FADS基因簇与乳母膳食对乳汁中脂肪酸成分的影响及机制研究论文

2020年7月30日15:06:04FADS基因簇与乳母膳食对乳汁中脂肪酸成分的影响及机制研究论文已关闭评论

FADS基因簇与乳母膳食对乳汁中脂肪酸成分的影响及机制研究论文

中文摘要
FADS基因簇与乳母膳食对乳汁中脂肪酸成分的影响及机制研究
母乳又被誉为“白色血液J由身体健康且营养状态好的母亲分泌的乳汁,富 含各类营养素,是保障足月出生婴儿健康生长及发育的最理想食物来源。脂肪和 脂肪酸被认为是提供婴儿能量和营养的重要化合物,乳汁中的脂肪酸是促进婴儿 中枢神经系统发育的主要物质来源,尤其是多不饱和脂肪酸,在婴儿生长发育中 发挥的作用已获得广泛认可。
母乳中脂肪酸成分的多寡可能受到乳母膳食与基因的共同影响,对于日常膳 食摄入较少鱼类的内陆地区乳母,FADS基因编码的4-5和A-6去饱和酶在体内 PUFA转化中所发挥作用可能更为突出,但FADS基因变异对脂肪酸状态的影响 以及FADS基因簇中的很多功能性SNP均未被鉴定,且未有研究报道母乳中的 FADS基因表达情况与脂肪酸间的关联。关于膳食对母乳脂肪酸影响的研究目前 主要集中于单一的膳食和补充剂摄入,但由于日常生活中人们不只摄取一种营养 素或食物,而是从各种类型的食物中摄取大量营养素,并且已经形成了固定习惯 的饮食模式,但关于膳食模式与乳汁FA构成谱的研究很少。本研究收集了长春 地区的哺乳期女性的乳汁样本,探讨了 FADS基因簇的SNP与母乳PUFA水平 的关系;运用膳食模式来探索膳食摄入与母乳FA之间的关系;建立了检测母乳 FADS基因表达的体系,分析了母乳的PUFA水平在不同FADS基因表达组的差 异性。本研究包括了以下三个部分内容:
第一部分:FADS基因簇与乳汁脂肪酸
目的:
明确 FADS 基因簇的 rs 174547> rsl74553> rsl74602、rs3834458 和 rs 1000778 位点与母乳PUFA水平的关系。
方法:
运用气相色谱检测母乳中的8种PUFA水平,提取母乳中的DNA并运用 Sequenom MassArray系统进行FADS基因簇上的5个SNP分型。使用SPSS24.0 软件分析研究对象的基本信息及母乳中的8种PUFA水平;使用SNPstats在线分 析软件分析FADS基因的5个SNP与乳汁PUFA水平间的关系。
结果:
1.母乳中的LA、ALA、DGLA、EPA、DTA和DHA水平与年龄呈正相关 (P<0.05) , LA、ALA、DGLA 和 DTA 与乳母产后 BMI 相关(P<0.05),未
发现母乳PUFA水平与膳食来源PUFA的相关性(P>0.05)。
2.研究纳入的5个位点的检出率最低的为rs 174547 (96.19%),其他位点 的检岀率均位于97%以上;Hardy-Weinberg检验的P值最小的为0.30,均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡。
3.母乳的LA、ALA和DHA水平和在各位点的不同遗传模式组中无差异性 (P>0.05) o
4.母乳GLA和AA水平与FADS1基因的rsl74547位点、rsl74553位点和 FADS2 基因的 rs3834458 位点、rsl74602 位点有关;rsl74547、rsl74553 和 rs3834458位点的最优模式为共显性模式,rsl74602位点最优遗传模式为显性模 式。
5.母乳DGLA 水平与FADS1基因的rs 174547位点和FADS2基因的 rs3834458位点有关;前者的最优遗传模式为显性模式,后者的最优遗传模式为 隐性模式。
6.母乳EPA水平与FADS1基因的rsl74547位点、FADS2基因的rs3834458 位点、ts174602位点有关,最优遗传模式为显性模式;与FADS3基因的rslOOO力8 位点也有关,最优遗传模式为隐性模式。
7.母乳DTA水平与FADS1基因的rsl74547位点、rsl74553位点、FADS2 基因的rs3834458位点有关,这3个SNP位点的最优模式均为隐性模式。
结论:
1.母乳PUFA水平与乳母的年龄和产后BMI相关,与膳食中的PUFA无关。
2.母乳中的GLA、DGLA、AA和DTA水平与FADS1和FADS2基因变异 有关,母乳中的EPA水平与FADS1、FADS2和FADS3基因的变异有关。
第二部分:膳食模式与乳汁脂肪酸
目的:
研究膳食模式与哺乳期母亲的母乳FA构成谱之间的关系,为哺乳期女性的 合理膳食和更好的哺育婴儿提供科学依据。
方法:
采用横断面调查,从2015年1月开始至2017年6月,招募了长春市274名 产后22天到6个月健康的汉族哺乳期女性,收集问卷和乳汁。检测母乳中的FA 构成谱,使用主成分分析法将研究对象的膳食情况划分为不同的膳食模式。运用 SPSS24.0统计学软件分析不同膳食模式组乳母的膳食和乳汁FA的构成差异。 结果:
1.本研究纳入的哺乳期女性日常能量摄入的平均水平为1774.36 kcal,占推 荐摄入量的力.15%;碳水化合物的平均摄入量为233.76 g/d,蛋白质的平均摄入 量为67.38 g/d,脂肪的平均摄入量为66.65 g/d,分别占推荐摄入量的70.70%、 84.22% 和 104.31%o
2.本研究共划分为4种膳食模式:模式1是以菌藻类、肉类和水产品为主, 模式2是以大豆及其制品、坚果和乳制品为主,模式3以水果和蔬菜为主,模式 4是以谷薯类、豆制品和蛋类为主。
3.在不同的膳食模式中,乳母日常的能量、碳水化合物、蛋白质的平均摄入 量以及它们分别与其参考摄入量的比值在四组膳食模式之间的差异均具有统计 学意义(P二0.014, Q0.004,民0.002);而乳母的每日脂肪摄入量和比值在四 组膳食模式之间的差异无统计学意义(P二0.556) o
4.乳母日常摄入的钙、铁、锌、铜和镁在四组膳食模式之间均具有统计学差 异(P<0.001, PvO.OOl, P=0.021, P<0.001, P=0.012);维生素 A、维生素 Bi、 维生素B2、烟酸和叶酸的摄入量在四组膳食模式之间的差异均具有统计学意义
(P=0.011,户二0.045,户二0.004, P=0.003, P二0.029),而维生素 C 和维生素 E 未显示差异。
5.母乳中的SFA和PUFA的总比例在不同模式间有统计学差异(PvO.OOl, P=0.025),n-6 PUFA的比例也显示有统计学意义(P二0.038);而乳汁中的MUFA, n-3 PUFA和n-6/n-3在4种膳食模式间的差异未发现有统计学意义(P>0.05)。
6.母乳的SFA中,C6:0、C10:0、C11:O和C23:0的比例在不同模式间有统 计学差异(p二0.038, P二0.008, P二0.003, PvO.OOl) ; MUFA 中,C15:l (P二0.048)、 C18:ln9t (P<0.001)和 C18:ln9c (P二0.002)表现出差异性;母乳 PUFA 中, C18:2n6c> C20:2、C20:3n6、C20:4n6 和 C22:6n3 这 5 种 PUFA 在不同的膳食模 式间显示有差异性(P二0.002, F=0.043, PvO.OOl, P=0.018,户二0.020)。 结论:
1.274名乳母的日常能量摄入量以及碳水化合物和蛋白质摄入量的平均水 平均低于参考摄入量,而脂肪的平均摄入量高于参考摄入量。
2.不同膳食模式间乳母的能量摄入、碳水化合物、蛋白质、矿物质和微量元 素摄入量均有所不同。
3.膳食模式可影响母乳中的SFA、PUFA和n-6PUFA的含量。
第三部分:FADS基因表达与乳汁脂肪酸
目的:
探索母乳的PUFA水平在不同FADS基因表达组的差异性,为更准确地研究 母乳PUFA水平与FADS基因相关性提供科学依据。
方法:
研究对象为从2017年1月开始至2017年8月,在长春市某妇幼保健医院招 募的50名产后42-45天的健康汉族女性,调查基本信息问卷并收集母乳。检测 乳汁中的8种PUFA,采用Trizol法提取乳汁中的RNA,使用实时定量PCR实 验检测母乳中的FADS基因mRNA表达水平;提取乳汁中蛋白并结合Western blot 实验技术检测母乳中FADS基因的蛋白表达水平。运用SPSS24.0统计学软件分析 母乳的PUFA水平在不同FADS基因mRNA表达水平和蛋白表达水平组的差异。 结果:
1.本研究乳母的乳汁中AA占总FA的0.8616%, DHA含量为0.2952%□
2.母乳中的GLA含量在FADS1基因mRNA表达水平分组中具有统计学意 义(户二0.009),且FADS1基因mRNA表达水平较高组的母乳GLA含量为 0.3606%,高于FADS1基因mRNA表达水平较低组的0.2869%o
3.母乳中的二十碳三烯酸(C20:3n6)含量在FADS1基因mRNA表达水平 分组中具有统计学意义(卩二0.042),且FADS1基因mRNA表达水平较高组的
母乳二十碳三烯酸(C20:3n6)含量(0.5088%)高于FADS1基因mRNA表达水 平较低组(0.4363%) o
4.母乳中的二十碳三烯酸(C20:3n3)含量在FADS1基因蛋白表达水平分组 中具有统计学意义(户二0.047),且FADS1基因蛋白表达水平较高组的母乳二十 碳三烯酸含量(0.1132%)高于FADS1基因蛋白表达水平较低组(0.0888%)。
5.母乳中EPA含量在FADS3基因蛋白表达水平分组中具有统计学意义 (户二0.040),且FADS3基因蛋白表达水平较高组的母乳EPA含量(0.1366%)
高于FADS3基因蛋白表达水平较低组(0.1012%) o
6.母乳中DHA含量在FADS1基因蛋白表达水平分组中具有统计学意义 (户二0.020),且FADS1基因蛋白表达水平较高组的母乳DHA含量(0.3228%)
高于FADS1基因蛋白表达水平较低组(0.2526%)。
结论:
1.母乳n-6 PUFA中的GLA和二十碳三烯酸(C20:3n6)与FADS1基因的 mRNA表达水平有关。
2.母乳中n-3 PUFA中的二十碳三烯酸(C20:3n3)和DHA与FADS1基因 的蛋白表达水平有关,EPA与FADS3基因的蛋白表达水平有关。
关键词:
乳汁,脂肪酸,FADS基因,膳食模式,基因表达
Abstract
The effects of FADS gene cluster and maternal diet on the
composition of fatty acids in breast milk and its mechanism
Breast milk is also known as ''white blood*'. The healthy and nutritious milk is a rich in various nutrients and considered the most ideal food source to ensure the healthy growth and development of babies. Fats and fatty acids are considered one of the important compounds that provide energy and nutrition for infants. Fatty acids in milk are the main source that promotes the development of the central nervous system in infants, especially polyunsaturated fatty acids, which have been used in infant growth and development.
The amount of fatty acid in breast milk may be affected by the diet and genes of the lactating mother. For the inland lactating mothers who consume fish rarely, the effect of the FADS gene which encodes the A-5 and A-6 desaturase in the PUFA transformation in vivo may be more prominent. But the effects of FADS gene mutations on fatty acid status and many functional SNPs in the FADS gene cluster have not been identified, and no studies have been reported the association between FADS gene expression and fatty acids in breast milk. Studies on the effect of diet on breast milk fatty acids focus on a single diet and supplement intake. Lactating mothers do not consume only one nutrient or food in their daily diets, but take in large amounts of nutrients from various types of food and have specific dietary patterns. Little research has been carried out on dietary patterns and compositional profiles of milk FA. The current study composed of lactating women in Changchun and explored the relationship between the SNP of FADS gene cluster and the level of PUFA in breast milk. The dietary pattern was used to explore the relationship between dietary intake and breast milk FA. A system for detecting FADS gene expression in breast milk was established. The differences in PUFA levels of breast milk in different FADS gene expression groups were analyzed. The current study included the following three parts:
Part I: FADS gene cluster and fatty acids of breast milk
Objective:
To determine the relationship between rsl74547, rsl74553, rsl74602, rs3834458 and rs 1000778 loci in the FADS gene cluster and PUFA levels in breast milk.
Methods:
A total of 420 postpartum 22-25 day lactating women were collected from postpartum care center in Changchun from March 2012 to December 2014. Informed consent was obtained and a comprehensive questionnaire and adequate breast milk were provided. Gas chromatography was used to detect the levels of eight PUFAs in breast milk, and DNA was extracted from breast milk and used the Sequenom MassArray system to perform five SNP typing on the FADS gene clustet. The basic information of the subjects and the eight PUFA levels in breast milk were analyzed by SPSS24.0 software. The relationship between the five SNPs of FADS gene and the PUFA level of milk was analyzed by SNPstats online analysis software.
Result:
1.The levels of LA, ALA, DGLA, EPA, DTA, and DHA in breast milk were correlated with age (P<0.05). The levels of LA, ALA, DGLA, and DTA were associated with maternal postpartum BMI (P<0.05). No PUFA levels were found correlation with dietary source PUFA (P>0.05).
2.The lowest detection rate of the five loci included in the study was rsl74547 (96.19%), the detection rate of other loci was above 97%; the minimum P value of Hardy-Weinberg test was 0.30, which was consistent with Hardy-Weinberg genetic balance.
3.There were no differences in LA, ALA, and DHA levels in breast milk and in different genetic model groups at each SNP (P>0.05).
4.The levels of GLA and AA in breast milk were related to rsl74547 loci, rsl74553 loci of FADS1 gene, rs3834458 loci and rsl74602 loci of FADS2 gene; the optimal model of rsl74547, rsl74553 and rs3834458 loci was codominant model, while the optimal genetic model of rsl74602 loci is dominant model.
5.The level of DGLA in breast milk is related to rs 174547 loci of FADS1 gene and rs3834458 loci of FADS2 gene; the optimal genetic model of the former is dominant model, and the optimal genetic mode of the latter is recessive model.
6.The level of breast milk EPA is related to rsl74547, rsl74602, and rs3834458 loci and the optimal inheritance model of these three SNP is dominant model. EPA is also related to rs 1000778 loci of FADS3 gene, and the optimal inheritance model is recessive model.
7.The level of DTA in breast milk is related to rsl74547, rsl74553, and rs3834458 loci. The optimal model of these three SNP loci is recessive model.
Conclusion:
1.The level of PUFA in breast milk is related to the age of the lactating mother and the postpartum BMI and has nothing to do with the PUFA in the diet.
2.The levels of GLA, DGLA, AA and DTA in breast milk are related to FADS1 and FADS2 gene variants. The level of EPA in breast milk is related to the variation of FADS1, FADS2 and FADS3 genes.
Part II: Dietary patterns and fatty acids of breast milk
Objective:
To study the relationship between dietary patterns and the composition of breast milk FA in lactating mothers. And that provides a scientific basis for a reasonable diet and better feeding of babies in lactating women.
Method:
Using a cross-sectional survey, from January 2015 to June 2017, 274 Han Chinese lactating women from 22 to 6 months postpartum were recruited from Changchun City and questionnaires and milk were collected. The composition of FA in breast milk was determined, and the dietary condition of the subjects was divided into different dietary patterns using principal component analysis. The SPSS24.0 statistical software was used to analyze the differences in the composition of the diet and milk FA of the lactating mothers in different dietary patterns.
Result:
1.The average daily energy intake of lactating women included in this study was 1774.36 kcal, accounting for 77.15% of the recommended intake; the average intake of carbohydrates was 233.76 g/d, the average intake of protein was 67.38 g/d, the average intake of fat was 66.65 g/d, accounting for 70.70%, 84.22% and 104.31% of the recommended intake, respectively.
2.The study was divided into four dietary patterns. Lactating women with
dietary Pattern 1 mainly ate mushrooms and algae, meat, and marine products; those with Pattern 2 mainly ate soybean products, nuts, and dairy products; Pattern 3 mothers mainly ate fruits and vegetables; and Pattern 4 mothers mainly ate grains, potatoes and beans as well as eggs.
3.In different dietary patterns, the average daily intake of energy, carbohydrates, and protein in the lactating mothers and their ratios to their recommended amounts were statistically significant (P二0.014, P二0.004, P二0.002); the daily fat intake and ratio of the lactating mothers were not statistically significant (P二0.556).
4.The daily intake of calcium, iron, zinc, copper and magnesium in the lactating mothers were statistically different among the patterns (P<0.001, PvO.001, P二0.021, P<0.001, P二0.012); vitamin A, vitamin Bl, vitamins B2, niacin, and folic acid intake were statistically significant (P二0.011, P二0.045, P二0.004, P二0.003, P二0.029), while vitamin C and vitamin E did not show differences.
5.The total proportion of SFA and PUFA in breast milk was statistically different among different patterns (PvO.001, P二0.025), and the proportion of n-6 PUFA also showed statistical significance (P=0.038); MUFA, n-3 PUFA and n-6/n-3 were not found to be statistically significant among the four dietary patterns (P>0.05).
6.In the SFA of breast milk, the percentages of C6:0, C10:0, Cll:0 and C23:0 were statistically different among four patterns (P二0.038, P=0.00& P二0.003, P<0.001). In MUFA, C15:l (P二0.048), C18:ln9t (P<0.001) and C18:ln9c (P=0.002) showed differences. In PUFA of breast milk, C18:2n6c, C20:2, C20:3n6, C20:4n6 and C22:6n3 showed differences among different dietary patterns (P二0.002, P二0.043, P<0.001, P=0.018, P二0.020).
Conclusion:
1.The average energy intake, carbohydrates and protein intake are lower than the recommended intake of the 274 lactating mothers, while the average intake of fat is higher than the recommended intake.
2.The intake of energy, carbohydrates, protein, minerals and trace elements in lactating mothers varies from different dietary patterns.
3.Dietary patterns can affect not only the SFA, PUFA and n-6 PUFA levels in breast milk.
Part III: FADS gene expression and fatty acids of breast milk Objective:
To explore the difference in PUFA levels of breast milk of different FADS gene expression groups. And provide a scientific basis of the correlation between the levels of PUFA in breast milk and FADS gene expression.
Method:
The study population consisted of 50 healthy Han women who were recruited for 42-45 days after birth from a maternal and child health care hospital in Changchun from January 2017 to August 2017. The basic information questionnaire and breast milk were collected. Eight kinds of PUFAs in milk were detected. The RNA in milk was extracted by Trizol method. The transcription level of FADS gene in breast milk was detected by real-time quantitative PCR. The total protein in milk was extracted and combined with Western blot experiment to detect the translation level of FADS gene in breast milk. SPSS24.0 statistical software was used to analyze the differences in PUFA levels of breast milk between different FADS gene transcription and translation groups.
Result:
1.AA accounted for 0.8616% of total FA and the content of DHA was 0.2952% in the breast milk of this study.
2.The content of GLA in breast milk was different significantly in the different FADS1 gene transcription groups (P二0.009), and the content of GLA (0.3606%) in the higher level FADS1 gene transcription group was 0.2869% higher than the lower level FADS1 gene transcription group.
3.The content of eicosatrienoic acid(C20:3n6) in breast milk was different significantly in the different FADS1 gene transcription groups (P二0.042), and the content of eicosatrienoic acid in the higher level FADS1 gene transcription group(0.5088%) was higher than the lower level FADS1 gene transcription group(0.4363%).
4.The content of eicosatrienoic acid(C20:3n3) in breast milk was different significantly in the different FADS1 gene translation groups (P二0.047), and the higher FADS1 gene translation level group mothers had higher eicosatrienoic acid content (0.1132%) than the lower FADS1 gene translation level group (0.0888%) in breast milk.
5.The content of EPA in breast milk was different significantly in the different FADS3 gene translation level groups (P二0.040), and mothers in the higher FADS3 gene translation level group had higher EPA content (0.1366%) in breast milk than the lower FADS3 gene translation level group (0.1012 %).
6.The content of DHA was different significantly in the different FADS1 gene translation groups (P二0.020), and mothers in the higher FADS1 gene translation level group had higher DHA content (0.3228%) in breast milk than the lower FADS1 gene translation level group (0.2526%).
Conclusion:
1.The n-6 PUFA in breast milk is related to the transcription level of the FADS gene cluster, that is, the content of GLA and eicosanoid acid(C20:3n6) are related to the transcription level of FADS 1 gene.
2.The n-3 PUFA in breast milk is related to the translation level of FADS gene cluster, that is, the content of eicosanoid acid(C20:3n3) and DHA are related to the translation level of FADS1 gene, and the content of EPA is related to the translation level of FADS3 gene.
Key Words:
Breast milk, fatty acids, FADS gene, dietary pattern, gene expression

第1章前言
1978年,Derek和Patrice Jelliffe在他们的经典著作《现代世界的母乳》中 写到,“母乳喂养在工业化国家和发展中国家都是一个值得关注的问题1981 年,儿科医生Bo Vahlquist指出:“在所有的哺乳动物中,其生殖周期包括孕期和 母乳喂养期;在没有后者的情况下,包括人在内的这些物种都不能存活下来J 1984年,美国儿科学会声明,在拥有良好卫生条件,营养和医疗保健的人群中, 母乳喂养对婴儿后续成人的健康所产生的影响,其好处是很明显的⑴。几十年后 的今天,“生命早期1000天叩勺概念被广泛认可,它包括了母体孕期(280天) 和胎儿出生后直至2岁时期(720天),这是奠定一生健康的最关键期,婴儿良 好的营养状态还能预防各种慢性疾病如肥胖、糖尿病、心血管疾病等的发生[同。
母乳又被誉为“白色血液=由身体健康且营养状态好的母亲分泌的乳汁,富 含各类营养素,是保障足月出生婴儿的健康生长及发育的最理想食物来源⑹。 2009年世界卫生组织(World Health OTganization, WHO)发布的婴幼儿喂养全 球战略中指岀:在婴儿出生的最初6个月应保障纯母乳喂养,在6个月之后添加 辅食仍同时母乳喂养至2岁及以上,以促进其最佳的生长和发育⑺。WHO推荐 的母乳喂养时期正好涵盖了“生命早期1000天^中的胎儿娩出到两岁阶段,因此 母乳是婴儿生命早期最主要的食物来源;尤其对于纯母乳喂养婴儿,乳汁是其出 生后6个月内唯一的食物,提供了他们生长发育所需的全部能量和营养素,其发 挥的作用不可替代;乳汁中丰富的营养物质和特殊的功能作用已引起营养学界的 广泛研究mW。]。
1.1母乳喂养概述
母乳根据产妇分娩后泌乳时间的不同可分为三段,分别是初乳,过渡乳和成 熟乳。通常,在分娩后5天内分泌的乳汁为初乳;在产后5天至2周分泌的乳汁 为过渡乳;分娩2周后的乳汁为成熟乳。不同阶段的乳汁分泌量、外观和组成都 不同⑼。母乳喂养包括纯母乳喂养和混合喂养,通常所说的母乳喂养一般指纯母 乳喂养。WHO定义的纯母乳喂养是指除母乳外,不给婴儿喂任何饮料(甚至不 给水)或食物,但可以添加维生素或矿物质补充剂和药物滴剂或糖浆;而在中国, 习惯上把在喂养母乳基础上添加了水的供给的喂养方式称为纯母乳喂养何。当母 乳不足时,添加了其它母乳替代品共同喂养的方式称为混合喂养。
1.1.1母乳喂养的现况
从全球范围看,各国家的纯母乳喂养率水平并不理想,图1.1列出了世界上 1995年至2013年间的153个国家,12个月内母乳喂养情况:撒哈拉以南的非洲, 南亚和拉丁美洲部分地区12个月的母乳喂养率最高;在大多数高收入国家,母 乳喂养率低于20%⑴。

Figure 1.1 Distribution of breastfeeding worldwide for 12 months from 1995 to 2013[1]

在欧美国家中,来自美国疾控中心的数据显示,在2015年美国出生的婴儿 中,出生时有超过五分之四(83.2% )是母乳喂养;在6个月时超过一半(57.6%) 继续母乳喂养;在12个月时超过三分之一(35.9%)仍进行母乳喂养。与2014 年出生的婴儿相比,2015年出生的婴儿在6个月和12个月时的母乳喂养率有所 上升。但在出生后3个月内不到50%的婴儿是纯母乳喂养,6个月内纯母乳喂养 的婴儿约25%[12】。在加拿大,Gionet等在2013年的研究显示89%的女性产后开 始进行母乳喂养,但只有55%的女性完全母乳喂养至婴儿3个月,6个月时降至 26%[⑶,但6个月的纯母乳喂养率比2010年时有所提高。在2010年时加拿大6 个月的婴儿纯母乳喂养率约为13.8%叫 挪威为35%、瑞典为16%[1】。
在亚洲国家中,来自韩国的一项从1994年到2012年对母乳喂养的调查结果 显示,纯母乳喂养率从1994年到2000年有所下降,但直到2012年逐渐增加;
2012年的最新数据显示,3个月、4个月和6个月的纯母乳喂养率分别为50.0%, 40.5%,和11.4%丽。在印度和菲律宾,6个月的婴儿大约有一半为纯母乳喂养; 而在印度尼西亚和马来西亚约三分之一纯母乳喂养。在泰国和越南,纯母乳喂养 率较低,低于20%。图1.2显示了来自于经合组织参考报告的健康概览数据,为

