抗齿禹齿益生菌性质及其作用机制的研究论文

2020年8月7日17:37:21抗齿禹齿益生菌性质及其作用机制的研究论文已关闭评论

抗齿禹齿益生菌性质及其作用机制的研究论文

摘要

犒齿仍是世界上最普遍流行的疾病之一,它除了给患者造成巨大的经济损失外,也对他 们的生活质量造成严重的威胁,但是传统的犒齿治疗方式没有取得良好的效果。近年来应用 益生菌预防及治疗舗齿的想法引起了高度关注,该方法安全性高,可行性强,患者在治疗过 程中所要承受的痛苦与经济损失都比较小,如果可以将这种想法实现并应用在临床中应用将 是一种非常理想的齬齿治疗方式。但是目前相关研究开展时间短,成果缺乏,抗舗齿益生菌 的种类非常有限,并且对于其发挥功效的作用机制不明确。因此,丰富抗舗齿益生菌的菌株 库,阐明它们发挥抗犒齿作用的机制成为抗舗齿益生菌研究的重要基础,将为临床应用益生 菌防治齬齿奠定了重要基础。

本研究对实验室保藏的13株乳酸菌进行抑菌性能测定,并以舗齿的主要致病菌一一变异 链球菌作为指示菌,筛选出具有抑菌作用的乳酸菌株作为抗犒齿益生菌的备选菌株;并对所 选菌株的潜在危害性进行评估;采用荧光染色技术对生物膜进行荧光染色,再通过激光共聚 焦显微镜(CLSM)与扫描电镜(SEM)等观察初选菌株对变异链球菌生物膜形成的影响,进而对 其发挥抑菌作用的机制进行探究。最后基于前期有关活性天然产物对于犒齿治疗的研究,选 择姜黄素与筛选菌株复配,探究二者共同作用条件下对齿禹齿防治的关系。研究结果表明备选 的13株乳酸菌中有五株对变异链球菌具有抑制作用,分别为YRL45、YRLP45、QL-2、Q7 和T1。它们在排出酸与过氧化氢的作用后仍能形成直径为10-11 mm抑菌圈,并初步确定他 们发挥抑菌作用的物质是蛋白类产物。风险评估表明五株乳酸菌均具有较低的应用风险,它 们发酵终点的pH在3.80以上,其中T1菌株的发酵终点pH更是高达4.17,都高于已知的抗 齬齿益生菌唾液链球菌,对牙本质的腐蚀性都显著性的低于变异链球菌,并且区别于S. mutans对牙齿的腐蚀作用一直在进行,筛选出的五株乳酸菌对牙齿的腐蚀作用在2 h达到最 高值并停止;同时它们在发酵过程中可以产生75-100 mg/L的多糖,对牙齿的粘附率在10-25% 之间,具有在口腔中定植和独立存活的能力。而乳酸菌对变异链球菌的抑制作用机制主要是 通过影响变异链球菌生物膜的形成,与共聚机制没有关系。它们的发酵上清中和液 (Fermentation Neutralized Supernatant, FNS)从生物膜的量,结构,膜内菌体的存活情况以 及膜内胞外多糖(Extracellular Polysaccharide, EPS )这多个方面都干扰了生物膜的正常形成。 其中生物膜在FNS存在时的形成量下降了 9-30%,而形成的生物膜结构有序性,膜中菌体存 活情况以及EPS的量在显微镜下可以观察到明显的下降。此外,在益生菌与姜黄素的复配实 验中,含有活菌的培养液与姜黄素展现出了对变异链球菌抑制的协同作用。

YRL45、YRLP45、QL-2、Q7和T1五株乳酸菌对变异链球菌具有抑制作用,临床应用 具有一定的安全性,初步确定了其发挥抑菌作用的机制,符合抗舗齿益生菌的应用条件,可 以作为抗犒齿益生菌的候菌株。本研究的结果丰富了抗齿禹齿益生菌的菌株库,初步阐明了抑 菌的机制,并探讨了益生菌有天然活性产物协同的抑菌效果。为抗犒齿益生菌制剂的开发提 供了一定的理论基础。

关键词:变异链球菌,生物膜,乳酸菌,发酵上清液,抗嶠齿

Study on the Properties and Mechanism of Anti-caries
Probiotics

Abstract

Caries is one of the most prevalent diseases in the world. In addition to causing huge economic losses, it also poses a serious threat to people's quality of life. However, traditional caries treatment has not achieved good results. In recent years, the idea of using probiotics to prevent and treat dental caries has attracted a lot of attention. This method has high safety and strong feasibility, and the patient suffers from the pain in the treatment and the economic loss is small, which is a very ideal treatment for caries. However, the relevant research is short-lived, the results are lacking, and the types of anti-caries probiotics are very limited. And the mechanism of action for its efficacy is not clea匸

In this study, 13 strains of lactic acid bacteria deposited in the laboratory were tested for their antibacterial activity, and the main pathogen of dental caries, Streptococcus mutans, was used as indicator bacteria to screen the lactic acid strain with antibacterial activity as a preparation for anti-caries probiotics. And then evaluate the potential hazard of selected strains; explore the mechanism of the bacteriostatic action of the selected strains through the fluorescence staining technology, laser confocal technology (CLSM) and scanning electron microscopy (SEM). Finally, based on the previous research on the treatment of dental caries with active natural products, curcumin was selected and compounded with selected strains to explore the effect of prevention and treatment on dental caries under the the combined conditions. The results showed that 5 of the 13 strains of lactic acid bacteria had inhibitory effects on S.mutans, which were YRL45 and YRLP45, QL-2, Q7 and Tl, respectively. After eliminating the action of acid and H2O2, they can still form a 10-11 mm inhibition zone, and it is initially determined that the antibacterial effect is a protein product. Risk assessment showed that 5 strains of lactic acid bacteria have lower application risks. Their fermentation end point pH is above 3.80, and the fermentation end point pH of the T1 strain is as high as 4.17, which is higher than the known anti-carious probiotics, Streptococcus salivarius. The corrosiveness to dentin is also significantly lower than that of S.mutans, and it is different from the corrosive effect of S. mutans on the teeth. The corrosiveness of the five strains of lactic acid bacteria on the teeth reached the highest at 1 h and then stopped. Simmiquently, they produce between 14-15% mg/mL of sugar during fermentation, with the ability to colonize and survive independently in the mouth. The mechanism by which lactic acid bacteria inhibit S. mutans is by inhibiting the formation of S. mutans biofilm. Their fermentation and supernatants (FNS) interfere with the normal formation of biofilms from the amount of biofilm, structure, survival of intracellular biofilm, and extracellular polysaccharides (EPS) in the biofilm. The formation of biofilm in the presence of FNS decreased by 5.45-30.91%, and the formation of biofilm structure order, the survival of bacteria in the membrane and the amount of EPS can be observed under the microscope. In addition, in the compounding experiment of probiotics and curcumin, the culture solution containing the live bacteria and curcumin exhibited a synergistic effect on the inhibition of S.mutans.

YRL45, YRLP45, QL-2, Q7 and T1 five strains of lactic acid bacteria have an inhibitory effect on S.mutans, and have a certain safety in clinical application. The mechanism of its antibacterial action is preliminarily determined, which is consistent with the anti - carious probiotics. Application conditions can be used as a candidate strain for anti-caries probiotics. The results of this study enriched the strain library of anti-caries probiotics, preliminarily clarified the mechanism of antibacterial, and explored the synergistic antibacterial effect of probiotics with natural active products. It provides a theoretical basis for the development of anti-caries probiotics.

Key words: Streptococcus mutans', biofilm; lactic acid bacterial; fermentation supernatant; anti-caries

Candidate: Zhang Yan

Speciality: Food Science

Supervisor: Prof.Zhang Lanwei

1前言

1.1立题背景

舗齿是全世界分布最广泛的细菌性的慢性疾病之一,虽然随着社会经济的发展,近几年 的发病率有下降趋势,但其发病率仍处于较高的水平,全世界约有80-90%的人们受其影响⑴。 据2010年的统计,有56.5%的巴西少年患有永久性齿禹齿,这代表有170万的巴西儿童遭受着 齬齿的折磨,而这样触目惊心的数据也只是不完全的统计⑵。此外,由舗齿引起的疼痛,营 养不良,辍学等问题严重的影响了患者的生活品质,并造成了巨大的经济损失。有研究表明, 当口腔中的“致犒菌”数量超出一定范围,或者当原有的微生物组成发生重大改变时,犒齿 的患病率会大幅度上升。这表明口腔中的微生物在犒齿的发生过程中起到了重要作用。而传 统的治疗方式诣在完全消除口腔中的致舗菌,而抗生素也成为了杀菌的第一选择。但是这样 的治疗方式使得抗生素的滥用盛极一时,这就引发的细菌耐药性等一系列副作用,并且治疗 效果一般。

由于益生菌在治疗肠道疾病中起到了积极的作用,人们开始试图以同样的方式治疗舗齿。 虽然有报道证实了这种方式的可行性,但是具有明确的抗舗齿性能的益生菌种类非常少。变 异链球菌(Streptococcus mutans)作为齬齿的主要致病菌成为了这项研究的主要指示菌。本 研究以抑菌实验的方式对13株乳酸菌进行筛选,并对其发挥作用的机制,应用的潜在风险性 进行初步的探究,同时将天然产物一一姜黄素作为辅助物质与其进行复配,观察共同作用的 抗犒齿效果。以期获得一株或几株抗齿禹齿益生菌,这将对齿禹齿的临床治疗,抗精齿益生菌种 类的丰富产生非常重要的意义。

1.2離齿

1.2.1龌齿与口腔微生物

犒齿是一种由于口腔内菌群失衡引起的内源性疾病,主要是通过口腔内的菌群分解牙釉 质中的矿质成分,引起牙齿硬组织不同程度的破坏形成的。舗齿的形成不仅影响美观,还会 造成牙齿根部的炎症反应,引起牙周炎等口腔疾病,严重时甚至可以导致败血症的发生。

作为机体的第二大微生物聚集地,口腔中丰度巨大的各种微生物之间的健康稳定对于平 衡机体局部和系统中健康与疾病之间的关系非常重要⑶。正常口腔内的微生物组可以包括细 菌,古细菌,真菌,原生动物和病毒等多种微生物,每种微生物都具有特定的作用,微生物 种属之间,微生物与宿主之间又可以相互作用,维持机体的稳定与健康状态⑷。当口腔中的 微生物组稳态因为某种原因被打破,就会造成部分菌株的不良生长,从而引起口腔疾病。如: 牙周炎、齿龈炎等,甚至可以导致口腔癌⑷。舗齿就是口腔微生物失衡生长造成的典型口腔 疾病之一。

近年来,随着第二代测序技术的发展,口腔微生物的基因组测序工作逐步完成。一系列 的研究表明,舗齿患儿与正常儿童的口腔微生物组成之间存在着不同程度的差异⑸。对比嶠 齿患儿和正常儿童的牙斑与唾液中的微生物基因组可知,舗齿患儿口腔中的链球菌、韦荣菌、 放线菌、毗邻贫养菌、纤毛菌、硫单胞菌以及它们组成的群落与犒齿存在显著相关关系。两 组儿童口腔中未发现特殊存在的致病菌类型,但是犒齿个体的微生物组具有很大程度的变异, 菌落组成与正常儿童也存在显著差异。此外,Asa等人血7】的研究也发现,在早发性齬齿患儿 的唾液中含有较多的以下几类细菌:链球菌属,韦氏球菌属,放线菌,颗粒链菌属,纤毛菌 属,毛滴虫属,双歧杆菌属,奇异菌属等。这种正常人群与犒齿患者口腔中微生物组成上的 区别进一步表明了齬齿与口腔微生物之间的重要关系⑻。

1.2.2頻齿的发生机制

犒齿的发生是一个极其复杂的多因素过程,目前还没有得出一个准确的结论,关于舗齿 (特别是儿童早期犒齿,Early childhood caries, ECC)的诱因有三种假说,其一为生态学假 说:该假说认为,舗齿的形成与口腔中致犒菌产酸或产碱相关,也即,齿禹齿是由口腔内微生 物群的自然变化导致局部环境的改变而产生的⑷。例如,在短时间内摄入大量的碳水化合物, 它们在口腔细菌的发酵下产生大量的菌酸,腐蚀牙釉质,造成牙齿的硬组织损坏,从而形成 舗齿。其二为非特异性斑块假说:该假说认为精齿的形成是单个菌株的失衡生长引起的,但 在活性位点内并无单个菌株存在。在牙斑内存在的大量菌株中只有少数几株与犒齿相关。以 上两种假说真实性还有待验证,目前在学术界被广泛接受的是第三种假说一一舗齿发生机制 的四联因素学说,即细菌,口腔环境,宿主和时间综合作用形成舗齿。

