褪黑素在人颗粒细胞调控StAR生成的机制研究论文

2020年8月27日16:39:55褪黑素在人颗粒细胞调控StAR生成的机制研究论文已关闭评论

褪黑素在人颗粒细胞调控StAR生成的机制研究论文

摘要

性激素属于类固醇當体类激素,主要包括雌激素、雄激素和孕激素,成年 女性体内性激素的分泌呈现周期性变化。性激素的生成过程包括一系列复杂的 酶促反应。在反应的第一个酶促步骤中,类胆固醇作为合成类固醇當体类激素 的原料之所以能够实现从线粒体外膜至线粒体内膜的转运,主要是受到了类固 醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory, St AR)的作用。这是 當体类激素生成的重要步骤,也是限速步骤。因此StAR被称为类固醇激素生成 的限速酶。在此限速步骤之后,受到胆固醇侧链裂解酶(The cholesterol side-chain cleavage enzyme, P450scc)的作用,进入线粒体内的胆固醇则会转变为孕激素、 雄激素和雌激素等性激素合成的前体物质——孕烯醇酮。

褪黑素(N■乙酰・5冲氧色胺,Melatonin)是由松果体分泌的一种卩弭朵类神 经内分泌激素,参与很多重要的生理功能,并且能够调控与昼夜节律和生殖相 关的多种中枢和外周活动。植物与动物中均存在褪黑素受体(Melatonin receptor, MT),在哺乳动物中已被克隆的褪黑素膜表面受体为MT1 (又称Mel la)和 MT2(X称Mel lb),均为具有7个跨膜段的G蛋白耦联受体。褪黑素通过MT 介导 cAMP (cyclic adenosine monophosphate)、IP3 及 cGMP (cyclic guanosine monophosphate)信号转导通路参与相应的生理病理过程。生殖系统中褪黑素受 体存在于子宫、卵巢和乳腺上皮细胞、黄素化的颗粒细胞。褪黑素具有抗氧化 和抗凋亡的作用,在人卵泡液中高表达,能够刺激卵母细胞成熟促进因子的启 动和胚泡的破裂。此外,它还参与下丘脑■垂体■性腺轴功能和生殖内分泌活动的 调节。大量研究表明褪黑素对生殖系统的作用因物种种类、生理状态不同而表 现出抑制、促进或无作用的多重性。

生殖系统中已知的参与调控StAR表达的主要信号通路为cAMP-PKA (Cyclic adenosine monophosphate/ Protein kinase A)信号通路。除此之外,也有 很多其他的激素、生长因子或细胞因子可以通过激活不同的胞内信号通路参与 调控StAR的表达。其中在颗粒细胞中LH/hCG (Luteinizing hormone/ Human chorionic gonadotrophin)可以调控 StAR 的表达。表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)相关家族因子及受体在生殖系统广泛分布,与多种生殖过程相关。 其中体内及体外实验均已经证实,AREG (Amphiregulin)作为LH/hCG峰后卵 泡液内表达量最多的EGF家族成员,具有LH样作用,即促进卵母细胞成熟、 促进卵丘复合体(Cumulus oocyte complex, COC)扩张、通过调控环氧合酶・2

(Cyclooxygenase-2, COX-2)的表达调控排卵的发生。已有的研究也证实了 AREG同样在StAR的生成过程中起着重要的作用。其中,在人颗粒细胞中, AREG已被证实可以通过与表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)结合而活化ERK1/2信号通路上调StAR的表达。

褪黑素及其受体在LH/hCG峰后也急速上升,且同样可以促进卵母细胞成 熟、促进排卵。此外,褪黑素已被证实参与调控cAMP-PKA信号通路。但其是 否影响StAR的表达以及褪黑素与AREG是否具有协调作用来一起参与调控 StAR的表达尚不十分清楚。因此,本文旨在研究褪黑素是否参与调控StAR表 达以及是否与AREG具有协调作用来一起参与调控StAR的表达,并进一步深入 研究其中可能的作用机制。

目的:

证实在人颗粒细胞中,褪黑素是否参与调控StAR表达生成及其调控机制以 及褪黑素是否与AREG具有协调作用可以一起参与调控StAR的表达及其中可能 的作用机制。

方法:

我们以人原代颗粒细胞为研究模型,探究褪黑素是否参与调控StAR表达生 成及其中相关的调控机制。主要通过实时荧光定量PCR (Real time-qPCR, RT-qPCR)和western blotting技术对颗粒细胞中RNA和蛋白的表达水平进行了 检测。对卵泡液内褪黑素的浓度以及血清内孕激素的浓度进行了检测,分别应 用 了酶联免疫吸附实验(EnzymeJinked immunosorbent assay, ELISA)、电化学 发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)的检测方法。

结果:

在人颗粒细胞中,褪黑素可以增强StAR表达,这种的上调作用具有时间与 剂量依赖性且这种上调作用可被其受体抑制剂Luzindole所阻断;褪黑素可通过 活化PKA/CREB信号通路调控StAR的表达,且这种调控作用可被PKA抑制剂 H89所阻断;褪黑素可增强AREG作用下StAR的表达;褪黑素通过与EGFR 结合活化ERK1/2信号通路增强AREG作用下StAR的表达;褪黑素对AREG的 这种协同增强作用可被EGFR抑制剂AG1478所阻断;此外,卵泡液内褪黑素 的浓度与hCG日、取卵日(Oocyte pick up, OPU)血清内孕激素的浓度存在正 相关关系。

结论:

  1. 在人颗粒细胞中,褪黑素可通过与其受体MT结合活化PKA/CREB信号 通路直接调控StAR的表达;
  2. 在人颗粒细胞中,褪黑素可通过与EGFR结合活化ERK1/2信号通路协 同增强AREG作用下的StAR表达;
  3. 卵泡液内褪黑素的浓度与血清内孕激素的浓度呈正相关。

关键词:褪黑素StAR 双调蛋白 人颗粒细胞PKA/CREB EGFR

Abstract

Sex hormones including estrogen, testosterone and progesterone, belong to steroid hormones. The endocrine profile of normal female changes periodically, under the stimulation of gonadal axis. Steroidogenesis is a complex process that involves multiple enzymatic reactions. Once free cholesterol has been transported to the mitochondria, it will be moved from the outer to the inner mitochondrial membrane by steroidogenic acute regulatory protein (StAR), which has been well-recognized as the key regulatory protein involved in the rate-limiting step of steroidogenesis. On the inner mitochondrial membrane, cholesterol is catalyzed to pregnenolone by the cholesterol side-chain cleavage enzyme complex. Pregnenolone is transferred to the cytoplasm and is then catalyzed to progesterone by 3(3-hydroxysteroid dehydrogenase (3(3-HSD). Progesterone (P4) is the precursor of other steroid hormones.

Melatonin (N-acety 1-5 -methoxytryptamine) is a compound extracted from pineal glands and peripheral nerve. As a neurohormone, melatonin has numerous important physiological functions and regulates varieties of central and peripheral actions related to circadian rhythms and reproduction. Melatonin's activity is mostly performed through membrane-bound receptors MT1 and MT2, which are members of the superfamily of G protein-coupled receptors. Earlier studies have demonstrated that MT1 and MT2 are widely distributed in the female reproductive system, such as the uterus, ovaries, the epithelial cells of the mammary gland, and the granulosa cells. The broad-spectrum free radical scavenging capacity and antioxidant capacity of melatonin play an important role in the reproductive system. Melatonin may directly affect ovarian function. It also participates in the regulation of hypothalamic- pituitary-gonadal axis function and reproductive endocrine activity.

The cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A (cAMP/PKA) signaling pathway is a well-defined mechanism for regulating StAR expression in the reproductive system. In addition, many other hormones, growth factors and cytokines can participate in the regulation of StAR expression by activating different intracellular signaling pathways. In granulosa cells, LH/hCG also induces StAR expression. Epidermal growth factor receptor (EGFR) and its ligands are expressed in female reproductive tissues and have been shown to regulate various important reproductive functions. In granulosa cells and follicle fluids, it has been indicated that the mRNA levels and concentrations of AREG, BTC and EREG increase, could induce cumulus-oocyte-complex (COC) expansion, oocyte maturation and COX-2 expression in vivo and in vitro, which is called "LH-like” effect. As the most abundantly expressed EGFR ligand in human follicular, AREG had been indicated can upregulate the StAR expression.

Melatonin also rise rapidly after the LH/hCG peak, and can also promote oocyte maturation and ovulation. Furthermore, melatonin can also activate the cAMP/PKA signaling pathway. However, whether Melatonin mediates the StAR expression and whether it has the synergistic effect with AREG on the upregulation of the StAR expression in human granulosa cells remains unknown. Thus, we aim at exploring whether Melatonin regulate the expression of StAR and defining the underlying mechanism.

Objective:

To investigate the role of melatonin in the regulation of StAR expression, whether it has the synergistic effect with AREG on the upregulation of the StAR expression and the underlying molecular mechanisms in human granulosa cells.

Methods:

Human primary granulose cells were used as the cell model to explore whether melatonin played a role in the regulation of StAR expression and progesterone production. Level of mRNA and protein was measured by RT-qPCR and Western-blotting respectively. The protein levels of Melatonin in follicular fluid were measured by enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA). The levels of progesterone in serum were measured by electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA).

Results:

In human primary granulosa cells, treatment with 0.5mmol/L Melatonin for 24h could promote the expression of StAR expression. Inhibition of MT by Luzindole could abolish Melatonin-induced StAR expression. Moreover, activation of PKA/CREB signaling pathway was participated for Melatonin-induced up-regulation of StAR expression. Inhibition of PKA by H89 could abolish Melatonin-induced StAR expression. Melatonin strengthens the effect of AREG on the upregulation of the StAR expression in human granulosa cells by activating the ERK1/2 signaling pathway. Inhibition of EGFR by AG1478 could abolish its synergistic effect. Follicular fluid Melatonin levels were positively correlated with progesterone levels in serum on hCG day and oocyte-pick up (OPU) day.

Conclusion:

Melatonin mediates StAR expression in primary human granulosa cells through MT and activating PKA/CREB signaling pathway. Melatonin also can upregulate AREG-induced StAR expression by activating the ERK1/2 signaling pathway through binding EGFR.

