紫瘢性肾炎患儿血清及尿液中骨膜蛋白表达水平及意义论文

2020年9月2日14:38:53紫瘢性肾炎患儿血清及尿液中骨膜蛋白表达水平及意义论文已关闭评论

紫瘢性肾炎患儿血清及尿液中骨膜蛋白表达水平及意义论文

摘要

目的:

探讨骨膜蛋白(periostin )与紫瘢性肾炎(Henoch-Schonlein purpura nephritis, HSPN ) 之间的关系,以及血清、尿液中骨膜蛋白与肌酉干、尿素、胱抑素C、24h尿蛋白定量、 人尿微量白蛋白的相关性,采用ROC曲线评价血清、尿液中骨膜蛋白在紫瘢性肾炎中 价值,探讨血清及尿骨膜蛋白与紫瘢性肾炎发生之间的关系,为寻找早期实验室评价指 标提供新思路。

方法:

选取2017年7月至2018年12月于河北大学附属医院小儿内科住院的过敏性紫瘢 患儿60例,其中过敏性紫瘢(非肾炎型)患儿(Henoch-Schonlein purpura without nephritis, HSP)及紫瘢性肾炎组(Henoch-SchonleinpuTpuranephritis , HSPN)各 30 例,选同期 于我院门诊健康体检的健康儿童30例作为正常对照组。采用酶联免疫吸附实验(ELISA) 测定研究对象血清及尿液中骨膜蛋白的水平。分别比较HSPN组、HSP组和正常对照组 血清及尿骨膜蛋白的表达水平,并比较血清及尿骨膜蛋白与临床常用指标的相关性,采 用ROC曲线评价骨膜蛋白对紫瘢性肾炎的价值。

结果:

  1. HSPN组、HSP组、正常对照组血清骨膜蛋白平均浓度分别为(50.02土88)pg/ml, (41.68 + 8.26) pg/ml, (36.99 + 8.34) pg/ml,三组间差异具有统计学意义(F二 18.081,

PvO.001),两两之间比较:HSPN组与正常对照组、HSP组与正常对照组、HSPN组与 HSP组比较,差异均有统计学意义(PV0.001、PV0.001、PV0.05)

  1. HSPN组、HSP组、正常对照组尿骨膜蛋白平均浓度分别为(94±3.04)pg/ml, (31.75 + 1.91) pg/ml, (31.00土 1.99) pg/mlo尿骨膜蛋白水平在三组间差异具有统计

学意义(F=23.405, P<0.001),两两之间比较:HSPN组与正常对照组、HSPN组与HSP 组相比,差异有统计学意义(PV0.001、PV0.001) , HSP组与正常对照组相比,差异 无统计学意义(P>0.05) o

  1. HSPN组尿骨膜蛋白与24小时尿蛋白定量(810,PV0.001)、人尿微量白蛋 白呈正相关(厂二0. 735, PV0.001),与尿素、肌酹、尿酸、胱抑素C无相关性;HSPN 组血清骨膜蛋白与人尿微量白蛋白呈正相关(厂二0.396,民0.030),与24小时尿蛋白定 量、尿素、肌酹、尿酸、胱抑素C均无相关性。
  2. 血清骨膜蛋白水平预测紫瘢性肾炎的ROC曲线结果示:ROC曲线下面积为789, 95%CI为0.696〜0.882,灵敏度及特异度分别为:96.7%、56.7%,约登指数为0.534,最 佳临界值为 39.166pg/ml, P<0.001o
  3. 尿骨膜蛋白水平预测紫瘢性肾炎的ROC曲线结果示:ROC曲线下面积为851, 95%CI为0.760〜0.942,灵敏度及特异度分别为:76.7%、85.0%,约登指数为0.617,最 佳临界值为 33.627pg/ml, P<0.001o

结论:

  1. 尿骨膜蛋白在紫瘢性肾炎中明显升高,但在过敏性紫瘢(非肾炎型)中无明显升 高,提示其是反映紫瘢性肾炎肾损伤的敏感指标。
  2. 血清骨膜蛋白参与了过敏性紫瘢及紫瘢性肾炎的发生,在紫瘢性肾炎中水平更高。

关键词:紫瘢性肾炎,过敏性紫瘢,骨膜蛋白,儿童。

Abstract

Abstract

Objective:

To explore the relationship between periostin and Henoch-Schonlein purpura nephritis (HSPN), and the correlation of periostin with creatinine, urea, cystatin C, 24h urinary protein quantification and microalbumin in human urine. ROC curve is adopted to evaluate the value of periost in serum and urine in HSPN ,and also to explore the relationship between serum and urinary periostin and the occurrence of HSPN, so as to provide new ideas for further searching for early laboratory evaluation indexes.

Methods:

60 cases with HSP who were admitted to the Department of Pediatrics,Affiliated Hospital University from July 2017 to December 2018 were recruited,including 30 cases with Henoch-Schonlein purpura without nephritis (HSP)and 30 cases with Henoch-Schonlein purpura (HSPN), and another 30 healthy children who underwent a physical examination in our hospital during the same time as the normal control group. The serum and urine levels of periostin were determined by ELISA. The levels of serum and urinary periostin in the HSPN group, the HSP group and the normal control group were compared, and the correlation between serum and urinary periostin and common clinical indicators were compared. The ROC curve was used to evaluate the value of periostin in HSPN.

Results:

  1. The serum levels of periostin in the HSPN group, the HSP group and the normal control group were (50.02+8.88) pg/ml, (41.68+8.26) pg/ml, (36.99+8.34) pg/ml, respectively. There was significant difference among the three group (F=18.081, P<0.001). There were statistically significant differences of the HSPN group and the normal control group, the HSP group and the normal control group, the HSPN group and the HSP group (P < 001, P< 0.001, P< 0.05).

 

  1. The urinary levels of periostin in the HSPN group, the HSP group and the normal control group were (34.94+3.04) pg/ml, (31.75+1.91) pg/ml, (31.00+1.99) pg/ml, respectively. There was significant difference among the three group (F=23.405, P<0.001). There were significant differences of the HSPN group and the normal control group, the HSPN group and the HSP group (P <001, P <0.001). There was no significant difference of the HSP group and the normal control group (P > 0.05).
  2. In the HSPN group, the urinary periostin was positively correlated with the 24-hour urinary protein (r=0.810, P<0.001) and H-ALB (r735, PV0.001), but not with ure, Cr, UA and Cys C. In the HSPN group, there was a positive correlation between serum periostin and H-ALB (厂二0.396, P二0.030), and there was no correlation between serum periostin and ure, Cr, UA, Cys C and 24-hour urinary protein quantification.
  3. The ROC curve of the prediction of HSPN by serum periostin level showed that the area under the ROC curve was 0.789, 95%CI was 0.696〜882, the sensitivity and specificity were 96.7%, 56.7%, and the Youden index was 0. 534, the optimal critical value was 39.166pg/ml, P<0.001.
  4. The ROC curve of the prediction of HSPN by the level of urinary periostin showed that the area under the ROC curve was 0.851, and the 95%CI was 0.760~0.942. The sensitivity and specificity were 76.7%, 85.0%, and the Youden index was 0.617, and the optimal critical value was 33.627pg/ml, P<0.001.

Conclusion:

  1. Urinary periostin was significantly increased in HSPN, but was not significantly increased in HSP, which was a sensitive index reflecting renal injury.
  2. Serum periostin protein is involved in HSP and HSPN, which is higher in HSPN.

