哇来麟酸通过TLR4介导巨噬细胞Ml极化参与双磷酸盐相关性颌骨骨坏死的机制研究论文

2020年8月11日15:37:35哇来麟酸通过TLR4介导巨噬细胞Ml极化参与双磷酸盐相关性颌骨骨坏死的机制研究论文已关闭评论

哇来麟酸通过TLR4介导巨噬细胞Ml极化参与双磷酸盐相关性颌骨骨坏死的机制研究论文

中文摘要

双磷酸盐相关性颌骨骨坏死(Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw, BRONJ)是一种因长期注射双麟酸盐类药物引起的严重并发症,临床上,患者 在经历牙拔除术后多表现为持续长达八周以上的经久不愈的开放性拔牙创,并 伴有疼痛与局部炎症。外科手术切除与抗炎治疗尚不能起到关键性治疗作用。 以往报道显示卩坐来麟酸主要通过抑制破骨细胞活性进而降低局部颌骨骨代谢水 平最终导致BRONJ的发生。而近年来很多学者报道巨噬细胞也可能作为一个 关键因素参与BRONJ的发生,但其具体的机制尚不清楚。因此,本实验通过 研究卩坐来麟酸(Zoledronic Acid, ZA)诱导下的出现的Ml型巨噬细胞极化及相 关作用机制,从免疫学角度探究BRONJ发病的新机制。通过转录组水平筛选 发现伴随Ml巨噬细胞极化TLR-4 (Toll-Like Receptor-4)的表达也明显升高,并 进一步验证TLR-4介导的巨噬细胞Ml极化参与小鼠BRONJ的发生,通过本 实验研究,TLR-4可能作为新的靶点为临床上防治BRONJ提供更多实验基础以 及新的思路。

第一部分:口坐来麟酸对小鼠骨髓巨噬细胞极化的影响。

目的:体外分离培养小鼠骨髓巨噬细胞后检测ZA处理后小鼠BMDMs的极 化状态。

方法:骨髓贴壁法成功获取小鼠巨噬细胞之后,使用ZA处理体外培养成熟 的BMDMs细胞,24小时之后通过流式细胞仪检测Ml型(CDllc阳性)及M2型 (CD206阳性)巨噬细胞表达比例的变化,分析ZA对于巨噬细胞极化的影响。提 取极化诱导之后的巨噬细胞总蛋白,western blot实验检测Ml型及M2型巨噬 细胞标记物的表达。在以每孔接种60万细胞的24孔板中使用ZA进行巨噬细 胞极化诱导,并通过细胞免疫荧光技术状态使用激光共聚焦显微镜观察对于 BMDMs极化进行观察。提取经ZA处理的小鼠巨噬细胞培养液上清进行酶联免 疫吸附试验(ELISA),检测巨噬细胞上清中TNF-a与IL-1卩的表达量。

结果:流式检测结果显示在ZA作用下巨噬细胞明显呈现出Ml极化倾向, 蛋白印迹实验验证了这一结果。细胞免疫荧光结果显示:ZA作用下的巨噬细胞 呈现岀Ml极化增多,M2极化减少的趋势。同时,酶联免疫吸附试验 (ELISA)显示ZA诱导的巨噬细胞分泌TNF-a以及IL-1卩增多的这一结果。

结论:体外培养的小鼠巨噬细胞在ZA处理后呈现出明显的Ml极化趋势, 并释放TNF-a与IL-1卩等炎症因子。

第二部分:哩来麟酸通过TLR-4/NF-kB信号通路调控巨噬
细胞Ml极化

目的:通过检测ZA处理后的巨噬细胞Toll样受体(TLRs)表达水平的变 化,筛选出ZA的可能作用通路,并分析其对于巨噬细胞极化的影响。

方法:1、通过筛选ZA刺激巨噬细胞后Toll样受体家族基因转录组的表达 量,筛选出变化较为明显的TLR-4o并通过western blot检测巨噬细胞在ZA作 用下TLR-4/NF-kB信号通路的表达情况。使用荧光探针标记的ZA处理巨噬细 胞,通过激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对ZA的胞吞时间,同时提取细胞总 蛋白验证甲羟戊酸通路发挥作用时间相与ZA激活TLR-4的时间关系,探究ZA 对于巨噬细胞的作用机制。2、提取TLR-4全敲除小鼠巨噬细胞,通过western blot验证ZA对巨噬细胞极化状态及NF-kB通路的影响。3、使用TLR-4小分子 抑制剂(TAK-242)和ZA共同处理的小鼠巨噬细胞,western blot检测TLR-4 信号通路相关指标表达情况。

结果:1、通过对TLRs家族转录组的分析,我们发现小鼠巨噬细胞中的 TLR-4在ZA作用下呈现高表达趋势,并且TLR-4下游通路NF-kB被活化,表 现出巨噬细胞Ml极化趋势。通过激光共聚焦观测发现ZA首先激活巨噬细胞 表面膜受体蛋白TLR-4进而被巨噬细胞胞吞,同期检测ZA处理巨噬细胞后的 甲瓮戊酸通路亦可得到这一结论。2、ZA无法极化TLR-4表达缺失的巨噬细 胞,且TLR-4下游信号通路在ZA作用下无明显变化。3、TLR-4小分子抑制剂 可以阻断由ZA引起的TLR-4信号通路活化。

结论:ZA通过巨噬细胞膜受体TLR-4活化TLR-4/NF-kB信号通路,进而被 巨噬细胞内吞。TLR-4表达缺失导致巨噬细胞无法被ZA诱导向Ml极化。

第三部分U坐来麟酸对TLR-4敲基因小鼠拔牙创愈合的影 响。

目的:通过构建小鼠BRONJ模型,观察野生型小鼠(WT)与TLR-4基因敲 除小鼠(TLR-47)颌骨拔牙创周围软组织中的巨噬细胞极化状态以及小鼠拔牙 创愈合情况,进而确定TLR-4是否在BRONJ小鼠模型中扮演重要的角色。进 一步研究体内预防性使用TLR-4抑制剂(TAK-242)对小鼠BRONJ的预防效 果。

方法:1、建立C57/B6小鼠BRONJ模型,并通过大体观测、影像学、组织 学、整体发生率四个方面综合评估ZA处理后的野生型小鼠BRONJ的发病情 况。2、同等标准条件下建立TLR-47'小鼠BRONJ模型,通过大体观测、影像 学、组织学、整体发生率四个方面综合评估ZA处理后的TLR-47'小鼠BRONJ 发病情况并与WT小鼠进行比较分析。3、对成功造模后的小鼠的颌骨拔牙创进 行冰冻切片染色,采用激光共聚焦显微镜观察并统计WT和TLR-47'小鼠 BRONJ模型颌骨巨噬细胞极化的差异。4、WT小鼠诱导BRONJ模型在ZA给 药前一周预防性使用TAK-242,与未给予TAK-242的处理的对照组对比 BRONJ的发病率。使用激光共聚焦显微镜观察两组小鼠颌骨拔牙创周围软组织 中巨噬细胞极性转化的差异。

结果:1、成功建立小鼠BRONJ模型,与空白对照组相比,ZA处理后的小 鼠拔牙创延迟愈合,拔牙创内部骨质空虚,组织学分析提示拔牙创周围生成较 多死骨。2、相比WT小鼠,TLR-47'小鼠中BRONJ发病率明显降低,拔牙创延 迟愈合情况得到改善,死骨形成较少与WT组小鼠。3、冰冻切片染色结果显示 WT小鼠拔牙创周围软组织中巨噬细胞呈现明显的Ml型极化状态,TLR-47'小 鼠拔牙创周围软组织中可见M2型巨噬细胞浸润减少,但未见Ml型巨噬细胞 增多。4、对WT小鼠预防性使用TAK-242处理后小鼠BRONJ发病率明显降 低。大体观、影像学、组织学均表现出拔牙创的愈合情况优于与未给予TAK- 242的处理的对照组。同时,TAK-242的使用可以明显降低ZA诱导的小鼠拔牙 创Ml型巨噬细胞极化浸润。

结论:TLR-4在小鼠BRONJ的发生发展以及拔牙创周围Ml巨噬细胞的极 化中扮演着重要的角色。TAK-242可以明显改善由ZA导致的小鼠BRONJ的发 生,并且减少Ml型巨噬细胞在拔牙创周围的浸润。以上研究结果为TLR-4作 为新靶点防治BRONJ提供实验依据。

关键词:双麟酸盐颌骨骨坏死,Toll样受体-4,拔牙创愈合,巨噬细胞极化

Zoledronic acid promotes TLR-4-mediated Ml macrophage
polarization in bisphosphonate-related osteonecrosis of the
jaw

Abstract

Bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw (BRONJ) is a detrimental side effect of the long-term administration of bisphosphonates. Clinically, patients usually have the open-sockets and last for more than eight weeks. With pain and inflammation. Surgical resection and anti-inflammatory treatment have not played a key therapeutic role. Previous reports have shown that zoledronic acid mainly causes BRONJ development by inhibiting the activity of osteoclasts and then reducing the level of bone metabolism in the jaw. In recent years, many scholars have reported that macrophages may also be a key factor in the pathogenesis of BRONJ, but the specific mechanism is not known. Therefore, this study explored the new mechanism of BRONJ pathogenesis from the perspective of immunology by studying the superaboundant amount of Ml macrophage polarization induced by zoledronic acid (ZA) and its specific mechanism. By screening for TLR-4 with a marked increase in Ml macrophage polarization, our study also predicted that TLR-4 mediated Ml macrophage polarization is involved in the pathogenesis of mouse BRONJ, and through this study the target of TLR-4 also provides more experimental evidence and ideas for clinical prevention and treatment of BRONJ.

