neuropathology and Applied Neurob iology, 2011,37:441-463.
  • Peter GEK, Randal JC・Varicella-zoster virus human ganglionic latenc y :a current summary ・N euro Virology, 2010, 16:411-418 ・
  • Randall JC, Donald HG, Paul RK, et al. Varicella-zoster virus gene 6

6 trnscription and translation in latently infected human gangia. Jouma 1 of Virology, 2003, 77(12) :6660-6665・

  • Chelsea G, Megan S, Brian PM, et al. Varicella-zoster virus ORF63 p rotects human neuronal and keratinocyte cell lines from apoptosis and

changes its localization upon apoptosis induction. Virology, 2018, 92 (12):1-16.

  • Tricia Z, Hesham N, Donna C, et al. Cell-type-dependent activation o f the cellular EF-la promoter by the varicella-zoster virus IE63 prot

ein. Virology, 2005, 338:35-42.

  • Aruna PA, Trent B, Mir AA, et al. Varicella-zoster virus immediate-e arly 63 protin interacts with human antisilencing function 1 protein a nd alters its ability to bind hiatones H3. 1 and H3. 3. Virology, 2009, 83(1):200-209.
  • Aruna PNA, Jeffrey IC・Varicella-zoster virus IE63, a major viral late ncy protein, is required to inhibit the alpha interferon-induced antivira 1 response. Virology, 2007, 81 (15): 7844-7851.
  • Kris W, Hua P, John H, et al. Role of the IE62 consensus binding sit e in transactivation by the varicella-zoster virus IE62 protein. Virolog y, 2010, 84(8):3767-3779.
  • Nandini S, Marviin S, Che XB, et al. Varicella-zoster virus immediate -early protein 62 blocks interferon regulatory factor 3(IRF3) phospho rylation at key serine residues: a novel mechanism of IRF3 inhibition

among herpesviruses. Virology, 2010, 84(18) :9240-9250・

  • Michaela K, Helmut F・Infection by human varicella-zoster virus con fers norepinephrine sensitivity to sansory neurons from rat dorsal root

ganglia. The FASEB Journal, 2001, 15:1037-1042.

  • Chantelle H, Anthony LC, Barry S, et al. Varicella-zoster virus ORF6 3 inhibits apoptosis of primary human neurons. Virology, 2006, 80 (2): 1025-1031.
  • Emer MG, Ada D, Heather AA, et al. Varicella zoster virus induces n europathic changes in rat dorsal root ganglia and behavioral reflex se nsitisation that is attenuated by gabapentin or sodium channel blockig

drugs. Pain, 2005, 118:97-111.

  • Gilden D, Mahalingam R, Nagel MA, et al. Review: The neurobiology of varicella zoster virus infection. Neuropathology and Applied Neuro biology, 2011,37:441-463.
  • Umbach JL, Nagel MA, Cohrs RJ, et al. Analysis of human alphaherp esvirus microRNA expression in latently infected human trigeminal ga nglia. J Virol, 2009, 83:10667-10683.
  • Adriana W, Jane HZ, Michael NO, et al. Varicella-zoster vims—specif! c immune responses to herpes zoster in elderly participants in a trial

of a clinically effective zoster vaccine・ Infectious Diseases, 2009, 200: 1068-1077.

  • Atsuko H, Hideomi A, Mary R, et al. Use of an inactivated varicella vaccine in recipients of hematopoietic-cell transplants. N Engl J Med, 2002, 347(1) : 26-34・
  • Oxman MN, Levin MJ, Johnson GR, et al. A vaccine to prevent herp es zoster and postherpetic neuralgia in older adults. N Engl J Med, 20 05,352(22) : 2271-2284.
  • Georges MGMV, Rogier QH, Jessica MVD, et al. Selective retention of herpes simplex virus-specific T cells in latently infected human tri geminal ganglia. PNAS, 2007, 104(9) : 3496-3501 ・
  • Kavitha G, Megan S, Anthony LC, et al. Characterization of the host immune response in human ganglia after herpes zoster. Virology, 2010, 84(17):8861-8870.
  • Ralf B, Andreas B, Gunnar W・Neuropathic pain: diagnosis, pathophysi ological mechanisms, and treatment・ Lancet Neurol, 2010, 9:807-819・
  • 张爱民,蒋宗滨,何睿林,等自噬激活对带状疱疹后神经痛模型小鼠 脊髓背角GABA能神经元凋亡的影响•临床麻醉学杂志,2018, 34(3):

致谢

匆匆三载。首先,感谢我的导师蒋宗滨教授。学业上,蒋老师悉心教 导,费尽心力。不仅教导我掌握了专业技能和学习方法,更是亲力亲为为 我搭建良好的学习机会和平台,使得我拥有更加广阔的视野,拓展自己的 学术水平和专业技能。生活中,蒋老师嘘寒问暖,无微不至。蒋老师总是 将我的衣食住行放在心上。在我情绪低谷时,蒋老师会耐心为我开导,为 我指明道路,并且不断的激励我,予我信心。师恩难忘,师恩难报。

其次,感谢我的师兄张爱民、师姐陈云婷在科研方面给予我的指导和 帮助,感谢疼痛科的各位老师在我实习期间对我的教导和照顾,感谢我的 同门在学业和生活上给予我的支持。三年来,在他们的支持和帮助下,我 才能够攻克一个又一个的难关,得以顺利完成我的学业。

最后,我要感谢我的父母,是他们的默默付出,让我一步一步走到今 天。父母给予我的关爱,让我能够在追求理想的道路上没有后顾之忧,勇 敢前行。

感谢所有支持和帮助过我的人。