Key words Melatonin StAR amphiregulin granulosa cells PKA/CREB EGFR

英文缩略词表

AMH Anti-Mullerian Hormone 抗苗勒激素
AREG Amphiregulin 双调蛋白
AC Adenylyl cyclase 腺昔酸活化酶
cAMP Cyclic adenosine monophosphate cAMP
CREB cAMP response element binding protein cAMP反应元件结合蛋白
cGMP Cyclic guanosine monophosphate cGMP
COC Cumulus oocyte complex 卵丘复合体
COX-2 Cyclooxygenase-2 环氧合酶・2
BTC Betacellulin 己胞素
E2 Estradiol 雌二醇
EGF Epidermal growth factor 表皮生长因子
EGFR EGF Receptor 表皮生长因子受体
EREG Epiregulin 表皮调节素
ECLIA Electrochemiluminescence immunoassay 电化学发光免疫分析
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫法
FSH Follicle-stimulating hormone 促卵泡生成素
GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone 促性腺激素释放激素
GnRH-a gonadotropin releasing hormone agonist 促性腺激素释放激素激动剂
Gn Gonadotropin 促性腺激素
GPCRs G protein-coupled receptors G蛋白偶联受体家族
HB-EGF Heparin-binding EGF-like growth factor 肝素结合表皮生长因子样生长因子
HPOA Hypothalamic-pituitary-ovarian axis 下丘脑■垂体■卵巢轴
hCG Human chorionic gonadotrophin 绒毛膜促性腺激素
LH Luteinizing Hormone 黄体生成素
LHRH Luteinizing Hormone Releasing Hormone 黄体生成素释放激素
Melatonin Melatonin 褪黑素
MT1 Melatonin Receptor 1 褪黑素受体1
MT2 Melatonin Receptor 2 褪黑素受体2
MAPK Mitogen-activated protein kinase MAPK
IL-6 Interleukin-6 白介素・6
IVF/ICSI-ET In virto fertilization/intracytoplasmic sperm 试管内受精■胚胎移植/卵胞浆内单
  injection - embryo transfer 精子注射■胚胎移植
OPU Oocyte pick-up 卵巢穿刺取卵术
P450scc Cholesterol side-chain cleavage enzyme 胆固醇侧链裂解酶
  complex  
PL Premature luteinization 过早黄素化
PKA Protein kinase A 蛋白激酶A
RT-qPCR Reverse transcription quantitative real-time 逆转录实时定量PCR
  PCR  
StAR Steroidogenic acute regulatory protein 类固醇激素合成急性调节蛋白
TGF-a Transforming growth factor-a 转移生长因子w
3p-HSD 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 3p-HSD

1前言

褪黑素(N■乙酰・5冲氧色胺,Melatonin)是由松果体分泌的一种卩弭朵类神 经内分泌激素,其分泌受位于视交叉上核(SCN)的内源性昼夜节律生物钟控制, 且受环境中明暗刺激的调节,表现为白天低浓度和夜间高浓度。同时褪黑素能 够调控与昼夜节律和生殖相关的各种中枢和外周活动丄2]。植物与动物中均存在 褪黑素受体(Melatonin receptor, MT),在哺乳中已被克隆的褪黑素膜表面受 体为MT1 (Mel la)和MT2 (Mel lb),均为具有7个跨膜段结构的G蛋白耦联 受体⑶。褪黑素的活性主要通过与膜受体结合进行,其中MT1介导cAMP和IP3 信号转导通路,MT2介导cGMP信号转导通路参与相应的生理病理过程⑷。生 殖系统中褪黑素受体广泛存在于子宫、卵巢、乳腺上皮细胞和黄素化的颗粒细 胞⑵。褪黑素具有抗氧化和抗凋亡的作用,可以直接作为一种强效的抗氧化剂来 清除自由基⑹。褪黑素在人卵泡液中高表达,能够刺激卵母细胞成熟促进因子的 启动和胚泡的破裂⑺。在接受 IVF-ET (In virto fertilization - embryo transfer)助 孕的患者中也检测到大卵泡中的褪黑素浓度高于小卵泡中的褪黑素浓度。目前 对褪黑素调控當体类激素生成的研究主要集中在动物实验,已有的动物体外实 验表明,在猪颗粒细胞中,褪黑素主要通过其膜受体MT2介导类固醇生成⑹。 而在牛颗粒细胞中,褪黑素通过MT1和MT2受体共同刺激孕酮产生⑼。此外, 一些研究表明褪黑素对生殖系统中當体类激素的生成因物种种类、生理状态不 同而表现出抑制、促进或无作用的多重性a】。

类固醇當体类激素在女性生殖过程中具有关键性的调控作用,不仅参与调 控卵泡的成熟及排卵,在妊娠的维持中也起着重要作用Hi]。类固醇當体类激素 的生成包括一系列复杂的酶促反应。其中胆固醇是當体类激素合成的原料,类 固醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory, St AR)将胆固醇由 线粒体外膜转运至线粒体内膜,这是當体类激素生成的第一步,也是限速步骤, 因此StAR被称为类固醇激素生成的限速酶M2]。在限速步骤之后胆固醇进入线粒 体内,在胆固醇侧链裂解酶(The cholesterol side-chain cleavage enzyme, P450scc) 的作用下,胆固醇实现了向孕烯醇酮的转变,因此孕烯醇酮也是合成孕激素、 雄激素和雌激素等其他當体类激素的前体物质2】。因此,StAR对女性生殖生理 活动的调控过程起着至关重要的作用。

cAMP-PKA (Cyclic adenosine monophosphate/ Protein kinase A)信号通路是 调控StAR表达的主要信号通路,在卵巢卵泡的发育和类固醇生成中起关键作用 Hi】。被激活的PKA进入细胞核内可以使特定的调节因子磷酸化。CREB (cAMP response element binding protein)是一种能与cAMP反应元件特异结合的蛋白, 磷酸化反应后可以与特定的基因调控部位结合,从而调控StAR的表达["I。此外, 还有多种信号途径也可以调控StAR的表达。已经证实,在牛的卵泡膜细胞中褪 黑素通过与其受体MT结合活化PI3K/AKT信号通路来调控StAR的表达问。但 在人颗粒细胞中褪黑素是否调控StAR的表达及其作用机制仍不清楚。

cAMP-PKA (Cyclic adenosine monophosphate/ Protein kinase A)信号通路是 调控StAR表达的主要信号通路,在卵巢卵泡的发育和类固醇生成中起关键作用 Z⑴。被激活的PKA进入细胞核内可以使特定的调节因子磷酸化。CREB(cAMP response element binding protein)是一种能与cAMP反应元件特异结合的蛋白, 磷酸化反应后可以与特定的基因调控部位结合,从而调控StAR的表达"1。此外, 还有多种信号途径也可以调控StAR的表达。已经证实,在牛的卵泡膜细胞中褪 黑素通过与其受体MT结合活化PI3K/AKT信号通路来调控StAR的表达口。但 在人颗粒细胞中褪黑素是否调控StAR的表达及其作用机制仍不清楚。

在颗粒细胞中,StAR的表达也受黄体生成素(Luteinizing hormone, LH) / 人绒毛促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)的调控阴。月经中期, LH峰作用于卵巢卵泡膜细胞、颗粒细胞及卵母细胞,促进一些炎症因子、细胞 因子及生长因子的大量分泌,上述因素综合作用引起颗粒细胞黄素化、孕激素 大量分泌、卵母细胞恢复减数分裂、卵丘复合体增生和排卵的发生[19,2。]。其中, 表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)及其受体(EGF receptor, EGFR) 在女性生殖系统中广泛分布,参与调控多种重要的生殖功能S22]。EGF家族成 员主要包括 EGF,双调蛋白(Amphiregulin, AREG),乙胞素(Betacellulin, BTC), 表皮调节素(Epiregulin, EREG),与肝素结合的EGF样生长因子(Heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF)等均能与EGFR结合并使之活化㈡】。其中, AREG是1988年Shoyab等人由12■肉豆蔻酸・13■乙酸佛波醇处理后的人乳腺癌 MCF-7细胞系上清液中提取的,具有促进细胞生长、增殖、转移等生理功能的 EGF家族成员之一Bl。体内及体外实验均已经证实,AREG具有LH样作用, 即促进卵母细胞成熟、促进卵丘复合体(Cumulus oocyte complex, COC)扩张以 及通过调控环氧合酶・2 (Cyclooxygenase-2, COX-2)的表达调控排卵的发生㈤。 已有研究证实在人颗粒细胞中,AREG作为LH/hCG峰后卵泡液内表达量最多的 EGF家族成员,通过与EGFR结合活化ERK1/2信号通路上调StAR的表达宙。 与之相似的是褪黑素及其受体在LH/hCG峰后也急速上升,在人类的颗粒细胞 中褪黑素同样可以上调LH受体的mRNA的表达[27】。此外,与AREG的作用相 似,褪黑素同样可以促进卵母细胞成熟、促进排卵陈]。但在人颗粒细胞中褪黑 素是否与AREG具有协调作用来一起参与调控StAR的表达尚不十分清楚。若此 假设成立,其中的具体机制尚需进一步探究。

综上所述,本文旨在通过建立人原代颗粒细胞的体外模型,探究褪黑素是 否参与调控StAR的表达以及褪黑素是否与AREG在调控StAR的表达上具有协同 作用,并深入研究其作用的分子机制。

2实验材料与方法 2.1实验材料

2.1.1研究对象

本研究的研究对象为在本中心接受试管内受精■胚胎移植/卵胞浆内单精子 注射■胚月台移植 (In virto fertilization/intracytoplasmic sperm injection - embryo transfer, IVF/ICSI-ET)助孕治疗的患者。郑州大学第一附属医院伦理委员会业已 批准通过此次实验,所有参与本次实验的患者也都签署了相关的知情同意书。 患者纳入标准如下:年龄在20-35岁,月经周期规律,BMI: 19-24.9 kg/m2,基 础内分泌正常,染色体正常。排除标准为:合并有PCOS、子宫内膜异位症、糖 尿病或甲状腺疾病等其他基础疾病。

促排方案为标准的长方案,参与研究的对象于上次月经中期开始使用促性 腺激素释放激素激动剂(gonadotropin releasing hormone agonist, GnRH-a)降调, 降调14天后对研究对象的内分泌水平进行检查,如果研究对象的内分泌达标, 即满足双侧卵巢内卵泡直径<5mm,血清E2<50pg/ml, FSH<5IU/1, LH<5IU/1, 子宫内膜厚度<5mm,则针对该研究对象启动相应的促排卵方案。根据卵泡监测 及内分泌的情况调整促排卵药物的剂量,当直径达到了 18mm的卵泡数量有三 个或者以上时,研究对象被注射人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotrophin, hCG)以诱导卵母细胞成熟,注射hCG 36・38h后,我们在超声 的引导下进行经阴道卵巢穿刺取卵手术(Oocyte pick・up, OPU),第一管卵泡原 液用无菌容器收集,剩余的卵泡液用另外的无菌容器收集。其中,颗粒细胞的 分离主要采用的是密度梯度法,其培养则是应用的原代细胞培养方法。

