Hippo通路介导桑色素对口腔鳞癌细胞生物学行为调控作用的研究论文

2020年8月4日13:20:25Hippo通路介导桑色素对口腔鳞癌细胞生物学行为调控作用的研究论文已关闭评论

Hippo通路介导桑色素对口腔鳞癌细胞生物学行为调控作用的研究论文

中文摘要
背景和目的
口腔鳞状细胞癌(OSCC, oral squamous cell carcinoma)是口腔恶性肿瘤 中发病率最高的类型,约占口腔恶性肿瘤的90%e即使医学技术在不断发展, OSCC患者的死亡率仍然处于较高的水平。统计数据显示,其患病群体趋于年 轻化,总体预后差,5年生存率低于50%。研究开发高效、低毒性的抗OSCC 药物具有非常重要的临床意义。
桑色素(Morin, 355,7,2,,4,-pentahydroxyflavone)是从桑科植物中提取的一种 浅黄色黄酮类化合物。多种黄酮类化合物己在研究中被证实,具有潜在药用价 值。Morin可以通过参与调节细胞的多条信号通路发挥其抗氧化、抗炎、抗菌 及抗肿瘤等重要的生理作用。研究证实,Morin作为具有生物活性的化合物, 具有广泛的药理活性和极低的细胞毒性。探讨Morin对OSCC细胞生物学行为 的调控作用及分子机制,有助于为研究开发针对OSCC的抗肿瘤药物提供理论 基础。
Hippo通路是细胞内参与调节细胞多项生理活动的高度保守的信号通路。 Hippo信号通路的激活,可以通过磷酸化YAP使其限定在胞质内,使YAP被 泛素化作用降解;Hippo信号通路失活,会导致YAP磷酸化水平降低和胞核富 集,从而影响其下游多种靶基因的转录活性,对细胞的生物学行为起到调控作 用。YAP蛋白作为转录共激活因子,参与调控与细胞增殖、凋亡、分化相关的 生物信号,在肿瘤的发生发展中具有重要作用。YAP蛋白水平的提高和胞核富 集,可以诱导多种肿瘤的发生发展。
Morin作为具有重要抗肿瘤活性的化合物,其对OSCC细胞调控作用的相 关研究非常有限,且其在肿瘤细胞中发挥作用的分子机制也有待深入探讨。因 此,本研究旨在探讨Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用,并探究Morin 对OSCC所发挥的调节活性中,是否存在Hippo信号通路的介导。本实验首先 检测了正常口腔上皮细胞和OSCC细胞对Morin敏感性的差异;其次,检测了 Morin在OSCC细胞多项生物学行为中的调控作用;并探讨了 Hippo通路在 Morin对OSCC细胞调节活性中的介导作用;以期为进一步探究Morin在肿瘤 治疗方面的潜力和机制提供一定的理论基础,为开发、研究针对OSCC的治疗 药物提供新的思路。
材料和方法
选择口腔鳞状细胞癌细胞系Cal27和SCC15作为研究对象,探讨Morin对 OSCC细胞生物学行为的调控作用及其潜在机制。
1 .Morin对正常口腔上皮细胞(HOEC)和OSCC细胞的细胞毒性作用比较
分别用Morin处理HOEC和OSCC细胞,以DMSO (二甲基亚矶)处理的 细胞作为对照。用CCK-8法,检测Morin对HOEC和OSCC的细胞毒性,并 计算 Morin 在 HOEC 和 OSCC 细胞中的 IC50; Western blot 检测 Morin 对 HOEC 和OSCC细胞ERK激活水平的影响。
2. Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用
(1) Morin分别处理Cal27. SCCI5细胞,以DMSO处理作为对照:检测 6127、SCC15细胞的克隆形成能力、EdU着色能力。
(2) Morin分别处理Cal27、SCC15细胞,以DMSO处理作为对照:流式细 胞术检测Cal27、SCC15的细胞周期分布和凋亡水平;Western blot检测Cal27. SCC15细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P53.P21,凋亡相关蛋白CASPASE-3、 CASPASE-9、BCL-2 的表达水平。
(3) Morin分别处理Cal27> SCC 15细胞,以DMSO处理作为对照:划痕实 验检测Cal27、SCC 15的迁移能力;Western blot检测Cal27、SCC15 ±皮■间质 转化相关的标志蛋白E-CADHERIN、VIMENTIN的表达水平。
(4) 裸鼠体内成瘤实验:生长状态良好的裸鼠20只,随机分为A、B两组, 每组10只,分别于裸鼠皮下注射Cal27、SCC 15细胞构建裸鼠体内成瘤模型。 A、E两组裸鼠分别随机分为Al、A2、Bl、B2组,每组5只,连续25天: Al、B1组裸鼠经尾静脉注射50mg/kg Morin,每日1次;A2、B2组裸鼠经尾 静脉注射与Al、B1组等剂量DMSO,每日1次。正常饲养25天后,处死裸 鼠,剥离肿瘤,瘤体称重、拍照。
3. Hippo通路介导Morin对OSCC细胞生物学行为调控作用的机制研究
(1) Morin分别处理Cal27、SCC15细胞,以DMSO处理作为对照:©Western blot检测通路中关键激酶MST1.M0B1蛋白表达水平和磷酸化水平,②Western blot检测通路的关键效应因子YAP蛋白的磷酸化水平,及其分别在细胞质、细 胞核内的表达水平,③免疫荧光染色检测YAP蛋白胞质胞核的亚细胞定位情况, ④RPPCR检测通路下游靶基因Ctgf、Cyr61> Ankrd的mRNA表达水平。
(2) 构建干扰和过表达Yap的Cal27. SCC15细胞,①EdU染色检测细胞的 增殖能力,②流式细胞术检测细胞的周期分布和凋亡水平,③划痕实验检测细 胞的迁移能力。
⑶构建干扰 MST1的Cal27、SCC15细胞,①Western blot检测 phospho・MSTl、phospho-MOBk phospho-YAP > cytoplasmic-YAP x nuclear-YAP 的蛋白表达水平,②Morin处理感染病毒后的OSCC细胞,分为0SCC+DMSO 组、OSCC+Morin 组、LV3-ctrbOSCC+Morin 组LV3-shMstl-OSCC+Morin 组: EdU染色检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞的周期分布和凋亡水平;划 痕实验检测细胞的迁移能力;Western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因 子P53、P21,凋亡相关蛋白CASPASE-3、CASPASE-9、BCL-2,上皮■间质转 化相关的标志蛋白E-CADHERIN、VIMENTTN的表达水平。
结果
L Morin对HOEC和OSCC的细胞毒性作用比较
(1) 与对照组相比,Morin对HOEC、Cal27、SCC15细胞均产生增殖抑制作用, 该抑制作用存在Morin剂量依赖性,且Morin的半数抑制浓度在正常口腔上皮 细胞显著高于OSCC细胞。
(2) 与对照组相比,Morin对HOEC、Cal27. SCC15细胞phospho-ERK表达均 有抑制作用,对phospho-ERK起到显著抑制作用的药物浓度,在Cal27和SCC15 细胞中显著低于HOEC细胞。
2. Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用
⑴Morin处理Cal27、SCC15细胞,与对照组相比:OSCC细胞克隆形成能力. EdU着色阳性率显著降低。
(2) Morin处理Cal27、SCC15细胞,与对照组相比:OSCC细胞周期岀现G1期 阻滞,P53、P21的蛋白表达水平显著上调;细胞的凋亡水平增加,凋亡蛋白 CASPASE-3. CASPASE-9的蛋白表达水平显著上调,抑凋亡蛋白BCL-2的蛋 白表达水平显著下调。
(3) Morin处理Cal27、SCC15细胞,与对照组相比:OSCC细胞迁移能力显著 下降,黏附因子E-CADHERIN表达显著上调、间质表型的标志蛋白VIMENTIN 表达显著下调。
(4) 裸鼠皮下移植OSCC细胞后,尾静脉注射Morin组与尾静脉注射DMSO组 相比,OSCC细胞在裸鼠体内形成的瘤体平均重量显著降低。
3・Hippo通路介导Morin对OSCC细胞生物学行为调控作用的机制研究
(1) Moriri处理Cal27、SCC15细胞,与对照组相比:MSTK M0B1总蛋白表达 水平不变,MST1、M0B1、YAP蛋白磷酸化水平升高,cytoplasmic-YAP蛋白 表达水平升高,nuclear-YAP蛋白表达水平下降;Ctgf. Cyr61、Ankrd的mRNA 表达水平下调。
(2) 干扰YAP的6127、SCC15细胞,与对照组细胞相比:增殖能力下降,细胞 周期发生阻滞,细胞凋亡水平上调,细胞的迁移能力下降;过表达YAP的Cal27、 SCC15细胞,与对照组细胞相比:增殖能力增强,细胞周期加速,细胞凋亡水 平下调,细胞的迁移能力增强。
⑶①干扰MST1的6127、SCC15细胞,与对照组细胞相比:MST1、MOBk YAP的磷酸化水平降低,cytoplasmic-YAP蛋白水平降低,nuclear-YAP蛋白水 平升高;②Morin处理感染病毒后的OSCC细胞,分为OSCC+DMSO组、 OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、LV3-shMstl-OSCC+Morin 组: LV3-shMstl -OSCC+Morin 组较 OSCC+Morin 组和 LV3-ctrl-OSCC+Morin 组,显 著逆转了 Morin处理OSCC细胞后EdU着色阳性率.细胞周期分布、细胞凋亡 水平及细胞迁移能力的变化。③Morin处理感染病毒后的OSCC细胞,分为 OSCC+DMSO 组、OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、 LV3-shMstl-OSCC+Morin 组:LV3-shMstl-OSCC+Morin 组较 OSCC+Morin 组 和LV3-ctrl-OSCC+Morin组,显著逆转了 Morin处理OSCC细胞后相关蛋白表 达水平的变化©
结论
1. Morin对HOEC、OSCC细胞均有细胞毒性作用,与正常口腔上皮细胞相比, OSCC细胞对Morin敏感性更强。
2. Morin对OSCC细胞生物学行为存在调控作用,具体表现为抑制OSCC细胞 增殖、阻滞细胞周期.促进细胞凋亡、抑制细胞迁移,抑制细胞在裸鼠体内成 瘤能力。
3. Morin在OSCC细胞中上调Hippo信号通路的磷酸化水平,下调关键效应因 子YAP蛋白在细胞核内的表达水平。Hippo通路的关键效应因子YAP对OSCC 细胞的生物学行为的具有重要的调控作用。干扰MST1,抑制了 Hippo通路磷 酸化水平,显著逆转了 Morin对OSCC细胞的调控作用,从而证实了 Morin对 OSCC细胞的调控活性中Hippo通路的重要介导作用。
关键词:Morin,口腔鳞状细胞癌,Hippo信号通路,YAP蛋白;
Effects of Hippo signaling pathway on Morin regulated
biological behavior of oral squamous cell carcinoma cells
Postgraduate: Yawen Ji
Speciality: Oral clinical Medicine
Tutor: XinXu
ABSTRACT
Bacl^roud and Objectives
Oral cancer is a common malignant tumor in the world, especially in developing countries. Among oral malignant tumors, oral squamous cell carcinoma (OSCC) accounts for the largest proportion, about 80%. Even though medical technology is constantly evolving, the mortality rate of OSCC is still relatively high. Statistics show tiiat the diseased population tends to be younger, and the overall prognosis of cancer is poor, with a survival rate of about 55% to 65%. The treatment of OSCC emphasizes the mode of comprehensive treatment, mainly based on surgery, supplemented by radiotherapy and chemotherapy. However, chemotherapeutic drugs have eflfects on both normal cells and tumor cells, and there is a dose-limiting toxic effect, and it is possible to induce drug resistance of tumor cells. Therefore, it is very important to screen and develop highly effective and low-toxic anti-tumor drugs.
Morin (3,597,2\4,-pentahydroxyflavone) is a pale-yellow flavonoid extracted from the mulberry plants such as yellow mulberry and mulberry orange. A variety of flavonoids have been demonstrated in research and have important potential medicinal properties. Morin can exert its important physiological functions such as anti-oxidation, anti-diabetes, anti-inflammatory, anti-hypertensive, anti-bacterial and neuroprotective by participating in various signaling pathways regulating cells. Morin has been shown to exert its anticancer activity in a variety of cancers. For example, Morin inhibits cancer cell proliferation by interfering with cell cycle and exerts anticancer activity in human colon cancer cells; Morin can induce apoptosis in prostate cancer, human leukemia HL-60 cells, and multiple myeloma cells.
Studies have confirmed that Morin is a biologically active compound with broad pharmacological activity and very low cytotoxicity. Therefore, exploring the regulation of Morin on OSCC cell biology and its molecular mechanism are important foundations for guiding us to screen and develop anti-tumor drugs for OSCC.
The Hippo signaling pathway is a highly conserved pathway that can play a role in tumor suppression in a variety of tumors. Hippo signaling pathway is a kinase cascade reaction chain composed of four important core kinases, MST1, SAV1, LATS1/2 and MOBla/b. Hippo signaling pathway regulates the subcellular localization of YAP by phosphorylation. Activation of the Hippo signaling pathway can restrict the downstream effector protein YAP to the cytoplasm by phosphorylating, where degrades YAP by ubiquitination; inactivation of the Hippo signaling pathway leads to decreased YAP phosphorylation levels and nuclear : enrichment, thereby affecting the transcriptional activity of a variety of downstream related factors plays a regulatory role in the biological behavior of cells. As a transcriptional coactivator, YAP protein is involved in the regulation of biological signals related to tumorigenesis. The increase of YAP protein level and nuclear 汇 localization can induce the development of various tumors. It has been reported that 和 Morin can inhibit the nuclear localization of YAP by activating the Hippo signaling pathway, and induce apoptosis of human hepatoma cells, tiiereby exerting the anti-cancer effect of Morin. It has also been confirmed that Morin can induce cell cycle arrest in human oral squamous cell carcinoma cells, thereby exerting a tumor suppressor effect. However, to date, studies on the anti-cancer effect of Morin in OSCC have been very limited, and the molecular mechanism of its anti-cancer effect in OSCC is still unclear and remains to be clarified・ Therefore, our study aimed to explore Morin's anti-cancer effect on OSCC in a more comprehensive and in-depth manner, and to verify whether Hippo signaling pathway get involve in the anti-cancer role of Morin in OSCC.
Materials and Methods
Oral squamous cell carcinoma cell lines Cal27 and SCC15 were selected as subjects to investigate the regulation of Morin on the biological behavior of OSCC and its potential mechanism.
1. Comparison of cytotoxic effects of Morin on normal oral epithelial cells (HOEC) and OSCC cells
HOEC and OSCC cells were treated with Morin, respectively, and cells treated with DMSO (dimethyl sulfoxide) were used as blank control. The cytotoxicity of Morin to HOEC and OSCC was detected by CCK-8, and tiie IC50 of Morin in HOEC and OSCC cells was calculated. The effect of Morin on the expression of phospho-ERK in HOEC and OSCC cells was detected by Western blot.
2. The regulation of Morin on the biological behavior of OSCC cells
The Cal27 and SCC15 cell lines were treated with different concentrations of
Morin, and the cells treated with DMSO were used as blank control:
(1) The Cal27 and SCC15 cell lines were treated with different concentrations of Morin, and the cells treated with DMSO were used as blank control: the effect of Morin on the colony forming ability and EdU positive rate of Cal27 and SCC15 were detected.
(2) The Cal27 and SCC15 cell lines were treated with different concentrations of Morin, and the cells treated with DMSO were used as blank control: cell cycle distribution and apoptosis of OSCC cells were detected by flow cytometry. The expression level of cyclin-dependent kinase inhibitors P53, P21; apoptosis-related proteins CASPASE-3, CASSASE-9, BCL-2 of Cal27 and SCC15 were detected by Western blot; thus to explore the regulation of Morin on OSCC cell cycle and apoptosis levels.
(3) The Cal27 and SCC15 cell lines were treated with different concentrations of Morin, and the cells treated with DMSO were used as blank control, and the migration ability of OSCC cells was detected by scratch test. The expression levels of E-CADHERIN and VIMENTIN which were the markers related to epithelial-mesenchymal transition in OSCC cells were detected by Western blot・
(4) Tumor formation capacity in nude mice: 20 nude mice with good growth status were randomly divided into A and B groups, with 10 rats in each group. The tumor models of nude mice were constructed with Cal27 and SCC15 cells respectively. The nude mice in group A and B were randomly divided into Al, A2, Bl and B2 groups, with 5 rats in each group: nude mice in group Al and group Bl were injected with 50 mg/kg Morin via tail vein once a day; nude mice in group A2 and group B2 were injected with the same dose of DMSO via the tail vein once a day. After 25 days of normal feeding, the nude mice were sacrificed, the tumor was removed, and the tumor was weighed and photographed. Thus, the effect of Morin on the tumor formation capacity of OSCC cells was verified.
3. The effects of Hippo signaling pathway in Morin regulated biological behavior of OSCC cells
(1) To investigate whether Morin has a regulatory effect on the activation level of Hippo pathway in OSCC cells, Cal27 and SCC15 cell lines were treated with different concentrations of Morin, and DMSO-treated cells were used as blank control:©Western blot was used to detect the key kinases MST1, MOB1 total protein level and phosphorylation level, ©Western blot was used to detect the phosphorylation level of the key effector YAI^ and its expression level in the cytoplasm and nucleus, ® immunofluorescence staining was used to detect the 亍 subcellular localization of YAP protein,④RT»PCR was used to detect the mRNA ? expression levels of CtgC Cyr61, Ankrd;
(2) To explore whether the key effector factor YAP of Hippo pathway mediates the regulation of the biological behavior of OSCC cells, and to indirectly speculate whether the Hippo pathway mediates the regulation of Morin on the biological behavior of OSCC cells, OSCC cells with silencing and overexpressing YAP were constructed: ®EdU staining was used to detect cell proliferation ability, ©flow cytometry was used to detect cell cycle distribution and apoptosis level, ③ scratch test was used to detect cell migration ability.
(3) To directly confirm the mediated role of the Hippo pathway in the regulation of Morin on the biological behavior of OSCC cells, Mstl-silenced OSCC cells were constructed.① Western blot was used to detect the expression level of phospho-MSTl, phospho-MOBl, phospho-YAP, cytoplasmic-YAP and nuclear-YAP;
so as to explore the effect of Mstl silencing on the activation level of Hippo pathway. ② Infbcted OSCC cells were treated with Morin, and cells were divided into OSCC+DMSO group, OSCC +Morin group, LV3-ctrl-OSCC+Morin group, LV3-shMstl -OSCC+Morin group: EdU staining was used to detect cell proliferation ability; Cell cycle detection and apoptosis level were detected by flow cytometry; cell migration ability was detected by scratch assay; Western blot was used to detected the expression level of P53, P21, CASPASE-3, CASSASE-9, BCL-2, E-CADHERIN, VIMENTIN.
Results
1. Comparison of the cytotoxicity of Morin on HOEC and OSCC
(1) Compared with the control group, Morin inhibited the proliferation of HOEC, Cal27 and SCC15 cells in a dose-dependent manner, and the half inhibitory concentration of Morin was much higher in HOEC than in the OSCC cells・
(2) Compared with the control group, Morin inhibited the expression of phospho-ERK in HOEC, Cal27 and SCC15 cells; and the concentration of Morin produced significantly inhibition in HOEC was much higher than in the OSCC cells.
