咬合创伤对大鼠颍下颌关节软骨中PPAR・Y、IL-lpx IL-6> MMP-13表达的影响论文

2020年8月5日16:11:13咬合创伤对大鼠颍下颌关节软骨中PPAR・Y、IL-lpx IL-6> MMP-13表达的影响论文已关闭评论

咬合创伤对大鼠颍下颌关节软骨中PPAR・Y、IL-lpx IL-6> MMP-13表达的影响论文
中文摘要
研究背景:
临床中常见因为牙齿异常接触,咀嚼肌肉紊乱和医源性因素导致的咬合创伤。 咬合关系紊乱可能是颛下颌关节紊乱病(temporomandibuardisorder, TMD)的病 因之一©近年来研究发现过氧化物酶增殖物激活受体Y(peroxisome proliferators- activatedreceptor-y, PPAR-y)在颛下颌关节疾病发展、炎症及异常改建中等紧密 相关。
实验目的=
本研究通过建立咬合创伤动物模型,检测并分析不同时间点额下颌关节中 PPAR-y,基质金属蛋白酶・13 (MMP-13, matrix metalloproteinase-13),白介素 B (IL-1 p, interleukin-1 p),白介素・6 (IL-6, interleukin-6 )表达变化趋势,探索 咬合创伤对颛下颌关节炎可能存在的病因机制,以及PPAR-y在大鼠課突炎症以 及异常改建过程中的相关作用,并且研究炎症在颛下颌关节中的分布情况,为进 一步探究颛下颌关节紊乱的病因机制提供新的思路,为颛下颌关节的治疗提供新 的方向。
实验方法:
将48只8周龄雄性Wistar大鼠(体重180・220g)随机分为实验组一 (Experiment group I , EG I )、实验组二(Experiment group II, EG II)和对 照组(Control group, CG)三大组。在EG 1和EGII大鼠右下颌第一磨牙上,粘
接厚度为1.0mm的3/4钻钻金属冠。EG I组为咬合创伤实验组,分为咬合创伤 1周(week, w)、4w及8w组,每组各5只大鼠;EGII组分别在1、4、8w去 除咬合创伤并继续喂养2w后处死,根据时间点分为l+2w、4+2w及8+2w组, 每组各5只大鼠;对照组大鼠在lw、3w、4w、6w、8w、lOw相应时间点处死, 每组各3只大鼠。所有大鼠按实验计划在相应的时间点处死大鼠,取颍下颌关节 样本,进行苏木精一伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE染色)观察颗下 颌关节髒突软骨形态变化;免疫组织化学染色(immunohistochemical staining, IHC染色)检测PPAR-y, IL-ip> IL-6和MMP-13的变化趋势。
实验结果:
第一部分咬M伤大鼠动物的建立
本实验及本课题组前期实验已经验证3/4钻锯金属冠固位良好、可操作性强, 金属冠粘接力良好,颍下颌关节存在明显的病理性损伤,咬合创伤诱导颍下颌关 节炎模型建立成功,可以用于进一步颍下颌关节炎症的相关研究。
第二部分咬合创伤大局R下颌关节的组织形态学观褰
颍下颌关节HE染色的组织形态学结果表明:
1. 对照组大鼠課突组织形态无显著改变。
2. EG I组大鼠髒突软骨软骨细胞数目减少,各层细胞排列紊乱,并炎症表 现。可见4w、8w组增殖层以及肥大层厚度变薄,肥大层细胞明显肿大, 聚集呈岛状,有的组织上出现无细胞区。
3. EGII组炎症情况较EG I组有所减轻,各层细胞排列趋于正常,肥大层以 及增殖层与对照组相比较薄。
第三部分大BUFF颌关节中PPAR y,IL-lp,IL-6 and MMP-13的表达变化
大鼠颛下颌关节免疫组织化学染色结果显示:
1. CG组中IL・1|3、IL・6、MMP13呈弱阳性表达在髒突肥大细胞层,也可 少量表达在肥大细胞层与增殖层细胞之间;PPAR-y呈强阳性表达(p< 0.05)
2. EG I组中4w组IL-6s MMP13和IL-ip在課突肥大细胞层的阳性表达 增强,表达也可少量表达在肥大细胞层与增殖层细胞之间,较lw组表 达增多(严0・01);而8w组IL6 MMP13和IL-1卩表达有所降低; PPAR-Y主要表达在肥大细胞层,也可少量表达在纤维层、增殖层、以 及软骨下层,EG I各组表达量均小于CG组(p<0.05) , 4w组较1周 组PPAR-Y阳性表达降低(pV0・05)
3. EGII 组:l+2w、4+2w 及 8+2w 组中可见 IL-1 队 MMP13 和 IL-6 均呈 阳性表达(pV0・05)。与对应时间EG I相比,EGII组阳性表达量呈 现下降趋势(pV0.05) o另外发现PPAR-y表达量在去除金属冠后较 EG I均有所回升(卩<0.05)。 4. EGI组、EGII组、CG组在颛下颌关节与听泡交界区以及颍下颌关节 窝中并未见明显炎症表达,并且无统计学意义(p>0.01)。
结论=
1. 粘接3/4钻珞金属冠可创造咬合高点,诱导TMJ炎症。其方法稳定可 靠,适用于咬合与颛下颌关节下一步病因机制的研究
2. 在咬合创伤lw至4w时,颍下颌关节炎症反应明显,逐渐增加至4w 后,咬合创伤后期,其炎症反应减缓。而且去除金属冠后,其炎症反应 降低,提示临床上咬合高点导致的创伤中,应尽早去除咬合创伤,临床 上有利于TMJ组织愈合。
3. 咬合创伤环境下,PPAR-y可能参与了颍下颌关节的调控,PPAR-y的下 调可能会导致MMP-13、IL・1|3、IL・6表达增加,进而诱导了颛下颌关 节的一系列炎症反应。
4. 本实验未见颛下颌关节与听泡交界区以及颛下颌关节窝中有明显的炎症 表达,可能与咬合创伤的模型的时间长短有关,仍然需要进一步实验研 究证明。
关键词:咬合创伤,PPAR-y, IL-lp: IL-6 : MMP-13,颍下颌关节,炎症反应
The effect of occlusal trauma on the expression of PPAR-y JL-1 p,IL-6
and MMP-13 in the temporomandibular joint of rats.
Postgraduate: Zuping Wu
Speciality: Oral medicine
Major: Orthodontics
Supervisor; Associate Prof. Jie Guo
Co-supervisor Prof. Minqi Li
ABSTRACT

Background:
Occlusion trauma is caused by abnormal contact of teeth, dysfunction of chewing, and occlusal interference due to iatrogenic causes・ Abnormal occlusion may be one of the causes of temporomandibular disorder (TMD). In recent years, studies have found that PPAR-y (peroxisome proliferators-activated receptor-y) is closely related to the development of inflammation during the abnormal reconstruction of joints ・
Purpose:
In our study, an animal model of occlusal trauma was established・ The distribution of PPAR-y, MMP-13(matrix metalloproteinase-13) , IL-ip(interleukin- ip)and IL- 6(interleukin-6) in TMJ was observed and analysed at different time points. To explore the possible etiology of temporomandibular arthritis caused by occlusal trauma , the related role of PPAR-y in rat condylar inflammation and abnormal reconstruction, and to provide a new way to further explore the etiology of temporomandibular joint disorders and the new target of the treatment of the mandibular joint.