Part I ZA promotes mice BMDMs polarizations.

Objective: Detective the macrophage phenotype after the ZA treatment.

Methods: Firstly, detect the macrophage phenotype after the ZA treatment and PBS treatment by flow cytometry. To confirm these data, the BMDMs protein level was determined using CD-86 or iNOS for the Ml macrophages and CD-206 for the M2 macrophages. Furthermore, 6*105 cells were seeded in the 24-well flask for IF staining and the confocal analysis. The cells supernatant was also harvested for detecting the TNF-a and IL-ip expression level using ELISA.

Results: The western-blot analysis, flow cytometry and the IF staining showed the same result that the Ml polarization was up-regulated by the ZA treatment. Conclusion: ZA promotes the Ml-macrophage polarization in vitro.

Part II ZA activates the TLR-4/NF-kB signaling, and ZA cannot promotes Ml macrophages polarization in TLR-4 /_ BMDMs.

Objective: Detecting the TLRs expression level after the ZA-treatment. And its possible effect in macrophage polarization.

Methods: 1: Detecting the TLRs mRNA levels after the ZA treatment, and TLR-4 was significantly overexpressed after the treatment. Then, the TLR-4/NF-kB signaling was analyzed by WB. By utilizing the immunofluorescent-labeled ZA, we also detected the time of the macrophage internalization of ZA. Next, the mevalonate signaling pathway was also detected. 2: The NF-kB signaling and the macrophage polarization were also detected in TLR-4 /_BMDMs. 3: The small molecular inhibitor of TLR-4 signaling (TAK-242) was adopted to investigate the potential way of preventing TLR-4 signaling activations.

Results: 1: We found that TLR-4 was highly up-regulated after the ZA treatment, besides, the TLR-4 signaling downstream NF-kB was also activated by ZA. Then Ml macrophage polarization was also enhanced. We also found that ZA activates the TLR-4 signaling before the endocytosis. Furthermore, the mevalonate pathway also showed a uniform conclusion. 2: ZA cannot promotes the macrophage polarization, and the TLR-4 signaling downstream shows no difference after the ZA-treatment. 3: The small molecular inhibitor of TLR-4 signaling could inhibit the ZA-induced TLR- 4 downstream activation.

Conclusion: ZA activates the TLR-4/NF-kB signaling, then internalized by macrophages. ZA could not induce the Ml macrophage polarization in the TLR-4’

BMDMs.

Part III The role of TLR-4 in macrophage polarization of extraction sockets and the development of BRONJ.

Objective: We generated the WT and TLR-4 /_ BRONJ-like disease mice model, for analyzing the role of TLR-4 in macrophage polarization and wound healing of mice tooth extraction sockets. Intravenously injected the TAK-242 one week before the ZA administration into the WT mice. Then, compared the incidence rate of BRONJ with the ZA-treated group, finally compare the phenotype of macrophage infiltrated in the extraction sockets of these two groups.

Methods: 1: generating the BRONJ-like disease mice model. Then, evaluate the healing condition by their clinical appearance, micro-CT analysis, histology analysis and the incidence rate of delayed wound healing. 2: Comparing the BRONJ development of WT and TLR-4’ mice. 3: Detecting the macrophage polarization of WT and TLR-4’ tooth-extraction sockets. 4: Using TAK-242 one week before the ZA injection, evaluate its prevention effect of BRONJ and the macrophage polarization.

Results: 1: The mice BRONJ-like disease model was successfully generated, and ZA- induced socket wound healing delay appears in the ZA-treated mice. 2: Compared with WT mice, TLR-4’ mice have lower incidence rate of BRONJ, less necrotic bone formation and better healing of the tooth extraction sockets.3: The confocal analysis showed an elevated Ml macrophage polarization in WT mice, but the M2 macrophage polarization was decreased and Ml macrophage infiltration appeared to be no difference after the ZA-administration in the TLR-4’ mice. 4: The TAK-242 pre-treated mice have lower incidence rate of BRONJ better socket wound healing and less necrotic bone formation. 5: The pre-treatment of TAK-242 could reduce the Ml-macrophages infiltration in the extraction sockets.

Conclusion: TLR-4 plays an important role in the Ml macrophage polarization in the mice tooth extraction sockets, and the development of BRONJ. The small molecular inhibitor of TLR-4 (TAK-242) could reduce the incidence rate of BRONJ, and TAK-242 might has the potential of becoming a preventative drug of BRONJ.

Key words: BRONJ; TLR-4; wound healing; macrophage polarization.

前言

含氮双麟酸盐被广泛用于患有转移性骨癌,佩吉特病和骨质疏松症的患者

[l]o然而,在接受高剂量静脉注射双麟酸盐如卩坐来麟酸(ZA)和帕米麟酸盐 后,患者可能会出现双麟酸盐相关的颌骨坏死(BRONJ) [2]o BRONJ是一种 罕见但具有破坏性的疾病,其中2/3的病例发生在下颌骨[3]。BRONJ被定义为 颌面部坏死骨暴露,持续超过8周,患者没有接受颌骨放射治疗,并且目前或 之前没有使用过抗骨吸收或抗血管生成剂的治疗的历史[4]。牙齿拔除、牙周 炎、创伤和口腔感染等风险因素均可能导致BRONJ的发生[2, 5, 6]o以往的研 究报道,骨吸收抑制,血管生成抑制和维生素D缺乏均可导致BRONJ[7-9]o目 前BRONJ的治疗主要以抗炎保守治疗为主,手术清创治疗主要应用于保守治 疗效果不佳及骨坏死面积较大的患者,但在某些病例中会加重病情。

巨噬细胞作为伤口愈合和骨折修复的关键介质[10]在骨代谢[11]和组织再 生[12]中发挥重要作用。最近的研究显示巨噬细胞参与颌骨坏死(ONJ)的发生 发展。此外,有研究报道,IL-17介导的Ml / M2型巨噬细胞极化可导致 BRONJ样骨疾病的发生⑵,Ml巨噬细胞表达的炎性体含有pyrin结构域的蛋 白3促成炎症微环境并延迟糖尿病小鼠和人类拔牙后的伤口愈合[6]。因此,巨 噬细胞极化可能是BRONJ进展过程中的重要介质,但其具体作用机制仍需深 入研究。

Toll样受体(英文全称,TLRs)是调节先天免疫系统的重要受体[13-15]O 最近的研究揭示了 TLRs在宿主防御中的关键作用,其中负性调节的丧失是炎 症性疾病发病机制的基础[16]o通过基因表达数据库BioGPS分析,小鼠骨髓来 源的巨噬细胞中Toll样受体-4 (TLR-4)呈现高表达[17],并且TLR-4介导促炎 表型交替。巨噬细胞能够维持慢性病的状态[18]o TLR-4与BRONJ相关的炎性 因子如脂多糖(LPS)及IL-17[19, 20]具有高度相关性。此外,TLR依赖性转录 因子,NF-kB和AP-1,可导致Ml巨噬细胞极化增强[21], TLR2 / 4信号也参 与miRNA介导的肺泡巨噬细胞极化[22]。因此,深入研究TLR-4是否参与调控 ZA诱导的Ml巨噬细胞极化,对BRONJ的治疗具有重要意义。

在本研究中,我们特别关注TLR-4与BRONJ发生发展之间的相关性。我 们发现,与其他TLRs相比,TLR-4在ZA处理后的巨噬细胞中表达显著增强。 此外,与野生型小鼠相比,ZA作用下TLR-4基因敲除小鼠Ml型巨噬细胞极化 减少并且表现出更好的伤口愈合效果。就潜在的机制而言,在ZA作用下,

TLR-4表达受到抑制从而阻断下游NF-kB通路活化并挽救小鼠BRONJ样病 变。综上,我们的研究结果表明TLR-4作为新的靶点可能为BRONJ的治疗提 供新的思路和线索。

 

正文

第一部分瞠来麟酸对小鼠巨噬细胞极化的影响

本部分实验旨在通过ZA处理巨噬细胞,提出“ZA促进Ml型巨噬细胞极性转化”的假设。 本实验利用流式细胞分选,western blot,酶联免疫吸附试验,细胞免疫荧光等手段,通过多个 角度多个指标检测ZA对于巨噬细胞极性转化的影响。

1 •材料与方法

1.1实验材料和试剂

1.1.1实验动物

4周龄C57/B6J小鼠,体重约17+5 g,由南京医科大学动物研究所提供。

1.1.2细胞培养的主要试剂

卩坐来麟酸(ZAlOptM)(诺华,择泰)其余同第一部分

1.1.3蛋白提取及western blot相关试剂

1)蛋白提取相关试剂:RIPA蛋白裂解液(碧云天,江苏)。

2)  western blot相关试剂:SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(凯基,江苏),5x 蛋白上样缓冲液(碧云天,江苏),蛋白Marker (Fermentas,美国), SuperSignal West Pico 化学发光底物(Thenno,美国)。

3)  western blot相关抗体:CD86单克隆抗体(Abeam, CD206单克隆抗体 (Abeam, Ab64693)、CD206 单克隆抗体(Abeam, Ab64693),小鼠

抗P-actin单克隆抗体(BM0627,博士德公司,武汉),山羊抗兔IgG

(ZB-2301;中杉金桥,北京),山羊抗小鼠IgG (ZB-2305;中杉金桥, 北京)。

1.1.4 western blot实验相关化学试剂

小鼠抗CD86单克隆抗体(Abl 12490, Abeam)

小鼠抗CD206单克隆抗体(Ab64693, Abeam)