Key words: Henoch-Schonlein purpura nephritis, Henoch-Schonlein purpura, periostin,

children.

中英文缩略词表

缩写词 英文全称 中文名称
HSP Henoch-schonlein purpura 过敏性紫瘢
HSPN Henoch-Schonlein purpura nephritis 紫瘢性肾炎
Cr creatinine 肌酹
ure Urea 尿素
UA Uric acid 尿酸
CysC cystatin C 光抑素c
H-ALB Human microalbumin 人尿微量白蛋白
IL-4 Interleukin-4 白细胞介素-4
IL-13 Interleukin-13 白细胞介素-13
ROC receiver operating characteristic curve 受试者工作特征曲线
AUC area under curve 曲线下面积
EMT Epithelial-Mesenchymal Transition 上皮间充质转化
IgAN IgA glomerulonephritis IgA肾炎
ESRD End stage renal disease 终末期肾病
LN lupus nephritis 狼疮性肾炎

ADPKD autosmal dominant polycystic kidney diseas 常染色体显性遗传多囊性肾病

第一章绪论

过敏性紫瘢(Henoch-Schonlein purpura, HSP),是一种自身免疫性血管炎,也可 以认为是白细胞破坏过多造成的血管炎,多见于儿童及青少年,可造成全身多个脏器 病变。过敏性紫瘢以秋冬季节发病率高为特点,在性别方面,男孩发病率较女孩高, 有一定的性别差异倾向。具体的病因及发病机制仍未明确,考虑与细菌、病毒感染有 关,在一些地区可能还与寄生虫感染造成嗜酸性粒细胞增多有关,另外,随着人们食 物的多样化的出现,一些食物也逐渐成为过敏性紫瘢的诱因,比如蛋类、牛奶、各种 肉类以及鱼虾等海鲜产品引起的过敏反应也称为过敏性紫瘢发生的重要因素,另外服 用药物、疫苗接种、花粉、虫咬等也是一些常见的致敏因素。当过敏性紫瘢患儿发生 肾损害,如出现血尿、蛋白尿、肾功能不全等症状时,我们称之为紫瘢性肾炎(Henoch- Schonlein purpura nephritis, HSPN),在儿童继发性肾小球疾病中,紫瘢性肾炎可以占 到第一位⑴。因为诊断标准不统一、随访时间差异,造成过敏性紫瘢患儿中发生肾损害 的报告率差异较大,而依据临床表现诊断,主要报道发病率为40%〜50%24]。紫瘢性 肾炎是一种自限性疾病,且大多预后良好,但近年经过学者长期随访发现,10%〜 20 %可进展为慢性肾功能不全[网,1 %〜7 %可进展为慢性肾衰竭甚至终末期肾病El。 肾脏损害及其损害程度直接决定过敏性紫瘢患儿的远期预后,因此预测紫瘢性肾炎的 发生并探索监测早期病情变化的指标,进而改善紫瘢性肾炎患儿预后成为目前亟待解 决的问题。目前,紫瘢性肾炎的具体发病机制尚不完全清楚,虽然肾脏组织活检能帮 助临床诊断和了解疾病的严重程度,但因其对组织损伤较大,很多家长难以接受,且 单次活检难以评估病情进展,因此,寻找创伤性小、便于取材的生物标记物具有非常 重要的意义。

骨膜蛋白于上个世纪90年代被命名为成骨细胞特异因子-2(steoblast-specific factor- 2, OSF-2),属于fasciclin家族,它是从小鼠成骨细胞系中克隆出的一种具有调节成 骨细胞分化和粘附的功能骨粘附分子⑼,Osf-2常被用来命名转录因子。后来,人们逐 渐发现该蛋白多出现在骨膜和牙周韧带中,所以它又被重新命名为骨膜蛋白,是成骨 细胞及其前体细胞分泌产生的一种细胞外基质蛋白,与骨骼、牙齿生长及皮肤修复有 关。它是一种具有促进细胞粘附、迁移等功能分泌蛋白,不具有特定的结构作用,而 是与细胞表面受体、蛋白酶和其他调节细胞粘附/迁移和胶原蛋白和其他细胞外基质 (ECM)蛋白原纤维形成的分子相互作用[10'13]o骨膜蛋白具有多种结构域结构,其中 特定结构域结合促进ECM蛋白交联的许多蛋白质和酶。骨膜蛋白参与正常骨和牙齿组 织的形成和维持,并且在受到机械应力的组织成分中高度表达,例如骨膜和牙周韧 带。在其他器官和组织中也观察到它的存在,包括心脏,肺,肾,皮肤,肝脏,骨骼 肌和视网膜Mg]。近年来,关于骨膜蛋白在肾脏中的研究越来越多,HwangJ H等 发现尿骨膜蛋白可能是IgA肾病患者肾纤维化的早期标志物,同时也可以用来评价肾 损伤以及预测IgA肾病患者的预后。通过对狼疮性肾炎患者研究发现骨膜蛋白主要表 达于硬化的肾小球及肾小球周围纤维化的部位,而且骨膜蛋白的表达水平与肾脏慢性 化指数及肾功能恶化相关a】。糖尿病肾病患者中骨膜蛋白在肾小球和肾小管均有表 达,且骨膜蛋白表达与肾功能相关,与非蛋白尿糖尿病肾病患者相比蛋白尿糖尿病肾 病患者骨膜蛋白表达显著升高[勿。另外,骨膜蛋白与多种肾损伤模型如5/6肾切除术 后大鼠模型、UUO单侧输尿管梗阻模型(Unilateral ureteralobstruction, UUO )关系密切 [28'29]o而骨膜蛋白在紫瘢性肾炎中是否同样会产生类似上述的生物学效应,目前国内 外在这方面的研究较少有涉及。因此本次实验主要是通过检测紫瘢性肾炎患儿血清及 尿液中骨膜蛋白的水平,同时通过观察血清及尿骨膜蛋白与检测肾功能的临床经典标 志物如肌酹、尿素、胱抑素C、24h尿蛋白定量、人尿微量白蛋白的相关性,采用 ROC曲线评价血清、尿液中骨膜蛋白检测紫瘢性肾炎敏感度及特异度,探讨血清及尿 骨膜蛋白与紫瘢性肾炎发生之间的关系,为寻找早期实验室评价指标提供新思路。

第二章资料与方法

2.1 一般资料

本次研究选取的研究对象为2017年7月至2018年12月间于河北大学附属医院小 儿内科住院的初发过敏性紫瘢患儿,按照患儿有无肾脏损伤分为过敏性紫瘢无肾损伤

(HSP)组及紫瘢性肾炎(HSPN)组。HSPN患儿30例,其中男孩18例,女孩12 例,年龄介于5-12岁之间,平均年龄(7.51 + 1.76)岁;HSP患儿30例,男孩17 例,女孩13例,年龄介于4-11岁之间,平均年龄(7.84土 1.71)岁;并选同期健康儿 童30名作为正常对照组,其中男孩15例,女孩15例,年龄介于5-10岁之间,平均 年龄(7.37±1.45)岁。