Materials and Methods:
48 8-week-old male Wistar rats (weight: 180-220 g) were divided into experimental group I (EG I ), experimental group II (EG II) and control group (CG ) randomly. On the right lower jaw first molar of EG I and EG II group was bonded with a 3/4 cobalt-chromium metal crown with a thickness of 1.0 mm. The EG I group was the experimental group with the occlusion trauma, which was randomly divided into occlusal trauma at 1 week, 4 weeks, and 8 weeks, with 5 rats in each group. The 3/4 cobalt-chromium metal crown of the EG II group was removed at 1, 4, and 8 weeks, and they were sacrificed after 2 weeks. So the EG II group was divided into 1 + 2 weeks, 4 + 2 weeks and 8 + 2 weeks group, 5 rats in each group; the CG group was divided into 1 week, 3 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks, 10 weeks group with 3 rats in each group. These time points were sacrificed. The temporomandibular joint slices were prepared for hematoxylin-eosin staining (HE staining) at the corresponding time points in order to observe morphological changes of temporomandibular condylar cartilage. Immunohistochemical staining (IHC staining) was used to compare the expression of PPAR-y? IL-IL, IL-6 and MMP-13 in condylar cartilage・
Results:
Part I The establishment of traumatic occlusal rat model
This study and the previous study have verified that the 3/4 cobalt-chromium metal crown has good retention and maneuverability, good metal crown adhesion, obvious pathological damage to the temporomandibular joint. And occlusal trauma could induce temporomandibuiar arthritis. The model was successfully established and could be used for further research on temporomandibular joint inflammation・
Part II Histology observation of traumatic occlusal TMJ
The hematoxylin-eosin staining showed that:
The morphology of TMJ in the control group showed no significant changes.
In the EG 1 group, the number of condylar cartilage chondrocytes decreased, and the cells in each layer were disordered with inflammatory behavior. It can be seen that the thickness of the proliferative layer and the hypertrophic layer of the 4w and 8w groups are thinner, the cells of the hypertrophic layer are obviously swollen with “island-like,' shapes, and some areas had a cell-free zone.
The inflammatory condition of EG II group was less than that of EG I group. The arrangement of cells in each layer became normal, and the hypertrophic layer and proliferative layer were thinner than the control group.
Part IH Expression changes of PPAR-y, IL-lp, IL-6 and MMP-13 in rat temporomandibular joint
The immunohistochemical staining showed that:
1・ In the CG group, IL-lp, IL-6 and MMP13 were weakly positively expressed; PPAR-y was strongly expressed ( p<0.05).
2. In the EG I group, when compared with 1-week group, the positive expression of IL-6, MMP13 and IL-ip was concentrated in the mast cell layer and enhanced in the 4-week group(p<0.01). The Chondrocytes between the mast cell layer and the proliferating layer cells also showed positive expression in a small amount. Besides, the expression of IL-6, MMP13 and IL-ip decreased in the 8w group(p<0.01); PPAR-y was mainly expressed in the mast cell laye. The expression of PPAR-y in the EG I group was lower than that of CG group (p<0.05), and the positive expression of PPAR-y in 4 weeks group was the lowest among all the EG I groups (p<0.05)・
3. EG II group : As for IL-ip, MMP13 and IL-6 ,each group of EG II showed positive expression, statistically different from the control group (p<0.05). Compared with the EG I group ,the expression of IL-ip, MMP13 and IL-6 lessened in EG II group( p<0.05). However, EG group showed positive expression of PPAR-y, increasing after the mental crown was removed(p<0.05). 