2.1.3实验仪器、耗材

表2.2仪器和耗材

名称 厂家
CO2培养箱 Sanyo日本
25ml、10ml、5ml 移液管 BD Falcon 美国
恒温水浴箱 上海精宏实验设备有限公司中国
-80°C冰箱 Thermo美国
转印套装(即用型) Bio-Rad 美国
电动的移液器 Falcon美国
移液器(lOOOuk 100uk 10uk 200uk 2.5ul) Eppendorf 中国
超纯仪器 Millipore 美国
EP 管(1.5ml、200ul) Axygen美国
离心管(50ml、15ml) Corning 美国
离心机 Thermo中国
Real-Time PCR FAST 7500 Applied Biosystems 美国
PowerPac Universal 电泳系统 Bio-Rad 美国
PCR扩增仪 Applied Biosystems 美国
细胞培养板(96孔、12孔、6孔) Corning 美国
摇床 QILINBEIER 中国
Trans-Blot Turbo的转膜系统 Bio-Rad 美国
4度冰箱 海尔中国
枪头 Axygen美国
电子天平 Sartorius BP21ID 德国
酶标仪 Thermo美国
空气层流的过滤室 苏州净化工程公司
ChemiDoc MP成像软件 Bio-Rad 美国
CHA-2恒温振荡器 苏州威尔实验用品有限公司中国

2.1.4实验试剂配制

  • 颗粒细胞培养液

DMEM/F12 (无酚红),1%抗生素(100 U/mL链霉素+100 U/mL青霉素), 10%胎牛血清(经活性炭/葡聚糖处理过的),储存于4弋冰箱,需要于两周内使 用完毕。

  • lOxTBS液体(杂交膜清洗液体)

浓度为0.20mol/L的Tris-base,浓度为1.41mol/L的NaCl溶液,将PH调 节到7.6,最后使用纯水定容到1L。

  • 10x电泳缓冲液体

0.25mol/L Tris, 0.03mol/L SDS, 1.92mol/L 甘氨酸。

  • 10x转膜缓冲液体

浓度为0.48mol/L的Tris-base,浓度为0.39mol/L的甘氨酸,将PH调节到 9.2,最后用纯水定容到1L。

转膜缓冲工作液体是用20%的乙醇来配制的。

  • 5%脫脂牛奶

用TBS溶解脱脂奶粉。

  • 抗体洗脱液体

配制 0.06mol/L Tris-Base, 0.01 mol/L DTT, 0.07 mol/L SDS 混合液,将 PH 调节到6.7,最后用纯水定容到IL。

2.2研究方法

2.2.1卵泡原液收集

于取卵时分别收集该患者的第一管卵泡原液。卵泡原液为不含血液、未经 冲洗的卵泡液,收集后立即2000 r/min,离心10min,留取上清液分装后置于・80弋 冰箱内保存待测。

2.2.2颗粒细胞分离及培养

  • 人原代颗粒细胞收集

严格按照研究设计的纳入和排除标准,进行患者的筛选工作。在取卵日, 用无菌容器来收集所选取的符合相关要求的患者的所有卵泡液体。收集的液体 在细胞操作间进行颗粒细胞分离。

(2)人原代颗粒细胞分离

1) 卵泡液转移到50ml离心管,离心15min(转速为450 G/min);

2) 离心工作完成之后,将上清液弃去,随后将已经预热好的培养液加入其 中,并充分吹打混匀;

3) 将淋巴细胞分离液加入15ml离心管之中,沿试管壁以缓慢的速度把已 经混匀的细胞悬液加到淋巴分离液的上层,此时可以观察到一条清晰的分界在 淋巴细胞分离液层和细胞悬液层之间,离心20min (转速为2000r/min);

4) 完成上一步离心工作之后,即可见离心管中出现4层分层,从上到底 依次为:培养液层(无色透明)、颗粒细胞层(细胞悬液层)、淋巴细胞分离 液层(透明)、红细胞层(密度最大);

5) 将细胞悬液层液体缓慢地吸出,放于另一个15ml的离心管,离心5min (转速为 1500r/min);

6) 倒去上清液,仅留下细胞沉淀物,将细胞培养液缓慢加入其中并用移液 枪吹打均匀至无细胞沉淀物存在。细胞悬液按密度为5xl04/cm2,接种于6孔板 或12孔板中;

7) 37°C> 5%CO2培养箱内培养,每天在显微镜下对细胞进行观察。需要 注意细胞生长情况、密度、形态等。

2.2.3 实时定量荧光PCR (Real-time qPCR)方法

(1)总RNA提取

按照1ml RLT+10 ul卩毓基乙醇配制好lysis buffer缓冲液。观察细胞状态后 将上清弃去,每孔加入0.5-lml PBS缓冲液浸泡lmin后甩去液体,每孔细胞加 入350ul的lysis buffer缓冲液,反复吸取液体均匀吹在孔壁及孔底后将所有液体 转移到1.5ml离心管(已经标记好,且无RNA酶),储存于・80。(2冰箱中。由于 RNA很容易降解,该实验操作需要在冰上进行,且所用耗材均不含RNA酶。 RNA的提取需要在RNA操作间进行,操作过程必须注意RNA酶污染的问题。

RNA提取的操作步骤(QIAGEN RNeasy试剂盒)

1) 将标本移至室温解冻后震荡均匀并离心

2) 将全部液体转移至2ml gDNA Eliminator spin套管中,以>8000xg (lOOOOrpm)转速离心30s,保留外套管及液体,弃去内套管

3) 加入350ul的70%乙醇(用7体积99.9%乙醇加入3体积纯水配成), 吹打混匀

4) 将总共700ul液体移至新的2ml RNeasy mini spin管内,盖上盖子以 >8000xg (lOOOOrpm)转速离心15s,弃下清

5) 加入700ulBuffer RW1,离心lmin,弃下清

6) 加入500ulBuffer RPE,离心lmin,弃下清

7) 加入500ulBuffer RPE,离心2min,弃下清

8) 弃去外套管,取下内套管放入新的2ml collection管中离心lmin

9) 弃去外套管,取下内套管放入新的1.5ml collection管中,加入 30ulRNase-free water (注意直接加至底部膜上但不要戳到膜),离心lmin,留 下清即是mRNA

10) 使用分光光度计测定所提取的总RNA的浓度。

(2) RNA 的反转录RT, Reverse Transcription)

整个反转录过程在冰上进行,反转录试剂盒是Applied Biosystems Grand Island公司的GaldScript 一步法实时定量荧光PCR。反转录反应体系,包含 M-MLV反转录酶、3ug RNA> dNTP以及随机引物,总体积为20uL具体操作 步骤如下:

1) 将200U1E-P管标序号放好

2) 按下表所示配置反转录体系,e.g.有10个样则需配至少12个体积的下 列混合液(防止液体滞留在壁上不够用)即将下列表中每个数字x 12

3) 上述液体总量配好后震荡离心混匀后,每个E・P管内加10ul

成分 体积(ul)
10X RT Buffer 2.0
25X dNTP Mix 0.8
10X RT Random Primers 2.0
MultiScribe Reverse Transcriptase 1.0
Nuclease-free H20 4.2
每份总体积 10.0

4) 上述液体总量配好后震荡离心混匀后,每个E・P管内加10ul

5) 每个管子中加入样本10ul配成总量20ul的反应体系

6) 上机反转录2个半小时,反转录程序如下,结束后将样品收至・20。保存

  Stepl Step2 Step3 Step4
温度(°C) 25 37 85 4
时间 lOmin 120min 5min 无穷

(3)基因表达量检测——RT・qPCR实验

本研究使用的实时荧光定量PCR仪器为ABI 7500o RT-qPCR实验的反应体 系包括 25nM 的引物、lxSYBR Green PCR master Mix、20ng cDNA,总体积为 20uL RT-qPCR的反应条件为:变性为95°C 15s, 95°C 5s> 60°C 34s进行40个 循环,最后95°C 15s进行延伸反应。通过分析PCR反应的熔解曲线和PCR反应 终产物琼脂糖凝胶电泳结果来确定引物特异性,每个样本会设置三个复孔,最 终取三个复孔的平均值。本研究的内参对照基因为GAPDH,阴性对照为水和未 进行反转录niRNA。计算采用目的基因相对定量法,公式为2-AACto

本实验中所使用的引物由Invitrogen生物有限公司加工生产。引物序列如下:

StAR: 5f-AAA CTT ACG TGG CTA CTC AGC ATC-3f (正义链)

5f-GAC CTG GTT GAT GAT GCT CTT G-3f (反义链)
GAPDH: 5f-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3f (正义链)
5f-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3f (反义链)

2.2.4 SDS-PAGE Western blot 实验

(1) 蛋白提取:用RIPA裂解溶液(DSL, USA)裂解LSECs细胞(全程冰 上操作)。保存于・20°C的RIPA裂解液于冰上融化,使用前加入蛋白酶抑制剂。 细胞去除培养液,用预冷的PBS清洗细胞2・3遍,6孔板每孔加入50-100(11加有蛋 白酶抑制剂的RIPA裂解液,吹打至澄清,置于冰上裂解30mino 15000rpm离心 15min,取上清液即为蛋白提取液。

(2) 蛋白定量:标准品和样品用去离子水稀释,标准品倍比稀释成一系列 浓度梯度溶液。对于每种标准品或样品稀释液,取20 M分配到96孔微量培养板 中。配制BCA工作液,将试剂A和试剂B以50:1的比例混合在一起。每孔加入200 U1BCA工作液,在平板振荡器上彻底混合30seco室温孵育5min后,用酶标仪检 测480nm处的吸光度。先绘制标准曲线,再代入样品吸光度,最后得到样品蛋白 浓度。蛋白定量后,在蛋白样品中加入5XLoading Buffer,加热板上100°C煮沸 5 min。