小鼠抗卩-ACTIN 单克隆抗体(3700, Cell Signaling Technology)

1.1.5免疫荧光细胞化学相关试剂

Triton X-100 (SIGMA,美国),正常山羊血清(博士德公司,北京), DAPI(碧云天公司,江苏),iNOS单克隆抗体(Abeam, ab3523); CD206 单克隆抗体(Abeam, Ab64693)。

1.1.6实验设备及仪器

生物安全柜(SG403aHE, BAKER公司,美国),CO2孵育箱(HERA cell 150, Thermo公司,美国),恒温台式多用离心机(MACH1.6R, Thermo公司,德国),光学倒置相差显微镜成像系统(1X50, OLYMPUS公司,日本),酶联免疫检测仪(Bio-tek公司,美国),数显 恒温水浴箱(HH-2,常州国华电器公司),低温离心机(Heraeus,德 国),常温离心机(Thermo,美国),4°C> -20°C冰箱(中国海尔公 司),-80°C冰箱(Thermo,美国),分光光度计(Amersham bioscience,英国),SDS-PAGE电泳仪和转膜仪(Bio-Rad公司,美 国),PVDF 膜(Millipore,美国),基因 PCR 扩增仪(Eppendorf,德 国),7300 Realtime PCR system(ABI公司,美国),凝胶成像系统

(WEALTEC,美国)。

117主要试剂的制备

(1) BMDMs培养液的配制:

DMEM高糖培养基                            500ml

10%胎牛血清                                     50ml

青链霉素                                            5ml

Recombinant murine M-CSF              50mg

  • PBS 缓冲液:将 NaCl 8 g> KC1 0.2 g> Na2HPO4-12H2O 3.6 g> KH2PO4 24 g加入烧杯,用900 ml纯水溶解后,调pH至7.4,纯水定容至1000 ml,室温保存。
  • PBST 缓冲液:将 NaCl 8 g> KC10.2g、Na2HPO4-12H2O 3.6 g> KH2PO4 24 g加入烧杯,用900 ml纯水溶解后,加入Tween-20 0.5 ml,调pH 至7.4,纯水定容至1000 ml,室温保存。
  • 5xTris-Glycine电泳缓冲液的配制:称取Trise base 15 g>甘氨酸94 g> SDS 5.0 g,加入约800 ml的去离子水,搅拌溶解后加去离子水定容至1 L,室温保存。
  • 转膜缓冲液(使用时配制):配制1L转移缓冲液,称取3 g甘氨酸、 3.6 g Trise base,加入300 ml甲醇,搅拌溶解后加纯水定容至1 L, 4°C 预冷。
  • 1%DEPC水:1 ml DEPC水溶于1000 ml双蒸水,高压消毒,4°C保 存。

1.2实验方法

  • BMDMs细胞的获取
  • 通过颈脱位处死小鼠,在75%无水乙醇中浸泡5分钟,然后转移到PBS 中,冲洗并干燥以解剖和分离胫骨和腓骨而不破坏腿骨完整性。
  • 用无菌纱布擦去胫骨和股骨上的残余肌肉组织。将胫骨浸入含有双抗体的 冰浴培养基中,并将其转移到生物安全柜中,如下提取骨髓细胞:

a剪掉胫骨的两端,可线显露髓腔内部骨髓;

b注射器吸取5 ml含双抗的培养基,由胫骨一端向骨髓腔注入,将骨髓冲 洗入一 50 ml离心管,反复三次;

c 1000 rpm, 4度离心5 min,倒去上清用10ml碧云天牌红细胞裂解液重悬 骨髓细胞沉淀,裂解2min之后用20ml完全培养基终止裂解;

d lOOOrpm, 4度离心5min,倒去上清。用10ml含有murine M-CSF的完全 高糖培养液重悬细胞,并种于10mm大皿里培养三天。

e 3天后添加一倍含有murine M-CSF的完全高糖培养液;

f 5天后倒置显微镜观察贴壁的巨噬细胞呈密集排列。

g 2.5%胰蛋白酶消化收获成熟的巨噬细胞用于流式鉴定,并用于进行后续实 验。

  • BMDMs的形态学观察

h用倒置显微镜观察成熟的巨噬细胞,观测其生长,增值及其他行他学的 特征。

  • BMDMs的流式细胞学鉴定
  • 将成熟的巨噬细胞消化并离心,得到细胞沉淀。
  • 以lOOOul DPBS重悬细胞沉淀。重复以DPBS清洗细胞2-3次。500 xg, 3mins 离心
  • 以100ul含2%FBS的DPBS重悬细胞沉淀,并以FC block处理细胞

15mino

  • 直接以2ul/l*106细胞加入F4/80和cdllb流式抗体,避光处理

30mino

  • 以lOOOul DPBS重悬细胞,并弃去上清,反复清洗三次。
  • 以500ul DPBS重悬细胞,避光,等待上机。

1.2.4巨噬细胞的极化诱导。

  • 收获的成熟的巨噬细胞分别以1*106/孔铺于六孔板中,置细胞培养箱 培养24小时
  • 分别以100ng/ml LPS以及40ng/ml IL-4处理细胞24小时后观察细胞 形态以及流式细胞分选结果以确定巨噬细胞极化的水平。

1.2.5 western blot 实验

(1)总蛋白提取

a取出细胞培养瓶,将原细胞培养液全部倒去,在每个小瓶中加入3ml 4°C预冷PBS溶液(0.01 mol / L, pH 7.4),轻轻摇动1 min,洗净细 胞,弃去PBS溶液,重复上述步骤。在三次操作之后,将培养瓶倒置在 吸收纸上以吸收瓶中剩余的液体。

b加入1(11含有PMSF (100 mM)的RIPA蛋白裂解液加,向将被提取蛋 白的每个小瓶中加入200(11含有PMSF的RPPA蛋白裂解液,轻轻摇动裂 解液至烧瓶底部,在冰上进行细胞裂解过程30分钟。将冰盒在摇床上摇 动以使细胞完全裂解。

c用干净的刮刀刮掉烧瓶一侧的裂解细胞,然后用移液管将细胞碎片和裂 解液转移到预先冷却的1.5ml离心管中。

d使用超声细胞破碎器将收集的含有细胞碎片的裂解物超声处理1分钟。

e超声处理后的裂解物在4°C以12000rpm离心5分钟。

f离心后,将上清液收集到1.5 ml离心管中,得到总蛋白质。

g Bradford方法测定上述提取的总蛋白的蛋白质浓度,按体积加入5x蛋白 质上样缓冲液,混合并煮沸5分钟,分配并储存在-80°C ,避免反复冻 融。

Brandfold法标准曲线测量细胞蛋白浓度方法:

a制作标准曲线:按下表在各管中加入各种试剂,混匀后,室温放置2
min,在生物分光光度计上比色分析,计算制作标准曲线方程。

b分别吸取10(11样本蛋白,10(il0.15mol/LNaC 1加入1 ml G250考马斯亮 蓝溶液中摇匀,在生物分光光度计上比色分析,得出吸光度值,根据标 准曲线方程计算出样本蛋白含量。

  • western blot

a上样和电泳:配制聚丙烯酰胺分离胶和聚丙烯酰胺浓缩胶。

将分离胶均匀的注入大小两玻璃板间,加入至高度的2/3后,用双蒸水压

平液面。待分离胶凝固后吸去双蒸水,加入浓缩胶,立即插入梳子,待浓缩胶 胶完全凝固后将玻璃板放入电泳槽内,加入1X电泳缓冲液,拔掉梳子,根据每 个泳道内加入样本总蛋白20憾计算出相应的上样体积,蛋白Marker加10 pl, 浓缩胶60V、分离胶80V恒压电泳。

b转膜

将海绵和滤纸放于预冷的转膜缓冲液中浸泡10 min,取出WB胶并切胶、 铺胶于滤纸上,将甲醛浸润的PVDF膜正面覆盖在胶上,用滚轮在膜上滚动挤 压赶除胶与PVDF膜之间存在的气泡,并将贴好滤纸和海绵的一起移入电泳槽 内,加入转膜缓冲液,冰水混合物降温下用300 mA恒流转膜共90分钟左右。

c封闭

从转膜槽中取出PVDF膜,用PBST先清洗膜一次,以便于去除PVDF膜 上的残留的SDS,将PVDF膜浸泡在PBST配制的5%脱脂牛奶中封闭,并缓慢 摇动,室温下封闭2小时。

d 一抗孵育

  1. 将封闭结束的PVDF膜取出,分别孵育在事先配好的一抗中(1: 1000 稀释),并且在4度中摇床封闭过夜。
  2. PBST漂洗PVDF膜3次xlO min,以杂交袋装PVDF膜,分别加入山羊 抗兔 IgG 1 ml (1:10000),山羊抗小鼠 IgG 1 ml (1:10000), 37°C孵育 1 h, PBST缓冲液漂洗PVDF膜10次xlO min。

e显影检测

以杂交袋装PVDF膜,以A: B=l: 1的比例将化学发光底物按照配好加入各杂交袋中,暗 室曝光,每张膜均以暗盒封闭显影1分钟后、水洗,晾干

1.2.6流式细胞分选实验

  • 贴壁法培养BMDMs细胞,给予不同刺激因子处理细胞24小时候PBS 轻洗三次。
  • 每个细胞培养皿内加入300ul PBS,用橡胶细胞刮刀轻轻刮下铁壁 BMDMs 至 PBS 中。
  • 上步得到的细胞悬液经由500xg, 3min离心后反复用DPBS清洗2-3 遍。
  • 以lOOul PBS重悬细胞,按照2(iL/l*106细胞的比例加入Fc阻断剂避光