2016年出版的中国居民营养与健康状况监测结果显示,我国6个月内的婴 儿纯母乳喂养率是20.8%,喂养水平较低;其中农村地区的纯母乳喂养率高于城 市,即城市19.6%,农村为22.3%[叫 杨振宇等对来自中国30个省的55个县的 14 539名2岁及以下(0-730天)儿童进行了调查研究,结果显示婴儿母乳喂养 率加权值为79.6%; 1岁时母乳喂养为11.5%, 2岁时母乳喂养为6.9%切。不同 地域的母乳喂养率有所差异,赵健等对中国的12个中西部省份进行的横断面调 查结果显示,中西部地区总体上妇女产后的母乳喂养率为98.3%,而6个月以下 的婴儿纯母乳喂养率只有28.7%™,但稍高于我国6个月内的婴儿纯母乳喂养水 平 20.8%[⑼。
总体来看,我国母乳喂养率并不理想,为此国家推出了相应政策目标。在 2017年,国务院办公厅印发了《国民营养计划(2017—2030年)》,制定了关 于母乳喂养的两个目标:一是到2020年时,0-6个月婴儿纯母乳喂养率达到50% 以上;二是到2030年时,0-6个月婴儿纯母乳喂养率在2020年的基础上提高 10%™o各相关机构贯彻落实,以促进我国的母乳喂养率得到有效提高。
1.1.2母乳喂养的优点
母乳喂养对婴儿及其母亲在短期和长期都有着许多的健康益处。通过母乳喂 养可改善婴儿的认知功能创,母乳喂养的母亲的患乳腺癌和卵巢癌的风险较低, 还可降低患高血压、高脂血症和心血管疾病风险凹。通过母乳喂养的婴儿还可以 减少在日后其他慢性疾病包括糖尿病(1型和2型)、肥胖症、高血压、心血管 疾病、高脂血症和某些类型的癌症发生325]。最新的一项对11980名儿童的回顾 性研究表明,母乳喂养与儿童的心血管疾病风险因素之间也有关,发现母乳喂养 对儿童甘油三酯水平的保护作用很显著,这为母乳喂养对后期心血管疾病发病风 险的保护作用提供了一些支持[26]。还有研究表明,母乳喂养还可影响婴儿的肠道 菌群;在出生后6个月内,非纯母乳喂养的婴儿中肠道细菌的多样性、微生物群 年龄、拟杆菌和厚壁菌门的相对丰度以及与碳水化合物代谢相关的预测微生物途 径方面始终高于纯母乳喂养的婴儿,而与脂质相关的途径的相对丰度新陈代谢, 维生素代谢和排毒都较低;纯母乳喂养的持续时间较长还与腹泻相关的肠道微生 物群数量减少有关。此外,纯母乳喂养和非纯母乳喂养婴儿之间肠道微生物群的 差异在6个月后仍然存在,可能产生较长远的效应旳。
由于母乳喂养可为婴儿带来众多的健康益处,而对于那些由于各种原因无法 接受足够数量的母乳的婴儿,尤其是早产儿,食用其他女性捐赠的乳汁是很有必 要的,于是诞生了人乳库(human milk banks, HMB),它已在北美和欧洲建立 了 100多年曲。自2013年以来中国大陆第一家非营利性的HMB开始运营,HMB 在中国的运作是基于北美人乳库协会和欧洲一些国家的标准和指南,并经过修改 以满足中国现况的需求,例如仅由当地HMB的医务人员捐赠。HMB在中国发 展迅速,供体人乳不仅用于早产儿,也用于其他患病儿童。从2013年3月至2016 年12月,在中国的公立医院开发并运营了 14家非营利性HMB,总共有2680 名符合条件的捐赠者捐赠了 4608.2升母乳。共有4678名接受者,包括早产儿、 喂养不耐受、产妇疾病、严重感染、坏死性小肠结肠炎、术后和其他疾病的婴儿。 但HMB的发展任重而道远,其可持续性需要相关的卫生部门和政府的适当管理 及更多的财政支持[29, 30]。
1.2母乳的成分概述
母乳是健康婴儿的最佳营养食物,乳汁中含量最多的是水,约占90%;其余 为营养性成分和非营养性的生物活性成分。母乳中的营养成分主要有三个来源: 乳汁中的一部分营养成分来自乳腺细胞中的合成;一部分来源于母亲的膳食;另 一部分来自母体自身的存储⑼。乳汁中的营养成分可分为宏量营养素和微量营养 素,尽管不同乳母个体的膳食和营养状态有差异,但宏量营养素的成分含量在人 群中相对恒定,而它们的水平会随着哺乳期的进展而变化;母乳中的微量营养素 含量在不同个体间差异较大,会随着母体的营养状态变化产生波动;乳汁中的脂 肪酸更会因乳母的膳食和个体营养状态有所不同,是母乳中变化最明显的成分之 一 [31】。
1.2.1宏量营养素
1.2.1.1碳水化合物
碳水化合物在早期阶段对婴儿营养起着较大的作用阳。母乳中的碳水化合物 主要是乳糖,乳糖是由一分子的葡萄糖和一分子的半乳糖共价结合形成的二糖。 成熟乳中的乳糖的浓度约为6.7至7.8g/100mPb是乳汁常量营养素中变化最小 的,有研究表明在产奶量较高的母亲分泌的乳汁中含有较高浓度的乳糖閃。人的 乳汁中的乳糖含量与任何其他物种相比,是最丰富的。乳糖在人体中以最高浓度 存在,对应于人脑的高能量需求列。
近年来,人乳低聚糖(human milk oligosaccharides, HMOs)逐渐引起营养 学界的关注,目前为止已经确定了 150多种不同的HMO。HMOs也占母乳中碳 水化合物的很大一部分,但婴儿难以消化。在成熟乳中,研究发现HMOs的浓 度为5-20g/Lo HMOs由中性和阴离子物质组成,具有5种单糖的结构单元:D- 葡萄糖,D-半乳糖,N-乙酰葡糖胺,L-岩藻糖和N-乙酰神经氨酸。HMOs的基 本结构包括在还原端的乳糖核心,它们被N-乙酰基乳糖胺单元延长,通过广泛 的岩藻糖基化和/或唾液酸化提供更大的结构多样性,在末端位置加入岩藻糖和 唾液酸残基列。它们的功能有防止病原体附着于人细胞表面或粘膜、调节免疫系
统的能力以及调节胃肠道微生物群閃。
1.2.1.2蛋白质
母乳中含有400多种不同的蛋白质,它们具有多种功能:提供营养、抗菌和 免疫调节活性,以及促进营养素的吸收肮37]。成熟足月母乳的平均蛋白质水平约 为0.9至1.2克/lOOml^],随着泌乳期时间的延长,蛋白质水平下降。母乳中的蛋 白质可分为三组,分别为酪蛋白,乳清蛋白和粘蛋白閃。乳清蛋白和酪蛋白可根 据其溶解度进行分类,可溶性乳清蛋白存在于溶液中;而酪蛋白存在于酪蛋白胶 束中,悬浮在溶液中;粘蛋白存在于乳脂肪球膜中。在乳清部分,存在着大量的 a-乳清蛋白、乳铁蛋白、IgS>血清白蛋白和溶菌酶等蛋白质a】。
乳汁中存在着三种酪蛋白:a-酪蛋白,卩-酪蛋白和k-酪蛋白。k-酪蛋白与a- 酪蛋白都和卩-酪蛋白形成稳定的不溶物,进而形成胶体悬浮液(酪蛋白胶束如图 1.3所示)。酪蛋白不形成二硫键,导致胶束形成缠结的网状结构。人类母乳中 含有的酪蛋白约为总蛋白质含量的13%,是所有研究物种的乳汁中酪蛋白浓度 最低的,可能与人类婴儿的生长缓慢相对应跑。

Figure 1.3 Optical microscope image of casein scanning electron microscope (left) and lipid globule in breast milk (right)[35]
学功能,包括抗感染、抗菌、抗炎、免疫调节和益生元活性以及促进细胞增殖和 分化。此外,有临床试验证明了乳铁蛋白在预防早产儿腹泻,新生儿败血症和坏 死性小肠结肠炎中发挥了重要的作用⑷]。杨振宇等对我国妇女哺乳过程中的乳汁 乳铁蛋白的动态变化进行了研究,并探讨了与中国不同种族人群中乳汁乳铁蛋白 浓度相关的因素,研究结果显示在整个泌乳过程中,母乳中乳铁蛋白的浓度会发 生动态变化(初乳3.16g/L、过渡乳1.73g/L和成熟乳0.90g/L);而母体的特征 很少影响乳汁中的乳铁蛋白浓度,但在我国不同的地理区域和种族中乳铁蛋白有 所不同⑷]。
1.2.1.3脂肪与脂肪酸
成熟乳中的脂肪含量为3.2至3.6g/100ml,是乳汁中最主要的能量来源,占 母乳总能量的40%-55%[42】。乳汁的能量范围约为65至70kcal/100ml,与乳汁的 脂肪含量密切相关。早产儿和足月儿母亲分泌的乳汁之间的常量营养素成分不 同,早产奶的蛋白质和脂肪较高肌
母乳中的脂肪是以液态形式存在,其成分绝大多数是三酰基甘油酯(甘油三 酯),占98%;其余部分主要由二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、游离脂肪酸、 磷脂和胆固醇组成。这些成分被包装成乳脂的脂质小球,磷脂形成球体的大部分 膜和核心中存在的甘油三酯的。这些小球通常在1到10微米之间,成熟乳中的 平均直径为4微米时。图1.3右图为来自美国化学学会的母乳脂质球的光学显微 镜图像,也显示了母乳中其他成分的结构更'44]。
甘油三酯由三分子的脂肪酸(fattyacid, FA)和一分子甘油结合而成。母乳 中含有200多种FA,其中大多数FA都以非常低的浓度存在,而其余的FA的则 占主导地位。例如,油酸在母乳中占30-40g/100g脂肪。脂肪酸的从头合成约占 母乳总脂肪的17%。FA根据化学结构的不同,可分为三种:饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)、单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)和多不饱和 脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)o其中PUFA又根据不饱和双键位置的 不同分为n-3系列和n-6系列脂肪酸。长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFA),是链长超过20个碳原子的分子加上2个 或更多个双键构成的,约占母乳中总脂肪酸的2%更]。
母乳中的FA既包括SFA,也包括MUFA和PUFA。母乳中的FA具有不同
的来源:C14:0以下的FA来源于乳腺的从头合成,而链长大于C14:0的FA来源 于母体饮食或身体储存[45]。母乳中的亚油酸(linoleic acid, LA)和a-亚麻酸 (alpha-linolenic acid, ALA)是必需FA,它们不能在人体内合成,因此需要通 过饮食获得。MUFA和LC-PUFA可以从头合成或从体内脂肪组织中动员以及从 膳食脂肪(例如橄榄油、肉、鱼)中获得肌47]。
母亲的饮食会影响母乳的FA组成,一般在餐后8-10小时内出现变化,约占 总FA的30%左右。母乳中FA的种类和含量可以通过改变膳食脂肪或能量摄入 来改变。Nasser等人的研究表明,哺乳期妇女摄入低脂肪和高碳水化合物饮食时, 母乳的中链脂肪酸浓度显著升高跑。
母乳FA不仅受膳食影响,还会随着哺乳期时间的变化而变化。来自我国不 同地区的研究表明,母乳中的总SFA含量在不同哺乳阶段保持稳定,而C10:0 和C12:0的含量会随着哺乳期延长而增加;总MUFA含量从初乳时的34.50%到 过渡乳时的37.06%显著增加;总PUFA含量在初乳中最高(29.58%);成熟乳 中二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid , DHA )和二十碳五烯酸 (eicosapentaenoic acid, EPA)最低,分别为 0.38%和 0.41%,初乳中的 ALA 最 低(1.83%)脚。
Glycerot Fatty adds
o
5J7-1 position"*H2C-O- C- r
sn-2 position —► HC~O_ R
o
h
sn-3 position —►H2C-O- C- R
Figure 1.4 Structure of triacylglycerol with annotation of sn position
脂肪和脂肪酸被认为是提供婴儿能量和营养的重要化合物之一,乳汁中的脂 肪酸是促进婴儿中枢神经系统发育的主要物质来源,尤其是PUFA,在婴儿生长 发育中发挥的作用已获得广泛认可[49'5。]。PUFA在大脑中的积累从胚胎期后期开 始,直至婴儿出生后两岁,约占婴儿大脑干重的15%〜30%叫
1.2.2微量营养素 1.2.2.1矿物质
母乳中的矿物质种类丰富,它们在婴幼儿生长发育过程中也发挥着重要作 用。乳汁中的矿物质可分为3大类:1)主要矿物质,如钙,磷和镁,它们在母 体血清中受到严格调节;2)电解质,包括钠,钾和氯,其在母乳中的含量由分 泌细胞中的电势梯度决定;3)微量元素,如铁,铜和锌,它们在乳汁中的浓度 很低,可能在很大程度上受到母体饮食的影响列。母乳中还含有重金属元素如铅 和汞,有研究表明它们与母亲摄入鱼类有关冈。
乳汁中的铁存在于脂质以及部分低分子量的化合物中,只有少量与乳铁蛋白 结合;铜主要存在于乳汁的脱脂乳中,但乳脂中也存在大量的铜,母乳中的铜结 合蛋白包括酪蛋白,血清白蛋白和铜蓝蛋白;锌存在于母乳的乳清和脂肪部分, 大量的锌与柠檬酸盐,低分子量结合配体以及酪蛋白和血清白蛋白结合,形成锌 结合蛋白。乳汁中还含有碘,乳母的碘摄入量会影响乳汁中的碘浓度。由于哺乳 期主要的碘转运蛋白的表达增加,碘会被泌乳的乳房吸收说。
1.2.2.2维生素
母乳中含有多种维生素。乳汁中的脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、 维生素E和维生素K。乳汁中维生素A的视黄醇在初乳中最高,在成熟乳中达 到稳定。由于婴儿天生就缺乏维生素A储备,母乳中足够的视黄醇对于确保婴 儿健康成长至关重要阿。维生素D在婴儿骨骼的生长,免疫系统的发育和大脑 发育中起着重要作用,但是母乳中的维生素D以较低浓度存在何。初乳中含有 非常高浓度的维生素E,在母乳喂养开始后4-6天内,婴儿体内维生素E的浓度 可达到正常成人的三分之一㈤。人乳中的维生素K主要由叶绿醍(维生素K-1) 和甲基蔡醍-4 (维生素K-2)组成,此外,还有痕量的甲基荼醍-6^o母体内的 维生素K很难穿过胎盘传递给胎儿,并且在母乳中的浓度很低跑。
乳汁中的水溶性维生素包括维生素B族和维生素Co维生素B1又称硫胺, 游离硫胺和硫胺素一磷酸盐是人乳中维生素B1的主要形式旳,母乳中的硫胺浓 度在哺乳的前几个月增加。维生素B1缺乏症是孕妇和幼儿中最常见的公共卫生 问题,可能导致婴儿脚气病,并且是受影响婴儿人群中发病率和死亡率的主要原 因。维生素B2又称核黄素,核黄素及其辅酶形式黄素腺卩票吟二核昔酸是母乳中 维生素B2的普遍形式。母乳中的核黄素与母亲的膳食摄入量呈正相关网,有研 究发现在低收入的印度女性母乳中的核黄素在哺乳期2-4个月时出现峰值,随后 在5-6个月下降,但在营养良好的母乳中核黄素的浓度在哺乳期的前3个月内是 稳定的阿。维生素B3又称烟酸,烟酸包括烟酸(卩比噪-3-竣酸)和烟酰胺(毗噪 -3-竣酸酰胺)、烟酰胺及其辅酶形成烟酰胺单核昔酸、烟酰胺腺卩票吟二核昔酸、 烟酰胺腺瞟吟二核昔酸(P)和烟酰胺核糖昔存在于母乳中阴。毗哆醛是乳汁中 维生素B6的主要形式,母乳中维生素B6浓度在产后最初几周增加3至4倍, 随后逐渐下降。6个月后,单独的母乳可能不足以满足婴儿的维生素B6要求阿。 维生素B12又称钻胺素,只有具有生物活性的钻胺素才被选择性地转运到母乳 中。维生素B9又称叶酸,母乳中的叶酸与乳清蛋白共价结合,主要以翼氨酸聚 谷氨酸和N-5甲基四氢叶酸的形式存在。维生素B5又称泛酸,乳汁中大约85-90% 的泛酸以其游离形式存在,虽然它是脂质代谢的关键物质,但这种维生素在脂质 中不会大量出现。维生素B7又称生物素,它在早期和过渡母乳中发现的形式包 括生物素及其代谢产物双生物素(〜50%)和生物素亚砚(〜10%),在整个泌乳 过程中生物素浓度相对稳定。乳汁中胆碱的形式主要包括游离胆碱及其代谢产物 磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱,其中亲脂性磷脂酰胆碱(卵磷脂)和鞘磷脂的贡献较 小。由于磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的量的增加,其浓度在婴儿出生后6-7天增加 一倍冋。
乳汁中维生素C的生物学相关形式是以脱氢抗坏血酸为代表的。有研究表 明,母乳中的维生素C可降低婴儿过敏的风险a】。各阶段母乳的抗坏血酸在初乳 中含量最高,在哺乳过程中降低。母乳中的抗坏血酸浓度存在很大差异,这在很 大程度上是由于母亲身体状况和饮食摄入量的差异他。在资源匮乏的环境中,母 乳的抗坏血酸浓度与富含维生素C的水果和蔬菜的消费量的季节性变化相关;而 在营养良好的女性中,饮食摄入或补充对母乳维生素C浓度的影响要小得多。维 生素C在早产母乳中比在足月乳中更集中,在吸烟或患有糖尿病的母亲的乳汁中 更低叫
1.2.3生物活性物质
母乳中除了提供婴儿生长和发育的营养成分外,还存在着众多的非营养生物 活性因子,包括生长因子、激素和免疫因子、趋化因子和具有不同生理作用的细 胞因子等。这些生物活性成分的来源有:一些是由乳腺上皮细胞或乳汁中携带的 细胞产生和分泌的,而另一些是从母体血清中摄取的,并通过受体介导的转运途 径转移到乳腺上皮细胞。这些生物活性分子已被证明可以保护新生儿免受呼吸道 和胃肠道的感染,并且在获得性免疫方面具有重要作用[62'6讥除了免疫学效应外, 它们还有助于婴儿的器官发育,此外它们对神经系统,消化系统和心血管系统的 发育也发挥至关重要的作用阴。有研究表明,母乳中还存在着不同种类的细胞, 如白细胞、上皮细胞、干细胞等,如下图1.5所示,这为在分子生物学方面更深 层次的研究母乳提供了可能閃。
CELLS Of HUMAN BREAST MILK

1.3脂肪酸的作用
FA是脂质的主要成分,FA由具有竣基末端(COOH)和甲基(CH3)或co 末端的碳原子的直链组成,并且基于碳链的饱和度进行分类。SFA是没有双键的 脂肪酸;不饱和脂肪酸根据双键的数量和位置进一步分类,MUFA具有单个双键, PUFA具有多个双键。PUFA又可根据双键的位置分为co-3 PUFA或n-3 PUFA (从

碳链(D末端算起,第一个双键位于第三个碳),cd-6 PUFA或H-6PUFA (第一个 双键位于第六个碳)跑。图1.6显示了生活中比较常见的几种不同类型FA的化 学结构。不同类型的FA在人体可发挥不同的作用,由于纯母乳喂养婴儿所需的 FA全部来源于乳汁,因此研究乳汁中的脂肪酸是很有必要的。1.3.1饱和脂肪酸
常见的SFA有棕槁酸(16: 0)和硬脂酸(18: 0),富含SFA的食物包括 乳制品、红肉和棕槁油等。发展中国家母乳的脂肪成分显示出较高水平的SFA, 反映了日常富含碳水化合物的饮食⑹】。棕櫚油是世界上使用最广泛的植物油,棕 櫚油广泛存在于超市产品中,包括人造黄油、谷物、糖果和方便面等食品。在过 去的几十年中,许多研究都集中在饮食中棕槁油的潜在不健康效应,因为其棕槁 酸含量高。棕槁酸是天然存在于动物脂肪和植物油中的主要SFA,也是母乳脂肪 的主要成分。在动物模型中,补充有棕櫚酸的饮食诱导葡萄糖耐量降低,这可归 因于胰岛素敏感性的降低。对人类进行的研究表明,饮食中存在的不同SFA对 二型糖尿病发病率有不同的影响阴。在一项针对绝经后妇女的前瞻性研究中,研 究者发现棕扌闾酸与硬脂酸的摄入量和乳腺癌发病率之间存在正相关[69】。与这项研 究一致的是,之前一项对前瞻性研究的荟萃分析显示,高水平的棕槁酸与绝经后
乳腺癌风险增加89%相关wo】。此外,棕稠酸还可增加人类患心血管疾病的风险;
棕櫚酸过量对氧化应激介导的线粒体功能具有负面影响,这种效应被称为脂毒 性;在喂养小鼠富含棕稠油的饲料后,发现在小鼠血浆中可诱导产生更高浓度的 炎症标志物皿。图1.7中展示了棕櫚油和棕櫚酸对人体健康影响阴。有研究发现 硬脂酸可诱导神经酰胺相关的巨噬细胞死亡,在巨噬细胞内高表达表皮脂肪酸结 合蛋白和脂肪脂肪酸结合蛋白,通过积极摄取饱和及不饱和脂肪酸来调节其免疫 功能。最终结果证明了硬脂酸诱导的巨噬细胞死亡与累积的细胞神经酰胺水平呈
正相关,而巨噬细胞是重要的免疫细胞,巨噬细胞死亡可能引起免疫功能下降[72]。
Figure 1.7 Effects of palm oil and palmitic acid on human health[68]
1.3.2单不饱和脂肪酸
MUFA主要包括棕植I油酸(16: ln-7)、异油酸(18: ln-7)、油酸(18: ln9)、巨头鲸酸(20: ln-9)、芥酸(22: ln-9)和神经维酸(24: ln-9)。其 中油酸是脂类中最丰富的MUFA,膳食MUFA主要的来源有植物油(橄榄油、 榛子、杏仁和油菜籽)和动物脂肪(如猪油、牛脂和黄油)。地中海饮食可降低 心血管疾病风险,它的一个主要特征是摄入MUFA的比例较高,其MUFA主要 来自橄榄油。先前在短期喂养实验中已证实了,用MUFA替代其他常量营养素 会降低血压;有研究者对来自中国、日本、英国和美国的17个人群样本的4680
名志愿者进行横断面流行病学调查,结果发现膳食MUFA的摄入,尤其是植物 来源的油酸,有助于预防和控制一般人群的不良血压水平丽。来自美国的一项研 究证实,富含MUFA的膳食可减少患者体内已建立的疾病生物标志物以及降低 冠心病和2型糖尿病的发病率,并且若遵循每日MUFA摄入量的建议,可能会 节约大量的年度医疗保健和社会成本。富含MUFA的饮食不仅对健康有益,并 且对消费者、食品加工者和医疗保健机构潜在的经济效益都具有实际意义皿。多 项荟萃分析研究表明,受试者在富含MUFA的饮食后,HDL-胆固醇增加和甘油 三酯相应减少;对总胆固醇和LDL-胆固醇的影响似乎不一致,但没有观察到对 血脂的不利影响;与低MUFA饮食相比,使用大量MUFA的短期和长期方案中 发现受试者的收缩压和舒张压的值均降低;这些都表明了 MUFA在降低心血管 疾病风险方面发挥重要作用。在2型糖尿病受试者中,MUFA长期发挥降血糖作 用并降低糖基化血红蛋白水平⑺的。
1.3.3多不饱和脂肪酸
PUFA 分为 n-6 PUFA 和 n-3 PUFA ,n-6 PUFA 如 LA 和花生四烯酸(arachidonic acid, AA),很容易在膳食中获得,如植物油,肉类,蛋类和乳制品;n-3 PUFA 如ALA、EPA和DHA, ALA主要存在于亚麻籽和其他植物油中,而EPA和DHA 主要存在于富含脂肪的深海鱼中,如金枪鱼和鮭鱼。
对于PUFA功能的研究,尤其是LC-PUFA,女口 AA、EPA和DHA, —直是 营养学界关注的焦点。有研究显示,母亲孕期的n-6和n-3 PUFA水平与婴儿心 率和心率变异性有关,婴儿早期的心率和心率变异性反映了自主神经系统的成熟 状况。在婴儿2周、4个月和6个月时使用连续动态心电图进行监测,结果显示 母体n-3 PUFA水平与婴儿的心率呈负相关,与心率变异性呈正相关。相反,母 体n-6PUFA与婴儿心率呈正相关,与心率变异性呈负相关[79】。人体大脑和眼睛 中的DHA浓度很高,提示DHA与大脑和视网膜发育及其功能密切相关。人类 大脑的生长突增发生在大约怀孕的第三个月到出生后的18个月之间,在大脑发 育突增期间,大脑中DHA的含量急剧增加。人的大脑重量从妊娠30周时的约 100g增加到岀生后18个月时的约1100g,在此期间,大脑的DHA含量从900 pig/ g (总共90 mg)增加到3000(ig/ g (总共3300 mg),这表示脑DHA增加了 35 倍跑,结果表明DHA是大脑发育必不可少的物质基础。关于母乳中PUFA水平 与儿童智商关系的研究显示,母乳喂养的持续时间和初乳PUFA水平与队列中儿 童5-6岁时的智商相关;这项研究为母乳喂养及早期PUFA暴露对儿童认知的作 用提供了科学依据刚。母乳中含有的n-3 LC-PUFA被认为是母乳喂养对血压和血 脂谱有益的长期影响的调节因素,有研究证实了在母亲产后4个月乳汁中m3 LC-PUFA的含量与4个月男婴收缩压和舒张压呈负相关;且与女婴的血脂谱也 存在着关联阳。PUFA还在婴儿免疫系统的快速发育及出生后期间具有重要的免 疫调节作用,干预研究表明,补充AA和DHA的喂养婴儿与未补充配方奶粉的 喂养婴儿相比,他们体内的许多免疫功能标志物有所改善,这提示补充PUFA可 带来有益的健康结局,包括降低生命早期发生过敏性和特应性疾病的风险阴。此 外,PUFA还可对心血管健康以及儿童的注意力缺陷/多动障碍、自闭症、运动障 碍、阅读障碍和攻击性中发挥着非常重要的作用附旳。
PUFA不仅对健康人群产生重要影响,还在一些特殊人群中发挥重要作用。 PUFA不仅可影响婴儿的认知功能发育,来自中国的一项针对轻度认知功能障碍 老年人的双盲对照研究中,发现n-3 PUFA还可以改善老年患者的认知功能⑻]。 在对早产儿的研究中,发现n-3 PUFA可能在降低早产儿的支气管肺发育不良、 坏死性小肠结肠炎、败血症和视网膜病变的风险中发挥重要作用跑。有研究显示 脑膜炎也与脑脊液中的脂肪酸有关,研究者收集了入住的3个月至6岁患病儿童 的脑脊液样本,通过气液色谱分析总共81个样品的脂肪酸谱,发现化脓性脑膜 炎中油酸的相对量增加,而n-3 PUFA的相对量减少。提示化脓性脑膜炎及其并 发症败血症的发病与脑脊液脂肪酸的改变有关,主要原因是长链m3多不饱和脂 肪酸的缺乏跑。
1.4影响PUFAs水平的因素
在婴儿期,膳食PUFAs的主要来源是母乳,尤其是DHA和EPA,维持DHA 浓度在整个生命过程中都很重要。哺乳期是婴儿成长的关键时期,母乳DHA供 应不足会影响婴儿心理和视觉发育及其表现;DHA在大脑和眼睛视网膜的结构 和功能中起着至关重要的作用,在胎儿和婴儿期适当的供应对于确保最佳发育至 关重要[9叭母亲分泌的乳汁中脂肪酸成分的多寡可能受到乳母膳食与基因的共同 影响,有研究表明了母亲日常饮食中补充鱼类或DHA能够使乳汁中的DHA含 量显著升高[91】,而基因对脂肪酸的影响则主要表现在编码脂肪酸代谢通路中的关 键酶基因的单核昔酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)所发挥的作 用[92】。研究影响乳汁中PUFAs水平的因素可为科学的哺育婴儿,尤其是纯母乳 喂养婴儿提供理论依据。
1.4.1膳食摄入
膳食摄入是影响PUFAs水平的主要因素。众多研究表明,母乳中DHA的浓 度与乳母摄入鱼的量关系密切,来自丹麦的横断面调查显示,人群中母乳DHA 水平的差异超过10倍,这种变异的55%可以通过母体摄入鱼量的差异来解释阴。 最近的一项随机对照研究也证实了口服磷虾(富含DHA和EPA,且主要与磷脂 酰胆碱结合,从而显著提高生物利用度)能有效地增加母乳中的DHA和EPA含 量网;研究来自其他国家的人群研究如肯尼亚、中国也得到了相同的结论[95,96]。 此外,在孕期额外补充DHA会提高哺乳期乳汁中DHA的水平,日常DHA摄入 高于185mg的乳母乳汁中DHA浓度显著升高[9化在哺乳期,美国的一项研究表 明服用DHA补充剂的女性母乳DHA的含量高于未服用DHA补充剂的女性,且 通过对乳母进行DHA膳食摄入的知识普及,经过一段时间后检测母乳中的 DHA,发现乳汁中的DHA含量会显著增加何。
不同国家和同一国家中不同地区的乳母乳汁中PUFA构成不尽相同。日本母 乳中DHA水平高于欧美国家[99】,中国母乳的PUFA百分比略高于韩国a],中国 母乳的DHA百分含量与世界各国母乳的DHA水平相近,而AA水平高于其他国 家[100]。来自中国杭州(南部)、北京(北部)和兰州(中部)三个地区乳母同 一时期乳汁中的SFA、MUFA和PUFA构成情况差异均有显著性(PvO.OOl); 杭州地区乳母膳食摄入较多的鱼类,且鱼的摄入量与分泌的乳汁中EPA和DHA 成分呈正相关何】。一项来自对中国的沿海地区、湖泊地区和内陆地区三组哺乳 期女性人群的调查研究显示,三个不同地区哺乳期妇女的血浆、红细胞和母乳 DHA浓度之间存在着差异性,且母乳、血浆和红细胞DHA浓度与DHA膳食摄 入量呈正相关,沿海地区的DHA摄入量最高(24.32 mg/d),其次是湖地(13.69 mg/d),内陆最低(8.84 mg/d)〔9叭