2. The regulation of Morin on the biological behavior of OSCC cells
(1) The Cal27 and SCC15 cell lines were treated with different concentrations of Morin, and the cells treated with DMSO were used as blank control, with the increase of Morin concentration: cell clone formation ability and EdU positive rate decrease,
(2) The Cal27 and SCC15 cell lines were treated with different concentrations of Morin, and the cells treated with DMSO were used as blank control, with the increase of Morin concentration: cell cycle arrested in the G1 phase, and the protein expression level of P53 and P21 was significantly up-regulated. Cell apoptosis rate increased, and the protein expression level of CASPASE-3 and CASFASE-9 was significantly up-regulated, and the protein expression level of BCL-2 was significantly down-regulated.
(3) The Cal27 and SCC15 cell lines were treated with different concentrations of Morin, and the cells treated with DMSO were used as blank control, with the
increase of Morin concentration: the migration ability of OSCC cells decreased, the protein expression level of E-CADHERIN was significantly up-regulated, and the protein expression level ofVIMENTIN was significantly down-regulated.
(4) After subcutaneous transplantation of OSCC cells in nude mice, the weight of the tumor in Morin group was significantly lower than that of in the DMSO group.
3. Hippo pathway-mediated the regulation of Morin on the biological behavior of OSCC cells
(1) Cal27 and SCC15 cells were treated with different concentrations of Morin, the cells treated with DMSO were used as blank control. As the concentration of Morin increased: the results from Western blot showed that the total protein levels ofMSTl and M0B1 were unchanged, and the phosphorylation levels of MST1, M0B1 and YAP were increased. The level of cytoplasmic-YAP protein was increased, and the level of nuclear-YAP protein was decreased. Immunofluorescence staining showed^ that the cytoplasmic localization of YAP protein was increased. RT-PCR results^ showed that the transcription levels of CTGF, CYR61 and ANKRD were down-regulated.
(2) Silencing of YAP in Cal27 and SCC15 cells, compared with control cells: decreased proliferation ability, arrested cell cycle, up-regulated the apoptosis level;- decreased cell migration ability; overexpressing of YAP in Cal27 and SCC15 cells, compared with control cells: proliferative capacity was up-regulated, cell cycle was accelerated, apoptosis level was down-regulated, cell migration ability was enhanced.
(3) ®Compared with control cells, the Mstl-silenced OSCC cells had increased phosphorylation levels ofMSTl, MOB1, and YAP, increased levels of nuclear-YAP protein, and decreased levels of cytoplasmic-YAP protein; OOSCC cells infected with virus were treated with Morin, and cells were divided into OSCC+DMSO group, OSCC+Morin group, LV3-ctrl-OSCC+Morin group, LV3-shMst I -OSCC+Morin group: LV3-shMstl -OSCC+Morin group compared with OSCC+Morin group and LV3-ctrl-OSCC+Morin group partially reversed the changes of EdU staining positive rate, cell cycle distribution, apoptosis level and cell migration ability after Morin treatment; but LV3-shMst 1 -OSCC+Morin group compared witii the OSCC+ DMSO group, the cells did not return to the state before the Morin treatmen; ® OSCC cells infected with virus were treated with Morin, and cells were divided into OSCC+DMSO group, OSCC+Morin group, LV3-ctrl-OSCC+Morin group, LV3-shMstl -OSCC+Morin group: the results from Western blot showed that compared with OSCC+Morin group and LV3-ctrl-OSCC+Morin group, the LV3-shMst 1 -OSCC+Morin group reversed the changes of related protein expression levels caused by Morin-treatment; however; LV3-shMstl-OSCC+Morin group Compared with the OSCC+DMSO group, the expression level of the relevant protein did not return to the state before the Morin treatmen.
Conclusions
1. Morin has cytotoxic efifects on HOEC and OSCC cells, and has a stronger cytotoxic effect in OSCC cells.
2. Morin has a regulatory effect on the biological behavior of OSCC cells, which is specifically to inhibit cell proliferation, arrest cell cycle, promote apoptosis, and inhibit cell migration.
3. (1) Morin up-regulates the activation level of Hippo pathway in OSCC cells
(2) The key effector of the Hippo pathway, YAP, does have a regulatory effect on the biological behavior of OSCC cells. To some extent, indicated that the regulation of Morin on OSCC cells may be mediated by the Hippo pathway.
(3) By silencing Mstl in OSCC cells 9 inhibiting the activation level of Hippo pathway: partially reversing the regulation of Morin on OSCC cells, further directly confirming that the regulation of Morin on OSCC cells is mediated by Hippo pathway.
Keywords: Morin; OSCC cells; Hippo pathway
符号说明
符号 英文名 中文名
OSCC Oral squamous cell carcinoma 口腔鳞状细胞癌
HNSCC Head and neck squamous cell carcinoma 头颈部鳞状细胞癌
Morin 3,5s7,2*,4-pentahydroxyflavone 桑色素
HL-60 Human promyelocytic leukemia cell 人急性早幼粒白血病细胞
MST1 Mammalian STE20-like protein kinasei 哺乳动物STE20样蛋白激酶1
SAV1 Salvador kinase activator SAV激酶激活因子1
LATS1/2 Large tumor suppressorl/2 大肿瘤抑制基因1/2
MOBla/b MOB kinase activatorla/b Mobla/b激酶激活因子
YAP Yes-associated protein Yes相关蛋白
PBS Phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液
RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction 逆转录-聚合酶链反应
HOEC Human oral epithelial cell 人口腔上皮细胞
DEPC Diethyl pyrocarbonate 焦炭酸二乙酯
cDNA Complementaiy DNA 互补DNA
PMSF Phenylmethanesulfbnyl fluoride 苯甲基磺酰氟
PVDF Polyvinylidene Fluoride 聚偏氟乙烯
APS Ammonium persulfate 过硫酸钱
TBST Tris-buffered saline Tween 洗膜缓冲液
BSA Bovine serum albumin 牛血清白蛋白
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase 甘油醛•磷酸脱氢酶
OD Optical Density 光密度
P Probability value 概率值
EdU S-ethynyl^^deoxyuridine 5■乙烘基2脱氧尿唏陀核昔
ERK Extracellular regulated protein kinases 细胞外调节蛋白激酶
DMSO Dimethyl sulfoxide 二甲基亚矶
CTGF Connective tissue growth factor 结缔组织生长因子
CYR61 Cysteine-rich 61 富含半胱氨酸蛋白61
ANKRD Ankyrin repeat domain 锚蛋白重复结构域蛋白
PDT Photodynamic Therapy 光动力疗法
EMT Epithelial-mesenchymal transition 上皮间质转化
BCA Bicinchoninic acid assay 双辛丁酸法测定
前言
1 •口腔鱗状细胞癌
口腔癌最常见的发病部位是舌部,其次为牙龈、颊粘膜、口底、唇部。在 口腔癌中,90%以上为口腔鳞状细胞癌(OSCC) [l]o烟草、酒精、槟榔等均 是OSCC的致病因素,长期暴露于这些因素,会导致口腔粘膜的损伤,极大地 增加OSCC的发病风险[2]。吸烟者的OSCC发病风险较不吸烟者高4・7倍,若 吸烟同时兼具饮酒和咀嚼槟榔习惯者,OSCC发病风险增加20倍以上[3, 4]« 现如今全球每年约有64万OSCC的新发病例o根据数据统计,1990年死于OSCC 的人数约为8万4千人,至2013年该数据增长到13万5千人[5]。约60%的患 者在接受了 OSCC的程序化标准治疗后,会出现OSCC的复发。
OSCC的治疗应采取何种方式取决于多种因素,需要综合考量包括疾病的 进展阶段,疾病的病变部位和患者的全身健康状况等在内的多种因素。在1980 年之前,单纯的手术治疗,或手术联合放射治疗是晚期OSCC的首选治疗策略@ 然而,临床数据证实针对OSCC的传统治疗策略的疗效并不乐观。为了提高 OSCC的疗效和患者生存率,20世纪70年代中期,在OSCC的治疗策略中, 作为综合治疗的一部分引入全身化疗[6]°OSCC的一线化疗药物有顺钳,卡钳, 氟尿唸旋,多西他赛,紫杉醇等。这些化疗药物与放射治疗联合使用时,可以 在OSCC的治疗过程中产生协同作用。这种协同作用依赖于,放射线对化疗药 物具有增敏作用,与此同时,电离辐射所沉积的能量可以破坏治疗位点的肿瘤 细胞。
近年来,EGFR、COX-2抑制剂等治疗方式逐渐在OSCC的研究中开展[7]。 表皮生长因子受体(EGFR)是一种膜结合酪氨酸激酶受体,调控包括细胞增 殖、分化、存活和死亡在内的多种细胞行为。EGFR的过度表达被认为是促进 肿瘤发展,转移和化疗耐药的一个重要的因素[8,刃。在OSCC细胞中涉及多种 基因的突变,其中就包括了 EGFR的基因突变,与OSCC患者的不良预后有关 叨。在临床试验中证实,单独使用EGFR抑制剂或与放化疗联合使用可有效对 抗OSCC[10, 11]。EGFR抑制剂如Nimotuzumab和Cetuximab可以有效抑制 OSCC细胞的迁移和侵袭能力以及血管生成能力[12-14]c Nimotuzumab联合光 动力疗法(PDT)在OSCC移植瘤动物模型中,可显著下调EGFR, Ki-67和 CD-31的表达[15]oHiraishi等人开展的针对OSCC细胞的研究,评估了 AG1478
(EGFR抑制剂)与顺钳联合应用对OSCC细胞顺钳耐药性的影响,研究结果 表明抑制EGFR可增强OSCC细胞对顺钳的敏感性[16, 17]。
COX-2是一种环氧化酶,与正常细胞相比,在OSCC细胞中,COX-2 mRNA 的表达水平增加近150倍[18]。在OSCC细胞中过度表达的COX-2,抑制细胞 凋亡,有利于细胞逃避免疫监控,增加细胞迁移能力。因此,COX・2是OSCC 中重要的分子靶点。JTE-22 (COX-2抑制剂)可以通过抑制血管生成、端粒酶 活性和细胞周期,来限制OSCC移植瘤动物模型中肿瘤的进展[19]。研究表明, COX-2抑制剂在OSCC细胞中具有重要的抗迁移作用[20]0动物体内实验研究 表明,COX-2抑制剂可以抑制OSCC细胞的增殖,并且COX-2靶向疗法与化 学放射疗法具有协同作用[21]0 Minter等学者的研究表明,NS398 (COX-2抑 制剂)对OSCC细胞的增殖能力具有显著的抑制作用[22]Q Mohammad等学者 的研究结果表明,体内过渡表达COX-2的OSCC患者对化放疗的耐药性高于 体内COX-2表达不足的患者[23]o
即使医学技术在不断发展,OSCC患者的生存率仍未见明显改善。大部分 接受手术治疗的OSCC患者,常面临着程度不一的容貌丧失,言语问题,吞咽 困难,进食困难,听力丧失及上颌窦损伤等。而化学药物和放射疗法均存在重 要的缺陷,即非特异性细胞死亡,该缺陷会导致对肿瘤临近正常组织的破坏及 严重的全身毒副作用。EGFR、COX-2抑制剂等药物也存在一个重要的限制因 素,即患者容易产生耐药性。因此,面对OSCC的治疗,我们仍有很长的路要 走,对疾病发生发展精确分子机制的探索以及新药的研究开发具有非常重要的 临床意义。
2 •桑色素
许多天然化合物因其在肿瘤的化学治疗方面存在重要的药用价值,而逐渐 成为肿瘤研究领域的热点[24]。多项研究证实了植物来源的黄酮类化合物在抗 肿瘤方面的重要作用[25]。Morin作为一种黄酮类化合物,可以通过调节细胞内 多种生物信号发挥重要的生理作用[26-29],多项研究证实,作为具备生物活性 的化合物,Morin具有广泛的药理活性:其在抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等 方面均具备潜在的研究价值。
在抗氧化方面,许多黄酮类化合物是天然的抗氧化剂,可以作为抵抗活性 氧(ROS)的第一线细胞防御,Morin即是其中强有力的代表[30-33]o ROS参 与调节多种细胞生存相关的信号传导通路,当ROS的产生超过抗氧化酶的清除 活性时,细胞内的蛋白质.碳水化合物、脂质和核酸等重要的组分均会遭到破 坏[34]。体外实验表明,Morin可以保护肺成纤维细胞避免过氧化氢引起的细胞 内DNA损伤和脂质过氧化[35,36]。Kapoor R.等学者的研究表明,Morin可降 低高浓度葡萄糖在大鼠肝细胞内诱导的ROS水平,从而有助于维持线粒体完整 性,并防止DNA损伤[37]o
在抗炎方面,Morin作为有效的抗炎剂能够通过抑制巨噬细胞的活化,抑 制多种炎症因子的表达[38-42]o NF-kB是炎症过程中最重要的效应因子之一, 多项炎症相关的研究证明Morin可以显著抑制转录因子NF・kB的活性[43, 44]。 Morin可以显著降低LPS活化的巨噬细胞中TNF-a和IL-12等炎症因子的表达 [45]。
在抗菌活性方面,DNA解旋酶是细菌代谢和增殖所必需的酶,体外实验研 究表明,Morin可以抑制DNA解旋酶的酶活性[46,47]。Morin对多种食源性致 病菌表现出抗菌活性,其中包括大肠杆菌,李斯特菌,荧光假单胞菌,肠球菌, 金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌[48-52]。