15mino

  • 直接以2I1L/1*"细胞的比例加入一抗,避光30mino
  • 5OOxg, 3min离心后反复用DPBS清洗2-3遍。
  • 流式上机。

1.2.7巨噬细胞免疫荧光检测

  • 盖玻片处理:将盖玻片浸泡强酸过夜,用自来水冲洗残留的酸并使用 蒸憎水反复冲洗3次,晾干,放入玻璃皿中,用干净的纱布包好,用高压蒸汽 消毒,干燥后使用;
  • 取10cm细胞培养皿,在每个培养皿中均匀放置3个盖玻片,不进行 诱导的细胞、分别诱导为Ml, M2细胞,消化,离心,制备单细胞悬液;
  • 将一滴细胞悬浮液滴在每个培养皿盖玻片的中心,在37°C, 5%CO2 下孵育30分钟,然后将培养液缓慢加入液体中,无盖玻片,37。。5%孵育二 氧化碳过夜;
  • 进行免疫荧光细胞化学染色,激光共聚焦观察细胞。

1.2.8 ELISA酶联免疫吸附试验

  • 获取处理过后的巨噬细胞上清液,直接使用或-80度保存。
  • 以标准品制作相应标准曲线样本孔。
  • 将收获的细胞上清设置复孔加入微孔板中(抗原夹心法)。
  • 配置产品相应的标准清洗液反复清洗每个微孔板四次。
  • 加入预混好的显色液避光显色15minso
  • 上机检测。

1.2.9数据分析

结果表示为平均值土标准误。本实验所使用Prism 7软件(GTaphPad

Software, La Jolla, CA, USA)进行统计分析。使用非配对Student's t检验分 析两组之间的比较。使用单因素方差分析进行多于两组之间的比较,然后进行 Tukey多组T检验比较。其中,当P<0.05的时候被认为差异具有统计学意义 的。

2结果

2.1 BMDMs的形态特点

全骨髓贴壁法获取的小鼠骨髓来源的巨噬细胞在培养初期可见大量单核细胞悬浮,培养3 日之后可见大量M0巨噬细胞(图1.1-A),此时收获成熟的M0巨噬细胞进行Ml极化诱导, 可见巨噬细胞形态变圆润,细胞通透性下降(图1.1-B)。将巨噬细胞进行M2极化诱导之后可 见细胞伪足加长,细胞整体形态与M-CSF诱导出的细胞形态基本保持一致。(图1.1-0

图1.1 BMDMs的形态特点

A:小鼠BMDMs培养自第三天后可见大量巨噬细胞密集排布。

B: 100ng/ml LPS诱导24小时后,可出现Ml极化。

C: 40ng/ml IL-4诱导24小时候,可出现M2极化。图中bar代表100屮n。

2.2 BMDMs的生物学特征及鉴定

为了对本实验后续实验提供保障,本研究中每次提取的小鼠BMDMs都将经过流式细胞检 测巨噬细胞纯度(图1.2-A),流式细胞分选鉴定结果巨噬细胞标志物F4/80以及CDllb双阳 性细胞的比例在95%以上方可在后续实验中使用。之后,在对成熟巨噬细胞进行极化诱导并通 JI western blot实验(图1.2-B)以及细胞免疫荧光(图1.2-C)检测巨噬细胞表面标志物的表达 情况,经由LPS诱导过后的Ml型巨噬细胞表现为CD86高表达以及CD206低表达,经由IL-4 诱导之后的M2型巨噬细胞表现为CD86低表达以及CD206的高表达。

A: ZA处理后的巨噬细胞TNF-a分泌量增加;B: ZA处理后的巨噬细胞IL-

2.4卩坐来麟酸促进巨噬细胞TNF-a> IL-邛等炎症因子的分泌
ZA处理巨噬细胞24小时后收集细胞上清,ELISA检测上清液中炎症因子 TNF-a> IL-1卩的表达量(图2.2 A, B)

图2.2卩坐来麟酸促进巨噬细胞TNF-a> IL-1卩等炎症因子的分泌

A:流式细胞分选分析Ml型与M2型巨噬细胞比例。B:对于流式细胞分选的 统计。C, D: western blot检测ZA作用前后巨噬细胞中CD86与CD206 表达量的差异。E:细胞免疫荧光检测极化巨噬细胞数量,图中 ba尸 100pm。

1卩分泌量增加。图中数据代表均值土标准误,样本量二3。*PV0.05, **P

<0.01 o

3.讨论

巨噬细胞(希腊语中的“大食者T是单核骨髓谱系细胞,可消除部分外来 的病原体,并被从外周血中募集以快速介导炎症免疫反应和感染。巨噬细胞的 起源和归因功能一直在发展,以突出它们在几乎所有组织新陈代谢中的独特以 及重要的作用。巨噬细胞在许多生理过程中发挥不同的作用,其中包括葡萄 糖,脂质,氨基酸和铁代谢等,当巨噬细胞的功能发生改变时可导致疾病的发 生[23]。

研究显示,巨噬细胞在伤口愈合自然过程的所有阶段均发挥作用[24]。巨噬 细胞可以在不同的环境条件刺激下进行分化,分泌各种细胞因子,包括白细胞 介素、趋化因子、生长因子以及其他小分子[25]o通过这种自分泌的方式,巨 噬细胞协调炎症表型到再生表型的转变,引导其他细胞共同促进伤口自然愈合 [26]o然而,当组织缺陷超过临界尺寸时,必须通过原位植入支架以引导组织 再生并修复缺损。植入的支架通常刺激巨噬细胞聚集并引起异物反应

(FBR),导致长期炎症的发生[27],严重持续的炎症反应进一步阻碍伤口愈合 [28] o因此,巨噬细胞的应答反应对于组织创口的愈合起着重要的作用。作为 重要的抗原递呈细胞,巨噬细胞不仅能够通过抗原递呈的功能在疾病中发挥作 用。其极性的转化在炎症反应以及组织愈合中的作用同样也是近年来研究的热 点。而经检测,本部分实验成功获得的巨噬细胞符合流式细胞分选结果的要 求,可以作为后续实验使用的体外培养的细胞模型。

在本次实验中所采用的巨噬细胞提取的方法为骨髓细胞贴壁法,这样的方 法有利于获得数量较多的骨髓细胞以及更好的模拟了骨髓来源的巨噬细胞的生 长方式[29]o巨噬细胞在受到不同程度的外界刺激可以将自身极化成经典的Ml 型和非经典的M2型巨噬细胞[30],巨噬细胞极化指的是巨噬细胞如何在空间和 时间的里定点被激活。况且极化是不固定的,极化状态也反映出了巨噬细胞所 处的微环境状态[31]o本实验首先通过贴壁法提纯了巨噬细胞,在巨噬细胞被 成熟诱导之后又对其进行了极化诱导,证明了其在不同炎症环境中是可以做出 不同的反应和表面标记物表达的。本次试验中提取的小鼠骨髓来源的巨噬细胞 经流式炎症可以达到95%以上纯度(图1.2A),可以满足后续实验的需要。且 巨噬细胞可以被外界因子作用下诱导分化为Ml与M2型(图1.2 B-C)为后续 实验研究巨噬细胞极化在BRONJ发病机制中的重要作用奠定了基础。

巨噬细胞长期以来一直被认为是有效的免疫效应细胞,在组织稳态和病变 中具有明确的作用,例如,促进组织损伤的修复,并改善伤口愈合和组织重塑 [32]o有证据表明,巨噬细胞具有异质性和可塑性等特征[33],自身局部环境衍 生的刺激,可以诱导巨噬细胞表型极化,如Toll样受体(TLRs)和IFNy诱导 的经典(Ml)巨噬细胞极化和IL4诱导的改变型巨噬细胞极化(M2) o免疫 复合物(M2b)和抗炎细胞因子IL-10或转化生长因子-卩(M2c),分别反映巨 噬细胞的TH1/TH2极化并介导TH1/TH2相关的免疫反应[34] o特定的微环境 决定了巨噬细胞极性和状态,并反映了巨噬细胞从Ml到M2的连续的不同转 换中巨噬细胞对局部免疫微环境可能的作用与影响[35] o本实验通过应用ZA处 理巨噬细胞,建立BRONJ微环境体外细胞模型,观察小鼠巨噬细胞的极性转 化情况。通过流式细胞分选,western blot,细胞免疫荧光等实验,我们发现巨 噬细胞在ZA的作用下呈现明显的Ml型极化特征(图2.1) o ELISA实验结果 显示小鼠巨噬细胞在经过ZA处理后TNF-a、IL-1卩炎症因子的分泌显著增加 (图2.2),这一结果更加证实了 Ml型巨噬细胞的极化现象,表明ZA对于巨 噬细胞介导的局部炎症微环境的形成具有明显的促进作用。

ZA作为一种骨吸收抑制剂,通过抑制骨组织局部的破骨细胞活性来减缓 骨代谢速度[36] o有报道显示,ZA主要通过抑制巨噬细胞Rapla蛋白的异戊烯 化的水平来抑制巨噬细胞的甲瓮戊酸通路,进而促使ZA被巨噬细胞内吞[37]。 但是,ZA对于巨噬细胞内化以及巨噬细胞具体的极化调控机制仍不清楚。接下 来,对于ZA如何调控巨噬细胞极化与ZA对巨噬细胞存在的真正药理作用依然 需要进一步探索。后续实验也将着重围绕巨噬细胞相关炎症通路的检测,希望 能给ZA对其极化机制做更加详细的阐述。