膳食摄入的PUFA种类不同,也会影响母乳中不同PUFA的水平。在体内 PUFAs的转化过程中存在着n-3和n-6两条合成通路,如图1.8所示,LA和ALA 是PUFA通路中转化的前体物质,是体内不能合成的两种必需脂肪酸,只能由食 物供给。
在人体内n-3 PUFAs和n-6 PUFAs代谢过程中,关键酶同时在两种PUFAs 的转化进程发挥作用,因此n-3 PUFAs和n-6 PUFAs由前体物质向下转化时存在 竞争关系,如图1.8[102]o食用富含LA的食物可降低体内40%的ALA转换率, 乳母在孕期服用鱼油(富含11-3卩1^人$中的£卩人和。11人),其婴儿红细胞膜上 的AA (n-6 PUFA)水平比服用橄榄油乳母的婴儿高;摄入富含LA和DHA,而 不含AA的食物可使血浆中AA水平的降低。维持体内PUFAs的平衡需合理摄 入膳食,为此我国推荐了 n-3 PUFAs和n-6 PUFAs的膳食摄入比例,其适宜比为 (4〜6: 1)〔"I。
1.4.2 FADS基因多态性
膳食摄入对PUFA的影响主要针对于沿海地区日常摄入鱼较多的人群,而对 于许多低的PUFA膳食摄入量的人群来说,组织中EPA和DHA水平也受到ALA 的生物转化率的影响。4-5和\6去饱和酶是参与必需脂肪酸(ALA和LA)生 物转化为较长链PUFA的关键酶,编码它们的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase, FADS)基因簇位于人的第11号染色体上,包括FADS1、FADS2和

FADS3基因,见图1.9。其中FADS1和FADS2基因分别编码4-5和\6去饱和 酶,它们通过在脂肪酸碳链上的碳原子之间加入双键调节不饱和脂肪酸的合成代 谢,见图1.8。FADS1和FADS2基因在n-6和m3脂肪酸代谢通路中发挥的作用 已被广泛认可,而FADS3基因所发挥的作用尚不明确【I。%

众多研究表明人群中FADS基因特定的SNP可影响关键酶对PUFAs的转化 效率,进而影响体内LC-PUFAs的合成和生物利用度,使得体内LC-PUFAs水平 各不相同。迄今为止,FADS基因变异对脂肪酸状态的影响以及FADS基因簇中 的很多功能性SNP均未被鉴定。有研究表明,FADS次等位基因的携带者的血浆 和组织具有较高的LA和ALA的水平,以及较低水平的AA、EPA以及较低的 DHA水平。现有研究结果表明,FADS次等位基因也与炎症和心血管疾病风险 降低有关[io%研究FADS的功能性SNP可有助于改进人群补充EPA和DHA建 议,从而可以为携带FADS次要等位基因的人推荐额外的n-3 LC-PUFA摄入量。
近期的一项研究表明,FADS基因的rs 174546和rs 174450位点变异与血浆中 n-6 PUFA的水平相关,并与妊娠时间存在关联[1。叫来自瑞典的一项研究显示, FADS基因簇的rsl02275和rsl74448位点的次等位基因青少年携带者血清中有较 低水平的AA,且由于FADS多态性导致的去饱和酶降低的血清中n-6 PUFA水 平与降低的湿疹发展风险相关[io®。一项对抑郁症患者的研究显示,FADS基因 rsl74537和rsl74547位点变异与患者体内ALA水平有关,且rsl74537和rsl74547 的次等位基因与重度抑郁症的患病率显著相关,可能是FADS基因变异通过调节 体内的ALA水平在重度抑郁症的病理生理学中发挥的作用[1切。另有研究表明了 FADS基因rsl74537位点的变异不仅影响血清中AA的合成,而且影响全血合成 5-脂氧合酶产物的总体能力,说明与FADS基因型相关的PUFA水平的变化可能 在各种炎症性疾病中具有重要意义a叭 关于FADS基因与脐带血浆中的 LC-PUFA关系研究表明,母亲与后代的FADS基因的SNP可共同发挥作用。母 体和儿童的FADS基因型和单倍型均影响脐带血浆中LC-PUFA的量和比例,这 项关于FADS基因型和脐带脂肪酸的研究表明,胎儿体内的LC-PUFA水平在某 种程度上是通过胎儿摄取的脂肪酸转化而来,特定单倍型的关联表明FADS基因 的rs498793和rs968567位点对脂肪酸代谢具有特异性作用;母体的FADS基因 SNP与脐带血浆中前体n-6 PUFA的水平相关,而儿童FADS基因型主要与更高 度去饱和的n-6 LC-PUFA相关何。此外,有研究证明了母亲FADS基因型还与 婴儿6个月时的免疫反应相关,研究者发现母乳的AA水平与婴儿体内IL-10、 IL-17、IL-5和IL-13的产生呈负相关,而EPA与血液调节性T细胞和细胞毒性T 细胞的计数呈正相关,并且T辅助细胞计数减少。FADS次等位基因与母乳中较 低的AA和EPA相关,母亲携带FADS中rsl74556位点次等位基因的婴儿体内 产生IL-10较高,这项研究的结果可能是由于母体FADS变异对母乳中LC-PUFA 水平的调节,通过母乳的转移影响了婴儿的免疫反应[I】。】。
1.5研究依据、内容和创新点
1.5.1研究依据
关于人体内FADS基因簇与PUFAs之间关系的研究主要来源于血浆和红细 胞膜,而对乳母乳汁中FADS基因簇和PUFAs之间关系的研究甚少。本课题组 先前的研究证实了 FADS2基因中的SNP (rsl535 )和2位点单倍型 (rs3834458-rsl535, rsl535-rsl74575)与母乳中严亚油酸(GLA)和 AA 的浓度 相关。在FADS1基因中,2位点构建的单倍型(rsl74547-rsl74553)也影响GLA 和AA浓度(&0.05)。上述SNP和单倍型的次要等位基因携带者具有较低浓度 的GLA和AA。在FADS2基因中,3位点单倍型rs3834458-rsl535-rsl74575显著 影响GLA的浓度,但不影响AA。成对比较显示,FADS3基因中SNPrs 1000778 的主纯合子个体在其母乳中具有较低浓度的ALA和LA,表明了在中国汉族哺乳 期妇女人群中,FADS基因簇的多态性可能影响母乳中的PUFA浓度[in】。但先前 的研究收集了 209名哺乳期女性,需要收集更多的志愿者来验证这一结论。
近年来,膳食模式成为研究人群膳食摄入的焦点。由于日常生活中人们不只 摄取一种营养素或食物,而是从各种类型的食物中摄取大量营养素,并且形成了 固定习惯的饮食模式。关于膳食模式的研究,主要集中于膳食模式与疾病间的关 联。如一项关于膳食模式与抑郁风险的潜在关联的荟萃研究显示,一种以较多水 果、蔬菜、全谷物、鱼、橄榄油、低脂奶制品、抗氧化剂摄入量高和动物性食物 摄入量低的健康膳食模式,与抑郁症的患病风险降低有关;另一种膳食模式,其 特征是以红色和/或加工肉类、精制谷物、甜食、高脂肪乳制品、黄油、马铃薯 和高脂肪肉的高消费量,以及低水果和蔬菜摄入量的西式膳食模式与增加患抑郁 症的风险相关[112]。此外,膳食模式还与2型糖尿病、心血管疾病、胰腺癌等疾 病间存在密切关联["1叫 而未见关于膳食模式与乳汁fa构成谱的研究,因此, 可以用膳食模式来解释膳食摄入与母乳FA之间的关系。
母乳中除含有非富的营养物质外,还含有多种细胞,包括免疫干细胞、祖细 胞和上皮细胞。除细胞外,乳汁中还存在着mRNA和microRNAs,表明它们在 乳母和母乳喂养的婴儿体内可能发挥着重要作用。国内外相关研究表明,从动物 和人的乳汁中提取出的RNA均可进行实时定量PCR检测,为后续研究相关FADS 基因表达和机制提供实验依据MG 116]。
乳母作为一类特殊群体,其分泌的乳汁直接被婴儿食用,乳汁中的FA直接 作用于婴儿机体的生长发育,研究其乳汁中的FA构成情况具有很好的指导意义。 中国人与其他国家相比具有不同的膳食习惯,由于膳食脂肪酸在体内转化效率较 低,对膳食中摄入较少鱼类人群而言,基因编码的关键酶所发挥作用更为突岀, 本研究拟在膳食摄入和基因机制两方面,研究中国北方乳母乳汁中的脂肪酸构成 谱及其影响因素并探索FADS基因簇的相关表达所发挥的作用,可为指导乳母个 性化营养措施和更好的哺育婴儿提供科学依据。
1.5.2研究内容
母乳脂肪酸的水平受乳母膳食和基因的共同影响,长春市位于我国东北部内 陆地区,乳母的膳食习惯具有一定的地域代表性,且国内对于FADS基因多态性 及其表达对母乳脂肪酸影响的研究很少。本研究旨在从膳食摄入和FADS基因两 方面,研究它们对母乳脂肪酸水平的影响,为指导哺乳期女性更合理的膳食摄入, 改善母乳脂肪酸状况及科学的哺育婴儿满足其生长发育需求提供理论依据。
本研究的内容主要包括三个方面:①招募了中国北方汉族乳母人群,收集乳 汁并进行膳食调查,检测母乳中的PUFA并提取乳汁中的DNA,研究了 FADS 基因簇的5个SNP对乳汁脂肪酸的影响;本部分的研究对象来源于某产后护理 中心,由于乳母食用统一的供餐,可排除膳食因素对母乳PUFA的影响,为更好 的研究基因多态性与母乳PUFA间的关系奠定基础。②由于第一部分的研究人群 不具有膳食代表性,因此无法划分为不同膳食模式,本部分的研究扩大了招募研 究对象的方式,来源于产后护理中心、网络招募和妇幼保健院三种途径;检测母 乳中的脂肪酸构成谱,使用主成分分析法将乳母膳食分为不同的膳食模式,研究 乳母膳食模式与乳汁脂肪酸构成谱之间的关系。③收集新鲜母乳,提取乳汁中的 RNA和蛋白质,研究FADS基因表达与乳汁脂肪酸的关系。
三个部分的研究概况见图1.10所示,第一部分的研究为探究FADS基因多 态性对母乳中PUFA水平的影响,从FADS基因DNA层面发现母乳PUFA水平 与FADS基因的SNP间关系,并研究了日常膳食的PUFA摄入水平与母乳PUFA 的相关性;第二部分为研究乳母膳食习惯对乳汁脂肪酸构成的影响,根据乳母膳 食摄入情况划分为不同膳食模式,分析乳汁脂肪酸与膳食习惯间的关系;第三部 分为研究FADS基因的相关mRNA和蛋白表达水平对母乳中PUFA水平的影响, 探索FADS基因对母乳PUFA影响的分子生物学机制。

1.5.3创新点
本研究运用主成分分析法将乳母的膳食划分为不同的膳食模式,并研究了膳 食模式与乳汁FA构成谱之间的关系;建立了从中国母乳样本中提取RNA和目 的蛋白的方法体系,初步探索了母乳中FADS基因表达与PUFA水平间关系。
第2章FADS基因簇与乳汁脂肪酸
2.1引言
根据WHO的建议,婴儿在岀生后六个月内需纯母乳喂养,但母乳仍然是儿 童直到两岁或以上的重要营养来源⑺。人的乳汁提供婴儿生长所需的所有不同种 类的FAo DHA在婴儿大脑发育中是从妊娠中期到出生后两年内有着明显的积 累,有研究表明在分娩时母亲具有较高的DHA水平与婴儿期早期较长的持续注 意力有关,并在12-18个月时降低了后代的注意力分散",提示了 DHA对后代 生长发育可产生短期及长期的有益影响。母乳是生命早期的主要食物来源,乳汁 中需含有足够量的各种FA以满足哺乳期婴儿的需求,而PUFA水平低可能对婴 儿生长发育产生长期的不良影响in讥
长春市位于我国东北部内陆地区,日常膳食摄入较少鱼类,因此FADS基因 编码的A-5和4-6去饱和酶在体内PUFA转化中所发挥作用可能更为突出。FADS 基因特定的SNP可影响A-5和\6去饱和酶的活性,进而影响体内LC-PUFAs 的合成,使得体内LC-PUFAs水平各不相同。由于FADS基因变异对母乳PUFA 水平的影响以及FADS基因簇中的很多SNP均未被确定,本研究收集了长春市 的健康乳母,研究了 FADS基因簇的SNP与乳汁PUFA之间的关系,为确定FADS 基因簇中是否存在功能性的SNP并为指导乳母个性化营养措施和科学地哺育婴 儿提供依据。
2.2材料与方法
2.2.1研究对象
2.2.1.1 SNP 的选取
应用Hapmap和查阅NCBI数据库,获得FADS基因的SNP信息。根据相关 的研究报道和次等位基因频率>10%,本研究最终确定了 FADS基因簇的5个 SNP,其中 rsl74547 和 “174553 位于 FADS1 基因,rsl74602 和 rs3834458 位于 FADS2基因,:rsl000778位于FADS3基因。rs3834458位点在FADS2基因启动子
区域,其余4个位点均是内含子。
221.2样本量的估计
样本量的计算采用描述性研究中样本量的公式n = ^p(l-p)获得, a=0.05时,^=1.96^2; 〃为容许误差,由于本研究中乳母群体的特殊性, d=0.2p,因此公式转换为〃 = 100x上左。从NCBI中获得位点的次等位基因频
P
率为P进行计算,每个位点均采用东亚人群中的次等位基因频率,其中rsl74547 位点的次等位基因频率为0.424, rsl74553位点的次等位基因频率为0.425, rs 174602位点的次等位基因频率为0.379, rs3834458位点的次等位基因频率 0.426, rsl000778位点的次等位基因频率0.298o这5个位点分别对应的样本量 为136、136、164、153和236人,因此至少需要236人。由于基因多态性检测 中可能存在未检岀情况,在检测率为80 %时,至少所需样本量 n = 2% = 295 q 300 人。
80%
2.2.1.3研究对象的确定
研究对象为2012年3月至2014年12月在长春市某产后护理中心招募的600 名产后22-25天的哺乳期健康女性,由于乳汁分泌较少等原因退出本研究86名, 剩余514名乳母。其中有420名乳母的问卷信息完善并提供足够母乳。本研究的 纳入标准如下:产后身体健康的汉族乳母,年龄<40岁,无特殊膳食习惯;娩出 的婴儿为健康单胎的足月儿。排除标准:孕期和哺乳期患有合并疾病如妊高症、 妊娠糖尿病和其他脏器疾病的乳母,胎儿为多胎及早产。纳入本研究的乳母均签 署了知情同意书。
2.2.2实验试剂和仪器
2.2.2.1实验试剂 十七烷酸甲酯(>99%) 亚油酸甲酯(>99%) 广亚麻酸甲酯(>99%) a-亚麻酸甲酯(>99%)2.2.3实验方法
2.2.3.1乳汁收集
采用手挤法在上午9:00-11:00之间收集研究对象的乳汁,弃去前几滴后,收 集乳汁于干净的一次性收集桶内,收集完毕后轻轻混匀,将乳汁倒入2个洁净的 收集管中,每管10ml,标记好后拧紧管盖。收集完毕后将样品迅速置于4°C的冰 箱中,冷却后储存至-80°C的冰箱中,并在1个月内检测乳汁脂肪酸。
2.2.3.2 基本信息调查
采用面对面调查的方式,在收集乳汁时完成对志愿者基本信息问卷的填写。 基本信息问卷内容包括研究对象的姓名、年龄、联系方式、家庭月收入、身高、 体重和生活方式等信息;问卷还包括了婴儿的一些信息,如出生体重、出生身长、 性别、胎龄等。
2.2.33 3d24h膳食调查
采用面对面的方式,详细调查研究对象在收集乳汁前3天的膳食情况。采用 膳食回顾问卷,内容包括了每天每餐食用的食物及每餐间隔内的食物摄入,记录 志愿者食用的食物种类和数量。将3d24h膳食问卷收集的内容输入孕产妇版的金 钥匙营养专家系统软件(上海营康)内,获得研究对象的膳食摄入能量和各类营 养素数据。
2.2.3.4膳食频率调查
同样采用面对面方式,调查研究对象近一年内日常生活中食用的各类食物种 类和数量。问卷中包含了日常生活中常见的食物,根据研究对象的不同情况按照 每天、每周和每月的摄入量(以g为单位)进行记录。计算某种食物的日常摄入 量公式为:日常摄入量(g/d)二每天食用量+每周食用量/7+每月食用量/30。如某 种日常摄入较少的食物每月食用300g时,需在每天和每周的食用量处标记为0, 最终获得这种食物的日常摄入量为10g/d。根据膳食摄入量和食物成分中的PUFA 含量,计算乳母的膳食PUFA摄入水平。
2.2.3.5乳汁PUFA的检测
[1]标准曲线的绘制
本研究检测的为母乳中的8种PUFA,包括LA、GLA、ALA、DGLA、AA、 EPA、DTA和DHAo以C17:0为内标物,将这9种FA甲酯的混合标准溶液按照 不同的浓度梯度稀释。在设定的检测条件下分离不同浓度混合标准溶液中的9种 FA甲酯,记录每种FA甲酯的保留时间和峰面积。每种浓度的混合标准溶液检 测完毕后,以FA甲酯的浓度为横坐标,以各浓度下对应的FA甲酯的色谱峰面 积/内标物峰面积的值为纵坐标,回归分析后获得该FA甲酯的标准曲线。检测母 乳样品时,需记录下样品图谱中各FA甲酯的保留时间和峰面积,将样品中各FA 甲酯的保留时间与9种FA甲酯的混合标准溶液进行比对,确定母乳样品中的8 种PUFA甲酯和内标物的峰面积,将测定的母乳样品某种PUFA的峰面积/内标 物的值带入先前获得的回归方程中,计算出该PUFA在母乳中的含量。
[2]乳汁的前处理
采用直接酯化一步法,将乳汁中的脂肪酸转化为脂肪酸甲酯化产物。实验前 一天从-80°C的冰箱中取出待测乳汁,置于4°C冰箱中过夜。用lOOul的移液器轻 轻吸取上层乳脂于洁净的10ml玻璃离心管中,取两次共计200ul。称重后加入 45ul的十七烷酸(C17:0)作为内标物,再加入2ml的以体积比为4: 1配制的甲 醇和苯的混合液,拧紧管盖后震荡管内混合物使其充分混匀。静置lmin,在充 满氮气的通风环境中缓慢逐滴加入200ul乙酰氯,边加边轻微震荡摇匀。拧紧以 Teflon为内衬的管盖后,置于100°C的甘油中加热,lh后取出。用冷水冷却加热 完成的离心管,拧开盖子缓慢加入5ml质量浓度为6%的碳酸钾溶液,边加边缓 慢震荡使反应终止。待管内不出现气泡后拧紧盖子,以3000r/min的速度离心 lOmin。离心完成后,用移液器缓慢吸取上层淡黄色的苯相液于1.5ml的Ep管中, 可直接用气相色谱仪进行检测。
[3]母乳FA的检测条件
使用气相色谱仪(GC-14C, SHIMADZU Corp., Kyoto, Japan)和色谱柱 (SP-2560, Supplco 100 mx0.25 mmx0.20|Lim)进行乳汁中不同种类的脂肪酸甲酯 检测。检测条件设置如下:初始柱温为140°C,保持5min后以4°C/min的速度 升温至260°C并维持20 min;以99.999%的高纯度氮气为载气,氮气流速为 lml/min;汽化室的温度为260°C,分流比为50:1;检测室(FID)的温度为280°C; 氢气的流速为40ml/min,空气流速为500 ml/min。使用进样器吸取lul的苯相液, 吸取液体时避免出现气泡,手动进样后进行脂肪酸甲酯的分离检测。
2.2.3.6 FADS基因簇的SNP分型
[1]母乳DNA的提取
实验前一天取1管乳汁于4°C冰箱中融化过夜,使用DNA提取试剂盒提取 母乳中细胞的基因组DNA,步骤同本课题组先前的研究一致冋,具体如下:
(1)从母乳的中间层吸取1.5ml于洁净的Ep管中,在15000r/min的条件下 离心lOmin;
(2)吸取离心后的1.2ml乳汁至盛有先前加入0.3ml的细胞裂解液的离心管 中,轻轻吹打混匀。
(3)盖好管盖,每间隔2-3min上下颠倒混匀一次,置于室温下反应约
20min;
(4)在13000r/min的条件下离心3.5min;
(5)离心完成后弃去上清液,向管中加入200ul的GS缓冲液,震荡混匀;
(6)向管中加入20ul的蛋白酶K溶液及200ul的GB溶液,吹打混匀;
(7)在56°C的水浴锅中水浴lOmin,在此过程中每隔2min颠倒混匀一次;
(8)水浴完成后向管中加入200ul的无水乙醇,在管内可出现絮状物;
(9)将絮状物悬液转移到吸附柱CB3中后进行编号;
(10)在13000r/min的条件下离心70s;
(11)弃去收集管中的废液,加入500ul的去蛋白GD溶液于CB3柱中;
(12)在13000r/min的条件下离心70s;
(13)弃去收集管中的废液,加入700ul的PW溶液于CB3柱中进行漂洗;
(14)在13000r/min的条件下离心70s;
(15)弃去收集管中的废液,再次加入600ul的PW溶液于CB3柱中进行漂洗;
(16)在13000r/min的条件下离心2min;
(17)弃去废液,用吸水纸轻轻吸干液体,置于室温下干燥20min;
(18)将CB3柱放入新的Ep管中,在柱膜的正中心上方悬空滴加TB洗脱 液30ul,室温下静置lh;

(19)在13000r/min的条件下离心3min;
(20)收集离心后提取的DNA样品30ul;
(21)检测母乳中提取的DNA样品的纯度和浓度。
[2] SNP的分型
应用Sequenom MassArray系统进行FADS基因的SNP分型,具体流程为: 首先将SNP序列信息整理成标准格式,然后将信息输入到软件进行SNP位点的 引物设计,确定目的位点并合成引物;将引物稀释后加入定量好的待测样本,进 行384孔的PCR反应;而后进行384孔的SAP纯化反应和384孔的单碱基延伸 反应;继而进行树脂纯化步骤,上机检测纯化的产物并收集结果。本研究中的5 个SNP位点的引物设计均以待测位点为中心,获取lOObp以上的基因序列,应 用AssayDesigner3.1软件进行引物的设计,引物的合成由北京博淼生物完成。本 研究中的5个SNP的引物序列见表2.1o
Table 2.1 The primer sequences of five SNPs in FADS genes (5'-3‘)
Sequence
Forward ACGTTGGATGAGACTGGAGCATAACACAAC
ACGTTGGATGGAGCCTCAGGCTAATGAGAA
2.2.4数据库建立
使用Excel 2010软件建立基本信息数据库、3d24h问卷获得的膳食能量、营 养素数据库、膳食频率问卷获得的日常摄入食物的种类和数量数据库和乳汁脂肪 酸数据库。SNP分型的结果也汇总入Excel中并整理成标准格式,建立5个SNP 基因的数据库。
2.2.5数据分析
使用SPSS24.0软件分析研究对象的基本信息及母乳中的8种PUFA水平, 数据是否满足正态分布使用Kolmogorov -Smirnov检验来判断。满足正态分布的 计量数据采用Mean+SD表示,非正态分布的计量数据采用Median(P25, P75)来 表示,计数资料使用构成比表示。母乳中的8种PUFA水平与膳食PUFA摄入量、 乳母的年龄和产后BMI间的关系使用一元线性相关分析;使用SNPstats在线分 析软件(https://www.snpstats.net/staTt.htmq二snpstats/start.htm)分析 FADS 基因的 5个SNP与乳汁PUFA水平间的关系,并建立与PUFA水平相关的该SNP的最 优遗传模式。
2.2.6技术路线
本研究的技术路线详见图2.1所示。

Figure 2.1 Flow diagram of the study
2.3实验结果
2.3.1研究对象的基本情况
本研究纳入的研究对象为420名哺乳期的健康汉族女性,她们的平均年龄为 30.28+3.39岁。研究对象的平均孕期增重为18.61+6.25 kg,平均产后BMI为 24.26+3.25 kg / m2o婴儿的平均出生体重为3.46+0.52 kg,平均出生身长为 50.50+1.31 cmo有50.24%的婴儿是男孩,86.43%的婴儿是头胎。研究对象的基 本情况见表2.2o
Table 2.2 Maternal and infant demographics of this study
Characteristics Mean+SD/n(%)
Maternal age (year) 30.28+3.39
Postpartum BMI (kg/m2) 24.26+3.25
Gestational weigh gain (kg) 18.61+6.25
Birth weight (kg) 3.46 +0.52
Birth length (cm) 50.50+1.31
Gender of infant
Boy 211 (50.24)
Girl 204 (48.57)
Missing 5 (1.19)
Parity of infant
First 363 (86.43)
Second 47 (11.19)
Missing 10 (2.38)
2.3.2研究对象的膳食营养素摄入量
研究对象日常摄入的能量和三大宏量营养素情况详见表2.3。本研究纳入的 哺乳期女性日常能量摄入的平均水平为2627.75 kcal,稍高于参考摄入量2300 kcal/d;三大宏量营养素中碳水化合物的平均摄入量为335.71 g/d,蛋白质的平均 摄入量为112.70 g/d,脂肪的平均摄入量为83.94 g/d;其中碳水化合物和脂肪的 供能比分别是54.13%、28.73%,在推荐范围内;而蛋白质的供能比为17.14%, 略高于推荐摄入的比例。

Table 2.3 The energy and macronutrient intake per day of the participants
Energy/
Macronutrient Average Intake(kcal/d or g/d)
[Median (P25,P75)] DRIs*
(kcal or %) Provided energy proportionA(%)
Energy 2627.75(2080.07,2962.05) 2300 -
Carbohydrate 335.71(264.05,399.65) 50 〜65 54.13
Protein 112.70 (80.81 , 142.80) 10 〜14 17.14
Fat 83.94 (72.24 ,103.39) 20 〜30 28.73
*The DRIs of macronutrients are their AMDR from Chinese dietary reference intakes 2013. AActual intake divided by the recommended nutrient intake per the Chinese Nutrition Society (%).