4. There is no obvious inflammatory expression in the junction between temporomandibular joint and the olfactory fossa and the temporomandibular joint fossa in this experiment group, which may be related to the time of the model of occlusion trauma. Further experimental research is still needed・ Conclusion: Bonding a 3/4 cobalt-chromium metal crown is a stable and reliable method of occlusal trauma, which is suitable for the investigation of occlusal trauma and temporomandibular joint. In the early stage of occlusal trauma, the TMJ inflammation in rats is obvious. In the late stage of occlusion trauma, the inflammatory reaction weakens, and the inflammatory reaction of the occlusion trauma after removing the crown weakens, which is beneficial to the tissue healing of the temporomandibular joint In the occlusal trauma environment, PPAR-y may be involved in the regulation of the temporomandibular joint inflamation. The down-regulation of PPAR-y may be related to the up-regulation of IL-Ip, IL-6 and MMP-13 factors, which promotes the inflammatory response of the temporomandibular joint in occlusal trauma model. Key words: Occlusal trauma; temporomandibular joint; PPAR-y; IL-ip; IL-6; MMP- 13; inflammatory response  符号说明 缩略语 英文名称 中文名称 OT occlusal trauma 咬合创伤 TMJ temporomandibular joint 颍下颌关节 TMD temporomandibular disorders 颍下颌关节紊乱病 OA osteoarthritis 骨关节炎 IL-6 interleukin-6 白介素・6 IL-1P lnterleukin-1 beta 白介素 过氧化物酶体增殖物激活型 PPAR-y peroxisome proliferator activated receptor-gama 受体・丫 MMP13 matrix metalloproteinase-13 基质金属蛋白酶・13 PFA Paraformaldehyde 多聚甲醛 AGEs advanced glycation end products 晚期糖基化终末产物 TNF-a tumor necrosis factor-a 肿瘤坏死因子 TCA chloral hydrate 水合氯醛 HE hematoxylin-eosin 苏木素■伊红 TIMPs tissue inhibitor metalloproteinase¬ 金属蛋白酶组织抑制因子 AD AMTS recombinant A disintegrin And metalloproteinase 血小板反应蛋白解整合素金 with thrombospondin 属肽酶 ECM extracellular matrix 细胞外基质 COX-2 cyclooxygenase-2 环氧合酶-2 PGE2 prostaglandin E2 前列腺素E DAB 3,-diaminobenzidine 二氨基联苯胺 BSA bovine albumin 牛血清白蛋白 EDTA ethylene diaminetetra-acetic acid 乙二胺四乙酸 IHC immunohistochemical staining 免疫组织化学染色 IOD index of optical density 光密度值 w week 周 前言 咬合创伤是因为咬合干扰或者咬合力量不协调引起咀嚼肌的损伤。临床上常 见牙齿咬合高点、咀嚼肌肉紊乱及医源性创伤都可能造成咬合干扰继而诱发咬合 创伤⑴。咬合创伤的发生发展可能伴随着牙齿松动,移位,折裂以及牙龈退缩, 甚至出现牙根吸收以及咀嚼疼痛,长期的咬合创伤不仅会对牙体牙髓组织、牙周 组织造成损害,同时也会对咀嚼肌肉、颍下颌关节以及神经感觉系统等整个口颌 生态系统造成多种生物学损害. 颛下颌关节紊乱病(TMD)是被认为是常见的口颌系统疾病之一,伴随着关 节弹响、颌面部疼痛,病变持续可引发张口受限、进一步扩展可出现头颈部以及 耳部疼痛的症状,而颍下颌关节骨关节炎症(TMJ-OA)是TMD中病情最为严 重的一种,主要病理改变有软骨进行性的退行性变、软骨下骨反应性改建、骨赘 形成、滑膜炎症等。 颍下颌关节・骨关节炎(TMJ-OA)是一种多因素关节疾病,其特征在于关 节退行性变化,由于蛋白多糖和胶原网络的丧失导致关节软骨的退化和磨损,以 及软骨下骨的增厚和重塑的发生,从而导致下颌运动受限,咬合功能受损以及疼 痛发生⑵。各种流行病学研究中往往采用不同诊断标准或评估方法,颍下颌关节 炎的患病率可在1 %至84%之间浮动⑶。过度的机械应力刺激被认为是导致关节 软骨退化级联反应的初始刺激。对于TMJ-OA,超负荷的机械力刺激机制可能与 其他滑膜关节炎相同。在机械力等多种因素作用下,关节软骨细胞、细胞外基质 和软骨下骨三者之间的平衡状态被打破,关节软骨的分解代谢能力远远旺盛于其 合成代谢,平衡的破坏将导致软骨完整性被破坏。 软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞成分,包埋在丰富的细胞外基质(ECM) 中。对于正常的颛下颌关节组织,软骨细胞的合成代谢和分解代谢往往是相互平 衡的一对组织代谢活动两者之间的不平衡导致会软骨的损伤。11型胶原是组 成ECM的主要胶原类型,构成软骨骨架。而也有研究表明MMP-13是降解II型 胶原主要的基质金属蛋白酶,在0A的发生发展病理机制中扮演着重要角色⑸◎ 软骨细胞中软骨降解酶(如基质金属蛋白酶MMPs)的释放是其分解代谢的主力 军,其减少了 II型胶原和聚集蛋白聚糖的产生。MMPs通常在正常生理条件下呈 现最低限度表达,同时在一些特殊病理条件下表现出高度的表达(如关节炎)。 在关节软骨中,软骨细胞合成分泌MMPs,在降解ECM扮演者重要的角色⑹。 关节发生炎症时,MMPs表达增高,诱发了软骨间质的降解增加,其降解产物的 积聚,对炎症反应有正反馈的调节,引发了细胞外基质进一步裂解,恶性循环就 此生成,关节软骨的进行性破坏就此生成⑸。 虽然TMJ-OA的发病机制尚不清楚,先前的研究表明炎症与TMJ-OA有关⑺ %关节软骨细胞受到炎症刺激后,分泌多种细胞因子,其释放与关节组织的损 害密切相关,研究表明IL-lp> IL・6在0A病变的早期出现⑻9〕。先前的研究中 也表明了 IL・1卩、IL-6在关节病进展中主要的促炎细胞因子【°⑷。尤其是是IL- 1卩,它经常与细胞表面受体相互作用,是破坏TMJ结构的关键因子,提高关节 分解代谢速率DM。研究发现IL■邛受体被阻断时,IL-1卩对软骨基质的破坏作 用随之降低[叭 在TMJ-OA患者的滑膜液中,IL・ip表达增加皿叫 在软骨细胞 体外实验中,IL-lp刺激了其Wnt-5A蛋白表达增加,激活了 JNK通路,进而诱 发了 MMP-1, MMP-3, MMP-9和MMP・13的上调如。因此本实验IL・1队IL- 6和MMP-13可以作为评判OA发病的实验观察指标,并且探索性观察咬合创伤 模型下颛下颌炎症主要的分布范围,是否在颛下颌关节窝以及颛下颌关节与听泡 的交界区分布,为后期实验研究打下坚实的基础。
最近的研究表明过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)在骨关节炎中扮演 着重要的角色0;22]。PPAR属于配体激活的转录因子和核激素受体超家族成员中 的一员㈡〕。PPAR在自然状态下有三种异构形式,分为a、卩和丫型,在人体细 胞中广泛表达。关节软骨细胞中PPAR-y的表达较多。囉哩烷二酮类药物是PPAR- Y的主要合成型配体,市面上常见的药物有罗格列酮、匹格列酮。早期研究认为 PPAR-y脂质代谢调节中发挥了重要的作用,而近年研究表明PPAR*扮演着信 号装配复合体的作用,介导炎症调控,控制基质分解与合成反应〔却。
PPAR-y已被证明在外周葡萄糖的利用和胰岛素的致敏中发挥核心作用◎相 当多的证据显示PPAR-y与糖尿病紧密相关,其也介入了非酒精性脂肪性肝病, 认知功能障碍和痴呆、心血管疾病、骨关节炎症的病变进程。越来越多的证据表 明在许多呼吸道疾病中,PPAR-y作为一种抗炎成分抑制了促炎基因的表达从而 起到抗炎作用【均。
另一方面,一些研究观察到PPAR-v激动剂在体外和体内减少了软骨降解, 并表明PPAR*的激活能够减少关节炎疾病进展Z旳。研究发现在犬关节炎模型 中,PPAR-y激动剂毗格列酮通过抑制MAPKs和NF・KB信号通路减少MMP-1 和iNOS的合成,从而减少软骨损伤NJ%毗格列酮还可以通过减少MMP-13和 IL-lp的水平来减少软骨病变【绚。研究表明,毗格列酮可降低动物模型中OA的 严重程度【26]也有研究表明在应用晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导兔软骨细胞 炎症增加,在此期间使用毗格列酮对进行干预,加入不同剂量的毗格列酮共同孵 育。结果证明AGEs诱导后TNF・a和MMP-13的表达量增高,毗格列酮能明显 地逆转AGEs造成的炎症效应。毗格列酮的剂量越大,抑制炎症作用越明显。 AGEs结合软骨细胞中的RAGE (AGEs受体)下调PPAR-yo AGEs对RAGE的 激活触发了下游一系列信号传导的级联,其中包括MAPK JNK/p38的激活以及 PPAR-y的下调后NF・KB的激活【2叫