  • SDS-PAGE蛋白胶的配制:玻璃板和制胶梳洗净烘干备用。在制胶夹 上夹好玻璃板,置于制胶架上。按照SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒说明书中的 试剂比例配制自己所需凝胶浓度的下层分离胶,水封。待胶凝固后,再按照说 明书配制上层浓缩胶,插上梳子,等待凝固。
  • SDS-PAGE电泳:SDS-PAGE蛋白胶配制完成后拔掉梳子,置于电泳 槽中,加入1XSDS-PAGE电泳缓冲液(200ml 5XSDS-PAGE电泳缓冲液+800ml 去离子水稀释)向梳孔中加入蛋白marker或蛋白样品,样品上样总量为20昭 每孔,用IX Loading Buffer^所有孔体积补齐。盖上电泳槽盖,接电源开始电泳, 先以80V恒压跑至样品到达分离胶层,换为120V恒压跑到底。
  • 转膜:将10X转膜缓冲液(23g Tris+144g甘氨酸去离子水定容至 1000ml)用去离子水稀释为IX转膜缓冲液,用IX转膜缓冲液浸泡硝酸纤维膜、 滤纸、及含蛋白的电泳胶。浸泡后,按以下顺序摆放于转膜板上:负极一海绵 —滤纸一胶一膜一滤纸■海绵■正极。注意胶和膜之间不能有气泡。转膜板夹紧放 入转膜槽中,接上电源,放入冰水中开始转膜,转膜条件为300mA恒流2h。
  • 封闭:转膜后,将膜取出放入5%牛奶封闭液中,于室温摇床孵育lh。
  • 孵抗体:封闭后将膜按目标蛋白的分子量大小裁剪,做上记号,浸入 相应的蛋白一抗稀释溶液中,4°C摇床孵育过夜。一抗孵育结束后,用1XTBST 缓冲液(8g氯化钠+20ml的Tris・HCl (ImM, PH8.0)去离子水定容至1L)将膜 清洗3遍,每次5・10mim再孵育二抗。二抗孵育条件为常温摇床lh,孵育结束后 用1XTBST缓冲液将膜清洗3遍,每次5・10min。
  • 显影:将DAB显色试剂盒中的A液和B液按1:1混合配制成DAB染色工 作液,在Baygene显影仪上显色。

2.2.5褪黑素ELISA检测方法

  • 在B0孔中加入100ul IX的质控品;在NSB孔中加入150ul的质控品。
  • 将配制好的标准品分别100ul加入到相应的孔中。
  • 将100yL样品分别加入相应的孔中。
  • 除了空白孔,向所有微孔中加入50ul IX的褪黑素示踪剂。
  • 除了 NSB和空白孔,向所有孔中加入50ul IX的褪黑素抗体。
  • 用封口膜密封并在室温下孵育,在平板振荡器上以〜500转/分钟振荡1 小时。
  • 移去封口膜,弃去孔内容物,加入约400卩1的洗涤溶液进行全孔清洗 3次。在吸水纸上拍干以去除任何剩余的洗涤缓冲液。
  • 除空白孔外,向每个孔中加入200piL褪黑素缀合物溶液。
  • 封板,室温下在摇床上以500转/分钟孵育30分钟。
  • 移去封口膜,弃去孔内容物,加入约400pl的洗涤溶液进行全孔清洗 3次。在吸水纸上拍干以去除任何剩余的洗涤缓冲液。
  • 在每个孔中加入200(iLTMB底物溶液。封板,室温下在摇床上以500 转/分钟孵育30分钟。
  • 在每个孔中加入50(iL终止液,在450nm处读取OD值
  • 使用数据分析软件计算相应的褪黑素浓度。

2.2.6孕激素ECLIA检测方法

采用ECLIA方法对血清内孕激素的浓度进行检测,实验操作严格按照Roche Diagnostics公司所生产的ECLLA试剂盒说明书进行。

2.2.7统计学分析

用SPSS21.0软件进行数据分析。“匚士b代表计量资料结果,P<0.05代表 存在统计学显著性差异。多重比较用单因素方差分析和Turkey^多重比较法。 每次实验需至少独立重复验证三次。运用Pearson相关分析以检查两项指标之间 的相关系数。

3实验结果

3.1人颗粒细胞中,褪黑素上调StAR蛋白的表达

本研究所使用的颗粒细胞均来自于本中心接受 试管婴儿助孕治疗的患者, 本研究中将人颗粒细胞进行体外原代培养,使用不同刺激因子刺激颗粒细胞探 究该因子的生理功能。将人原代颗粒细胞体外培养,从时间及浓度方面探究褪 黑素对StAR mRNA及蛋白表达的作用特点。结果显示,0.05mmol/L及0.5mmol/L 的褪黑素作用24h后均能明显上调StAR蛋白的表达,并且当褪黑素作用浓度为 0.5mmol/L时,其对StAR蛋白的上调作用更为显著(附图1A)。因此,在后续 实验中褪黑素所使用的作用浓度均为0.5mmol/Lo

使用0.5mmol/L的褪黑素作用于颗粒细胞,于不同时间点蛋白,结果显示褪 黑素对StAR蛋白的表达有上调作用。并且当褪黑素作用时间为24h时,其对 StAR mRNA及蛋白的上调作用更为显著(附图1B)上述结果表明,褪黑素对 StAR mRNA及蛋白表达的调控作用具有时间及剂量依赖性。

附图1

Tubulin

附图1:褪黑素上调人原代颗粒细胞StAR的表达。图A:分别使用不同浓度的褪黑素 (0.005mmol/L> 0.05mmol/L和0.5mmol/L)处理人颗粒细胞,作用24h后收集细胞的蛋白, 使用RT-qPCR的方法检测StAR mRNA水平。图B:分别使用不同浓度的褪黑素 (0.005mmol/L> 0.05mmol/L和0.5mmol/L)处理人颗粒细胞,作用24h后收集细胞的蛋白, 使用Western blotting的方法检测StAR蛋白表达量。图C:使用0.5mmol/L的褪黑素处理人 颗粒细胞,并且分时间段收集细胞的蛋白,最后通过Western blotting的方法来检测StAR 的表达量。“匚士s”表示3次独立重复实验结果,不同的标注字母代表存在显著统计学差异 (p<0.05) o

3.2在人颗粒细胞中,褪黑素通过与受体结合的方式促进StAR的 表达

为了探究褪黑素受体(MT)是否参与介导褪黑素对StAR的调控作用。将 人原代颗粒细胞体外培养,使用MT特异性抑制Luzindole (10nM)预处理颗粒 细胞lh,再给予0.5mmol/L的褪黑素作用24h后收取蛋白。Western blotting的 结果显示,Luzindole能抑制褪黑素对StAR的调控作用(附图2)。因此,褪黑 素 促进人颗粒细胞中StAR蛋白水平的表达主要是通过与MT结合的方式来实 现。

3.3在人颗粒细胞中褪黑素通过PKA/CREB信号通路调控StAR的 表达
图2:在人颗粒细胞中,褪黑素通过与MT结合促进StAR蛋白的表达。分别使用DMSO、 Luzindole (10nM)来对颗粒细胞进行预处理,约lh,再给予褪黑素(0.5mmol/L),于24h 后收集颗粒细胞的蛋白,StAR的蛋白表达量的变化检测主要通过western blotting实验方 法。实验结果的表示为:独立重复实验(至少三次)的结果表示“均数土标准差”,不同 的标注字母代表着〃<0.05,表示具有显著统计学差异。

为了检测CREB信号通路是否参与了褪黑素对StAR的调控过程,使用 0.5mmol/L的褪黑素分别对颗粒细胞进行lOmin、30min> 60min的处理,然后收 取对应的蛋白质,采用western blotting的方法探究褪黑素对CREB的磷酸化水 平(pCREB)的影响。Western blotting的结果显示,褪黑素作用lOmin后即能 显著促进CREB的磷酸化(附图3A)。此外,使用PKA通路特异抑制剂探究 褪黑素调控StAR表达的通路(附图3B)O结果显示,PKA通路抑制剂H89能抑 制褪黑素对StAR的调控作用。因此,褪黑素通过PKA/CREB信号通路参与调 控StAR的表达。

附图3:在人颗粒细胞中,CREB信号通路介导褪黑素对StAR蛋白的诱导作用。图A: 使用褪黑素(0.5mmol/L)处理颗粒细胞,分别作用lOmin、30 min、60 min。使用 western-blotting的方法检测磷酸化CREB (p-CREB)的蛋白表达水平。洗脱该膜上的一抗, 使用CREB再次孵育,检测CREB蛋白的表达水平。图B:预处理颗粒细胞60min (分别使 用DMSO, H89),再给予0.5mmol/L褪黑素刺激颗粒细胞24h, StAR蛋白的表达水平的 差异通过westenvblotting实验来检测。“x士s”来表示3次独立重复实验结果,不同的标注字 母代表着〃<0.05,表示具有显著统计学差异。

3.4人颗粒细胞中,褪黑素可增强AREG受体EGFR的表达

将人原代颗粒细胞体外培养,从时间及浓度方面探究褪黑素对EGFR表达 的作用特点。结果显示,0.05mmol/L及0.5mmol/L的褪黑素作用24h后均能明 显上调EGFR蛋白的表达,并且当褪黑素作用浓度为0.5mmol/L时,其对StAR 蛋白的上调作用更为显著(附图4A)。使用0.5mmol/L的褪黑素作用于颗粒细 胞,于不同时间点收集蛋白,结果显示当褪黑素作用时间为24h时,其对EGFR 蛋白的上调作用更为显著(附图4B)。

附图4:褪黑素上调人原代颗粒细胞EGFR的表达。图A:分别使用不同浓度的褪黑素 (0.005mmol/L、0.05mmol/L和0.5mmol/L)处理人颗粒细胞24h,收集颗粒细胞蛋白, Western blotting实验来检测EGFR蛋白表达量。图B:使用0.5mmol/L褪黑素处理颗粒细胞, 并且在不同的时间截点点收集细胞的蛋白,Western blotting实验检测EGFR的蛋白表达量。 “匚士酹表示3次独立重复实验结果,P<0.05代表存在统计学显著性差异。

3.5人颗粒细胞中,褪黑素可增强AREG作用下StAR的表达

将人原代颗粒细胞体外培养,探讨褪黑素是否可以协同增强AREG对StAR 表达的上调作用。100ng/ml的AREG作用于人颗粒细胞24h后,可使StAR mRNA及蛋白表达明显增加(图5) o使用0.5mmol/L的褪黑素刺激人颗粒细胞, 可协同增强AREG对StAR mRNA及蛋白的上调作用(图5)。上述结果说明,褪 黑素可以增强AREG对StAR表达的诱导作用