在肿瘤的相关研究中,Morin所具备的抗肿瘤活性已引起广泛重视,亦得 到了深入的研究[53]。在前列腺癌LNCaP细胞和白血病HL・60细胞中,Morin 可以促进CASPASE-3和BAX的活化,引发细胞色素C从线粒体中释放并降低 抗凋亡因子BCL-2表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡[54,55]。在多发性骨髓瘤细胞 中,Morin可以通过STAT3信号通路的失活来诱导肿瘤细胞的凋亡[56]。在高 转移性MDA-MB-231乳腺癌细胞中,低剂量Morin给药即可降低N-cadherin, MMP-9的表达,有效降低肿瘤细胞的间质表型[57]。在二甲苯诱导乳腺癌的动 物实验中,Morin给药可以抑制二甲苯在实验大鼠体内诱导的氧化应激,有效 抑制肿瘤的发生、发展[58]。有研究报道,在人肝癌HepG2细胞中,Morin可 以通过激活Hippo信号通路阻止YAP核转位,从而发挥促进肿瘤细胞凋亡的作 用[59] °
3. Hippo信号通路
Hippo信号通路在维持组织器官大小、调节细胞增殖凋亡和肿瘤的发生发 展等方面具有非常重要的作用。Hippo通路是由MST1(mammalian sterile 20-like 1)、SAV1 (Salvador)x LATS1/2 (large tumor suppressorl/2 )> MOBla/b (MOB kinase activatorla^b)四个核心激酶组成的激酶级联反应链[60]。Hippo信号通路 激活时,MST1激酶与其接头蛋白SAV1结合,发生磷酸化被激活,随后作用 于LATS1/2和MOB1激酶,二者亦被磷酸化而激活。激活的激酶进一步通过磷 酸化作用于其下游的YAP蛋白(Yds・associated protein) [61]。磷酸化的YAP无 法从细胞质中易位进入细胞核,而滞留在胞质中[62]。滞留在胞质内的磷酸化 YAP大多被泛素化降解[60]。当Hippo通路组分突变、缺失或失活时,上游的 激酶级联反应不复存在,不能实现对YAP蛋白的磷酸化作用。未被磷酸化的 YAP蛋白会易位进入细胞核,在胞核中富集,发挥转录共激活因子的作用,以 促进有助于细胞增殖和存活的相关基因的表达[63,64〕。因此,Hippo通路的激 活状态决定着YAP蛋白的磷酸化水平和亚细胞定位,从而也决定着该通路在肿 瘤发生发展中的重要作用。
正常生理状态下,Hippo通路处于一种动态平衡,维持着细胞增殖.凋亡 以及机体内环境的稳定。当Hippo通路失活时,常导致YAP蛋白磷酸化水平降 低、胞核富集,该异常表现在多种肿瘤中均有报道。Zhang等学者研究发现, YAP的胞核富集能够促进前列腺肿瘤细胞的增殖、迁移能力,以及肿瘤细胞的 EMT转化[65]。Cao等学者报道,与正常肾组织相比,在肾癌组织中,Hippo 通路关键激酶呈低表达,YAP蛋白呈高表达,且YAP蛋白的表达水平与肾癌 的临床分期和分化密切相关[66]。已有研究报道,YAP在胃癌的发生、侵袭及 转移中有促进作用。Jiao等学者研究发现,通过激活Hippo通路,促进YAP蛋 白的磷酸化,抑制YAP与下游转录因子间的结合,可有效控制胃癌肿瘤细胞的 增殖能力[67, 68]。
综上所述,Morin的抗肿瘤活性在多项肿瘤相关的研究中被证实,Hippo 通路在肿瘤发生发展中也具有重要的调控作用。关于Morin在OSCC细胞中调 控作用的研究相对缺乏,本研究目的是探讨Morin在OSCC细胞生物学行为中 的调控作用,并探究在Morin对OSCC细胞的调节活性中是否有Hippo信号通 路的介导作用;以期为OSCC的治疗和筛选开发抗OSCC药物提供新的思路。
第一部分Moriii对正常口腔上皮细胞(HOEC)和OSCC细
胞的细胞毒性作用比较
口腔是进行咀嚼、吞咽、发音等生理功能的重要器官,在选择OSCC的治 疗方式时,必须综合考量多种因素,并且应根据每个患者的具体情况制定治疗 方案,以确保良好的生活质量和疗效。尽管肿瘤的诊断和治疗技术在飞速发展, OSCC的5年生存率却维持在50%以下[69]。因此,研究和开发针对OSCC经 济而有效的药物具有非常重要的临床意义。
黄酮类化合物因其具备重要的生物活性而成为药物研究领域的热点,其在 抗肿瘤方面的作用已被广泛证实。Morin是从桑科植物中分离得到的黄色色素 样黄酮类化合物,其经济成本低廉,具有多种生物活性和药理活性[70]。许多 研究的结果表明,Morin可以有效的调节肿瘤细胞的生物学行为并诱导肿瘤细 胞凋亡,抑制肿瘤的发生和进展[71]。Morin所具备的抗肿瘤活性在OSCC的相 关研究中具备潜在的研究价值。一些细胞学实验和动物体内研究证实/Morin 在具备多重生物活性和良好药理活性的同时,其细胞毒性非常低,并且具有肿 瘤细胞特异性。针对人早幼粒白血病细胞的研究证实,Morin对正常组织细胞 毒作用较肿瘤细胞弱[72]。大鼠体内药物毒性实验研究证实,约300至2400毫 克/千克体重的给药剂量,大鼠并没有出现不良反应。Morin高剂量持续给药13 周后大鼠亦没有表现出不良反应[73]。Gupta等学者对多发性骨髓瘤细胞进行的 研究表明,Morin使肿瘤细胞的凋亡率增加30%的同时,不影响正常细胞的活 力[74]©因此,本部分实验,检测了 Morin对正常口腔上皮细胞(HOEC)和 OSCC细胞增殖能力的影响,探讨了 HOEC和OSCC细胞对Morin的敏感性是 否存在差异,为进一步研究Morin在OSCC细胞中的调控作用提供基础。
材料和方法
1主要试剂和仪器
1.1主要试剂和耗材
(1) DMEM高糖培养基(Hyclone,美国)
(2) 0.25%胰蛋白酶(Gibco,美国)
<3)青霉素•链霉素溶液(Hyclone,美国)
(4) lxPBS 缓冲液(Hyclone,美国)
(5) 胎牛血清(FBS;Hyclone,美国)
(6) Morin (Sigma,美国)
(7) CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所,日本)
(8) 二甲基亚砚DMSO (索莱宝生物科技有限公司,中国上海)
(9) Western blot 试剂:
① 细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、广谱磷酸酶抑制剂(Boster生物工程有限公司, 美国)
② BCA蛋白浓度检测试剂盒(索莱宝生物科技有限公司,中国上海)
③ 聚偏二氟乙烯PVDF膜(Millipore,美国)
④ SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(Boster生物工程有限公司,美国)
⑤ 10%过硫酸鞍(APS)溶液:称量过硫酸鞍1 g溶于5 mL三蒸水,振荡充 分溶解后,用三蒸水定容,至10mL,混匀后按实验需求用量分装到1.5 mL的 EP管中,保存在・20 °C冰箱备用。
⑥ 10x Tris-glycine-SDS 电泳缓冲液:称量 15J5 g Tris, 94.5 g 甘氨酸,5 g SDS, 用三蒸水定容,至500 mL,用磁力搅拌器于室温搅拌,溶液充分溶解后即为 10x Tris-glycine-SDS电泳缓冲液,保存于室温。使用前用三蒸水稀释为 1 xTris-glycine-SDS 电泳缓冲液。
⑦ I0x Tris・glycine转膜缓冲液:称量15.15 g Tris, 72.5 g甘氨酸,用三蒸水定 容,至500 mL,用磁力搅拌器于室温搅拌,溶液充分溶解后即为10x Tris-glycine 转膜缓冲液,保存于室温。使用前将10x Tris-glycine转膜缓冲液、三蒸水、甲 醇、按1:7:2的体积比混合稀释,即得到为lxTris-glycine转膜缓冲液©
⑧ SxSDS-PAGE蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司,中国)
⑨ pH=7.5〜7.6的TBS缓冲液:称量L21 g Tris. &8 gNaCl,用三蒸水定容至 1000 mL,保存于室温备用。
⑩ TWEEN-20 (Boster生物工程有限公司,美国)
⑪TBST缓冲液:预先配制好的TBS缓冲液1000 mL中,加入1 mL TWEEN-20, 保存于室温备用。
⑫5%脱脂牛奶封闭液:称量脱脂奶粉lg,用TBST缓冲液定容至20 mL,室 温于震荡机上振荡,使其充分溶解,备用。
⑬ 蛋白相对分子质量 Marker 26616# (Thermo Fisher Scientific,美国)
⑭ 兔抗人 phospho-ERK 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
⑮ 辣根过氧化物酶标记的GAPDH抗体(ProteintechGroup,美国)
⑰ 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Cell Signaling Technology,美国)
⑱ECL化学发光试剂(Millipore,美国)
(10) 10 cm细胞培养皿、3 cm细胞培养皿、6孔细胞培养板、24孔细胞培养板、 96孔细胞培养板、移液管、细胞冻存管、15 mL离心管、50 mL离心管、1.5 mL EP管、一次性滤器、各种型号移液枪头(Coming,美国)
1・2主要仪器
(1) Heraguard™ ECO 高性能超净工作台(Thermo Fisher Scientific,美国)
(2) 细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific,美国)
(3) 倒置差相显微镜(OlympusCorporation,日本)
(4) 高压灭菌器MLS-3750型(Sanyo,日本)
(5) BP221S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司,德国)
(6) ZMQS50FOI型超纯水系统(Millipore,美国)
(7) 4 °C台式离心机(Thermo Fisher Scientific,美国)
(8) 4乜、-20乜冰箱(美的,中国)
(9) -80 QC冰箱(Sanyo,日本)
(10) 常温离心机(Heraeus,德国)
(11) 电热恒温水浴锅HHS型(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司,中国)
(12) HNDKT200-4型干式恒温金属浴(上海汗诺仪器有限公司,中国)
(13) SPECTROstar Omega全波长全自动多功能酶标仪(BMGLABTECH,德 国)
(14) Mini-PROTEAN® Tetra Cell 小型垂直电泳槽、PowerPac Basic Power Supply 基础型电泳电源、Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell 小型 Tmns-Blot转印槽、制胶器(BIO-RAD生命医学产品,美国)
(15) QYC-200型恒温数显摇床(上海福玛实验设备公司,中国)
(16) 90・2型恒温定时磁力搅拌器(上海精科科学仪器有限公司,中国)
(17) 全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司,中国)
(18) Eppendorf Research plus 0.1-2.5 pL、0.5-10 jiL、2-20(1L、10-100 yL、20-200 pLx 100-1000 yL、0.5・5mL、30-300 gL 移液器(Eppendrof,美国)
1.3细胞系
Cal27细胞:山东省口腔组织再生重点实验室
SCC15细胞:山东省口腔组织再生重点实验室
HOEC细胞:购买自中国深圳华拓生物科技有限公司
2实验方法
2.1细胞复苏.传代
迅速取出液氮罐中冻存的细胞,将冻存管放入37 °C水浴中,快速摇动,使 冻存液尽可能在最短的时间内融化。操作动作快速,使管内的冻存液在1分钟 内融化是细胞复苏成功的关键。用75%的酒精消毒管壁,并用清洁的擦手纸擦 干,放入超净工作台中(超净工作台每次使用前预先紫外线消毒至少30分钟), 将融化的冻存液移至15 mL离心管中,加入5 mL完全培养基(含10%FBS、 1% 100 U/mL青霉素-100 gg/mL链霉素的DMEM高糖培养基),放至于离心机 中1000 rpm离心5 min,离心过后吸掉上清液,用10 mL完全培养基重新悬浮 离心所得的细胞团,接种于10 cm培养皿中,放入含5% CO2的37 °C恒温细胞 孵育箱中培养,24小时后弃去旧培养液,“PBS缓冲液冲洗三遍,加入lOmL 新鲜的完全培养基,去除没有贴壁能力的细胞,之后每2天换液一次。待细胞 融合度达到80〜90%时,按1:3的比例传代,注意无菌操作。
2.2 Morin对HOEC和OSCC细胞的毒性作用比较
(1) 胰蛋白酶消化细胞后收集细胞于培养液中,对细胞悬液进行计数,调整细 胞悬液的细胞浓度以备用。在离心管中吹打重悬细胞,使细胞悬液充分混匀, 然后迅速将细胞接种于96孔板,每孔约3000个细胞,置于培养箱中培养过夜;
(2) 隔天,用DMSO溶解Morim将Morin溶液加入完全培养基中,配制其终 浓度达到实验设计各浓度,即0, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300 yM。用 100 pL含有不同浓度Morin的完全培养基给培养板中的细胞换液。以100 yL 含有等浓度DMSO的完全培养基为对照。每组设置5个复孔用于重复实验。设 置空白孔为等量不含细胞的完全培养基;
(3) 细胞继续置于细胞培养箱中培养48・72小时,每隔48小时更换培养基;
(4) 在48、72h时间点,每孔(包括空白孔)加入10 gL CCK-8溶液,避光放 置于细胞培养箱中孵育2小时;
(5) 用酶标仪检测在450nm处的吸光度值,并对数据进行分析。
23 Morin对HOEC和OSCC细胞ERK激活水平的影响
(1) 取生长状态良好的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后,细胞计数调整细胞悬液 浓度,以5x10'/孔接种于6孔板,每孔加2 mL完全培养基。
(2) 细胞在培养箱中培养过夜◎
(3) 吸净旧有培养基,lxPBS缓冲液冲洗细胞1次,将2 mL含有Morin浓度 分别为0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 pM的完全培养基加入6孔板中,每 种浓度设置3个复孔。对照组细胞加入含有等浓度DMSO的完全培养基。
(4) 将细胞培养板放于孵育箱中继续培养24 h。
(5) 提取每孔细胞的总蛋白。步骤如下^
① lxPBS缓冲液于冰上预冷。
② 每1 mL WPA裂解液加入10 pL PMSF和10 pL磷酸酶抑制剂。至于冰上, 备用。
③ 吸净细胞培养板中的旧有培养基,预冷的lxPBS缓冲液冲洗细胞3M;
④ 吸净PBS后,每孔加入配制好的裂解液200 pL,将细胞培养板置于冰上30min, 期间每隔10 min轻轻摇晃培养板,使裂解液与细胞充分接触,使细胞充分裂解。
⑤ 用细胞刮刀将细胞刮下,然后将每孔的细胞裂解液分别收集,吸入预冷的 l.SmLEP 管中。
⑥ 于4 °C离心机、12000 rpm离心5 min。
⑦ 离心后的上清液,即为提取的细胞总蛋白,吸取该上清液,放入提前预冷的 1.5mLEP管中,-80C冰箱保存备用。
(6) BCA法测定蛋白浓度。步骤如下:
① 准备工作液:将BCA试剂和Cu试剂加入干净的15mL离心管中,体积比为 50: 1,制备成为BCA工作液。
② 稀释标准品:lxPBS将lOgLBSA标准品稀释至100 pL至终浓度为0.5 mg/mLo 将0, 2, 4, 6, & 12, 16, 20吐标准品加入到96孔板的蛋白质标准品孔中, 并加入lxPBS至20吐。
③ 将样品用lxPBS缓冲液稀释10倍,取20吐加入样品孔中。
④ 向每个孔中加入200吐制备好的BCA工作溶液,上述孔板在37°C培养箱中 孵育30分钟。通过酶标仪测量562 nm处的吸光度以制备标准曲线。基于样品 孔的吸光度值和标准曲线计算样品的蛋白质浓度。
(7) 蛋白变性的步骤
① 预热金属浴至100乜。
② 将蛋白质样品与1/4体积的5XSDS-PAGE上样缓冲液混合,置于金属浴中, 在100 °C下变性5分钟。
(8) SDS-PAGE蛋白电泳步骤
① 将玻璃板清洗干净,经过三蒸水充分冲洗后,放入烤箱干燥,干燥后的玻璃 板待其温度降至室温后再使用,玻璃板使用时需在制胶架上夹紧。
② 分离胶的配制
a. 10%分离胶的配制,成分列表如下:
试剂 体积(此)
Distilled water 2700
Acr-Bis (30%, 29:1) 3300
Tris, 1.5 M, pH8・8 3800
SDS (10%) 100
APS (10%) 100
TEMED 4
b.分离胶灌制
将安装好的玻璃板置于较为水平的桌面上。在完成分离胶的配制后,用移 液枪将混合液吹打均匀,用5 mL移液枪吸取混合液体沿玻璃板边缘加入,胶 面高度到达5cm左右时停止,此时加入的液体体积大约为7.5 mL左右,在胶 上轻缓的加入三蒸水至玻璃板最高处,以起到液封的作用。室温下,静置约30 分钟左右,当三蒸水和胶之间出现一条明显可见的折射线时,说明分离胶已经 完成凝固过程,继而开始配制浓缩胶。
③ 浓缩胶的配制,成分列表如下:
试剂 体积(吐)
Distilled water 2100
Acr-Bis (30%, 29:1) 500
Tris, IM, pH6.8 380
SDS (10%) 30
APS (10%) 30
TEMED 3
④ 灌入浓缩胶用三蒸水将梳子清洗干净并晾干,在完成浓缩胶的配制后,用 移液枪将混合液吹打均匀,用5 mL移液枪吸取混合液体沿玻璃板边缘在分离 胶上部灌入,用浓缩胶将玻璃板灌满后插入梳子于浓缩胶中,注意动作轻缓, 以防止出现气泡。于室温静置约15 min左右,待浓缩胶完全凝固后,将梳子拔 出,然后将配置好的胶放入已加满lx电泳缓冲液的电泳槽。
⑤ 蛋白样本上样 取变性后的备用蛋白样品按分组顺序依次加入浓缩胶的样 品孔中,每组蛋白样本上样量为20 yg,样本孔两旁加入蛋白MarkeT,注意加 样要轻缓,避免样本溢出而发生各组间样本污染。
⑥ 电泳步骤
a. 蛋白的浓缩将电泳仪电压设置为60 V,蛋白浓缩时间在30 min左右, 电泳至漠酚蓝达浓缩胶和分离胶交界面且被浓缩成为一条直线。
b. 蛋白的分离将电泳仪电压设置为160 V,蛋白分离时间约为1 h,电 泳至漠酚蓝到达分离胶的最下缘时停止电泳。
(9) 转膜步骤
① 将转膜夹浸入装满lx转膜缓冲液的托盘中:平放阴极电极(黑色),平铺一 张海绵,海绵上平铺一层厚滤纸;将电泳结束的玻璃板从电泳槽中拿岀,轻柔 地撬动玻璃板,将短板玻璃板拆除后,用切胶刀将浓缩胶切掉,小心滑下分离 胶,胶的质地很易碎动作需轻柔,平铺于厚滤纸上;戴手套剪取与分离胶大小 相应的PVDF膜,并在膜上制作缺角以便在转膜过程中区分膜的正反面(与浓 缩胶直接接触的一面为正面),剪好的PVDF膜置于甲醇中浸泡激活。将激活 后的PVDF膜平铺在凝胶上,所制作的缺口放在左上角,这一步要确保膜和凝 胶之间没有任何气泡,否则会极大地影响实验结果;在PVDF膜上依次平铺覆 盖一层厚滤纸和一层海绵垫片,盖上阳极电极(红色),此时就准备好了转膜 所需要的“三明治”结构。
② 将“三明治”结构放入转膜槽中,转移夹阳极面对应电泳槽阳极位置,用lx 转膜缓冲液将转膜夹完全浸没,开通电源,调节仪器电压为100 V,转膜时间 大约为1 ho为防止转膜过程中产热对实验的影响,用冰块将转膜槽完全浸没。
(10) PVDF膜封闭、抗体孵育、显色步骤
① 转膜过程结束后,取出“三明治”结构中的PVDF膜,用lxTBST漂洗三 遍,每次5 min。
② 用预先配好的5%的脱脂牛奶浸泡PVDF膜,室温下,置于摇床上轻轻摇动 封闭1 ho
③ 用5%脱脂牛奶将一抗稀释至适当浓度,加入适量一抗于抗体孵育盒中,将 PVDF膜缺角位于左上即蛋白面朝下平铺于抗体液面上,平放在4 °C冰箱过夜。
④ 完成一抗孵育后,将PVDF膜浸入lxTBST液中,室温下,置于摇床上轻 轻摇动漂洗3遍,每次洗10 mino