软骨特异性敲除PPAR-y基因小鼠表现出自发性骨关节炎表型,这进一步证 明了 PPAR许是软骨健康的关键调节因子0】。此外,PPAR-y的活化可以抑制类 风湿性关节炎中滑膜成纤维细胞和单核细胞的炎症和分解代谢反应㈤。因此 PPAR-y可能是0A治疗中药物干预的潜在靶点。
与其他滑膜关节不同,颛下颌关节炎症是一种常见但独特的疾病。就组织学 结构而言,下颌髒突软骨与肢体关节软骨不同。下颌髒突软骨主要由纤维软骨组 成,而不是透明软骨,表面有多个胶原纤维区组成【29】。I型胶原广泛分布于髒突 软骨的浅层,纤维层下面的成熟软骨层中则有很丰富的II型胶原蛋白。此外,一 项免疫组织学研究显示新生哺乳动物的下颌課突软骨中都存在IX型和XI型胶 原。由于纤维软骨和透明软骨之间的成分差异,PPAR-y对颍下颌关节软骨基质 的降解以及炎症的调控作用仍然需要实验去证实⑺。
然而,PPAR-y在咬合因素导致的颛下颌关节炎紊乱病中的表达是否有差异 还没有相关的报道,本实验旨在为探讨在大鼠咬合高点模型诱导的颍下颌炎症中 内源性PPAR-y的表达趋势如何,比较PPAR-y与炎症因子IL-lp. IL-6以及
MMP13表达的趋势,探讨PPAR-y在颍下颌关节中的可能存在的病因机制,本 实验旨在为进一步探索颖下颌关节紊乱的病因机制提供新的思路,为颍下颌关节 的治疗提供新的方向。
第_部分咬合创伤大鼠动物模型的建立
1. 目的
通过粘接3/4钻铮金属铸造冠建立动物模型,验证咬合创伤模型的可靠性和可重 复实验性。
2. 材料与方法
2.1实验分组
48只雄性Wistar大鼠(购于山东大学动物中心),8周大,重约180g・220g,, 按动物伦理标准要求饲养。保证各组大鼠充足的饮食,分笼饲养,12小时昼夜更 替。
所有大鼠随机分为实验组一(EG 1 , n=15)、实验组二(EG lb n=15) 和对照组(CG=18)三大组,按照实验计划根据3个不同的观察点对以上实验组 继续分组。EG I组为咬合创伤实验组,各组分别保留3/4金属冠分约lw、4w组 以及8w组,每组各5只大鼠,分为咬合创伤lw、4w组以及8w组;EGII组分 别在第1、4、8w拆除金属冠去除咬合创伤并继续饲养2周后处死,每组各5只 大鼠组成,分为l+2w、4+2w和8+2w组;对照组大鼠在lw、3w、4w、6w、8w、 lOw组时间点处死。
2.2实验仪器与试剂材料
实验仪罰
特制拉钩、修复雕刻刀、游标卡尺、酒精灯 正畸技工室
lml 一次性注射器 天津富宇
玻璃离子水门汀 上海医疗器械股份有限公司
实砂剂及材料:

23实验方法
制作3/4钻铅金属铸造冠
预实验期间分离8周龄雄性大鼠的右下颌骨,剔除肌肉,用酒精擦洗牙冠表 面,随后用棉棒蘸取分离剂,涂布在下颌第一磨牙牙冠处,随后气枪轻吹至均匀, 将嵌体蜡均匀铺于牙冠表面嵌体蜡至牙龈缘处,精细修整牙冠形态至胎面厚度 1.5mm,嵌体蜡边缘与牙颈部平齐,嵌体蜡型制作完毕后(见图1),送至山东 大学口腔医学院修复技工中心进行包埋、铸造钻馅合金冠。
建立咬合创伤大亂动物模型
1) EG I、EG II组经检查大鼠毛发完整,精神状态可,随后腹腔注射戊巴比妥 钠(3.5 ml/kg)用于麻醉©
2) 打磨、抛光3/4钻辂合金铸造冠,标准化要求牙合面厚度使其为1.0mm以防误 差出现,试戴合适以后,两位实验者相互配合粘接铸造冠(玻璃离子水门汀), 术者用拉钩撑开口角并用轻轻钳持舌体,尽量直视下粘接右下颌磨牙,另一位术 者用棉块快速清理牙面,隔湿,调拌玻璃离子粘接剂,快速粘接,去除多余粘结 剂,至此大鼠右下颌咬合创伤模型建立完毕(见图2) o
3) 每天分不同时间点观察大鼠的体重、情绪、饮食等多项生理状态,用棉签检 查铸造冠在口内是否有松动,若有脱落,及时麻醉重粘,确保铸造冠具有良好的 固位。
4) 在1周、4周、8周三个时间点,用戊巴比妥钠(3.5ml/kg)麻醉EG I实验 组大鼠并且处死,并心脏灌注至肝脏发白。EG II组大鼠麻醉后,术者轻力移除 3/4铸造冠,苏醒后继续饲养2周随后处死。
3•结果
实验中所有大鼠生理状态健康,无一出现明显精神状态异常;试验期间3/4 钻锯金属冠未见松脱现象。实验人员观察到EG I大鼠可见铸造冠对颌牙磨耗明 显,因单侧牙齿咬合接触造成咀嚼肌酸痛,大鼠进食量有所减少。
4.1^
为了研究咬合创伤对颍下颌关节的影响,有很多方法可以建立有效的咬合创 伤模型,大鼠、兔子、恒河猴等动物被用来建立咬合创伤模型亠],研究者们 有通过磨牙早接触(金属丝、金属冠)造成咬合创伤,另有也有在关节腔注射碘 乙酸钠、制作前牙反雅 动物模型或者应用Col2al敲除小鼠建立关节炎模型,这 些都是行之有效的方法⑴歳]。
5.结论
本课题组前期实验及本实验也已经验证3/4钻锯金属冠固位良好、可操作性 强,金属冠粘接力良好,粘接3/4钻锯金属冠可创造咬合高点,诱导TMJ炎症。 其方法稳定可靠,适用于咬合与颍下颌关节下一步病因机制的研究。
第二部分咬合创伤大顾下颌課宪软骨组织形态学观察
1. 目的
通过苏木精一伊红染色(HE染色)对咬合创伤下颖下颌髒突软骨关节组织 进行形态学观察,观察咬合创伤对颍下颌关节相关组织的影响。
2. 材料与方法
2.1实验仪器=
BX50台式显微镜 Olympus
KD-BL包埋机冷冻台 浙江KEDEE
KD-MBII电脑生物组织包埋机 浙江KEDEE
载玻片 海门神燕
KDS-22电热恒温水浴锅 上海精宏
BCD-215DK 冰箱 青岛海尔
KD-HI电脑生物组织烘片机 浙江KEDEE
ECLIPSE El00 显微镜 日本NIKON
IKA RCT基本型磁力加热搅拌器 IKA
电子分析天平 Sartorius 德国
CKX41倒置相差显微镜 Olympus
LD2X-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安
超纯水系统 Merck Millipore 美国
Starter 3C实验酸碱度计 上海奥豪斯
TE1245级精度电子天秤 北京利斯
DNG90-30A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏
ZTLH00005纯水机 AQUEL1X
LKB1型超薄切片机 LKB瑞典

2・2实验试剂及材料:
十二水合磷酸氢二钠 (沪市 1002031)
乙二胺四乙酸二钠 (沪市 10009717)
磷酸二氢钠 天津福晨
1 %戊巴比妥钠 山东大学齐鲁医院
4%多聚甲醛 天津广成
30%过氧化氢 天津大茂
PBS缓冲液 天津广成
苏木素染液、伊红染液 北京索莱宝科技有限公司
中性树胶 氢氧化钠 氯化钠 Solarbio G8590
天津大茂
天津大茂
乙醇 天津市广成化学试剂有限公司
二甲苯
石蜡 天津富宇
国药集团
2.3实验试剂配置
EDTA脱钙液配制方法:
分析天平别称取200g EDTA粉末和20g氢氧化钠颗粒,溶解在适量双蒸水 中,定容至2000mLo用电子式酸碱度计测量PH值,1%盐酸溶液将pH调节到
7.4,定容至 2000mL,
2.4实验方法
241实验标本取材 储存在4°C冰箱中。
术前空腹,称重, 以1%戊巴比妥钠(3.5ml/kg)腹腔注射进行麻醉,大鼠
仰卧位固定于手术台。组织剪刀打开胸腔暴露心脏后,灌注体积分数为10%生理 盐水20mL后,灌注体积分数为4%多聚甲醛400ml,先快后缓,观察大鼠全身 抽搐痉挛,肝脏泛白,至僵直,停止灌注。室温放置约半小时,组织剪剔多余肌 肉,轻力取岀双侧TMJ,切忌蛮力,浸泡于4%多聚甲醛溶液(pH=7.4)固定2448 小时后用自来水冲洗,然后放在PBS中。
242切片标本制作
(1) 脱钙脱水:用10%EDTA溶液(pH 7.4, 4°C)对TMJ组织进行脱钙约
1.5个月,每三天更换脱钙液,针刺骨组织无阻力停止脱钙,在浓度为70%、80%、 90%、100% I和100% II的乙醇中梯度脱水各6h。
(2) 透明:浸于二甲苯I液和II液透明各1.5h°
(3) 浸蜡、包埋:依次于蜡池I和蜡池II中浸蜡,各3h,然后包埋,固化 后在4C储存,并做好标记备用。
(4)切片:调整切片厚度,沿着課突矢状方向制备4・5um连续切片,在40°C 水浴中展开,用载玻片舀起切片,60°C烘烤2小时,4°C储存备用。
2.4.3 HE 注
(1)二甲苯I液和二甲苯II液脱蜡10分钟
⑵梯度酒精中水化5分钟,乙醇浓度依次为100%(液体I)、100% (液II)、 90%、80%、70%,用双蒸水在摇床上摇荡漂洗3分钟*3次。
(3) 浸于苏木素染液中约15min,用双蒸水在摇床上摇荡漂洗3分钟* 3次。
(4) 浸于伊红染液中8min,用双蒸水在摇床上摇荡漂洗3分钟* 3次
(5) 梯度酒精脱水,乙醇浓度依次为70%、80%、90%、100% (I液)、100% (II液)后各两分钟,放入二甲苯(I)、二甲苯(II) 10分钟,中性树胶封闭标
本,切片于在光学显微镜下观察额下颌关节组织基本形态后拍照。
3. 结果
咬合创伤下大鼠颍下颌关节HE染色的组织形态学观察(见图3.1、图4): 空白对照组髒突软骨表面完整,自上而下为纤维层、增殖层、肥厚层和钙化层… 各层细胞分布清晰,排列整齐;
EGI大鼠髒突软骨各层细胞排列紊乱,无序,软骨细胞数目减少,细胞核 固缩,可见4w、8w组增殖层以及肥大层厚度变薄,肥大层细胞明显肿大,聚 集呈岛状,部分组织上出现无细胞区,lw, 4w组吞噬小泡增多、关节软骨细 胞肿大,8w组炎症减轻。