附图5:在人原代颗粒细胞中,褪黑素可增强AREG作用下StAR的表达。分别使用

AREG (100 ng/mL)、褪黑素(0.5mmol/L)或褪黑素(0.5mmol/L) +AREG (100 ng/mL) 刺激颗粒细胞24h, StAR的mRNA和蛋白的表达水平的检测是分别是通过RT-qPCR和 western blotting的方法实现。“x±s”表示3次独立重复实验结果,不同的标注字母代表着 〃<0.05,表示具有显著统计学差异。

3.6人颗粒细胞中,褪黑素通过活化AREG作用下的ERK1/2信号 通路增强AREG作用下StAR的表达

已有研究表明AREG能通过激活ERK1/2信号通路参与调控StAR的表达。 且ERK1/2信号通路是已被证实的参与當体类激素生成的常见通路。然而在人原 代颗粒细胞中,褪黑素是通过何种通路增强ARGE作用下StAR表达尚不十分清 楚。为了进一步探究褪黑素增强AREG作用下StAR表达的机制,分别使用 100ng/ml的AREG和0.5mmol/L的褪黑素处理颗粒细胞30min后收取蛋白。Western blotting的结果显示,褪黑素自身不能活化ERK1/2信号通路,但是它能显著促 进ARGE作用下ERK1/2的磷酸化水平。因此,褪黑素可通过ERK1/2信号通路 促进AREG作用下StAR的表达。

附图6:人颗粒细胞中,褪黑素通过活化ERK1/2信号通路促进AREG作用下StAR的 表达。使用褪黑素(0.5mmol/L)、AREG (100ng/mL)或褪黑素(0.5mmol/L) +AREG (100 ng/mL)处理颗粒细胞30 min。使用western-blotting的方法分别检测磷酸化ERK1/2 (p-ERKl/2)的蛋白表达水平。洗脱该膜上的一抗,使用ERK1/2再次孵育,同样使用 western-blotting的方法检测ERK1/2蛋白的表达水平。“匚士酹表示3次独立重复实验结果,P <0.05代表存在统计学显著性差异。

3.7在人颗粒细胞中,褪黑素通过EGFR增强AREG作用下StAR 的表达

AREG是EGF家族的一员,通过与EGFR结合发挥其生理功能,使用EGFR 抑制剂AG1478可阻断EGF家族因子的作用。为了进一步研究褪黑素对AREG 在StAR表达上的协同作用,将人原代颗粒细胞体外培养,使用褪黑素预处理细 胞24h后用EGFR特异性抑制AG1478 ( (10(1M))预处理颗粒细胞lh,再给 予0.5mmol/L的褪黑素和(或)100ng/ml的AREG作用24h后收取蛋白。western blotting的结果显示,AG1478能抑制褪黑素对AREG作用下StAR表达的调控 作用(附图7)。

图7,使用0.5mmol/L的褪黑素处理颗粒细胞24h后,分别使用DMSO及AG1478 (10 |1M)预处理颗粒细胞lh后,再给与褪黑素(0.5mmol/L)和(或)AREG (100 ng/mL)刺 激颗粒细胞24h。StAR蛋白的表达水平的检测通过western blotting的方法实现。“匚士酹表 示3次独立重复实验结果,P<0.05代表存在统计学显著性差异。

3.8卵泡液内褪黑素浓度与血清内孕激素浓度呈正相关

为了准确检测卵泡液内褪黑素及孕激素浓度,本实验共收集了 57例不孕女 性患者的卵泡液及血清(表1) o卵泡液为取卵术中所获得的第一管卵泡液,未 经冲洗、不含血液,用于褪黑素浓度检测。血清为该患者hCG日及OPU日空腹 所抽血液经离心后所得,用于检测孕激素浓度。经检测,卵泡液内褪黑素平均 浓度为29.41±1.61ng/ml, hCG日血清内孕激素平均浓度为0.88±0.06憾/ml, OPU 日血清内孕激素平均浓度为16.95il.82ng/mL卵泡液内褪黑素浓度与hCG日血 清内孕激素浓度以及OPU日血清内孕激素浓度正相关(图8A和8B)。上述结 果表明,在人体内褪黑素对孕激素的生成具有诱导作用。

表1: 57例不孕女性的基本信息(x±s)

特点(N=57) 结果
年龄(岁) 29.14±0.45
BMI (kg/m2) 23.33±0.38
基础 FSH (mIU/ml) 6.60±0.20
基础 LH (mIU/ml) 5.42±0.51
基础 E2 (pg/ml) 34.2U5.85
基础 P4 (ng/ml) 2.12±1.13
基础 T (ng/ml) 0.27±0.02

 

基础 PRL (ng/ml) l8.22±l.O2
窦状卵泡数(No.) l4.9l±0.68
使用Gn的天数(No.) ll.l2±0.22
使用Gn的总剂量(ampoules) 1625±69.66
所得的卵子数(No.) l4.96±0.97
卵泡液内褪黑素的浓度(ng/ml) 29.4l±l.6l
hCG日血清P4的浓度(ug/ml) 0.88±0.06
OPU 0血清P4的浓度(ug/ml) I6.95±l,82

缩写:BMI:身体质量指数(Body mass index, BMI) ; FSH:促卵泡生成素(Follicle stimulating hormone, FSH) ; E2:雌激素(estradiol) ; P:孕激素(progesterone) ; T:睾 酮(testosterone) ; PRL: (prolactin)。结果以 x 士S 表示。

附图8:卵泡液内褪黑素浓度与血清内孕激素浓度正相关。使用ELISA方法检测卵泡 液内浓度(57例)。使用ECLIA方法检测血清内孕激素浓度(57例)。图A:卵泡液内褪 黑素浓度与hCG日血清内孕激素浓度正相关。图B:卵泡液内褪黑素浓度与OPU日血清内 孕激素浓度正相关。

4讨论

卵泡发育和排卵需要内分泌环境保持正常,排卵前过早出现的孕激素升高 会扰乱内分泌环境平衡,从而导致卵泡的提前闭锁[29-32]o因此,对调控孕激素 生成的相关调节因素进行研究不仅能帮助我们理解卵巢生殖的生理和病理过 程,同时也能为不孕症的诊断、预防和治疗提供新方向。两细胞两促性腺激素 学说阐述了颗粒细胞在當体类激素生成过程中的重要作用[辺。在促性腺激素的 作用下,颗粒细胞可以分泌多种性激素和细胞因子作用于卵母细胞,调节卵母 细胞的发育、成熟及排卵[列。此外,卵巢组织本身也会产生多种生长因子和细 胞因子,这些因子会通过旁分泌和自分泌途径作用于颗粒细胞。因此人颗粒细 胞是研究當体类激素生成的理想细胞模型。而StAR将胆固醇转移进线粒体是當 体类激素生成的第一步也是重要的一步。目前,已经有很多关于调节當体类激 素生成的作用因子的研究,但由于人体取材困难,这些研究主要集中于动物模 型水平。而本研究采用的细胞模型来自于本中心进行IVF/ICSI助孕的患者,是目 前用于科学研究的颗粒细胞中最接近生理状态的细胞模型,也是用来研究颗粒 细胞在围排卵期功能的理想细胞模型。在本研究中,我们通过检测褪黑素在人 颗粒细胞中对孕激素合成限速酶StAR的调节作用,证明了在人颗粒细胞中褪黑 素上调StAR的表达并且可以增强AREG作用下StAR的表达。同时,我们的实验 结果也证明血清中孕激素的浓度会随卵泡液中的褪黑素浓度的升高而升高,从 而进一步证明了褪黑素在當体类激素生成过程中的重要作用。

已有的研究已经表明卵泡液中存在高浓度的褪黑素,其受体(MT1和MT2) 在不同类型的卵巢细胞中也均有表达3】。褪黑素的表达与卵子发育和成熟密切 相关,在接受IVF助孕的患者中检测到大卵泡中褪黑素的浓度高于小卵泡中褪 黑素的浓度[⑼,而且卵泡液中褪黑素的浓度与获得的卵子数、优质胚胎数也密 切相关弘辺。我们在人颗粒细胞中检测发现褪黑素对孕激素合成的限速酶StAR 具有调节作用,结果表明褪黑素能使StAR表达上调。这与Nakamura等人之前 对大鼠颗粒细胞的研究结果相一致,他们证实了在大鼠颗粒细胞中褪黑素可以 上调StAR的的表达,同时也可以下调BMP-6的表达與】。除此之外,以往的动 物实验在猪和牛的颗粒细胞中均已证实褪黑素可以通过MT调控當体类激素的 产生B9]。Luzindole是MT的竞争性拮抗剂,在本研究中作为MT的抑制剂[39]。

实验结果表明,在加入Luzindole后,褪黑素对StAR的上调作用被明显抑制。 因此,本实验表明在人颗粒细胞中褪黑素也可以通过与其受体MT结合的方式 调控當体类激素的产生。

参与调控StAR表达的信号通路很多购,其中cAMP/PKA信号通路在卵巢 中是经典的调控StAR表达的机制,而CREB是位于PKA下游激活StAR转录 的主要转录因子之一HU。在本研究中,我们证明了褪黑素可以活化PKA/CREB 信号通路。H89作为PKA信号通路的抑制剂,可以阻断褪黑素在人颗粒细胞中 对StAR的上调作用。因此,在人颗粒细胞中,褪黑素对StAR的上调作用可能 是通过与MT相结合后活化PKA/CREB信号通路。

颗粒细胞的分泌功能主要受FSH和LH的调控,但是局部因子的分泌也能 参与调控卵巢及颗粒细胞的功能。已有研究发现TGF-P超家族成员如TGF・|31、 激活素、BMP类及GDF类能通过自分泌、旁分泌的方式下调StAR表达及孕激 素生成皿-45]。与之相反,AREG则可上调StAR表达及孕激素生成a】。在人颗粒 细胞中,除了经典的PKA/CREB外仍有多条通路参与调控StAR表达及孕激素 生成,其中ERK1/2是已经被全面研究的介导StAR表达的信号通路。同时, ERK1/2信号通路也是LH在颗粒细胞中发挥重要作用的下游通路跑。在ERK1/2 基因敲除小鼠实验中,发现随着ERK1/2基因表达的缺失,其排卵会异常、生育 能力受损。在小鼠颗粒细胞实验中,发现阻断ERK1/2信号通路的表达后,hCG 上调EREG、AREG、COX・2、以及BTC的mRNA表达水平的能力会受阻旳。 ERK1/2信号通路对StAR的调控作用是多向的。已有研究证实,促性腺激素激 活ERK1/2通路,可诱导StAR表达跑。TGF-pi及GDF-8通过激活ERK1/2通 路抑制StAR表达陀45]。而AREG对StAR的上调作用是通过与EGFR结合活化 ERK1/2信号通路进行的必]。但之前也有报道证实,在牛的卵泡膜细胞中,褪黑 素也不能直接活化ERK1/2信号通路"I。本课题组研究发现,在人颗粒细胞中褪 黑素虽然不能直接活化ERK1/2信号通路但可以通过增强ERK1/2信号通的路活 化水平,从而协同增强AREG对StAR的诱导作用。且这种增强作用也是通过与 EGFR结合发挥作用的。