⑤ 用5%脱脂牛奶将二抗稀释至适当浓度,加入适量二抗于抗体孵育盒中,将 PVDF膜浸泡于二抗液体中,室温下,置于摇床上轻轻摇动孵育1 h。
⑥ 完成二抗孵育后,将PVDF膜浸入lxTBST液中,室温下,置于摇床上轻 轻摇动漂洗3遍,每次洗10 min。
⑦ 配制适量ECL发光液,将PVDF膜平铺于显色板上,缺角位于右上,用滤 纸吸干多余水分,将适量的ECL发光液均匀滴加在PVDF膜上,然后置入成像 仪中显色。
C11)图像分析
用Image J软件分析蛋白条带的灰度值,计算目标蛋白条带灰度值与内参 条带灰度值的比值,标准化后作为实验结果©
2・4统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件,对实验数据做单因素方差分析,每项实验至少 重复三次,数据用均数土标准差表示,p<0.05为具有统计学意义。
结果
1. Morin对HOEC和OSCC细胞的细胞毒性作用比较
与对照组(DMSO组)相比,Morin对HOEC. Cal27、SCC15细胞均产生 增殖抑制作用,该抑制作用存在Morin剂量依赖性,即Morin浓度越高,毒性 作用越明显。与对照组相比,在Cal27、SCC15细胞中,从50 jiM起,Morin 对细胞产生显著的增殖抑制作用,差异有统计学意义(卩<0・05),且该差异随 Morin药物浓度升高而加大。与对照组相比,在HOEC细胞中,从100 pM起, Morin对细胞产生显著的增殖抑制作用,差异有统计学意义3<0.05),且该差 异随Morin药物浓度升高而加大。根据CCK8检测数据计算得到Morin的IC50,
Cal27: IC50=103・6±4・57 pM; SCC15:IC50=94.72±3.76 gM; HOEC: IC50=292.4 ±8.783 (图 1-1)。
2. Morin对HOEC和OSCC细胞ERK激活水平的影响
与对照组(DMSO 组)相比,Morin 处理 24 h 后,HOEC、Cal27> SCC15 细胞phospho-ERK蛋白表达水平均降低,且对phospho-ERK起到显著抑制作用 的药物浓度,在Cal27和SCC15细胞中显著低于HOEC细胞。与对照组相比, 从50pM起,随Morin浓度升高,Cal27> SCC15细胞phospho・ERK表达显著 降低,差异有统计学意义(p<0.05),且该差异随Morin浓度升高而加大;与对 照组相比,从150gM起,HOEC细胞phospho・ERK表达显著降低,差异有统 计学意义(p<0.05),且该差异随Morin浓度升高而加大(图1・2)。
讨论
Morin作为具备多重生物活性的黄酮类化合物,广泛存在于桑科植物中。 许多研究表明,Morin可以有效调节肿瘤细胞的生物学行为,诱导肿瘤细胞凋 仁 Morin所具备的抗肿瘤活性在OSCC的相关研究中具备潜在的研究价值。 但是,我们不可忽略所有化学药物均存在的重要缺陷,即非特异性细胞死亡及 全身毒副作用。然而,研究报道,Morin在发挥抗氧化,抗炎,抗菌,抗肿瘤 等重要生理作用的同时,其细胞毒性非常低。
本研究检测了 Morin对正常口腔上皮细胞HOEC和OSCC细胞CAL27、 SCC15增殖能力的影响,结果表明,Morin对HOEC和OSCC细胞均存在增殖 抑制作用,Morin的半数抑制浓度在HOEC细胞远高于OSCC细胞:Cal27: IC50=103.6gM; SCC15:IC50=94.72gM; HOEC: IC50=292.4gM° 这项研究数 据,与发表在2003年的一篇文献报道相符[75],该研究分析了多种黄酮类化合 物对正常口腔黏膜组织以及OSCC病变组织来源的原代培养细胞,细胞生长能 力的影响。该研究报道,来源于同一 OSCC患者的肿瘤细胞、癌旁组织细胞以 及正常口腔黏膜细胞作对比,通过DNA synthesis分析观察到了 OSCC细胞和 正常口腔黏膜细胞(NOMC)之间对Morin敏感性的差异。
由表皮生长因子受体EGFR调节的信号通路在细胞的增殖中起重要作用, 并且EGFR在OSCC细胞中常存在过渡表达。丝裂原活化蛋白激酶信号通路通 过响应EGFR导致ERK活化,是调控OSCC细胞增殖能力的重要途径[23]。因 此,本研究检测了 Morin是否能够影响OSCC细胞增殖能力重要的调节因子
ERK的活化。实验结果表明,Morin显著降低了 HOEC和OSCC细胞中 phosphsERK的蛋白水平,这与细胞增殖能力降低的表型相符。值得注意的是, 在OSCC细胞中观察到能够显著抑制phospho-ERK蛋白水平的Morin浓度显著 低于HOEC细胞。在Judith等学者的研究中[75], OSCC细胞经Morin处理24 小时后,在血清浓度为0.25%的培养基中饥饿18小时,加入EGF刺激15分钟 后用Western blot检测ERK的激活情况,结果显示Morin并没有通过EGF的处 理降低ERK的激活水平。这项研究与本实验结果存在不相符的情况,我们推 测Morin对细胞增殖能力的影响机制较为复杂,可能有多条细胞信号通路参与 其中,因此,Morin对细胞增殖能力的作用会受多种因素影响。除药物的浓度 外,实验研究过程中的细胞种类、细胞来源、细胞状态、实验条件的差异等也 可能是造成这些矛盾结果的原因。
综上所述,本部分的研究证实Morin的半数抑制浓度在HOEC细胞远高于 OSCC细胞;且在OSCC细胞中观察到显著抑制phospho-ERK蛋白水平的Morin 浓度低于HOEC细胞;该研究结果提示与正常的口腔上皮细胞相比,OSCC细 胞对Morin的敏感性更强。为进一步研究Morin在OSCC细胞中的调控作用提 供了基础,并且为开发高效、低毒的抗OSCC药物提供了希望。
第二部分Morin对OSCC细胞生物学行为的调控作用
OSCC发生发展涉及细胞内多种遗传物质的损伤,遗传物质的损伤会逐渐 导致细胞异常增生,随后发展成为细胞发育异常的表型,继而细胞增殖失调, 最终导致癌变。相关报道总结了肿瘤细胞最基本且关键的异常表型是:持续增 殖的生物信号,逃避生长抑制信号,逃避机体的免疫检査,侵袭和转移能力, 诱导血管生成的能力,细胞内遗传物质不稳定且易突变[76]。因此,肿瘤细胞 的克隆形成能力、增殖凋亡情况、细胞周期分布、细胞迁移能力、体内成瘤能 力等生物学行为是肿瘤相关研究中重要的检测指标。在本部分实验,针对Morin 在OSCC细胞以上生物学行为中的调控作用,做了全面的检测和分析。
材料和方法
1. 实验材料
1.1主要试剂
(1) 细胞培养试剂同第一部分。
(2) 细胞系:CAL27细胞、SCC15细胞(山东省口腔组织再生重点实验室)
(3) EdU细胞增殖染色试剂盒(锐博生物科技有限公司,中国广州)
(4) 细胞周期检测试剂盒(三箭生物科技有限公司,中国天津)
(5) AnnexinV・PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(联科生物技术股份有限公,中 国杭州)
(6) Western blot试剂同第一部分
(7) 4%多聚甲醛(索莱宝生物科技有限公司,中国)
(6) TritonX-100 (索莱宝生物科技有限公司,中国)
(7) 结晶紫染液(索莱宝生物科技有限公司,中国)
(8) 小鼠抗人 CASPASE-9 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
(9) 兔抗人 CASPASE-3 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
(10) 小鼠抗人BCL-2抗体(万类生物科技,中国)
(11) 兔抗人 P21 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
(12) 小鼠抗人P53抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,美国)
(13) 兔抗人 E-CADHERIN 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
(14) 兔抗人 VIMENTIN 抗体(Cell SigrmlingTechnology,美国)
(15) 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗(Cell Signaling Technology, 美国)
1.2主要仪器
(1) 与第一部分相同的仪器设备此处略
(2) Accuri C6 Plus 流式细胞分析仪(Bect(m,Dickinson and Company,美国)
(3) 荧光倒置显微镜(Olympus Corporation,日本)
13实验动物
5周龄雄性BALB/c免疫缺陷鼠,体重18*20g,购自北京维通利华实验动 物技术有限公司。
2实验方法
根据实验的第一部分结果计算得到药物的IC50, Cal27: IC50=103.6±4.57 gM; SCC15:IC50=94・72±3・76 pM,本部分实验采用的药物浓度为约等于两种 细胞 0.5 倍 IC50、IC50、2 倍 IC50 的低(50gM)、中(100pM)、高(150pM) 三种药物浓度。
2.1 Morin对OSCC细胞增殖能力的影响
2.1.1 Morin对OSCC细胞克隆形成能力的影响
(1) 取对数生长期且状态良好的CAL27、SCC15细胞,用0.25%胰酶消化后, 细胞计数,调整细胞悬液的浓度,以每孔2000个细胞接种于6孔板中,每孔 加入2 mL完全培养基,每个实验组设置3个复孔。
(2) 在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 隔天,按照试验设计方案,将2 mL预先配制好的含有Morin浓度分别为 50 gM、100 gM、150 pM的完全培养基加入6孔板相应的孔中。对照组加入 Morin浓度为0且含有等浓度溶剂DMSO的完全培养基。每3天进行一次细胞 换液,细胞持续培养2周。
(4) 吸弃孔板中旧的培养基,用lxPBS缓冲液轻柔地将细胞漂洗3遍。
(5) 在6孔板中,每孔加入1 mL细胞固定液(4%多聚甲醛),室温下,平置 15min,固定细胞。
(6) 吸弃固定液,"PBS缓冲液轻柔地漂洗细胞3遍。在6孔板中,每孔加入
2 mL结晶紫染色液,室温下平置30 min,进行染色。
(7) 吸弃染色液,"PBS缓冲液漂洗多余染液后,空气中干燥。
(8) 倒置显微镜下观察,对细胞数目N50的克隆进行计数,分析比较各个实验 组的克隆形成能力。
2.1.2 Morin对OSCC细胞EdU着色阳性率的影响
24.2.1细胞铺板
(1) 取对数生长期且状态良好的CAL27. SCC15细胞,用0.25%胰酶消化后, 细胞计数,调整细胞悬液的浓度,以每孔7xl04个细胞接种于24孔板中,每 孔加入200 pL完全培养基。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
2A.2.2药物处理
(1) 吸净旧有培养基,"PBS缓冲液冲洗细胞3遍。
(2) 按照试验设计方案,将500 gL预先配制好的含有Morin浓度分别为50即、
100 gM. 150 J1M的完全培养基加入24孔板相应的孔中。对照组加入Morin浓 度为0且含有等浓度溶剂DMSO的完全培养基。
(3) 将以上24孔板放置在细胞孵育箱中培养24h。
2.1.23 EdU 标记
(1) 用完全培养基按1000:1的比例稀释试剂A (EdU溶液),制备浓度为50 pM
EdU培养基; -
(2) 吸掉细胞培养板中的旧培养基,每孔加入200 pL含50 jiM EdU的鉛养基, 于细胞培养箱中孵育2小时;
(3) 吸净培养基,lxPBS冲洗细胞2遍,每次5分钟,将未渗入DNA的EdU 洗脱,以免影响实验结果。
2・1・2・4细胞固定
(1) 24孔板中每孔加入200pL4%多聚甲醛(细胞固定液),室温下平置,孵育
30 min。
(2) 吸弃固定液,24孔板中每孔加入200 pL2 mg/mL的甘氨酸溶液,室温下, 于摇床孵育5 min,中和孔板中的多聚甲醛溶液;
(3) 吸掉孔板中的甘氨酸溶液后,每孔加入200HL1XPBS缓冲液,室温下摇床 漂洗5 min后,吸掉孔板中的PBS;
(4) 24孔板中每孔加入200 gL含0.5% TritonX-100的PBS缓冲液(渗透剂), 室温下,于摇床上孵育10 min;吸弃渗透剂,lxPBS缓冲液,室温下于摇床上 漂洗5 min。
2.1.2.5 Apollo 染色
(1) 24孔板中每孔加入200 gL lx Apollo染色反应液,室温下,摇床孵育30 min, 从该步骤以后,EdU染色过程的剩余步骤均注意需要避光操作。孵育完成后, 吸弃孔板中的反应液。
(2) 24孔板中每孔加入200 gL含0.5% TritonX-100的PBS缓冲液(渗透剂), 室温下,于摇床上漂洗3遍,每次10 min;
(3) 吸弃渗透剂后,24孔板中每孔加入200 pL甲醇,室温下于摇床上漂洗两 遍,每次5 min。吸弃甲醇,lxPBS缓冲液漂洗5 mino
2丄2.6DNA染色
(1) 用三蒸水按100:1体积比稀释试剂F (Hoechst33342),制备lx Hoechst染 色液,注意避光操作。
(2) 24孔板中每孔加入200 [xLHoechst染色液,室温下,于摇床孵育30 min后, 吸弃染色液,注意操作过程避光进行。
(3) 24孔板中每孔加入200 pL lxPBS缓冲液,室温下于摇床上漂洗3遍,每 次 5 min。
2.1.2.7图像获取及分析
染色完成后,在尽量短的时间内于荧光显微镜下观察着色情况。Hoechst 染色液激发光为紫色,激发后呈蓝色;Apollo激发光为绿色,激发后呈红色; 二者叠加呈紫色,即为EdU阳性细胞。每组于荧光显微镜下,随机拍摄6个视 野,利用Image!软件统计每个视野中EdU阳性细胞占视野内总细胞的比例, 从而分析各个实验组细胞增殖活力。
2.2 Morin对OSCC细胞周期分布和凋亡的影响
2.2.1Morin对OSCC细胞周期分布的影响
(1) 取生长状态良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,细胞计数, 调整细胞悬液的浓度,以每孔7x10'个细胞接种于6孔板中,每孔加入2 mL 完全培养基。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 吸净旧有培养基。按照实验设计方案,将2 mL预先配制好的含有Morin 浓度分别为50 gM. 100 pM、150 gM的完全培养基加入6孔板相应的孔中, 每种浓度重复3个复孔。对照组加入Morin浓度为0且含有等浓度溶剂DMSO 的完全培养基。细胞在孵育箱中培养24阮
(4) 用0.25%胰酶消化收集细胞。用冰上预冷的"PBS缓冲液洗涤细胞,并离 心收集细胞,重复该步骤两遍。
(5) 细胞固定:用75%的预冷乙醇ImL重悬细胞团后,细胞悬液于4°C冰箱过 夜。
(6) 离心细胞悬液,吸弃乙醇固定液,预冷的lxPBS缓冲液洗涤细胞一遍。
(7) 每组细胞中加入500jiLPI/RNase染色工作液,轻柔吹打混匀,室温下孵育 30 min,该步骤注意避光操作。
(8) 用流式细胞分析仪,检测细胞的周期分布情况,分析并比较各实验组间的 差异。
2.22. Morin对OSCC细胞凋亡的影响
222.1流式细胞分析仪参数调节
(1) 分别收集IO'个CAL27、SCC15细胞,用预冷的"PBS缓冲液洗涤两遍, 经过离心弃缓冲液。
(2) 分别加入 500 Apoptosis Positive Control Solution 重悬细胞团,冰上孵育
30 mine
(3) 用预冷的lxPBS缓冲液洗涤一遍,经过离心弃缓冲液
(4) 加入预冷1 * Binding Buffer重悬细胞团,并加入细胞数量相同且未经处理 的正常细胞与之混合。加入预冷1 x Binding Buffer至1.5 mL,然后将细胞悬液 等分成三管,其中一管为空白对照、另外两管为单染Annexin V-PE或7-AAD 管。
(5) 单染管分别加入5 J11 Annexin V-PE或10 p.1 7-AAD,室温下孵育5 min,此 步骤需要避光操作。
(6) 在流式细胞仪上,用空白对照和两个单染管调节流式细胞分析仪的通道电 压和补偿参数。
2.2.22样本检测
(1) 取生长状态良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,细胞计数, 调整细胞悬液的浓度,以每孔7x105个细胞接种于6孔板中,每孔加入2 mL 完全培养基。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 隔天,吸净旧有培养基。按照试验设计方案,将2 mL预先配制好的含有 Morin浓度分别为50 pMx 100 pM、150 gM的完全培养基加入6孔板相应的孔 中,每种浓度重复3个复孔。对照组加入Morin浓度为0且含有等浓度溶剂 DMSO的完全培养基。细胞在孵育箱中培养48 h。
(4) 用0.25%不含EDTA的胰酶消化收集细胞。用冰上预冷的lxPBS缓冲液洗 涤细胞,并离心收集细胞,重复该步骤两遍。
(5) 用500山预冷的1 x Binding Buffer重悬细胞团。
(6) 每管中加入5 ^11 Annexin V-PE染液和10 gl 7-AAD染液。
(7) 轻柔地吹打混匀细胞悬液,室温下孵育5 min,此步骤注意避光操作。
(8) 用流式细胞分析仪检测,分析比较各实验组细胞凋亡率的差异。
2.3 Morin对OSCC细胞迁移能力的影响
(1) 取生长状态良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,细胞计数, 调整细胞悬液的浓度,以每孔9xl()5个细胞接种于6孔板中,每孔加入2 mL 完全培养基。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 隔天,用200皿黄色枪头于6孔板的每孔的中央处划一道直线,人为制造 细胞划痕。用”PBS缓冲液轻柔冲洗两次,清除划痕造成的脱落细胞。然后吸 净旧有培养基,按照实验设计将2 mL预先配制好的含有Morin浓度分别为50
100 pM. 150 pM的完全培养基加入6孔板相应的孔中,每种浓度重复3 个复孔。对照组加入Morin浓度为0且含有等浓度溶剂DMSO的完全培养基。 使用倒置显微镜拍照,每孔细胞沿细胞划痕自上至下取6个视野,将细胞置于 细胞孵育箱培养,分别于划痕后6小时和24小时,再次拍照。分析比较各组 细胞间划痕愈合差异。
2.4 Morin对OSCC细胞周期、凋亡、迁移能力相关标志蛋白表达的影响
(1) 取生长良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,以5x10'/孔接 种于6孔板中,每孔加入2mL完全培养基。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 吸净旧有培养基,"PBS缓冲液冲洗细胞1遍。
(4) 按照实验设计方案,将Morin终浓度分别为50 gM、100 pM. 150 gM的完 全培养基加入6孔板相应的孔中,每种浓度重复3个复孔。对照组加入Morin 浓度为0且含有等浓度溶剂DMSO的完全培养基。
(5) 将以上6孔板放置在细胞孵育箱中培养48 h。
(6) 提取每孔细胞的总蛋白蛋白提取步骤详见第一部分。
(7) BCA法测定蛋白浓度步骤详见第一部分。
(8) 蛋白变性步骤详见第一部分。
(9) 蛋白电泳步骤详见第一部分。
(10) 转膜 步骤详见第一部分。
(11) 封闭、抗体孵育.显色步骤详见第一部分。
(12) 图像分析步骤详见第一部分。
2.5 Morin对OSCC细胞裸鼠体内成瘤能力的影响
用Cal27、SCC15细胞构建裸鼠体内成瘤模型,实验前,裸鼠饲养于山东省 口腔组织再生重点实验室SPF室,裸鼠饲养严格遵从实验室实验动物相关的操 作规范。SPF室,空气经过万级过滤,温度恒定在21-25 °C,相对湿度为40・50%, 室内明暗周期为10:14小时。
(1) 取生长良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,收集细胞。