表2.4为根据膳食频率问卷获得的本研究中乳母的膳食PUFA摄入情况,其 中LA和ALA为必需脂肪酸,平均摄入量为18.88g/d和1.78g/d,均比参考摄入 量高;EPA和DHA的平均摄入量分别为10.41mg/d> 14.41mg/d,分别占参考摄 入量的20.82%和7.21%,摄入水平较低。
Table 2.4 The daily dietary intake of fatty acids of lactating mothers
Fatty Acids Dietary intake
[Median (P25,P75)] RNI (Al) * Intake/RNI (Al) (%)A
LA(g) 18.88 (15.91,24.48) 10.20 185.10
ALA(g) 1.78 (1.06, 2.32) 1.53 116.34
DGLA(mg) 0.36 (0.00, 1.03) - -
AA(mg) 10.03 (3.81, 23.26) - -
EPA(mg) 10.41 (1.69, 26.97) 50 20.82
DTA(mg) 0.84 (0.00, 3.60) - -
DHA(mg) 14.41 (2.72, 36.15) 200 7.21
*No data from the Chinese dietary reference intakes (DRIs) 2013.
AActual intake divided by the recommended nutrient intake per the Chinese Nutrition Society (%). -Represents no data temporarily.

2.3.3母乳PUFA与膳食PUFA
根据乳汁脂肪酸检测的结果,母乳中含量最高的为LA,在每100g乳汁中的 平均水平为0.3643g;其次为ALA,在每100g乳汁中的平均水平为0.1447g;排 在第三位的为AA,在每100g乳汁中的平均水平为0.0784g;研究对象的母乳中 8种PUFA的水平见表2.5 o

Table 2.5 The levels of PUFAs in breast milk for lactating mothers
Fatty Acids Concentration (g/lOOg, Mean+SD)
LA 0.3643 + 0.1827
GLA 0.0408 ± 0.0229
ALA 0.1447 + 0.0752
DGLA 0.0535 ± 0.0285
AA 0.0784 ± 0.0388
EPA 0.0086 ± 0.0055
DTA 0.0182 + 0.0091
DHA 0.0517 + 0.0309

有研究表明了乳汁中的PUFA水平与乳母的年龄和BMI有关[I% 表2.6为 本研究中的母乳PUFA和母亲年龄、产后BMI及膳食FA摄入的相关分析结果。 母乳中的6种PUFA水平与年龄相关,分别为LA、ALA、DGLA、EPA、DTA 和DHA;检测的8种PUFA中,有一半的PUFA与乳母产后BMI相关,分别是 LA、ALA、DGLA和DTA;由于未能获得膳食中的GLA含量数据,我们研究 了 7种乳汁的PUFA水平与其对应的膳食摄入PUFA之间的关联,未发现母乳 PUFA水平与膳食来源PUFA的相关性。
Table 2.6 The relationship between dietary FA and the FA in breast milk
PUFA Age Postpartum BMI Dietary FA*
r P r P r P
LA 0.100 0.041 0.112 0.027 0.023 0.663
GLA 0.089 0.068 0.048 0.343 - -
ALA 0.123 0.011 0.110 0.030 0.091 0.080
DGLA 0.172 <0.001 0.126 0.013 -0.033 0.515
AA 0.093 0.058 0.084 0.098 -0.010 0.839
EPA 0.193 <0.001 0.044 0.387 -0.001 0.983
DTA 0.150 0.002 0.107 0.035 -0.007 0.887
DHA 0.125 0.010 0.073 0.148 0.033 0.526
^Refers to the corresponding dietary fatty acids of each milk fatty acid
2.3.4母乳PUFA与FADS基因簇的SNP
本研究共筛选5个SNP,表2.7列出了 FADS基因簇上的5个候选SNP的具 体特征。这5个位点的检岀率最低的为rsl74547 (96.19%),其他位点的检出率 均位于97%以上,检出率较高。以M代表该位点的主等位基因,次等位基因用 m代替,本研究中纳入的这5个位点中的Hardy- Weinberg检验的P值最小的为 0.30,均大于0.05,这表明5个候选位点均符合Hardy- Weinberg遗传平衡,即本 研究中的哺乳期女性具有群体代表性。
Table 2.7 The characteristic of candidate SNPs in the FADS gene cluster
SNP Genotyping Alleles Genotype (n) HWE
Success rate (%) M/m MM Mm mm
FADS1 rs 174547 96.19 T/C 201 164 39 0.55
rsl74553 97.86 A/G 203 170 38 0.81
FADS2 rs 174602 97.62 A/G 248 140 22 0.67
rs3834458 97.38 T/DEL 201 167 41 0.48
FADS3 rs 1000778 97.86 G/A 259 130 22 0.30

运用SNPstats在线分析软件,将研究中的5个SNP分为4种不同的遗传模式。这4种遗传模式分别为:共显性模式(Codominant:
M/M, M/m, m/m)、显性模式(Dominant: M/M, M/m+m/m)、隐性模式(Recessive: M/M+M/m, m/m)和超显性模式(Overdominant:
M/M+m/m, M/m)。表2.8中列出了这5个候选的SNP在不同的遗传模式下的组合及所对应的人数分布情况。
Table 2.8 Models of the five SNP for the FADS gene cluster
Model rs 174547 rsl74553 rs 174602 rs3834458 rs 1000778
Genotype n Genotype n Genotype n Genotype n Genotype n
Codominant T/T 201 A/A 203 A/A 248 T/T 201 G/G 259
C/T 164 A/G 170 A/G 140 DEL/T 167 A/G 130
C/C 39 G/G 38 G/G 22 DEL/DEL 41 A/A 22
Dominant T/T 201 A/A 203 A/A 248 T/T 201 G/G 259
C/T+C/C 203 A/G+G/G 208 A/G+G/G 162 DEL/T+DEL/DEL 208 A/G-A/A 152
Recessive T/T+C/T 365 A/A+A/G 373 A/A+A/G 388 T/T+DEL/T 368 G/G-A/G 389
C/C 39 G/G 38 G/G 22 DEL/DEL 41 A/A 22
Overdominant T/T+C/C 240 A/A+G/G 241 A/A+G/G 270 T/T+DEL/DEL 242 G/G-A/A 281
C/T 164 A/G 170 A/G 140 DEL/T 167 A/G 130

根据SNPstats在线分析软件的结果,FADS基因簇的5个SNP位点的4种遗 传模式与母乳LA水平的相关性分析见表2.9,未发现各位点的不同遗传模式组 中母乳LA水平有差异性。
Table 2.9 The association between SNP models of FADS genes and LA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs 174547 -201.3 0.59 -203.1 0.34 -202.6 0.52 -202.6 0.55
rsl74553 -189.4 0.81 -191.1 0.81 -191.4 0.51 -191.0 0.89
FADS2 rs 174602 -190.7 0.89 -192.5 0.80 -192.7 0.65 -192.4 0.96
rs3834458 -187.8 0.84 -189.8 0.56 -189.5 0.86 -189.7 0.63
FADS3 rs 1000778 -197.9 0.20 -199.8 0.07 -196.8 0.68 -199.4 0.09

经乳母的年龄、产后BMI和膳食LA摄入量校正后,FADS基因簇的5个 SNP位点的4种遗传模式与母乳LA水平的相关性分析见表2.10,仍未发现各位 点的不同遗传模式组中母乳LA水平有差异性。
Table 2.10 The adjusted association between SNP models of FADS genes and LA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs 174547 -166.9 0.30 -168.1 0.20 -168.1 0.21 -166.8 0.58
rsl74553 -156.3 0.44 -157.0 0.57 -158.3 0.21 -156.7 0.89
FADS2 rs 174602 -159.2 0.77 -161.2 0.50 -160.9 0.67 -161.0 0.61
rs3834458 -156.5 0.52 -158.2 0.31 -157.9 0.42 -157.5 0.58
FADS3 rs 1000778 -161.9 0.18 -163.0 0.11 -160.6 0.71 -163.8 0.06

表2.11中显示的为FADS基因簇的5个SNP位点的4种遗传模式与母乳GLA 水平的相关性分析结果,FADS1和FADS2基因的共计4个位点显示出了差异性, FADS3的位点无差异。根据AIC最小的原则,判断SNP位点的最优遗传模式。 FADS1基因的rsl74547位点、rsl74553位点和FADS2基因的rs3834458位点的 最优模式均为共显性,而FADS2基因的rsl74602位点的最优遗传模式为显性模 式。

Table 2.11 The association between SNP models of FADS genes and GLA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 □174547 -1853.8 0.0035 -1852.8 0.004 -1851.1 0.01 -1846.3 0.17
rsl74553 -1875.3 0.0077 -1873.7 0.013 -1874.2 0.0099 -1868.5 0.32
FADS2 rs 174602 -1861.4 0.12 -1863.4 0.038 -1859.6 0.46 -1862.3 0.07
rs3834458 -1859.9 0.0086 -1858.7 0.012 -1858.7 0.012 -1853.4 0.31
FADS3 rs 1000778 -1866.8 0.43 -1867.1 0.94 -1868.7 0.21 -1867.4 0.59

经乳母的年龄、产后BMI和膳食GLA摄入量校正后,FADS基因簇的5个 SNP位点的4种遗传模式与母乳GLA水平的相关性分析结果见表2.12,仍有4 个位点显示出了差异性。FADS1基因的rs 174547位点、rsl74553位点和FADS2 基因的rs3834458位点的最优模式仍为共显性,而FADS2基因的rsl74602位点 的最优遗传模式仍为显性模式。
Table 2.12 The adjusted association between SNP models of FADS genes and GLA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs174547 -1704.2 0.011 -1703.5 0.011 -1702.4 0.02 -1698.5 0.22
rsl74553 -1727.5 0.018 -1726.6 0.023 -1726.7 0.021 -1722.4 0.32
FADS2 rs 174602 -1716.5 0.13 -1718.5 0.043 -1714.6 0.58 -1717.7 0.07
rs3834458 -1718.4 0.019 -1717.6 0.023 -1717.7 0.022 -1713.2 0.35
FADS3 rs 1000778 -1716.5 0.34 -1716.3 0.96 -1718.2 0.17 -1716.8 0.48

母乳中的GLA在这4个SNP最优遗传模式下不同组中的水平见图2.2所示, 其中 rsl74547、rsl74553 和 rs3834458 位点分组情况为 M/M, M/m, m/m; rsl74602 位点分组情况为M/M, M/m+m/mo这4个SNP的主等位基因纯合子的母亲乳汁 中GLA水平都表现岀了较高水平。

母乳ALA水平与FADS基因簇的5个SNP位点的4种遗传模式相关性分析
见表2.13,未发现各位点的不同遗传模式组中母乳ALA水平有差异性。
Table 2.13 The association between SNP models of FADS genes and ALA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs174547 -917.7 0.82 -919.5 0.69 -919.7 0.56 -919.4 0.95
rsl74553 -935.4 0.82 -937.1 0.82 -937.3 0.63 -937.3 0.60
FADS2 rsl74602 -935.0 0.73 -936.5 0.69 -936.9 0.44 -936.3 0.97
rs3834458 -928.7 0.95 -930.6 0.94 -930.6 0.80 -930.6 0.81
FADS3 rs 1000778 -937.4 0.24 -939.1 0.11 -936.5 0.94 -939.4 0.09

经乳母的年龄、产后BMI和膳食ALA摄入量校正后,母乳ALA水平与FADS 基因簇的5个SNP位点的4种遗传模式相关性分析见表2.14,仍未发现各位点 的不同遗传模式组中母乳ALA水平有差异性。

Table 2.14 The adjusted association between SNP models of FADS genes and ALA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs 174547 -757.3 0.40 -757.6 0.68 -759.3 0.18 -757.6 0.71
rsl74553 -774.1 0.41 -774.3 0.96 -775.9 0.21 -774.9 0.44
FADS2 rs 174602 -774.0 0.74 -775.4 0.84 -776.0 0.44 -775.4 0.88
rs3834458 -765.7 0.90 -767.6 0.78 -767.7 0.66 -767.5 0.98
FADS3 rs 1000778 -769.0 0.23 -769.8 0.18 -768.3 0.57 -770.9 0.09

表2.15中显示的为母乳DGLA水平与FADS基因簇的5个SNP位点的4种 遗传模式间的相关性分析结果,FADS1和FADS2基因的4个位点显示出了差异 性,FADS3的位点无差异;这4个位点的最优遗传模式均为显性模式。
Table 2.15 The association between SNP models of FADS genes and DGLA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs 174547 -1720.1 0.01 -1720.7 0.0065 -1717.3 0.04 -1715.6 0.12
rsl74553 -1740.9 0.04 -1740.9 0.033 -1740.3 0.05 -1737.4 0.32
FADS2 rs 174602 -1726.7 0.17 -1728.2 0.081 -1726.6 0.23 -1726.6 0.22
rs3834458 -1724.2 0.03 -1724.4 0.024 -1723.3 0.04 -1720.3 0.29
FADS3 rs 1000778 -1733.2 0.59 -1735 0.30 -1734.7 0.46 -1734.5 0.56

由于无法获得膳食中的DGLA摄入量,经乳母的年龄、产后BMI校正后母 乳DGLA水平与FADS基因簇的5个SNP位点的4种遗传模式间的相关性分析 结果见表2.16o校正后仅两个位点与母乳中DGLA水平有关,FADS1基因的 rs 174547位点的最优遗传模式为显性模式,FADS2基因的rs3834458位点的最优 遗传模式为隐性模式。
Table 2.16 The adjusted association between SNP models of FADS genes
and DGLA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs 174547 -1438.8 0.036 -1438.7 0.033 -1438.3 0.041 -1435 0.34
rsl74553 -1459.9 0.10 -1459.6 0.12 -1460.8 0.058 -1457.4 0.64
FADS2 rs 174602 -1444.6 0.11 -1444.7 0.12 -1445.4 0.077 -1442.9 0.42
rs3834458 -1447.9 0.07 -1447.4 0.09 -1448.6 0.042 -1444.7 0.61
FADS3 rs 1000778 -1449.3 0.49 -1450.1 0.63 -1451.3 0.24 -1449.8 0.95

母乳中的DGLA在这2个SNP最优遗传模式下不同组中的水平见图2.3所 示,其中rsl74547位点的分组情况为M/M, M/m+m/m; rs3834458位点分组情 况为M/M+M/m, m/mo rsl74547位点的主等位基因纯合子乳母分泌的乳汁中 DGLA水平高于其他基因型乳母;rs3834458位点的主等位基因携带者的母亲乳 汁中DGLA水平高于次等位基因纯合子乳母。

的最优遗传模式为显性模式。
Table 2.17 The association between SNP models of FADS genes and AA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rsl74547 -1459.9 <0.001 -1457.1 <0.001 -1453.1 0.001 -1446.0 0.056
rsl74553 -1474.3 <0.001 -1472.8 0.001 -1469.8 0.0052 -1469.8 0.0052
FADS2 rs 174602 -1461.2 0.017 -1462.2 0.0073 -1457.9 0.088 -1458.8 0.051
rs3834458 -1466.3 <0.001 -1464.5 <0.001 -1460.6 0.0026 -1454.7 0.071
FADS3 rs 1000778 -1465.5 0.54 -1466.6 0.53 -1467.4 0.29 -1466.2 0.89

经乳母的年龄、产后BMI和膳食AA摄入量校正后,FADS基因簇的5个 SNP位点的4种遗传模式与母乳AA水平的相关性分析结果见表2.18,仍有4个 位点显示出了差异性。FADS1基因的rs 174547位点、rsl74553位点和FADS2基 因的rs3834458位点的最优模式仍为共显性,而FADS2基因的rsl74602位点的 最优遗传模式仍为显性模式。
Table 2.18 The adjusted association between SNP models of FADS genes and AA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs 174547 -1219.9 <0.001 -1216.4 0.0016 -1216.4 0.0016 -1208.1 0.18
rsl74553 -1235.4 0.0063 -1233.8 0.01 -1233.7 0.011 -1228.4 0.25
FADS2 rs 174602 -1220.1 0.037 -1220.9 0.02 -1218.3 0.092 -1218.1 0.10
rs3834458 -1229.2 0.0013 -1227.0 0.0024 -1225.9 0.0043 -1219.5 0.17
FADS3 rs 1000778 -1224.7 0.40 -1224.9 0.75 -1226.7 0.18 -1224.9 0.75

母乳中的AA在这4个SNP最优遗传模式下不同组中的水平见图2.4所示, 其中 rsl74547>rsl74553 和 rs3834458 位点分组情况为 M/M, M/m, m/m; rsl74602 位点分组情况为M/M, M/m+m/mo这4个SNP的主等位基因纯合子的母亲乳汁 中AA水平都高于其他基因型乳母的乳汁AA水平。

*Pv0.05, compared with group 1.
rs 174547 Group 1-T/T, Group2-C/T, Group3-C/C; rsl74553 Group 1- A/A, Group2-A/G, Group3- G/G; rs 174602
Group 1-A/A, Group2-A/G+G/G; rs3834458 Group 1-T/T, Group2- DEL/T, Group3- DEL/DEL
表2.19中显示的为母乳EPA水平与FADS基因簇的5个SNP位点的4种遗 传模式间的相关性分析结果,FADS1基因的rsl74547位点和FADS2基因的 rs 174602位点和rs3834458位点共3个位点显示出了差异性,FADS3的位点无差 异;这3个位点的最优遗传模式均为显性模式。
Table 2.19 The association between SNP models of FADS genes and EPA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rsl74547 -2966.5 0.046 -2968.5 0.013 -2962.9 0.44 -2966.6 0.039
rsl74553 -2996.3 0.23 -2998.1 0.095 -2996.1 0.38 -2996.7 0.24
FADS2 rs 174602 -2992.7 0.092 -2994.5 0.032 -2989.9 0.81 -2994.3 0.036
rs3834458 -3007.0 0.044 -3008.5 0.016 -3004.8 0.15 -3005.1 0.12
FADS3 rs 1000778 -3014.6 0.20 -3013.6 0.59 -3016.6 0.07 -3013.4 0.75

经乳母的年龄、产后BMI和膳食EPA摄入量校正后,FADS基因簇的5个 SNP位点的4种遗传模式与母乳EPA水平的相关性分析结果见表2.20,有4个 位点显示出了差异性。除FADS1基因的rsl74547位点、FADS2基因的rsl74602 位点和rs3834458位点的3个位点外,FADS3基因的rsl000778位点在校正后出
现差异oFADSl和FADS2基因的3个位点的最优遗传模式均为显性模式;FADS3 基因的rsl000778位点的最优遗传模式均为隐性模式。
Table 2.20 The adjusted association between SNP models of FADS genes and EPA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs 174547 -2468.5 0.13 -2470.5 0.042 -2466.6 0.59 -2469.4 0.08
rsl74553 -2507.6 0.41 -2509.6 0.18 -2508.1 0.59 -2508.9 0.30
FADS2 rs 174602 -2496.1 0.07 -2498.1 0.022 -2493 0.66 -2497.5 0.03
rs3834458 -2524.8 0.09 -2526.4 0.036 -2523.5 0.21 -2523.9 0.17
FADS3 rs 1000778 -2518.0 0.13 -2516 0.68 -2519.9 0.044 -2516.1 0.59

母乳中的EPA在这4个SNP最优遗传模式下不同组中的水平见图2.5所示, 其中 ts174547、rsl74602 和 rs3834458 位点分组情况为 M/M, M/m+m/m;这 3 个SNP的主等位基因纯合子的母亲乳汁中EPA水平均高于其他基因型乳母。 rs 1000778位点分组情况为M/M+M/m, m/m,结果显示主等位携带者的母亲乳汁 中EPA水平高于次等位基因纯合子乳母的乳汁EPA水平。

母乳DTA水平与FADS基因簇的5个SNP位点的4种遗传模式与水平的相 关性分析结果见表2.21, FADS 1和FADS2基因的共计3个位点显示出了差异性, FADS3的位点无差异。FADS1基因的rsl74547位点和FADS2基因的rs3834458 位点的最优模式均为共显性,而rsl74553位点的最优遗传模式为隐性模式。
Table 2.21 The association between SNP models of FADS genes and DTA level
SNP 一 Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 注174547 -2598.7 0.0063 -2597 0.011 -2597.5 0.0084 -2591.5 0.32
rsl74553 -2644.6 0.028 -2643.7 0.039 -2644.6 0.024 -2640 0.44
FADS2 rs 174602 -2629.1 0.13 -2630 0.08 -2629.2 0.13 -2628.1 0.28
rs3834458 -2629.4 0.0069 -2627.3 0.015 -2628.7 0.0071 -2622.1 0.41
FADS3 rs 1000778 -2636.2 0.45 -2638.1 0.22 -2636.9 0.56 -2637.6 0.31

经乳母的年龄、产后BMI和膳食DTA摄入量校正后,FADS基因簇的5个 SNP位点的4种遗传模式与母乳DTA水平的相关性分析结果见表2.22, FADS1 基因的rsl74547位点、rsl74553位点和FADS2基因的rs3834458位点仍有意义, 这3个SNP的最优模式均为隐性模式。
Table 2.22 The adjusted association between SNP models of FADS genes and DTA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 rs 174547 -2177.2 0.01 -2174.4 0.034 -2177.3 0.007 -2170.2 0.56
rsl74553 -2222.5 0.056 -2221.4 0.10 -2223.4 0.03 -2218.8 0.67
FADS2 rs 174602 -2201.8 0.11 -2201.6 0.13 -2202.7 0.07 -2199.9 0.47
rs3834458 -2214.2 0.0099 -2211.3 0.036 -2214.5 0.006 -2207 0.63
FADS3 rs 1000778 -2207.6 0.40 -2208.9 0.28 -2209 0.27 -2208.1 0.55

母乳中的DTA在这3个SNP最优遗传模式下不同组中的水平见图2.6所示, ts174547、rsl74553 和 rs3834458 位点分组情况均为 M/M+M/m, m/mo 这 3 个 SNP的主等位基因携带者的母亲乳汁中DTA水平均高于次等位基因纯合子的乳 母分泌的乳汁DTA水平。

FADS基因簇的5个SNP位点的4种遗传模式与母乳DHA水平的相关性分 析见表2.23,未发现各位点的不同遗传模式组中母乳DHA水平有差异性。
Table 2.23 The association between SNP models of FADS genes and DHA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P
FADS1 □174547 -1514.6 0.63 -1514.4 0.39 -1515.7 0.89 -1516.6 0.34
rsl74553 -1550.9 0.74 -1552.9 0.46 -1552.3 0.96 -1552.9 0.47
FADS2 rs 174602 -1536.7 0.42 -1537.2 0.65 -1538.7 0.19 -1537.0 0.88
rs3834458 -1538.9 0.70 -1540.7 0.50 -1540.3 0.80 -1540.9 0.40
FADS3 rs 1000778 -1549.0 0.48 -1550.1 0.48 -1550.1 0.47 -1550.7 0.28

经乳母的年龄、产后BMI和膳食DHA摄入量校正后,母乳DHA水平与FADS 基因簇的5个SNP位点的4种遗传模式相关性分析见表2.24,仍未发现各位点 的不同遗传模式组中母乳DHA水平有差异性。