  • 细菌:细菌是齬齿发生的先决条件,某些细菌,如链球菌属在生长的过程中产生生 物被膜,这种被膜中含有丰富的多糖类物质,使其具有很强的粘附性。而其他种类的致舗菌 吸附在被膜表面形成牙菌斑,这也是舗齿形成的第一步⑸。口腔细菌主要包括两种类型,其 一为产酸类细菌,它们通过代谢口腔中食物的残渣而产生酸性物质,导致牙齿硬组织中的牙 本质脱矿化。主要有 mutans,牙龈吓卩林单胞杆菌,乳酸杆菌等⑹。另一种为革兰氏阳性球 菌,它们可以分解牙齿中的有机质,使牙齿形成“虫洞”。口腔细菌的作用是产生舗齿的主要 因素。
  • 口腔环境:口腔是牙齿存在的位置,是牙齿直接暴露的环境,因此对于犒齿的发生 能够起到直接的作用。口腔中存在大量的食物的残渣和唾液,它们可以对舗齿的发生产生重 要影响。其中食物残渣的主要成分是碳水化合物,他不仅可以作为牙菌斑形成的基质,同时 又可以作为牙菌斑中细菌能量的来源,为细菌正常的生长代谢提供物质基础⑻。牙菌斑中致 舗菌的自由生长代谢,就会产生大量的酸,腐蚀牙齿外层(牙釉质和牙本质)的无机质,由 于离子浸出,促进舗齿发展⑼。唾液在口腔中的作用则更偏向于保护牙齿,例如唾液的存在 可以机械性的清洗牙齿,由于唾液流动,吞咽等动作将犒菌排出口腔。除此之外唾液还可以 中和口腔中的酸性物质,杀菌,防止牙齿的硬组织溶解等。所以,一旦口腔中的唾液的质和 量发生不正常改变,犒齿的发生率也会有很大程度的提升。
  • 宿主:宿主因素也可以在很大的程度上影响犒齿的形成,宿主不同就意味着犒齿形 成的靶器官一一牙齿的形态、矿化程度和组织结构等存在差异,而这些因素都与犒齿发生有 密切关系。如牙齿的窝沟处和矿化不良的牙较易患嶠齿,而矿化程度较好、组织内含氟量适 当的齿抗犒能力较强;另一方面,牙齿的结构与机体有密切关系,尤其是在发育中,不仅影 响到牙齿的发育和结构,而且对涎液的流量、流速及其组成也有很大影响,最近的研究还显 示,舗齿的发生与遗传基因也存在着一定的关系。因此,宿主是犒齿发生过程中的另一个影 响因素。

(4)时间:本质上来说,时间并不是引起舗齿或加速犒齿形成的直接因素,但从另一个 方面讲,舗齿的形成需要一个缓慢的过程。一般情况下,从初期犒齿形成到成熟舗洞的形成 需要1.5-2年的时间,即便致舗菌、适宜的环境和易感宿主同时存在,犒病也不会立即发生。 所以时间也可以归纳为犒齿形成的条件之一。

1.2.3龌齿发生的影响因素

犒齿的发生是一个漫长,多变且复杂的过程,也因其复杂性,目前仍有很多人忍受着它 的折磨。虽然医生和研究人员已经在积极的探寻根治这种疾病的方法,但是生活水平的上升, 影响犒齿发生的因素也越来越多[10J1]o使得犒齿的发病率在经济良好的现代社会仍然久居不 下。总体而言,影响犒齿发生的因素也可以主要归纳为以下几个方面:

1.2.3.1生物因素

S.mutans和乳酸杆菌是齿禹齿发展过程中的主要微生物[12,13]O S. mutans与早期齿禹齿病变的 发展有关[1445],乳酸杆菌与病变的进展有关。这些致犒细菌的特点都具有以下这些特点:(a) 发酵糖并将其转化为酸;(b)产生细胞外和细胞内多糖,这些多糖有助于牙菌斑基质的形成, 并使细菌能够通过特异性受体相互粘附到牙齿表面;(c)在低pH环境下正常生长[⑹。在很 长的一段时间内,人们认为变形链球菌需要一个非脱落表面进行定植,并且假设他们无法在 乳牙上进行定植。因为在恒牙出现前学者们并没有在口腔中发现S. mutans lll]o此外,S. mutans 的定植的“感染窗口”在19至31个月之间变得明显口8】。近年来美国及澳大利亚的研究人员 先后发现并确定了 S. mutans在婴儿口腔中也可以定植的假设[19^0o并发现与早期定植有关的 因素是婴儿的睡前乳,经常摄入含糖的零食,与成人共用食物和母体S. mutans水平⑵】。这 些都证明了 S. mutans是影响犒齿尤其是儿童犒齿发生的决定性因素。

1.2.3.2行为因素

舗齿与家庭行为规范有关,尤其是儿童的喂养习惯,刷牙频率,暴露于氟化物和牙科就 诊等。我们对生活中可能发生的与犒齿相关的行为因素进行了以下的分类:

(1)饮食方式

有大量证据表明饮食中可发酵碳水化合物与精齿之间存在关系。糖摄入与齿禹齿发病率之 间的关系在很大程度上取决于食糖消费的频率QI。近年来的研究得出糖摄入量于精齿之间的 关系并不像氟化物出现前那么强烈,但糖摄入的限制在预防犒齿方面具有重要作用,特别是 对于未成熟牙釉质的幼儿⑼。尽管非乳外源糖的产酸潜力差异很小,但蔗糖是大多数食品和 饮料中最常见的产品,对S. mutans来讲很容易发酵。对ECC的系统评价表明,糖的摄入方 式和形式以及消费频率比消耗的绝对糖量更重要[如。甜食饮料等作为日常生活中常见的糖来 源,他们的摄入与犒齿的发生密切相关。究其本质我们可以知道,当饮食中有频繁的糖进入 口腔时,致犒菌就可以发酵这些碳水化合物产生大量的酸,造成牙本质中的无机质发生脱矿 化。使得牙齿产生“虫洞”,形成犒齿。所以经常吃甜点,饮料等的人群中舗齿的发病率会更 高一些。同时,频繁的糖摄入还会加速变异链球菌等致舗菌在口腔中的定植,有助于牙菌斑 的形成,最终加速导致齿禹齿的发生。

  • 刷牙及氟化物暴露

众所周知,刷牙是主要的社会化过程,大多数人每天至少刷一次牙齿。刷牙对犒齿影响 的关键是将牙膏中的氟化物引入牙釉质表面。氟化物是一种高效的药剂,可以使早期病变再 矿化,并通过形成氟磷灰石来强化表面牙釉质。使用氟化物刷牙可以阻止大多数舗齿病变。 然而,Reisine和Psoter认为,通过刷牙干预舗齿形成的行为很难确定是氟化物的效果还是机 械性去除舗齿牙菌斑的效果IM。Featherstone则认为舗齿形成的过程是脱矿质和再矿化之间 的微妙平衡霜。虽然目前仍不能得到一个确切的结论〔旳,但未接触过氟化水也不使用氟化物 牙膏的儿童更容易患有犒齿0,2叽 同时仍有诸多证据表明,自20世纪70年代以来,使用氟 化物牙膏刷牙是许多发达国家舗齿减少的最重要因素

就儿童舗齿来说,若孩子在较晚的年龄开始刷牙,更容易发生舗齿[2731]O此外,有足够 的证据表明经常刷牙的儿童的ECC发病率显著低于不经常刷牙的儿童册32]。Harris等人的系 统评价表明,每天刷牙少于一次,没有父母监督刷牙,睡前不刷牙,也不使用氟化物牙膏是 ECC的主要危险因素©I。除了用氟化物牙膏刷牙外,还有充分的证据表明,生活在没有公共 供水的地区的儿童的ECC患病率也比较高①]。

  • 牙科护理

常规的牙科护理是最容易被人们忽略的一种舗齿发生影响因素。往往都是在犒齿发生后 才会进入医院或者牙科这所进行诊疗,却忽略了舗齿防大于治的特点。因此接受牙科护理的 时间以及程度也是影响犒齿发生的重要因素。在美国牙科护理是幼儿最不满意的健康需求之 一,因此处于经济水平落后国家的人口口腔健康状况不佳的风险更高㈤]。牙科医生建议儿童 在12个月大的时候就应该进行第一次牙科护理,但美国的统计数据中也只有约9%的3-4岁 儿童接受过专业的牙科护理[旳。在澳大利亚,虽然有不到40%的3-4岁儿童接受过这种专业 的牙科护理,但是他们都集中在拥有私人医疗保险的幼儿,弱势儿童的牙科就诊频率较低[迪。 牙科护理因素被忽视或者或略的原因可能是由于所涉及的费用,所以在解决这种因素的时候 需要多方配合。牙科专业人员应与其他初级卫生保健提供者合作,筛查牙齿腐烂的早期迹象, 并提供预期建议,以减少ECC的发生率。

1.2.3.3社会人口统计学因素

与犒齿发生风险相关的社会人口学因素主要有三个:即社会经济地位(Socioeconomic status, SES),种族和健康素养。SES通常是教育水平,家庭收入和职业的综合⑴】。从公共 卫生研究的角度来看,其中一个局限是对如何定义SES缺乏共识[24]。尽管存在学术上的分歧, 但社会的发达程度是对于犒齿发生的重要影响因素[3839]o Sheiham和Watt认为口腔健康程度 不一致的主要原因是非外源性乳糖的摄入情况和日常中氟化物牙膏使用状况不同[型。此外, 在少数民族社区长大的儿童患ECC的风险增加[⑼,但将种族文化与Sheiham和Watt提出的 设想完全具有很大的难度。另外据最近的报道,健康素养水平较低的人在一般和口腔健康方 面的结果较差⑷]。主要表现在对健康读物等的阅读力低等,不能形成良好的健康意识,使得 这也成为影响齿禹齿发生的另一个因素。

1.2.3.4宿主唾液和遗传因素

宿主相关因素是导致舗齿易感性,耐药性或两者兼顾的重要因素。唾液在维持口腔软组 织和硬组织的健康过程中起着重要作用。它可以通过缓冲牙菌斑酸,免疫球蛋白的存在以及 进食时流量增加来减少舗齿的发生〔⑵,同时它还是钙和磷酸盐矿物质的储存库,有助于牙釉 质的再矿化,长期唾液流速低是齿禹病风险增加的最有力指标之一。口腔干燥症的主观诉求客 观发现唾液流量减少通常不相关。这一发现为临床评估唾液分泌提供了临床建议和指导。唾 液流量的客观测量是犒齿风险评估和管理的重要基石。

1.2.4龌齿的防治

精齿与其他疾病不同,其中最明显的就是其一旦发生就会对牙齿造成不可逆的伤害,因 此对于舗齿防重于治。如果能在舗齿未发生或者未对牙齿造成永久性伤害之前,将舗齿发生 的可能性因素减少到最低,就可以在很大程度上预防舗齿的发生,降低舗齿的发病率。因此 通常将齿禹齿的防治综合在一起考虑,常用的方法可以归结为以下几种:

  • 风险评估

犒齿的风险评估是以患者为中心的齿禹齿管理的基石。它是确定一个人在特定时期内发生 新的精齿病变的可能性舵]以及现有病变的大小或活动随时间变化的概率S3】。它有助于确定患 者是否需要额外的诊断;确定需要犒齿治疗的患者;评估控制精齿的有效性等。调查人员己 经证明,以前的舗齿病史是预测未来犒齿患病率的最佳预测因素,其次是父母教育和社会经 济状况,并且这也可以作为治疗计划和复诊的诊疗依据⑷】。同时幼儿在的变异链球菌的定植 时的时间也是一个重要的危险因素。虽然过往的舗齿病史可能是最有用的风险评估标准,但 由于犒齿伤害的不可逆性,被发现的时间太晚而无法用于预防舗齿的发生。为了实现有效预 防,研究人员必须确定有效的方法,以便在最早的时间发现犒齿的高风险儿童。为了实现这 一目标,研究人员必须开发分子和遗传方法,以改进齿禹齿微生物的鉴定和表征,并找出减少 或消除其定植和有害影响的方法。开发改进技术以检测和量化早期病变并直接评估犒齿的发 病率,这可能是强化犒齿预防工作的最佳策略[⑷。

  • 机械法

该方法是指通过机械性的清除牙齿表面的牙斑,残留物等来使牙齿达到清洁的目的,如 日常的刷牙,通过牙线,牙签等除去牙菌斑生物膜等。通过医学的手段直接清除牙齿表面的 牙菌斑以及消除齿龈袋也算是机械法。同时应用密封剂对犒洞进行密封或外壳手术介入舗齿 斑块修复牙齿的方法我们都将其归纳入机械法中。

  • 药物法

药物法通常都用于舗齿发生后的治疗中,如使用氟化物,酚类化合物或强氧化剂类化合 物等来治疗犒齿。以应用最多的氟化物为例,自从二十世纪美国开创了氟化物治疗犒齿的方 法后,诸多的研究都证实了氟化物在局部使用时具有预防精齿的作用,特别是对儿童龌齿的 发生。在进行深入的研究之后美国科学家正式确定了氟化物对嶠齿的有效性,表明氟化物对 舗齿的主要影响在局部[⑹。流行病学证据表明,氟化物降低了儿童和成人的犒齿的患病率。 动物实验和临床试验的结果支持局部氟化物应用的有效性和氟化物的安全性[⑹。美国动物学 家对氟化物-牙釉质相互作用的物理化学方面的知识,氟化物对牙齿的脱矿质和再矿化过程的 影响和氟化物在口腔环境中的药代动力学[他做了深入研究后也得到了积极的结果[⑺。此外, 天然产物也可以作为抗舗齿的有效药物,并且多种天然产物被证明具有安全有效的抗犒齿功 能,如大蒜素,绿茶多酚等,其中姜黄素在众多天然产物中具有突出的作用,可以抑制致犒 菌变异链球菌的生长,影响牙斑生物膜的产生,是一种己经被证明了的有效抗犒齿类天然产 物。