第二部分(1坐来麟酸通过TLR-4/NF-kB信号通路调控巨噬细
胞Ml极化

第一节口坐来麟酸激活巨噬细胞TLR-4/NF-kB信号传导通路

本部分研究主要通过检测及筛选在转录水平差异性表达的巨噬细胞相关炎 症调控家族TLRs,提出“ZA通过TLRs调控巨噬细胞Ml极化啪勺假设。利用 PCR实验筛选可能的TLRs靶点。通过western blot分析TLRs下游通路变化情 况。通过对比ZA作用于巨噬细胞胞膜蛋白TLRs的时间与被巨噬细胞内吞的时 间,进一步阐明ZA调控巨噬细胞Ml型极化的作用机理。

1.材料和方法

1.1实验材料和试剂

1.1.1细胞培养的主要试剂同第二部分

1.1.2蛋白提取和western blot相关试剂

小鼠抗TLR-4单克隆抗体(76B357.1, Novous)

小鼠抗 MyD88 单克隆抗体(4283, Cell Signaling Technology)

小鼠抗 iKb-a 单克隆抗体 (4818, Cell Signaling Technology)

小鼠抗 P65 单克隆抗体 (8242, Cell Signaling Technology)

小鼠抗 p-P65 单克隆抗体(3303, Cell Signaling Technology)

小鼠抗 IRAK-4 单克隆抗体(4363, Cell Signaling Technology)

小鼠抗 TRIF 单克隆抗体(4596, Cell Signaling Technology)

小鼠抗 Lamin B1 单克隆抗体(13435, Cell Signaling Technology)

小鼠抗 Unprenylated-Rapla 单克隆抗体(SC-373968, Santa Cruz)

小鼠抗 Total-Rapla单克隆抗体(SC-398755, Santa Cruz)

1.1.3巨噬细胞内吞实验的相关试剂

荧光竣基标记的卩坐来麟酸(5-FAM-ZOL, Biocinc)其他同第二部分

1.1.4实时定量PCR相关试剂

1) RNA提取及逆转相关试剂:TRIzol (Invitrogen,美国),DEPC (Ameresco,美国),PrimeScript RT reagent Kit (DRR037A; TaKara 公司, 大连)。

2) 实时定量 PCR 试剂:SYBR Premix Ex TaqTM (DRR041A; TaKara 公司, 大连)。

3)实时定量PCR引物

1.1.5实验设备及仪器同第二部分

116主要试剂的制备同第二部分

1.2实验方法:

1.2.1 western blot免疫印迹实验

  • 总蛋白提取

a取出细胞培养瓶,将原细胞培养液全部倒去,在每个小瓶中加入3ml 4°C预冷PBS溶液(0.01 mol / L, pH 7.4),轻轻摇动1 min,洗净细 胞,弃去PBS溶液,重复上述步骤。在三次操作之后,将培养瓶倒置在 吸收纸上以吸收瓶中剩余的液体。

b加入1(11含有PMSF (100 mM)的RIPA蛋白裂解液加,向将被提取蛋 白的每个小瓶中加入200(11含有PMSF的RPPA蛋白裂解液,轻轻摇动裂 解液至烧瓶底部,在冰上进行细胞裂解过程30分钟。将冰盒在摇床上摇 动以使细胞完全裂解。

c用干净的刮刀刮掉烧瓶一侧的裂解细胞,然后用移液管将细胞碎片和裂 解液转移到预先冷却的1.5ml离心管中。

d使用超声细胞破碎器将收集的含有细胞碎片的裂解物超声处理1分钟。

e超声处理后的裂解物在4°C以12000rpm离心5分钟。

f离心后,将上清液收集到1.5 ml离心管中,得到总蛋白质。

g Bradford方法测定上述提取的总蛋白的蛋白质浓度,按体积加入5x蛋白 质上样缓冲液,混合并煮沸5分钟,分配并储存在-80°C ,避免反复冻 融。

(2)     核蛋白提取:

  1. 取己经经过处理后的细胞,4°C离心,500 xg, 3 min收集细胞,弃去培 养液,用预冷的PBS洗涤两遍;
  2. 尽可能吸去上清,勿留残液,每瓶细胞加入200pL预冷的Buffer A (每 mL Buffer A 加入 1(1L DTT, 5|iL lOOmM PMSF, 5|iL 蛋白酶抑制剂,使 用前配制),最大转速涡旋剧烈振荡15 s,放置冰上10〜15 min;
  3. 加入llpiL冷Buffer B,最大转速涡旋剧烈振荡5s,放置冰上1 min;
  4. 再次最大转速涡旋剧烈振荡5 s后,4°C离心,16000 g, 5 min;
  5. 尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管中,置于冰上,即得胞浆蛋 白;
  6. 在离心沉淀物中加入lOOpiL预冷的Buffer C (每mL Buffer C加入1(1L DTT, 5|nL lOOmM PMSF, 5yL蛋白酶抑制剂,使用前配制),最大转速 涡旋剧烈振荡15 s,放置冰上40 min,每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 s;
  7. 4°C离心,16000 g, 10 min,尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管 中,即得核蛋白;
  8. 上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法),按体积加入 5x蛋白上样缓冲液,混匀后煮沸5 min,分装并保存于-70°C,避免反复 冻融。

(3) western blot 同第二部分

122激光共聚焦实验

(1) 待观测的细胞被4%多聚甲醛固定20mino

(2)     将固定好的细胞爬片取出倒扣于载玻片上,以抗荧光淬灭剂封片。

(3) 避光上机。

2结果

2.1卩坐来麟酸促进巨噬细胞中TLR-4表达

我们通过使用PCR技术检测ZA处理前后巨噬细胞中TLRs家族成员RNA

表达变化,结果显示TLR-4在ZA刺激下上调最为明显(图3.1) o通过PCR实验检测ZA处理前后的巨噬细胞中TLR-4下游myD88, TRIP, /R4K-4的表达变化,结果显示:伴随ZA的刺激myD88, TRIF, /R4K-4呈现出 时间依赖性上调趋势,且在处理后24小时表达增加最为明显(图3.2)。

图3.2卩坐来麟酸促进TLR-4通路下游基因myD88f TRIF, /RAK-4表达**P

<0.01.

2.3卩坐来麟酸激活TLR-4及其下游通路蛋白水平的表达

通过western blot验证TLR-4通路蛋白水平表达的变化,结果显示,

以 10(iM 的 ZA 处理 BMDMsO, 6, 12, 24 小时之后 TLR-4、Myd88> Trif、 IRAK-4蛋白水平显著升高。*PV0.05, **PV0.01.
2.4
卩坐来麟酸促进巨噬细胞NF・kB核转位

图3.3 ZA活化TLR-4信号通路

在检测TLR-4通路变化之后,我们继续监测BMDMs中NF-kB核转位情 况(图 3.4) o 通过不同浓度 ZA                                                               5(iM, 10(iM, 15(iM)处理 BMDMs,

分别提取BMDMs核蛋白以及胞浆蛋白进行western blot检测,结果显示ZA促 进了 P65的核转位,胞质中的磷酸化P65表达水平显著升高,且IkB-ol蛋白逐 渐降解使用荧光竣基基团标记的ZA (5-FAM-ZOL)处理BMDMs,可以发现巨 噬细胞在被处理的第12小时开始出现较为明显的内吞活动,且内吞作用在第 24小时达到峰值(图2.5 A) o通过western blot实验分析Rap la异戊烯水平发 现,ZA处理后巨噬细胞中甲轻戊酸通路被抑制。本实验通过使用TLR-4 7-小鼠的骨髓巨噬细胞来检测ZA对于其BMDMs的 极化能力的影响,更进一步的研究TLR-4在BMDMs极化中的作用。
图2.4 ZA促进巨噬细胞NF-kB核转位

以通过不同浓度ZA (O(iM, 5(iM, 10(iM, 15(iM)处理BMDMs, 30分钟 之后分别提取细胞核蛋白和胞浆蛋白。A: western blot检测BMDMs胞核蛋白 中P65表达量。B: western blot检测BMDMs胞浆蛋白中磷酸化P65及IkBf 表达量变化。*PV0.05, **PV0.01。

2.5卩坐来麟酸被BMDMs内吞进而抑制甲羟戊酸通路

A:将5-FAM-ZOL以OH, 6H, 12H, 24H不同时间点处理BMDMs后激 光共聚焦观测细胞。图2.5 ZA被BMDMs内吞进而抑制甲瓮戊酸通路

B: ZA处理BMDMs OH, 6H, 12H, 24H之后检测Rap-la异戊烯化的程 度,***pvO.OOl, *Pv0.05。

第二节[1坐来麟酸对TLR-4基因敲除巨噬细胞极化的影响

1.材料与方法

1.1实验材料和试剂

  • TLR-4 抑制剂

TAK-242 (APEXBIO 公司,美国)

  • western blot相关试剂 同第一节

1.2实验方法

  • TLR-47 BMDMs的获取同野生型小鼠BMDMs的获取方法。

1.2.2其他试验方法同第一节

2 •结果

  • ZA无法活化TLR-4 7 BMDMs中的NF・kB核转位

获取的成熟TLR-4 7 BMDMs,在同等条件的ZA刺激下,检测TLR-4下游 信号通路蛋白表达(图2.6 A) o以不同浓度的ZA刺激TLR-4 7'BMDMs 30分 钟并检测NF-kB核转位情况(图2.6 B-C) o结果显示ZA并不能激活TLR-4 7' BMDMs中的TLR-4下游信号转导通路,同时无法促使NF-kB在巨噬细胞中核 转位。

A:相同条件下 ZA 处理 TLR-4'BMDMs, WB 检测 TLR-4、Myd88> TRIF、 IRAK-4蛋白水平的变化;B:不同浓度ZA处理TLR-4_/ BMDMs 30分钟, western blot 检测 P65 的核转位情况。*PV0.05, **PV0.01。