Table 2.24 The adjusted association between SNP models of FADS genes and DHA level
SNP Codominant Dominant Recessive Overdominant
AIC P AIC P AIC P AIC P

FADS1 rs174547 -1239.0 0.80 -1240.7 0.72 -1240.7 0.67 -1240.9 0.54
rsl74553 -1275.4 0.89 -1277.2 0.81 -1277.3 0.75 -1277.3 0.67
FADS2 rs 174602 -1258.4 0.23 -1257.8 0.52 -1260.4 0.089 -1257.4 0.91
rs3834458 -1264.2 0.77 -1265.8 0.76 -1266.0 0.60 -1266.1 0.53
FADS3 rs 1000778 -1270.3 0.14 -1269.6 0.24 -1269.6 0.25 -1271.4 0.08

经乳母的年龄、产后BMI和膳食PUFA摄入量校正后,母乳中的8种PUFA 水平与FADS基因簇的5个SNP位点的遗传模式相关性分析的结果汇总详见图 2.7,每个位点下方框中的字母代表该种PUFA的最优遗传模式。FADS基因簇的 这5个候选SNP均表现出与母乳PUFA的水平相关,它们共同的特征为携带次 等位基因或次等位基因纯合子的乳母分泌的乳汁中PUFA含量较低。Figure 2.7 Summary of relationship between PUFA in breast milk and the best
model among five SNP in FADS genes
-represents no significance; C represents Codominant model;
D represents Dominant model; R represents Recessive model.
2.4讨论
本研究的研究对象为420名产后22-25天的哺乳期健康汉族女性,结果显示 本研究中的乳母的平均产后BMI为24.26 kg/m2,略高于正常值范围;她们的孕 期平均增重为18.61 kg,高于一项来源于深圳市的调查研究(15.45 kg) [12。],也 超岀了孕期增重的适宜值范围13.0-18.5 kg;有研究表明我国有33.3%〜50.9%的 孕妇孕期增重过多,孕期增重过多易导致多种不良妊娠结局的发生,如妊娠期糖 尿病、妊娠期高血压疾病、巨大儿等mo本研究中乳母产后BMI超出了正常值 范围也直接与孕期增重过多有关,而膳食是体重增加的最重要因素,因此需保障 孕期的科学合理膳食,加强营养宣教并维持孕期增重在正常范围内对母婴的身体 健康至关重要。
在乳母的产后日常能量和三大宏量营养素摄入方面,能量摄入的平均水平为 2627.75 kcal,稍高于推荐量2300 kcal/d;碳水化合物和脂肪的供能比分别是 54.13%、28.73%,在推荐范围内;而蛋白质的供能比为17.14%,略高于推荐摄 入的比例。有研究表明了体重的增加与能量摄入、碳水化合物及脂肪供能比有关, 且存在着正相关趋势,但与蛋白质的供能比的关系存在争议[切;本研究中的乳 母为产后22-25天,尚处于民间的“月子^期间,她们摄入的碳水化合物和脂肪的 供能比在正常范围内,说明膳食构成较合理,可能与食用产后护理中心提供的经 营养专业人员设计的“月子餐^有关。
本研究中乳母膳食摄入的必需脂肪酸LA和ALA水平均超出了参考摄入量; 但EPA和DHA的平均摄入量分别仅占参考摄入量的20.82%和21.58%,摄入水 平较低。这可能与研究对象的膳食习惯密切相关,LA和ALA主要来源于植物 油中;而EPA和DHA主要来源于富含脂肪的深海鱼类。本研究结果显示母乳中 的LA、ALA、DGLA、EPA、DTA和DHA共6种PUFA水平与乳母的年龄呈正 相关,LA和ALA是从膳食中摄入的必需脂肪酸,可能是由于年龄稍大的乳母 获取的营养知识较多,比较注意膳食PUFA的摄入。母乳中的LA、ALA、DGLA、 和DTA与乳母的产后呈正BMI相关,来自韩国的一项研究也证实了母乳中的 PUFA水平与乳母的年龄和BMI有关[叫
本研究纳入了 5个位于FADS基因簇的SNP,其中rsl74547和rsl74553位 于 FADS1 基因,rsl74602 和 rs3834458 位于 FADS2 基因,rslOOO力8 位于 FADS3 基因,经检验后这5个位点均符合Hardy- Weinberg遗传平衡,表明本研究中的 哺乳期女性具有群体代表性。我们运用SNPstats在线分析软件分析了母乳中的8 种PUFA与这5个候选SNP之间的关系,并构建了这5个SNP位点与相关PUFA 的最优遗传模式,在最优模式下分析了不同SNP基因型的乳母分泌的乳汁中相 关PUFA的水平。研究结果显示母乳中的5种PUFA与FADS基因变异有关,即 母乳中的GLA及AA水平与FADS1基因的rsl74547和rsl74553位点,FADS2 基因的rs3834458和rs 174602位点有关,且这4个SNP的主等位基因纯合子的 母亲分泌的乳汁中GLA和AA均表现出了较高水平;母乳中的DGLA水平与 FADS1基因的rs 174547位点及FADS2基因的rs3834458位点有关,这两个SNP 的主等位基因纯合子或主等位基因携带者的母亲乳汁中GLA水平较高;母乳中 的EPA水平与FADS1基因的rsl74547位点、FADS2基因的rsl74602位点和 rs3834458位点、FADS3基因的rsl000778位点有关,这4个SNP中前三个位点 的主等位基因纯合子的母亲乳汁中EPA水平较高,而rsl000778位点的主等位携 带者的母亲乳汁中EPA水平较高;母乳中的DTA水平与FADS1基因的rsl74547 位点、TS174553位点和FADS2基因的rs3834458位点有关,这3个SNP的主等 位基因携带者的母亲乳汁中DTA水平均较高。
本研究的结果证实了纳入的这5个候选FADS基因簇的SNP或多或少的与 母乳中的PUFA水平相关,且它们呈现出了共同的规律,即这5个SNP的主等 位基因纯合子或携带者母亲分泌的乳汁中的PUFA水平较高。本次研究的结果与 国内外相关研究的报道较一致Em。在n-6 PUFA转化中,GLA是内源性LA通 it A-6去饱和酶转化的直接产物,在LA足量的情况下,GLA水平较高提示体内 的\6去饱和酶活性较高;DGLA是GLA向下游转化的产物,是直接转化为AA 的底物;AA是LA通过A-6去饱和酶和\5去饱和酶的共同作用在体内转化的 终产物,AA水平较高提示体内的A-6去饱和酶和A-5去饱和酶活性较高。同样, EPA和DTA是n-3 PUFA转化过程的产物,母乳中的EPA和DTA水平也反映了 A-6去饱和酶和4-5去饱和酶的活性较高。最近的一项来自对波兰女性红细胞FA 的研究显示,FADS1基因的rsl74547位点和FADS2基因的rs3834458位点多态 性可影响红细胞的A-5去饱和酶活性;有研究也证实了在糖尿病人群中FADS基 因多态性对血液4-6去饱和酶活性的影响gw]。欧洲的一项研究也表明,FADS1 基因的rsl74553位点与血清中的GLA和AA水平具有关联性,且携带次等位基 因的人群血清中GLA和AA水平较低,这与本研究的结果一致mi。德国的一项 关于母乳FA浓度与FADS基因簇多态性关系的研究结果显示,母乳中的AA浓 度与FADS1基因的rsl74547位点和FADS3基因的rsl000778位点有关,次等位 基因携带者的母亲分泌的乳汁中AA浓度较低[126],这与本研究的结果保持一致。 但这项研究未观察到FADS2基因中的rs 174602与母乳FA浓度间的关系,我们 的研究结果表明了 FADS2基因中的rsl74602位点可影响母乳中的AA、GLA和 EPA水平,这个结果与Koletzko等人的研究一致,他们对妊娠期女性红细胞PUFA 与FADS多态性的关系研究表明,FADS2基因中的rsl74602位点可对红细胞中 的AA和EPA产生影响,次等位基因携带者的红细胞AA和EPA水平较低【⑵】。
在本研究中,我们未发现乳母中的LA、ALA和DHA水平与这5个SNP存 在着关联性,可能的原因为,LA和ALA为体内不能合成的必需脂肪酸,主要 来源于膳食,本研究膳食调查的结果显示乳母日常膳食摄入的LA和ALA均超 过了参考摄入量,因此母乳中的这两种必需脂肪酸水平主要反映的是膳食摄入的 状况,在PUFA合成中这两种FA作为底物,底物充足的情况下由基因转化为产 物时所需要的底物对底物的初始状况影响不大。而对于母乳DHA的水平研究中, 主要集中于膳食DHA摄入对母乳DHA水平的影响,有研究指出人体内血液DHA 的水平差异由基因变异引起的仅占3%[12叽 关于FADS基因变异与DHA水平之 间关系的研究很少,现有的研究尚存在争议性。Andrea等人的研究结果显示血 浆的DHA水平与FADS1和FADS2基因的多态性无关回;Koletzko等人的研究 指岀,红细胞DHA水平与FADS2基因的rs3834458和ts 174602位点有关,次等 位基因携带者的DHA水平较高mi;而来自丹麦的研究结果表明婴儿红细胞中的 DHA水平与FADS2基因的rs3834458相关,主等位基因携带者DHA水平更高 to】。此外,本研究存在着一定的局限性,由于未考虑PUFA补充剂的摄入情况, 也可影响母乳DHA与FADS基因间的关联。因此,仍需进一步研究母乳DHA 水平与FADS基因变异间的关系。
本研究收集了 420名长春市的健康乳母,研究了 FADS基因簇的SNP与乳 汁8种PUFA之间的关系,结果表明了 FADS1、FADS2和FADS3基因变异均可 影响母乳中的PUFA水平。由于FADS1基因和FADS2基因分别编码\5和4-6 去饱和酶,因此这两个基因的变异可能通过影响A-5和4-6去饱和酶的活性来改 变母乳中的PUFA水平;而FADS3基因编码的产物尚未被确定,本研究结果表 明FADS3基因的rsl000778位点可影响母乳中的EPA水平,这为确定FADS3基 因表达在PUFA转化中发挥的作用提供了依据。
2.5小结
本研究招募了 420名产后22-25天的哺乳期健康汉族女性,检测了母乳中的 8种PUFA水平,研究了 FADS基因簇的5个SNP位点与乳汁PUFA的关联,得 到的结论如下:
1.母乳PUFA水平与乳母的年龄和产后BMI相关,与膳食中的PUFA无关。
2.母乳中的GLA、DGLA、AA和DTA水平与FADS1和FADS2基因变异 有关,母乳中的EPA水平与FADS1、FADS2和FADS3基因的变异有关。
第3章膳食模式与乳汁脂肪酸
3.1引言
母乳中FA是受母亲饮食习惯最敏感的成分之一汕,FA的组成受环境和遗 传因素的影响。最近的研究表明FA的水平,特别是PUFA,主要取决于母亲的 饮食。来自北美的母亲的DHA水平较低,因为她们的饮食摄入偏向较高的n-6 和较低的n-3 PUFAo经常食用淡水鱼和野生动物可能会导致美国哺乳母亲的母 乳中m3和n-6多不饱和脂肪酸水平升高Mi】。在希腊,研究人员发现,在哺乳期 妇女产后的前半年,母乳中PUFA含量受到母体PUFA及MUFA摄入量的影响 [132】。在一些来自亚洲国家的研究中也得出了类似的结论,来自韩国、马来西亚 和中国东南部的母亲乳汁中的FA水平与FA摄入量呈正相关[10'133,134]。这些发现 与Kumar和Su的结果相矛盾,他们的研究结果表明了除乳母膳食以外的因素, 如地理位置和种族群体在母乳FA的组成中起着至关重要的作用何,136]。
该领域的研究主要集中在母体膳食(或不同种类的食物)中的个体FA与母 乳中的FA水平之间的联系,迄今得到的结论各不相同。哺乳期的母亲在日常饮 食中不会仅摄取一种营养素或食物,而是从各种类型的食物中摄取大量营养素, 且她们形成了特定的饮食模式,各种营养素和某些类型的食物之间存在密切的相 关性。此外,乳母每餐摄入的食物并不依赖于其他食物的摄入量;因此使用膳食 模式代表食物摄入的综合影响可能更好的解释母体食物摄入对乳汁FA成分的影 响[1371。
最近的研究表明,母亲的饮食模式不仅可能影响孕产妇健康,还可能与后代 的营养状况有关[1込139】。然而先前的研究中,尚不清楚母体膳食模式是否会影响 母乳中的FA水平。中国是世界上最大的发展中国家,拥有大量的哺乳期妇女, 此外,不同人群的膳食模式不同且母乳的FA水平因地区而异阳。由于关于母体 膳食模式与乳汁FA之间关系的研究很少,我们的研究主要关注膳食模式与中国 东北地区哺乳期母亲的母乳FA构成谱之间的关系,为哺乳期女性的合理膳食和 更好的哺育婴儿提供科学依据。

3.2材料与方法
3.2.1研究对象
本研究是采用横断面调查,从2015年1月开始至2017年6月招募长春市健 康的汉族哺乳期女性,招募的志愿者通过三个途径:网上招募、长春市某妇幼保 健医院和长春市某产后护理中心。纳入标准是母乳喂养女性、产后6个月以内, 孕期没有妊娠并发症,乳母产后不使用含FA的补充剂;娩岀的胎儿是健康的单 胎,出生时胎龄N37周,体M>2500克。排除标准:孕期合并各种妊娠疾病,早产、 多胎及产后服用FA补充剂的乳母。总共招募了 313名哺乳期女性,最终根据纳入 与排除标准确定了 274名研究对象,如图3.1的流程图所示。所有参与者都签署了 知情同意书,本研究的内容得到了吉林大学公共卫生学院伦理委员会批准。

天津市光复精细化工研究所 天津市光复精细化工研究所 北京化工厂 北京化工厂
天津市光复精细化工研究所 天津市光复精细化工研究所 长春巨洋气体有限公司
江苏海门科诺科技有限公司 江苏海门科诺科技有限公司 美国 Corning 公司 美国 Corning 公司 美国Gilson公司 美国 Corning 公司 沈阳市电炉厂 美国Bio-Rad公司 日本岛津公司 美国Sigma公司 日本岛津公司 北京惠普分析技术研究所 中国奥克斯公司 中科美菱公司 上海安宁科学仪器厂
3.2.3.1乳汁收集
研究对象母乳的收集方法同前,详见2.2.3.1所述。
3.2.3.2 问卷调查
问卷调查包括基本信息问卷、3d24h膳食问卷和膳食频率问卷,调查方法和 内容与前面一致,详见223.2-223.4部分。
3.2.33乳汁脂肪酸检测
母乳的前处理方法和FA的检测条件同前2.2.3所述,本研究是以Supelco-37 种脂肪酸甲酯的标准品混合溶液(Sigma, Catalog No. 18919-1 AMP)的分离谱图 为参照,确定每种脂肪酸甲酯的保留时间并计算当前检测条件下的校正因子。以 标准品谱图显示的C17:0的保留时间为准,计算其余各种组分的相对保留时间; 在乳汁样品中提取的脂肪酸甲酯分离谱图中,用保留时间确定内标物C17:0后, 以相对保留时间定性乳汁样品中分离出的每种脂肪酸甲酯。根据色谱峰面积定量 脂肪酸甲酯,参照国标中的脂肪酸甲酯转换成FA的系数,计算出每种FA的含 量,乳汁中各种FA的含量以所占百分比表示吨。
3.2.4数据库建立
使用Epidata 3.0软件建立研究对象的基本信息数据库,Excel 2010软件建立 3d24h问卷获得的膳食能量、营养素数据库,膳食频率问卷获得的176种食物的 日常摄入量数据库和乳汁脂肪酸数据库。
膳食模式数据库的建立也来源于膳食频率问卷,将问卷中的176种食物合并 为10大类,分别为谷薯类、豆类、菌藻类、水果、蔬菜、坚果、肉类、蛋类、 水产类和乳类。每大类中的各种食物日常摄入量(g/d)之和即为该类食物的摄 入量,采用Excel 2010软件建立研究对象的膳食模式数据库。
3.2.5数据分析
运用SPSS24.0统计学软件(IBM Corporation),数据是否满足正态分布使 用Kolmogorov -Smirnov检验来判断。满足正态分布的计量数据采用Mean±SD 表示,非正态分布的计量数据采用Median(P25, P75)来表示,计数资料如胎儿性 别、分娩方式使用构成比表示。
膳食模式的划分使用主成分分析法,对每一类食物的进行Varimax,即方差 最大正交旋转。研究中的Kaiser-Meyer-Olkin (KMO)值应>0.6 (KMO值衡量抽 样的充分性)和Bartlett测试的球形度P值应<0.05。不同膳食模式间的计量资料 比较使用Kruskal Wallis检验,计数资料比较使用%?检验。所有的统计学检验均 为双侧检验,以P<0.05为差异有显著性。
3.3实验结果
3.3.1基本情况
本研究的研究对象为274名产后22天到6个月的哺乳期健康汉族女性。她 们的平均年龄为30.10岁(21.0-45.0),其中有一半以上来自中等收入家庭 (56.20% ) o研究对象的平均孕前体质指数(body mass index, BMI)为21.08+3.28 kg / m2,孕期增重的平均值为16.80+5.41 kgo有不到一半(49.64%)的母亲是 自然分娩,其余的是剖宫产。婴儿的平均胎龄为39.51+0.97周,平均出生体重为 3.43+0.40 kg,平均出生身长为50.49±1.32cmo在母乳喂养方面,73.36%的婴儿 是纯母乳喂养,其余的则是混合喂养。研究对象的基本情况见表3.1。
Table 3.1 Maternal and infant demographics of this study
Characteristics Mean+SD/n(%)
Maternal age(year) 30.10+3.36
Preconception BMI(kg/m2) 21.08+3.28
Gestational weigh gain(kg) 16.80+5.41
Gestational age(wk) 39.51+0.97
Birth weight(kg) 3.43 +0.40
Birth length(cm) 50.49+1.32
Family income (yuan/month)
<5000 46 (16.79)
5000-10000 154 (56.20)
>10000 74 (27.01)
Mode of delivery
Vaginal 136 (49.64)
Cesarean 138 (50.36)
Feeding patterns
Exclusive breastfeeding 201 (73.36)
Mixed feeding 73 (26.64)

研究对象日常摄入的能量和三大宏量营养素情况详见表3.2o本研究纳入的
哺乳期女性日常能量摄入的平均水平为1774.36 kcal,占推荐摄入量的力.15%;
三大宏量营养素中碳水化合物的平均摄入量为233.76 g/d,蛋白质的平均摄入量
为67.38 g/d,脂肪的平均摄入量为66.65 g/d;根据中国营养学会推荐的宏量营养 素供能比计算出参考摄入量,碳水化合物、蛋白质和脂肪的日常平均摄入量分别 占参考摄入量的70.70%、84.22%和104.31%。
Table 3.2 The energy and macronutrient intake per day of the participants
Energy/
Macronutrient Average Intake(kcal/d or g/d)
[Median (P25, P75)] DRIs*
(kcal or %) Energy proportion
(%)A
Energy 1774.36 (1501.31,2227.62) 2300 77.15
Carbohydrate 233.76 (195.52, 316.08) 50 〜65 70.70
Protein 67.38 (52.14, 84.62) 10 〜14 84.22
Fat 66.65 (53.24,81.90) 20 〜30 104.31
*The DRIs of macronutrients are their AMDR from Chinese dietary reference intakes 2013. A Actual intake divided by the recommended nutrient intake per the Chinese Nutrition Society (%).

研究对象日常摄入的微量元素情况见表3.3,钙、铁、锌、铜和镁的平均摄 入量分别为 395.46 mg/d、17.力mg/d、10.29mg/d> 1.56mg/d 和 244.68mg/d,其中 钙、铁、锌和镁的摄入量均低于参考摄入量,且钙的日常平均摄入量最低,仅占 RNI的32.96%;只有铜的日常平均摄入量超过了参考摄入量,占RNI的111.43%。
Table3.3 The amount of dietary mineral intake per day in this study
Mineral Dietary intake (mg)
[Median (P25, P75)] RNI (Al) *
(mg) UL*
(mg) Intake/RNI (Al) (%)A
[Median (P25, P75)]
Ca 395.46 (260.94, 634.74) 1000 2000 32.6 (21.74, 52.90)
Fe 17.77 (13.53,24.19) 24 42 73.94 (56.30, 100.69)
Zn 10.29 (8.06, 13.47) 12 40 85.75 (67.13, 112.27)
Cu 1.56(1.21,2.06) 1.4 8 111.43 (86.43, 147.32)
Mg 244.68 (194.19,306.06) 330 - 74.15 (58.85, 92.74)
* The Chinese dietary reference intakes (DRIs) 2013.
A Actual intake divided by the recommended nutrient intake per the Chinese Nutrition Society (%).
-Represents no data temporarily.

表3.4中列出了研究对象的日常维生素摄入情况,其中维生素A、维生素
Bi、维生素B2、维生素C和叶酸的平均摄入水平均偏低,分别占参考摄入量的
43.35%、58.00%、61.67%、49.23%和33.20%;烟酸的日常摄入平均水平与RNI
接近,达到了 RNI的96.90%;维生素E的日常平均摄入水平较高,为RNI的 166.35%o由于维生素D的特殊性,在食物中的含量较低,无法评估本研究对象 的维生素D摄入情况。
Table 3.4 The dietary vitamin intake per day of the participants
Vitamin Dietary intake
[Median (P25,P75)] RNI (Al) * UL* Intake/RNI (Al) (%)A
[Median (P25, P75)]
VitA (|igRAE) 569.70 (359.08,919.97) 1300 3000 43.35 (27.34, 70.55)
VitBi (mg) 0.87 (0.64,1.10) 1.5 - 58.00 (44.00, 73.33)
VitB2 (mg) 0.93 (0.69, 1.31) 1.5 - 61.67 (45.83, 87.33)
VitC (mg) 74.31 (49.35, 100.65) 150 2000 49.23 (32.25, 66.78)
VitE (mgaTE) 28.46 (20.83, 34.83) 17 700 166.35 (122.04, 204.69)
Niacin (mgNE) 14.72 (11.3& 18.65) 15 35 96.90 (75.37, 124.08)
Folate (ptgDFE) 184.21 (128.01,247.08) 550 1000 33.20 (22.97, 44.45)
* The Chinese dietary reference intakes (DRIs) 2013.
A Actual intake divided by the recommended nutrient intake per the Chinese Nutrition Society (%).
-Represents no data temporarily.

3.3.2膳食模式
根据主成分分析的结果,本研究的KMO值为0.649, Bartlett球形度检验的 P<0.001o 10大类食物经最大方差旋转和碎石图(图3.2)获得4种膳食模式, 每类食物的最大因子载荷即为该食物划分到膳食模式类型的依据,表3.5中显示 了 10类食物在4种膳食模式中旋转矩阵后的因子载荷值。最终获得4种膳食模 式:模式1是以菌藻类、肉类和水产品为主,模式2是以大豆及其制品、坚果和 乳制品为主,模式3以水果和蔬菜为主,模式4是以谷薯类、豆制品和蛋类为主。

Scree Plot

Figure 3.2 Scree plot for the ten different types of food

Table3.5 Rotated component matrix among the different dietary patterns
Food group Pattern 1 Pattern 2 Pattern 3 Pattern 4
Grains/potatoes and beans -0.001 0.125 0.034 0.792
Soybean products -0.001 0.663 -0.199 0.072
Mushrooms and algae 0.678 0.260 0.076 0.040
Fruits 0.309 0.052 0.667 -0.413
Vegetables 0.010 -0.102 0.808 0.249
Nuts 0.354 0.579 -0.108 0.061
Meat 0.773 0.008 0.131 -0.052
Eggs 0.231 0.350 0.288 0.379
Marine products 0.574 -0.176 -0.019 0.475
Dairy products -0.063 0.684 0.349 0.005

依据获得的4种膳食模式,274名哺乳期女性划分到不同模式中的人数是: 膳食模式1包含66人,膳食模式2中有63人,膳食模式3包含73人,膳食模 式4为72人。不同膳食模式中乳母和婴儿的一般情况如表3.6所示,母亲的年 龄、孕前BML孕期增重、家庭月收入、分娩方式以及婴儿的胎龄、出生体重 和喂养方式在4种膳食模式组间均无统计学差异(Q0.05) o

Table 3.6 Maternal demographics by different dietary patterns
Characteristics Pattern 1
N=66 Pattern 2
N=63 Pattern 3
N=73 Pattern 4
N=72 P
Maternal age1 (year) 30.0 (28.& 32.0) 29.0 (27.0, 32.0) 30.0 (28.0, 32.0) 30.0 (28.0,31.8) 0.783
Preconception BMI1
(kg/m2) 20.4(18.9, 22.0) 20.7 (19.1, 23.4) 20.7(18.& 23.1) 20.4(18.5,22.7) 0.891
Gestational weigh gain1 (kg) 15.0(13.0, 18.0) 17.0 (13.6, 20.0) 17.5 (12.0, 20.0) 16.0(14.3, 20.0) 0.782
Gestational age1 (wk) 39.8 (39.0, 40.3) 39.7 (39.0, 40.3) 39.7 (39.0, 40.1) 39.1 (38.7, 40.0) 0.199
Birth weight1 (kg) 3.4 (3.1, 3.8) 3.4 (3.2, 3.7) 3.4 (3.2, 3.6) 3.5 (3.2, 3.7) 0.977
Family income2
(yuan/month)
<5000 8 (12.1) 16 (25.4) 9 (12.3) 13 (18.1) 0.284
5000-10000 35 (53.0) 33 (52.4) 45 (61.6) 41 (56.9)
>10000 23 (34.9) 14 (22.2) 19 (26.1) 18 (25.0)
Mode of delivery2
Vaginal 34 (51.5) 30 (47.6) 35 (47.9) 37 (51.4) 0.947
Cesarean 32 (48.5) 33 (52.4) 38 (52.1) 35 (48.6)
Feeding patterns2
Breastfeeding 54 (81.8) 40 (63.5) 55 (75.3) 52 (72.2) 0.124
Mixed feeding 12(18.2) 23 (36.5) 18 (24.7) 20 (27.8)
1Values are expressed as medians (P25, P75) for skewed data(compared by Kruskal Wallis test).
2Values are expressed as n (%) for categorical data(compared by Chi-Square test).