2.1.1纳入标准

  1. 入选的过敏性紫瘢患儿均符合《诸福棠实用儿科学第八版》[沏中关于过敏性紫瘢的 诊断标准:
  • 皮肤症状:出现皮肤紫瘢或明显的於点、瘀斑,一般多出现于双下肢或臀部,对 称分布、略高出皮面、压之不褪色,但血小板无异常;
  • 消化道症状:急性弥漫性腹痛,可岀现肠套叠或消化道出血;
  • 关节症状:关节肿胀或疼痛伴活动受限;或者关节疼痛不伴肿胀或活动受限。
  • 肾脏症状:出现血尿或蛋白尿。

其中第一条为必备条件。

  1. 入选的紫瘢性肾炎患儿均符合中华医学会儿科学分会肾脏学组制定的儿童紫瘢性肾 炎诊治循证指南(2016)[31]诊断标准:

在发生过敏性紫瘢6月内出现血尿或蛋白尿,其中血尿需符合以下诊断标准:

肉眼血尿或镜下血尿;

蛋白尿需符合以下标准:

  • 一周内至少三次尿常规提示尿蛋白阳性;

⑵24h尿蛋白定量大于150mg;

(3) 一周内至少3次尿微量白蛋白含量高于正常值上限。

正常对照组纳入标准:正常对照组儿童均来自于河北大学附属医院儿科门诊体检的 健康儿童,不符合过敏性紫瘢和紫瘢性肾炎诊断标准中的任何一条,近一月未患呼吸 道感染及胃肠道感染性疾病,近一月未服用存在肾毒性药物,既往无肾脏及泌尿系统 疾病,家族无肾脏遗传性疾病,尿检筛查均正常。

2.1.2排除标准

  • 非初发型,即既往已经患有过敏性紫瘢或者紫瘢性肾炎的患儿;
  • 近期有应用激素等免疫抑制剂的病史;
  • 存在泌尿系肿瘤、泌尿系统畸形、肾脏外伤或行肾脏手术的患儿;
  • 患儿患有原发性或继发性肾脏疾病;
  • 存在家族遗传性肾脏疾病的患儿;
  • 近期服用过可能造成肾损伤的毒物、药物;
  • 患有其他免疫系统疾病;
  • 患有肝脏、心血管系统等严重疾病;
  • 资料不完整影响判断的患儿。

2.1.3标本采集

过敏性紫瘢患儿于就诊第二天早晨留取血、尿标本,健康儿童于就诊时留取血、 尿标本。具体方法:取外周静脉血3ml,并清洗外阴后留取中断尿5ml,于4°C下离心 10分钟,转速要求3000〃分。分别提取上层血清及上层尿液,置于无菌干燥的EP管 中,于-80°C冰箱中冻存备用,实验开始前避免反复冻融标本。

2.1.4临床资料采集

统计过敏性紫瘢患儿、紫瘢性肾炎患儿及正常对照组儿童的详细资料:年龄、性 别、个人史、既往史、家族史;并记录紫瘢性肾炎患儿实验室检查结果:肌酹、尿 素、胱抑素C、24h尿蛋白定量、人尿微量白蛋白、尿常规(尿潜血、尿蛋白)。

2.2

2.2.1

实验仪器和实验试剂

主要实验仪器

  仪器 生产厂家
  酶标仪 美国热电Thermo FC酶标仪
  移液器1 德国EPPENDORF 8道移液器
  移液器2 美国热电Thermo l-5ml移液器
  移液器3 美国热电Thermo 20-200(11移液器
  移液器4 美国热电Thermo 2-50(11移液器
  摇床 海门市其林贝尔水平摇床TS-2
  电子天平 余姚市纪铭称重校验设备有限公司
  生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司
  -80摄氏度冰箱 青岛海尔特种电器有限公司
  离心机 美国热电Thermo

2.2主要实验试剂

表2-1人骨膜蛋白试剂盒组成(江苏酶标生物科技有限公司提供)

试剂名称 规格 试剂名称 规格
30倍浓缩洗涤液 20mlxl 瓶 终止液 6mlxl 瓶
酶标试剂 6mlxl 瓶 标准品(160pg/ml) 0.5mlxl 瓶
酶标包被板 12孔x8条 标准品稀释液 1.5mlxl 瓶
样品稀释液 6mlxl 瓶 说明书 1份
显色剂A液 6mlxl 瓶 封板膜 2张
显色剂B液 6mlxl 瓶 密封袋 1个

2.3实验步骤

用同一批次骨膜蛋白试剂盒采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测所有研究对象 的血清及尿液中骨膜蛋白水平,根据标准曲线计算出相应的OD值对应的骨膜蛋白浓 度,整个实验过程严格按照说明书的操作进行,以酶标仪读数判定试验结果。

  • 实验开始前,首先需要将冷藏的试剂盒取出,于室温下复温,并将待测的冰冻血 清及尿液取出,于室温下融化,以待实验备用。
  • 标准品的稀释:准备7个小试管,并一次标记为1-7号,用精密移液器将150卩1 的原倍标准品加入5号试管中,然后再向其中加入150卩1标准品稀释液稀释,然 后取5号小试管中的液体150卩1加入到4号小试管中,再向4号小试管中加入 150^11标准品稀释液进行稀释,以此类推,直至加到1号小试管为止,进行倍比 稀释。6、7号小试管中只加入标准品稀释液,为空白孔,然后根据7个小试管的 值绘制标准曲线。
  • 加样:将酶标包被板上的96孔分别设置为标准孔、待测样品孔和空白孔。在标 准孔中加入50卩1标准品,将用稀释液稀释5倍的待测血清及尿液加入待测样品 孔中(加入样品稀释液40卩1后加待测血清或尿液10卩1),空白对照孔不加样品。 加样时将样品加于酶标板孔底部,尽量不接触孔壁,轻轻晃动混匀。
  • 温育:用封板膜将酶标包被板封板后,于37°C温育30分钟。
  • 配液:用蒸憎水将30倍的浓缩洗涤液30倍稀释适量,备用。
  • 洗涤:将酶标包被板的封板膜小心揭去,弃掉板内的液体,并甩干,将残余液体 用吸水纸吸干,然后每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,重复5次,拍干,最 后一次洗涤时要将孔内的液体彻底甩干。
  • 加酶:在除空白孔之外的酶标包被板的孔中加入酶标试剂50^11 o
  • 温育:同步骤(4) o
  • 洗涤:同步骤(6) o
  • 显色:在各个孔中按先后顺序加入显色剂A、显色剂B各50卩1,轻轻晃动,混 匀,37°C避光显色。
  • 终止:10分钟后于每孔加入50卩1终止液,终止反应。
  • 测定:以空白孔调零,加入终止液15分钟内以450nm波长依次测量各孔的吸光 度值(OD值)。
  • 计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘制出标准曲线, 根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释的倍数,计算出样品 的实际浓度。

2.4统计学方法

所有数据均采用spss22.0统计学软件进行数据分析及统计学处理。所有符合正态 分布的连续定量资料结果均采用均数土标准差({土s)来表示。计算前先进行正态性 检测及方差齐性检验,三组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD—t检验, t检验用于两样本均数之间的比较。采用卡方检验比较二分类变量资料。分析资料的相 关性,根据资料是否符合正态性分布,若符合选择Pearson,否则采用Spearman相关 分析。采用受试者工作曲线(ROC曲线)评价血清及尿液骨膜蛋白表达水平对紫瘢性 肾炎的价值。检验水准以P<0.05为差异有统计学意义。

第三章结果

3.1 HSPN组、HSP组和正常对照组间性别、年龄的比较

对三组年龄、性别进行统计学分析结果显示:HSP组、HSPN组和正常对照组三

组间年龄、性别差异无统计学意义(P二0.525、P=0.730) o (见表3-1)