总之,本研究结果表明褪黑素上调人颗粒细胞StAR表达。其中,褪黑素可 通过活化PKA/CREB信号通路促进StAR的表达,也可以通过活化AREG作用下 的ERK1/2信号通路协同增强StAR的表达。这些发现均表明在人颗粒细胞中, 褪黑素可以调控StAR的表达,这也可能是褪黑素与孕激素的分泌呈正相关的原 因。研究颗粒细胞中褪黑素对StAR生成的调节作用及其机制有助于我们理解褪 黑素在卵泡生长发育过程中的作用。此外,目前已有大量研究证明了外源性褪黑 素在人类应用的安全性[49,50]。因此,本实验这不仅有助于深入理解當体类激素生 成的机制,也有助于为相关不孕症的诊断、预防和治疗提供新思路。

5结论

虽然卵巢卵泡的发育以及类固醇當体激素的生成这两者的调控的都主要受 到下丘脑垂体卵巢轴的影响,但除此之外,在调控卵巢功能的活动中也有许多 其他入生长因子、细胞因子和激素等参与。卵巢的生理功能包括卵泡发育、排 卵、黄体形成、黄体退化以及类固醇當体激素合成等。卵巢功能的调节过程需 要很多因素参与,这些因素会形成一个复杂的网络。颗粒细胞在这个调控网络 中主要通过表达多种激素、细胞因子或生长因子及其受体来发挥重要的调控作 用。本研究重点在于褪黑素在人颗粒细胞中调控StAR产生的作用和相关机制。 本研究结果显示在人颗粒细胞中,褪黑素可以通过与其受体MT结合激活 PKA/CREB信号通路上调StAR的表达;在人颗粒细胞中,褪黑素也可通过与 EGFR结合激活ERK1/2信号通路协同增强AREG作用下StAR的表达。卵泡液 中褪黑素浓度与血清中孕激素浓度的正相关性也进一步验证了褪黑素在當体类 激素的生成调控中起着重要的作用。

6创新点

  1. 本实验发现了在人原代颗粒细胞中,褪黑素可促进StAR的表达,进而 促进孕激素的生成;
  2. 本实验探讨了在人原代颗粒细胞中,褪黑素调控StAR表达的作用机制。 褪黑素可通过与其受体MT结合后活化经典的PKA/CREB信号通路上调StAR 的表达。此外,褪黑素也可以通过与EGFR结合后活化AREG作用下的ERK1/2 信号通路协同增强AREG作用下StAR的表达;
  3. 本实验发现了在进行试管婴儿助孕治疗的患者中卵泡液中褪黑素的浓度 与血清中孕激素的浓度呈正相关。

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【摘要】

褪黑素是一种神经内分泌激素,主要在哺乳动物的松果体内以芳香族氨基 酸色氨酸为原料合成。褪黑素可作为广谱抗氧化剂、强效自由基清除剂、抗炎 剂、抗癌因子、睡眠诱导剂和昼夜节律调节剂,以及潜在的免疫调节剂。褪黑 素和生殖系统在生理和病理条件下均相互关联。大量研究已证明褪黑素对卵巢 功能有直接影响,可以影响卵泡发生、闭锁,影响卵母细胞成熟、排卵,同时 也参与影响黄体(corpus luteum, CL)形成。大量研究表明氧化应激、炎症反应 和免疫失调参与子宫内膜异位症(endometriosis, EMS),复发性自然流产 (recurrent spontaneous abortion, RSA)和多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)的发病过程。而褪黑素在这些疾病中有多重作用,且是调节 炎症和免疫反应并保护特殊细胞或器官的候选治疗药物。我们总结了现阶段已 有的研究中对于褪黑素在人类生殖系统中基本功能的理解,以探讨其生理病理 学意义和治疗潜力。褪黑素有望成为改善卵巢功能和卵母细胞质量的新药物, 并能为几种生殖系统疾病的治疗提供了新方向。

关键词:褪黑素抗氧化免疫调节卵泡发育排卵多囊卵巢综合征子宫 内膜异位症 复发性自然流产

1958年Lerner等人从人、猴和牛的松果体及外周神经第一次分离出褪黑素 (N■乙酰・5■甲氧色胺,melatonin),他们发现这种物质既可以减轻青蛙黑色素 细胞的素色沉积,又可以抑制促黑色素细胞的生长和促肾上腺皮质激素的分泌 ⑴。作为一种神经激素,褪黑素具有很多重要的生理功能,并且能够调控与昼夜 节律和生殖相关的各种中枢和外周活动。它可作为一种广谱抗氧化剂、自由基 清除剂、抗炎剂,同时参与调节免疫反应、抗癌、睡眠诱导以及体内昼夜节律⑵。 褪黑素的活性大部分通过与其受体相结合发挥作用。目前,已被证实的褪黑素 受体(membransbound receptor, MT)有三种。其中,MT1和MT2均为具有7 个跨膜段的G 蛋白耦联受体,参与cAMP/PKA ( cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A)信号通路⑶。MT3虽然在氨基酸水平结构上与 褪黑激素受体有45%的同源性,但不能结合褪黑素⑷。在人体中,褪黑素受体 存在于脑和视网膜,心血管系统,肝和胆囊,肠,肾,免疫细胞,乳腺上皮细 胞,子宫肌层和皮肤等松果体以外的器官和组织。其中,在生殖系统中,褪黑 素受体广泛存在于乳房、子宫肌层、卵巢⑸。在人的颗粒细胞和黄体细胞以及大 鼠的窦卵泡和黄体中均检测到褪黑激素受体(MT1和MT2)血7]。

1褪黑素的合成与分泌

褪黑素是一种神经内分泌激素,属于眄|味胺类物质,主要在哺乳动物的松 果体中由芳香族氨基酸色氨酸合成。在哺乳动物中,经典的褪黑激素合成途径 需要4个连续的酶促反应。首先,松果体细胞从血液中摄取色氨酸,通过色氨 酸・5■轻化酶(tryptophan-5 -hydroxy lase , TPH )轻基化形成5■瓮色氨酸 (5-hydroxytryptophan, 5HTryp)。随后在芳香族氨基酸脱竣酶(aromatic amino acid decarboxylase , AADC )的催化下,将5HTryp脱竣形成5■径色胺 (5-hydroxytryptamine, 5-HT,也称为serotonin)。然后通过芳基烷基胺N■乙酰 转移酶(NFcetylserotonin, NAT)将5■轻色胺乙酰化形成N■乙酰基・5■轻基色 胺(N■乙酰基血清素)。最后,通过轻卩引味O 甲基转移酶 (hydroxyindole-O-methyltransferase, HIOMT),也称为 N■乙酰血清素 O■甲基 转移酶(Nkacetylserotonin O-methyltransferase, ASMT)甲基化形成 N■乙酰 甲氧色胺,即为褪黑素⑻。褪黑素的分泌具有昼夜节律性,呈白天低浓度夜间高 浓度,受光和暗刺激的共同影响Hl。NAT在松果体中通常表现出与血液中褪黑 素水平相同的昼夜节律,因此NAT被认为是褪黑素合成中的限速酶。但最近的 研究已将重点转移到HIOMT,因为这可能是褪黑素形成昼夜节律循环的原因。 有研究表明,由肾上腺素能a和肾上腺素能卩受体激动剂刺激后的NAT活性升 高,但未能促进褪黑素产生,而HIOMT活性的升高与松果体褪黑素的产生呈正 相关,故使这一想法得到了证实⑹。在脊椎动物中,褪黑素可在松果体、视网膜、 皮肤和胃肠道中合成,但其节律性仅出现在松果体和视网膜中[1°]。生殖系统中 也可以检测到褪黑素,其合成来自于体循环还是卵巢目前尚没有明确的结论, 但研究表明NAT和HIOMT在卵巢组织中均可检测到,这表明卵泡液中的褪黑 激素可能是局部产生的,也可能是从血液中摄取的[11J2]o

作为神经激素,褪黑素有许多重要的生理功能,且具有调节与昼夜节律和 与繁殖相关的多种中枢和外周作用。它可以作为广谱抗氧化剂、强大的自由基 清除剂、抗炎剂、潜在的免疫调节剂、抗癌效应物、睡眠诱导剂和体内昼夜节 律的调节剂⑵。在生理和病理条件下,褪黑素均与生殖系统均密切相关。氧化应 激、炎症反应和免疫失调与女性生殖系统的发病机制密切相关,包括子宫内膜 异位症(endometriosis, EMS),复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)和多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS) [13_15]O 在本篇综 述中,我们从神经内分泌免疫的角度系统地总结和评估褪黑素在EMS, RSA和 PCOS中的多效作用,以探索其病理学意义从而为这些疾病的治疗提供新思路。