表3.7显示了 4种膳食模式间乳母的每日能量和三大宏量营养素的摄入情 况,包括了实际摄入量以及实际摄入量与参考摄入量的比值。在不同的膳食模式 中,乳母日常的能量、碳水化合物、蛋白质的平均摄入量以及它们分别与其参考 摄入量的比值均具有统计学意义(卩二0.014,民0.004, P=0.002);而乳母的每 日脂肪摄入量和比值无统计学意义(dO.556)。膳食模式4中的哺乳期女性能 量摄入、碳水化合物和蛋白质摄入水平最高。在每种膳食模式的乳母中,都有接 近一半或以上的人数脂肪的日常摄入量超过了参考摄入量。

Table 3.7 The amount of energy and macronutrients intake with different dietary
patterns [Median (P25, P75)]
Variables Pattern 1
N=66 Pattern 2
N=63 Pattern 3
N=73 Pattern 4
N=72 P
Energy(k cal/d) 1762.65(1414.51,2065.66) 1732.44(1455.54,2186.97) 1674.01(1460.23,2217.38) 1949.03(1625.91,2682.68) 0.014
Energy rate* 76.64(61.50, 89.81) 75.32(63.2& 95.09) 72.78(63.49, 96.41) 84.74(70.69, 116.64)
Carbohydrate(g/d) 219.99 (177.37, 301.81) 232.46(190.86,313.3) 229.26(184.37, 290.72) 274.97(218.52, 360.78) 0.004
Carbohydrate rate* 66.54(53.65,91.28) 70.31(57.73,94.76) 69.34(55.76, 87.93) 83.17(66.09, 109.12)
Protein(g/d) 61.58 (45.34, 74.81) 70.61(55.90, 87.32) 66.10(49.0& 79.67) 74.26(57.19, 119.3) 0.002
Protein rate* 76.97 (56.67, 93.51) 88.26(69.8 & 109.15) 82.63(61.35, 99.59) 92.82(71.4& 149.13)
Fat(g/d) 64.45 (49.51,81.41) 67.85(54.59, 81.79) 62.62(50.66, 80.81) 70.20(56.98, 84.87) 0.556
Fat rate* 100.87 (77.4& 127.43) 106.20(85.44, 128.02) 98.01(79.2& 126.48) 109.88(89.1 & 132.84)
* Actual intake divided by the recommended nutrient intake per the Chinese Nutrition Society (%).
在4种膳食模式中乳母的矿物质摄入情况不同,乳母日常摄入的钙、铁、锌、 铜和镁都具有统计学差异(FvO.OOl, FvO.OOl, P=0.021, P<0.00L F=0.012), 详见表3.8。膳食模式4中的乳母钙、铁、锌的日常摄入量均高于其他组;而膳 食模式2中的乳母铜和镁的日常摄入量较高;膳食模式1中的乳母钙、铁、锌、 铜和镁的日常摄入量最低。
Table 3.8 Dietary mineral intake of lactating mothers with four patterns
[Median (P25, P75)]
Mineral(mg) Pattern 1
N=66 Pattern 2
N=63 Pattern 3
N=73 Pattern 4
N=72 P
Ca 325.98 (223.11,469.98) 469.69 (311.30, 701.60) 393.52 (255.66, 621.07) 499.66 (305.28, 790.78) <0.001
Fe 15.90(11.60, 20.17) 18.56(14.52, 24.74) 17.14(13.34, 24.22) 19.18 (14.63,33.25) <0.001
Zn 9.63 (7.1& 12.40) 10.66 (8.83, 13.68) 9.90 (7.53, 12.38) 11.29 (8.31, 15.77) 0.021
Cu 1.47 (1.08, 1.75) 1.78 (1.27, 2.21) 1.48 (1.11, 1.88) 1.66 (1.30, 2.69) <0.001
Mg 218.37 (173.16, 276.51) 262.29 (223.12, 336.44) 229.77 (189.20, 289.89) 253.84 (199.26, 360.69) 0.012

在膳食维生素方面,不同膳食模式间的乳母摄入情况也表现出了差异性,如
表3.9所示。4组膳食模式中乳母的维生素A、维生素Bi、维生素B2、烟酸和叶
酸的摄入量均具有统计学意义(P=0.011, P二0.045,民0.004, P=0.003,户二0.029),
而维生素C和维生素E未显示差异。膳食模式4中的乳母日常维生素A摄入量 最高,膳食模式1中的维生素A摄入量最低;维生素Bi和维生素B2的日常摄入 量较高的为膳食模式2和膳食模式4中的乳母;烟酸和叶酸日常摄入量较高的为 膳食模式4中的乳母,较低的为膳食模式1中的乳母。
Table 3.9 Dietary vitamin intake per day with four patterns [Median (P25, P75)]
Vitamin Pattern 1
N=66 Pattern 2
N=63 Pattern 3
N=73 Pattern 4
P
N=72
VitA(jigRAE) 453.96 (331.58,683.76) 617.90 (360.11,813.06) 574.83 (351.47, 945.56) 667.13 (425.18, 1213.20) 0.011
VitBi (mg) 0.80 (0.60, 1.07) 0.94 (0.75, 1.12) 0.86 (0.62, 1.11) 0.93 (0.74, 1.22) 0.045
VitB2 (mg) 0.81 (0.60, 1.05) 1.07 (0.74, 1.40) 0.94 (0.73, 1.20) 1.05 (0.72, 1.63) 0.004
VitC (mg) 73.84 (45.96, 100.995) 72.64 (49.35, 96.75) 86.50 (59.67, 105.41) 64.69 (47.5& 94.35) 0.136
VitE (mgaTE) 27.69 (20.80, 33.63) 27.75 (19.31,35.89) 28.67 (20.30, 33.86) 29.95 (22.90, 36.43) 0.356
Niacin(mgNE) 13.36 (9.72, 15.78) 15.30(12.40, 19.42) 13.90(11.14, 1.93) 16.09(12.30,21.35) 0.003
Folate(figDFE) 167.22(113.09, 225.20) 169.08 (115.3& 217.85) 192.28 (139.72, 261.02) 201.95 (142.67, 272.70) 0.029

3.3.3乳汁脂肪酸
本研究共检测出母乳中的35种脂肪酸,其中包括15种SFA, 9种MUFA和 11种PUFAo乳汁脂肪酸的构成谱详见表3.10所示,SFA在母乳FA中含量最高, 约占总FA的41.19%;其次为MUFA,约占总FA的34.11%; PUFA含量最低, 约占总FA的23.50%o母乳中的n-6 PUFA和n-3 PUFA分别为19.3%和3.79%。
Table 3.10 The FA profile of breast milk in this study [Median (P25, P75)]
FA Percentage of total FA (%)
SFA 41.19 (37.56, 46.91)
MUFA 34.11 (30.02, 36.92)
PUFA 23.50 (20.37, 27.32)
n-6 PUFA 19.3 (16.86, 22.85)
n-3PUFA 3.79 (2.73, 4.70)
n-6/n-3 PUFA 4.81 (3.93,7.13)

母乳中的SFA构成谱详见表3.11o在检测出的母乳15种SFA中,含量最高
的为棕稠酸(C16:0),占21.17%;其次为硬脂酸(C18:0),占6.41%;排名第
三的为月桂酸(C12:0),占5.08%0
Table 3.11 The SFA profile of breast milk in this study [Median (P25, P75)]
Common name FA Percentage of total FA (%)
Hexanoic acid C6:0 0.12(0.07, 0.18)
Octanoic acid C8:0 0.18 (0.03,0.24)
Capric acid C10:0 1.48 (1.19, 1.95)
Eleven carbonic acid Cll:0 0.03 (0.13,0.05)
Lauric acid C12:0 5.08 (3.56, 6.88)
Thirteen carbonic acid C13:0 0.01 (0.00, 0.02)
Myristic acid C14:0 4.33 (3.07, 5.80)
Fifteen carbonic acid C15:0 0.14(0.10, 0.20)
Palmitic acid C16:0 21.17(19.5& 22.89)
Stearic acid C18:0 6.41 (5.67, 7.45)
Arachidic acid C20:0 0.21 (0.17, 0.27)
Twenty-one carbonic acid C21:0 0.06 (0.02, 0.10)
Twenty-two carbonic acid C22:0 0.09 (0.07, 0.15)
Tricosanoic acid C23:0 1.20 (<0.01, 1.60)
Tetracosanoic acid C24:0 0.08 (0.06, 0.12)

本研究检测出母乳中的9种MUFA,排名前三位的依次是油酸(C18:ln9c) > 十六碳一烯酸(C16:l)和二十碳一烯酸(C20:l),它们分别占乳汁总FA的29.24%、 2.73%和0.61%,其余6种MUFA的含量详见表3.12。
Table 3.12 The MUFA profile of breast milk in this study [Median (P25, P75)]
Common name MUFA Percentage of total FA (%)
Myristoleic acid C14:l 0.07 (0.04, 0.12)
Pentadecenoic acid C15:l 0.02 (<0.01,0.06)
Zoomaric acid C16:l 2.73 (2.11,3.33)
Heptadecenoic acid C17:l 0.22 (0.16, 0.30)
Trans-oleic acid C18:ln9t 0.34 (0.22, 0.56)
Oleic acid C18:ln9c 29.24 (25.60, 32.0)
Eicosaenoic acid C20:l 0.61 (0.51,0.71)
Erucic acid C22:ln9 0.09 (0.0&0.12)
Twenty-four-carbituric acid C24:l 0.05 (0.02, 0.08)

母乳中的11种PUFA构成谱见表3.13,前7个为n-6 PUFA,后4个为m3 PUFAo n-6 PUFA 中含量最高的是亚油酸(C18:2n6c),占 13.73%; n-3 PUFA 中含量最高的是a-亚麻酸,占2.41%O亚油酸和a-亚麻酸是两种PUFA合成通路 的前体物质,终产物为AA (C20:4n6)和DHA (C22:6n3),本研究乳汁中AA 占总 FA 的 0.80%, DHA 占 FA 的 0.75%。
Table 3.13 The PUFA profile of breast milk in this study [Median (P25, P75)]
Common name PUFA Percentage of total FA (%)
Trans linoleic acid C18:2n6t 0.07 (0.04, 0.13)
linoleic acid C18:2n6c 13.73 (14.15,20.00)
y-linolenic acid C18:3n6 0.42 (0.31,0.56)
Eicosene dienoic acid C20:2 0.77 (0.65, 0.90)
Eicosatrienoic acid C20:3n6 0.70 (0.47, 0.95)
Arachidonic acid C20:4n6 0.80 (0.62, 0.98)
Docosadienoic acid C22:2 0.21 (0.14, 0.28)
a-linolenic acid C18:3n3 2.41 (1.76,3.38)
Eicosatrienoic acid C20:3n3 0.13 (0.0& 0.18)
Eicosapentaenoic acid C20:5n3 0.11 (0.05, 0.20)
Docosahexaenoic acid C22:6n3 0.75 (0.29, 1.17)
3.3.4膳食模式与乳汁脂肪酸
乳汁的脂肪酸构成谱在4种膳食模式中的分布详见表3.14。母乳中的SFA 和PUFA的总比例在不同模式间有统计学差异(PvO.OOl,民0.025) , n-6 PUFA 的比例也显示有统计学意义(P二0.038);而乳汁中的MUFA, n-3 PUFA和n-6/ n-3在4种膳食模式间未发现有统计学意义(P>0.05) o
Table 3.14 Proportions of FA in breast milk for dietary patterns [Median (P25, P75), %]
FA Pattern 1
N=66 Pattern 2
N=63 Pattern 3
N=73 Pattern 4
N=72 P
SFA 40.38 (37.41, 44.25) 42.92(38.61,49.62) 39.10(34.65,45.04) 42.92(40.31,49.93) <0.001
MUFA 34.40 (31.20, 36.84) 33.53(29.91, 36.42) 34.85(31.39, 39.58) 33.45(29.09, 35.39) 0.053
PUFA 24.49 (21.73, 28.43) 22.09(19.92, 27.08) 24.63(20.37, 29.17) 22.77(19.49, 26.38) 0.025
n-6 20.71(18.11,23.27) 18.24(16.41,22.71) 20.11(17.33, 24.22) 18.49(16.11,21.89) 0.038
n-3 3.96 (2.70, 5.01) 3.55(2.9& 4.46) 3.56(2.32, 4.98) 3.86(3.09, 4.56) 0.292
n-6/n-3 4.83 (3.80, 7.32) 4.76(4.14, 6.30) 5.34(3.74, 9.39) 4.69(3.85, 5.74) 0.341

母乳中的单个SFA在4种膳食模式中的分布详见表3.15。结果显示,有4 种SFA,即C6:0、C10:0、C11:O和C23:0的比例在不同模式间有统计学差异 (P二0.038, P二0.008, P二0.003, PvO.OOl),而乳汁中的其余 11 种单个的 SFA 在4种膳食模式间未发现有统计学意义(P>0.05)。
Table 3.15 Proportions of SFA in breast milk for dietary patterns [Median (P25, P75), %]
SFA Pattern 1
N=66 Pattern 2
N=63 Pattern 3
N=73 Pattern 4
P
N=72
C6:0 0.11 (0.07,0.16) 0.12(0.56, 0.18) 0.12(0.07,0.17) 0.14(0.09, 0.24) 0.038
C8:0 0.17 (0.03,0.22) 0.19 (0.02, 0.27) 0.19(0.03,0.22) 0.19 (0.03,0.30) 0.383
C10:0 1.37 (1.07, 1.81) 1.62(1.2& 2.37) 1.44(1.15, 1.73) 1.68 (1.20, 2.28) 0.008
Cll:0 0.02 (0.01,0.04) 0.04 (0.02, 0.06) 0.03 (0.01,0.04) 0.03 (0.01,0.07) 0.003
C12:0 4.97 (3.19, 6.29) 5.61 (3.85, 7.37) 4.85 (3.06, 6.42) 4.94 (4.11,7.61) 0.255
C13:0 0.01 (<0.01, 0.02) <0.01 (<0.01, 0.04) <0.01 (<0.01,0.01) 0.01 (<0.01,0.03) 0.526
C14:0 4.26 (3.06, 5.68) 4.74 (3.04, 6.32) 4.14(2.65,5.52) 4.76 (3.34, 6.14) 0.287
C15:0 0.13(0.0 &0.19) 0.15 (0.10, 0.24) 0.12(0.09, 0.18) 0.15(0.11,0.20) 0.166
C16:0 20.64 (19.00, 22.60) 21.50 (20.06, 22.69) 20.92 (19.02, 22.57) 21.77 (20.13, 23.67) 0.126
C18:0 6.58 (5.79,7.81) 6.66 (5.79, 7.69) 6.08 (5.39, 6.92) 6.48 (5.70, 7.35) 0.124
C20:0 0.22 (0.17,0.27) 0.21 (0.16, 0.26) 0.20 (0.17,0.25) 0.22 (0.1&0.27) 0.673
C21:0 0.07 (0.03,0.10) 0.07 (0.03,0.10) 0.06 (0.02, 0.09) 0.06 (0.02, 0.09) 0.369
C22:0 0.10(0.07,0.14) 0.09 (0.06, 0.15) 0.09 (0.07,0.15) 0.09 (0.06, 0.14) 0.602
C23:0 1.00 (<0.01, 1.51) 1.32 (0.16,1.70) <0.01 (<0.01, 1.40) 1.41 (1.11, 1.69) <0.001
C24:0 0.08 (0.06, 0.10) 0.08 (0.06, 0.11) 0.09 (0.06, 0.17) 0.08 (<0.01,0.12) 0.097
表3.16显示了母乳中的9种MUFA在4种膳食模式中的分布,其中3种
MUFA在不同模式间显示有差异性,分别为C15:1 (P=0.048)>C18:ln9t(P<0.001)
和C18:ln9c (P=0.002);而其余6种MUFA未显示有统计学差异(P>0.05)。
Table 3.16 Proportions of MUFA in breast milk for dietary patterns [Median (P25, P75), %]
MUFA Pattern 1
N=66 Pattern 2
N=63 Pattern 3
N=73 Pattern 4
N=72 P
C14:l 0.07 (0.04, 0.09) 0.08 (0.03,0.13) 0.70 (0.39, 0.10) 0.08 (0.03,0.14) 0.482
C15:l 0.03 (<0.01,0.06) 0.04 (<0.01,0.07) <0.01 (<0.01, 0.05) 0.03 (<0.01,0.06) 0.048
C16:l 2.64(1.91,3.21) 2.87 (2.13,3.37) 2.66 (2.05, 3.24) 3.00 (2.45, 3.59) 0.161
C17:l 0.24 (0.16, 0.35) 0.24 (0.17, 0.31) 0.19(0.15,0.29) 0.22 (0.1& 0.30) 0.414
C18:ln9t 0.28 (0.18,0.44) 0.42 (0.26, 0.58) 0.26 (0.19, 0.54) 0.43 (0.29, 0.68) <0.001
C18:ln9c 29.73 (27.03, 32.15) 28.53 (25.03,31.31) 31.02 (26.44, 35.10) 28.35 (23.90, 30.72) 0.002
C20:l 0.61 (0.53, 0.70) 0.63 (0.53, 0.71) 0.59 (0.50, 0.67) 0.62 (0.52, 0.71) 0.678
C22:ln9 0.09 (0.0& 0.12) 0.09 (0.07,0.11) 0.09 (0.0&0.13) 0.09 (0.0&0.13) 0.711
C24:l 0.04 (0.02, 0.08) 0.05 (0.01,0.07) 0.06 (0.02, 0.12) 0.05 (0.02, 0.08) 0.109
检测出的乳汁中11种PUFA在4种膳食模式中的分布详见表3.17,其中 C18:2n6c> C20:2、C20:3n6、C20:4n6 和 C22:6n3 这 5 种 PUFA 在不同的膳食模 式间显示有差异性(P二0.002, F=0.043, PvO.OOl, P二0.018,尸=0.020),其余的 6种PUFA未显示有统计学意义(P>0.05) o
Table 3.17 Proportions of PUFA in breast milk for dietary patterns [Median (P25, P75), %]
PUFA Pattern 1
N=66 Pattern 2
N=63 Pattern 3
N=73 Pattern 4
N=72 P
C18:2n6t 0.06(0.03,0.15) 0.07(0.05,0.13) 0.06(0.04,0.13) 0.10(0.05,0.14) 0.142
C18:2n6c 18.11 (15.39, 20.48) 15.67 (13.43, 19.86) 17.56 (15.01,21.73) 15.70 (13.01, 18.85) 0.002
C18:3n6 0.40 (0.29, 0.57) 0.44 (0.33, 0.57) 0.39 (0.2& 0.52) 0.44 (0.33, 0.57) 0.362
C20:2 0.77 (0.62, 0.90) 0.82 (0.69, 0.93) 0.70 (0.59, 0.85) 0.80 (0.6& 0.91) 0.043
C20:3n6 0.57 (0.45, 0.81) 0.85 (0.53, 1.05) 0.58 (0.42, 0.88) 0.83 (0.5& 1.01) <0.001
C20:4n6 0.85 (0.64, 1.05) 0.67 (0.41,0.78) 0.88 (0.74, 1.02) 0.66 (0.29, 0.81 0.018
C22:2 0.19(0.12, 0.27) 0.20 (0.15, 0.28) 0.21 (0.12, 0.29) 0.22 (0.16, 0.27) 0.783
C18:3n3 2.88 (1.85,3.66) 2.32(1.84, 2.92) 2.27 (1.52, 3.66) 2.52(2.03,3.31) 0.375
C20:3n3 0.14(0.09, 0.23) 0.12(0.09, 0.16) 0.11 (0.07, 0.21) 0.13(0.07, 0.17) 0.270
C20:5n3 0.11 (0.05, 0.21) 0.10(0.05,0.20) 0.13 (0.06, 0.19) 0.11 (0.04, 0.20) 0.718
C22:6n3 0.64 (0.32, 0.96) 0.83 (0.2& 1.21) 0.41 (0.26, 0.99) 0.95 (0.4& 1.39) 0.020

3.4讨论
由于不同地区的人群具有特定的膳食习惯,本研究共纳入了 274名的健康汉 族乳母,她们来源于网络招募、产后护理中心和妇幼保健院三个途径,能很好地 代表着中国东北内陆地区的哺乳期女性。本研究调查了乳母日常的膳食并收集乳 汁,将膳食情况分为不同的膳食模式,研究了长春地区的哺乳期女性的膳食模式 与母乳脂肪酸之间的关系。
研究对象的日常能量摄入量以及碳水化合物和蛋白质摄入量的平均水平均 低于推荐摄入量,而脂肪的平均摄入量高于推荐摄入量。可能的原因是产后女性 由于孕期体重的增加,为了产后尽快恢复孕前的体重,最直接的方式是减少日常 生活中的食物摄入,但由于哺乳期仍需要为婴儿提供足够的母乳,很多女性选择 日常摄入脂肪含量较高的食物,如经常食用猪蹄汤等,因此在总体日常能量摄入 不足的情况下,脂肪的摄入量仍高于推荐量。
本研究纳入的哺乳期女性矿物质和维生素的摄入情况仍不理想,钙的日常平 均摄入量仅占RNI的32.96%,维生素A、维生素Bi、维生素B2>维生素C和 叶酸的平均摄入水平均偏低,分别占推荐量的43.35%、58.00%、61.67%、49.23% 和33.20%; 一项来自对我国湖南省的哺乳期女性的膳食调查也显示了相同的结 果,她们日常膳食钙的摄入量仅为DRIs的35.5%,且摄入不足的人数高达 96.65%;维生素A、维生素Bi、维生素B2和维生素C的摄入量分别占DRIs的 47.5%、69.8%、62.2%和50.3%zi]。这说明了我国哺乳期女性普遍存在着膳食维 生素和矿物质的摄入不足现象,需改善乳母的膳食营养状况,以满足机体对矿物 质和维生素的需求。
本研究通过主成分分析法获得了 4种膳食模式:模式1是以菌藻类、肉类和 水产品为主,模式2是以大豆及其制品、坚果和乳制品为主,模式3以水果和蔬 菜为主,模式4是以谷薯类、豆制品和蛋类为主。有研究表明,母乳中的FA成 分受孕妇的年龄,家庭收入和胎龄的影响【I。' M2, 143],在本研究划分的这4种膳食 模式间乳母和婴儿的一般情况均无差异性,因此排除了个体因素的影响,这为后 续准确研究乳母的膳食模式与乳汁脂肪酸间的关系奠定了基础。
在4种膳食模式间乳母的能量摄入量虽表现出差异性,但各模式中乳母日常 能量摄入的平均水平均低于2000kcal,这与中国营养学会推荐的2300 kcal/d有一 定差距;但来自对中国东南部的温州和常州的乳母膳食调查结果显示,这两个城 市乳母的日常能量摄入量分别为1964.54kcal和1823.力kcal,与本研究的结果较 一致a。]。韩国的一项研究结果也表明a],其哺乳期女性能量摄入为8173.2kJ/d (1953.4kcal/d),与本研究和常州、温州两城市的乳母能量摄入水平相近。这 可能共同反映了哺乳期女性在产后恢复方面通过减少日常膳食的摄入来降低能 量的摄入量,达到减轻体重目的。
膳食模式4中的乳母日常摄入的能量最高,她们食用较多的谷薯类、豆类和 蛋类,这个结果与先前的研究是一致的时】,由于谷薯类和杂豆类富含碳水化合 物,且碳水化合物是能量的主要来源,因此膳食模式4中的乳母膳食摄入能量最 高是由日常膳食组成的影响。蛋类是高质量蛋白质的最主要来源,由于膳食模式 4中的女性摄入的食物多是主食和蛋类,因此她们比其他膳食模式中的乳母摄入 的碳水化合物和蛋白质的量要高。膳食模式3中乳母的能量摄入最低,这也与她 们以低能量的水果和蔬菜膳食为主密不可分。虽然各种膳食模式之间乳母的碳水 化合物和蛋白质的摄入量有差异,但各组的平均摄入水平均低于推荐值,本研究 的这个结果与来自中国东南部及意大利的研究一致[啄⑷]。不同膳食模式间乳母 的矿物质和维生素摄入情况表现出较大的差异性,但各膳食模式乳母总体的摄入 水平都不高,由于乳汁中的矿物质和维生素受膳食影响较大糾,因此乳母的矿物 质和维生素摄入可通过母乳传递给后代,保障足够的摄入量对婴儿的生长发育也 至关重要。
本研究中母乳的SFA约占总FA的41.19%,与韩国的一项研究报道SFA比 例42.1%相近叫 但高于一项对中国母乳的研究(34.71%),低于芬兰(48.22%) > 南非(48.31%)和西班牙(46.11%);本研究中MUFA占34.11%,与对这四个 国家的研究结果相差不大,分别为35.43%、36.55%、34.68%和36.63%; PUFA 占23.50%,高于芬兰(12.74%)、南非(14.85%)和西班牙(15.68%)⑴习。本 研究乳汁中DHA占总FA的0.75%,韩国的母乳中DHA的浓度为0.67%与本研 究中的DHA含量接近;而日本的母乳中DHA含量为1.09,高于本研究中母乳 的DHA水平,可能与日本乳母日常鱼的摄入量较多有关徊。有研究指出在不 同人群的母乳中MUFA的含量较恒定,而DHA含量的变异最大,本次研究的结 果也证实了这项研究的结论a。]。
在不同膳食模式中,母乳中的SFA、PUFA和n-6 PUFA的含量均显示岀了 差异性。以食用大豆及其制品、坚果和乳制品为主的膳食模式2和以食用谷薯类、 豆制品和蛋类为主的膳食模式4中的乳母分泌的乳汁中SFA含量最高(平均含 量均为42.92%),可能的原因是模式2中的乳母食用较多的乳制品,有研究表 明了日常食用较多全脂牛奶的母亲分泌的乳汁中SFA含量较高Mi,而模式4中 的母亲食用较多的蛋类,蛋类食物的蛋黄中含有较高水平的胆固醇,有研究表明 了在膳食胆固醇摄入与体内SFA之间存在着正相关,韩国的研究也表明了乳母 的胆固醇摄入和乳汁SFA呈正相关呻叫膳食模式3中的母亲分泌的乳汁中SFA 含量最低,由于她们以水果和蔬菜摄入为主,这两类食物本身含有极低的FA; 但膳食模式3中母乳的PUFA含量最高,这可能与这两类食物富含的抗氧化成分 如维生素C在体内PUFA的介导中起保护作用有关Qi】。膳食模式1中的母亲分 泌的乳汁中n-6 PUFA的含量最高,她们以食用菌藻类、肉类和水产品为主,但 吉林省位于东北的内陆地区,乳母日常摄入的水产品远低于沿海地区人群的摄入 量,日常膳食还是以摄入较多畜肉和禽类为主,畜肉和禽肉已被证实是重要的 n-6 PUFA来源,因此她们膳食摄入的n-6 PUFA水平可能更高,导致了她们分泌 的乳汁中n-6 PUFA的含量最高[mm。在膳食模式4的乳母乳汁中,我们还发现 了众多单个FA的含量最高,既包括了单个的SFA,也包括了 MUFA和PUFA。 我们推测由于膳食模式4中的食物主要为主食,乳母主食的食用量较高,并不影 响其他膳食种类的摄入量,膳食模式4中的乳母可能较其他模式中乳母的总体膳 食摄入量高,即在主食摄入量较高的情况下,其他类型食物的摄入量也不低。这 种结果也可以很好的解释膳食模式4中的乳母能量摄入、碳水化合物和蛋白摄入 量较高的现象。
本研究的主要目的是确定乳母的膳食和乳汁的FA构成谱之间的关系,我们 根据膳食问卷的调查结果将研究对象的日常膳食情况划分成4种不同的膳食模 式。研究结果显示出在这4种膳食模式中乳母的日常能量、碳水化合物、蛋白质、 矿物质和微量元素摄入方面存在着显著差异。此外,母乳中的SFA、PUFA、n-6 PUFA和单个的FA含量也存在着差异性。本研究的结果证明了母乳FA构成谱 与乳母的膳食习惯密切相关,可以用膳食模式很好的解释乳汁中的FA差异。
本研究是首次对我国东北地区哺乳期女性的饮食习惯影响乳汁FA构成的研 究,具有一定创新性,但也存在着一些不足之处。我们收集的志愿者母乳均是成 熟乳,从产后22天到产后6个月之间,有研究指出母乳的FA含量受哺乳期不 同时间段的影响my但我们研究的母乳样本基本涵盖了 WHO推荐的婴儿在出 生后6个月内母乳喂养的整个成熟乳的时间段,也具有一定的研究意义。此外, 由于长春位于东北内陆地区,乳母日常海产品的摄入量较低,我们今后将合作其 他机构,扩大样本收集范围,收集更多来自不同地域的乳母,以便更好的研究哺 乳期女性膳食模式与母乳FA构成谱间的关系。
3.5小结
本研究共收集了 274名产后22天到6个月的哺乳期健康汉族女性,划分为 4种膳食模式,探索了不同膳食模式间乳母分泌的乳汁脂肪酸构成情况,得到的 结论如下:
1.274名乳母的日常能量摄入量以及碳水化合物和蛋白质摄入量的平均水 平均低于参考摄入量,而脂肪的平均摄入量高于参考摄入量。
2.不同膳食模式间乳母的能量、碳水化合物、蛋白质、矿物质和微量元素摄 入量均有所不同。
3.膳食模式可影响母乳中的SFA、PUFA和n-6PUFA的含量。
第4章FADS基因表达与乳汁脂肪酸
4.1引言
母乳中的PUFA是纯母乳喂养婴儿唯一的膳食来源,对于PUFA功能的研究, 尤其AA、EPA和DHA在婴儿大脑和视网膜发育中不可替代的作用已获得广泛 认可,保障母乳中PUFA水平对婴儿长期的生长发育和身体健康至关重要。母乳 中的PUFA水平不仅受母体膳食的影响,也与内源性的生物合成密切相关,尤其 是对于膳食摄入较少鱼类的内陆地区乳母,研究体内PUFA的合成更为关键。
A-5和A-6去饱和酶是参与必需脂肪酸ALA和LA生物转化为较长链PUFA 的关键酶,编码它们的基因分别为FADS1和FADS2基因,在FADS基因家族中 还存在着FADS3基因。FADS1和FADS2基因在n-6和m3脂肪酸代谢通路中发 挥的作用已被广泛认可,但FADS3基因所发挥的作用尚不明确I®]。研究FADS 相关基因的表达与PUFA之间的关联主要来源于动物模型和细胞,对人的组织研 究主要来源于血液,未发现来自母乳中的FADS基因表达的研究。母乳中存在的 细胞成分为研究FADS基因簇的表达提供了可能丽,本研究以新鲜母乳为样本, 利用分子生物学技术检测母乳中的FADS基因簇的mRNA表达和蛋白表达情况, 探索了母乳的PUFA水平在不同FADS基因表达组的差异性,为更准确的研究母 乳PUFA水平与FADS基因相关性提供科学依据。
4.2材料与方法
4.2.1研究对象
本研究纳入的人群是从2017年1月开始至2017年8月,在长春市某妇幼保 健医院招募的产后42-45天的健康汉族女性。纳入标准与3.2.1部分一致,所有 参与者都签署了知情同意书,本研究的内容得到了吉林大学公共卫生学院伦理委 员会批准。
4.2.2实验试剂和仪器4.2.2.1实验试剂
十七烷酸甲酯(>99%