表3-1 HSPN组、HSP组和正常对照组间性别、年龄的比较

  HSPN 组

(n=30)

HSP组

(n=30)

正常对照组

(n=30)

P
年龄(岁) 7.51 土 1.76 7.84±1.71 7.37 ±1.45 0.525
性别(男:女) 1.5:1 1.31:1 1:1 0.730

3.2 HSPN组、HSP组和正常对照组血清骨膜蛋白水平比较

HSPN组血清骨膜蛋白平均浓度为(50.02 + 8.88) pg/ml, HSP组血清骨膜蛋白平 均浓度为(41.68±8.26) pg/ml,正常对照组血清骨膜蛋白平均浓度为(36.99土8.34) pg/mlo血清骨膜蛋白水平在三组间差异具有统计学意义(F=18.08, PvO.OOl),两两 之间比较:HSPN组与正常对照组相比,差异有统计学意义(PvO.OOl) , HSPN组与 HSP组相比,差异有统计学意义(PV0.001) o HSP组与正常对照组相比,差异有统 计学意义(P二0.036, PV0.05) o HSP组、HSPN组血清骨膜蛋白水平较正常对照组明 显升高。(见表3-2)

表3-2 HSPN组、HSP组和正常对照组血清骨膜蛋白水平比较

组别 例数(n) 骨膜蛋白(pg/ml)
HSPN 组 30 50.02+8.88a
HSP组 30 41.68+8.26a
正常对照组 30 36.99+8.34
F - 18.08
P   < 0.001

注:△与HSP组比较,PV0.001,与正常对照组比较,PV0.001

▲与正常对照组比较,P=0.036, P<0.05

3.3 HSPN组、HSP组和正常对照组尿骨膜蛋白水平比较图3-1 HSP组、HSPN组和正常对照组血清骨膜蛋白水平比较

HSPN组尿骨膜蛋白平均浓度为(34.94±3.04) pg/ml, HSP组尿骨膜蛋白平均浓 度为(31.75土 1.91) pg/ml,正常对照组尿骨膜蛋白平均浓度为(31.00土 1.99) pg/mL 尿骨膜蛋白水平在三组间差异具有统计学意义(F=23.405, PV0.001),两两之间比 较:HSPN组与HSP组相比,差异有统计学意义(PV0.001) , HSPN组与正常对照 组相比,差异有统计学意义(PV0.001) , HSP组与正常对照组相比,差异无统计学 意义(P二0.221, P>0.05) o HSPN组尿骨膜蛋白水平较HSP组、正常对照组升高。

(见表3-3)

表3-3 HSPN组、HSP组和正常对照组尿骨膜蛋白水平比较

组别 例数(n) 尿骨膜蛋白(元土 s, pg/mD
HSPN 组 30 34.94±3.04*
HSP组 30 31.75 土 1.91**
正常对照组 30 31.00 ±1.99
F - 23.405
P - < 0.001

注:*与於卩组比较,PV0.001,与正常对照组比较,PV0.001

**与正常对照组比较,P =0.221, P>0.05

45.000-图3-2 HSP组、HSPN组和正常对照组尿骨膜蛋白水平比较

尿骨膜蛋白与24小时尿蛋白定量(厂二0.810, PvO.OOl)、人尿微量白蛋白
3.4 HSPN组血清及尿骨膜蛋白与各临床指标的相关性分析

(厂二0.0.735, PvO.OOl)呈正相关,与尿素、肌酹、尿酸、胱抑素C无相关性;血清骨 膜蛋白与人尿微量白蛋白呈正相关(厂二0.396, P=0.030),与尿素、肌酹、尿酸、胱抑 素C、24小时尿蛋白定量均无相关性。(见表3-4)

表3-4 HSPN组血清及尿骨膜蛋白与各临床指标的相关性分析

  尿骨膜蛋白 血清骨膜蛋白
厂值 P值 厂值 尸值
尿素 (mmol/L) 0.046 0.808 -0.187 0.323
24h尿蛋白定量 0.810 <0.001 0.179 0.344
人尿微量白蛋白(ug/mL) 0.735 <0.001 0.396 0.030
肌 Sf(umol/L) -0.258 0.168 -0.058 0.763
尿酸(umol/L) -0.045 0.815 0.202 0.285
胱抑素C(mg/L) -0.132 0.486 0.000 0.999

淸骨膜蛋白(pg/ml)

图3-5血清骨膜蛋白与人尿微量白蛋白相关分析

3.5血清及尿骨膜蛋白受试者工作曲线分析(ROC曲线)

血清骨膜蛋白的ROC曲线下面积0.789, 95%的置信区间0.696〜0.882,

PvO.OOl,最佳临界值39.166pg/ml,敏感度96.7%,特异度56.7%,约登指数0.534;尿

骨膜蛋白ROC曲线下面积0.851, 95%的置信区间0.760〜0.942, P<0.001,最佳临界值

33.627pg/ml,敏感度76.7%,特异度85.0%,约登指数0.617。(见表3-5)

表3-5血清及尿骨膜蛋白受试者工作曲线

检验指标 曲线下面95%置信区间 P值最佳临界值敏感度特异度

约登指数 积(AUC) (pg/mD (%) (%)

血清骨膜蛋白 0.789 (0.696, 0.882) 0.000 39.166 96.7 56.7 0.534

尿骨膜蛋白 0.851 (0.760, 0.942) 0.000 33.627 76.7 85.0 0.617

图3-6血清和尿骨膜蛋白的ROC曲线

第四章讨论

过敏性紫瘢的基本病变是弥漫性血管炎,当累及到肾脏时发展为紫瘢性肾炎。紫 瘢性肾炎病理改变可表现为系膜增生、微小病变、局灶性肾炎以及弥漫增殖性肾炎伴 新月体形成等血管炎表现。人们现在对于紫瘢性肾炎的发病机制的研究仍处于探索阶 段,有研究发现紫瘢性肾炎患儿体内循环免疫复合物水平较高[32-36],因此,一般认为 紫瘢性肾炎是一种免疫复合物介导的疾病。这些循环免疫复合物可沉积于肾系膜区, 通过选择性凝集素途径激活补体系统,导致巨噬细胞和淋巴细胞等细胞的增殖,以及 炎症和促纤维化细胞因子和趋化因子的产生,这些因子在系膜细胞的增殖、基质的扩 张和炎症反应中起着关键作用[37]o另外,有研究表明,紫瘢性肾炎患儿体内会有大量 单核细胞和巨噬细胞产生,经抗体和细胞介导的免疫反应在肾小球及肾间质产生浸 润,并释放大量炎症介质和细胞因子,促进炎症的发生,同时也参与了肾损伤的发生 [38]o过敏性紫瘢是一种全身性小血管炎症,紫瘢性肾炎患儿肾小血管同样会发生损 伤,造成肾脏有效毛细血管密度降低,肾血流不足导致肾脏慢性缺血,同时肾间质炎 性细胞浸润,进一步导致了肾间质纤维化的发生[39'40]o而且,由于慢性炎症的刺激, 一些促纤维化因子如TGF-P逐渐被分泌,促进了肾间质纤维化和肾小球硬化的发生, 甚至造成新月体的形成,最终导致肾衰竭。