图2.6 ZA无法活化TLR-4'BMDMs中NF-kB核转位

2.2 TLR-4基因表达缺失阻碍巨噬细胞Ml型极化

通过流式细胞分选,细胞免疫荧光,western blot等手段检测ZA作用下 TLR-4'BMDMs的极化能力。结果显示巨噬细胞极化相关指标CD86、iNOS、 CD206在ZA作用前后无明显变化(图2.7A-D) ELISA检测细胞上清TNF-a 和IL-1卩表达量,发现ZA作用前后TNF-a和IL-1卩表达量无明显变化(图2.7 E-F) o

图2.7 TLR-4表达缺失使ZA失去Ml型巨噬细胞极化能力

A-B:流式细胞分选检测TLR-4'Ml, M2型BMDMs比例。C: western blot检 测CD86和CD206蛋白水平变化。D:细胞免疫荧光检测TLR-4’BMDMs极化 水平。E-F: ELISA检测TLR-4'BMDMs上清中TNF-a和IL-1卩表达情况。#p >0.05, **pv0.01。

2.3 TAK-242抑制ZA引起的TLR-4信号通路活化

我们以TLR-4为靶点纠正Ml型巨噬细胞极化的临床转化进行初步探索。 通过使用TLR-4小分子抑制剂TAK-242处理巨噬细胞并检测其对于ZA导致的 TLR-4/NF-kB活化状态的影响。结果发现:TAK-242可以抑制ZA引起的TLR- 4/NF-kB 活化

讨论

现有的研究认为,Ml巨噬细胞极化是BRONJ发病的重要原因[2]。此外, TLR-4介导的NF-kB激活能够维持巨噬细胞的促炎表型[1& 38]o TLR-4是否介 导ZA诱导的Ml型巨噬细胞极化并参与BRONJ疾病的发展仍不清楚。我们的 目前研究显示,ZA通过激活TLR-4信号传导诱导NF-kB核转位(图2.3-2A), 促进巨噬细胞Ml型极化,在TLR-4基因缺失的小鼠巨噬细胞中ZA对于巨噬 细胞极化无明显作用(图2.7)本研究充分证明TLR-4对于小鼠巨噬细胞极 化调控的关键作用,为后续研究奠定基础。

巨噬细胞的表型转化与多种炎症性疾病的发生发展密切相关[39]o Ml型巨 噬细胞聚集可能会影响组织再生及伤口愈合[40,41]o最近的研究表明TLR-4高 表达促进Ml巨噬细胞极化[18,42, 43],在小鼠的BRONJ样病变模型中报道了 ZA能够诱导Ml型巨噬细胞极化[2, 6]o在大多数情况下,长骨与口腔炎症微环 境中的细胞具有相似性,因此我们选择小鼠长骨中分离出巨噬细胞进行后续研 究[44]。根据以往的报道,ZA主要通过阻断甲羟戊酸通路来发挥抑制骨吸收的 作用[37]o在本部分的实验中,我们的研究重点集中在体外巨噬细胞极化与信 号通路的变化上。此外,为了进一步探究ZA对于巨噬细胞的药理作用,我们 对TLR-4信号通路活化时间与巨噬细胞内吞ZA的时间进行对比分析(图 2.5),结果显示,ZA首先活化细胞膜蛋白TLR-4及其下游通路,继而被 BMDMs吞噬。这一结论更加说明细胞膜表面的TLR-4受体及其下游通路的活 化在ZA促巨噬细胞Ml型极化中的重要作用。在BRONJ中,ZA通过激活巨 噬细胞细胞膜表面的TLR-4受体并活化其下游信号通路,进而促进巨噬细胞 Ml型极化,导致局部骨骼微环境发生免疫应答反应,进而阻碍骨创的愈合。

此外,在研究TLR-4信号通路对Ml巨噬细胞极化作用的同时,我们还进 一步探索TAK-242这一 TLR4信号小分子抑制剂的作用。TAK-242可以在体外 抑制巨噬细胞中TLR-4的表达[45],我们在通过ZA活化巨噬细胞的TLR-4信 号通路的基础上应用TAK-242处理巨噬细胞,发现TLR-4信号通路被阻断,并 且其下游NF-kB核转位同样被抑制(图2.8)。综上,本部分实验说明了 TLR- 4信号通路对于BMDMs极化起到了至关重要的作用。

第三部分[1坐来麟酸对TLR-4敲基因鼠拔牙创愈合的影响

本部分实验主要在建立小鼠BRONJ模型的基础上,结合前期研究结果比 较WT野生型小鼠及TLR-4 7'小鼠同等诱导条件下拔牙创的愈合情况、坏死骨组 织情况、BRONJ发病率以及拔牙创周围软组织的巨噬细胞极化情况。通过使用 TLR-4小分子抑制剂TAK-242对小鼠BRONJ模型进行建模前干预,以观察其 预防BRONJ的作用。为以TLR-4为靶点的BRONJ预防提供进一步的实验依 据。

2 •结果

2.1 BRONJ小鼠模型的建立

给予WT野生型小鼠每周两次进行尾静脉注射,每次注射300 mg/kg ZA, 构建BRONJ小鼠模型,给药一周后行上颌第一磨牙拔除术。之后持续尾静脉 给药三周。在第五周时收获小鼠模型的上颌骨以备后续分析(图2.1 A) o根据 大体观测、micro-CT检测小鼠拔牙创愈合情况、BRONJ发病率统计分析及病理 组织切片检测死骨形成数目评估小鼠BRONJ造模效果(图2.1 B-H) o结果显 示通过尾静脉注射ZA成功构建小鼠BRONJ模型,维持BRONJ在WT小鼠的 整体发病率为40%左右。Micro-CT显示ZA处理后的小鼠拔牙创明显空虚,新 骨形成能力下降。H&E染色可见ZA处理后的小鼠拔牙创局部大量死骨形成。

图2.1 BRONJ小鼠模型的成功诱导

A:小鼠BRONJ模型造模的流程图。B:体示显微镜观测下的小鼠拔牙创愈合 的一般情况以及有开放的拔牙创的小鼠数量统计。C-E: micro-CT分析小鼠拔 牙创愈合情况。F: BRONJ造模小鼠中发生拔牙创延迟愈合对小鼠数量统计分
析。G-H:病理切片H&E染色检测拔牙创死骨形成百分比。#P>0.05, *PV

0.05, **PV0.01。

2.2 TLR-4对小鼠拔牙创愈合的影响

我们通过同样方法建立TLR-4 7'小鼠BRONJ模型,检测TLR-4基因在

BRONJ模型拔牙创愈合中发挥的作用,为了排除TLR-4基因本身对于骨创愈合 的影响,我们使用PBS处

图2.2 TLR-4对于小鼠拔牙创愈合的影响

WT和TLR-47'小鼠尾静脉注射PBS,并拔除上颌第一磨牙。取3周和5周为观 测点通过micw-CT观察小鼠拔牙创愈合状况。并分析BMD和BV/TV指标的差 异。#P>0.05o

2.3 TLR-4基因缺失有助于小鼠拔牙创的愈合,降低BRONJ发病率

建立WT和TLR-4 7-小鼠BRONJ模型,发现TLR-4 7-小鼠在拔牙创口开放 数目少于WT小鼠。我们通过micro-CT检测新骨形成情况,发现TLR-4 7'小鼠 拔牙创口愈合后新骨形成速度和质量均好于WT小鼠(图2.3A-D) o统计分析 结果显示WT小鼠组拔牙创发生延迟愈合的小鼠数目多于TLR-4 7'小鼠组(图 2.6 TAK-242减少由ZA引起的Ml型巨噬细胞拔牙创局部浸润

图2.5 TAK-242对小鼠诱导的BRONJ起到预防作用

A:体示显微镜观测小鼠拔牙创愈合的一般情况以及有开放的拔牙创的小鼠数 量统计。B-D: micro-CT分析小鼠拔牙创愈合情况。E: BRONJ模型小鼠中发 生延迟拔牙创愈合小鼠数量的统计分析。F-G:组织学检测拔牙创死骨,统计 分析死骨形成百分比。*PV0.05, **PV0.01。***PV0.001

通过细胞免疫荧光检测TAK-242对于拔牙创局部软组织Ml型巨噬细胞浸 润的影响。结果发现:造模前预

图2.6 TAK-242减少由ZA引起的拔牙创局部Ml型巨噬细胞浸润

A: BRONJ模型小鼠和TAK-242预处理之后的BRONJ模型小鼠拔牙创周围巨 噬细胞极化情况;B: Ml型巨噬细胞极化数目的统计;C: M2型巨噬细胞极化 数目的统计。#P>0.05; *PV0.05。

3.讨论

据报道,TLRs可调节伤口愈合的过程[46]另外,来自股骨头的坏死骨表现出巨噬细胞中 TLR-4信号通路的激活,诱导Ml巨噬细胞极化[47] o而在本研究中,我们成功建立了 WT及 TLR-4-/-小鼠BRONJ疾病模型,在WT小鼠中表现为拔牙创口延迟愈合(图2.1)。与WT小 鼠相比,TLR-4-/-小鼠的拔牙创伤口愈合良好,组织学可见更多的上皮覆盖拔牙创,以及更少 的坏死骨区域(图2.3)。我们的研究结果表明,TLR-4信号激活可能是BRONJ拔牙创伤口愈 合受损的重要危险因素。