中国奥克斯公司 中科美菱公司
4.2.3实验方法
4.2.3.1问卷调查
基本信息问卷的内容和方法同前面一致,详见2.2.3.2部分。
4.2.3.2乳汁收集
乳汁收集方法同前面一致,每位研究对象的母乳分为3管,每管10ml; 一 管用于检测母乳脂肪酸,一管用于提取乳汁RNA, —管用于提取蛋白。为了避 免RNA酶对乳汁中RNA的分解,乳汁收集管先前用0.1%的DEPC水浸泡24h 后高压,烘干后用于收集新鲜乳汁。
4.2.33乳汁脂肪酸检测
检测母乳中的8种PUFA,检测方法同前面一致,详见3.2.3.3部分。
4.2.3.4 母乳中的FADS基因mRNA表达水平检测
[1]母乳中的RNA提取
采用Trizol法提取乳汁中的RNAo为避免RNA酶的分解,提取RNA的实 验用品均先用0.1%的DEPC水浸泡24h后高压,烘干后用于实验。具体步骤如 下:
(1)取10ml收集的新鲜母乳,在4°C时8000g离心
(2)取出离心后的乳汁,可明显分为三层:上层为乳脂,中层为脱脂乳, 管底部可看到沉淀;
(3)将管内的上层乳脂和中层脱脂乳倒入废液桶中,留管底部沉淀;
(4)向留有沉淀的管中加入lml PBS,吹打洗涤沉淀;
(5)将含有沉淀的PBS洗涤液移入1.5ml的Ep管中,8000g条件下4°C离 心 15min;
(6)弃上清液,向留有沉淀的Ep管中加入lml的Trizol,吹打混匀;
(7)盖好Ep管盖后上下颠倒用力摇晃约30s,置于室温下放置lOmin;
(8)12000g的条件下4°C离心5min,将上清液倒入新的Ep管中;
(9)向上清液中加入400ul的氯仿,吹打混匀,盖好管盖用力摇30s;
(10)12000g, 4°C离心5min,移上清液至新的Ep管中,不能吸到中间的 白色液面;
(11)向上清液中加入等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,置于室温下30mim
(12)12000g, 4°C离心 15min,弃上清液;
(13)向留有沉淀的管中加入1ml的75%DEPC乙醇,轻轻震荡管底部沉淀;
(14)8000g, 4°C离心 5min,弃上清液;
(15)重复第13和14步一次;
(16)晾干沉淀,加入10ul的RNAse free水,吹打混匀;
(17)吸取lul的RNA悬液于微孔板检测仪上检测提取RNA的浓度和纯度。
[2]RNA完整性检测
采用1%的琼脂糖凝胶电泳实验,将提取的乳汁RNA加样进行电泳,在显 影仪下曝光,观察RNA电泳后的结果,如岀现三条亮带(28S, 18S和5S), 则表明提取的RNA完整性好。
[3]逆转录实验
将母乳中提取的RNA转化为cDNA,逆转录实验所使用的体系如表4.1所示。 将所需试剂和RNA悬液混匀后,在PCR中设置反应条件进行逆转录,具体的反 应条件设置为:25°C时5min,然后50°C时15min,最后85°C时5mino最终获得 的cDNA可直接用于实时定量PCR实验。
Table 4.1 The reagents in reverse transcription experiments
Reagent Volume
Random hexamers 1 ul
Oligo (dT)is (50uM) 1 ul
Hiscript Enzyme Mix 2ul
2xRT Mix 10 ul
Rnase free water+RNA 6 ul

[4] FADS引物设计与合成
选取GAPDH为内参基因,目的基因FADS1、FADS2和FADS3的mRNA 序列通过检索NCBI获取;引物设计通过NCBI中的Primer网站在线设计,获取 的碱基序列进行NCBI中的Blast比对,选取引物的碱基序列见表4.2。目的基因 引物的合成及内参GAPDH基因的引物均购于上海生工公司。
Table 4.2 The primer sequences of FADS genes
Gene Sequence
FADS1 Forward GTGGC TAGTG ATCGA CCGTAA
Reverse ATTCT TGGTG GGCTC AAAGC
FADS2 Forward AACTG GTGGAATCAT CGCCA
Reverse ATTCG CCCAG AACAAACACG
FADS3 Forward TCGTG ATGGG GCAGC TAAAG
Reverse CTTCT TGCCA TACTC GACGG A

[5]实时定量PCR实验
根据Roche实时定量PCR试剂盒的说明书,在冰上按照如下的体系加入各 种试剂:
Fast Start Universal SYBR Green Master (Rox) lOul
Forward Primer (10 uM) lul
Reverse Primer (10 uM) lul
cDNA 2ul
Water, PCR Grade 6ul
Total 20ul
为保证实验结果的准确性,每个样本的同一基因平行三副孔加样,完成后将
体系中的各种组分充分混匀,采用快速PCR反应方法,在荧光实时定量PCR仪
上设置条件进行反应,具体的PCR反应条件和溶解曲线的条件设置如下:

厂 95 °C 1 min
溶解曲线Y 55 °C 30 s »1个循环
95 °C 30 s

循环完成后收集不同样本的目的基因和内参基因的Ct值,计算个体的目的 基因相对表达情况。
4.2.3.5乳汁中FADS基因的蛋白表达水平检测
[1]乳汁蛋白的提取
为避免蛋白的分解,裂解样品的所有步骤均在冰上进行。
(1)取1ml的RIPA蛋白裂解液,并加入10ul的100mM的PMAF液,使 得RIPA裂解液中PMSF的浓度为ImM,吹打混匀;
(2)取10ml收集的新鲜母乳,在4°C时8000g离心8min;
(3)取出离心后的乳汁,将管内的上层乳脂和中层脱脂乳倒入废液桶中, 留管底部沉淀;
(4)取200ul的含有PMSF的RIPA裂解液,吹打沉淀并移入新的Ep管中;
(5)用涡旋振荡器震荡30s,使样品充分裂解;
(6)使用4°C离心机12000g的速度下,离心5min;
(7)取岀离心后样品的上清液测定提取的蛋白浓度。
[2]蛋白定量
使用BCA法制作标准曲线,并对提取的样品蛋白进行定量。
(1)根据样本的数量配制适量的BCA工作液,按照BCA试剂A与BCA 试剂B的体积比为50:1进行配制,充分混匀;
(2)使用0.9%的NaCl溶液溶解蛋白标准品,稀释浓度至0.5mg/ml;
(3)将 0.5mg/m 1 的蛋白标准品按 Oul、lul、2ul> 4ul、8ul> 12ul> 16ul 和 20ul的顺序加入96孔板的标准品孔内;
(4)按照上一步的加样顺序分别加20ul> 19ul> 18ul> 16ul> 12ul> 8ul> 4ul 和Oul的0.9%的NaCl溶液至每孔总体积20ul;
(5)样品孔中加入2ul的待测样品和18ul的0.9%的Nacl溶液;
(6)标准品孔和样品孔均加入200ul的BCA工作液,37°C时水浴30min;
(7)用微孔板检测仪检测各孔在562nm波长时的吸光度值;
(8)根据标准品的吸光度绘制蛋白浓度标准曲线,根据样品的吸光度计算 蛋白浓度,调节样品的蛋白为同一水平。
[3]蛋白样品的制备
(1)从-20°C冰箱中取出5x的SDS-PAGE ±样缓冲液,置于室温下融化;
(2)取16ul的蛋白样品上清液和4ul的上样缓冲液,吹打混匀;
(3)在100°C的水浴锅内加热5min,使样品蛋白充分变性;
(4)取出变性后的样品,冷却至室温后可直接加样于SDS-PAGE胶孔中。
[4]Western blot 实验
(1)配液
①5X电泳缓冲存储液:称取甘氨酸94g、Tris碱15.15g和5g的SDS,加入 去离子水溶解,定容至1000ml;置于室温下存储,使用时量取200ml,去离子水 定容至1000ml即为IX电泳缓冲液。
②5X的TBS存储液:称取Tris碱30.285g和43.83g的NaCl,去离子水溶 解后,用稀盐酸调节PH值为7.4,定容至1000ml;使用时量取200ml,去离子 水定容至1000ml即为IX的TBS溶液。
③TBST溶液:取1ml的吐温-20加入至1000ml的1XTBS溶液中,溶解混匀。
④转膜缓冲溶液:称取甘氨酸14.4g和Tris碱3g,去离子水溶解后加入200ml 的无水甲醇,再用离子水定容至lOOOmlo
⑤封闭液:称取lg脱脂奶粉溶解于20ml的TBST溶液中。
(2)制胶
装好灌胶玻璃板,用蒸惚水检查密封性好后可用于灌胶;使用碧云天生产的 SDS-PAGE快速凝胶试剂盒进行配制,根据目的蛋白分子量大小选用10%的分离
胶和5%的浓缩胶,配胶所需各试剂加样量如下:
分离胶(10%) 浓缩胶(5%)
蒸馆水 2.0 ml 1.17 ml
30% Acr-Bis 1.7 ml 0.33 ml
配胶缓冲溶液 1.25 ml 0.5 ml
10%过硫酸鞍 50 ul 20 ul
TEMED 2 ul 2 ul
按照以上试剂加样顺序先配10%的分离胶,各溶液在10ml离心管混匀后迅 速灌胶至密封好的玻璃板中。使用蒸馆水压胶,室温下静置30mim肉眼可见胶 与蒸馆水之间的水平线即表示胶已凝固。倒掉蒸憾水,用吸水纸吸干玻璃板内残 留的蒸馆水。按照以上顺序配制5%的浓缩胶,各试剂混匀后迅速加满盛有分离 胶的玻璃板,插入齿状梳,避免出现气泡;室温下静置30min后,浓缩胶可充分 凝固。
(3)电泳
将凝固好的胶放入垂直电泳槽中,短玻璃板面朝向槽内,固定好后向电泳槽 内倒入IX的电泳缓冲液,液面要没过短玻璃板,轻轻拔出齿状梳。将蛋白Marker 和制备好的蛋白样品加入胶孔中,电泳仪电压调至80V恒压电泳,待蛋白样品 中的蓝色条带移动到分离胶底部时停止电泳,整个过程约2ho
(4)转膜
将6张滤纸按照胶的大小裁剪,与黑色夹层海绵一起放入转膜缓冲液中浸 泡。取出电泳完毕的凝胶,用小银子轻轻撬开玻璃板,根据蛋白Marker确定内 参蛋白和目的蛋白的位置,切去多余的胶。按照剩余胶的大小裁剪PVDF膜,做 好标记后浸入甲醇中浸泡使其活化。从电源正极(红色)到电源负极(黑色)按 照如下顺序放置转膜物品:白色多孔边盒、黑色夹层海绵、3张滤纸、PVDF膜、 凝胶、3张滤纸、黑色夹层海绵、黑色多孔边盒。扣好边盒后移入转膜槽中,槽 内放入冰袋,倒入转膜缓冲溶液至所需界面。转膜电压设置为100V,将转膜槽 置于冰上转膜约lho
(5)封闭
取出转膜完毕的PVDF膜,浸入盛有20ml的封闭液容器中,在摇床上摇lho
(6)抗体孵育
使用一抗稀释液稀释内参和目的蛋白的一抗,均按照抗体体积与稀释液体积 比为1:5000进行稀释。按照蛋白Marker的位置裁膜,将载有内参和目的蛋白位 置的膜分开,分别浸入对应的蛋白一抗稀释液中。在摇床上轻摇lh后,置于4°C 冰箱中过夜。第二天取出一抗孵育好的膜,回收一抗后用TBST洗膜3次,每次 在摇床上轻摇lOmin。二抗用TBST稀释,同样按照抗体体积与稀释液体积比为 1:5000进行稀释。洗好的膜用稀释好的二抗在摇床上轻摇孵育lh,完成后同样 用TBST洗膜3次,每次在摇床上轻摇lOmino洗膜完成后倒入新的TBST浸泡 膜,可直接用于显影。
(7)显影
采用ECL化学发光显影法,显影液现用现配,取适量等体积的A液和B液 混合于避光管中。用银子取出TBST浸润的膜置于显色板上,滤纸吸干膜周边的 TBST液体,在膜上均匀滴入混合好的显影液,lmin后进行显影。
4.2.4数据库建立
使用Epidata 3.0软件建立研究对象的基本信息数据库,Excel 2010软件建立 乳汁脂肪酸数据库。运用MxPro-Mx3000P软件,获得实时定量PCR实验中的待 测样本GAPDH基因和FADS1、FADS2和FADS3基因的Ct值,使用2丛心法计 算目的基因的相对表达量,Excel 2010软件建立实时定量PCR数据库。使用Image J 2x软件对Western Blot实验显影的结果进行分析,构建半定量的Excel数据库。
4.2.5数据分析
运用SPSS24.0统计学软件进行数据的分析,数据是否满足正态性分布使用 Kolmogorov -Smirnov检验来判断。对于满足正态性分布的计量数据采用 Mean+SD表示,非正态性分布的计量数据采用Median (P25, P75)来表示;计数 资料使用构成比表示。正态分布两组间比较使用t检验,非正态的计量资料比较 使用Kruskal Wallis检验。所有的统计学检验均为双侧检验,以P<0.05为差异有 显著性。
4.2.6技术路线
本研究的技术路线详见图4.1所示。

50 lactating wo men enrolled in the study
V

The association between FADS The association between FADS
mRNA expression and PUFA of protein expression andPUFAof
breast milk breast milk

Figure 4.1 Flow diagram of this study
4.3实验结果
4.3.1基本情况
本研究纳入的研究对象为50名产后42-45天的哺乳期健康汉族女性。她们 的平均年龄为29.58+2.42岁,家庭收入水平较高,仅有9人家庭月收入在5000 元以下。研究对象的平均孕前BMI为20.68+2.85 kg/m2,平均孕期增重为 16.23+5.53 kgo 52%的研究对象是自然分娩,其余的是剖宫产。婴儿的平均胎龄 为39.58+0.93周,平均出生体重为3.45+0.49 kg,平均出生身长为50.59+1.26 cm。 有72%的婴儿是纯母乳喂养,其余的则是混合喂养。研究对象的基本情况见表
4.1o

Table 4.1 Maternal and infant demographics
Characteristics Mean+SD/n(%)
Maternal age(year) 29.58 土 2.42
Preconception BMI(kg/m2) 20.68 + 2.85
Gestational weight gain(kg) 16.23 + 5.53
Gestational age (wk) 39.58 + 0.93
Birth weight(kg) 3.45 士 0.49
Birth length(cm) 50.59 + 1.26
Family income (yuan/month)
<5000 9 (18.00)
5000-10000 26 (52.00)
>10000 15 (30.00)
Mode of delivery
Vaginal 26 (52.00)
Cesarean 24 (48.00)
Feeding patterns
Breastfeeding 36 (72.00)
Mixed feeding 14 (28.00)

4.3.2 乳汁PUFA含量
表4.2中列出了本研究中检测的乳汁8种PUFA的平均含量,包括了 4种n-6 系列的PUFA和4种m3系列的PUFA。本研究乳母的乳汁中AA占总FA的 0.8616%, DHA 含量为 0.2952%o

Table 4.2 The PUFA profile of breast milk in this study
PUFA Percentage of total FA (%)
[Mean+SD / Median (P25, P75)]
C18:2n6 21.0886 + 4.7437
C18:3n6 0.3245 + 0.1008
C20:3n6 0.4726 + 0.1245
C20:4n6 0.8616 + 0.1996
C18:3n3 1.9504(1.4444, 2.7370)
C20:3n3 0.0999 ± 0.0320
C20:5n3 0.1097 (0.0787, 0.1499)
C22:6n3 0.2952 + 0.1114

通过检测的乳汁中n-3和n-6系列PUFA的含量,可获得母乳中的A-5和\6 去饱和酶活性及m3和n-6系列PUFA代谢通路的转化水平回,详见表4.3。本 研究中4-6去饱和酶活性的平均水平为0.0154, A-5去饱和酶活性的平均水平为 1.8482; n-3系列PUFA代谢通路的转化水平为0.0554, n-6 PUFA通路的转化水 平为 0.0418o
Table 4.3 Some index of PUFA with breast milk in this study
Index Calculation formula Mean+SD / Median (P25, P75)
D6D * C18:3n6/C18:2n6 0.0154 (0.0127, 0.0190)
D5D * C20:4n6 / C20:3n6 1.8482 + 0.5725
n-3 pathway C20:5n3/C18:3n3 0.0554 (0.0303, 0.0798)
n-6 pathway C20:4n6/C18:2n6 0.0418 (0.0354, 0.0481)
*D6D: A-6-desaturase activity; D5D: A-5-desaturase activity

4.3.3 FADS基因簇表达情况
4.3.3.1 RNA完整性检测
将从母乳中提取的RNA加样进行琼脂糖凝胶电泳实验,结果如图4.2所示。
图中可见到三条亮带,分别为28S, 18S和5S,表明从乳汁中提取的RNA较完

Figure 4.2 Agarose gel electrophoresis of total RNA from breast milk

43.3.2 RNA纯度检测
根据微孔板检测仪检测的核酸结果,本研究从乳汁中提取的RNA样本,其
OD260/OD280的值位于1.8-2.0之间,表明RNA的纯度较高,可进行后续实验。
43.3.3 实时定量PCR实验结果
内参基因GAPDH和目的基因FADS1、FADS2及FADS3的溶解曲线见图
4.3-4.6,均显示为单峰,表明了本研究中各基因的扩增产物具有特异性。
Protein concentration (mg/ml)
Figure 4.7 Standard curve of protein quantification
本研究western blot实验的结果见图4.8,图中展示了 7名乳母的目的基因和 内参基因蛋白表达情况。从研究对象的母乳提取的蛋白中目的基因FADS1、 FADS2、FADS3和内参基因GAPDH表达的蛋白条带清晰。

43.3.5 FADS基因簇表达情况
根据实时定量PCR实验和western blot实验的结果,研究对象的FADS1、
FADS2和FADS3基因在mRNA表达水平及相关蛋白的表达水平见表4.4。
Table 4.4 The relative levels of mRNA and protein with FADS genes expression
[Median (P25, P75)]
Gene mRNA Protein
FADS1 -0.1302 (-0.1319,-0.1255) 0.3499 (0.2139, 0.5502)
FADS2 -0.2619 (-0.3497,-0.1359) 0.4844 (0.3427,0.9516)
FADS3 -0.5039 (-0.8220, -0.0132) 0.4683 (0.3679, 0.6396)

4.3.4FADS基因的mRNA表达与母乳PUFA
4.3.4.1 FADS基因的mRNA表达水平分组
按照FADS1、FADS2和FADS3基因的mRNA表达水平中位数的值,将三
个目的基因的mRNA表达水平分为两组,见表4.5所示,三个目的基因的mRNA 表达水平在组间均具有差异性(PV0.001)。mRNA Q1组代表mRNA表达水平 较低组,mRNA Q2组代表mRNA表达水平较高组。
Table 4.5 Groups divided by the relative levels of mRNA
Gene mRNA QI mRNA Q2 P
FADS1 <-0.1302 >-0.1302 <0.001
FADS2 <-0.2619 >-0.2619 <0.001
FADS3 <-0.5039 >-0.5039 <0.001

43.4.2 FADS基因的mRNA表达分组与母乳PUFA
母乳中的亚油酸(C18:2n6)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因的mRNA 表达水平分组的情况详见图4.9o结果显示母乳亚油酸含量在FADS各基因的 mRNA表达水平分组中差异无统计学意义(P>0.05)。
tJ
10-

Figure 4.9 The C18:2n6 level of FADS mRNA Groups
QI: Low mRNA expression group, Q2: High mRNA expression group
母乳中的严亚麻酸(C18:3n6)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因mRNA 表达水平分组的情况详见图4.10o结果显示广亚麻酸含量在FADS1基因mRNA 表达水平分组中具有统计学意义(户二0.009),且FADS1基因mRNA表达水平 较高组的母乳严亚麻酸含量(0.3606%)高于FADS1基因mRNA表达水平较低 组(0.2869%);在FADS2和FADS3基因mRNA表达水平分组中,母乳中的严 亚麻酸含量无统计学差异(P>0.05) o

母乳中的二十碳三烯酸(C20:3n6)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因 mRNA表达水平分组的情况详见图4.11,结果显示二十碳三烯酸含量在FADS1 基因mRNA表达水平分组中具有统计学意义(P二0.042),且FADS1基因mRNA 表达水平较高组的母乳二十碳三烯酸含量(0.5088%)高于FADS1基因mRNA 表达水平较低组(0.4363%);在FADS2和FADS3基因mRNA表达水平分组中, 母乳中的二十碳三烯酸含量无统计学差异(P〉0.05) o

图4.12中显示了母乳中的AA (C20:4n6)含量在FADS1、FADS2禾口 FADS3 基因mRNA表达水平分组的情况,AA含量在各基因mRNA表达水平分组中无 统计学差异(P>0.05) o

Figure 4.12 The C20:4n6 level of FADS mRNA Groups
QI: Low mRNA expression group, Q2: High mRNA expression group
母乳中的a-亚麻酸(C18:3n3)含量在FADSKFADS2和FADS3基因mRNA 表达水平分组的情况详见图4.13,结果显示a-亚麻酸含量在各基因mRNA表达 水平分组中无统计学差异(P>0.05) o