  • 饮食控制

饮食控制是齬齿防治中非常重要的一个环节,即使使用氟化物治疗舗齿的过程中也需要 配合严格的饮食控制⑼。但是通过控制饮食的方法来防治舗齿的方法的效果是有限的,因为 现代饮食很复杂,含有许多天然糖,精制糖和糖类替代品。此外,许多加工食品中的邛急藏的 糖”却很难避免,这对于犒齿的高风险人群是危险的。幼儿监护人可以通过限制他们对含糖软 饮料【4&49]的摄入以及增加他们对牛奶和其他乳制品的摄入来降低儿童的舗齿风险[50]。因为乳 制品具有保护牙齿免受舗齿侵害的特性,而在糖摄入后食用奶酪可以迅速中和牙菌斑的酸度, 这对于犒齿的防治是有意义的。同时多种糖类替代品具有低致犒性或无致精性⑸】,可以用来 替代致犒性的糖,例如,三氯蔗糖是一种高强度非致犒性甜味剂等。某些食品中添加的天然 产物也有助于降低致犒菌的致精性,例如,蔓越莓提取物可以降低变形链球菌的细菌粘附和 葡萄糖基转移酶活性,使得口腔中致舗菌数量下降;茶提取物抑制唾液淀粉酶活性,降低 S.mutans 口腔中的糖的利用,抑制其生长,从而抑制精齿的发生〔‘刀。

  • 再矿化法

对欧洲人群的齿禹齿进行临床研究表明,当氟化物与机械除斑的方法相结合时,唾液可以 修复初期犒齿〔河。随后,这些研究结果得到了众多专业人士的认可,并最终得出了部分脱矿 质的牙釉质和牙本质磷灰石晶体可以在实验室优化的条件下再矿化至几乎其原始尺寸的结论。 但是这种再矿化的能力只针对于初期舗齿,一旦牙齿中的矿物质完全丧失,就不可能发生再 矿化[何。再矿化过程是一个发散进行的过程,并且大多数再矿化发生在表面,这就在舗洞上 方形成了密封的表面〔何,这种表面比原有的狂琅质更能抵精齿形成过程中的脱矿质[旳。尽管 如此,学者们仍在尝试使犒洞内区域再矿化,以期完全修复己经形成的犒洞⑶]。

  • 益生菌法

该方法是引入一株或者几株益生菌,通过调整口腔中的微生态平衡,改善口腔环境等来 预防或治疗犒齿。因为传统防治方式在诸多方面具有局限性,如药物治疗法的副作用明显, 控制饮食法很难做到实时监管等,而使得犒齿的治疗复杂,昂贵且效果不理想。益生菌疗法 的出现则在一定程度上规避了传统治疗方式中的所有弊端,简单安全并且易于获得,所以近 年来这种以益生菌对抗致舗菌的细菌替代疗法受到广泛关注。目前已经发现甚至应用的抗犒 齿最常见的益生菌是罗伊氏乳杆菌J Lactobacillus rente讥),鼠李糖乳杆菌GG {Lactobacillus rhamnosus GG)和双歧杆菌(Bifidobacterium) [58]0并且,还有研究证明,多株益生菌菌株 的组合使用的方式可以使抗嶠齿的效果呈现出倍增的效果[河。

1.3益生菌

1.3.1益生菌的定义及临床应用

世界卫生组织定义益生菌为一种活的细菌,当其使用量足够时,他们对人类和动物的有 益山叭目前已经发现的益生菌种类主要涉及乳酸杆菌,双歧杆菌、酵母菌、链球菌等。许多 的临床研究表明,某些益生菌在预防和治疗全身性胃肠道疾病中具有良好的作用a】。最早关 于益生菌的研究开始于肠道菌群,肠道中的菌群结构与人体的健康状态密切相关。一旦肠道 内菌群的稳态被打破,机体就会出现某些疾病a%】。随着众多学者对益生菌功效的不断挖掘, 其多种功能逐渐被人们所了解,如改善肠道菌群功能、调节肠道菌群结构、提高药物生物利 用度、提高机体免疫力、降低胆固醇等⑹]。

  • 腹泻

益生菌对腹泻具有明显的疗效,能促进肠道内的卫生物稳定,因此它们用于治疗急性感 染性腹泻,肠易激综合征,抗生素相关腹泻(Antibiotic-associated diarrhea, ADD),炎症性 肠病和过敏性腹泻等疾病,尤其是ADD,它的本质是抗生素使用的副作用,是由于抗生素改 变了患者的肠道微生物,导致的腹部疼痛和腹泻®]。科研人员针对益生菌对腹泻的治疗作用 在过去十年内做了大量的研究,如Ouwehand等人[冋的研究发现益生菌剂量与ADD之间存 在负相关关系,当益生菌的剂量高时,ADD的发病率显著降低。除了治疗腹泻外,益生菌还 具有降低腹泻发生的风险,预防腹泻发生的作用,如鼠李糖乳杆菌Lactobacillus Yharmosus GG)将美国儿童的ADD发病率降低了 75%;布拉迪酵母菌(Saccharomyces boulardii)也显 示了良好的降低AAD风险的能力。有研究通过对766例ADD儿童进行分析发现,益生菌可 使发病率由28.5%下降到11.9%[61]o益生菌还能提高机体的免疫力,抑制致病菌的定植和粘 附,帮助肠道菌群快速恢复,加强肠道内的非免疫防御屏障的构建等,并通过这些途径来达 到预防和治疗腹泻的效果⑹]。

  • 肝脏疾病

最近有研究提出了“肠肝轴理论”,即肝脏和肠道共同构成了一条轴线,两者之间相互影 响共同维持机体的健康国】。这使得通过肠道菌群来治疗肝脏疾病变成了可能。基于这样的研 究基础,就有了通过用益生菌干预肠道菌群来治疗肝脏疾病的尝试,治疗的肝脏疾病主要涉 及肝硬化,脂肪肝,肝炎和肝移植的术后感染等[64?65]O如干酪乳杆菌代田株YIT 9029可以 升高血清中甲状腺运载蛋白水平,降低超敏C反应蛋白,这说明益生菌的介入改善了肠道菌 群的结构,促进了肝脏中特异性蛋白的合成〔旳,有利用受损肝功能的恢复。在肝移植的术后 感染中,应用六种益生菌联合治疗的方式使得术后的感染率下降了 21.5%[何。由于益生菌治 疗肝脏疾病的安全性高,副作用小,并且可以起到预防作用的特点,目前用益生菌治疗肝脏 的药物已经在持续开发中。

  • 肿瘤

恶性肿瘤己经成为当今医学界面临的最重要的难题之一,致死率高达13%以上,其具体 的发病机制仍在不断的探索中。近年来随着对益生菌的研究越来越深入,某些益生菌展现出 了喜人的抗癌特性,虽然目前没有用益生菌治疗肿瘤的临床实例,但是在实验室条件下的动 物实验和体外实验中,益生菌仍表现出了积极的效果,例如:研究发现双歧杆菌的活化是诱 导肿瘤细胞凋亡的重要途径之一;双歧杆菌可以通过诱导机体产生NO的方式杀伤肿瘤细胞; 乳酸杆菌可以诱导TRAIL受体的表达,促进NK细胞对前列腺肿瘤细胞的杀伤活性;鼠李糖 乳杆菌还可以降低肿瘤细胞的端粒酶的活性等[何。虽然益生菌防治癌症的分子机制还有待进 一步探究,但是它对于几种常肿瘤的防治作用已经在大量的动物实验与体外实验中被证明, 如:结直肠癌,胃部肿瘤,肝脏肿瘤,乳腺癌,膀胱癌,白血病等。益生菌作为一种安全的 治疗方式正在成为肿瘤防治的焦点。

  • 肥胖

目前的研究已经证明了肥胖与肠道菌群之间的关系,肠道内的菌群稳态被打破会增加肥 胖发生的风险,当“肥胖型微生物”在肠道内成为优势菌群,进行过度繁殖就会增加肥胖的 几率。益生菌在预防和治疗肥胖疾病中突显出了积极的作用,因此有学者提出,肥胖的发生 可能与摄入的食物的量并不相干,肥胖的主要成因是肠道菌群结构和环境的改变。用益生菌 对肥胖人群进行干预时,可以降低机体摄入食物的利用率⑺。虽然关于益生菌与肥胖具体的 作用关系仍不明确,却有临床试验验证了几株益生菌对肥胖有良好的治疗作用:清酒乳杆菌 (L. sakei NR 28),鼠李糖乳杆菌(LGG),唾液乳杆菌 UCC 118 CL.salivarius UCC 118), 加氏乳杆菌(L. gasseri SBT)。

  • 口腔疾病

以前对于益生菌的应用主要针对肠道微生物菌群,也发现了益生菌对多种疾病都具有良 好的治疗作用。而口腔是除肠道外机体最大的微生物聚集地,因此益生菌用来治疗口腔疾病 的研究也引发关注。最近的研究结果表明,使用益生菌预防口腔疾病也是可行的,犒齿,癣, 口臭或牙周疾病这几种常见的口腔疾病在益生菌的干预下都有积极的效果[⑹。益生菌在口腔 中的作用机制类似于在肠道中的作用,主要涉及细菌素的产生,局部免疫的刺激,炎症反应 的调节,生态位的调节以及与病原体竞争的结合位点和营养物等。目前常见的用于治疗口腔 疾病的益生菌有罗伊氏乳杆菌,植物乳杆菌,短乳杆菌,干酪乳杆菌,唾液乳杆菌和枯草芽 抱乳杆菌等,他们在各种口腔疾病的治疗中都有显著的疗效。其中犒齿是口腔疾病中最具代 表性的一种,用益生菌的治疗犒齿的新方法也是目前研究的热点问题。

1.3.2抗龌齿益生菌

以益生菌介入口腔治疗舗齿是最近兴起的技术方法,相比于传统意义上的机械清洗和药 物治疗,具有安全性高,效果明显,作用温和等多种优点。目前己经发现多株益生菌具有抗 舗齿的功能,他们中的绝大多数都为乳酸杆菌。此外,之前还有研究表明乳酸菌是唯一能够 整合到羟基磷灰石表面并且干扰致犒菌的发展的菌群a】。乳杆菌作为口腔中的正常菌群,构 成人类可培养的口腔微生物群落的约1%,因此在应用的过程中安全高。人类唾液中最常见 的乳酸菌种类包括嗜酸乳杆菌,干酪乳杆菌,发酵乳杆菌,植物乳杆菌,鼠李糖乳杆菌,唾 液乳杆菌,嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌3】。大量的研究表明用益生菌治疗舗齿都得到了积极的 结果,虽然目前仍无法解释益生菌抗龌齿的具体作用机制,但综合已有研究作用机制可能涉 及以下的几个方面[5870]:

  • 黏附机制

口腔的致病菌都是浮游在口腔中的细菌,为了有效地预防或者治疗舗齿,益生菌必须能 够粘附到牙齿表面并整合到构成牙科生物膜的细菌群落中一一定植是细菌发挥作用的第一步 砂],同时,致病菌在口腔中的定植也是其发挥作用的必要因素[呵。所以益生菌替代或抑制致 病菌在口腔中定植是其发挥抗犒齿作用的机制之一。在此机制下的作用方式主要有三种,其 一,益生菌与致病菌或牙齿表面的受体物质相互识别结合,其细胞壁上的大分子可以阻断或 抑制致病菌与受体或活性位点结合,从而使致病菌不能定植于牙齿表面(或者定植量少),降 低舗齿的发生率"1】。其二,致病菌本身不具备黏附能力,需要通过牙斑上的生物被膜来定植。 而益生菌的介入可以降低生物被膜的产生量,或减少可以生成被膜的菌的胞外多糖的产生量, 降低生物被膜的粘性,从而降低致齬菌的定植数量,同样减少舗齿的发生。其三,某些益生 菌具有与致病菌相似的外壁结构,可以与致舗菌竞争牙齿表面或者牙斑上的结合位点,以竞 争性抑制的方式来降低致舗菌的定植量[汕。同时益生菌在宿主上定植,黏附并与致犒菌竞争 营养物质,可以增加自身在口腔中的保留时间,有利于长时间发挥活性作用。

  • 共聚机制

共聚是指两种不同种属的菌株之间发生特异性识别而结合在一起的现象。益生菌进入口 腔后可以与致犒菌的菌株发生特异性的共聚,使致犒菌不能在口腔内长久存在。这样形成的 共聚物易于在唾液流动,吞咽动作发生时排出口腔⑴】。

  • 产生抑菌物质机制

益生菌在代谢及发酵过程中可以产生复杂的代谢物,其中的过氧化氢等物质可以作为杀 菌剂在口腔中发挥作用,造成口腔中的致犒菌数量下降阳]。其他常见的杀菌物质诸如短链脂 肪酸、细菌素、过氧化氢、小分子肽类、酚类物质等。当多种物质产生时,口腔内的环境发 生变化,pH、氧化还原电位等呈现出不同程度的变化,大多数情况下,这种变化都是有利的, 这从另一个方面辅助了益生菌的抑菌作用。