骨膜蛋白属于TGF-B诱导蛋白的超家族。它存在于富含胶原蛋白的组织中,例如 那些经受机械应力条件的组织,包括牙周韧带,骨膜和心脏瓣膜⑷],并且在损伤后在 几种组织中高度表达[任45]。骨膜蛋白直接与细胞外基质组分相互作用,并通过激活赖 氨酰氧化酶促进胶原蛋白交联[%47]。通过骨膜蛋白刺激胶原纤维形成保持了 ECM的完 整性并影响结缔组织的生物力学特性[41賂49]。然而,骨膜蛋白的过度或持续表达与器 官纤维化有关[爼50亠]。骨膜蛋白含有高度保守的FAS1结构域,使其可作为特异性整联 蛋白。骨膜蛋白与其整联蛋白受体结合刺激组织修复进而形成纤维化的途径,包括 EMT,细胞增殖,存活和基质产生【42,49,55-60]。近年来,骨膜蛋白正在成为肾纤维化的标 志物和治疗靶点[61'65]o在多囊性肾病模型中,由于肾囊肿扩张导致慢性损伤,骨膜蛋 白异常的高表达导致细胞增殖、囊肿扩张,最终导致肾纤维化[碍。5/6肾切除术后远端 小管中岀现新生骨膜蛋白表达[绚,肾小球损伤后,在肾小球丛、血管极、鲍曼囊和间 质纤维化区域也岀现了骨膜蛋白表达增加[河。另外,骨膜蛋白作为细胞外基质蛋白和 基质细胞蛋白的双重功能对于炎症的发生也很重要,尤其是对于过敏性炎症。骨膜蛋 白沉积在炎症部位显示纤维化,而它作为基质细胞蛋白激活免疫细胞和非免疫细胞, 进一步加剧炎症。我们发现,骨膜蛋白在许多慢性炎症性疾病,如哮喘a】、特应性皮 炎(AD)⑹]、嗜酸性慢性鼻窦炎/伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎(CRSWNP)[网过敏性结 膜炎的上皮下区域[何高度表达,并且在这些疾病的发病机制中发挥重要作用。

本研究发现,HSPN组血清骨膜蛋白水平高于HSP组,差异有统计学意义,HSP组 血清骨膜蛋白水平高于正常对照组,差异具有统计学意义,提示血清骨膜蛋白可能参 与了过敏性紫瘢及紫瘢性肾炎的发生,且在紫瘢性肾炎中水平更高。过敏性紫瘢中血 清骨膜蛋白的升高机制目前尚不清楚,然而我们在许多过敏性炎症性疾病,如特应性 皮炎[67]、嗜酸性慢性鼻窦炎[68]等疾病中观察到血清骨膜蛋白明显升高,血清骨膜蛋白 与哮喘[砂、持续嗜酸性气道炎症和哮喘加重El的高发生率有关,而且还发现嗜酸性肉 芽肿合并多血管炎与血清骨膜蛋白存在相关性门2]。由此可以拓展到过敏性紫瘢,当机 体产生免疫炎症反应,促进小血管内皮细胞受损,产生的促炎因子如IL-4、IL-13刺激 骨膜蛋白产生并释放入血中,造成血清骨膜蛋白升高。国外关于骨膜蛋白在肾脏疾病 中的研究主要集中于组织及尿液中,在血清中的研究较少,在国内,何海琼⑴]关于血 清骨膜蛋白在IgA肾病中进行了研究,发现血清骨膜蛋白有可能成为潜在的预测IgA肾 病病理改变及预后的生物标志物;李艳宇阳]关于血清骨膜蛋白在慢性肾脏病中进行了 研究,发现血清骨膜蛋白水平的增加可以早期反应慢性肾脏病肾损伤、评估肾功能, 对评价慢性肾脏疾病进展有一定临床意义;与其研究结果相似,我们认为血清骨膜蛋 白可能参与了紫瘢性肾炎的发生,推测当机体发生炎症免疫反应时,刺激肾血管平滑 肌细胞及纤维化的肾组织产生大量骨膜蛋白释放入血,也可能由于肾脏发生炎症时, 肾小血管遭到破坏造成肾脏缺血、缺氧,刺激肾血管平滑肌细胞产生骨膜蛋白释放入 血。

本研究通过对HSP组、HSPN组和正常对照组尿骨膜蛋白的表达水平研究,发现 HSPN组与HSP组、正常对照组相比升高,差异有统计学意义,提示尿骨膜蛋白是反 映紫瘢性肾炎肾损伤的敏感指标,与紫瘢性肾炎的发生有关。有研究表明[绚,蛋白尿 较非蛋白尿肾疾病患者的尿中骨膜蛋白/肌酹比值明显升高,因为肾小球滤过屏障功能 不全导致尿中骨膜蛋白排泄。SatirapojB^等发现5/6肾切除术后尿骨膜蛋白增加,他 们认为骨膜蛋白通过小管上皮细胞的残余分泌能力或通过退化的脱落细胞的直接释放 进入尿液,但很难得出明确的结论说明不是由于肾小球基底膜损伤致使通透性改变, 造成骨膜蛋白从高浓度的血清中漏出。尿骨膜蛋白在紫瘢性肾炎中研究尚少见,拓展 至紫瘢性肾炎,可以推测当过敏性紫瘢患儿发生肾损害时,受损的肾组织骨膜蛋白被 诱导大量表达,当肾小球滤过屏障功能受损造成基底膜通透性改变,通过肾小管分泌 或者表达有骨膜蛋白的细胞脱落至尿液中造成尿骨膜蛋白的增加,然而这需要进一步 对骨膜蛋白进行标记后的过滤检测才能证实。另外,IgA肾病与紫瘢性肾炎在临床表 现、病理表现有一定相似性,人们推测两者在发病机制可能一致,Hwang JH〔25]等对大 量的IgA肾病患者进行了研究发现IgA肾病患者尿中有骨膜蛋白的表达,且高尿骨膜 蛋白浓度与肾纤维化程度相关,提示骨膜蛋白可能是肾纤维化的早期标志物,也是评 价肾损伤和预测IgA肾病预后的一种有前途的尿生物标志物,我们已经发现尿骨膜蛋 白与紫瘢性肾炎肾损伤有关,这与Hwang JH等研究结果相似,可以推测紫瘢性肾炎 也会与IgA肾病肾脏发生相似的病变过程,随着肾损伤越重甚至纤维化程度越高,尿 中骨膜蛋白的浓度也会越高,当然这需要经过对紫瘢性肾炎患儿随访并进行病理活检 来进一步证实。

另外,本研究对血清及尿骨膜蛋白与临床指标肌酹、尿素、胱抑素C、24h尿蛋白 定量、人尿微量白蛋白进行相关性分析,发现尿骨膜蛋白与人尿微量白蛋白、24h尿蛋 白定量相关,血清骨膜蛋白与人尿微量白蛋白相关,提示血清及尿骨膜蛋白在一定程 度上可以反映疾病的严重程度。既往人们发现在高血压肾病模型中骨膜蛋白与24小时 尿蛋白定量呈正相关[呵,我们的研究结果与其一致,然而还有一些研究表明在慢性同 种异体肾病患者中尿骨膜蛋白与肌酹呈正相关⑹],我们的研究结果与其不相符,考虑 可能因为接受研究的紫瘢性肾炎患儿肾损伤尚未达到一定程度,而肌酹只有在人体肾 脏大部分受损,肾小球滤过率下降比例较大时,肌酹升高的情况才能显现出来,也可 能与本次实验选取的样本量不够大有一定的关系。另外,尿骨膜蛋白与人尿微量白蛋 白、24h尿蛋白定量相关,然而血清骨膜蛋白与人尿微量白蛋白相关,这种差异的出现 是否与骨膜蛋白和过敏性紫瘢、紫瘢性肾炎的病程、病情程度有关,需要大样本及多 节点的研究来进一步证实。