最近的一些研究集中在一些小分子抑制剂的作用上,这些抑制剂可以控制炎症并且达到抑制 和预防BRONJ发生的作用[2, 5]0在本研究中,我们采用了 TAK-242, TLR-4信号传导的小分 子抑制剂进行功能研究。与ZA + PBS处理的小鼠相比,用ZA + TAK-242处理的小鼠表现出更 好的拔牙创愈合以及更少的坏死骨形成(图2.5) o因此,BRONJ小鼠中的异常Ml型巨噬细 胞浸润在TAK-242治疗后的拔牙窝中被逆转(图2.6)。这些数据表明通过TAK-242处理降低 TLR-4信号通路的传导有助于减少ZA引起的过多的Ml型巨噬细胞的产生,同时这些发现提 示TAK-242在预防BRONJ中具有潜在价值。

随着可能引起颌骨骨坏死的药物范围的不断扩大,迪诺塞曼等一些抗骨吸 收药物也可能成为颌骨骨坏死的原因[4, 48]o TLR-4在迪诺塞曼诱导的巨噬细 胞极性转化中的作用和TLR-4在骨髓炎发展中的治疗价值需要进一步评估。此 外,据报道,ZA抑制破骨细胞生成,继而导致BRONJ发展[49],而BRONJ和 骨髓炎在破骨细胞组织学分化中仍存在诸多不同[50]o研究表明,Ml型巨噬细 胞可以抑制破骨细胞生成[51],而破骨细胞相关融合蛋白可能会阻碍Ml巨噬细 胞的极化[52];此外,雌激素缺乏的M2巨噬细胞可促进破骨细胞分化[53]o这 些研究均揭示了 Ml巨噬细胞在抑制破骨细胞功能中的潜在作用。

在本研究中,我们首次证明了 TLR-4介导的Ml巨噬细胞极化在小鼠 BRONJ中的病因学作用。通过TLR-4 7-小鼠和特异性TLR-4抑制剂TAK-242 的功能研究,我们提出了一种预防和治疗BRONJ病症的新的思路。

全文总结

本实验从体外实验和体内实验两个层次验证了 TLR-4这一靶点对于Ml型 巨噬细胞极化引起的小鼠BRONJ表型中的重要作用,为BRONJ的预防和治疗 提供更多思路。

1、 卩坐来麟酸通过TLR-4信号通路调控Ml型巨噬细胞的极化。

  1. 卩坐来麟酸处理后的巨噬细胞极化状态的改变

首先我们成功获得小鼠骨髓来源的巨噬细胞,在卩坐来麟酸作用下通过流式细胞 分选、蛋白印迹实验、细胞免疫荧光实验、酶联免疫吸附试验来检测巨噬细胞 极化状态,结果显示,卩坐来麟酸处理过后的巨噬细胞呈现出Ml型极化状态。

  1. 卩坐来麟酸激活巨噬细胞TLR-4信号通路,随之被巨噬细胞内吞

接着,我们筛选出巨噬细胞相关信号通路TLRs家族基因TLR-4信号通路作为 调控巨噬细胞极化的关键基因,并从蛋白水平上检测ZA作用前后TLR-4及其 下游NF-kB信号通路的变化。应用荧光标记的卩坐来麟酸观察卩坐来麟酸被巨噬细 胞内吞的动态过程,结果显示,卩坐来麟酸能够显著活化TLR-4信号通路,并且 最终通过被巨噬细胞内吞抑制甲羟戊酸通路以发挥其药理作用。

  1. 卩坐来麟酸不能调控TLR-4,小鼠巨噬细胞的极化

同等条件下卩坐来麟酸处理TLR-47'小鼠巨噬细胞,检测巨噬细胞的极化状态以及 TLR-4, NF-kB信号通路的变化。结果显示,卩坐来麟酸对TLR-4基因缺失巨噬 细胞的极化以及TLR-4下游信号通路无明显作用。

2TLR-4缺失减少卩坐来麟酸导致的小鼠双磷酸盐颌骨骨坏死发生率

  1. 卩坐来麟酸导致正常小鼠的拔牙创延迟愈合以及死骨形成。

首先,我们通过尾静脉持续6次(125pig/kg)的方法给小鼠给药,在给药一周 后拔除小鼠上合第一磨牙,并第三和第五周对小鼠拔牙创愈合情况进行观察。 以此方法我们成功建立了小鼠双磷酸盐颌骨骨坏死模型。

  1. 接下来以同样的方法在TLR-4敲除的小鼠进行造模,比较野生型小鼠和敲除 小鼠在大体观,影像学,以及病理学诊断上的差异。以上结果显示,TLR-4敲 除的小鼠显著缓解了因卩坐来麟酸注射导致的拔牙创愈合延迟、骨密度降低、以 及新生死骨面积。
  2. 通过使用激光共聚焦检测野生型与敲基因小鼠拔牙创局部周围巨噬细胞的极 性转化标记蛋白来确定在拔牙创周围的巨噬细胞极化程度。结果显示野生型小 鼠双磷酸盐骨坏死模型中的拔牙创出现明显的Ml巨噬细胞浸润,而在基因敲 除小鼠造模的拔牙创局部未能检测出过多的Ml型巨噬细胞的浸润。
  3. 最后通过使用TLR-4小分子抑制剂TAK-242同期尾静脉注射于小鼠体内观 察小鼠拔牙创愈合状况来确定其可能的对于双磷酸盐相关颌骨骨坏死的预防效 果,结果显示,小鼠同期注射了 TAK-242和卩坐来麟酸与只注射了卩坐来麟酸相 比,TAK-242显著缓解了小鼠延迟的拔牙创愈合,并且能减少拔牙创周围的死 骨形成。
  4. 在对TAK-242注射小鼠拔牙创巨噬细胞进行极化检测后我们也发现了 TAK- 242 同样能降低由卩坐来麟酸导致的Ml巨噬细胞的局部浸润。

本实验立足于巨噬细胞极化,探讨了关于Ml型巨噬细胞这一经典活化的 炎症性巨噬细胞在BRONJ发生发展中的作用。本实验从检测体外培养的巨噬 细胞极性转化到体内使用的TAK-242抑制剂预防BRONJ的发生,均说明了 TLR-4这一靶点对于BRONJ造成的疾病表现有着重要的作用。并为日后针对 TLR-4这一靶点的临床转化提供更多的依据和可能。

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综述

【双磷酸盐相关性颌骨骨坏死致病机制与治疗研究分析】

【摘要】:双磷酸盐相关性颌骨骨坏死是一种近年来发病率明显上升而逐渐引 起人们重视的疾病,大多因治疗原发病时使用大剂量的双磷酸盐类药物所致。 但是目前临床治愈极为困难,近年来对于BRONJ机制的研究表明了通过合适 的动物模型建立以及针对细胞水平的诱导分化得出BMSCs、破骨细胞、T细 胞、血小板浓度以及免疫调节都有着很大的相关性。那么从合适的动物模型的 建立与破骨细胞抑制到血供减少成因的进一步研究将仍需进行。

【关键字】:双磷酸盐相关性颌骨骨坏死;骨髓间充质干细胞;破骨细胞;T细 胞;动物模型;免疫调节。

[The analysis of pathogenic mechanism and treatments for Bisphosphonate- Related Osteonecrosis of Jaws.]

[Abstract]: Recently is being widely noticed by people though its high incidence, and most lead by a high dose of bisphosphonates for a protopathy's treatments. But a completely cure of BRONJ seems impossible. Lately the researches show that BMSCs, osteoclasts, T cells, platelet concentration and immune modulations do relevant with the BRONJ,s pathogenic mechanism through a properly establishment of a animal model and cellular induced differentiation. Thus, the reason of BRONJ induced inhibition of osteoclasts and lower amount of the blood vessels still need to be find out.

[Key words]: Bisphosphonate-Related Osteonecrosis of Jaws; Bone Marrow Stromal Cells; Osteoclast; T-cell; Animal model; Immune Modulation.

【前言】:

双磷酸盐类药物作为一种骨吸收抑制剂已经被使用长达30年之久,一直在 治疗和预防骨质疏松,恶性肿瘤性疾病骨转移,佩吉特氏病等有着出色的疗 效。因其成功的临床疗效而被广泛使用(1)。自从2003年起从一些使用双磷酸 盐类药物治疗癌症患者之中连续出现了与双磷酸盐类药物相关的颌骨坏死病例 且报道数量急剧上升,其中近三分之二以上病例发生在下颌骨,常伴有长达八 周及以上口腔内骨组织暴露(2)。女性患者明显多于男性(3),而逐渐引起人们重 视。并且该病的发生发展与病人所使用的双磷酸盐类药物的种类及剂量有着很 大的关系。然而,作为一个并不陌生的疾病存在,治疗困难却不小,临床上的 治愈几乎不可能,目前多将双磷酸盐骨坏死的并发症控制作为首要目的(4)。对 于双磷酸盐药物服用者。停药的风险评估显得尤为重要,不少患者停药所带来 的原发病预后往往不佳。纵而对于双磷酸盐骨坏死致病机制的研究就显得尤为 重要,如何通过这些可能的疾病发生机制采取相关的治疗方案对于双磷酸盐骨 坏死的预后发展将有着巨大的意义(5)。可是建立在对于双磷酸盐骨坏死致病机 制尚不明确的基础上的治疗总归是被动而又保守的治疗,并且由于考虑是药物 因素引起的病症,停药显得理所当然,但是许多患者停药后所带来的极其不良 的原发病的预后则更加需要引起重视(6-ll)o

【双磷酸盐骨坏死的研究中主要研究手段及方向】

  • 动物模型的建立对BRONJ致病机制的探索:

通过动物模型的建立(12-15),人为创造出尽可能符合临床疾病的双磷酸盐 颌骨骨坏死动物模型,并且在动物模型上设立实验,加入对照组,以寻求对该 病治疗的新方法。对于动物模型的建立很多学者都给出了自己不同见解常有提 出用大鼠(12,16),小鼠(13-15, 17-19),家猪(20),猿猴等建立动物模型,虽然 动物种类差异大,但是对于该疾病模型的建立成功率尚可。可是动物模型的选 择除了需要考虑该动物模型是否适合,是否容易形成BRONJ模型。有人提出 为了便于研究二型糖尿病与双磷酸盐颌骨骨坏死相关性作用,直接建立糖尿病 小鼠模型,研究表明给糖尿病小鼠静脉注射两周一次的双磷酸盐后,出现了一 种因双磷酸盐而引起的NLRP3炎症小体在巨噬细胞中持续被激活现象,并在相 应小鼠牙槽窝被检查到。也就是说,糖尿病小鼠使用双磷酸盐药物后进行牙拔 除术,其之后的拔牙窝损伤和双磷酸盐有很大关系。并且目前最可能机制在于 NLRP3对于巨噬细胞促炎症作用,加重了这一病损进程(15)o还应注意的是在 其临床表现与病理表现中是否与人类存在相似性,例如;鼠类动物就属于啮齿 类,它们的口腔生理结构与人类差异大,在对该疾病进行研究时,是否应当考 虑其口腔胜利环境带来的差异性影响,还有,由于啮齿类动物牙齿细长,牙齿 拔除术中极易发生断根或者牙槽损伤,那么这些损伤是否会对该疾病模型的建 立构成误差?有着很大的混淆性,因此对于动物模型建立方向仍有很多思考和 值得改进的地方。

  • 骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Stromal cells)的应用:

有证据表明骨髓间充质干细胞(BMSCs)对于治疗双磷酸盐骨坏死有作 用。在通过建立小鼠双磷酸盐骨坏死模型后通过进一步研究骨髓间充质干细胞 免疫调节和抗炎作用后多篇文献也对于BMSCs (骨髓间充质干细胞)对于人类 的双磷酸盐骨坏死疾病有重要作用的推测,在从人体分离得到的hBMSCs

(human Bone Marrow Stromal Cells)通过培养加入双磷酸盐诱导后可观察到成 骨细胞活跃现象,表明对于治疗骨质疏松双磷酸盐的益处得到了明显的证实 (21)o并且在通过静脉注射BMSCs后的小鼠模型中发现了完整的粘膜愈合与骨 再生,并且这也是第一次的提出并且有证据的表明了 BMSCs的免疫治疗作用 有望恢复调节性T细胞功能以及预防及治愈小鼠的双磷酸盐相关性骨坏死 (13)o在大鼠模型中,有学者在控制组出现拔牙后拔牙窝创口不愈合的状况后 给予了拔牙窝表面以含有BMSCs薄片的材料覆盖的处理。结果发现控制组相 比较于对照组均出现了相对良好的伤口愈合(12)o在对于野生型小鼠的融合了 BMSCs的治疗的模型中可以得知BRONJ病人的致病机制与免疫调节也是密不 可分的(22)o所以,在通过对BMSCs的应用中不仅可以判断模型状况还可以应 用于对治疗方法的探索。

  • 针对破骨细胞的研究:

进而在探究与破骨细胞生成,及破骨细胞功能抑制作用之间是否有关联。

目前研究表明双磷酸盐颌骨骨坏死的致病机制在于双磷酸盐药物对于骨组织正 常代谢造成影响,也就是说它降低甚至是停止了骨的正常的代谢,骨组织的吸 收受到了抑制,这也是为什么双磷酸盐药物可以改善病理性骨折的原因。并且 双磷酸盐对于破骨细胞抑制作用促进其凋亡,改变了骨组织生理性的吸收。所 以,破骨细胞是极为重要的因素之一。在双磷酸盐注射后的小鼠模型中破骨细 胞数量抑制现象一直存在,可是进一步研究又表明甲瓮戊酸特别是其代谢物 GGOH (香叶基香叶醇)对于破骨细胞生成抑制有着恢复作用,也就是说甲羟 戊酸对于双磷酸盐颌骨骨坏死的小鼠模型提供了新的治疗思路(17)。通过比较 双磷酸盐颌骨骨坏死与其他药物如维生素D,类固醇激素之间相互作用的关 系。研究表明:动物模型中如果添加了对于维生素D的供应,维生素D对于一 些组织病理学指标(成骨及破骨细胞的数量)以及宏观的骨坏死的临床表现都 有影响。并且可以总结概括为维生素减弱了双磷酸盐的抑制作用(23)。然而, 仍然不为所知的是,是否是破骨细胞的活动被激活了导致原发癌病灶的骨转移 活动得以提升。

  • 免疫调节反应与BRONJ致病机制之间的联系:

同样的对于T细胞的研究发现在BRONJ病人中发现了 GAMMA-DELTA T- 细胞减少,进一步研究似乎也反驳了以往的对于T-细胞是介导炎症的认识,反 之他对于骨组织损伤(特别是骨折)的恢复有重要作用(24)。这也证明了 T-细 胞并不总是带来坏处的这一说法,进而对于研究BRONJ免疫调节作用以及T- 细胞之间的关系似乎可以为其致病机制的研究打开新的窗口。然而,对于 BRONJ确切的致病机制的研究却更多地针对于细菌感染。虽然最先对于其致病 机制研究归结于炎症导致,然后对于大鼠模型研究发现感染因素与BRONJ相 关性也同样不如炎症刺激。那么,BRONJ大鼠体内的免疫异常或许扮演着重要 的角色(22) o

  • BRONJ对新生血管的抑制作用:

总体来讲,BRONJ发生机制与破骨细胞;巨噬细胞;NF-kB; LPS-TLR4通路 之间关系都需要进一步验证。并且,对于免疫调节的依赖性也需要进一步证 实。在通过对双磷酸盐对于血管生成作用的影响研究表明:双磷酸盐可以作用 于人脐静脉内皮细胞,并且产生直接的血管生成抑制作用增加细胞凋亡进程以 及直接对血管造成损伤(25),再者,对于小鼠模型研究中进一步发现:双磷酸 盐通过抑制新骨以及新生血管的形成来延长牙槽窝愈合时间,并且通过抑制上 皮细胞的增殖和扩散进而可以产生对于新生血管的抑制(14)o这也尽可能的阐 释了在病损区常出现血供不足的原因。

6,对于BRONJ治疗研究的新进展:

有人提出在部分患者有双磷酸盐药物服用史而又需要拔牙或者手术的人群 进行死骨切除。有病例分析到在进行死骨病灶切除后运用金属板(钛板)以及 下颌下腺联合修复损伤区域给病人带来了良好的预后(26)。这种对于坏死骨组 织感染不严重的病人,术中给予下颌下腺吻合,有利于其局部血供的恢复。这 一思路和方法对于解决BRONJ局部血管生成抑制降低局部骨组织代谢有着重 要作用。而且还有人指出在死骨切除术后使用富含血小板的血浆或者纤维蛋白 有助于缩短其病程以及更好的拔牙创愈合及预后(4, 27, 28)O因为同样有研究表 明卩坐来麟酸同时对于成纤维细胞抑制作用阻止了其纤维生成的过程(29),在对 于各型双磷酸盐颌骨骨坏死病人进行治疗时采取手术局部切除死骨合并抗生素 治疗的方法都表现出了较为良好的效果(30)。在比较该病与其他不良嗜好(吸 烟,饮酒等)相关性时:对于此类比较的研究中结论大都可以归结为不良嗜好 对于双磷酸盐颌骨骨坏死病情的恶化有促进作用(31)。同时在针对BRONJ病人 进行种植修复时也应当格外慎重,因为BRONJ可能极大地增强种植修复的失 败概率(32)。但是,对于部分病人在适当时间停止双磷酸盐药物之后,经过良 好的清创术以及规范的手术,可以达到预期的种植修复目的,也就是说双磷酸 盐颌骨骨坏死不再是种植徐修复绝对禁忌。但是存在的可能的高风险以及失败 的概率仍然是需要慎重考虑的(ll)o在手术方法中通过荧光导向技术可以更好 的定位到病损区,对于死骨切除帮助作用显著(33)。特别需要注意的是对于肿 瘤患者,在提供了双磷酸盐类药物进行治疗时,肿瘤医生应当加强与口腔科医 生的联合诊治工作(5),这种联合治疗思路与方案对于更好的治疗BRONJ是具 有重要帮助的。

【讨论】

双磷酸盐类药物在治疗骨质疏松,恶性肿瘤骨转移等病症在临床阶段已经 得到充分的认可和肯定。然而对于其引起的相关性骨坏死的治疗也大多是在预 防阶段。进而,对于双磷酸盐相关性颌骨骨坏死的病因机制研究就显得格外重 要。目前,对于破骨细胞分化进程以及其破骨机制的进一步探索是否可以作为 一个切入口。而通过动物模型的建立不难得到一个与人类“相仿叩勺模型,可是 与人类临床表现之间存在的不同与差异仍需重视。在对于其治疗方法研究中无 论如何处理拔牙创或者是暴露的骨组织都是被动的。也就是说对于双磷酸盐类 药物在体内引起的一系列免疫反应用于控制原发病机制联合考虑,在细胞水平 比如:对破骨细胞研究;LPS-TLR4信号转导通路与其相关性上寻找新的突破 口,或许可以对双磷酸盐颌骨骨坏死有进一步的了解和认识。要知道的是唯有 更深入的了解治病机理才可以进一步掌握主动权,找到治愈的可能。

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