(2) 离心细胞悬液,弃上清收集细胞团,5PBS缓冲液重悬细胞,细胞计数,
并调整细胞浓度为107个/mL,备用。 :
(3) 生长状态良好的裸鼠20只,随机分为A、B两组,每组10只,75%酒精 消毒裸鼠双上肢腋下后部,A、B两组分别注射Cal27、SCC15细胞悬液于皮下, 每个位点接种200卩1细胞悬液。注意履行无菌操作的要求。
(4) 细胞种植完成后,A、B两组裸鼠分别随机分为Al、A2> Bl、B2组,每 组5只。连续25天:Al、B1组裸鼠经尾静脉注射50mg/kgMorin,每日1次; A2、B2组裸鼠经尾静脉注射与Al、B1组等剂量DMSO,每日1次。注意: 尾静脉注射前,酒精棉球擦拭注射点处,确认无误后缓慢注射。
(5) 正常饲养25天后,处死裸鼠,剥离瘤体、称重、拍照。
2.6统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件,两样本之间采用t检验,多个样本之间进行单 因素方差分析,实验至少重复三次,数据用均数士标准差表示,p<0.05视为有 统计学意义。
结果
1. Morin对OSCC细胞克隆形成能力的影响
与对照组(DMSO组)相比,Morin处理后Cal27、SCC15细胞形成的克 隆数目显著减少,差异有统计学意义(pVO.05)(图2-1),且该差异随Morin 浓度升高而加大。
2. Morin对OSCC细胞EdU着色阳性率的影响
在Cal27细胞中,DMSO组、50pM组、100 gM组、150 0 组的EdU阳 性率分别为:64.935 + 3.786%, 33.742±4.001%, 24.887±2.342%, 22.467 + 2.965%。在 SCC15 细胞中,DMSO 组、50 pM 组、100 pM 组、150 gM 组的 EdU 阳性率分别为:45.470土4.087%, 36.071+4.791%, 25.528土3.425%, 18.965 土&965%。与对照组(DMSO组)相比,Morin药物处理后,Cal27> SCC15 细胞EdU阳性着色细胞数与细胞总数比率显著降低,差异有统计学意义(p< 0.05),且该差异随Mofin药物浓度升高而加大(图2・2)。
3・Morin对OSCC细胞周期分布的影响
与对照组(DMSO组)相比,Morin处理后,Cal27. SCC15细胞周期均出 现G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低,发生G1期阻滞,差异有统计学意 义(pV0・05),该差异随Morin药物浓度升高而加大(图2-3)o Morin处理后, 与对照组(DMSO组)相比,Cal27> SCC15细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因 子P53、P21的蛋白表达水平显著上调,差异有统计学意义(pVO.05),该差异 随Morin药物浓度升高而加大(图2-3 )o
4・Morin对OSCC细胞凋亡的影响
与对照组(DMSO组)相比,Morin处理后,6127、SCC15细胞的早期凋 亡率与晚期凋亡率均升高,差异有统计学意义(pV0・05),该差异随Morin药 物浓度升髙而加大。与对照组(DMSO组)相比,Morin处理后,Cal27. SCC15 细胞凋亡蛋白CASPASE』、CASPASE-3的蛋白表达水平显著升高,且差异有 统计学意义(pV0.05);抑凋亡蛋白BCL-2的蛋白表达水平显著下降,且差异 有统计学意义(pV0・05)(图24)。
5. Morin对OSCC细胞迁移能力的影响
6h时,在Cal27细胞中,DMSO组、50gM组、100 gM组、150 pM组的 划痕愈合比率分别为:25.142+1.786%, 24.521 + 1.001%, 23.296±0.342%,
13.998±0.365%, DMSO组与150 gM组存在显著性差异(pV0・05);在SCC15 细胞中,DMSO组、50pM组、100 0 组、150 pM组的划痕愈合比率分别为: 25.180± 1.387%, 24.812±1.671%, 16.998±3.452%, 7.834+1.465%, DMSO 组与100 pM组、150 0 组存在显著性差异(p<0.05)o 24h时,在Cal27细 胞中,DMSO组、50pM组、100 pM组、150 pM组的划痕愈合比率分别为: 79.635 ±1456%, 65.986±3.033%, 54.694+3.249%, 53.877+2.985%;在 SCC15 细胞中,DMSO组、50gM组、100 pM组、150 pM组的划痕愈合比率分别为: 78.850+1.283%, 66.212+3.296%, 53.877土3.345%, 44.716±2.946%。24h 时, 各加药组与DMSO组均存在显著性差异,且该差异随药物浓度升高而更加显著 (p<0.05)o提示OSCC细胞经Morin处理后,细胞迁移能力显著降低。Morin 处理后,与对照组(DMSO组)相比,Cal27、SCC15细胞黏附因子E-CADHERIN 的蛋白表达水平显著增加、间质表型的标志蛋白VIMENTIN的蛋白表达水平显 著下降,且差异有统计学意义(p<0.05)(图2-5. 2・6)。 :
6. Morin对OSCC细胞裸鼠体内成瘤能力的彫响
裸鼠接种后第2天,注射区域见红肿。接种后第7天,红肿情况消退,大 部分裸鼠可观察到皮下有瘤体形成。接种后第10天,全部裸鼠可观察到皮下 有瘤体形成。截止25天时,处死全部裸鼠,剥离出瘤体,称重,拍照,统计 数据如下:①接种Cal27细胞+尾静脉注射DMSO组瘤体平均重量为83.630土 3.342mg,②接种Cal27细胞+尾静脉注射Morin组瘤体平均重量为51.783 + 4.238mg,③接种SCC15细胞+尾静脉注射DMSO组瘤体平均重量为79.903 + 5.472mg,④接种SCC15细胞+尾静脉注射Morin组瘤体平均重量为47.386土 3.342mgo①组与②组.③组与④组间差异均有统计学意义(pV0・05)(图2-7)。
讨论
正常生理状态下,细胞通过复杂的调节信号实现内环境稳定平衡的生存模 式。然而,肿瘤细胞内通常存在多种失调的生物信号,使细胞生物学行为呈现 自主且混乱的模式[77-80]。在肿瘤细胞中,常存在肿瘤抑制基因的突变失活, 继而产生肿瘤细胞增殖能力上调、凋亡率下降的表型。在60%的OSCC患者中 检测到抑癌基因P53的体细胞突变[81]o研究报道,P53体细胞突变的OSCC 患者的生存率明显低于P53体细胞野生型的OSCC患者[82]。P21蛋白是位于 P53蛋白下游的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子。P21可以和P53共同构成 细胞周期G1检查站,细胞发生DNA损伤后不经过修复则无法通过该检查站, 减少了受损DNA的复制和积累,从而发挥抑癌作用[83] o P21、P53在调节细 胞周期、细胞分化、DNA修复等方面具有非常重要的作用。P21在OSCC组织 内表达水平降低与患者的预后不良显著相关[84]。
肿瘤细胞具有逃避凋亡信号的能力,使其凋亡率明显低于正常组织细胞 [85]o细胞的凋亡存在外源性和内源性两种调控途径[86, 87]o外源性途径由肿 瘤坏死因子或Fas蛋白触发细胞膜上的凋亡诱导配体或Fas配体,从而激活凋 亡蛋白CASPASE-8、CASPASE-3o内源性通路由BCL-2蛋白家族调节,通过 线粒体细胞色素C的释放,刺激凋亡蛋白CASPASE・9、CASPASE-3的表达。 BCL-2蛋白可以通过抑制CASPASE-3, CASPASE-7和CASPASE-9的活性来抑 制细胞凋亡[88]o已有学者在OSCC细胞中观察到BCL-2蛋白的过度活化,并 证实这与OSCC患者的临床分期和预后不良有关[89]o
在解剖学上,口腔颌面部组织相对疏松,淋巴丰富、错综交互,OSCC容 易侵袭临近组织且淋巴转移率非常高。上皮■间质转化(EMT)的特征是上皮表 型减少和间质表型的获得,在肿瘤细胞的侵袭和迁移中起关键作用。存在EMT 转化的肿瘤细胞表现出细胞附着能力降低的同时,常伴随着E-CADHERIN. ZO-k OCCLUDIN等标志蛋白表达下调,以及VIMENTIN. N-CADHERIN、 DESMIN等间充质标记物的过度表达[90]。E-CADHERIN蛋白是维持正常上皮 细胞间粘连的关键蛋白,其表达水平下降是肿瘤细胞附着力下降、获得迁移能 力的重要标志。OSCC细胞中黏附因子E-CADHERIN表达下降,间质表型的标 志蛋白VIMENTIN过渡表达,是OSCC患者预后不良的重要分子机制[91]。
综上所述,OSCC发生发展相关的分子病理学因素已有了较为深入广泛的 研究。这些分子机制导致OSCC细胞生物学行为发生众多的异常改变,包括无 限制的增殖、细胞周期加速、逃逸细胞内凋亡信号、细胞间黏附能力下降等。 因此,开发和研究能够调控OSCC细胞异常生物学行为的药物,是治疗OSCC 的一个重要的思路。正如在论文前言中综述的内容,Morin的抗癌活性已在多 种肿瘤的相关研究中引起广泛重视,Morin可以减少DNA损伤,并参与调节多 种细胞增殖和分化相关的信号通路。
因此,本部分实验详细探究了 Morin在OSCC细胞多项生物学行为中的调 控作用。本研究结果显示,随着Morin药物浓度的升高,CAL27、SCC15细胞 的克隆形成能力、EdU着色阳性率显著降低;Morin可以引起OSCC细胞发生 周期阻滞,并诱导细胞凋亡率的增加;Morin使OSCC细胞的划痕愈合能力显 著降低,意味着肿瘤细胞迁移能力的减弱;另外,裸鼠体内成瘤实验证实,Morin 给药可以显著抑制裸鼠体内OSCC移植瘤的生长。以上对Morin处理后OSCC 细胞生物学行为的检测,有效的证实了 Morin对OSCC细胞的抑制作用。另外, 在分子生物学水平上,OSCC细胞经Morin处理后:细胞周期蛋白依赖性激酶 抑制因子P53、P21蛋白表达水平显著上调,抑凋亡蛋白BCL-2表达水平显著 下调,凋亡蛋白CASPASE-9、CASPASE-3蛋白表达水平显著上调,与OSCC 细胞EMT水平息息相关的黏附因子E-CADHERIN表达显著上调、间质表型的 标志蛋白VIMENTIN表达显著下调。本实验结果,从细胞表型和蛋白水平上, 均证实了 Morin在OSCC细胞生物学行为中的调控作用,为进一步探讨Morin 在OSCC细胞中的调控机制提供了研究基础。
第三部分Hippo通路介导Morin对OSCC细胞生物学行为调
控作用的机制研究
Hippo信号通路作为一条在维持组织器官的大小.调节细胞增殖凋亡等方 面具有非常重要作用的信号通路;近年来,其在肿瘤的发生发展中的作用受到 越来越多的重视,亦得到了广泛的研究。包括在乳腺癌;卵巢癌、结肠癌、肺 癌和肝癌等的研究中,大量研究证据表明,肿瘤组织内常存在Hipoo通路失调 导致的YAP蛋白磷酸化水平降低和核富集,且这种表型多与癌症的预后和生存 期存在密切相关性[92・94]。Wang等学者的研究报道,YAP在OSCC组织中呈 高表达,且主要表达在肿瘤细胞核中;MST1在OSCC组织中以低表达或不表 达居多。Hippo信号转导通路在众多种类肿瘤的发生发展中具有重要的调节作 用;在OSCC组织中Hippo通路组分存在异常表达;因此,我们有理由推测 Morin在OSCC细胞中的调控作用可能存在Hippo通路的介导。
为了验证我们的推测,本部分实验:首先检测了 Morin处理后是否引起 OSCC细胞Hippo通路关键蛋白表达的变化,以期验证Morin能否引起Hippo 通路激活水平的改变,其次,运用基因重组技术在OSCC细胞中干扰和过表达 Hippo通路的关键效应因子YAP,以期验证YAP对OSCC细胞生物学行为是否 存在调控作用;最后,通过基因重组技术干扰Hippo通路的上游关键激酶MST1, 抑制Hippo通路的磷酸化水平,检测Morin在OSCC中的调控作用是否被逆转, 以期验证Morin对OSCC细胞的调控活性中Hippo信号通路的介导作用。
材料和方法
1主要试剂和仪器
1.1主要试剂
(1) 细胞培养试剂同第一部分。
(2) 细胞系:CAL27细胞、SCC15细胞(山东省口腔组织再生重点实验室)
(3) RT-PCR相关试剂:
① Trizol裂解液(Takara宝日医生物技术有限公司,日本)
② PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒(Takara 宝日 医生物技术有限公司,日本)
③ TB Green™ Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)聚合酶链式反应试剂盒
(Takara宝日医生物技术有限公司,日本)
④ DEPC水(上海碧云天生物技术有限公司,中国)
(4) Western blot试剂详见论文第一部分。
(5) 细胞免疫荧光染色相关试剂
① TritonX-100 (索莱宝生物科技有限公司,中国)
② Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)绿色荧光二抗(上海碧云
天生物技术有限公司,中国)
③ 24孔细胞培养板细胞爬片(无锡耐思生物科技有限公司,中国)
④ DAPI细胞核染色液(上海碧云天生物技术有限公司,中国)
⑤ 免疫染色封闭液(上海碧云天生物技术有限公司,中国)
⑥ 抗淬灭封片剂(上海碧云天生物技术有限公司,中国)
(6) 亚细胞结构胞核与胞浆蛋白抽提试剂盒(Boster生物工程有限公司,美国)
(7) Polybrene (Sigma,美国)
(8) 病毒感染相关试剂
① 干扰Yap、Mst的慢病毒颗粒及阴性对照慢病毒颗粒(LV3・shYap、LV3・shMstl、
LV3-ctrl,上海吉玛制药技术有限公司,中国)
② 过表达Yap的慢病毒颗粒及阴性对照慢病毒颗粒(LV5-Yap、LV5-ctrl,上 海吉玛制药技术有限公司,中国)
LV3、LV5载体质粒图谱如下:
③ Puromycin (Thermo Fisher Scientific,美国)
④ Polybrene (上海吉玛制药技术有限公司,中国)
(9) EdU染色、细胞周期检测、细胞凋亡检测相关试剂见论文的第二部分
(10) 兔抗人 YAP 抗体(Cell Signaling Technology?美国)
(11) 兔抗人 phospho-YAP 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
(12) 兔抗人 MST1 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
(13) 兔抗人 phospho-MSTl 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
(14) 兔抗人 MOBI 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
(15) 兔抗人 phospho-MOBl 抗体(Cell Signaling Technology,美国)
1.2主要仪器
(1) 与前两部分实验相同的仪器,此处略。
(2) Nanodrop 分光光度计(Thermo Fishei* Scientific,美国)
(3 ) T-Gradient biometra梯度PCR仪(德国耶拿分析仪器股份公司,德国)
(4) LightCycler 480 高通量实时荧光定量 PCR 仪(Roche Life Science,美国) 2实验方法
2.1 Morin对OSCC细胞Hippo通路的影响
根据实验的第一部分结果计算得到药物的IC50, CaI27: IC50=103.6±4.57 gM; SCC15:IC50=94.72士3.76 gM,本部分实验采用的药物浓度为约等于两种细胞
0.5 倍 IC50、IC50、2 倍 IC50 的低(50gM)、中(lOOpiM)、高(150gM)三种 药物浓度。
2.1.1 Morin对OSCC细胞Hippo通路关键蛋白表达的影响
(1) 取生长良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,以5皿/孔接 种于6孔板中,每孔加入2mL完全培养基。
(2) 在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 吸净旧有培养基,"PBS缓冲液冲洗细胞1遍。
(4) 按照实验设计方案,将2mL预先配制好的含有Morin浓度分别为50 piM、
100 |1M、150 gM的完全培养基加入6孔板相应的孔中,每种浓度重复3个复
孔。对照组加入Morin浓度为0且含有等浓度溶剂DMSO的完全培养基。
(5) 将以上6孔板放置在细胞孵育箱中培养48 h。
(6) 提取每孔细胞的总蛋白蛋白提取步骤详见第一部分。
(7) BCA法测定蛋白浓度 步骤详见第一部分。
(8) 蛋白变性 步骤详见第一部分。
(9) 蛋白电泳 步骤详见第一部分。
(10) 转膜 步骤详见第一部分。
(11) 封闭、抗体孵育、显色步骤详见第一部分。
(12) 图像分析步骤详见第一部分。
2.1.2 Morin对OSCC细胞YAP蛋白亚细胞定位的影响
2. L2.1亚细胞结构胞核与胞浆蛋白抽提及电泳,分析YAP蛋白的亚细胞定位 情况
(1) 取生长良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,以1.5xlO6/IHL接 种于3 cm细胞培养皿中,每皿加入3 mL完全培养基。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 吸净旧有培养基,"PBS缓冲液冲洗细胞1遍。
(4) 按照实验设计方案,将3 mL预先配制好的含有Morin浓度分别为50 pM、
100 jiM、150 pM的完全培养基加入培养皿中,每种浓度重复3个复孔。对照 组加入Morin浓度为0且含有等浓度溶剂DMSO的完全培养基。
(5) 将以上细胞培养皿放置在细胞孵育箱中培养48h。
(6) lxPBS缓冲液于冰上预冷。
(7) 取出胞浆蛋白提取试剂和胞核蛋白提取试剂置于冰上,按照100:1的体积 比预先加入PMSF和磷酸酶抑制剂。
(8) 吸净细胞培养皿中的旧有培养基,预冷的WPBS缓冲液冲洗细胞3遍。
(9) 细胞刮刮下细胞,置于预冷的1.5mLEP管中,600 g离心5分钟,尽量吸 尽离心管中的上清液,细胞沉淀备用。
(10) 按照细胞沉淀与胞浆蛋白提取试剂A体积比为1:10的比例加入胞浆蛋白 提取试剂A,振荡混匀,使细胞沉淀完全分散开呈悬浮状态,置于冰上裂解10 min。
(11) 按照细胞沉淀与胞浆蛋白提取试剂B体积比为2: 1的比例加入胞浆蛋白 提取试剂B,振荡混匀,置于冰上裂解1 min。
(12) 再一次振荡EP管,16000 g离心5 min。
(13) 迅速吸取上清液,于预冷的L5 mLEP管中,即为得到的胞浆蛋白,・80°C 保存备用。
(14) 按照细胞沉淀与胞核蛋白提取试剂体积比为1:50的比例加入胞核蛋白提 取试剂,振荡混匀,使细胞沉淀完全分散开呈悬浮状态,置于冰上裂解40 min。 期间每10 min,振荡混匀一次。裂解完成后,16000 g离心5 min。
(15) 迅速吸取上清液,于预冷的1.5mLEP管中,即为得到的胞核蛋白,-80°C 保存备用。
(16) BCA法测定蛋白浓度 步骤详见第一部分
(17) 蛋白变性 步骤详见第一部分
(18) 蛋白电泳 步骤详见第一部分
(19) 转膜步骤详见第一部分
(20) 封闭、抗体孵育、显色步骤详见第一部分
(21) 图像分析步骤详见第一部分
2.1.2.2细胞免疫荧光染色,分析YAP蛋白的亚细胞定位情况
(1) 取生长状态良好的CAL27、SCC15细胞,用0.25%胰酶消化后,细胞计数, 调整细胞悬液的浓度,以每孔7xl04个细胞接种于24孔板中的细胞爬片上, 每孔加入200 pL完全培养基。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 吸净旧有培养基,lxPBS缓冲液冲洗细胞1遍。
(4) 按照试验设计方案,将500 gL预先配制好的含有Morin浓度分别为50 gM.