  • 免疫调节机制

虽然益生菌的发挥作用的机制仍不能完全明确,但其对机体免疫系统的调节以及免疫刺 激的激发发挥关键作用⑴】。益生菌的免疫调节作用主要与系统的树突状细胞相关,它可以促 进淋巴细胞的分化,转化为均有免疫应答作用的浆细胞,产生大量的分泌型免疫球蛋白A (Immunoglobulin A, IgA ),其作用于口腔内的活性位点,协调免疫应答发挥作用[95,112]0

但是,由于大多数的乳酸菌都具有产酸性能,会对牙齿的硬组织造成伤害,所以并不是 所有的乳酸菌都适用于犒齿的治疗。因此,确定一株乳酸菌是否可以作为抗犒齿益生菌需要 进行严格的筛选。比如要考虑菌株的胞外多糖产量,过氧化氢的产生量,对于牙齿及口腔上 皮细胞的粘附性,以及批量用于治疗犒齿时的安全性等[⑵]。因此虽然己经有大量的研究对此 进行过探究,但是目前可用的益生菌种类仍非常缺乏,所以,更多的更稳定和更安全的抗犒 齿益生菌仍有待发掘。

1.4国内外的研究进展

益生菌防治齬齿是指无害菌株植入宿主微生物区系通过抑制致病微生物来维持或恢复天 然微生物群体,且被用于激活健康相关的微生物或恢复口腔生物膜中的生物多样性⑴]。目前 研究较多的抗齿禹齿益生菌大都属于乳酸杆菌属或双歧杆菌属"I,且对于抗舗齿益生菌的研究 可以大致包括菌株筛选、潜在危害性评价、抗舗齿机制研究及功能性的验证四个方面,基于 体内和体外两个方面展开。体内研究方面,NNse等人画对594名1-6岁的儿童进行了为期七 个月的双盲实验,实验组儿童日常饮用的牛奶中添加鼠李糖乳杆菌,对照组为普通牛奶。实 验期结束后发现实验组儿童的犒齿发病率低于对照组,同时儿童口腔内5. mutans的数量也低 于对照组,其中3-4岁的儿童中尤为明显。证明了鼠李糖乳杆菌对儿童牙齿健康有益。 Stensson[77]等人针对齿禹齿与罗伊氏乳杆菌菌株 ATCC 55730 QLactobacillus reuteri ATCC 55730) 之间的关系进行了单盲实验。孕晚期孕妇和出生至一月龄的婴儿暴露于罗伊氏乳杆菌环境中, 控制摄入量及暴露方式,在婴儿长到九岁时考察他们的舗齿发生情况。结果表明,实验组儿 童虽然生活习惯,饮食结构等均有不同,但是整体看来,婴儿期的罗伊氏乳杆菌暴露仍然显 著地降低了他们的犒齿发病率,口腔内5. mutans等致犒菌的数量也相对较低。体外研究则主 要从不同的环境中筛选备选菌株,然后以舗齿的致病菌作为指示菌进行抑菌实验。对抑菌物 质进行分离纯化,模拟菌株的抗犒齿过程。Kang[78]等人从儿童唾液中分离出两株可以抑制变 异链球菌生长的益生菌,它们通过分解蔗糖产生水溶性聚合物来抑制S. mutans生物膜的形成, 从而起到抗犒齿作用。而关于抗舗齿益生菌的作用机制研究,有学者认为是主要是由于葡糖 基转移酶基因(g轴)和果糖基转移酶(加)基因的表达在S. mutans初始粘附于牙齿表面过 程中发挥了助力作用,加速了牙斑的形成,并因此引发犒齿和其它牙周疾病。而Janczarek[58] 等人认为益生菌发挥抗犒齿作用的机制尚不能完全明确,目前认可的解释机制是益生菌可以 自然地置换口腔中的致舗菌并影响成人和儿童的口腔健康。Laetitia Bonifait[59W人的对抗齬 齿益生菌的作用机制进行了如下归纳,(1)定植于牙齿表面与致舗菌竞争活性位点;(2)产 生抗菌物质,杀灭致舗菌或抑制致犒菌的生长;(3)通过群体效应等调节口腔的微生态环境;

(4)刺激口腔的免疫系统,降低炎症反应。

近年来国内学者对于口腔益生菌的研究也有诸多报道,其中杨颖等从健康宿主的口腔中 筛选出一株对血清型为g的变异链球菌具有明显抑制作用的的植物乳杆菌HO-69,对其产生 的抑菌物质进行研究并纯化后,得到了一种抑菌优良的新型抗菌肽m81]o李思佳等发现罗伊 氏乳杆菌可以产生对S. mutans有明显抑制作用的抑菌物质,并初步确定了发挥抑菌作用的是 蛋白类物质一一罗伊氏乳杆菌产生的细菌素〔跖。杨娟等从健康的志愿者唾液和牙菌斑中的乳 酸菌中进行抗舗齿筛选,得到两株候选的口腔益生菌,又通过各种作用指标评价后选出一株 最佳抗齬齿菌株砂】。姚沛琳等从唾液、泡菜、内蒙古奶酪等多个样品中分离出97株乳酸菌, 然后以这些乳酸菌分别作用于变异链球菌,通过观察变异链球菌生物膜各种结构的变化,最 终发现一株(韩国魏斯氏菌)表现出了潜在的预防舗齿作用,它可以在不同时期抑制甚至破 坏变异链球菌生物膜的形成,降低牙斑生物膜的活性[河。

最近的体外生物膜研究已经证实了不同菌株如唾液乳杆菌W24,鼠李糖乳杆菌GG,双 歧杆菌动物乳杆菌BB12,鼠李糖乳杆菌LB21和嗜酸乳杆菌LA-5都可以升高生物膜pH值

【5跖5],使得口腔环境中的酸性降低,降低犒齿的发生率。本课题的目的在于系统的筛选出具 有抗犒齿功能的乳酸菌作为潜在抗舗齿益生菌。在理论上为犒齿的预防以及治疗提供了新的 思路和方法,在实践中为抗舗齿益生菌产品的研发与生产提供技术支持。

1.5研究目的与意义

犒齿是世界上最普遍并且最昂贵的口腔传染病。据不完全估计,世界上60-90%的儿童和 几乎全部的成人均患有不同程度的齬齿,同时ECC的发病率高达60%以上,并在后来的成长 过程中不断增加,给人们的日常生活及口腔健康带来极大的不便。目前普遍认为犒齿是以S. mutans和产酸菌为主要细菌成分的过度生长而引起的牙体硬组织的感染性疾病,其中S. mutans和产酸菌的致舗性主要是基于他们对牙表面极强的粘附能力以及较强的产酸和耐酸 能力,这使得口腔内环境被破坏,酸性增加,牙本质脱矿化使得牙齿缺损或脱落。

研究表明舗齿的发病主要受到饮食结构,卫生习惯,和遗传因素等的影响。甜食的过量 摄入可以加快口腔内致舗菌的快速繁殖而加剧犒齿的产生。面对当今社会犒齿发病率居高不 下的现状,人们与齬齿的舗齿斗争从未停止过。传统的治疗方法周期较长,同时耗费大量的 精力与金钱,效果也不明显,因此亟待开发新型的抗精齿技术方法。

本课题拟采用生态调节法对犒齿的发生进行干预,以具有功能性的乳酸菌抑制口腔中致 舗齿菌株的生长来预防甚至治疗舗齿病症。目前的研究已经证明S. mutans是导致舗齿的主要 致病菌,因此本研究选择此菌株作为指示菌,以本实验室保存的13株乳酸菌作为备选菌株进 行抑菌试验,筛选出能够抑制变异链球菌生长乳酸菌株。并通过单因素变量法对抑菌物质的 类别属性做出初步判定。同时,从筛选菌株的产酸,产糖,粘附性,腐蚀性等多方面进行乳 酸菌株的潜在危害性评价,进一步筛选出高安全性的抗舗齿乳酸菌。最后,对所选乳酸菌发 挥抗舗齿功能的机制进行探究。

多株乳酸菌都可以作为潜在的抗舗齿益生菌,用于犒齿的预防或者治疗。但目前由于益 生菌种类依然局限,作用机制不明确等原因,该方法未普及。此外,目前发现的绝大多数抗 舗齿益生菌都属于乳酸菌,当它们直接作用于口腔时,由于乳酸,胞外多糖等的存在一定程 度上加速舗齿的形成。因此对于抗犒齿益生菌的潜在危害性评价也尤为重要,但在之前的研 究中缺少系统的评价。本研究旨在对本实验室保藏的研究具有良好功能性的乳酸杆菌进行筛 选,以典型致齿禹菌S. mutans作为指示菌,筛选出具有抗齿禹齿作用的乳酸菌菌株,对其进行潜 在危害性评价,并对其作用机制进行研究,同时将它们与天然活性产物一一姜黄素进行复配, 考察当它们共同作用时的抗舗齿效果。筛选出符合条件的作为潜在抗舗齿益生菌,从而进一步 丰富抗舗齿益生菌的多样性。

1.6研究内容

本课题将实验室保存的13株乳酸杆菌作为备选菌株,以筛选出安全高效的抗舗齿益生菌 为目的,主要的研究内容如下:

  • 菌株的筛选与抑菌物质类型的确定

主要是通过抑菌实验对备选的13株乳酸菌行进筛选,得到抗嶠齿益生菌潜在菌株,并通
过单因素法对筛选出菌株发挥抗菌作用的物质类别进行初步确定。

(2)  菌株对牙齿潜在损伤的研究

主要从乳酸菌对牙齿的潜在腐蚀性和在口腔中发挥作用的可能性两个方面进行,在此部 分选择羟基磷灰石模拟牙齿本质进行。腐蚀性的研究是从乳酸菌产酸以及酸对轻基磷灰石腐 蚀程度反面进行,应用的可能性则从乳酸菌产糖及对牙齿的粘附性两方面进行。综合研究初 选菌株对牙齿存在的潜在危害。

(3) 菌株抑制致舗菌生长的作用机制研究

从与致病菌共聚集和对生物膜形成的影响两个方面对目标菌株的抗舗齿机制进行探讨。 共聚机制通过将致病菌与乳酸菌共培养然后计算共聚率的方法进行,而对生物膜的影响机制 则通过生物膜量,结构,膜内菌体的存活情况以及细胞外多糖产量进行综合探究。

(4) 菌株与抗舗齿物质协同作用及其抗舗齿效果

将菌株与天然姜黄素复配,探究二者共同作用时的抗舗齿效果。这一部分选取致舗菌的 几个主要毒力因子进行研究,如致舗菌的产酸性,生物膜形成情况及膜内细胞外多糖产量等。

1.7试验技术路线

与天然产物复配

图1-1实验设计流程图

Fig.1-1 The experiment design flow chart

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1供试菌株

致病菌:变异链球菌J Streptococcus mutcms)(哈尔滨工业大学食品学院惠赠) 备选乳酸菌 13 株:YRL45(LacobaciHius plantarum YRL45 ), YRLP45(L. plantarum YRLP45 ),

BRAP-01 (L. paracasein, YRL8020 (L. rhamuosus                               , YRL519

(L. rhamuosus YRL519), LB21 (L. rhamuosus ABLB2S), YRL578 (L.

casei YRL578), YRL306CL. casei YRL306), YRL475CL. cos勿 YRL475), YRL28 (L. rhamuosus YRL2S^), T1 ^Enterococcus faecium ZLWT1), Q7

(L. plantarum Q7), QL-2 (L. plantarum QL-2)(哈尔滨工业大学食品 学院惠赠)

2.1.2培养基

乳酸菌培养基:本研究使用液体MRS培养基对乳酸菌进行活化,并在活化后取乳酸菌 24 h发酵上清液制备抑菌液样品。MRS培养基购自广东省环凯微生物科技有限公司。

变异链球菌培养基:本研究中变异链球菌的活化与培养均在液体BHI培养基中进行,半 固体BHI应用在抑菌实验中。BHI培养基购自青岛海博生物有限公司。

2.1.3仪器与设备

表2-1主要设备仪器与厂家

Tab.2-1 Main equipment and manufacturers

2.2实验方法

本实验拟对13株乳酸菌进行筛选,得到对变异链球菌有抑制作用,并且对于口腔环境及 牙齿安全的益生菌,并对其作用机制进行简单的探讨。最后再将其与具有明确抗舗齿作用的 化学物质姜黄素复配,共同作用于变异链球菌,观察作用效果。本研究所用的菌株在实验前 均需活化,乳酸菌于MRS液体培养基于37 °C下活化24 h,变异链球菌于BHI液体培养基中 于微厌氧条件下(85% 2,10% CO2, 5% 02) 37 £活化1211,备用。

2.2.1抗龌齿菌株的初筛

2.2.1.1抑菌试验

本研究中的抑菌试验采用双层平板法。根据wasfi R等人恥]的研究方法,双层平板下层 采用琼脂,上层选择半固体BHI培养基。实验中首先将琼脂倾注在平板内,凝固后在上面摆 好牛津杯。后将BHI半固体培养基加热融化,待温度冷却至50 °C左右时接入10 J1L的指示 菌(变异链球菌),混匀后倾注在上述准备的平板内,无菌条件下凝固后拔出牛津杯备用。然 后将乳酸菌发酵液注入样品孔内,置于微厌氧条件下,37 °C培养24 h。值得注意的是,为了 确定了抑菌效果的来源,本实验将乳酸菌发酵样品通过离心分为发酵上清液和菌体细胞两个 部分分别进行抑菌试验。待培养结束后,观察并测量抑菌圈的直径。得到具有抑菌效果的乳 酸菌菌株进行下一步的实验。