此外部分髒突区可见肥大层软骨细胞反应性增生(图3.2),向软骨下骨 突起呈“钉突状",细胞排列层次紊乱。
EG II炎症情况较EG I有所减轻,各层细胞排列趋于正常,肥大层以及 增殖层与对照组相比较薄。
4. 讨论
在咬合创伤刺激下,髒突软骨呈现了类似于TMD的组织形态学变化,这 是因为颛下颌关节是一个终生改建的关节3;呵,这与其长期受到咬合力的加载 相关,关节骨由纤维软骨和软骨下骨,并且对应力作用十分敏感,关节软骨不
断在进行重塑改建。过大的机械应力被认为是导致TMJ中软骨退化的关键因 素卩艮一项回顾性研究表明,单侧TMJ-OA与下颌骨不对称性和患侧咬肌肌电 活动增加有关卩9]。然而,TMJ-OA,咀嚼肌张力过大和牙颌形态之间的因果关 系仍有待阐明。最近的研究集中在关节软骨退化与机械传感相关的分子途径, 相关的体内体外研究表明了机械应力对下颌課突软骨细胞产生作用,过大的机 械应力诱导纤溶酶原激活物(PA)系统的活化,这可能导致细胞外基质中的蛋 白水解Mo】。长期实验性紊乱性可能会导致软骨下骨骨质流失和破骨细胞活化的。 因此,过重的关节负荷和异常牙齿咬合状态已经被用来建立TMJ-OA动物模型 [4罠
相当多的证据表明,异常的生物力学刺激在TMJ-OA的发生和发展中具有 重要作用。然而,机械应力也是下颌骨髒突发育的必要条件。据报道,3周龄 雌性小鼠喂养软包饲料并且修剪切牙,4周后发现其TMJ中具有更薄的软骨和 软骨下骨体积减少⑷】。实验性的咬合改变被认为通过增加关节软骨负重从而导 致关节的损伤,王美青实验组通过建立大鼠渐进性咬合紊乱模型以及前牙反合 模型均发现颖下颌关节退行性变化【血42;的,与本实验一致。Fujisawa等对家兔 重复性被迫张(3小时/天,共5天)建立OA样改变昭。因此本实验通过粘接 3/4铸造冠改变咬合力,从而改变了额下颌关节的生物学环境,打破了软骨细 胞的增殖与凋亡的平衡,从而导致了 OA样改变。課突软骨肥大层是受关节负 荷影响较大1呦,所以肥大层炎症变化明显。去除咬合创伤刺激2周后,1W组 观察到TMJ软骨细胞排列接近正常,说明咬合创伤的存在与否可能对TMJ有 病理性的影响。
5.结论
咬合创伤模型可以造成大鼠TMJ创伤反应,该模型可用于今后颛下颌关 节紊乱病致病机制的进一步深入研究。
第三部分咬合创伤大羸颗下颌关节課突中PPAR-Y. IL-K
IL-6v MMP13表达变化
1. 目的
通过IHC检测PPAR-丫、IL・1、IL-6. MMP13变化趋势,观察咬合创伤对TMJ 中PPAR-y表达的影响,探究PPAR-Y在颍下颌关节炎症中的相关作用。
附加实验目的:探索性观察额下颌关节与耳部听泡交界以及关节窝的炎症表 达,颍下颌关节炎症的分布范围。
2. 材料与方法
2.1实验仪器
BX50台式显微镜 Olympus
KD-BL包埋机冷冻台
IKA RCT基本型磁力加热搅拌器 浙江KEDEE
IKA
KD-MB 11电脑生物组织包埋机
神燕组织防脱载玻片、组织盖玻片 浙江KEDEE
海门神燕
Mentler电子天平
LKB1型超薄切片机 瑞 士 AT261
LKB瑞典
KD-HI电脑生物组织烘片机
CKX41倒置相差显微镜 浙江KEDEE
Olympus
超纯水系统 Merck Millipore 美

Starter 3C 实验 PH 计 上海奥豪斯
DNG90-30A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏
ZTLH00005纯水机 AQUELIX
微量移液枪(10pL、lOOyL、lOOOgL) Eppendorf Research

2. 2材料与试剂
DAB显色盒 上海羽朵生物科技有
限公司
胎牛血清白蛋白 AMRESCO
甲基绿 Fisher Scientific93071f
PPAR-y Antibody Abeam香港
IL-1 Antibody Abeam香港
胰酶消化液 Solarbio,中国
IL-6 Antibody Abeam香港
MMP13 Antibody Abeam香港
Swine polyclonal Secondary Antibody to Mouse Abeam香港
Rabbit anti-Mouse IgG(H+L) Secondary Antibody Abeam香港

2.3图像以及统计分析软件
Image- Pro-Plus 6.0 专业图像分析软件 (Media Cybernetics,美国) GraphPad Prism 5. G 统计软件包 (Mackiev Software,美国)
2・4实验试剂配制
(1) 1%BSA-PBS 配制方法:
取lOOmLPBS溶液,加入lg胎牛血清白蛋白粉末(BSA)加入将其彻底溶 解,过滤、后贮存于4°C冰箱中。
(2) 甲基绿的染色液制备方法:
量取0.3586g甲基绿粉末,,溶于适量的双蒸水中,定容至50.0mL
2.5实验方法
2・5•彳免疫组织化学染色(I mmunoh i stochem i stry y IHC):
(1) 二甲苯I液和二甲苯II液脱蜡10分钟
(2) 梯度酒精中水化5分钟,乙醇浓度依次为100% (液体I)、100% (液 体II)、90%、80%、70%,用双蒸水在摇床上摇荡漂洗3分钟忙次。
(3) 室温条件下,将切片浸入0.3%过氧化氢溶液中封闭30分钟,用双蒸 水在摇床上摇荡漂洗3分钟* 3次。
(4) 滴加1%胰酶消化液进行抗原修复,37°C下孵育20分钟,于摇床上双 蒸水震荡冲洗3min*3次。
(5) 在37°C湿盒中加1%BSA-PBS放置20分钟后,然后倒出液体,轻轻甩 出,分别滴加一抗 IL-1 (1:200)、IL-6( 1:200)MMP13 (1:200)、PPAR-y( 1:300), 4C孵育过夜。
(6) 次日,常温下复温10min,于摇床上双蒸水震荡冲洗3min*3次。滴加 相应的二级抗体(1:200) , 37°C孵育lh,于摇床上双蒸水震荡冲洗3min*3次。
(7) DAB显色液现场制备,避光条件下,将显色液滴在切片上,观察显微 镜下组织着色后停止显色,流水冲洗7分钟;
(8) 甲基绿复染,于摇床上双蒸水震荡冲洗3min*3次。
(9) 梯度酒精脫水各2分钟,后放入二甲苯(1)、二甲苯(11) lOmin,中 性树胶封闭切片,镜下观察拍照。
2.5.2统计分析
实验组1、实验组2、空白对照组随机选取三个视野进行照相保存o Image Pro Plus 6.2(IPP 6.2)专业图像分析软件用于组织学检测和Graph pad Prism 6.0软件 用于统计分析。测量免疫组化染色IL-ip> IL・6、MMP13、PPAR-y的积分光密度 (IOD),计算各标本的平均值,表示实验组指标的表达水平。所有数据以均数 士校准差的形式表示。组间对比通过Student9 s-t检验确定两组之间是否存在统计 学差异。p<0.01时,认为有统计学意义。 3. 结果 咬合创伤大鼠颛下颌关节免疫组织化学染色结果显示: 1・1L・1卩、IL-6> MMP13在CG组中大鼠課突各层中弱阳性表达在髒突肥大细 胞层(见图5、7、9),也可少量表达在肥大细胞层与增殖层细胞之间; PPAR・Y在软骨细胞中强阳性表达(^<0.05**)(见图14)
2. 免疫组化结果显示lw、4w、8w组软骨细胞中IL-lps MMP-13和IL-6的表 达明显高于对照组(;?<0.05**)(见图5、7、9) o 4w组IL・6、MMP13和 IL-lp的阳性表达增强,集中分布驟突肥大细胞层,也可少量表达在肥大细 胞层与增殖层细胞间的细胞带。与lw组和8w组相比,4w组增加至高峰 区(p<0.01*)(见图14) o PPAR*的表达聚集在肥大细胞层,也可少量 阳性表达存在于在纤维层、增殖层区,软骨下骨的骨髓腔内可见阳性的表 达。EG I软骨细胞中PPAR・Y表达量均小于CG组(p<0.05**) , 4w组 PPAR-y在软骨细胞阳性表达降低至最低点(p<0.05**) , 8w组PPAR* 表达量较4w有所回升(p<0.05**)(见图11、14)
3. 去除咬合创伤后EG II中各组中软骨细胞中IL-lp. MMP13和IL・6呈阳 性表达(见图6、8、10、15),与EG I相比,炎症因子明显降低,表达 水平与对照组有差异,有统计学意义(p<0.05**) o PPAR-y在去除咬合创 伤后较EG I组均有所回升(p<0.05**)(见图12/15) 0 4. 颍下颌关节窝,颛下颌关节与听泡交界区并见软组织中,炎症因子IL-lp以 及IL-6未见明显表达,随着观察时间的增加并无改变(见图13・1、13・2、 16-1、16・2),并且无统计学意义(p>0.01) o
4. 讨论
颛下颌关节紊乱病是一类疾病的总称,颛下颌骨关节炎症是其中一种。I 型胶原和II型胶原纤维是TMJ主要的细胞外基质,蛋白聚糖是胶原纤维的重要 组成成分。正常情况下,TMJ内的细胞外基质(ECM)的降解和重组处于一个不 断更新的动态平衡中1你,为TMJ软骨细胞和滑膜细胞等提供良好的内环境。TMD 关节炎发病时,细胞外基质代谢平衡打破,继而胶原纤维降解或蛋白聚糖流失, TMD病变过程中,MMPs扮演着重要的角色【翎。TMJ软骨细胞、滑膜细胞均可 表达MMPs,在OA的病程进展中,MMPs与TIMPs的相互拮抗作用可能极大 程度上影响着软骨基质的合成与降解。多种MMPs均被报道在人骨关节炎症中 表达,其中包括了 MMP-1 ,-2,-3,・8,・9 ,・13,以及膜型MMP^-53^其中, MMP13功能作用广泛,不仅可以降解ECM中的II型胶原,还可以裂解骨粘连 蛋白,基底膜聚糖以及造成IV型蛋白聚糖,IX胶原流失厲】.