100 150 gM的完全培养基加入24孔板相应的孔中,每种浓度重复3个复
孔。对照组加入Morin浓度为0且含有等浓度溶剂DMSO的完全培养基。
(5) 将以上24孔板放置在细胞孵育箱中培养24 h。
(6) 洗净旧有培养基,4%多聚甲醛固定细胞10 min; 1><PBS缓冲液漂洗细胞3 遍,每次5 min。
(7) 0.5% TritonX-100处理细胞10 min; lxPBS缓冲液漂洗细胞3遍,每次5 min
(8) 免疫染色封闭液封闭30 min, lxPBS缓冲液漂洗细胞2遍。
(9) 按照1:100比例,用免疫染色封闭液稀释一抗,每孔滴加适量一抗,将含 有细胞爬片的孔板平置于4°C冰箱,孵育过夜。
(10) 第二天,孔板取出,lxPBS缓冲液漂洗细胞2遍。
(11) 按照1:500比例,用免疫染色封闭液稀释二抗,每孔滴加适量二抗,室温 下含有细胞爬片的孔板平置孵育1小时;此步骤注意避光操作。
(12) lxPBS缓冲液漂洗细胞3遍,每次5 min。
(13) 加入适量DAPI细胞核染色液,室温孵育5 min,此步骤注意避光操作。 lxPBS缓冲液漂洗细胞5遍,每次5 min,以去除多余的DAPI。
(14) 小心地将细胞爬片从孔板中取出,倒扣在滴加适量封片剂的载玻片上,该 步骤应注意载玻片与细胞爬片间不要产生气泡。
(15) 染色完成后,在尽量短的时间内于荧光显微镜下观察着色情况。DAPI染 色液激发光为紫色,激发后呈蓝色;荧光二抗激发光为蓝色,激发后呈绿色。 每张细胞爬片于荧光显微镜下,随机拍摄6个视野,根据视野中着色情况,分 析YAP蛋白的亚细胞定位情况。
2.13 Morin对OSCC细胞Hippo通路下游靶基因表达的影响
(1) 取生长良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,以5xlO5/?L^ 种于6孔板中,每孔加入2 mL完全培养基。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 吸净旧有培养基,lxPBS缓冲液冲洗细胞1遍。
(4) 按照实验设计方案,将2 mLMorin终浓度分别为50 gM、100 gM、150 gM 的完全培养基加入6孔板相应的孔中,每种浓度重复3个复孔。对照组加入 Morin浓度为0且含有等浓度溶剂DMSO的完全培养基。
(5) 将以上6孔板放置在细胞孵育箱中培养24h。
(6) OSCC细胞RNA提取步骤如下:
① 吸净旧有培养基,1*PBS缓冲液冲洗细胞3遍。
② 弃净缓冲液,每孔加入lmL的Trizol,室温下裂解5 min,将孔板内的全部 液体吸入无RNA酶的l.SmLEP管中。
③ 向EP管中加入氯仿200 gL,剧烈震荡15 s,于室温下静置5 mine
④ 4 °C超低温离心机,12000 rpm,离心15 min。
⑤ 离心后,管内液体明显分为三层,需要提取的RNA是位于上层水相中。保 证上层水相不被中间层和下层水相污染的情况下,轻缓地吸取上层水相移入另 一新的无RNA酶的1.5mLEP管中。吸取上层水相时,注意记录获得的液体体 积。
⑥ 在上一步获得的液体中加入等体积异丙醇,盖上盖子,上下颠倒EP管,使 管内液体充分混匀,室温下静置10min;
⑦ 4°C超低温离心机,12000 rpm,离心10mim
⑧ 取出EP管,可见管底有少量白色半透明胶冻状物质,即为RNA沉淀,小 心吸净EP管内上清液。动作仔细轻缓,勿触碰到白色RNA沉淀。
⑨ DEPC水配制75%乙醇于冰上预冷后,每支EP管内加入1 mL,反复颠倒 EP管漂洗白色RNA沉淀。
⑩ 4 °C超低温离心机,12000 rpm,离心5 min。
⑪ 彻底吸净上清,动作仔细轻缓,勿触碰到白色RNA沉淀,打开EP管盖子, 于室温下干燥2〜5 mine
⑫ 根据获得的白色RNA沉淀的体积适量加入DEPC水,使白色的RNA沉淀 充分溶解,得到的即为RNA溶液,于-80 °C冰箱储存备用。
(7) RNA样本浓度及纯度测定步骤:
① 打开Nanodrop分光光度仪,选择RNA测量模式。
② 用稀释RNA所用的DEPC水做空白对照,调零。
③ 吸取1 yLRNA样本于Nanodrop探测头上,测定样本的浓度和纯度,每个 样本测量三次后取平均值,260 nm/280 nm OD值的比值在1・8〜2.0之间的RNA 样本作为合格样本,储存备用。记录每个样本的浓度。
(8) 反转录步骤:以1.0 pg RNA样本作为模板,使用PrimeScript™ RTreagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒反转录获取cDNA。以下步骤全程需在冰上 操作:
① 将下表中的试剂于无RNA酶的200 gLEP管中充分混合:
名称 剂量
5xDNA Eraser Buffer 2.0 [iL
gEraser 1.0 gL
RNA样本 1.0 Mg
用无RNA酶的蒸憾水将管中液体体积补齐至10 pLo
② 将上一步的EP管放入T-Gradient biometra梯度PCR仪中进行反转录反应的 第一步,反应条件是:42 °C,作用2 min;降温至4 °C取出。
③ 取出PCR仪中的EP管,置于冰上,将下表中的试剂加入管中:
名称 剂量
SxReaction Buffer 4 jiL
PrimeScript RT Enzyme Mix 1 pL
RT Primer Mix 1 gL
无RNA酶的蒸憎水 4yL
④ 将上一步的EP管放入T-Gradient biometra梯度PCR仪中进行反转录反应的 第二步,反应条件是:
37 9 作用 15 min;
85 X: 作用 5 s;
降温至4°C取出。
⑤ 每个样本经过上述反转录反应得到20 jiL的cDNA样本,cDNA样本存储 于-8(TC备用。
(9) TB Green™ Premix Ex laq™ (Tli RNaseH Plus)聚合酶链式反应试剂盒进行 PCR扩增,本实验所用到的引物序列:
Gapdh 5f-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3T
5,-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3,
Ctgf 5,-TCTCCAACCTCTCCTACTAC-3,
5LGCACGTAGTTTCGATCACT・3‘
Ctr61 5JCCTTGTGGACAGCCAGTGTA3
5,-ACTTGGGCCGGTATTTCTTC-3,
Ankrd 5 JAGTAGAGGAACTGGTCACTGG-引
5T-TGGGCTAGAAGTGTCTTCAGAT-3,
本实验用到的引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成,引物以冻干 粉状态常温运输。使用前,首先用超速离心机12000 rpm,离心5 min。然后, 用适量三蒸水将引物溶解,制备成100 J1M的引物溶液,储存于・20 9冰箱备用。
使用时,引物的终浓度为10HMO
按照以下剂量配制反应体系:
名称 体积
三蒸水 7.2 pL
cDNA样本 2pL
上游引物 0.4 pL
下游引物 0.4 jiL
Master混合物 10 nL
使用LightCycler480高通量实时荧光定量PCR仪进行扩增,反应条件为:
95 °C 作用 30 s;
95 °C 作用 5 s;-
60 X: 作用35 s; — 45个循环
95 °C 作用 15 s; 一
60 °C 作用 1 min。
反应完成后,分析结果。
2・2 Hippo通路关键效应因子YAP对OSCC细胞生物学行为的调控作用
2.2.1慢病毒感染
(1) 取生长良好的CAL27和SCC15细胞用0.25%胰酶消化后,以5x"个/孔 接种于6孔板中,每孔加2 mL完全培养基,于细胞培养箱孵育过夜。
(2) 第二天,OptLMEM冲洗细胞三遍。
(3) 按病毒使用说明书推荐,选择适合的MOI值,完全培养基稀释病毒原液, 将病毒液加入6孔板,同时加入5 pg/mL polybrene,每组三个复孔©
(4) 培养箱内孵育6 h, lxPBS缓冲液漂洗细胞,加入不含双抗的完全培养基 培养96h。
(5) 将上述感染过后的细胞中,加入含Puromycin (Puromycin的浓度应确保一 周内杀死未被感染的OSCC细胞)的完全培养基,继续培养。
(6) 继续培养一周,待细胞筛选结束后,更换新鲜的完全培养基继续培养,用 于后实验。
2.2.2慢病毒感染后,YAP干扰和过表达效果评价
慢病毒感染后的细胞分组为:
干扰Yap组过表达Yap组
CAL27细胞 LV3-shYap-CAL27 LV5-Yap-CAL27
LV3-ctrl-CAL27LV5-ctrl-CAL27
SCC15细胞 LV3-shYap-SCC15 LV5-Yap-SCC15
LV3-ctrl-SCC15LV5-ctrl-SCC15
2.221感染后,OSCC细胞Mp基因表达水平
(1)感染后的细胞0.25%胰酶消化,以7x"个/孔接种于6孔板中,每孔加2 mL 完全培养基,于细胞培养箱培养24 h。
(2) 弃旧的培养基,lxPBS缓冲液冲洗细胞3遍。
(3) 提取细胞RNA、反转录、PCR扩增步骤详见本论文第三部分的第2.L3 章节,本实验用到的引物序列委托上海生工生物工程股份有限公司合成:
Gapdh 5l-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3,
5,-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3,
Yap 5,-TCTTACACCGTGCTGCCATT.3,
5*-AGCACTGTGCCAGGTATCAC-3*
2.2.22感染后,OSCC细胞YAP蛋白表达水平
(1) 感染后的细胞0.25%胰酶消化,以7x105个/孔接种于6孔板中,每孔加2 mL 完全培养基,于细胞培养箱培养24 ho
(2) 弃旧的培养基,lxPBS缓冲液冲洗细胞3遍。
(3) 蛋白提取、浓度测定、变性、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育、
显影、图像分析具体步骤详见论文的第一部分。 ”
2.2.3 YAP对OSCC细胞生物学行为的调控作用
2.23.1 YAP对OSCC细胞EdU着色阳性率的影响
(1) 胰蛋白酶消化感染后的细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行计数,调整 细胞悬液的细胞浓度以备用。以每孔7xl04个细胞接种于24孔板中尸每孔加 入200 gL完全培养基,每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养24 h。
(3) EdU标记、细胞固定、Apollo染色、DNA染色、图像获取及分析 详细步 骤见文章第二部分的第2.1.2章节。
2.23.2 YAP对OSCC细胞周期分布的影响
(1) 胰蛋白酶消化感染后的细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行计数,调整 细胞悬液的细胞浓度以备用◎以每孔7x105个细胞接种于6孔板中,每孔加入 2 mL完全培养基,每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养24h。
(3) 细胞收集、洗涤、固定、染色、上机检测 步骤详见论文第二部分的第221 章节
2.23.3 YAP对OSCC细胞凋亡的影响
(1) 流式细胞仪的参数调节 步骤详见论文第二部分的第2.2.2.1章节
(2) 胰蛋白酶消化感染后的细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行计数,调整 细胞悬液的细胞浓度以备用。以每孔7x10'个细胞接种于6孔板中,每孔加入 2 mL完全培养基,每组设置3个复孔用于重复实验。
(3) 细胞在细胞孵育箱中培养48 h
(4) 细胞收集、染色、上机检测步骤详见论文第二部分的第222.2章节
2.23.4 YAP对OSCC细胞迁移能力的影响
(1) 胰蛋白酶消化感染后的细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行计数,调整 细胞悬液的细胞浓度以备用。以每孔9x105个细胞接种于6孔板中,每孔加入 2 mL完全培养基,每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) 用200卩1黄色枪头于6孔板的每孔的中央处划一道直线,人为制造细胞划 痕。用lxPBS缓冲液轻柔冲洗两次,清除划痕造成的脱落细胞。加入2mL完 全培养基使用倒置显微镜拍照,每孔细胞沿细胞划痕自上至下取6个视野,将 细胞置于细胞孵育箱培养,于划痕后24小时,再次拍照。分析比较各组细胞 间划痕愈合差异。
2.3干扰MST1对Morin在OSCC细胞中调控作用的影响
23.1干扰MST1的OSCC细胞模型的建立
2.3.1.1慢病毒感染 详细步骤见本论文第三部分的第221章节
2.3.L2慢病毒感染后,MST1干扰效果评价
23.1.2.1感染后,OSCC细胞Mstl基因表达水平
(1) 感染后的细胞0.25%胰酶消化,以7乂1()5个/孔接种于6孔板中,每孔加2 mL 完全培养基,于细胞培养箱培养24阮 每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 弃旧的培养基,"PBS缓冲液冲洗细胞3遍。
(3) 提取细胞RNA、反转录.PCR扩增 步骤详见论文第三部分的第2.L3章节, 本实验用到的引物序列委托上海生工生物工程股份有限公司合成:
Gapdh 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3,
5,-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3,
Mstl 5JTCCGAGTAGCCAGCACCATGACO
5l-AGTTCCTTCCTCTTCCTCATCCTCTG-3,
2.3.12.2感染后,OSCC细胞MST1蛋白表达水平
(1) 感染后的细胞0.25%胰酶消化,以7x"个/孔接种于6孔板中,每孔加2 mL 完全培养基,于细胞培养箱培养24 h。每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 弃旧的培养基,WPBS缓冲液冲洗细胞3遍。
⑶ 蛋白提取、浓度测定、变性、SDS-PAGE电泳*转膜、封闭、抗体孵育、 显影、图像分析具体步骤详见论文的第一部分。
23.2干扰MST1对OSCC细胞Hippo通路关键蛋白表达的影响
(1) 感染后的细胞0.25%胰酶消化,以7x105个/孔接种于6孔板中,每孔加2 mL 完全培养基,于细胞培养箱培养24肌每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 弃旧的培养基,WPBS缓冲液冲洗细胞3遍。
(3) 蛋白提取、浓度测定、变性、SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、抗体孵育、 显影、图像分析具体步骤详见论文的第一部分。
233干扰MST1对Morin在OSCC细胞中调控作用的彭响
实验分为四组:OSCC+DMSO 组、OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、 LV3-shMstl-OSCC+Morin组;根据实验的第一部分结果计算得到药物的IC50, Cal27: IC50=103.6±4・57pM; SCC15:IC50=94.72土3.76pM,本部分实验采用 的药物浓度为约等于两种细胞IC50的药物浓度(lOOgM)o
2.33.1干扰MST1,对Morin在OSCC细胞EdU着色阳性率调控作用中的影 响
(1) 按照上述分组,胰蛋白酶消化各组细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行 计数,调整细胞悬液的细胞浓度以备用。以每孔7xl04个细胞接种于24孔板 中,每孔加入200 “L完全培养基,每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 细胞在孵育箱中培养过夜。
(3) OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、LV3-shMstl-OSCC+Morin 组 细胞每孔加入200 gL Morin终浓度为100 pM的完全培养基;OSCC+DMSO组 每孔加入200 jiL与前三组含等量DMSO的完全培养基。
(4) 细胞在细胞孵育箱中培养24 h°
(5) EdU标记、细胞固定、Apollo染色、DNA染色、图像获取及分析 详细步 骤见论文第二部分的第2.1.2章节。
23.3.2干扰MST1,对Morin在OSCC细胞周期分布调控作用中的影响
(1) 按照上述分组,胰蛋白酶消化各组细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行 计数,调整细胞悬液的细胞浓度以备用O以每孔7X105个细胞接种于6孔板中, 每孔加入2 mL完全培养基,每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 细胞在孵育箱中培养过夜。
(3) OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、LV3-shMstl-OSCC+Morin 组 细胞每孔加入2 mL Morin终浓度为100 的完全培养基‘ OSCC+DMSO组每 孔加入2 mL与前三组含等量DMSO的完全培养基。
(4) 细胞在细胞孵育箱中培养24 h。
(5) 细胞收集、洗涤、固定、染色、上机检测步骤详见论文第二部分的第221 章节。
23.3.3干扰MST1,对Moriii在OSCC细胞凋亡调控作用中的影响
(1) 流式细胞仪的参数调节步骤详见论文第二部分的第2.2.2.1章节
(2) 按照上述分组,胰蛋白酶消化各组细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行 计数,调整细胞悬液的细胞浓度以备用o以每孔7xl05个细胞接种于6孔板中, 每孔加入2 mL完全培养基,每组设置3个复孔用于重复实验。
(3) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(4) OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、LV3-shMstl-OSCC+Morin 组 细胞每孔加入2 mL Morin终浓度为100 gM的完全培养基;OSCC+DMSO组每 孔加入2 mL与前三组含等量DMSO的完全培养基。
(5) 细胞在细胞孵育箱中培养48h。
(6) 细胞收集、染色、上机检测步骤详见本论文第二部分的第2.2.2.2章节 2,33,4干扰MST1,对Morin在OSCC细胞迁移能力调控作用中的影响
(1) 按照上述分组,胰蛋白酶消化各组细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行 计数,调整细胞悬液的细胞浓度以备用。以每孔9X105个细胞接种于6孔板中, 每孔加入2 mL完全培养基,每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 细胞在孵育箱中培养过夜。
(3) 用200 ixL黄色枪头于6孔板的每孔的中央处划一道直线,人为制造细胞划 痕。用lxPBS缓冲液轻柔冲洗两次,清除划痕造成的脱落细胞。每孔细胞沿细 胞划痕自上至下取6个视野。
(4) OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、LV3-shMstl-OSCC+Morin 组 细胞每孔加入2 mL Morin终浓度为100 gM的完全培养基;OSCC+DMSO组每 孔加入2 mL与前三组含等量DMSO的完全培养基。将细胞置于细胞孵育箱培 养,于划痕后24小时,再次拍照。分析比较各组细胞间划痕愈合差异°
233.5干扰MST1,对Morin在OSCC细胞周期、凋亡、迁移能力相关标志 蛋白表达调控作用中的影响
(1) 按照上述分组,胰蛋白酶消化各组细胞,收集细胞悬液,对细胞悬液进行 计数,调整细胞悬液的细胞浓度以备用。以5x10*孔接种于6孔板中,每孔加 入2mL完全培养基。每组设置3个复孔用于重复实验。
(2) 细胞在细胞孵育箱中培养过夜。
(3) OSCC+Morin 组、LV3-ctrl-OSCC+Morin 组、LV3-shMstl-OSCC+Morin 组 细胞每孔加入2 mL Morin终浓度为lOOgM的完全培养基;OSCC+DMSO组每 孔加入2 mL与前三组含等量DMSO的完全培养基。
(4) 将以上6孔板放置在细胞孵育箱中培养48 h.
(5) 提取每孔细胞的总蛋白蛋白提取步骤详见第一部分。
(6) BCA法测定蛋白浓度 步骤详见第一部分。
(7) 蛋白变性步骤详见第一部分。
(8) 蛋白电泳步骤详见第一部分。
(9) 转膜 步骤详见第一部分。 汀
(10) 封闭、抗体孵育、显色步骤详见第一部分。
(11) 图像分析步骤详见第一部分
2・4统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件,两样本之间釆用I检验,多个样本之间进行单 因素方差分析,实验至少重复三次,数据用均数土标准差表示,p<0.05为有统 计学意义。
结果
LMorin对OSCC细胞Hippo通路的影响
1.1 Morin对OSCC细胞Hippo通路关键蛋白表达的影响
Hippo通路的关键激酶MSTk MOB1的蛋白表达水平没有发生变化(图 3-1);激酶MST1、MOB1的磷酸化水平明显升高,与DMSO组相比,差异有 统计学意义(p<0.05),该差异随Morin药物浓度升高而加大(图3-1);且Hippo 通路关键效应因子YAP的磷酸化水平明显升高,与DMSO组相比,差异有统 计学意义(pV0・05),该差异随Morin药物浓度升高而加大(图3-1 )o
1.2 Morin对OSCC细胞YAP蛋白亚细胞定位的影响
胞浆蛋白内YAP蛋白的水平升高,与DMSO组相比,差异有统计学意义 (pV0・05),且该差异随Morin药物浓度升高而加大(图3-1);胞核蛋白内YAP 蛋白的水平降低,与DMSO组相比,差异有统计学意义(pV0・05),且该差异 随Morin药物浓度升高而加大(图3-1 )o
经过Morin处理后,Cal27、SCC15细胞的胞核处,YAP着色呈明显的空 泡状。与对照组(DMSO组)相比,胞核内YAP着色明显减少(图3-2)。
1.3 Morin对OSCC细胞Hippo通路下游靶基因表达水平的影响
为了进一步证实Morin处理对YAP蛋白的核易位的影响,利用RT-PCR技 术检测了 YAP下游靶基因Ctgf、Cyr61、Ankrd的转录水平。结果显示,与对 照组相比,6127、SCC15细胞内Ctgf、Cyr61. Ankrd的mRNA表达水平均降 低,差异有统计学意义(pV0・05),且该差异随Morin药物浓度升高而加大(图 3-2)。
2 Hippo通路关键效应因子YAP对OSCC细胞生物学行为的调控作用 2.1慢病毒感染后,YAP干扰和过表达效果评价
为了评价慢病毒感染对Cal27> SCC15细胞YAP的过表达和干扰效果,应 用RT-PCR和Western blot检测了慢病毒感染后OSCC细胞中YAP的mRNA 和蛋白表达水平。结果显示,LV5・Yap・CAL27组、LV5-Yap-SCC15组Yap mRNA 表达水平分别较LV5-ctrl-CAL27组、LV5-ctrl-SCC15组显著升高,差异有统计 学意义(p<0.05)(图 3-3)o LV5-Mp・CAL27 组、LV5-Yap-SCC15 组 YAP 蛋 白表达水平分别较LV5-ctrI-CAL27组、LV5-ctrl-SCC15组显著升高,差异有统 计学意义(pV0・05)(图 3-3)。LV3-shYap-CAL27 组、LV3-shYap-SCC15 组 Yap mRNA表达水平分别较LV3-ctri-CAL27组、LV3-ctrl-SCC15组显著降低,差异 有统计学意义(pV0・05)(图 3-3)。LV3-shYap-CAL27 组、LV3-shYap-SCC15 组YAP蛋白表达水平分别较LV3-ctrl-CAL27组、LV3・ctrl・SCC15组显著降低, 差异有统计学意义(p<0.05)(图3-3)。