2.2.1.2抑菌物质的确定

因为乳酸菌发酵液中含有的成分非常复杂,采用以下方法初步确定发挥抑菌作用的物质 类别[5&71]。

(1)排除酸作用

因为乳酸菌自身就可以在生长条件下产生乳酸,而很多细菌在酸性条件下无法生存,所 以酸有可能是抑菌作用产生的原因。本研究将乳酸菌在MRS中的24 h培养物置于离心机中 离心(8000 r/min, 5 min)后获得乳酸菌的发酵上清液。以5 mol/L的NaOH调节其pH至 5.5-6之间,最后将中和后的发酵上清液通过0.22 pim的滤膜,将准备好的样品溶液作为抑菌 样品重复进行抑菌试验,观察排除酸后的发酵上清液的抑菌效果。

  • 排除H2O2作用

出。2是一种常见的氧化剂,可以杀死大多数细菌,乳酸菌发酵过程中产生出02,因此 它也是抑菌过程中抑菌效果产生的可能原因之一。为了排除这种可能,将乳酸菌在MRS中 的24 h培养物置于离心机中离心(8000 r/min, 5 min)后获得乳酸菌的发酵上清液,再以5M 的NaOH中和使其pH至6-6.5o向其中加入过氧化氢酶,混合均匀后置于37 °C下温育30 min。 以此作为抑菌样品进行抑菌试验,观察抑菌效果。

  • 确定蛋白作用

乳酸菌发挥抗菌作用的另一种可能的物质,细菌素中有一大部分是蛋白类物质。所以需 要检验抑菌现象出现的原因是否是由于蛋白质类物质。同(1), (2)得到乳酸菌的发酵上清 液,用5M的NaOH中和,并加入过氧化氢酶。最后分别用胃蛋白酶,胰蛋白酶,中性蛋白 酶,酸性蛋白酶,碱性蛋白酶,糜蛋白酶处理(同出02酶)。以此作为抑菌样品进行抑菌试 验,观察抑菌效果。

2.2.1.3最小抑菌浓度(MIC)的测定

采用二倍稀释法对选定菌株的发酵上清中和液(Fermentation neutralized supernatant, FNS) 对S. mutans进行MIC测定。将初选菌株的发酵上清中和液进行二倍梯度稀释(最高稀释8 次),并以无菌的PBS溶液作为对照。在无菌条件下将1 mLBHI培养基加入到24孔板的每 —孔中,后实验组加入等量的FNS的梯度稀释液,对照组加入等量的MRS培养基,最后每 一孔中按2% (v/v)的比例接种活化后的变异链球菌发酵液。在37 °C,微厌氧条件下培养过 夜。观察和孔内液体的浑浊情况,取孔内没有变异链球菌生长的最小浓度作为菌株的MICo

2.2.2抗齬齿菌株的潜在危害性评价

2.2.2.1产酸性评价

乳酸菌的产酸评价采用终点pH法进行测量【8叫 将初选菌株在MRS中培养24 h后,利 用pH计对培养液的酸性进行测定⑻】。

2.2.2.2产糖性评价

将初选菌株在MRS中培养24 h后离心(8000i7min, 10 min, 4 °C)的上清液。取10 mL 的上清液,向其中加入2 mL 80%的三氯乙酸,混合后置于冰上搅拌30 mino离心除去上清液 中残留的菌体和蛋白,收集二次离心的上清液后加入三倍体积的冰冻无水乙醇,随后将该混 合液置于4 °C下冷藏24h,待多糖成絮状析出。4 °C 10000 r/mi n离心15 min收集的沉淀即 为多糖,随后用10 mL的蒸憾水将沉淀重新溶解成多糖溶液备用[込啊。Liu等人测定多糖的 方法,本实验采用苯酚-硫酸法对备用的多糖溶液中的多糖含量(即初选乳酸菌菌株的游离胞 外多糖产量)进行测定〔9°]。

2.2.2.3腐蚀性评价

腐蚀性评价采用等量元素法测定。将活化后的乳酸菌菌株接种到MRS中培养24 h,后 离心取得发酵液(8000 r/min, 10 min, 4 °C)。将五种发酵上清液分别和轻基磷灰石的混合 液中,搅拌均匀后共同孵育。对照组中接种变异链球菌。分别在30 min, lh, 2h, 4 h取等 量发酵液,然后进行离心(8000r/niin, 10 min, 4 °C)取上清液。随后用酸吨目酸盐分光光度 法测定上清液中的磷。观察上清液中的磷含量变化,以表征轻基磷灰石被腐蚀的状况[91] oOmin 时做对照,以校正样品中的内源性磷[92】。

2.2.2A粘附性评价

本实验采用轻基磷灰石(HA, d=82 yni)模拟牙齿,评价初选菌株对其粘附性。改进 Haukioja等人阴粘附性测定方法。取1 mL的乳酸菌过夜培养物,离心获得菌体,再将菌体 重悬于等体积的无菌PBS中,转移到24孔板中测量其在600 nm下的吸光度,记为ODeoo前。 后向上述液体中加入10 mg灭菌后的轻基磷灰石粉末,混合均匀后置于培养箱中,37 °C下 温育1 h,后将培养液通过0.45 pm的针孔滤膜,收集滤液。再用无菌的PBS溶液冲洗两次, 合并过滤液,离心收集沉淀。最后将沉淀以lmL无菌的PBS溶液重悬,测量600 nm下的 吸光度,记为ODe。。后。贝U:

叭加 S °°600 前 一 °°600 后.nnn/
粘附率=           —                X 100%

U%。前

2.2.3初选菌株发挥抗龌齿作用的机制

2.2.3.1初选菌株和致病菌的共聚机制

有文献表明,益生菌发挥抗舗齿作用的原因可能是益生菌与病原微生物共聚,使其失去 吸附在牙齿表面的能力,从而通过唾液的吞咽等减少口腔中病原微生物的数量。利用E. Vlkova等人I%]的方法对五株初选菌株与变异链球菌之间的共聚率行进测量。首先将初选的五 株LAB菌株分别于MRS培养基中37 °C培养24 h,同时5. mutans于BHI培养基中,在微厌 氧条件下培养过夜。将培养结束后乳酸菌培养液混匀后分别与等量的变异链球菌培养液混合。 并测量混合样品此时在600 nm下的吸光度,记为To。后将混合液置于摇床中温育2 h,并在 再次测量其在600 nm下的吸光度,记为T?。贝卩:

共聚率=(1 —半)X100%

2.2.3.2初选菌株对变异链球菌生物膜的影响

  • 生物膜的培养

生物膜的培养采用孔板法。12孔板的每一孔内加入3 mL的添加有2%(m/v)蔗糖的BHI 培养基,后接种2% (v/v)的活化后变异链球菌。将孔板置于微厌氧的条件下,37 °C培养48 h,成熟的变异链球菌生物膜就会出现在孔的内壁及底部[97】。本研究中使用初选菌株的特别 说明,当后期生物膜需要在显微镜下进行观察等操作时,在培养前期于孔板底部置入细胞爬 片(d=8 mm),作为生物膜载体。

  • 对生物膜量的影响

本部分探究对生物膜影响的机制主要针对发酵液中的蛋白类抑菌物质,所以在研究中用 FNS作为抑菌样品。将变异链球菌接种到含有等量添加2% (m/v)蔗糖的BHI培养基和FNS

(对照组中加入等量的PBS)的孔中,置于培养箱中48 h以形成生物膜。通过结晶紫染色法 对变异链球菌的生物膜的量进行测量〔凋。培养结束后,除去含有浮游细胞的上清液同时保持 生物膜的完整性。随后用无菌的PBS溶液洗涤三次加入甲醇固定15 min。然后将微孔板倒空 并风干。接下来,将生物膜用结晶紫(CV, 0.1%, m/v)染色30 min,除去多余的染色剂。 最后,向每个孔中加入100% (v/v)的乙醇将结合的结晶紫重新释放回孔中。将溶液转移到 新的孔板中测其在600 nm下的吸光度,以此代替变异链球菌生物膜形成的量。

  • 对生物膜结构的影响

在孔板中加入细胞爬片,按照(2)中的方法在细胞爬片上培养生物膜,然后在SEM下 观察各组生物膜的结构。将生物膜清洗干净后置于戊二醛(1 mL, 2.5%, v/v)中稳定1 h, 并在一系列梯度乙醇中脱水20 min (50, 70, 80, 90, 95, 100%, v/v),随后转移到100% 的乙醇中浸泡一小时。取出后置于低温条件下干燥24 h,以金溅射喷涂,后用SEM观察〔凋。

  • 对生物膜中细菌存活情况的影响

按照(2)中的方法将生物膜培养在细胞爬片上。然后,除去浮游细胞,用无菌水洗涤盖 玻片,并用无菌滤纸干燥。然后用活/死菌染色试剂盒(Bac Light TM)对生物膜进行染色。 活细菌用SYTO9 (绿色荧光)染色,而死细菌用碘化丙喘(PI,红色荧光)染色。然后用无 菌的PBS洗涤两次以除去过量的染料。用CLSM (TCS SP2 AOBS, Leica, Germany)在530 nm/480 rnn波长下观察样品[99J00]o

  • 对生物膜中胞外多糖产量的影响

FNS对生物膜中胞外多糖的产量的测定同样采用CLSM法,即所有的处理方法都同于(4), 但是胞外多糖用FITC-ConA (绿色荧光)染色,蛋白质用罗丹明B染色(红色荧光)。并且 CLSM的观察波长被调节到620 nm / 550 nm。

2.2.4 FNS与姜黄素复配的作用效果

2.2.4.1对S.mutans生长情况的影响

姜黄素以二甲基亚砚(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)溶解,后用BHI培养基稀释到浓度 为MIC的8倍(约250 piM)备用。制备五株乳酸菌的FNS备用。然后采用12孔板法测定 S. mutans在姜黄素和FNS的共同作用下的生长情况。将孔板中加入1 mL的FNS,0.5 mLBHI 培养基和0.5 mL的姜黄素稀释液,随后接种2% (v/v)的活化后S. mutans培养液。置于微 厌氧的条件下,37 °C培养24 h。培养结束后用酶标仪测量其在600 nm下的吸光度。

2.2.4.2对S.mutans产酸性的影响

按2.2.4.1中的方式制备姜黄素稀释液和FNS,随后将姜黄素稀释液与发酵上清中和液按 比例混合成处理液加入装有2.5 mLBHI的试管中。再接种5. mutans后厌氧培养24 h后测终 点pHo处理液组成见表2-3[86]

表2-3处理液组成

Tab.2-3 Composition of treatment liquid

2.2.4.3对S.mutans粘附性的影响

对粘附影响的实验选择在试管内进行,按照2.2.4.1中处理液的配比方式将其加入到添加 了 2% (m/v)蔗糖的2.5 mL BHI培养基中,最后接种2% (v/v)的S. mutanso将混合液置于 37 °C下微厌氧培养24 h (注:培养时试管与地面呈30°角)。随后将液体倒出于600 nm下

测吸光度,记为ODe。。浮游细菌。再将试管内壁上的粘附细胞用0.5MNaOH重悬,随后与600 nm 下测吸光度,记为ODe。。粘附细菌〔1°匕贝I」:

2.2.4.4对S.mutans生物膜的影响

变异链球菌生物膜在24孔板中培养,向3 mL BHI培养中补充添加2% (m/v)的蔗糖, 接种2% (v/v) S. mutans后于37 °C下厌氧培养48 h。在孔板壁上得到成熟的变异链球菌生 物膜。随后用PBS将生物膜清洗3次,除去未粘附的细菌。将3 mL处理液(各组处理液组 成成分及比例见表2-4,且本实验中姜黄素稀释液浓度为4倍MIC)加入到带有生物膜的孔 中。37 °C下继续共培养24 h[102]o然后用结晶紫染色法测量生物膜量:将处理后的生物膜用 PBS清洗三次。置于空气中干燥45 min,等到孔中生物膜风干后,用1%的结晶紫染色15 mino 用PBS清洗除去浮色,加入3 mL的95% (v/v)乙醇脱色,将脱色液转移到新的孔中,测 OD595 nm[103]o

表2-4处理液组成

Tab.2-4 Composition of treatment liquid

组别                                                                           各样品添加量

224.5对S.mutans生物膜中胞外多糖产量的影响

先按照上述方式在孔板内形成生物膜。吸出培养基后,将生物膜用细胞刮刀刮下转移到 1.5 mL离心管中,并用1 mL水将生物膜重悬。在4 °C下以6000 r/min离心10 min,收集上 清液。并将沉淀重悬于lmL的水中洗涤两次,合并所有上清液。然后根据Chen[104], Koo[105] 等人的方法用苯酚-硫酸法对上清液中的多糖量进行测量。