本实验研究发现实验组大鼠課突MMP13从lw组到4w逐渐增加,表明 MMP13可能在TMD进程扮演着重要的作用。研究表明課突头的分解代谢基因 ADAMTS5、MMP3、MMP13表达增强的同时,蛋白聚糖和I和II型胶原表达量 相对减少〔羽。其中ADAMTS 4和5被认为是OA发展过程中主要的聚集蛋白聚 糖酶。小鼠膝关节OA模型中,敲除ADAMTS5基因或双重敲除ADAMTS5和 ADAMTS4的阻止了软骨的进一步退化厲:57]。Little等人研究表明敲除MMP13 基因可以预防关节软骨降解网。半月板韧带损伤诱导小鼠0A动物模型上使用 MMP13抑制剂后,免疫组织化学显示胶原裂解减少、蛋白多糖流失减少,表明 其可预防0A进展。因此,这一实验表明了通过相应分解酶的抑制剂可以尽可能 保留患者关节软骨和关节功能,而不是像现在的治疗方式一般简单地缓解现有的 0A症状a】。这些发现表明分解代谢酶在0A发展进程中起到重要作用,同时对 分解代谢酶靶向治疗不失为为减缓关节退化的治疗措施。
与此同时,促炎因子的重要性也被越来越多的专家强调,促炎因子的释放有 助于MMPs的合成⑻6°】。本实验IHC结果表明IL・lp、MMP13和IL・6表达随着 咬合创伤的时间逐渐增强,在4周时炎症因子表达最多,8周时咬合创伤炎症表 达有所下降。这表明咬合高点的刺激后IL・ip、IL-6促炎因子可能分泌增加,从 而导致MMP13这类基质金属蛋白酶释放增加,促进了 II型胶原的分解o IL-lp 是一种有效的促炎细胞因子,其作用于软骨细胞上的受体,增加了 IL・1和IL-6 的表达,进而促使了 MMPs形成增多因此IL-ip被认为是作为MMPs生理 活化剂的潜在因子之一【叭另外也就研究表明【・1卩、TNF-a的生成可能通过激 发软骨细胞中的多种信号通路来增加MMP1、MMP3、MMP13等基质酶的表达, 进而软骨完整性受到破坏。⑹IL-ip可以与其细胞膜上的受体(IL-1R1、IL- 1R2)结合,诱导激活NF・KB通路,继而诱导活化多种靶基因的转录,促使了软 骨降解酶如MMP13的增加I64】,另外还包括MAPK/c-Fos/AP-1 and JAK2/STAT1/2 等通路也参与到软骨代谢平衡以及炎症反应的调控中来165:66]。另外也有研究发 现1L-6可与软骨细胞表面的SIL-6R受体结合促进了 MMP-hMMP -3等多种降 解酶的分泌,其机制可能是激活了 STAT 1/3通路阿,另外也有研究表明IL-6/sIL- 6R与IL・1卩均有协同作用,在软骨细胞的平衡稳态中扮演着重要的角色昭,破 坏了关节软骨的完整性。
另外实验组发现,随着咬合创伤刺激时间的增加,PPAR-Y的表达量逐渐降 低,4w组降至低谷,8w组有所回升,这与Hassan等人的研究一致,其发现在人 类骨关节炎症中PPAR-y的表达量下降阴。关于PPAR-y在咬合紊乱造成颛下颌 关节炎症软骨中的表达尚未被研究,建立动物模型研究PPAR-y和炎症因子的表 达趋势,对于进一步研究颖下颌关节的病因机制以及治疗措施具有先锋作用。
目前为止,仍然没有合适的药物治疗来阻止骨关节炎的进展。最近的研究 表明,PPAR-y是该疾病的一个新型的靶点。PPAR-y的激活不仅调节参与脂质 代谢,也与抑制炎症反应紧密相关。在骨关节炎体内体外实验中发现,PPAR*在 软骨细胞中表达,并且与正常软骨相比,骨关节炎中的表达降低。这些发现表明 关节炎软骨中PPAR-y下降的同时,炎症因子和分解代谢因子增加[⑷。PPAR-y 激动剂可抑制LPS诱导的NF-KB活化和炎性细胞因子的产生。在瘦素刺激的软 骨细胞中加入毗格列酮(PPAR-y激活剂)略微降低了 MMP-13的分泌。不少中 草药也具有激活PPAR・y的能力,从而表现出抗炎作用【"J另外研究发现IL-1J3 诱导软骨细胞处于炎症状态中,芒果昔通过抑制炎症介质PGE2和NO的产生而 表现出抗炎作用。芒果昔作为PPAR-y的激活剂,阻断了 NF・KB通路,从而减轻 了软骨炎症反应〔9】。当PPAR-y受体被特异性敲除时,芒果昔抗炎作用减弱,NF・ KB通路无明显抑制。芒果昔的抗炎作用与PPAR-y激活有关,抑制了 IL・lp诱导 的NF*B信号通路活化,继而减少了软骨完整性破坏。
如上所述,IL・lp与0A的发病机理密切相关。一旦IL-lp释放增加,软骨 细胞受到刺激释放出NO、PGE2、MMPs等多种介质,MMPs等促进了 II型胶原 降解,瓦解ECM结构,产生组织损伤并破坏软骨完整性。另外PPAR激活剂上 调了 PPAR-y的表达,同时减少了炎症状态下软骨细胞炎症因子以及MMPs的表 达。
OA软骨中PPAR-y的表达降低以及相关文献提岀PPAR-y在OA发展中起 到保护作用,PPAR-y的炎症调控为为临床中预防和治疗0A提供了新的思路。 因此迫切需要进一步研究以确定控制PPAR-y表达的分子机制。这样的研究无 疑将增加我们对OA发病机制的理解,并可能导致在预防和治疗OA以及可能的 其他方面开发新的治疗策略。
本研究值得注意的是8w组相对4w组炎症因子表达相对有所回落,可能是 因为本实验建立的咬合创伤模型是并非单纯性的炎症反应模型,是多种症状并列 存在的结果,其间不乏关节退行性变以及关节后部代偿性增生,因此随着咬合创 伤刺激时间的延长有加重的趋势,软骨退变所致的具有分泌炎症因子功能的软骨 细胞减少有关,也可能随着刺激时间的延长,颍下颌关节更加能够适应较强的机 械力刺激,机体对咬合高点造成的刺激的自我保护性能力增加。另外,在颖下颌 关节窝内并未观察到炎症因子的分布,也可能和咬合创伤下导致的关节炎症相对 局限有关。
大鼠驟突软骨可出现类似于骨关节炎的退行性症状变进一步说明了实验性 的咬合高点可能会引起課突软骨的退行性变。