2.2 YAP对OSCC细胞生物学行为的调控作用
2.2.1 YAP对OSCC细胞EdU着色阳性率的影响
干扰YAP后,在Cal27细胞中,LV3-ctrl组、LV3-shYap组EdU阳性率分 别为:32.743±1.332%、15.384±3.872%,两组间差异有统计学意义(p<0.05); 在 SCC15 细胞 +,LV3-ctrl 组、LV3-shWp 组 EdU 阳性率分别为:40・196±0・563%、 24.285±2・843%,两组间差异有统计学意义(p<0.05)(图34)。
过表达YAP后,在Cal27细胞中,LV5-ctrl LV5-Yhp组EdU阳性率分 别为:31.818+1.783%.40.310+0.588%,两组间差异有统计学意义(pV0・05); 在 SCC15 细胞中,LV5arl 组、LV5-Yap组EdU 阳性率分别为 29.629± 0.673%、 45.025 + 3.765%,两组间差异有统计学意义(pV0・05)(图3-5)。
2.2.2 YAP对OSCC细胞周期分布的影响
干扰YAP后,在Cal27> SCC细胞中,LV3-shVap组较LV3-ctrl组G1期 细胞比例增多,而G2/M期细胞比例减少,差异均具有统计学意义(pV0・05) (图3・6)。
过表达YAP后,在Cal27. SCC细胞中,LV5-Yap组较LV5-ctrl组G1期 细胞比例减少,而G2/M期细胞比例增多,差异均具有统计学意义(p<0.05) (图3・6)。
2.2.3 YAP对OSCC细胞凋亡的影响
干扰YAP后,在Cal27、SCC细胞中,LV3-shYap组较LV3-ctrl组早期凋亡 率、晚期凋亡率均升高,差异均具有统计学意义(pV0.05)(图3・6先
过表达YAP后,在Cal27、SCC细胞中,LV5-Yap组较LV5-ctrl组早期凋亡 率、晚期凋亡率均降低,差异均具有统计学意义(pV0・05)(图3・6)。
2.2.4 YAP对OSCC细胞迁移能力的影响
干扰YAP后,在Cal27细胞中,LV3・ctrl组、LV3-shMp组划痕愈合比率 分别为:57.960±1.287%、50・574±2・402%,两组间差异有统计学意义(p<0.05); 在SCC15细胞中,LV3・ctrl组、LV3-shYap组划痕愈合比率分别为:57.221土 4.563%、46.228+1.980%,两组间差异有统计学意义(/?<0.05)(图3-7)。
过表达YAP后,在Cal27细胞中,LV5-ctrl组、LV5-Yap组划痕愈合比率 分别为:58.018±1・297%、81・046±0・859%,两组间差异有统计学意义(p<0.05); 在SCC15细胞中,EV5-ctrl组、LV5・$p组划痕愈合比率分别为62375 ±1.393%、 76.780± 1.385%:两组间差异有统计学意义(p<0.05)(图3-7)。
3. 干扰MST1对Morin在OSCC细胞中调控作用的影响
3.1病毒感染后,OSCC细胞MST1干扰效果评价
为了评价慢病毒感染对Cal27>SCC15细胞MST1的干扰效果,应用RT-PCR 和Western blot检测了慢病毒感染后OSCC细胞中MST1的mRNA和蛋白表达 水平。结果显示,LV3-shMstl-CAL27 组、LV3-shMstl-SCC15 组 Mstl mRNA 表达水平分别较LV3-ctrl-CAL27组、LV3-ctrl-SCC15组明显降低,差异有统计 学意义(pVO05)(图 3-8)。EV3-shMstl-CAL27 组、LV3-shMstl-SCC15 组 MST1蛋白表达水平分别较LV3-ctrl-CAL27组、LV3-ctrl-SCC15组明显降低, 差异有统计学意义(pV0・05)(图3-8)。
3.2干扰MST1对OSCC细胞Hippo通路关键蛋白表达的影响
为了探究干扰MST1是否引起OSCC细胞中Hippo通路磷酸化水平降低, 首先检测了感染病毒后,OSCC细胞6127、SCC15中Hippo通路关键蛋白的 磷酸化水平是否发生变化◎结果显示,在Cal27、SCC15中,LV3-shMstl组与 LV3-ctrl组相比,Hippo通路的关键激酶MST1 >MOB1的磷酸化水平明显降低, 差异有统计学意义(pV0・05)(图3-9)oLV3-shMstl组与LV3・ctrl组相比,Hippo 通路关键效应因子YAP的磷酸化水平明显降低,差异有统计学意义(p<0.05) (图 3-9)o
使用亚细胞结构胞核与胞浆蛋白抽提试剂盒,分别提取了病毒感染后的 Cal27、SCC15细胞的胞浆胞核蛋白。通过Western blot检测结果得知,在6127、 SCC15中,干扰MST1后:LV3-shMstl组与LV3・ctrl组相比,胞浆蛋白内YAP 蛋白的水平降低,差异有统计学意义(pV0・05)(图3-9);胞核蛋白内YAP蛋 白的水平升高,差异有统计学意义(pVO.05)(图3・9)。
3.3干扰MST1,对Morin在OSCC细胞中调控作用的影响
3.3.1干扰MST1,对Morin在OSCC细胞EdU着色阳性率调控作用中的影响
在 C&127 细胞中,DMSO 组、Morin 组、Morin+LV3・ctrl 组、Morin+LV3-shMstl 组 EdU 阳性率分别为:41・732 ±2・592%、22.522土3.296%、23.232±2・478%、 30,281 ±2.589%;在 SCC15 细胞中,DMSO 组冷 Morin 组、Morin+LV3-ctrl 组、 Morin+LV3-shMstl 组 EdU 阳性率分别为:35.245±2.163%、15.822 + 5.258%. 17.1 力土3.217%、27.083土 1.273%。
数据统计显示,LV3-ctrl-OSCC细胞用100pM Morin处理后与单纯用100pM Morin处理的Morin组,两组间无差异(p>0.05)(图3-10)© Morin组、
Morin+LV3・ctrl组分别与DMSO组相比,EdU阳性率显著降低,差异有统计学 意义(pV0.05)(图 3-10)°Morin+LV3-shMstl 组分别与 Morin 组、Morin+LV3-ctri 组相比,EdU阳性率显著升高,差异有统计学意义(p<0.05)(图3-10),说明 干扰MST1后,显著逆转了 Morin对OSCC细胞EdU阳性率的抑制作用。然 而,Morin+LV3-shMstl组EdU阳性率显著低于DMSO组,差异有统计学意义
(p<0.05)(图3・10),说明干扰MST1,只是部分逆转了 Morin对OSCC细胞
EdU阳性率的抑制作用,并没有使细胞恢复到未加药处理前的增殖状态。
3.3.2干扰MST1,对Morin在OSCC细胞周期分布调控作用中的影响
结果显示,LV3-ctrl-0SCC细胞用100pM Morin处理后与单纯用100pM
Morin处理的Morin组,两组间周期分布比率无差异(p>0.05)(图3・ll)°Morin 组、Morin+LV3-ctrl组分别与DMSO组相比,细胞周期均出现G1期细胞比率 升高,S期细胞比率降低,发生G1期阻滞,且差异有统计学意义(pV0・05)
(图 3-11)。Morin+LV3-shMstl 组分别与 Morin 组、Morin+LV3・ctM 组相比, i
G1期细胞比率降低,S期细胞比率升高,差异有统计学意义(pV0・05)(图341), *
说明干扰MST1后,显著逆转了 Morin引起的OSCC细胞周期的改变。然而, Morin+LV3-shMstl组G1期细胞比率显著高于DMSO组,S期细胞比率显著低 于DMSO组,差异有统计学意义(pV0・05)(图3-11),说明干扰MST1,只 «
是部分逆转了 Morin引起的OSCC细胞周期的改变,并没有使细胞恢复到未加 1
药处理前的周期分布状态。
333干扰MST1,对Morin在OSCC细胞凋亡调控作用中的影响
结果显示,LV3-ctrl-0SCC细胞用100gM Morin处理后与单纯用100pM
Morin处理的Morin组,两组间细胞凋亡比率无差异(p>0・05)(图3・11 Morin 组、Morin+LV3~ctrl组分别与DMSO组相比,细胞凋亡比率升高,且差异有统 计学意义(卩<0・05)(图3-11 )o Morin+LV3-shMstl组分别与Morin组、 Morin+LV3・ctrl组相比,细胞凋亡比率降低,差异有统计学意义(p<0.05)(图 3-11),说明干扰MST1后,显著逆转了 Morin引起的OSCC细胞凋亡比率的增 加。然而,Morin+LV3-shMstl组细胞凋亡比率高于DMSO组,且差异有统计 学意义(p<0.05)(图3-11),说明干扰MST1,只是部分逆转了 Morin引起的 OSCC细胞凋亡比率的改变,并没有使细胞恢复到未加药处理前的细胞凋亡水 平。
3.3.4干扰MST1,对Morin在OSCC细胞迁移能力调控作用中的影响
结果显示,LV3-ctrl-OSCC细胞用lOOgM Morin处理后与单纯用100pM Morin处理的Morin组,两组间划痕愈合比率无差异(p>0.05)(图3-12)。Morin 组、Morin+LV3心rl组分别与DMSO组相比,划痕愈合比率降低,且差异有统 计学意义(p<0.05)(图 3-12)o Morin+LV3-shMstl 组分别与 Morin 组、 Morin+LV3・ctrl组相比,划痕愈合比率升高,差异有统计学意义(p<0.05)(图 3-12),说明干扰MST1后,显著逆转了 Morin引起的OSCC细胞迁移能力的 降低。然而,Morin+LV3-shMstl组划痕愈合比率低于DMSO组,且差异有统 计学意义(p<0.05)(图3-12),说明干扰MST1,只是部分逆转了 Morin引起 的OSCC细胞迁移能力的改变,并没有使细胞恢复到未加药处理前的迁移能力o 3・3・5干扰MST1,对Morin在OSCC细胞周期.凋亡、迁移能力相关标志蛋 白表达调控作用中的影响
本部分实验检测了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P53、P21的蛋白表 达水平。结果显示:LV3-ctrl-OSCC细胞用lOOgM Morin处理后与单纯用lOOgM Morin处理的Morin组,两组间P53、P21蛋白表达水平无差异(p>0.05)(图 3・13)。Morin组、Morin+LV3-ctrl组分别与DMSO组相比,P53、P21蛋白表 达水平升高,且差异有统计学意义(pV0・05)(图3-13)o Morin+LV3-shMstl 分别与Morin组、Morin+LV3・ctrl组相比,P53、P21蛋白表达水平降低,差异 有统计学意义(pV0・05)(图3-13),说明干扰MST1后,显著逆转了 Morin 药物处理引起的OSCC细胞P53、P21蛋白表达水平的变化。然而, Morin+LV3・shMstl组P53、P21蛋白表达水平显著高于DMSO组,且差异有统 计学意义(pV0・05)(图3-13),说明干扰MST1,只是部分逆转了 Morin药物 处理引起的OSCC细胞P53、P21蛋白表达水平的变化,并没有使细胞恢复到 未加药处理前的蛋白表达水平。
本部分实验检测了细胞凋亡蛋白CASPASE-9. CASMSE-3和抑凋亡蛋白 BCL-2表达水平。结果显示:LV3-ctrl-OSCC细胞用100gM Morin处理后与单 纯用 100pM Morin 处理的 Morin 组,两组 CASRASE-9. CASPASE-3> BCL-2 蛋白表达水平无差异(p>0・05)(图3-13)o Morin组、Morin+LV3-ctrl组分别 与DMSO组相比,CASPASE-9. CASPASE-3蛋白表达水平升高、BCL-2蛋白 表达水平降低,且差异有统计学意义(p<0.05)(图3-13)。Morin+LV3-shMstl
组分别与 Morin 组、Morin+LV3-ctri 组相比,CASPASE-9、CASPASE-3 蛋白表 达水平降低、BCL-2蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(p<0.05)(图3-13), 说明干扰MST1后,显著逆转了 Morin药物处理引起的OSCC细胞CASPASE9 CASPASE-3、BCL-2蛋白表达水平的变化。然而,Morin+LV3-shMstl组 CASPASE-9>CASPASE-3 蛋白表达水平显著高于 DMSO 组;Morin+LV3-shMstl 组BCL-2蛋白表达水平显著低于DMSO组;且差异有统计学意义(pV0』5) (图343)O说明干扰MST1,只是部分逆转了 Morin药物处理引起的OSCC 细胞CASPASE-9. CASPASE・3、BCL-2蛋白表达水平的变化,并没有使细胞 恢复到未加药处理前的蛋白表达水平o
本部分实验检测了黏附因子E-CADHERIN和间质表型的标志蛋白 VIMENTIN的表达水平。结果显示:LV3-ctrl-OSCC细胞用1 OOpM Morin处理 后与单纯用100问 Morin处理的Morin组,两组E-CADHERIN> VIMENTIN 蛋白表达水平无差异(卩>0・05)(图3-13)o Morin组、Morin+LV3-ctrl组分别 与DMSO组相比,E-CADHERIN蛋白表达水平升高、VIMENTIN蛋白表达水 平降低,且差异有统计学意义(卩<0・05)(图3-13)o Morin+LV3-shMstl组分 别与Morin组、Morin+LV3-ctrl组相比,E-CADHERIN蛋白表达水平降低、 VIMENTIN蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(pV0.05) (® 3-13),说 明干扰MST1后,显著逆转了 Morin药物处理引起的OSCC细胞E-CADHERIN^ VIMENTIN蛋白表达水平的变化。然而,Morin+LV3-shMstl组E-CADHERIN 蛋白表达水平显著高于DMSO组、Morin+LV3-shMstl组VIMENTIN蛋白表达 水平显著低于DMSO组,且差异有统计学意义(pV0・05)(图3-13),说明干 扰MST1,只是部分逆转了 Morin药物处理引起的OSCC细胞E-CADHERIN> VIMENTIN蛋白表达水平的变化,并没有使细胞恢复到未加药处理前的蛋白表 达水平。
讨论
Hippo通路是一条在哺乳动物体内高度保守的激酶级联反应链,由MST1、 SAV1. LATS1/2、MOBla/b四个重要的上游激酶通过级联的磷酸化作用发挥功 能,在维持组织器官大小、调节细胞增殖凋亡信号等方面具有重要的作用[60]。 上游激酶在接收到激活信号后发生磷酸化,继而使通路的效应因子YAP蛋白在
Seri27和Ser397位点发生磷酸化[61]。YAP发生磷酸化后,磷酸化YAP被滞 留在胞质内,与14-3-3 S白结合,被泛素化蛋白酶降解系统降解[62]。当Hippo 通路的激酶没有被激活,对YAP没有起到磷酸化作用时,YAP蛋白会易位进 入细胞核,在胞核内富集,发挥其转录共激活因子的作用,与相应的转录因子 结合,促进与细胞增殖、存活等信号相关的基因的表达[63]o近年来,Hippo 通路在肿瘤发生发展中的重要作用越发突出,引起广泛的重视。本实验结果证 实,与正常口腔上皮细胞相比,OSCC细胞对Morin有更高的敏感性,且Morin 在OSCC细胞中可以发挥强有效的调节作用,抑制肿瘤细胞的增殖能力、克隆 形成能力,阻滞细胞周期,增加细胞凋亡比率,降低细胞的迁移能力,降低细 胞裸鼠体内成瘤能力。但是,Morin在OSCC细胞中的抑制作用的相关分子机 制尚不充分,仍有待深入研究。因此,本部分实验探讨了 Morin在OSCC细胞 生物学行为调控作用的分子机制中,是否有Hippo信号通路介导其中。
在本部分实验中,首先检测了 Morin处理OSCC细胞对细胞内Hippo通路 的激活状态是否存在影响,从而建立Morin对OSCC细胞的调节活性与Hippo 通路间的联系。研究结果显示,用Morin处理OSCC细胞,与对照组细胞相比: OSCC细胞内Hippo通路的重要激酶MST1、MOB1的磷酸化水平升高、关键 效应因子YAP的磷酸化水平升高,这两项在蛋白水平上的变化提示着,Morin 处理引起了细胞内Hippo通路的磷酸化水平的升高oMorin处理的OSCC细胞, 亚细胞结构胞浆胞核蛋白的Western实验证实:胞核内YAP蛋白水平下降、胞 浆内YAP蛋白水平上调;细胞免疫荧光实验同时证实,YAP在胞核内的表达 水平下降。这两项实验更加有力的证实了,Morin所引起的Hippo通路关键效 应因子YAP的变化,即YAP蛋白核易位减少。继而,从基因转录水平上,本 实验检测到了由于YAP蛋白胞核易位减少,随之而造成的YAP的下游靶基因 Ctgf、Cyr6k Ankrd转录水平的下调。以上研究结果可以说明:Morin引起了 Hippo通路磷酸化水平升高,通路活化状态升高,YAP核易位减少。
Morin引起了 Hippo通路磷酸化水平的升高,并导致Hippo通路的关键效 应因子YAP蛋白在胞核内的表达降低,以及YAP蛋白所调节的靶基因的转录 水平降低。那么YAP作为Hippo通路的关键效应因子,其对OSCC细胞的生 物学行为是否存在重要的调控作用呢?为了验证这一问题,我们利用重组的慢 病毒载体感染OSCC细胞,以构建干扰和过表达YAP的OSCC细胞模型。进 行慢病毒感染后收集OSCC细胞,应用RT-PCR和Western blot检测细胞内YAP 的表达水平,结果显示,YAP的干扰和过表达均达到很好的效果。在此基础上, 我们证实了 YAP对OSCC细胞的增殖能力、周期分布和凋亡水平、迁移能力 均具备重要的调控作用。在OSCC细胞中干扰YAP可以下调细胞增殖能力、 引起细胞周期阻滞、增加细胞凋亡水平以及下调细胞的迁移能力;过表达YAP 对OSCC细胞以上生物学行为起到与干扰YAP相反的作用。到此,研究结果 说明,Morin可以引起OSCC细胞内Hippo信号通路磷酸化水平升高,YAP蛋 白核易位减少,使我们有理由去推测Hippo通路在Morin对OSCC调节活性中 的介导作用;而干扰YAP与Morin处理,对OSCC细胞生物学行为的影响, 产生了一致的表型变化,可以在一定程度上间接说明Hippo通路在Morin对 OSCC调节活性中的介导作用。
为了更进一步证实我们的推测,利用携带Mstl shRNA的重组慢病毒感染 OSCC细胞,干扰MST1的表达,然后检测Morin对OSCC细胞的调节活性是 否能够被逆转。本部分实验首先观察到干扰MST1后,OSCC细胞内Hippo通 路激酶的磷酸化水平显著降低,显著抑制了 Hippo通路的激活水平。接下来, 我们用Morin处理感染病毒后的OSCC细胞,结果显示,干扰MST1显著逆转 了 Morin在OSCC细胞增殖能力、周期分布、凋亡水平以及迁移能为等各项生 物学行为中引起的变化,从而证实:在OSCC细胞中Morin通过Hipbo通路激 酶活化,进而使关键效应因子YAP磷酸化水平升高,核易位减少,从而发挥其 对细胞的调节活性。然而,实验结果同时显示LV3-shMst-OSCC+Morin组与 OSCC+DMSO组在各项生物学行为的检测指标中存在显著差异。该数据提示我 们,Morin在OSCC细胞各项生物学行为中的调节活性,并没有被干扰MST1 而完全逆转。因此,我们猜测Morin在OSCC细胞中的调节活性,除了 Hippo 信号转导通路外可能还有众多其他复杂的信号通路或分子机制参与其中,这是 非常有趣研究的方向,值得我们在未来去深入探索,以期对OSCC的治疗提供 更多的理论基础。我们的研究证明了在Morin调控OSCC细胞生物学行为的分 子机制中Hippo通路的介导作用,为进一步深入探讨Morin在肿瘤治疗方面的 潜力和机制提供了一定的理论基础,也为开发和研究OSCC的治疗药物提供了 新的思路。
全文总结
1 .Morin在HOEC中的半数抑制浓度远高于OSCC细胞,且在OSCC细胞中显著 抑制phospho-ERK蛋白水平的Morin浓度低于HOEC细胞。上述结果提示,与 正常口腔上皮细胞相比,OSCC细胞对Morin具有更强的敏感性。
2•观察了 Morin对OSCC细胞多项生物学行为的调控作用,结果显示:经过Morin 药物处理后,OSCC细胞增殖能力下降、细胞周期发生阻滞、细胞凋亡比率升高、 细胞迁移能力下降、细胞在裸鼠体内成瘤能力下降。上述结果提示:Morin对 OSCC细胞多项生物学行为均存在抑制作用,在OSCC中具备潜在的研究价值。 3•观察了 Morin药物处理对OSCC细胞Hippo信号转导通路的影响,结果显示: Morin处理后,Hippo通路关键激酶磷酸化水平升高,Hippo通路的关键效应因 子YAP磷酸化水平升高且在胞核内的表达水平下降,YAP下游靶基因的转录水 平下降©上述结果提示:Morin在OSCC细胞中的调节活性可能存在Hippo通路 的介导作用。
4•应用慢病毒载体成功构建干扰及过表达YAP的OSCC细胞模型,结果显示: 在OSCC细胞中过表达YAP可以上调细胞增殖能力、加速细胞周期、降低细胞 凋亡水平以及增强细胞的迁移能力;干扰YAP对OSCC细胞以上生物学行为起 到与过表达YAP相反的作用。上述结果提示,Hippo通路的关键效应因子YAP 对OSCC细胞的生物学行为存在重要的调控作用。
5•应用慢病毒载体成功构建干扰MST1的OSCC细胞模型,结果显示:通过干扰 MSTb抑制了 Hippo通路磷酸化水平。Morin处理病毒感染后的细胞,结果显 示干扰MST1显著逆转了 Morin在OSCC细胞生物学行为中引起的变化。上述 结果提示:Hippo通路在Morin对OSCC细胞的调控活性中具有重要的介导作用。
6 •通过干扰MST1虽然显著逆转了 Morin在OSCC细胞生物学行为中引起的变化, 但细胞的各项检测指标并未恢复至OSCC细胞未经Morin处理前的状态,该结 果提示我们,Morin在OSCC细胞中的调节活性,除了 Hippo信号通路外可能还 有众多其他复杂的信号通路或分子机制参与其中。
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附图
25
50
100
150
200
250 pM
300 pM
-fogy - anwA Qo
72h
O Dmso EE3 25 pM 口 50pM O 100 pM
150 pM E3 200 pM E3 250 pM 03 300 pM
25 pM
50 pM
100 pM
图1-1. Morin对HOEC和OSCC细胞的毒性作用比较
A: Morin处理Cal27细胞48爪72 h,细胞增殖能力CCK-8检测结果
B: Morin处理SCC15细胞48h、72 h,细胞增殖能力CCK-8检测结果
C: Morin处理HOEC细胞48h、72 h,细胞增殖能力CCK-8检测结果
*: pV0・05 勿 DMSO 组
图12 Morin对HOEC和OSCC细胞ERK激活水平的影响
A: Morin 处理 24 h, Cal27、SCC15、HOEC 细胞 phospho-ERK 蛋白表达水平
B: Morin 处理 24 h, CaI27. SCC15、HOEC 细胞 phospho-ERK 蛋白表达灰度
值量化分析
*: p<0.05 v^DMSO 组
图24. Morin对OSCC细胞克隆形成能力的影响
A: Morin处理两周后,6127、SCC15细胞的克隆形成情况
B: Morin处理两周后,Cal27、SCC15细胞克隆形成数目的量化分析
*: ^<0.05 DMSO 组
图2-2. Morin对OSCC细胞EdU着色阳性率的影响
A: Morin处理24 h后,Cal27细胞的EdU着色情况(xlOO)
B: Morin处理24 h后,SCC15细胞的EdU着色情况(xlOO)
C: Morin处理24 h后,Cal27、SCC15细胞EdU着色阳性率的量化分析
*: p<0.05 V5DMSO 组
Morin (yM)
Dmso 50 100 150
也■■■■■■
图2-3. Morin对OSCC细胞周期分布的影响
A: Morin处理24 h后,Cal27细胞周期分布情况及周期分布比率的量化分析
B: Morin处理24h后,SCC15细胞周期分布情况及周期分布比率的量化分析
C: Morin处理48h后,Cal27细胞P53、P21蛋白表达水平及蛋白表达灰度值
量化分析
D: Morin处理48h后,SCC15细胞P53、P21蛋白表达水平及蛋白表达灰度值
量化分析
*: p<0.05 DMSO 组
Morin (pM)