2.2.5数据处理和分析

本试验中每个实验做三次重复,并采用SPSS19.0进行显著性分析,同时利用Microsoft 软件和Origin8.5对试验数据进行整理、统计分析和作图。

3结果与分析

3.1抗龌齿益生菌的初筛结果

3.1.1抑菌试验及发挥抑菌物质的确定结果

对13株备选菌株采用抑菌试验初筛后,对5. mutans具有抑制作用的菌株在双层平板上 形成抑菌圈。由于抑菌实验对菌株的初筛以及抑菌物质类型的初步确定的实际操作过程中只 是抑菌液的处理不同,所以我们将两部分的实验结果合并完成对抗犒齿益生菌的初筛。当抑 菌圈直径偏小会导致测量困难,造成较大的误差,所以本次实验过程中,我们默认抑菌圈直 径小于5 nrni的处理液样品不具有抑菌效果。观察各株乳酸菌不同处理的发酵上清液形成的 抑菌圈,并记录抑菌圈直径,如图3-1所示。所有乳酸菌菌株及不同发酵上清液形成的抑菌 圈直径测量结果合并后的结果如表3-1所示。

注:A表示不加乳酸菌发酵上清液时变异链球菌的分布情况;B表示加入乳酸菌发酵上清液原液后形成 的抑菌圈;C表示加入中和并以H2O2酶处理的发酵上清中和液后形成的抑菌圈;D表示加入与蛋白酶温育 后的发酵上清中和液后形成的抑菌圈。图中数字表示形成抑菌圈的直径(mm),其中低于5 mm的直径未做 标记

图3-1不同处理的发酵上清液形成的抑菌圈

Fig.3-1 Inhibition zone formed by differently treated fermentation supernatants

如表3-1所示,本实验用于筛选的13株乳酸菌菌株中,以原培养液进行抑菌实验时有8 株具有抑菌效果,分别为 YRLP45、YRL45、QL-2、Q7、Tl、YRL8020、YRL519、YRL475 和YRL578o它们在双层平板抑菌实验中展现出的抑菌圈直径都远大于5 mm,随后,我们对 这8株菌的抑菌液中发挥抑菌作用的物质进行了研究。YRL8020、YRL519和YRL578这三 株乳酸菌的发酵液中的酸被中和后,显著的降低了对5. mutans的抑制作用,抑菌圈几乎消失, 达到了默认的不具有抑菌作用的标准。而其他五株菌株的抑菌圈直径虽然也有显著的降低, 但是仍然保持在5 mm以上,因此可以推断YRL8020、YRL519和YRL578原培养液表现出 的对变异链球菌的抑菌作用可能是乳酸菌产生的乳酸发挥的作用,而乳酸虽然可以发挥抑菌 作用,但在口腔中也可以加速舗齿的发生,这并不是我们想要的。而后,用H2O2酶处理的 发酵液用于抑菌试验时,也显著的降低了 FNS对变异链球菌生长的抑制作用,但整体来看来, 因此而降低的抑菌作用程度并不是很大,可以看出菌株产生过氧化氢的能力不是很强,它不 是主要的抑菌物质。此时,还有五株乳酸菌保持着抑菌能力,分别为YRL45、YRLP45、QL-2、 Q7 和 Tlo

表3-1用不同种处理液进行抑菌试验的抑菌圈直径(mm)

Tab.3-1 Inhibition zone diameter for bacteriostatic test with different treatment solutions (mm)

注:菌株类型相同的每一列两者不同字母表示差异显著(PvO.05),字母相同表示差异不显著(P>0.05), 且菌株不同的组之间不进行显著性比较

当用联合的蛋白酶处理上述五株菌株的培养液后再用于抑菌试验时,平板上形成的抑菌 圈的大部分都已不可见,抑菌作用几近完全消失。因此可以推测上述五株乳酸菌发挥抑菌作 用的物质可能是蛋白类物质,可能是乳酸菌发酵过程中产生的蛋白类细菌素,但还有待进一 步验证。综合上面的实验结果,最终选定YRL45、YRLP45、QL-2、Q7和T1这五株菌作为 抗犒齿益生菌的初选菌株进行后续研究。

3.1.2 MIC测定结果

对FNS最小抑菌浓度(MIC)的确定采用二倍稀释法进行,将各菌株的FNS以二倍为 梯度进行稀释,然后在微孔板内进行抑菌实验。最终测定的结果如表3-2所示。

如表3-2所示,在将变异链球菌在添加了不同稀释倍数的FNS的BHI培养基中培养后 24 h后,以肉眼观察培养液的浑浊程度。其中出现“-”的最高稀释倍数就对应于FNS的MICo 本实验的结果中,YRL45、YRLP45和T1这三株乳酸菌的FNS在稀释8倍时见到最后一个 清澈的孔,表示此时的稀释度是能抑制变异链球菌的最小浓度。而Q7,QL-2这两株菌的FNSs

在稀释到4倍时就出现了最后一个清澈的孔,为了更好的探究FNS对变异链球菌的影响,后 续实验如无特殊说明,均选择2倍稀释量作为实验浓度。

表3-2不同浓度的乳酸菌FNS对变异链球菌的抑制情况

Tab.3-2 Inhibition of Streptococcus mutans by different concentrations of LAB FNS

注:其中肉眼可见浑浊的用“ + ”表示,反之肉眼不可见浑浊则用“-”表示

3.2初选菌株的潜在危害性评价

3.2.1产酸性评价

通过对发酵液终点pH的测定可以发现,初选的几株乳酸菌展现出的产酸特性符合乳酸 菌的发酵特性,结果见表3-3。除了 T1菌株的pH显著(尸V0.05)高于其它以外,剩余的四 株乳酸菌发酵液的终点pH均维持在3.80左右。造成初选菌株发酵液整体呈酸性的主要原因 就是乳酸菌在发酵过程中产生的乳酸,虽然在一定程度上乳酸可以抑制一些致病微生物,但 由于牙齿的特殊性,乳酸的产生将给牙齿带了更大的舗齿风险。以唾液链球菌菌株的产酸性 作为标准(发酵终点pH约为3.65),我们可以得出上述五株乳酸菌的产酸量可以接受,在产 酸性方面可以成为抗嶠齿益生菌的候选者。

表3-3初选菌株的产酸性

Tab.3-3 Acidogenic properties of primary selected strains

3.2.2产糖性评价结果

通过苯酚-硫酸法对乳酸菌发酵过程中的产糖能力进行评价。结果如图3-2所示,初选的 五株乳酸菌都具有产生胞外多糖的能力,但是产多糖的能力具有差异性。整体来看,五株乳 酸菌产生的胞外多糖的含量在75-100 mg/mL,其中Q7菌株的胞外多糖产量显著高于其它菌 株,是产糖能力最强的菌株。并且各株乳酸菌的多糖产量略有不同,其中QL-2菌株的产糖 能力最差,比Q7低25%左右,但是它的净产糖量也有75 mg/mL,因此也在可以被考虑的范 围内。总的结果说明初选的五株乳酸菌符合研究之初对抗犒齿益生菌的期待,都具有一定的

产胞外多糖能力。

图3-2初选菌株的胞外多糖产量

Fig.3-2 Yield of the selected LAB's EPS

3.2.3腐蚀性评价

采用等量元素法测量乳酸菌对牙齿的腐蚀性,结果如图3-3所示。

—^YRL45 「^YRLP45

图3-3初选菌株对瓮基磷灰石的腐蚀性能力

Fig.3-3 Corrosive ability of selected LAB to hydroxyapatite

除Q7以外的四株菌株对羟磷灰石的腐蚀作用在1 h时达到最大,并在1 h以后几乎不再 有腐蚀的发生。而Q7在2h时对轻基磷灰石的腐蚀性最大,并在后续时间保持相对稳定。从 处理液中磷元素的含量来看,初选的五株乳酸菌中Q7对于轻基磷灰石的腐蚀作用最强,但 是与变异链球菌造成的腐蚀程度相比,仍然较小。YRL45、YRLP45和T1这三株菌对羟磷灰 石的腐蚀特性相似,腐蚀程度也具有相似性。QL-2菌株的腐蚀性趋势与YRL45、YRLP45 和T1相似,但是在腐蚀性上稍强。同时本实验以变异链球菌的腐蚀曲线作为对照,发现变 异链球菌对轻磷灰石的腐蚀持续存在,在初选菌株对其的腐蚀作用己经结束时,变异链球菌 的腐蚀效果仍在不断增加。所以初选的五株乳酸菌对轻基磷灰石的腐蚀程度均小于变异链球 菌,属于具有较弱腐蚀能力的菌株类型。虽然Q7菌株的腐蚀性显著高于其他四株,但仍在 可接受的范围内。

3.2.4粘附性评价

本研究考察了益生菌在轻基磷灰石上的粘附率,并以此来表征它们对牙齿的粘附性,实 验结果如图3-4所示。

YRL45 YRLP45 QL-2 Q7                                            T1

乳酸菌类型

图3-4初选菌株对径基磷灰石的粘附率

Fig.3-4 Adhesion rate of selected LAB to hydroxyapatite

图3-4表示初选的5株乳酸菌对轻基磷灰石的粘附率,由图可以看出,初选菌株对于轻 基磷灰石的粘附性差异较大,其中Q7和QL-2的粘附性最好,显著高于其他三株乳酸菌,它 们的粘附率可以达到20%以上,而其他三株的粘附率则在12-18%左右。从整体上来看,初选 出的这五株菌株对轻基磷灰石都具有一定的粘附性,综合其产糖性的评价可以看出,初选菌 株都具有在口腔中独立生存的能力,并具有在牙齿上定植或者整合到牙齿表面的生物膜中, 发挥抗精齿功效的潜力。

3.3初选菌株的抑菌机制结果

3.3.1共聚机制结果

关于所选菌株与变异链球菌的共聚作用,图3-5显示了共孵育2h后的共聚率。由图可 中可以看出,整体来看各乳酸菌株与变异链球菌的共聚集率普遍很低。其中,QL-2菌株的共 聚集率为7.85土 1.51%,是初选菌株中与5. mutans的共聚率最高的,但是从绝对值来说,这 样的共聚集状态并不理想。其他的四株乳酸菌与S. mutans的共聚集率在1.88-3.63%之间。这 或许表明初选菌株发挥抑菌作用并非因共聚机制。

10-1Fig.3-5 Co-aggregation rate of selected LAB and Streptococcus mutans

图3-5初选菌株与变异链球菌的共聚率

3.3.2对变异链球菌生物膜影响的机制

(1)对生物膜量的影响

变异链球菌在添加有FNS的BHI培养基中形成生物膜,其产量的测量采用结晶紫染色 法,结果如图3-6所示,整体上看FNS的添加显著降低了变异链球菌生物膜形成的量,对生 物膜的形成起到了抑制作用。其中YRLP45与QL-2两株乳酸菌的FNS对变异链球菌生物膜 量的抑制作用最强,在这它们的作用下形成的生物膜的量减少了 30%o YRL45与Q7的FNS 也对生物膜量有较强抑制作用,它们降低了约18%生物膜产量。本实验中T1菌株的FNS表 现出了最低的抑制作用,但它也显著的降低了大约为9%生物膜形成。

0 0 Control YRL45 YRLP45 QL-2 Q7 T1

乳酸菌类型

图3-6初选菌株对变异链球菌生物膜量的影响

Fig.3-6 Effect of selected LAB on amount of Strptococcus mutans biofilm

(2)对生物膜结构的影响

对FNS对5. mutans生物膜结构影响的结果如图3-7中所示。

图3-7 FNS对变异链球菌生物膜结构的影响

Fig.3-7 Effect of FNS on biofilm structure of Streptococcus mutans

对照组所示的是S. mutans在正常条件下形成的生物膜的结构,它是一种由S. mutans紧 密聚集形成的三维岛状结构,并且各种岛状结构彼此连接以形成网络结构。各个部分之间紧 密联系形成了一个相对完整的生物膜结构。然而,在处理组中可以发现,FNS的存在改变了 S. mutans生物膜的结构,生物膜中的岛状结构中缝隙变大。其中YRLP45的FNS是对生物 膜影响最大的,它的存在几乎导致了生物膜中岛状结构消失。其他四组FNS虽然没有YRLP45 作用的这么强烈,但也明显的影响了生物膜的结构,原始的连续和有序的空间结构不在出现。 此外,SEM下观察到的生物膜中存在的细菌细胞表面光滑且未受损,表明FNS的加入仅影 响生物膜形成的结构,而没有对S. mutans本身造成损害。

(3)对生物膜中菌体的存活情况影响

将成熟的生物膜用LIVE/DEAD试剂盒染色后用CLSM观察荧光分布,对比对照与处理 组之间的荧光分布情况,确定FNS对生物膜内细菌存活情况的影响。结果如图3-8所示,其 中绿色荧光代表活的S. mutans,红色则表示已经死亡的S. mutanso对照组中的大部分荧光是 绿色的,且被荧光标记的细菌数量也很多,这表明正常条件下形成的生物膜中含有大量活的 5. mutans细胞。而在FNS存在下,观察到大面积红色荧光斑块,并且生物膜中被荧光标记的 细胞总数减少。红色荧光占据了视野的大面积,并且生物膜中细菌的分布也发生了变化。尽 管在Q7和T1组的生物膜中细胞的分布没有显着变化,但是绿色荧光显着降低,表明膜中存 活细菌的数量减少。同时,YRL45、YRLP45和QL-2组的生物膜中的细胞分布被完全破坏。 不规则的细胞集群出现在视野中,被红色荧光标记,这意味着生物膜中的活细菌数量非常少。 关于膜中细菌分布的变化,可能验证了(3)中的结果,FNS的存在改变了生物膜的结构。 只从细菌存活的观点来看,FNS的添加减少了由S. mutans形成的生物膜中存活细菌的数量, 同时也减少了生物膜中细菌的总数。