HSPN组血清及尿骨膜蛋白高于HSP组,且血清骨膜蛋白与人尿微量白蛋白呈正 相关,尿骨膜蛋白与24h尿蛋白定量、人尿微量白蛋白呈正相关,提示骨膜蛋白能够 反映紫瘢性肾炎肾损伤,本实验中血清骨膜蛋白曲线下面积(AUC)为0.789,尿骨膜 蛋白曲线下面积(AUC)为0.851,与血清骨膜蛋白相比,尿骨膜蛋白的AUC更高, 说明骨膜蛋白对紫瘢性肾炎的发生有一定的诊断学意义,且尿骨膜蛋白对紫瘢性肾炎 的意义更大。血清骨膜蛋白的灵敏度高(96.7%),但特异性稍差(56.7%),而尿骨 膜蛋白的灵敏度较血清骨膜蛋白(76.7%)稍差,但其特异度与血清骨膜蛋白相比 (85.0%)高,而这与前面我们得出的血清骨膜蛋白与较敏感的人尿微量白蛋白相关, 而尿骨膜蛋白与体现肾损伤的指标24h尿蛋白定量、人尿微量白蛋白相关相符。血清 骨膜蛋白ROC曲线中最佳临界值为39.166pg/ml,当过敏性紫瘢患儿血清骨膜蛋白高 于39.166pg/m 1时,需警惕可能会有肾损伤的发生,尿骨膜蛋白ROC曲线中最佳临界 值为33.627pg/ml,当尿骨膜蛋白高于33.627pg/ml,也可能出现肾损伤的发生,所以当 过敏性紫瘢(非肾炎型)患儿检测出血清骨膜蛋白高于39.166pg/ml,或者尿骨膜蛋白 高于33.627pg/ml时,或者两项均高于最佳临界值的过敏性紫瘢(非肾炎型)患儿后期 有进展为紫瘢性肾炎的风险,然而由于时间原因,本次实验未能对所研究的患儿进行 随访工作,但这不失为一个很好的研究方向,通过对血清及尿骨膜蛋白水平超过最佳 临界值的过敏性紫瘢(非肾炎型)患儿进行随访,我们可以验证高血清及尿骨膜蛋白 是否可能是造成过敏性紫瘢患儿肾损伤的高危因素,通过定期随访我们也可以评估骨 膜蛋白对紫瘢性肾炎患儿预后情况。

综上所述,通过对急性期过敏性紫瘢及紫瘢性肾炎血清及尿骨膜蛋白水平的测 定,我们发现,骨膜蛋白在疾病发生早期即升高,且与早期肾损伤敏感指标人尿微量 白蛋白存在相关性,提示骨膜蛋白可能成为早期监测肾损伤的生物学指标。此外, HSPN组血清骨膜蛋白与HSP组相比有统计学差异,HSP组与正常组相比有统计学差 异;尿骨膜蛋白在HSPN组与HSP组及正常组有统计学差异,而HSP组与正常组无统 计学差异,提示骨膜蛋白在全身和局部均发挥其生物学作用,与血清骨膜蛋白相比, 尿骨膜蛋白可能是更好的特异性肾损伤的生物标志物,这与我们得出的尿骨膜蛋白在 紫瘢性肾炎中特异度更高这一结论相符。

由于本次实验所选用的样本量较小,未能形成大样本量的研究,且仅取急性期这 一个时间节点、未行病理活检,不能通过多个节点观察紫瘢性肾炎患儿骨膜蛋白的变 化趋势及与疾病发展的关系,所以,未来关于不同节点紫瘢性肾炎患儿体内骨膜蛋白 水平变化趋势的研究以及不同病理分级的紫瘢性肾炎与骨膜蛋白水平之间关系的研究 将会是我们更好的研究方向。

第五章结论

  1. 尿骨膜蛋白在紫瘢性肾炎中明显升高,但在过敏性紫瘢(非肾炎型)中无明显升 高,提示其是反映紫瘢性肾炎肾损伤的敏感指标。
  2. 血清骨膜蛋白参与了过敏性紫瘢及紫瘢性肾炎的发生,在紫瘢性肾炎中水平更高。

研究的优缺点及展望

  1. 虽然国内外关于骨膜蛋白与肾脏疾病的研究较常见,但关于骨膜蛋白与儿童 HSPN关系的研究较少,探究其与儿童紫瘢性肾炎关系对紫瘢性肾炎预测、诊疗有较大 意义,而且骨膜蛋白与儿童其他肾脏疾病乃至其他系统疾病的发生发展是否有关,值得 我们去探索。
  2. 本次实验针对血清及尿骨膜蛋白与紫瘢性肾炎的研究,但并未对紫瘢性肾炎患儿 进行肾脏穿刺活检,不能对患儿肾脏损伤的情况进行病理分级,从而未能对紫瘢性肾炎 患儿不同病理分级与骨膜蛋白水平之间的关系做进一步的研究。
  3. 本次实验所采集的样本量不够大,未能形成一定规模的大样本研究,所取得的结 果仍需进一步大样本资料的积累来进行验证。
  4. 本次实验未能对研究对象的长时间反复随访,未能观察到骨膜蛋白与紫瘢性肾 炎疾病进展的关系,未来我们可以建立完善的随访系统,进一步研究骨膜蛋白与紫瘢 性肾炎的疾病进展、缓解及转归的关联。

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综述

骨膜蛋白在肾脏疾病中的研究进展

摘要:骨膜蛋白是一种基质蛋白,多出现于骨膜和牙周韧带中。近年来,人们发 现它与多种肾脏疾病如多囊性肾病、高血压肾病、糖尿病肾病以及IgA肾病的发生发 展存在一定的相关性,本文针对骨膜蛋白在各种肾脏疾病的发生、发展作用进行综 述。

关键词:骨膜蛋白,肾损伤,纤维化

骨膜蛋白是基质细胞蛋白家族的一员,最初在成骨细胞中被发现。参与了细胞的 存活、增殖、迁移和分化〔I⑷。它参与了多种疾病的发生和发展,包括心脏胚胎发生和 成人疾病、转移、肿瘤抑制⑸和增殖性糖尿病视网膜病变⑹。这些组织中的证据表 明,骨膜蛋白可能在组织重塑〔"I和心血管系统疾病中发挥基础性作用[9-11]。在肾脏疾 病方面的研究相对较少,近几年人们逐渐将目光转移到肾脏疾病方面上来。