0 1 I I I I I I
FADS1 FADS2 FADS3
Group
Figure 4.13 The C18:3n3 level of FADS mRNA Groups

母乳中的二十碳三烯酸(C20:3n3)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因 mRNA表达水平分组的情况详见图4.14,结果显示二十碳三烯酸含量在各基因 mRNA表达水平分组中无统计学差异(P>0.05)。

图4.15为母乳中的EPA (C20:5n3)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因
mRNA表达水平分组的情况,结果显示在各基因mRNA表达水平分组中,母乳
EPA的含量无统计学差异(P>0.05) o

Group
Figure 4.15 The C20:5n3 level of FADS mRNA Groups

图4.16为母乳中的DHA (C20:6n3)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因
mRNA表达水平分组的情况,结果显示在各基因mRNA表达水平分组中,母乳
DHA的含量无统计学差异(P>0.05)。

母乳中的A-5去饱和酶活性水平在FADSKFADS2和FADS3基因mRNA表 达水平分组的情况详见图4.17,结果显示A-5去饱和酶活性水平在各基因mRNA
表达水平分组中无统计学差异(P>0.05) o

母乳中的A-6去饱和酶活性水平在FADS1、FADS2和FADS3基因mRNA表
达水平分组的情况详见图4.18,结果显示A-6去饱和酶活性水平在各基因mRNA
表达水平分组中无统计学差异(P>0.05) o

Group
Figure 4.18 The D6 activity level of FADS mRNA Groups
QI: Low mRNA expression group, Q2: High mRNA expression group
图4.19为母乳中的n-3系列PUFA代谢通路水平在FADSKFADS2和FADS3 基因mRNA表达水平分组的情况,结果显示在各基因mRNA表达水平分组中, 母乳m3系列PUFA代谢通路水平无统计学差异(P〉0.05)。
0.15n
□ Q1
0.伯・
_L
0.0“
T
0.00-1—I—
Figure 4.19 The n-3 pathway level of FADS mRNA Groups
图4.20为母乳中的n-6系列PUFA代谢通路水平在FADSKFADS2和FADS3 基因mRNA表达水平分组的情况,结果显示在各基因mRNA表达水平分组中, 母乳n-6 PUFA代谢通路水平无统计学差异(戶>0.05)。
0.08 n

Group
Figure 4.20 The n-6 pathway level of FADS mRNA Groups
QI: Low mRNA expression group, Q2: High mRNA expression group
4.3.5 FADS基因的蛋白表达与母乳PUFA
4.3.5.1 FADS基因的蛋白表达水平分组
按照FADS1、FADS2和FADS3基因蛋白表达水平的中位数的值,将三个目 的基因的蛋白表达水平分为两组,见表4.6所示,三个目的基因的蛋白表达水平 在组间均具有差异性(PV0.001) o Protein Q1组代表蛋白表达水平较低组,Protein Q2组代表蛋白表达水平较高组。
Table 4.6 Groups divided by the relative levels of protein
Gene Protein QI Protein Q2 P
FADS1 <0.3499 >0.3499 <0.001
FADS2 <0.4844 >0.4844 <0.001
FADS3 <0.4683 >0.4683 <0.001

43.5.2 FADS蛋白表达分组与母乳PUFA
中无统计学差异(P〉0.05) o

母乳中的Y-亚麻酸(C18:3n6)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因蛋白 表达水平分组的情况详见图4.22,结果显示广亚麻酸含量在各基因蛋白表达水平 分组中无统计学差异(P>0.05)。

Figure 4.22 The C18:3n6 level of FADS protein Groups
QI: Low protein expression group, Q2: High protein expression group
表达水平分组中无统计学差异(P>0.05)。

图4.24为母乳中的AA (C20:4n6)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因 蛋白表达水平分组的情况,结果显示AA含量在各基因蛋白表达水平分组中无统 计学差异(户>0.05)-

无统计学差异(P>0.05) o
61

FADS1 FADS2 FADS3
Group
Figure 4.25 The C18:3n3 level of FADS protein Groups
QI: Low protein expression group, Q2: High protein expression group
母乳中的二十碳三烯酸(C20:3n3)含量在FADS1、FADS2和FADS3基因 蛋白表达水平分组的情况详见图4.26,结果显示二十碳三烯酸含量在FADS1基 因蛋白表达水平分组中差异具有统计学意义(民0.047),且FADS1基因蛋白表 达水平较高组的母乳二十碳三烯酸含量(0.1132%)高于FADS1基因蛋白表达水 平较低组(0.0888%);在FADS2和FADS3基因蛋白表达水平分组中,母乳中 的二十碳三烯酸含量无统计学差异(P>0.05) o

图4.27中显示了母乳中的EPA (C20:5n3)含量在FADS1、FADS2和FADS3 基因蛋白表达水平分组的情况,EPA含量在FADS3基因蛋白表达水平分组中差 异具有统计学意义(戸二0.040),且FADS3基因蛋白表达水平较高组的母乳EPA 含量(0.1366%)高于FADS3基因蛋白表达水平较低组(0.1012%);在FADS1 和FADS2基因蛋白表达水平分组中,母乳中的EPA含量无统计学差异(P>0.05)o

0.0 J_I 1 1 1 1 1—
FADS1 FADS2 FADS3
Group
Figure 4.27 The C20:5n3 level of FADS protein Groups
*Pv0.05, QI: Low protein expression group, Q2: High protein expression group
母乳中的DHA (C22:6n3)含量在FADS基因蛋白表达水平分组的情况详见 图4.28,结果显示DHA含量在FADS1基因蛋白表达水平分组中差异具有统计 学意义(户二0.020),且FADS1基因蛋白表达水平较高组的母乳DHA含量 (0.3228%)高于FADS1基因蛋白表达水平较低组(0.2526%);在FADS2和 FADS3基因蛋白表达水平分组中,母乳中的DHA含量无统计学差异(P>0.05)。

Figure 4.28 The C22:6n3 level of FADS protein Groups
*Pv0.05, QI: Low protein expression group, Q2: High protein expression group
图4.29为母乳中的A-5去饱和酶活性水平在FADS1、FADS2和FADS3基因 蛋白表达水平分组的情况,结果显示在各基因蛋白表达水平分组中,母乳的A-5
去饱和酶活性水平无统计学差异(P>0.05) o

母乳中的A-6去饱和酶活性水平在FADS1、FADS2和FADS3蛋白表达水平 分组的情况详见图4.30,结果显示A-6去饱和酶活性水平在各基因蛋白表达水平 分组中无统计学差异(P>0.05)。

Group
Figure 4.30 The D6D activity level of FADS protein Groups
QI: Low protein expression group, Q2: High protein expression group
图4.31为母乳中的n-3系列PUFA代谢通路水平在FADSKFADS2和FADS3 基因蛋白表达水平分组的情况,结果显示在各基因蛋白表达水平分组中,母乳 m3系列PUFA代谢通路水平无统计学差异(P>0.05)。
0.15-1
0.10-
0.05-
0.00-
Group
Figure 4.31 The n-3 pathway level of FADS protein Groups
QI: Low protein expression group, Q2: High protein expression group
母乳中的n-6系列PUFA代谢通路水平在FADS1、FADS2和FADS3蛋白表 达水平分组的情况详见图4.32,结果显示n-6系列PUFA代谢通路水平在各基因 蛋白表达水平分组中无统计学差异(Q0.05)。

0.00 J―I 1 1 1 1 1-
FADS1 FADS2 FADS3
Group
Figure 4.32 The n-6 pathway level of FADS protein Groups
QI: Low protein expression group, Q2: High protein expression group
本研究的母乳中8种PUFA与FADS基因簇mRNA表达水平和蛋白表达水 平方面的关系见图4.33o在FADS基因簇mRNA表达水平分组中,母乳n-6系列 PUFA中的2种表现出了差异性;而在FADS基因簇蛋白表达水平分组中,母乳n-3 系列PUFA中的3种表现岀了差异性。

4.4讨论
本研究纳入了 50名健康的产后42-45天哺乳期女性,检测了母乳中的PUFA 含量,并成功建立了从人的乳汁中提取RNA和蛋白的实验体系,利用分子生物 学技术对母乳中FADS基因表达情况进行检测,探索了母乳中的PUFA和FADS 基因mRNA表达水平和蛋白表达水平的关系。
研究对象的母乳DHA平均含量为0.2952%,低于全球的平均水平0.32%阴, 可能的原因为长春市为我国东北部内陆地区,哺乳期女性日常生活中食用较少的 鱼类;但本研究中母乳的DHA含量与来自北欧国家拉脱维亚的鱼类消费量较低 的乳母DHA水平0.30%相近【id。而本研究人群的母乳DHA含量也低于了一项 来自中国乳母的0.36%和韩国乳母的0.67%; EPA含量为0.1097%,也低于韩国 的0.15%叫96],可能由于本研究纳入的哺乳期女性为未服用PUFA补充剂的人群, PUFA补充剂可影响PUFA代谢通路上关键酶的作用,研究对象为未服用PUFA 补充剂的乳母可排除膳食补充对基因表达的影响,为更好的研究母乳PUFA与 FADS基因表达的关系奠定基础。本研究母乳中的AA占总FA的0.8616%,高 于韩国的0.48%,也高于世界平均水平的0.71%,可能的原因为AA主要来源于 前体物质LA的转化,而体内的LA主要来源于膳食摄入的植物油中,膳食LA 在体内可以竞争性地干扰n-3PUFA转化为DHA,乳母体内较高的膳食LA可降 低母乳中的DHA浓度,因此本研究母乳中的AA水平较高也可能与较低水平的 EPA和DHA有关〔I%】。
有研究指出FADS基因可与脂肪酸去饱和酶的活性相关IM,为了更好的研 究脂肪酸代谢与FADS基因表达的关系,我们还研究了与母乳中的PUFA密切相 关的4个指标:A-6和A-5去饱和酶活性以及n-3和n-6系列PUFA代谢通路的 转化水平。本研究中A-6去饱和酶活性的平均水平为0.0154, A-5去饱和酶活性 的平均水平为1.8482; n-3系列PUFA代谢通路的转化水平为0.0554, n-6通路 的水平为0.0418o关于母乳中去饱和酶活性和PUFA代谢通路的转化水平研究很 少,对血浆的去饱和酶活性的研究显示,在血浆中4-6去饱和酶活性的水平约为 0.0016, 4-5去饱和酶活性的水平约为4.39回;提示血浆中的4-6去饱和酶活性 的水平与母乳中近似,但A-5去饱和酶活性的水平高于母乳。血浆中m3系列 PUFA代谢通路的转化水平为0.842-1.001, n-6系列PUFA代谢通路的转化水平 为0.233-0.389,提示母乳中的PUFA代谢通路的转化水平可能低于血浆中的 PUFA代谢通路的转化水平mi。
在FADS基因簇mRNA表达水平与母乳PUFA的研究中,我们发现了 FADS1 基因的mRNA表达水平与2种n-6系列PUFA之间的关系:在FADS1基因的 mRNA表达水平较高组中,母乳的GLA和二十碳三烯酸(C20:3n6)水平较高。 LA为人体必需脂肪酸,是从食物中摄入体内;LA为转化为AA的底物,母乳中 的LA主要来源于食物,不同组中母乳LA含量无差异表明乳母的膳食摄入LA 水平较一致,结合本研究小组之前膳食调查的结果,乳母膳食LA的摄入量高于 推荐摄入量,因此膳食摄入的LA足够满足母乳中LA的水平要求。FADS1基因 mRNA表达水平较高组母乳的GLA含量较高,可能与本组的哺乳期女性较高的 FADS1基因转录调节有关。有研究表明了在孕期和哺乳期母体对PUFA的需求 增加时,由母体膳食摄入的脂肪酸可激活基因转录机制,PUFA及其代谢产物可 作用于细胞核水平,与转录因子一起调节FADS基因的mRNA表达时】。一项动 物实验证明,仔猪在吸吮孕期和哺乳期补充LA的母体分泌的乳汁后,体内的 mRNA水平高于母体在孕期和哺乳期补充棕槁酸的对照组仔猪[15先这项研究充 分表明了膳食n-6系列PUFA摄入与体内基因mRNA表达水平间的相关性。另 一项来自动物实验的研究表明,与喂食适当脂质饮食的大鼠相比,喂食低脂饮食 的大鼠的乳腺、肝脏和脂肪组织在妊娠和哺乳期有显著过量表达FADS1和 FADS2 mRNA"。]。这项研究的结果看似与我们的研究矛盾,但基于本文先前的 研究表明乳母摄入的LA水平较高,均超过了推荐摄入水平,因此我们推断当底 物LA的水平较高时,可充分与PUFA代谢通路中的关键酶相结合,促进底物 LA向下转化为GLA,最终产物为AA;在膳食摄入较多时,基因发挥的作用相 对较小,因此本研究母乳中的AA水平在不同FADS基因mRNA表达组未显示 有差异性。当有限的关键酶与底物结合后,酶的量不足可能会促进合成关键酶的 FADS基因mRNA表达水平的升高;因此本研究中的FADS1基因mRNA表达水 平较高组的GLA和二十碳三烯酸(C20:3n6)含量较高可能是膳食与基因相互作 用的结果。而当足够的底物AA产生后可能会出现负反馈调节作用,在AA的转 化通路中,FADS 1基因编码的A-5去饱和酶位于距离底物AA较近位置,而FADS2 基因编码的A-6去饱和酶位于距离底物AA较远位置,底物AA会抑制距离较近 的FADS1基因的表达。因此在本研究中,我们只发现了 FADS1基因mRNA表 达水平分组中2种n-6 PUFA中间产物的差异性,而未发现FADS2基因mRNA 表达水平分组中的差异性。在本次研究中,我们未发现n-3系列PUFA与FADS 基因mRNA表达水平之间的关系,我们推断n-3 PUFA可能与FADS基因簇的蛋 白表达水平相关。
在FADS基因簇蛋白表达水平与母乳PUFA的研究中,我们发现了 FADS1 基因和FADS3基因的蛋白表达水平分组与3种m3系列PUFA之间的关系:在 FADS1基因的蛋白表达水平较高组中,母乳的二十碳三烯酸(C20:3n3)和DHA 水平较高;在FADS3基因的蛋白表达水平较高组中,母乳的EPA水平较高。DHA 是n-3 PUFA代谢通路的终产物,一项人体研究表明,a-亚麻酸向其长链代谢物 的转化率几乎是亚油酸对AA的转化率的十倍,这项研究也可能有助于解释母乳 DHA在不同个体内的水平变异较大而AA水平变异程度较低【I%】。在DHA转化 上起关键作用的限速酶包括FADS1基因编码的A-5去饱和酶和FADS2基因编码 的A-6去饱和酶,因此本研究发现FADS1基因蛋白表达水平较高的直接结果为 A-5去饱和酶的水平较高,有助于a-亚麻酸向其长链代谢物的转化,而二十碳三 烯酸(C20:3n3)为a-亚麻酸向终产物DHA转化的中间产物,因此FADS1基因 蛋白表达水平较高是通过合成较多的A-5去饱和酶实现母乳中较高水平的二十碳 三烯酸(C20:3n3)和DHAo对于FADS3基因在脂肪酸代谢中发挥的作用尚存 在争议,在啮齿动物中鉴定出FADS3基因表达产物是一种可以显75脂肪酸去饱 和酶的经典结构,且是与A-5和A-6去饱和酶同种型的蛋白质,但尚未观察到酶 活性;由于FADS3基因与FADS1和FADS2基因之间的序列同源性,有学者提 出FADS3可能编码新的脂肪酸去饱和酶Im。在最近的一项对FADS3基因敲除 小鼠的研究中,研究者给基因敲除和野生鼠喂养缺乏高度不饱和脂肪酸的饲料 后,FADS3基因敲除小鼠脑内的DHA水平较低,肝脏中的FADS1和FADS2基 因mRNA水平显著下调,而ELOVL2和ELOVL5基因的表达水平上调;表明了 FADS3基因可增强肝脏介导的DHA的合成时]。本研究发现在FADS3基因的蛋 白水平表达较高组中,母乳的EPA水平较高,这与本文FADS基因簇和母乳脂 肪酸部分中确定的FADS3基因的rs 1000778位点影响母乳EPA水平一致,本研 究的结果为确定FADS3基因表达产物在促进人体PUFA代谢中发挥的作用提供 了新的证据。
本研究直接以人的乳汁为样本,探索了母乳PUFA与FADS基因簇的mRNA 表达水平和蛋白表达水平的关系,具有一定创新性,但也存在着不足之处:首先, 我们未研究收集的50例乳母的膳食本底PUFA水平,只针对于母乳PUFA和 FADS基因表达的关系研究,无法评估膳食摄入和FADS基因表达对母乳PUFA 的共同影响;但基于本文中420名乳母膳食摄入PUFA水平的研究,我们发现乳 母对于必需脂肪酸LA和ALA的摄入量均远超出了参考摄入量,而对于EPA和 DHA的摄入水平,远低于参考摄入量;且在不同FADS基因mRNA和蛋白表达 水平分组中,这两种必须脂肪酸含量均无差异,表明乳母的膳食摄入较一致,因 此未评估这50名乳母的膳食PUFA可能对本研究结果的影响不大。此外,由于 本次研究对象是收集到的50例产后42-45天的哺乳期女性,未能达到检测基因 变异的样本量,因此无法与本文中FADS基因变异与母乳PUFA部分发现的与母 乳PUFA相关的SNP结合起来。本研究将继续收集样本,达到一定数量的样本 量后,对前面部分发现的与母乳PUFA相关的SNP进行分型,完善不同SNP基 因型在FADS基因表达方面发挥的作用,为指导不同基因型个体的乳母科学哺育 婴儿提供依据。
4.5小结
本研究纳入了 50例产后42-45天的健康汉族乳母,探索了母乳中的PUFA 含量与FADS基因簇的mRNA表达水平和蛋白表达水平的关系,得到的结论如 下:
1.母乳n-6 PUFA中的GLA和二十碳三烯酸(C20:3n6)与FADS1基因的 mRNA表达水平有关。
2.母乳中n-3 PUFA中的二十碳三烯酸(C20:3n3)和DHA与FADS1基因 的蛋白表达水平有关,EPA与FADS3基因的蛋白表达水平有关。
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附 录
附录一产妇基本信息表
年 月曰
姓名 民族 年龄(婴儿母)
年龄(婴儿父) 身高 (cm) 电话
职业 □学生 □工人 □农民 □家务 □公务员事业单位
□企业 □商业、服务人员 □其他
胎次 □头胎 □二胎 □三胎 喂养方式1母乳2人工3混合喂养
产次 □一次 □两次及以上 奶粉量(牌子):
体重 孕前: (kg)现在: (kg) 孕期增重 (kg)
孕期(胎龄) 周 电子邮箱
文化程度 母亲:1.研究生及以上2.大学3.高中4.初中5.小学
父亲:1.研究生及以上2.大学3.高中4.初中5.小学
月家庭两人收入(元):1. 2000-5000 2. 5000-10000 3. 10000 以上
妊娠期是否吸烟 ]•是 2.否 妊娠期是否饮酒 1.是 2.否
分娩方式 1.自然生产2.剖腹生产 生产日期 年 月 日
妊娠期间是否有以下疾病:
1.有(□高血压 □糖尿病 □高血脂 □先兆子痫)2.无 哺乳期是否有乳腺炎
□是 □否
过敏食物:
婴儿出生体重 (kg) 出生身长 (cm)
胎儿性别 1.男 2.女 出生头围 (cm)
出生胸围 (cm) Apgar评分 分

附录二24小时膳食回顾调查表
姓名: 填表日期:—年—月—日
产后: 天
进餐时间 食物名称 食用量
早 餐
早点
午餐
午点
晚餐
晚点

姓名:
附录三 食物频率调查问卷
一.如果以下有您近一年吃过的食物,请在上面圈出来并估计食物的平均食用量和次数。
食物名称
1•大米饭、二米饭、小米、黑米、绿豆、红小豆
2.馒头、花卷、玉米面
3.面条
4.油条
5.玉米
6.薯类(山芋、红薯)
7.黄豆、青豆、蚕豆
8.豆浆粉、豆浆、豆奶
9.豆腐
10.豆制品(豆腐皮、油豆腐、豆腐干、腐竹)
11.鲜蘑菇
12.干木耳
13.香菇、银耳、海带菜
14.水果
苹果、香蕉、火龙果、桃、樱桃
橘子、橙子、柚子
西瓜、哈密瓜、香瓜
15.蔬菜类
豆角、茄子、苦瓜
油麦菜、油菜、白菜、生菜、韭菜、荷蒿、香菜 青椒、辣椒、黄瓜、豆芽
16.核桃
17.腰果、开心果
每次进食数量
克/两 克俩 克俩 根俩
穗/克俩 克俩 克俩 克/mL 克俩
克俩
克俩
克/两
克俩
克俩/个
克俩
个/克
克俩
进食辱数
每天每周每月
18.炒瓜子、花生、榛子
19.松子仁、栗子
克俩
克/两
20潴肉
克俩
21.猪蹄
个/克俩
22.猪肝、猪脑、猪肺、猪肚、猪腰
23.猪排骨
个/克俩
块/克俩

24.午餐肉、腊肉(培根)、肉松、火腿肠、香肠、腊肠 克/两
25.牛肉 克俩
26.牛蹄筋、牛肚、牛肺、牛肝、牛舌、牛心、牛百叶、牛腱子 克/两
27.羊肉 克俩
28.羊肚、羊肺、羊肝、羊舌、羊肉串 克/两
29.驴肉、马肉、狗肉、鹿肉 克/两
30.鸡肉、鸡腿、鸡翅、烤鸡 克/两
31.烤鸭、乳鸽、烧鹅、鹤鹑 克/两
32.鸡蛋(红皮鸡蛋、白皮鸡蛋、土家鸡蛋) 克/两/个
33.鸭蛋、松花蛋、鹅蛋、鹤鹑蛋 克/两/个
34.鲤鱼、草鱼、鲍鱼、带鱼、 克/两
35.大黄花鱼、鲫鱼、餉鱼、觥鱼、鱈鱼 克/两
36.鱼罐头(沙丁鱼、午餐鱼、鳍鱼) 克/两
37.虾类(龙虾、海虾、河虾、江虾、基围虾) 克/两/只
3&海参 克俩/只
39. 鲜贝、扇贝、其它 克/两/只
40.液体奶(全脂、低脂) niL/克
41. 奶粉(全脂、低脂) 克/两
42.酸奶(普通、低脂、中脂、果粒) mL/克
43.面包、沙琪玛 克/两
44. 饼干(普通、VC、钙奶) 克/两
45.薯片 片/克/两
46. 燕麦片、麦片、黑芝麻糊粉 克/两
47.方便面 袋/克/两
48. 豆瓣酱、腐乳、芝麻酱、花生酱、沙拉酱 勺/克/两
二、请回忆在过去一个月你们家烹调油的消费情况,您家通常在一起就餐人数 人。

油 猪
油 香
油 花生
油 核桃
油 色拉
油 菜籽
油 玉米
油 胡麻
油 葵花
籽油 玉米胚
芽油 橄榄
油 调和

全家人一个月食用油( )斤/升。

三、孕产期保健品记录
妊娠期营养补充剂摄入情况:
保健品具体名称:
服用大概时间:孕 周-孕 周(备注: )。
服用量:每次 片/粒/袋/支;每日 次。
哺乳期营养补充剂摄入情况:
1•是(保健品具体名称: )
服用量:每次 片/粒/袋/支;每日 次。
2.否[1]Tian HM, Wu YX, Lin YQ, Chen XY, Yu M, Lu T, Xie L. Dietary patterns affect maternal macronutrient intake levels and the fatty acid profile of breast milk in lactating Chinese mothers. Nutrition.2019 Feb;58: 83-88. (IF二3.734)
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大会暨全球华人营养科学家大会,2017-05-22,中国北京.
[7]陈雪妍,田慧敏,徐洋,王烟,曾立鑫,吴义霞,谢林。乳母膳食模式对乳 汁脂肪酸构成的影响,中国营养学会第十三届全国营养科学大会暨全球华人 营养科学家大会,2017-05-22,中国北京.
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致 谢
时光飞逝,转眼间己接近博士生涯的尾声。行文至此,内心感慨万千,今年 已是在长春的第十一个年头,回想起自己从高中毕业时的懵懂无知到步入象牙塔 的大门,再到今天一步步迈向科研的殿堂,永远忘不了我的最美好青春年华有幸 在美丽的北国春城度过并与吉大结缘的一切。
首先要感谢的是我的导师谢林教授,您亦师亦母,作为您的第一个博士,您 寄予我很大期望。永远忘不了每次与您一起探讨学术问题几个小时耽误回家吃饭 的场景,忘不了深夜时您传递的与课题相关的最新文献,忘不了学习和生活中遇 到困难时您的温柔安抚……您是我人生路上的指明灯,教会我潜心踏实科研,虚 心温和待人;您的言传身教将使我受益终生,我仍会继续努力不断成长。
其次要感谢的是我的硕士导师刘娅教授,您亦师亦父,是您引领我走上科研 之路并让我真切的体会到了什么是刀子嘴豆腐心,每次在您严厉的批评下我体味 到您的无私关爱,会成长很多。您的刚正不阿教会我不仅在科研路还有人生路上 都要一身正气,每次遇到困惑,您的睿智和坚定为我指明方向;我会永远铭记您 默默为学生做的一切。
感谢预防医学实验教学中心的刘国良老师,实验中遇到的一切问题您一直在 身边排忧解难,并为课题组提供了良好的实验环境;感谢甘振威老师提供的后勤 保障。感谢营养与食品卫生教研室的刘雅娟主任、刘华峰老师、方芳老师、崔巍 巍老师和徐坤老师,大家的关爱使我在温暖的大家庭中顺利科研和生活;感谢课 题组的邓娟及何纯川师姐,李响和丁珍同门,吴义霞、陈雪妍、王烟、逮通、徐 文慧、杨璐桐、孙雅琼师妹和于苗师弟,我会铭记你们每一张张可爱的笑脸。感 谢公共卫生学院的所有老师和同学们,是你们在实验和生活中提供了众多帮助, 一起度过了这一段美好的时光。
感谢我的家人,你们是我最坚强的精神后盾,使接近而立之年的我一直在学 校安心读书,逐步实现自己的梦想。最后要感谢的是自己,感谢自己的勇气和坚 持,一步步迈向新的人生台阶。
最后,祝所有人身体安康,天天快乐,一切顺利!