图3-8 FNS对变异链球菌生物膜中菌体存活情况的影响

Fig.3-8 Effect of FNS on the survival of bacteria in Streptococcus mutans biofilm

(4)对生物膜内多糖的产生的影响结果

更换荧光染料,对生物膜中的EPS和蛋白进行染色,采用CLSM下观察FNS生物膜中 多糖产量的影响。结果如图3-9所示。

注:其中绿色荧光区域表示生物膜中EPS(图中左列),红色荧光区域表示生物膜中蛋白质(图中中间列), 并同时给岀了双通道图(图中右列)

图3-9 FNS对变异链球菌生物膜中EPS的影响

Fig.3-9 Effect of FNS on EPS in Streptococcus mutans biofilm

对比各组图片发现,对照组中存在大面积荧光,而补充有FNS的样品组的荧光面积减少。 其中用YRL45、YRLP45、Q7和QL-2的FNS处理的生物膜中的绿色荧光面积显着减少,表 明生物膜中EPS的含量很低,FNS的加入对生物膜中的EPS起到了很大的抑制作用。T1 FNS 处理的生物膜的绿色荧光面积比其他几种FNS处理的生物膜高,但仍明显低于对照组,对于 图片中绿色荧光的面积进行提取并计算,最终发现生物膜的降低量也超过50%。也就是说, EPS的产量减少了 50%以上。综合结果表明,五种FNS的加入都对生物膜中的EPS起到了 抑制作用。此外,FNS的加入也影响5. mutans生物膜中蛋白质的量。

3.4初选菌株与姜黄素共同作用的抑菌作用

3.4.1对变异链球菌生长情况的影响

将变异链球菌在添加不同样品的溶液中培养,观察不同样品对其生长情况的影响,并探 究姜黄素溶液与FNS复配后的作用效果。结果如图3-10所示。

乳酸菌类型

注:Control表示变异链球菌正常培养组;F表示添加FNS的实验组;J表示添加姜黄素的实验组;F+J 表示同时添加姜黄素和FNS的实验组;H表示添加各株乳酸菌活菌培养液的实验组

图3-10 FNS与姜黄素共同作用时变异链球菌生长情况

Fig.3-10 Growth of Streptococcus mutans when FNS interact with curcumin

与对照组相比,分别以姜黄素和五种FNS作为样品添加到变异链球菌的培养体系内时, 各组样品均显著地抑制了变异链球菌的生长。姜黄素与FNS复配条件下,除YRLP45的FNS 外,其他四种FNS对变异链球菌生长的抑制作用效果显著大于姜黄素单独作用,且均显著小 于发酵液单独作用。所以姜黄素与这四株乳酸菌的FNS发生了拮抗作用,并没有发挥预期的 对于变异链球菌更强的抑菌功效。而YRLP45的FNS与姜黄素复配后,二者共同作用的效果 优于任意一种单独作用的效果,表现出了更高的抑制作用,因此YRLP45的FNS与姜黄素之
间的复配可以发挥更加突出的抑菌功能。以对应的活菌培养液替代FNS与姜黄素溶液复配时, 终点OD值表示的是乳酸菌与变异链球菌共同的生长情况,此时两种菌株共同的生长情况仍 显著低于对照组,姜黄素单独作用组,可以发现活菌培养液与姜黄素复配也对5. mutans的生 长起到了更强的抑制效果。此外,用显微镜观查活菌组终点发酵液中的菌体,发现其中乳酸 菌数量较多,在此我们假设600 nm下的吸光度有一般是由S. mutans造成的,则此时终点发 酵液中5. mutans的生长情况仍显著低于其他组别。这可能是由于菌株的生长竞争,也有可能 是未中和的乳酸对S. mutans起到了一定的杀菌作用。活菌与姜黄素复配的方式也可以粗略的 认为对变异链球菌的抑制起到了协同作用。

3.4.2对变异链球菌产酸性的影响

同3.4.1,对5. mutans产酸性的影响也进行了探究,结果如图3-11所示。注:Control表示变异链球菌正常培养组;F表示添加FNS的实验组;J表示添加姜黄素的实验组;F+J 表示同时添加姜黄素和FNS的实验组;H表示添加各株乳酸菌活菌培养液的实验组

图3-11 FNS与姜黄素共同作用时变异链球菌发酵终点pH

Fig.3-11 The pH of the end of fermentation of Streptococcus mutans when FNS interact with
curcumin

姜黄素溶液单独作用对变异链球菌产酸没有显著性的影响,只是发酵终点pH在数值上 有微小的上升。各组FNS单独作用时则显著的提升了发酵终点的pH,这意味着它们显著地 抑制了变异链球菌产酸。在姜黄素与FNS的复配组,除YRLP45外未见到与FNS单独作用 具有显著性差异的产酸抑制发生。因此,YRLP45与姜黄素共同作用时对5. mutans的产酸发 挥了更加显著地抑制作用,这种结果在其他菌株并不存在。YRLP45的H组与F+J组之间没 有显著性差别,可以推测是YRLP45的发酵产物对S. mutans的产酸产生了抑制作用。其他四
中FNS中,H组变异链球菌发酵终点pH显著性低于H+J组,这可能是由于乳酸菌活菌在生 长的过程中也产生了乳酸,使得过夜培养物的pH低于没有乳酸菌活菌组别。但是整体的结 果仍然是显著性地抑制了 S. mutans产酸。

3.4.3对变异链球菌粘附性的影响

姜黄素与FNS共同作用对变异链球菌粘附性的影响结果如图3-12所示。

乳酸菌类型

注:Control表示变异链球菌正常培养组;F表示添加FNS的实验组;J表示添加姜黄素的实验组;F+J 表示同时添加姜黄素和FNS的实验组;H表示添加各株乳酸菌活菌培养液的实验组

图3-12 FNS与姜黄素共同作用时变异链球菌粘附性

Fig.3-12 The adhesion rate of Streptococcus mutans when FNS interact with curcumin

姜黄素单独作用时,显著地降低了变异链球菌的粘附率,表明姜黄素可以显著地抑制变 异链球菌的粘附性。但是当用FNS单独作用时却出现了令人意外的结果,除了 QL-2外,其 他四株乳酸菌FNS的加入不仅没有降低粘附率,反而使粘附率有了显著的上升。这样的结果 可能是FNS中含有利于S. mutans粘附的物质,这与我们的预期结果相悖,具体原因有待进 一步研究。但QL-2的FNS的加入与其它菌株不一致,它显著地降低了粘附率,并且在姜黄 素与FNS复配作用时,也有显著的下降。所以QL-2的FNS与姜黄素共同作用可以更好的抑 制S. mutans对牙本质的粘附性。同上,H组S. mutans的粘附性出现了非常大幅度的下降, 粘附率下降到3-7%之间,五株乳酸菌的活菌培养液都与姜黄素表现岀了巨大的协同作用,对 S. mutans的粘附性起到抑制作用。这说明乳酸菌菌体可以起到降低5. mutans粘附性的作用, 可能是乳酸菌与S. mutans竞争宿主的粘附位点,或者是竞争培养液中的糖,降低S. mutans EPS的产生,使得其粘附性下降。

3.4.4对变异链球菌生物膜的影响

对姜黄素与FNS共同作用对变异链球菌生物膜量的影响的结果如图3-13所示。

乳酸菌类型

注:Control表示变异链球菌正常培养组;F表示添加FNS的实验组;J表示添加姜黄素的实验组;F+J 表示同时添加姜黄素和FNS的实验组;H表示添加各株乳酸菌活菌培养液的实验组

图3-13 FNS与姜黄素共同作用时变异链球菌生物膜量

Fig.3-13 The amount of Streptococcus mutans biofilm when FNS interact with curcumin

与对照组相比,姜黄素单独作用时生物膜形成的量显著的降低,而FNS单独作用时也可 以显著的降低生物膜的形成量。但是将姜黄素与FNS复配作用时,产生的效果各组之间存在 差异。T1和YRL45的FNS单独作用显著降低了生物膜的形成量,将这两种FNS分别与姜黄 素复配作用时其效果与姜黄素单独作用没有显著性差异。因此二者与姜黄素之间不存在协同 作用。QL-2的FNS单独作用显著降低了变异链球菌生物膜的形成量,与姜黄素复配时其效 果显著差于FNS单独作用的效果,优于姜黄素单独作用的效果,所以与姜黄素之间也不存在 协同作用。Q7的FNS单独作用及与姜黄素复配共同作用时,5. mutans生物膜量都有显著性 减少,并且J、F和J+F组之间的生物膜量之间没有显著性差异,所以也不存在协同作用。H 组生物膜的量显著减少,低于单独作用时。最终的生物膜的量被减少到只有空白组的20-25%, 活菌培养液与姜黄素之间存在协同作用,可以抑制变异链球菌生物膜的形成。

3.4.5对变异链球菌生物膜中EPS的影响结果

姜黄素与FNS共同作用对变异链球菌生物膜中EPS含量影响的探究的结果如图3-14所 Zjl O乳酸菌类型

注:Control表示变异链球菌正常培养组;F表示添加FNS的实验组;J表示添加姜黄素的实验组;F+J 表示同时添加姜黄素和FNS的实验组;H表示添加各株乳酸菌活菌培养液的实验组

图3-14 FNSs与姜黄素共同作用时变异链球菌生物膜内EPS的量

Fig.3-14 The amount of EPS in Streptococcus mutans biofilm when FNS interact with curcumin

整体来看,各株乳酸菌对EPS量的影响趋势是一致的。对照组中形成的生物膜内多糖的 含量高达0.42 mg/mL左右,而姜黄素和FNS单独作用时生物膜中EPS的量都有显著下降。 二者复配后EPS的量显著低于两者单独作用时,所以姜黄素与发酵上清液之间存在协同作用 来减少变异链球菌生物膜中的多糖含量。H组生物膜内多糖含量出现了又一次显著性下降, 可以发现活菌比发酵上清液对于变异链球菌生物膜内多糖含量的影响更大,体现了与姜黄素 更强的协同作用。

 

4讨论

近几年应用肠道益生菌治疗各种疾病的成功引发了学者对应用益生菌治疗口腔疾病的设 想。目前己有多项研究表明了应用益生菌治疗犒齿疾病的可行性,也确定了多株抗舗齿益生 菌。但是由于抗舗齿益生菌的种类仍然稀缺,所以抗舗齿益生菌的筛选一直在不断地进行中。 而同时想要确定一株菌株为益生菌,需要经历筛选,危害性评价,流行性评价,功能性评价 等一系列的系统性评价过程。在明确抑菌效果存在后,其作用机制也尤为重要。同时还要考 虑多种有效性物质的共同作用会不会产生更加令人期待的效果。

4.1抗龌齿益生菌的筛选

乳酸菌是抗舗齿益生菌的主要类型,这些作为抗舗齿益生菌的乳酸菌可以对舗齿致病菌 ——5. mutans产生强烈的抑制作用,从而以一种安全有效的方式来防治精齿[108]o2011年Nase 等人证明,摄入含罗伊氏乳杆菌^Lactobacillus reuteri}的发酵菌株可以减少儿童犒齿的发生; Ishihara等人口呵发现了几株对s. mutans具有抑制作用的益生菌,包括唾液乳杆菌,发酵乳杆 菌和罗伊氏乳杆菌,这说明对于S. mutans具有抑制作用的乳酸菌可能对犒齿具有良好的防治 效果,可以作为抗犒齿益生菌的候选者。本实验采用双层平板法对实验室保藏的13株乳酸菌 对S.mutans的抑制作用进行了探究,研究发现13株乳酸菌中有9株的发酵上清液对S. mutans 具有良好的抑制作用(抑菌圈直径>5 mm),可以作为潜在的抗舗齿益生菌的候选者。

乳酸菌产生抑菌作用的方式有很多种,比如其发酵过程中产生的乳酸,H2O2以及各种细 菌素等Ml。Rungsri等人山1】发现副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等抑制S. mutans的生长是通 过产生细菌素实现的。这符合我们对抗犒齿益生菌发挥抑菌作用方式的期待,因此,本研究 对初筛出的9株乳酸菌发挥抑菌作用的物质的类型进行了初步研究,结果发现,当发酵上清 液中的酸被中和后,它们在平板内形成的抑菌圈的直径显著减小,只有5株乳酸菌还保持这 良好的抑菌效果,这说明其他4株乳酸菌通过产生乳酸抑制S.mutw的生长,而这种作用 方式对本身就存在很大的致舗风险,因此,该4株菌被排除;随后除去余下5株乳酸菌发酵 上清中和液中的H2O2,平板内的抑菌圈直径又有显著下降,但下降的绝对数值很小,且抑菌 圈直径仍大于5 mm,说明H2O2不是发挥抑菌作用主要物质;最后用联合蛋白酶处理5株乳 酸菌的发酵上清液,平板内的抑菌圈几乎消失,这说明当处理液中的蛋白类物质消失时,其 对S. mutans的抑菌效果消失,也即对S. mutans发挥抑菌作用的蛋白类物质。这与前人的研 究一致,Wasfi等人"I发现乳酸菌能够产生有机酸,过氧化氢,细菌素,粘附抑制剂等物质, 并通过这些物质发挥抗犒齿作用,而Wannun等人口⑷证明发酵乳杆菌SD11可以产生细菌素, 对致犒菌有良好的抑制作用,并且这些细菌素对部分蛋白酶不敏感,但是可以在大多数蛋白 酶的作用下水解,抗犒齿效果消失。此外,我们对初选5株乳酸菌的菌体细胞单独进行抑菌 实验时,平板内没有出现可以用于统计的抑菌圈,这表明5株乳酸菌菌体本身对于S. mutans 不具有抑菌作用。因此,初选出的5株乳酸菌YRL45、YRLP45、QL-2、Q7和T1通过分泌 蛋白类细菌素对S. mutans产生抑菌作用,可以作为抗嶠齿益生菌的候选菌株。