1.骨膜蛋白的结构及其特点

骨膜蛋白(periostin)是从小鼠成骨细胞系制备的cDNA文库筛选MC3T3-E1是否 存在特异性表达的过程中发现的M2]。这组cDNA被测序编码一种称为成骨细胞特异性 的蛋白质因子2 (OSF-2),其中包含了 811个氨基酸,这些氨基酸之间通过二硫键相 互连接,在细胞黏附中其重要作用。后来,人们逐渐发现该蛋白多出现在骨膜和牙周 韧带中,所以它又被重新命名为骨膜蛋白W 骨膜蛋白有一个典型的信号序列,分别 是参与蛋白质之间相互作用的富含半胱氨酸的结构区域,四重复区域和C端区域,其 中前两者又被分别称为EMI结构域和FSA-1结构域。但其缺乏典型的跨膜区。最初在 昆虫中鉴定,骨膜素的四重复区域与轴突导向蛋白FAS1具有同源性,其含有允许整 合素和糖胺聚糖在体内结合的序列,根据其与fasciclinl (FAS1)的同源性,将骨膜蛋 白归属于fasciclins家族。与FAS1具有同源性的蛋白质包括卩ig-h3, stablin I和II, MBP-70, Algal-CAM, periostin 和 periostin 样因子 1 和 2。在 N 端,periostin 具有 EMI结构域,约75个氨基酸的小的富含半胱氨酸的模块。EMI结构域首先以其存在于 EMILIN家族的蛋白质中命名,并且与其他结构域相关,例如Clq,层粘连蛋白型 EGF样,FN3, WAP, ZP或FAS1[14]O C端区域易发生基因插入和缺失,从而导致转 录过程中出现选择性剪接,而形成骨膜蛋白异构体。由于鼠和人骨膜蛋白具有同源 性,有89.2%氨基酸相同,成熟形式下90.1%相同,鼠periostin基因位于3号染色 体,人periostin基因位于13q染色体。

2.骨膜蛋白与多囊肾病

由于大量充满液体的囊肿的形成和逐渐扩张而导致的进行性肾脏增大是常染色体显 性多囊肾病(ADPKD)的主要病理生理特征[⑸。肾囊肿是一种良性肿瘤,在多囊性肾 病中,肾囊肿的进行性增大与肿瘤有共同的特点,包括异常细胞增殖、细胞外基质沉 积、紊乱[⑹,血管生成增加间质纤维化。

Quante M T等两通过免疫组化法在人多囊肾肾脏的囊肿上皮细胞和邻近的细胞外 基质中发现骨膜蛋白的存在。通过实验发现,骨膜蛋白可以促进细胞周期进程,并且 骨膜蛋白通过其对a v-整合素受体的作用促进囊肿上皮细胞大量增生,人多囊肾囊肿 衬里细胞中的骨膜蛋白高度过表达,并在多囊肾肾脏的间质和囊肿液中蓄积,造成囊 肿不断扩大。av-整合素的高表达可能导致ADPKD囊性细胞对骨膜蛋白的促分裂作用 变得敏感,因此骨膜蛋白作为一种自分泌因子,只促进已建立的囊肿的生长。av-整合 素的过度表达及其对骨膜蛋白的刺激可能激活潜伏期TGF-P,从而增加包括骨膜蛋白 在内的细胞外基质的产生,这样就会造成囊肿的不断增大还可能会造成肾脏的纤维 化,进而造成肾脏结构的变化及肾功能的下降甚至丧失。

Wallace D P[⑼等用pcy/ pcy小鼠(一种人类nephTonophthisis 3型直系同源的模型, 肾囊肿以节段性扩张的形式形成)与年龄匹配的野生型小鼠肾脏相比较,发现pcy/pcy 小鼠肾脏中的骨膜蛋白mRNA和蛋白质明显升高,证实了骨膜蛋白在缓慢进行性肾囊 性疾病模型中过度表达。同时,在另一种囊性疾病动物模型jck/jck小鼠中也发现了同样 的现象。我们已经知道,人常染色体遗传性多囊性肾病囊肿上皮细胞中的骨膜蛋白与 正常人肾细胞相比高表达[19】。现在,骨膜蛋白再次被发现高表达于几种囊性疾病动物 模型中,由此我们可以得出一个结论无论潜在的基因如何突变,在人常染色体遗传性 多囊性肾病和几种囊性疾病动物模型中均过度表达,这表明异常的骨膜蛋白表达是囊 性肾病的一般特征。

Wallace D P[19]取敲除 periostin (Postn)基因的 pcy / pcy 小鼠 pcy/pcy: Postn -/ - 小鼠与pcy/pcy: Postn +/ +小鼠肾脏切片进行显微镜检查,发现与pcy/pcy: Postn + / +小鼠相比,来自pcy/pcy: Postn 小鼠的肾脏显示出囊性区域的显著减少,发现

骨膜蛋白(Postn)表达的丧失使囊肿数量和总囊面积均减少了,证明了通过增加囊肿 数量和总囊面积是骨膜蛋白促进多囊性肾病的囊肿增长的方式之一。

骨膜蛋白是通过促进体内囊性细胞增殖来促进PKD进展的重要因素。我们以前已 经了解到,骨膜蛋白结合a v-整合素并激活整合素连接激酶(ILK),促进人ADPKD 细胞增殖[冈。骨膜蛋白基因的缺失减少了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(niTOR)的活 性,mTOR是一种信号通路,涉及肾脏上皮细胞的异常增殖和人类常染色体显性遗传 性多囊肾,常染色体隐性遗传性多囊肾和多囊肾动物模型中囊肿的形成][20知。此外, 已知mTOR通过蛋白激酶(AKT)依赖的结核菌素磷酸化(TSC2)在整合素连接激酶 (ILK)的下游被激活㈣。这些结果表明periostin-ILK-AKT-mTOR信号轴可能是 periostin刺激的囊肿细胞增殖的重要机制,因此骨膜蛋白可以作为一种新型的囊肿因子 调节多囊肾细胞增殖及多囊肾的发展。

骨膜蛋白通过刺激多囊性肾病模型中小鼠的囊肿上皮细胞增殖和间质纤维化,造 成多囊性肾病的肾功能的下降,进而发展为肾衰竭,同时也缩短了小鼠的生存年限。 由此可以推测,骨膜蛋白与多囊性肾病的发生、发展乃至预后有着密切的联系。

  1. 骨膜蛋白与高血压肾病

高血压肾损害的形态学改变包括硬化和细胞外基质(ECM)的积累,其特征最终 导致肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化。

Guerrot等〔绚在实验性高血压肾病模型中就骨膜蛋白对实验性高血压肾病的关系进 行了研究,对来自进展组及可逆转组的动物进行了分析,结果发现在180个涉及纤 维、细胞外基质调节和炎症的基因均显示了表达上调,而骨膜蛋白是其中过量表达最 高的,由此初步可以推测骨膜蛋白可能与高血压肾病有关。而且与可逆转组比,细胞 外基质蛋白骨膜蛋白在进展组中的表达水平显著升高,表明骨膜蛋白可能在评估高血 压肾病疾病进展方面提供依据。另外,骨膜蛋白与肾脏疾病功能相关的标志物血浆肌 酹、蛋白尿、肾血流量之间存在较强的相关性,而且这种相关性即使在收缩压变化的 情况下仍然成立,说明骨膜蛋白与高血压肾病的肾损伤相关,但与高血压因素无关。 综上所述,我们可以推测骨膜蛋白可能成为评估高血压肾病疾病进展、肾损伤程度的 敏感的标志物。

经组织学纤维化评分分布显示,根据实验性高血压肾病的骨膜蛋白分布,进展组 和可逆转组在血管纤维化方面的差异最明显,表明骨膜蛋白可能与肾损伤部位细胞外 基质积聚的病理生理学有关0]。