2褪黑素在生殖系统中的生理作用

  1. 1抗氧化

细胞新陈代谢的同时会产生大量的活性反应物质,如活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS),由这些物质产生的 氧化应激系统在炎症反应和组织损伤中都发挥着重要的作用[⑹。这些活性反应 物质会对其他分子产生破坏性的作用,从而引起细胞功能的紊乱甚至死亡。同 时自由基在女性生殖系统中起着重要的作用,特别是卵母细胞和卵泡液微环境 中的自由基,对卵泡的发育,卵子的质量及排卵过程都有重要的影响"I。线粒 体DNA位于线粒体内膜附近,是氧自由基的主要靶点。褪黑素可以减少线粒体 的蛋白质和DNA损伤,并提高电子传递链活性[国。褪黑素不仅可以直接作为一 种强效的抗氧化剂来清除自由基,同时它的代谢产物,如环状3■轻基褪黑素、 N1 ■乙酰・N2 ■甲酰・5冲氧尿卩密噪和N1 ■乙酰・5 ■甲氧基尿卩密噪也可以清除体内的有 毒反应物Z20]。除此之外,褪黑素还可以作为一种间接的抗氧化剂影响抗氧化 酶的活性和这些酶的mRNA表达水平。Ozturk等人观察到10mg / kg褪黑素给药 7天后,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性升高,而Liu和Ng 发现了单次褪黑激素注射(5mg/kg)后即可增强SOD活性0,22]。Baydas等研究 发现松果体切除术后诱导的褪黑素缺乏可降低大鼠多种组织中谷胱甘肽过氧化 物酶(glutathione peroxidase, GPx)的活性㈡】。Antolin等人的研究证实了在给 予外源性褪黑素(500憾/kg)后会引起铜■超氧化物歧化酶(CmSOD)、锌超 氧化物歧化酶(ZmSOD)、猛超氧化物歧酶(MmSOD)的信使RNA (mRNA) 水平的增加[24]。Mayo等人使用体外培养的多巴胺能细胞发现了褪黑素调节抗氧 化酶基因表达的机制,他们发现褪黑素诱导合成的新蛋白质是调节抗氧化酶基 因(如Cu・SOD基因,Mn-SOD基因和GPx基因)表达的必要条件㈤。

  1. 2免疫调节

对人类淋巴细胞亚群和细胞因子产生的昼夜节律性的研究表明,一些白细 胞亚群和血浆褪黑素之间存在强烈的正相关关系a】。众所周知,神经和内分泌 系统可以与免疫系统相互作用以调节其功能[27】。此外,褪黑素可以通过调节其 他功能和对应的靶细胞来影响免疫或炎症反应的光周期肌29]。在人类的免疫细 胞中检测到MT1受体和核受体RZR /RORa;在小鼠免疫系统中也检测到MT1 和MT2受体,为其在免疫系统的敏感性提供了分子基础㈤]。有报道显示在松果 体切除或任何其他减少褪黑素合成和分泌的实验中,细胞和体液的免疫功能都 会受到抑制,而这些抑制作用一部分可由外源性褪黑素抵消卩I】。除了通过作为 神经内分泌激素对免疫系统起调节作用外,由人淋巴细胞合成和分泌的褪黑素 也可以通过免疫系统中的自分泌/旁分泌机制起作用。褪黑素的免疫调节和抗细 胞凋亡主要通过T辅助(T helper, Th)淋巴细胞发挥作用。在超生理浓度下, 褪黑素可诱导T细胞增殖和上调促炎症细胞因子的表达卩I】。此外,褪黑素也会 影响包括单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、多形核粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性 粒细胞、嗜血杆菌、肥大细胞和自然杀伤细胞(natural killer, NK)在内的其他 免疫细胞。值得我们关注的是褪黑素在单核细胞/巨噬细胞系统以及NK细胞中 的作用。褪黑素可以刺激单核细胞增殖,抑制其凋亡,促进IL-K IL-6和IL-12 的产生,并抑制单核细胞分泌IL-10>IL-2和肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor a, TNFa)。在动物实验中,对正常和白血病小鼠给予外源性褪黑素均可导致 NK细胞的数量增加和功能增强厲]。

  1. 3促进卵泡发育

卵泡的发育是一个涉及内分泌、旁分泌和自分泌机制的复杂的过程。在每 个月经周期中从卵巢卵泡储备池中募集的大量卵泡中,能够完全成熟并脱落形 成卵子只是很少的一部分。实际上,除了优势卵泡之外,其余卵泡都会因闭锁 而凋亡。作为卵泡发育的微环境,卵泡液中含有水、电解质、血清蛋白和由颗 粒细胞分泌的高浓度當体类激素。已有研究证实卵泡液中的褪黑素浓度高于血 清中褪黑素浓度的三倍Z33]。此外,在接受IVF助孕的患者中也检测到大卵泡 中的褪黑素浓度高于小卵泡中的褪黑素浓度卩4]。颗粒细胞中也已证实存在大量 的褪黑素受体⑶。这些都表明褪黑素可能在卵泡发育的过程中起着重要的作用。 众所周知,當体类激素在卵泡生长发育的过程中起着重要的作用。而褪黑素可 以影响卵泡成熟过程中不同阶段的當体类激素的产生。已有的动物实验结果表 明,给与外源性的褪黑素(lOOpiM)培养12天后可促进小鼠窦前卵泡和窦卵泡 中孕激素和雄激素的产生[均;在猪的动物模型中,用褪黑素(100 ng/mL)刺激 卵泡30小时后,孕激素和雄激素的生成均有所增加,但是雌激素的水平没有发 生改变[36]。卵泡闭锁是卵泡发育过程中的一个重要现象,也是细胞凋亡的一种 过程,受到促细胞凋亡因子和抗细胞凋亡因子的共同调节。其中,氧化应激反 应是人类卵泡闭锁的一个重要凋亡机制,而一氧化氮(nitric oxide, NO)的累 积就会大大提高卵泡中凋亡细胞所占的百分比卩I卵泡液中存在的高褪黑素水 平和颗粒细胞中存在的褪黑素受体都表明褪黑素可能是一种对卵泡非常有益的 分子。在接受IVF■胚胎移植助孕的患者中,卵母细胞质量差的女性体内8■轻基 ・2匚脱氧鸟昔(8-hydroxy-2 deoxy guanosine, 8-OHdG,受损DNA产物的生物标 志)的浓度显著高于卵母细胞质量正常的人群。而褪黑素(3mg/d)或维生素E

(600mg /d)处理后都可以显著降低8-OHdG和己酰基■赖氨酸合成物 (Hexanoy 1-Lysine, HEL,脂质过氧化的生物标志物)的浓度。此外,褪黑素可 以治疗改善以往IVF■胚胎移植周期中曾有低受精率(<50% )女性的受精成功率 [38]o褪黑素也会影响抗氧化酶活性和其基因的表达。褪黑素给药(5 mg/kg)可 以增强SOD活性和SOD在血清中的浓度(1 nM),诱导抗氧化酶(即Cu, Zn-SOD, Mn-SOD和GPx)的生成国】。对于因卵母细胞质量差而无法正常怀孕的女性, 褪黑素可能成为改善卵母细胞质量的首选药物。褪黑素还具有调节卵母细胞成 熟的能力[均。这可能是因为褪黑素可清除RNS和ROS,并刺激生长卵泡中的抗 氧化酶活性。此外,褪黑素可以调节抗氧化酶和抗细胞凋亡/促凋亡蛋白基因的 表达。因此,在生长的卵泡中卵泡液褪黑素浓度的增加可能是避免闭锁的重要 因素。孕激素类固醇17a, 20卩■二轻基・4■孕烯・3■酮(17a, 20b-DP)作为一种可 被诱导成熟的孕前激素,能作用于卵母细胞膜上的受体,激活卵母细胞胞质中 的成熟促进因子,以启动卵母细胞的最终成熟卩刃。而最近的一项研究证明了褪 黑激素(50・500 pg/mL)可以增强成熟诱导激素的活性,从而促进鲤鱼卵母细 胞的成熟跑。

  1. 4促进排卵

排卵是一个复杂的动态过程,该过程主要由LH峰的波动和其他因素(包括 类固醇激素、NO和肽类物质)之间的动态相互作用所产生,并且具有周期性HU。 月经中期,LH峰作用于卵巢卵泡膜细胞、颗粒细胞及卵母细胞,促进一些炎症 因子、细胞因子及生长因子的大量分泌,上述因素综合作用引起颗粒细胞黄素 化、孕激素大量分泌、卵母细胞恢复减数分裂、卵丘复合体扩张以及排卵发生H2]。 已有研究证实在人类的颗粒细胞中褪黑素可以上调LH受体的mRNA表达量⑷】。 雌激素对腺垂体的正反馈作用是排卵期形成LH峰的主要原因。此外,孕激素的 急剧增加对黄体化和排卵也至关重要。有趣的是,卵泡液中孕激素和褪黑激素 浓度之间存在正相关屮】。褪黑素可能通过升高LH受体的表达,增强hCG刺激 下这些细胞分泌孕激素的能力,从而参与排卵的调控过程。因此,排卵前卵泡 中褪黑素浓度升高可能与孕激素生成有关,从而进一步导致黄体化和排卵。除 此之外,排卵时卵巢中前列腺素、血管紧张素II和NO合酶的浓度均有局部增 加[45, 46]。这些血管活性物质通过控制卵泡血管的通透性而在排卵过程中起主要 作用。卵泡壁中胶原蛋白的降解伴随着血管扩张和渗透性的增加,这是卵泡破 裂所必需的过程[47]。给予外源性褪黑素治疗,可增加大鼠胃黏膜和食管组织中 的前列腺素E2,同时保护其免受NO的侵害肌49]。因此褪黑素也可能通过调控 血管通透性相关因子的活性来参与排卵的过程。

3褪黑素在生殖系统中的病理影响

  1. 1多囊卵巢综合征(PCOS)

多囊卵巢综合征是一种常见的导致育龄期女性不孕的常见内分泌疾病,主 要表现为排卵异常、月经不规律及其他临床特征,如高雄激素血症、高胰岛素 血症、胰岛素抵抗、多毛、肥胖等症状。在PCOS患者中常发现咼水平的氧化 应激反应,表明PCOS的发病与氧化应激活动增加有关a】。同时也有研究表明 PCOS患者的卵母细胞和胚胎质量相比正常人群也有所下降[刃。而PCOS患者单 核细胞产生的ROS升高可能是卵母细胞质量差的原因之一卩2]。氧化应激可能通 过过氧化脂质、蛋白质和损伤卵母细胞中的DNA导致颗粒细胞和卵母细胞受损 [53-55]o在动物实验中,通过使用光持续性照射松果体可使褪黑素的生成减少, 同时对生殖系统造成损害和氧化应激增加,诱导其成为PCOS大鼠[殉。可观察 到在诱导的PCOS大鼠中,卵巢内的卵泡囊泡数量和直径增加、白膜增厚,而 原始卵泡和生长卵泡的数量减少,以及产生大量的闭锁卵泡3】。另一项研究的 结果显示,卵泡液内的8-OhdG含量的上升标志着卵母细胞的质量变差。此外, 卵泡液内8-OHdG水平与褪黑素浓度也呈负相关與]。褪黑素的功能主要由褪黑 素受体1 (MT1)基因和褪黑素受体2 (MT2)基因介导,两者均属于G蛋白耦 联受体超家族中的成员。一些研究结果表明MT1和MT2基因在PCOS的病因 学和病理生理学中有重要作用,MT1基因rs2119882和MT2基因rsl0830963的 多态性可能在PCOS的发病机制中起着重要的作用理5刃。同时,越来越多的研 究证明了褪黑素可作为PCOS治疗剂的潜在可能性。一方面,在体外培养基中 补充褪黑素可以促进未成熟卵母细胞的细胞质成熟,从而改善随后的临床结果。 另一方面,褪黑素可以显著改善PCOS小鼠卵母细胞的核成熟情况,与未经处 理的卵子相比,经105mol/L或106mol/L褪黑素处理的卵子的裂解率显著提高。 这些实验结果表明褪黑素有可能诱导卵母细胞核成熟并保证受精潜力颐】。