4.2抗龌齿菌株的潜在危害性评价

虽然大多数的抗舗齿益生菌都是乳酸菌属,但乳酸菌本身也是致舗菌之一。Klinke等人 ME认为牙齿硬组织的脱矿速率取决于微生物酸的产生,持续时间,作用位点,糖发酵情况等 多种情况,所以本研究对初选5株乳酸菌的潜在危害性进行评价。

有机酸的是在乳酸菌发酵过程中产生可以加速犒齿发生的重要物质。Haukiojd"等人的 研究结果一致,双歧杆菌以及乳酸菌都可以产生足以令牙齿脱矿化的酸,并且引起的pH下 降与变异链球菌相差不大。本研究通过对乳酸菌发酵终点pH的测量评估它们的产酸性,结 果发现,初选的5株乳酸菌的发酵终点pH都在3.8左右(T1在4.1左右),它们都低于牙齿 脱矿的临界pH (5.5),直接引起牙本质和牙釉质的脱矿〔I⑸。理论上这些菌株菌不能作为抗 舗齿益生菌在临床中应用。但是目前来看,被广泛应用的益生菌以及最常用的益生菌都是具 有相似的产酸性的,因此在筛选益生菌的过程中只能对这种产酸性给与接受的态度。此外, 益生菌在真正的临床应用过程中,通常会以乳制品作为载体的,乳制品良好的缓冲能力,及 其中包含的乳酸钙等物质可以有效的缓解有机酸带来的牙齿的损伤。因此,本研究接受了初 选菌株的产酸性能。

乳酸菌对牙齿腐蚀性通常伴随着其产酸同时发生,因为腐蚀性本质就是乳酸造成的牙本 质脱矿。本研究以发酵上清液对轻基磷灰石的腐蚀性模拟乳酸菌对牙齿的腐蚀性,结果表明, 初选5株乳酸菌对牙齿具有一定的腐蚀作用,但其腐蚀作用显著的小于S. mutanso同时,乳 酸菌对牙齿的腐蚀性在加入lh后达到最大值,随后即停止,而5. mutans造成的腐蚀则随时 间不断进行。因此,初选菌株对牙齿的腐蚀性显著性小于5. mutans,基于本研究接受了其产 酸性的事实,这样较低的腐蚀性也是被接受的。

益生菌发挥作用的重要前提之一是其至少可以在口腔中停留一段时间⑴8】。Li等人【I"]认 为胞外多糖(EPS)的产生使得菌株具有一定的粘性,容易独立或与其他微生物一起在特定 条件下整合到病灶位置,所以具有一定的产糖性也是抗犒齿益生菌筛选的要求之一。本研究 对初选菌株的产糖性进行研究,结果发现,5株乳酸菌都具有一定的EPS合成能力,合成量 在75-100 mg/L,但不同菌株的产糖能力之间存在显著性差异(PvO.05)。这样的研究结果与 前期的研究一致,乳酸菌可以产生一定量的EPS,它对益生菌在宿主中的定植发挥重要作用 口⑼,符合抗犒齿益生菌的应用标准。此外,细胞外游离的EPS还是一种对于机体有益的安 全成分,具有免疫刺激,抗诱变性,抗肿瘤活性,降低胆固醇的性质,降血压等活性。

乳酸菌对牙齿的粘附性通常也与其产糖性紧密联系,菌体EPS的产生使菌体具有粘附性 的主要原因之一。杨颖等人Qi】研究认为,益生菌在口腔中发挥益生作用,需要具有低水平的 粘附作用,使其可以黏附在牙齿表面,整合到牙菌斑中发挥作用。这样的特性除了保证了益 生菌发挥作用的时间,还可以防止菌株被唾液冲刷、吞咽,从而保证口腔益生菌的数量。本 研究对5株乳酸菌对羟基磷灰石的粘附性进行研究,结果发现初选的5株具有都可以对轻基 磷灰石具有一定的粘附能力,虽然不同菌株对应的粘附率之间存在显著性差异,但是整体来 看粘附率在10-25%之间,属于低水平的粘附。这与Haukioja等人印】的研究一致,口腔益生 菌可以通过产EPS,以及与牙齿上的活性位点的识别对牙齿产生粘附,从而整合到犒齿的病 灶位置,发挥抗嶠齿作用〔I?。]。初选菌株具备对牙齿低水平粘附能力,符合抗精齿益生菌的应 用标准。但是同时还有研究表明这种单纯的体外实验的分析是不足够的,因为唾液对益生菌 的粘附性有很大的影响,并且己经有实验证明LGG涂在有不同人的唾液样品上的时,粘附 率有显著的差别[93】。所以要完全确定初选菌株的粘附性时应添加有动物实验或临床流行病学 实验。

经过对初选的5株乳酸菌的潜在危害性评价,可以发现它们的各项指标均符合抗舗齿益 生菌的应用标准。可以作为抗犒齿益生菌的候选者。

4.3抗頻齿菌株的机制

目前,关于益生菌发挥作用的详细机制还不明确。本研究从以下两个方便对筛选出的5 株乳酸菌株的抑菌机制进行了研究。

(1)       益生菌与致病菌之间的共聚作用时益生菌发挥作用的重要机制之一,Re[123]等人在 综述中指出,口腔益生菌能抑制病原菌的生长或与病原菌共聚集形成大的不能粘附于牙齿上 的菌团,通过唾液流动或吞咽等动作从口腔中被消除。本研究对初选的5株乳酸菌分别与S. mutans的共聚率进行研究,结果发现它们与S. mutans之间的共聚率非常低,尽管还是能有 共聚现象还是存在的,但发生的几率非常小,几乎可以忽略。这样的结果与前人的研究相悖, 例如,Carciacayuela等人吋]研究发现,鼠李糖乳杆菌,嗜酸乳杆菌与变异链球菌之间有很强 的共聚集作用,共聚集率可以达到35%左右,是益生菌发挥作用的重要机制;Ciandrini E等 人a”对几株乳酸菌的自动聚集率和与变异链球菌的共聚集率进行研究,结果也发现用于实验 的所有双歧杆菌都对变异链球菌变现出了强烈的共聚集作用,在发挥益生功能时起到了重要 作用。这可能与菌株类型有关,以上两项研究中所用的乳酸菌类型包括鼠李糖乳杆菌,嗜酸 乳杆菌,双歧杆菌等,但是本次研究中初选的5株菌株都属于植物乳杆菌,这很可能是造成 结果差异的主要原因。如上所述,本研究中的5株乳酸菌发挥抑菌作用的机制与共聚效应无 关。

(2)      抗舗齿益生菌对5. mutans生物膜形成的影响是其发挥抗舗齿作用的另一个重要机 制。前期的研究证明嗜酸乳杆菌DSM 20079可以产生生物表面活性剂,通过抑制变异链球菌 与糖发酵有关的基因来抑制变异链球菌生物膜的形成血叫Youngjae等人发现乳酸乳杆菌HY 449对犒齿生物膜的形成具有抑制作用,此外,副干酪乳杆菌DSMZ 16671,植物乳杆菌299V, 鼠李糖乳杆菌GG,罗伊氏乳杆菌PTA5289与SD 2112等都具有抑制变异链球菌生物膜形成 的能力血叭 本实验对初选5株乳酸菌的FNS对S. mutans生物膜的形成进行研究。结果发现 FNS对5. mutans生物膜的形成具有很大的影响,首先,它们可以降低10-30%的生物膜产生, 这与郭夏蕾等人〔IM的研究结果一致,发酵乳杆菌,干酪乳杆菌,副干酪乳杆菌都能产生生物 活性物质,并且可以导致生物膜的显着减少;其次,它们对生物膜的结构造成明显的破坏, 在FNS存在条件下形成的生物膜中的活细菌数量以及细菌总数也明显下降,膜内细菌的EPS 产量也明显下降,这可能是因为FNS直接抑制了 5. mutans的EPS产生,从而影响了 5. mutans 对宿主的粘附性,进而影响了生物膜中的细菌数量,并且由于各种组成成分的改变使得生物 膜的三维结构难以维持。Lee等人MM的研究表明S. mutans在犒齿中致病作用通过EPS产生 完成,它可以通过基因表达合成水不溶性多糖,在牙齿表面为致病菌提供粘附位点,所 以本研究的结果可能也是因为FNS抑制了 G"基因的表达,使得EPS合成受阻,S. mutans 生物膜的形成也被抑制。Jeong等人[⑵]也在研究中表示,乳酸菌可能会通过影响膜内细菌的 粘附性来发挥抑菌功能,并且不对菌体细胞造成直接的伤害。这与我们未在SEM下观察到 S. mutans菌体本身有损伤的结果一致。所以初选的5株乳酸菌发挥抑菌作用的机制主要是影 响S. mutans生物膜的形成。

4.4与天然产物复配的作用效果

目前,许多天然产物被认为是替代或辅助的防犒疗法,特别是植物中的天然成分,如绿 茶多酚,儿茶素等。天然姜黄素就是其中一种,它已被证实是一种潜在的治疗性抗菌药物。 它可抑制多种细菌的长:如金黄色葡萄球菌,副伤寒沙门氏菌,石膏毛癣菌和结核分枝杆菌 等。最近有研究发现,姜黄素对口腔致犒微生物也具有良好的抑制作用[旳。本研究探究了 5 株乳酸菌的FNS与姜黄素复配时对S. mutans的作用效果,结果表明,将二者中的任意一种 单独作用时,结果仍与前人的研究结果一致[103429], FNS和姜黄素都可以抑制S. mutans的 生长,产酸,抑制变异链球菌生物膜的形成和生物膜内EPS的量。虽然结果中FNS添加增 加了变异链球菌的粘附性的结果出乎意外,但是整体来看仍然是符合预期的。但是,FNS与 姜黄素复配作用时,上述的抑制效果的出现了不同的效果,虽在不同的参数中复配样品的抑 菌效果大都明显地优于两种物质单独作用时,但还未达到协同作用程度。而当以活菌培养液 替代FNS与姜黄素复配进行实验时,情况则大有改观,与F+J组相比,除产酸性外其他的各 组数值均大幅度下降,极其显著地优于二者单独作用的效果,因此H组中,乳酸菌活菌培养 液与姜黄素出现了协同作用,表现出了对5. mutans更强的抑制效果。目前对于姜黄素单独抑 制S. mutans的效果已有报道,如姜黄素对S. mutans的毒力具有抑制作用,如姜黄素在短期 内会破坏EPS的结构,降低EPS的生物量,总细菌的数量和活细菌的百分比血性 姜黄素处 理可以降低EPS合成,碳水化合物代谢,粘附和双组分转导系统相关的基因表达等a%但 是关于乳酸菌与姜黄素复配,对S. mutans的作用效果的研究还未有报道,本研究中展现出的 活菌培养液与姜黄素之间的协同作用可能是由于姜黄素对S. mutans发挥抑菌作用的直接物 质是姜黄素的代谢产物,乳酸菌活菌催化了姜黄素向这种代谢产物的转化,使得抑菌效果大 幅度上升,活菌培养液与姜黄素之间出现协同作用的效果,但这种猜想有待考证。

5结论

本研究采用抑菌实验对实验室保藏的13株乳酸菌进行抑菌功能筛选,以变异链球菌为抑 菌实验的指示菌进行,并在得到几株初选的抗犒齿益生菌候选者后对它们在临床应用中的潜 在风险进行评价,从而进一步得到了几株具有抗犒齿活性的,安全的益生菌,而后对这几株 乳酸菌发挥抑菌作用的机制进行了探讨。最后将乳酸菌与天然活性物质一一姜黄素复配,探 究了二者共同作用条件下的抗舗齿效果。结果发现5株乳酸菌菌株具有良好的抗犒齿活性, 并得到以下结论。

  • 备选的13株乳酸菌株中有5株对变异链球菌具有抑制作用的菌株,分别为:YRL45、 YRLP45、QL-2、Q7和T1。并初步确定这五株乳酸菌是通过产生蛋白类抑菌物质来发挥功 效;
  • 五株初选菌株的发酵终点pH在80以上,产糖量在75-100 mg/mL,对牙齿的粘 附率在10-25%之间,整体来看,初选乳酸菌的产酸性,产糖性,对牙本质的腐蚀性和粘附性 都在可被接受的范围内,具有较低的潜在风险;
  • 初选菌株发挥作用的机制主要是干扰变异链球菌生物膜的形成,FNS可以降低9-30% 的生物膜产量,同时生物膜的结构遭到破坏,膜内细菌数以及细菌胞外多糖产量都有显著下 降;
  • 初选菌株活菌培养液与姜黄素之间存在协同作用,对变异链球菌的产酸性,生物膜 形成,膜内细菌胞外多糖的产量等都有协同的抑制作用,可以通过复配来共同防治舗齿的发 生。

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