Dmso 50 100 150
图2-4. Morin对OSCC细胞凋亡的影响
A: Morin处理48 h后,Cal27细胞的凋亡情况及细胞凋亡比率的量化分析
B: Morin处理48h后,SCC15细胞的凋亡情况及细胞凋亡比率的量化分析
C: Morin 处理 48 h 后,Cal27 细胞 CASPASE-9、CASPASE-3. BCL-2 蛋白表
达水平及蛋白表达灰度值量化分析
D: Morin 处理 48 h 后,SCC15 细胞 CASPASE-9、CASPASE-3、BCL-2 蛋白表
达水平及蛋白表达灰度值量化分析
*: o<0.05 v^DMSO 组
GA 卩 UH
图2-5. Morin对Cal27细胞迁移能力的影响
A: Morin处理6h和24h后,6127细胞划痕愈合情况(MOO)及
愈合比率的量化分析
B: Morin 处理 48 h 后,Cal27 细胞 E-CADHERIN. VIMENTIN 蛋白表达水平
及蛋白表达灰度值量化分析
*: pV0・05 诩 DMSO 组
图2-6. Morin对SCC15细胞迁移能力的影响
A: Morin处理6h和24h后,SCC15细胞划痕愈合情况(xlOO)及
愈合比率量化分析
B: Morin 处理 48 h 后,SCC15 细胞 E-CADHERIN、VIMENTIN 蛋白表达水平
及蛋白表达灰度值量化分析
*: pV0.05KyDMSO 组
恣妙地辿拠f —鬪•!;辿F他磴血J ,爾i』诡订念 瀬硕颐廁:萌踊诫谕;雨締谕瞒加・订谕击;;渦亦
图2-7. Morin对OSCC细胞裸鼠体内成瘤能力的影响
A: Morin持续给药25无 6127、SCC15细胞在裸鼠体内成瘤瘤体情况
B: Morin持续给药25天,Cal27> SCC15细胞裸鼠体内成瘤的瘤体平均重量量
化分析
**: 7?<0.01 DMSO 组
A、C: Morin处理48 h后,Cal27细胞Hippo通路关键蛋白表达水平及蛋白表
达灰度值量化分析
B、D: Morin处理48 h后,SCC15细胞Hippo通路关键蛋白表达水平及蛋白
表达灰度值量化分析
*: pV0・05 诃DMS0 组 **: p<0.01 v^DMSO 组
***; pVO.OOlusDMSO 组
Cal27
图3-2. Morin对OSCC细胞YAP蛋白亚细胞定位及YAP下游靶基因表达水平
的影响
A、 C: Morin处理24 h后,Cal27细胞YAP蛋白免疫荧光染色情况(x200)
及YAP下游靶基因mRNA表达水平
B、 D: Morin处理24h后,SCC15细胞YAP蛋白免疫荧光染色情况&200)
及YAP下游靶基因mRNA表达水平
*: p<0.05 vsDMSO 组 **: p<0.01 v^DMSO 组
图3・3.慢病毒感染后,YAP干扰和过表达效果评价
A:慢病毒感染后,Cal27细胞GFP表达情况(xlOO)
B:慢病毒感染后,SCC15细胞GFP表达情况(xlOO)
C:慢病毒感染后,Cal27> SCC15细胞Yap基因mRNA表达水平
D:慢病毒感染后,Cal27细胞YAP蛋白表达水平及蛋白表达灰度值量化分析
E:慢病毒感染后,SCC15细胞YAP蛋白表达水平及
蛋白表达灰度值量化分析
***: pVO.OOl V5 LV3-ctrl 组 orLV5-ctrl 组
Cal27
SCC15
图34干扰YAP对OSCC细胞EdU着色阳性率的影响
A:干扰YAP后,Cal27细胞的EdU着色情况(xlOO)
B:干扰YAP后,SCC15细胞的EdU着色情况(xlOO)
C:干扰YAP后,Cal27、SCC 15细胞EdU着色阳性率的量化分析
*: p<0.05 LV3-ctr 1 组 **: p<0.01 V5 LV3-ctrl 组
Cal27
图3-6. Yap对OSCC细胞周期分布及细胞凋亡的影响
A:干扰和过表达YAP后,6127、SCC15细胞的周期分布情况
B:干扰和过表达YAP后,Cal27、SCC15细胞的凋亡比率
C:干扰和过表达YAP后,C汶127细胞周期分布比率和凋亡比率的量化分析
D:干扰和过表达YAP后,SCC15细胞周期分布比率和凋亡比率的量化分析
*: jp<0.05 V5 LV3-ctrl 组 or LV5-ctrl 组
SCC15
图3-7. YAP对OSCC细胞迁移能力的影响
A、 C: Cal27细胞感染病毒后,划痕愈合24h,愈合情况(“00)
及愈合比率量化分析
B、 D: SCC15细胞感染病毒后,划痕愈合24 h,愈合情况(xlOO)
及愈合比率量化分析
图3-9.干扰MST1对OSCC细胞Hippo通路关键蛋白表达的影响
A:干扰MST1后,6127、SCC15细胞Hippo通路关键蛋白表达水平
B:干扰MST1后,6127细胞Hippo通路关键蛋白表达灰度值量化分析
C:干扰MST1后,SCC15细胞Hippo通路关键蛋白表达灰度值量化分析
*: p<0.05 LV3-ctr 1 组: **: pVO.Ol 佑 LV3-ctrl 组;
***: pVO.OOl vs LV3-ctrl 组
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致谢
十年的学医生涯,看似漫长,实则短暂,转眼我的校园生活就要结束了。 回顾在山东大学度过的学医生活,感慨万千,十年的付出即将得到收获,这将 是我人生中一笔宝贵的财富。值此论文交稿之际,我要衷心感谢所有关爱和帮 助过我的人们,是他们的支持和鼓励让我坚持到现在。
首先要感谢我敬爱的恩师徐欣教授在研究生生涯中对我的悉心教导。徐老 师学识渊博、和蔼可亲、诲人不倦。在临床工作中,徐老师精湛的医术和高尚 的医德深深影响了我,使我懂得了临床医生需要具备的能力和素质。在实验的 选题、设计过程中徐老师给予了关键性的指导,对我科研思路的养成起了极大 的帮助。在实验遇到问题时,徐老师给我提出了许多宝贵的意见和建议,帮助 我找到解决问题的方法❾在论文的撰写过程中,徐老师给了我细心地指导,才 能使论文顺利的发表。在生活中,徐老师时常关心和鼓励我,在我遇到困难时 都会提供无私的帮助。在五年的研究生生涯中,徐老师不仅是我的恩师,向我 传授专业知识,更是一位睿智的长者和无私的慈母,教导我为人处世的道理。 徐老师的教导使我受益一生,能成为徐老师的学生我深感荣幸。
衷心感谢山东省口腔组织再生重点实验室各位老师对我实验的指导和帮 助。感谢实验室的兄弟姐妹们在我实验需要帮助的时候伸出援手。没有你们的 帮助,我不可能如此顺利的完成我的研究内容。
衷心感谢山东大学口腔医院种植科各位老师,在临床工作中对我的指导和 帮助,使我受益匪浅。
衷心感谢我的师兄、师姐、师弟和师妹们在学习和生活中给我的鼓励和支 持,感谢你们营造出的温暖、团结、积极向上的氛围,让我感受到无比的温暖。
衷心感谢我的家人对我的理解、支持、关心和爱护。因为有你们,我才有 应对困难、迎接挑战的信心和力量。
最后,再次感谢所有关心和帮助过我的人们!
攻读博士学位期间发表学术论文目录
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7. An in vitro comparative study of multi-sources derived mesenchymal stem cells for bone tissue engineering. Stem cells and development 2018•第四作者
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JI el al- ANTITl JMOR ACTIVITY OF MORIN IN TSCC CEI J.S 3Q2
ONCOLOGY REPORTS 40 3024-3032, 2018
JI al ANTITUMOR ACTIVITY OF MORIN IN TSCC CHI A 用
figure 2. Effect of morin tre^ment on the reduction in TSCC colony formation. (A) The colony formation assay results revealed that morin treatment at 50, 100 and 150 ”M resulted in a lower number of tumor cell cronies than was observed in the DMSO group. This effect of morin was dose-depeodem. (B) Quantification of the data from A. T<0.05. vs. the control (DMSO) grcnq>. TSCC', tongue squamous cell carcinoma.
Hgure 3. Effect of moria ireaunem on the reduction in 1SCC cell EdU incorpasauon. (A) EdU incorporaiian assay. Cal27 cells were treated wixh morin ai concentraticms of 50,100 aad 150 pM and subjected to an EdU incorporatkm assagr and counterstainiog with Ho^hst blue. The nuclei of EdU-po&itive cells are labeled 同 and all cell nuclei are labeled Hue following Uoechst-bhie staining (magnificaiicm, xlCX». (B) Quandficaiion of the data from A. *P<0.05. vs. the (DM SO) contrd group. TSCC, (ongue squamous cdl carcinoma.
Figure 5. Effect of morin treatment on the inhibition of tumor cell wound healing. (A) Results of uv)und healing assay Cal27 cells (m^nification, xlOO) treated with morin at concentrations of 50.100 and ]S0^M. (B) Statistical analysis of womKl healing assay.Treatment with 150^M morin significantly inhib¬ited tumor cell migratkm ct»npan:d with the tumor cell migntion in the control group at 6 h. Trcalmcnl of tumor cells with the diffovnl mcHin concentrations a significant inhibiksy effect on migratioa at 24 h; *P<0J05, V$. tbe conttol (DMSO) group.
Morin reduces TSCC cell migration. We then performed the morin on the migratory capacity of Cal27 cells. We found that, lumor cell wound-healing assay to investigate the effect of IbHowing morin ireaimenl, cells showed a lower tumor cell
JI計述 ANTTTUMOR ACTTVrrYOFMC»lNINTSCCCEIJ.S
GAPI>H 1 11 '
Figure 6. Effect of morin trcaiment <MI the rc^iUtion of gene oi|Mcssicm. (A) Weston bfot analysis. The cx^cssion of MST1 and MOBI proteins in Cal27 cells after 24 h of treaimt»it with morin M ccmceffiraiions of 50,100 and 1M) pM. (B) QuantifkmKm 时 the ditta from A. (C) Impression of phospho-MSTl and |Miospho-MOBl in Cal27 cells after 24 h of treatmeni with morin at concentratKms of 50,100 and 150 禅M. (D) Quantification erf the dma from C,
(E) Fxprcssion & YAP and phosplw-YAP in the cyfo[dasmic protein oaracts from Cal27 cells after 24h<rf treatment with nxwin at comxMnitions of 50,100 and 150 ^M. (R Quantification of the data from E. (G) Expression of YAP in the nodear protein ejrtracts from Cal27 edb after 24 h of treatment uith morin a( ccmeentrations of 输* 100 and 150 “M. (H) 濒ioo of (he data Em G. (I) YAP tagi聘 genes w«re ana^zed using qRT-PCR iit Cal27 cells Mier
24 h M neMment whh at coocejair^ions X 50,1CK) and 1 刃 ftM. *P<0.05, vs. the coturol (DMSO) group.
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JI 巩必 NTITITMOR ACTIYITY OF MORIN IN TSCC CELLS
ONCOLOGY REPORTS 40 期24-3032, 201R
IXTFRNAT1ONAIJOVRNAL OF MOLECI H.AR MnDICINE 43: 167-176, 2019
Effect of la, 25-dihydroxyvitamin D3 on the osteogenic
differentiation of human periodontal ligament stem cells
and the underlying regulatory mechanism
YAWEN JIU, PANFAN ZHANG", YIXIAO XINGU, LINGLU JIA1-, YUNPENG ZHANG12,
TINCJTING JIA1'2, XUAN WU12, BIN ZHAO1 2 and XlNXl)12
1 School of Stomatology. Shandong University: 2Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration.
Jinan, Shandong 250012: 3Jinan Stomatological Hospital, Jinan, Shandong 250001. P.R. China
Received June 25, 2018; Accepted ()ek)l>er 打,2018
DOI: 103892/ijnuiL2018.3947
168 JUr EFFFICT OF i ,25-D3 ON OSTEOGENIC DIFFERENTIATION OF hPDLSCs
INTF^RNATION \l JOURNAl OP MOLECI I . \R MPDICINE 43: 167.)76. 2(119 169
JI et al EFH-CT OF 1.25”D3 ON OSTEOCJENK* DIFFERENTIATION OT hPDf^C:s
Figure 2.12S-D3 indue竞 the expwsskm and nudear kcalization of VDR in hPDLSCs. (A) hnnumo血orescae staining of cultured hPIXSCs for VDR (green). Cells woe coumersuuned with l)APi (blue) to visualize nudei ^cale tnrt50/m). (B) Western bl<A analysis and (C) pmetn band density quamUaiive analysis & prutun expressoo ofVMt at 48 h of culture. T<0.05, vs. control (0 nM groiqi). hPM-SCs, human periudonul ligamenl sl«n cells; VDR. viiamin D realtor; UAH, 4',6-diamkUno-2-phcnyItndolc.
PCM
Figure 3. 1,25-D3 inhibits lhe proli^ation of hPDLSCs. (A) Hffccls of diffcrenl ctHtctmlralions of 125-D3 (0,0.1. 1 and 10 nM) on ihr jHulifcration of hPIM^iCs were analyzed by CCK-8 at 24.48 and 72 h follofting treatment. Cell pmlifcraiinn was signifirantly inhibited by 1,25*D5 (1 and )0 nM) in hPDl-SCs at 48 and 72 h. (B) Western blotting showed that 1.25-D3 don-nregulated the protein exfnression of PCNA in hPDLSCs following treatment. *P<0.05 and **P<OD1. vs. ccnird (0 nM proup). hPDLSCs. human periodontal lipment stem cells; PCNA. proliieraiing cell nucleai antipm: NS. not signifiesmi.
JI et at: EH壬CT OF 1J25-D3 ON OSTEOGENIC DIH ERENTIAT1ON OF hFDLSCs
Figure 4. j«25・D3 promotes the o^eogenic difFerentiation of hPDLSCs. (A) Osteogenic differentiation following 7 days incubation was examined by ALP staining. In the BM groups the expression was ALP was undetectable. The expression of ALP in hPDIJSCs cultured in OIM with 10 nM 1,25-03 wvas more extensive than in those cultured in OIM alone. (B) Mineralization following 14 days incubation was examined hy AR staining. No calcium nodules were observed in the BM group. In the OIM group, the prcstmcc of 10 nM 1 »25-D3 significantly enhanced AR Gaining (scale bar. 100 //m). (C) Exprcssicm lewk □f asteogtsiic markers were delected by western blotting. The acMitiun of 10 nM 1,25-D3 significantly ufxcgulated the expression levels of AIJP and OPN in hPDLSCs. (D) Quanlitatixv analysis of protein baml density. and "P<0.01, vs. 0 nM. hPDI^SCs, human periodontal ligament stem cells: BM. b^ic
medium; osteogenic induction medium: AbR alkaline j^iosphatasc; OPN*ostcopontin.
INTERNATIONAL JOITRNAI. OF MOLHCin.AR MEDIHMn 43: 167-176. 2019
Figure 6一 Potential interaction of 125-D3 and TAZ on the osteogenic differentiation of hPDLSCs. (A) Fluorescence detection of hPDLSCs transduced wilh kmiviia) expression wctors. Upper panels show cells transduced with normal lentivirus vectors (vector), lower panels Aow cells iraasduced with TAZ overexjMcssing Jendvinl vecUw$ (TAZ). Scale bar* 100 mM (B) (a> mRNA and (b) protein Jevds 诫 TAZ, (c) quantification of the protein expression levels were agnificandy increased fbllcwing transfeclian with tenliviral vectors expressing TAZ, conqxared with those in the conirol. (C) ALP staining of TAZ-ovcrcxprcssing hPDI^SCs showed enhanced osteogenic differentiation fbllcwing osteogenic induction in vitro for 7 days. AR siaininj of the TAZ'Overexpresaag hPDLSCs shcu^d increased mineralizatiMi follouins osiec^eiuc tndnetion foe 14 da^rs. (D) Followiug cultuie with O1M for 7 days, co-lreatmem of 1,25-03 with TAZ overexpression significanily enhanced prolein expressiaa levels of ALP and OPN compared with levels when Healed with TAZ overcx|m:ssion or 135-D3 alone. (E) Quanlificalicm of the data from D. "P^O.OS, '"PcO.OOl (scale bar, 100 ^m). hPDI^SCs, human periodonul ligtuncni stem cells; TAZ, transcriptional coactivator with the PDZ-bitiding motif; ALJ* alkaline phosphatase; AR, Alizarin Red.
174 JI 刊 M. Ebhkt I (M OSTE(Kil:NI(' Dll I EKLM IA I ION OF hPDLSCs