此外,颛下颌关节与听泡交界区并未见明显炎症因子的表达。耳鸣是人类生 活中的常见症状,成年人群中发病率10-15%,常常影响患者的生活质量并经常 引起很多困扰I70;7,]o除了听力损失或噪音创伤外,耳鸣还与颍下颌关节疾病相关 【7°] o这种类型的耳鸣被称为躯体感觉性耳鸣。在一些研究中已经显示出耳鸣和 额下颌关节紊乱(TMD)频繁共存[72;731 o Lam等人调查TMD患者中耳鸣患病 率为30.4% o此外,64%的耳鸣患者患有TMDl74 75^ Buergers等发现与没有TMD 的患者相比,患有TMD的患者耳鸣的发病率是普通患者的8倍,并且通常可以 通过紧咬牙来改变耳鸣的感觉【7叫另外研究表明,TMD与听力丧失的感觉之间 存在显著关联(p<0.0001) "I。无论性别和年龄如何,87%的TMD患者中往往 存在着耳科症状,不乏耳鸣,耳聋,耳闷等多种表现。耳鸣(42%)是颛下颌关 节病中患病率最高的症状,也有不少患者因关节问题存在耳闷(39% )的症状卩叽 研究表明IL・lp和IL・6均有在听力丧失的耳部疾病表达I?岚0】,也是关节炎症的 致病因子。本实验做了大胆的假设,作了一个扩展性研究,观察炎性因子是否在 听泡与颛下颌关节交界区表达,为进一步研究颍下颌关节紊乱病与耳症的研究提 供理论支持。实验发现颛下颌关节与听泡交界区并无明显炎症表达,可能跟咬合 创伤造成的颛下颌关节炎症是比较局限的而非弥散性的有关。颍下颌关节炎症与 耳部症状的病因学仍然需要进一步的研究以及更加准确合理的实验设计。
5.结论
本实验及本课题组前期实验也已经验证粘接3/4钻锯金属冠可创造咬合高 点,诱导TMJ炎症。其方法稳定可靠,适用于咬合与颛下颌关节下一步病因机 制的研究。
在咬合创伤一周至四周时,颛下颌关节炎症反应明显,IL・lp、IL-6、MMP- 13逐渐增加,咬合创伤后期,其炎症反应减缓。而且去除金属冠后,其炎症反应 降低,有利于TMJ组织愈合。
在咬合创伤诱导的颛下颌关节动物模型中,PPAR-y下调可能是造成关节炎 的重要靶点,其下调可能增加了 ILJ0、IL・6、MMP13炎性因子以及分解代谢因 子的释放,促发的颍下颌关节的炎症反应。
探索性实验发现未观察到颛下颌关节窝,听泡与颍下颌关节后界之间的明显 炎性因子的表达,可能与咬合创伤造成颛下颌关节炎症相对局限有关,关于颍下 颌关节和耳症的病因学研究仍未有定论,需要更加深入的临床研究和基础研究。
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综述
过氧化物酶体增殖物激活受体在颛下颌关节中
的研究进展
摘要:
颖下颌关节(Temporo-mandibular Joint , TMJ)是一种人体中的滑膜关节, 能够在三维方向中运动。各种流行病学显示颛下颌关节炎的患病率可在1%至 84%之间变化。了解颍下颌关节的病因机制对其诊断以及治疗有着重要的意义。 过氧化物酶体增殖激活受体-y (PPAR-y)是一种治疗OA比较有吸引力的治疗 靶点。近年来研究发现PPAR-y(过氧化物酶增殖物激活受体丫,peroxisome proliferators-activated receptor-y)与关节异常改建过程中炎症发生发展等密切相关。 本文将PPAR-y在炎症和骨关节炎中的作用展开论述。
关键词:颛下颌关节;骨关节炎;PPAR-Y;软骨细胞;炎症
Abstract:
The Temporo-mandibular Joint (TMJ) is a synovial joint in the human body that moves in three dimensions. Various epidemiology shows that the prevalence of temporomandibular arthritis can vary from 1% to 84%. Understanding the etiology of the temporomandibular joint has important implications for its diagnosis and treatment. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-gamma) is an attractive therapeutic target for the treatment of 0A・ In recent years, it has been found that PPAR- Y (peroxisome proliferators-activated receptor-y) is closely related to the development of inflammation during joint abnormal reconstruction. This article discusses the role of PPAR-y in inflammation and osteoarthritis.
Key words: temporomandibular joint; osteoarthritis; PPAR-y; chondrocytes;
颛下颌关节(TMJ)是一种滑膜关节,能在三维方向进行复杂的运动并且承 受着负荷。骨关节炎(0A)是一种退行性病变,伴随软骨进展性的退化,软骨 下骨重塑,滑膜炎和慢性疼痛⑴。TMJ-OA也是颛下颌关节紊乱(TMDs)的重要 亚型⑴。临床上,TMJ骨关节炎(TMJ-OA)的病因往往是多因素。它继发于关 节盘移位,创伤,功能超负荷和发育异常,如继发性TMJOA⑵软骨退化和损伤 是0A发生发展中的重要一环⑶。通常,关节软骨被认为是主要的病变组织,分 解代谢和合成动态平衡被打破促使了软骨的完整性降低。在骨关节炎症早期病损 当中,促炎因子的表达十分活跃,主要包括白细胞介素-10(inp)和肿瘤坏死 因子f (TNF-a)的增加。其进一步促进多种炎症介质的分泌,主要包括诱导型 一氧化氮合酶(iNOS)和微粒体前列腺素E合成酶・1 (mPGES-1) >环氧合酶. 2 (COX-2),以及基质金属蛋白酶(MMPs)的产生。这些分解代谢酶可以降解 细胞外基质中的聚集蛋白聚糖和胶原蛋白,导致软骨损伤。此外,在0A期间, 一些合成代谢因子的表达显着下调,导致软骨破坏增加。
额下颌关节的现有治疗方法是姑息治疗,仅在不预防疾病进展的情况下提供 症状缓解。目前的药物治疗包括非笛体抗炎药(NSAID) o因此迫切需要额外的 新疗法。在潜在的治疗方法中,过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR-Y)是一 种治疗0A比较有吸引力的治疗靶点。研究调查PPARy基因突变可能与中国人 群的膝关节0A发病率密切相关⑷。本文将PPAR-y在炎症和骨关节炎中的作用 展开论述。 ,.