  1. 2子宫内膜异位症(EMS)

子宫内膜异位症是一种子宫内膜组织植入和生长于子宫腔外的慢性炎症性 疾病。这是一种常见的妇科疾病,具有进行性和复发性,在所有育龄妇女中的 发病率约为5%・15%,最常见的异位部位位于骨盆周围,特别是卵巢、骨盆壁 和后穹窿⑹]。子宫内膜异位症的病因目前尚不清楚,但国内外的研究均认为这 是一种多因素疾病,与腹膜腔内的炎症反应有关。腹腔内的氧化应激是EMS相 关不育的原因之一,这与脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA破坏对细胞造成的破 坏性影响有关[罔。患有EMS的妇女的盆腔液中含有高浓度的炎性细胞因子,如 IL-6, IL-8和TNFa®]。有学者认为在月经期间,脱落的子宫内膜碎片可能会通 过输卵管并以逆行的方式到达腹膜腔。这些子宫内膜碎片可能植入腹膜腔的浆 膜表面,在之后的每个月经周期都会发生增殖和出血。在这些部位,红细胞、 子宫内膜细胞和月经流出液中未分解的子宫内膜细胞都可以充当氧化应激反应 的诱导剂,从而参与子宫内膜异位症的病理反应⑹]。子宫内膜异位症患者的腹 腔液增加,且腹腔液中巨噬细胞的数量大于正常女性,活化的巨噬细胞诱导氧 化应激反应增强,促进ROS的生成24]。此外,在子宫内膜异位症患者中腹腔巨 噬细胞的iNOS(inducible NO synthase)活性和NO产生也显著升高阿。越来越多 的研究证明褪黑素有助于促进子宫内膜异位症的消退。已有的动物实验表明, 褪黑素作为一种强大的自由基清除剂,可通过腹腔注射来减少粘连,并且可通 过氧化应激反应诱导异位的子宫内膜消退和萎缩a】。Guney等人证实了,与对 照组相比褪黑素治疗(每日腹腔注射10 mg/kg)可显著降低宫腔外异位内膜的 体积、COX-2阳性细胞减少而SOD和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性升高〔冈。 此外,褪黑素可以通过caspase-3介导途径诱导细胞凋亡并使子宫内膜异位症消 退[斶。与来曲卩坐相比,褪黑素治疗后可以引起更多的子宫内膜异位病灶消退, 同时导致SOD和CAT的水平显著增加,在停止治疗后褪黑素组的复发率也低 于来曲卩坐组㈣。

  1. 3复发性自然流产(RSA)

复发性自然流产,是指在妊娠24周前有3次或3次以上的连续性流产,在 育龄妇女中的发病率约为0.5%・3%[70】。褪黑素可以调节子宫内膜形态,并且可 能通过调节激素来帮助成功受孕。孕酮对于受孕和维持健康怀孕至关重要。它 在月经周期的后半期由黄体分泌,在妊娠早期由黄体和胎盘共同分泌。孕酮使 子宫内膜进入准备植入胚胎的状态。如果胚胎种植,黄体会继续产生孕酮,但 在妊娠8到12周,开始完全由胎盘产生孕酮并在此后维持妊娠状态El。在人体 的颗粒细胞和黄体细胞中均可以检测到褪黑素的结合位点,褪黑素可增强人颗 粒细胞和/或黄体细胞中由hCG刺激的孕酮产生跑。同时,褪黑素也增加催乳素 分泌并抑制催产素释放[72,7現总之,大量研究表明褪黑素对维持孕酮的产生和 黄体功能很重要。除此之外,已有多项研究证实了 RSA与炎性细胞因子和高水 平的ROS有关,即抗氧化剂水平与ROS产生之间的不平衡可能是RSA相关病 理过程开始和进展的原因[74,75]。在胚胎流产前,ROS诱导的膜损伤的生化指标 如脂质过氧化物会显著升高⑴】。RSA患者的血清和/或胎盘组织中可检测到显著 降低的GPx, CAT活性和硒水平以及增加的脂质过氧化物和丙二醛水平"I。而 褪黑素作为一种强效抗氧化剂和维持孕酮产生的调控因子,是否直接参与RAS 的发生发展仍是未知。

4展望

目前对褪黑素的合成和分泌过程以及作用机制等方面的大量研究已取得了 重大的进展。它是一种多效性分子,是强大的自由基清除剂,广谱抗氧化剂和 多效免疫调节剂。女性生殖系统受神经内分泌免疫轴的控制和调节,因此褪黑 素被认为在女性生殖中发挥重要作用,并参与许多生殖系统的生理学和病理学 过程。如上所述,大量研究表明褪黑素参与包括卵泡发育、卵母细胞成熟、排 卵等在内的女性生殖生理过程。但其诱导人颗粒细胞當体类激素的生成机制以 及最利于人卵子发育的褪黑素作用浓度和调控卵子发育潜能的分子机制仍有待 研究。

此外,褪黑素缺乏似乎与多囊卵巢综合征,子宫内膜异位症和反复性流产 的病理过程有关。PCOS与氧化应激增强之间的关联使褪黑素成为PCOS患者的 可能药物。褪黑素可能通过促进卵母细胞的成熟和改善卵母细胞质量使PCOS 患者受益。褪黑素的抗氧化和抗炎能力,及其通过激素途径的内分泌调节功能, 似乎是EMS的有效治疗候选药物。已有的多项动物实验也表明,外源性褪黑素 的应用可以抑制EMS异位病变,缓解骨盆疼痛,改善EMS患者的睡眠质量。 除此之外,褪黑素可能有利于炎症消退,因此可能是治疗EMS的理想化合物。 然而,尚未有研究评估正常内膜环境和局部内膜异位环境中的褪黑素水平的差 异性。褪黑素浓度是否与EMS的发生、发展和严重程度有关仍尚不清楚。褪黑 素对子宫内膜基质细胞的活力、增殖、凋亡、自噬、迁移和植入的直接和间接 调节机制也仍需要更多的研究。褪黑素的免疫调节功能会影响不同生理或病理 条件下不同免疫细胞的功能和状态,而RSA与氧化应激和免疫失调密切相关。 但母体外周血和母胎界面的褪黑素水平是否影响胚胎植入和妊娠结局尚不清 楚;异常的褪黑素分泌是否会破坏母胎免疫耐受性也仍需要进一步研究。虽然 许多研究已证明了外源性褪黑素在人类应用的安全性皿7刃,为这些疾病的治疗 开辟了新思路。但基于根据目前的研究结果将褪黑素应用于这些疾病的治疗仍 有很长的路要走,这需要多学科基础研究和临床研究证实。

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致谢

生殖医学是一门令人向往的高精尖学科。三年前,我很幸运地获得了 在郑州大学第一附属医院生殖医学中心攻读生殖医学方向的硕士学位的 机会。我很珍惜这个来之不易的机会,所以我一直都是很认真地对待我的 学业。我们课题组是一个有高追求、互帮互助的和谐集体。在这个课题组, 我学到了很多知识,除了临床技能,还有科研思维及科研能力。短短三年 里,我收获了很多良师益友,思考问题的高度和格局也得到了升华。

首先,我最想感谢的是我的导师孙莹璞教授。您通过言传身教教导我 们的“诚实、勤奋、谦虚、感恩、担当、作为”的为人处世原则始终贯彻 于我的研究生生涯中。您不仅在学业上给予我们指导,更教会了我们很多 做人的道理。您用实际行动向我们展示了何为大家风范。当您的学生是一 种荣幸,因为是您让我养成了良好的学习习惯,是您让我懂得了科研的意 义,也是您促使了我更加奋发向上。今后,我要以您的品行、您的操守为 模范,努力成为一个像您一样优秀的人!

同样地,我也衷心的感谢我的第二导师方兰兰博士。刚进入实验室, 我有太多问题不明白。是您不厌其烦地给我讲述实验意义、实验方法;您 亲自操作给我们作示范,帮助我很快地进入科研状态。同时您严谨科研态 度,让我从科研一开始就学会对待科研严谨的必要性!

另外,在我的研究生生涯中,郑州大学第一附属医院生殖医学中心的 翟军老师、苏迎春老师、郭艺红老师也都给予了我很多帮助。研究生学习 过程中,我经常会遇到一些困难,包括心理困惑、生活压力。真的很感谢 您们及时给予我心里的疏导、生活上的关心,还有学业上的帮助!

我的研究生学业的顺利完成,还有很多人要感谢。真的很感谢胡琳莉、 张轶乐、宋文妍、金海霞、徐家伟、王恩银、姚桂东、杨庆岭、李刚、牛 文彬等老师。没有您们,我的临床工作和实验很难顺利完成。同时,也感 谢我的师姐孔慧娟、代玮、李嬪、程婷婷、赵菲、王琳琳、于医萍,师兄 卜志勤、张楠等。您们是我实验中最容易接触到的人,实验中的小错误, 实验中的困惑,生活中的困惑,您们都会不厌其烦地听我讲、尽力地帮我。 感谢生殖中心董悦芝、陈秋菊、杨丽、张倩、程露遥等所有护士老师。没 有您们的帮助,我的临床实践还有科研工作不会这么顺利地完成。非常感 谢我的同学王斯嘉、孔月、李彤、李颖、李芳媛、欧阳璐;师妹郭燕洁、 李羽曦、闫阳、史达源、杨琐、马禹佳、孔德琦等对我的工作及学习的支 持!

最后,我要感谢我的父母、亲人和朋友。你们的理解、关心和支持是 我得以全身心投入学习及工作中的最大保障,你们的期望与赞赏也是驱使 我不断奋发向前的动力!