Vethe等mi发现在高血压肾病大鼠模型的肾皮质中,骨膜蛋白是上调幅度最大的蛋 白质之一,仅骨膜蛋白的相对丰度就可以明确高血压肾病组和对照组的分类,说明骨 膜蛋白可能成为诊断高血压肾病潜在的生物学标志物。而且经免疫组化证实,高血压 肾病模型中,骨膜蛋白主要富集于肾纤维化血管周围,可以推测骨膜蛋白与肾脏纤维 化存在关联。

  1. 骨膜蛋白与糖尿病肾病

糖尿病肾病是糖尿病晚期严重的并发症,如果不能及时作出诊断并给予相应的治 疗,则会造成病情的迁延乃至恶化,甚至可能会增加糖尿病患者的死亡率。

Satirapoj B©】等将随机收集的2型糖尿病肾病患者肾组织进行骨膜蛋白染色,发现 这些糖尿病肾病患者肾脏切片显示骨膜蛋白多表达在结节性肾小球硬化伴小动脉玻璃 样变性、间质纤维化、肾小管萎缩区域。此外,在结节性硬化肾小球和周围纤维化区 域以及缺血型肾小球的包曼氏囊内,也可以见到弥漫的骨膜蛋白表达,骨膜蛋白在萎 缩或者非萎缩的肾小管上皮细胞也可以见到有表达,由此可以推测,糖尿病肾病患者 肾脏中,骨膜蛋白的表达不仅局限于病理性的肾小管在缺血或者纤维化的肾小球中也 有明显表达。

通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定2型糖尿病肾病患者和健康对照组尿液中 骨膜蛋白的含量,结果发现,健康对照组尿液中骨膜蛋白的水平明显低于正常蛋白尿 型2型糖尿病肾病患者、微量蛋白尿型2型糖尿病肾病患者、大量蛋白尿型2型糖尿 病肾病患者,而且,正常蛋白尿型2型糖尿病肾病患者与其他各型糖尿病肾病患者相 比尿液中骨膜蛋白含量也存在显著性差异0],这不仅可以得出糖尿病肾病患者未出现 明显白蛋白尿之前,已经可以检测出骨膜蛋白表达水平的升高,推测骨膜蛋白可以作 为糖尿病肾病肾损伤的早期标志物的结论,而且还可以看出尿骨膜蛋白在体现糖尿病 肾病病情严重程度方面也有一定的作用。另外,骨膜蛋白还与提示肾功能的经典标志 物蛋白尿、肾小球滤过率等相关0】,表明骨膜蛋白的表达水平可以提示糖尿病肾病肾 脏损伤的程度。尿骨膜蛋白在各阶段诊断中的ROC曲线分析提示尿骨膜蛋白对糖尿病 肾病的诊断具有中高敏感性和特异性0]。提示尿骨膜蛋白可能将成为一种新的肾脏标 志物,并且可以作为2型糖尿病正常蛋白尿患者肾损伤的早期生物标志物,尿中骨膜 蛋白的测定可为2型糖尿病患者提供早期诊断和早期干预措施。

综上所述,不论组织骨膜蛋白还是尿骨膜蛋白均有可能成为糖尿病肾损伤的生物 标志物。

  1. 骨膜蛋白与狼疮性肾炎

狼疮性肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)患者最严重的并发症之一。免疫复合物沉 积通过激活免疫通路,释放与肾脏炎症有关的细胞因子、趋化因子和生长因子,成为 狼疮性肾炎发生发展的主要原因[绚。临床上LN表现为蛋白尿、肾病综合征、颗粒 状、镜下血尿、肾功能减退。肾纤维化是最终发现的导致肾损伤慢性炎症的常见途 径,表现为细胞外基质成分的积累,导致正常结构的破坏,肾功能丧失,最终进展为 终末期肾功能衰竭。

Wantanasiri[29]等对42例狼疮性肾炎患者进行了研究,发现狼疮性肾炎患者发现在 肾小管上皮细胞、肾小管萎缩等病理性肾小管中有较多骨膜蛋白表达,可以推测骨膜 蛋白有望成为检测肾小管损伤的生物标记物。按骨膜蛋白染色评分进行分组,对高评 分组和低评分组患者的SCr和eGFR进行统计学分析发现两组间差异有统计学意义, 提示骨膜蛋白对肾病进展的预后有较大的作用。

  1. 骨膜蛋白与IgA肾病

IgA肾病(IgAN)是全球最常见的肾小球肾炎之一,也是终末期肾病(ESRD)的 常见病因削。在韩国,它约占所有原发性肾小球肾炎的一半的,IgA肾病(IgAN) 代表了各种临床特征,终身轻度血尿伴或不伴蛋白尿、诊断后肾功能迅速下降或丧 失。

Hwang JH^等对一组IgA肾病的患者进行了随访发现,在终末期IgA肾病患者 肾肾活检中发现了较高的upostn/cr水平,而这些患者的肾小球滤过率均明显下降。而 在如间质炎症和透明小动脉硬化等肾病理活检发现较高的骨膜蛋白的表达,我们可以 推测骨膜蛋白的表达与IgA肾病的预后相关。他们还发现较高尿骨膜蛋白水平反映了 组织中骨膜蛋白高表达,并与肾功能不良相关。尿骨膜蛋白是检测组织骨膜蛋白表达 和预测肾脏预后的有用工具。

总结

骨膜蛋白参与了很多疾病的发生及发展,尤其是近几年骨膜蛋白作为一种重要的 因子在肾脏疾病方面研究逐渐被人们所关注,虽然人们对骨膜蛋白在肾脏疾病的研究 有了一些进展,但关于很多机制方面和各种通路的研究仍不够深入,因此,骨膜蛋白 在肾脏疾病方面的研究未来仍有很广阔的前景。

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致谢

三年的研究生时光如白驹过隙,回想起这三年的点点滴滴如一幕幕精彩的画幕呈 现在我眼前,感谢河北大学附属医院儿科老师和同事们对我的帮助。

首先,我要向我的导师柏金秀主任医师表达我最衷心、最诚挚的感谢,在三年的 学习生活中,柏金秀老师勤勤恳恳,做事一丝不苟,为我们树立了良好的榜样,在临 床工作中她不仅教会了我大量的临床知识,还教会了我面对生命该有的敬畏。在科研 方面,她用敏捷的思维让我叹服。

感谢魏继红老师在研究生论文写作中不厌其烦的指导与修改,她让我领悟到,一 个科研人员应具备严谨的态度、强大的逻辑思维能力。感谢张磊老师带领我们踏进了 科研的大门,如何选题,从如何查文献,如何采集标本,如何构思等等。

我还要感谢儿科姬静璐主任、谢雪兰主任、石瑁主任、孙东明老师、李晨老师、 王玉老师、王博玉老师、袁博老师、贾浩老师、湛要五老师等儿科以及其他同学们在 临床工作和生活中给予我的帮助,让我在外求学的日子里感到无比温暖。

另外,感谢田瑞师兄和何海鹏师兄,在我论文写作期间为我解惑并提供无私的帮 助。

感谢检验科的郑海亮师兄、核医学科石宁老师、霍梓铭老师等提供给我无私的帮 助。

同时,感谢我的家人、朋友,你们在我最无助的时候给予我心灵上的支持,让我 一步一步努力度过各种难关。

感谢各位答辩委员会的专家以及论文评审专家对于我的论文提出的宝贵意见。

最后感谢各位曾给予我帮助的老师、同学、朋友、家人,我的每一分收获里都融 入了你们的支持与帮助。