PPAR*及相关配体
过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)在骨关节炎症的作用备受关注oPPAR 是一种配体激活的转录因子,在自然状态下有a、卩和丫型三种异构形式,属于 核激素受体超家族成员[5]oPPAR在人体中表达非常丰富,广泛表达于肝脏细胞, 心脏细胞和肌肉组织中I叭 他们在调控脂质平衡,促进表皮成熟扮演着重要的角 色,与皮肤伤口愈合和脑发育密切相关,在糖尿病的治疗以及心血管疾病的防治 中也展现了不俗的能力,是一个较有潜力的靶点16,隅9] o ppAR-y也可以分布在 颛下颌关节软骨细胞中。近年研究表明PPAR-y作为一种信号装配复合体,干预 炎症反应的调节,调控基质分解和合成反应【⑹。
PPAR-y与颜下颌关节
PPAR-Y激动剂在减缓颍下颌关节炎症中可能发挥了重要的作用。在弗氏佐 剂诱导鼠节炎模型中,口服罗格列酮或毗格列酮(每次30mg/kg),特异性激 活颛下颌关节中PPAR-y受体的表达,阻断了 NF-KB信号通路从而抑制了炎症 介质的分泌2】。
另外PPAR-y在动物体内保护作用具有在两种动物模型中进一步突出显示。 在骨关节炎(部分内侧半月板切除术)的实验性豚鼠模型中,毗格列酮的给药剂 量依赖性地减小了软骨损伤的面积和严重程度卩化 毗格列酮激发了体内PPAR-y 表达明显上扬,继而MMPJ3、IL・1|3的分泌下降〔⑷。在OA (前交叉韧带横断) 的犬模型中【⑸,PPAR-y激动剂减缓了炎症的进展,保护了软骨的完整性,主要 与MMP-1, iNOS等因子的表达显著削弱相关。这可能因为PPAR*其阻断了软 骨细胞中ERK-l/2,p38和NF・KB通路。另外在类风湿关节炎动物模型中,PPAR- y活化剂曲格列酮减少了软骨组织血管翳形成以及炎症反应昭o iL-ip和IL-6 等因子的血浆浓度明显减低【⑺。在II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中进一步 证实了这一点,其中毗格列酮和罗格列酮均降低了 IL-lp和TNF-a在该滑膜炎中 的表达阴。
因此,似乎PPAR・Y激动剂通过减少0A发病机制中关键基因的表达和介导其 转录激活的信号传导途径来保护软骨的完整性。PPAR-y的上调能抑制细胞活素 类、基质金属蛋白类的表达,这往往与软骨细胞中AP-K NF-KB、ERK-1/2, p38 信号通路被阻断了有关【叭而另外一方面,当PPAR-y的激活被抑制以后,软骨 细胞合成以及分解代谢的动态平衡可能被打破,炎症因子增多,破坏软骨的完整 性。
最近有研究提出OA与葡萄糖失衡,代谢功能障碍和糖尿病(DM)呈正相 关【20⑵]。Waine等首次将II型糖尿病与OA联系在一起,提出高血糖可能在OA 中发挥作用0】。Hart等人的研究还表明,女性的血糖升高与骨关节炎的放射学证 据之间存在显着的正相关㈤】。糖尿病,高血糖,血脂异常和高血压在OA中可能 有相关作用,这些代谢因素可能独立地促进软骨基质的降解和关节的损害[2戮 Rosa等表明高葡萄糖对软骨细胞中MMP-1和MMP-13的分泌具有催化诱导作 用卩兔此外,最近的流行病学研究表明糖尿病在OA的发展和进展中具有独立的 作用叫
进一步的研究表明,高糖刺激下调PPAR-y表达并引发软骨细胞炎症反应, 其中PPAR-y激活剂的给药可能逆转这些改变【2铁 研究中,发现PPAR-y蛋白的 表达在高糖处理的软骨细胞和糖尿病小鼠的软骨被下调畀比格列酮抑制高糖条件 诱导的软骨细胞或者滑膜细胞中C0X・2、PGE2, MMP-13和IL・6的产生,还可 逆转高糖诱导的人软骨细胞中胶原蛋白II和PPAR-y表达的下调。另外值得注意 的是,在正常葡萄糖条件下的人软骨细胞能够表达PPARb以维持细胞生理需求。 毗格列酮刺激对不影响正常葡萄糖条件下软骨细胞中PPAR-y表达,但在体外和 体内高糖条件下PPAR-y表达显着逆转,表明PPAR-y可能是可以自动调节的。
PPAR*与软骨细胞
与正常软骨相比,骨关节软骨中PPARy表达降低伴随着炎症和分解代谢因 子的表达增加。细胞实验表明1L-1P可诱导软骨细胞中有丝分裂原激活蛋白激酶 (MAPK) , p38 (SB203580)和 cJunN 末端激酶(JNK) (SP600125)以及核 因子(NF)信号传导,当这些信号通路被阻断后,可以逆转了的PPAR-y降 低的趋势〔叭 同样,IL・1卩降低了正常大鼠软骨细胞中PPAR-y蛋白的表达〔叭 因此,促炎细胞因子抑制软骨细胞中PPAR-y的表达也可能是0A病理生理学中 的重要过程,而PPAR-y在软骨细胞中表达并发挥功能,PPAR-y激动剂可下调 炎症因子的表达保护了软骨的完整性。
1、 抗炎作用
一些研究表明,PPAR-y在软骨细胞中表达并发挥功能,PPAR-y激动剂可下 调这些细胞中的炎症反应。例如,研究者发现IL-lp诱导的软骨细胞中PGE2、 iNOS和COX-2 il量表达,从而对软骨细胞进行损害,当实验者用15dPGJ2孵育 软骨细胞后观察到IL-17和TNF-a分泌下降,软骨细胞中NO/iNOS、PGE2、 COX-2分泌也随之减少"di 也有研究发现在脂多糖(LPS)诱导的ATDC5 细胞炎症模型中,通过PPAR・Y介导抑制了 0A进展。凝集素通过激活PPAR- 丫信号从而抑制NF-KB途径,保护了软骨细胞正常的生理结构【绚。
2、 抗基质金属蛋白酶
MMP表达增加在OA过程中的软骨退化中起关键作用。PPAR-y活化显示 抑制几种MMP的产生和蛋白多糖降解[妙辺。i5d・PGJ2和曲格列酮活化剂在人 软骨细胞中激活了 PPAR・Y表达,阻断了 AP・1和NF・KB信号通路,从而削减了 MMP-13表达[29]O 15d-PGJ2和GI262570 (PPAR-y的激动剂)也可抑制该炎症反 应保护了关节软骨的完整性虫】。多数研究⑶]证明15d・PGJ2、毗格列酮作为 PPAR*的激活剂的应用在人软骨细胞中,降低了炎症反应,减少了软骨降解酶 MMP-1和MMP-13的分泌。
3. 抗凋亡作用
抑制软骨细胞凋亡是预防0A中软骨退化的潜在治疗方法。有趣的是,15d- PGJ2及其前体PGD2抑制了 NF-KB抑制剂诱导的正常人关节软骨细胞中细胞 凋亡。这似乎是通过抑制MAPK ERK-1/2途径发生的卩叭软骨细胞在高剂量和 长时间暴露于AGEs (Advanced Glycation End Products晚期糖基化终末产物) 下,细胞自噬减少,细胞凋亡增加。PPAR.y激动剂毗格列酮显示出以剂量依赖 性方式保护细胞自噬。研究结果表明AGEs可以下调PPARy,从而诱导软骨细胞 自噬来维持细胞活力,这可能和PPAR-y通过激活Akt / MTOR信号通路相关【刑。 也有研究表明PPAR*敲除小鼠表现岀进行性0A表型,软骨降解增加,软骨细 胞凋亡,伴随mTOR表达增加以及自噬标志物降低。骨关节炎症中炎症和分解 代谢因子的过量产生。体外实验激活PPAR-Y受体后降低了 mTOR表达,增加了 自噬标志物的表达,并降低了 0A炎症/分解代谢因子的表达,从而逆转了 PPARy 敲除小鼠软骨细胞的表型【均。
总结
颛下颌关节的治疗正成为一个主要的医学问题。在未来几十年关节炎发病 率可能会增加,提高0A治疗效果的挑战具有重要意义,并且未来的治疗应该减 少或阻止疾病的进展。
颖下颌关节以及骨关节的发病可能和软骨细胞中的炎症表达和分解代谢反 应增强相关。而了解PPAR-y的功能作用正在为颍下颌关节以及骨关炎的疾病发 病机制带来新的视角。过去的研究表明,越来越多的体外和体内研究表明PPAR- Y激动剂抑制多种分解代谢和炎症反应,表明它们在治疗关节炎中存在潜在用途。 为了评估PPAR-y激动剂作为抗关节炎药物的未来研究中,仍然需要详细了解 PPAR-y激动剂在调控软骨细胞中基因表达的分子机制。
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