谷氨酸转运体4b-4c环关键氨基酸残基位点的鉴定及功能研究论文

2020年7月18日09:35:36谷氨酸转运体4b-4c环关键氨基酸残基位点的鉴定及功能研究论文已关闭评论

谷氨酸转运体4b-4c环关键氨基酸残基位点的鉴定及功能研究论文

摘要

谷氨酸是中枢神经系统中最重要的兴奋性氨基酸递质,因其不能在胞外代 谢,胞外溶液中多余的谷氨酸只能依靠谷氨酸转运体(兴奋性氨基酸转运体, excitatory amino acid transporters, EAATs)进行回收利用,否则突触间隙内过量 的谷氨酸会造成神经元的兴奋性毒性损伤。因此,谷氨酸转运体在预防神经兴 奋性毒性方面极为重要。

真核EAAT和原核谷氨酸转运体具有相似的蛋白结构,它们均由三个相同 的楔形亚基聚合而成,但与原核相比,EAAT的4b-4c环多了 50多个氨基酸残 基,提示EAAT的4b・4c环可能具有不一样的作用。虽然EAATlpst的晶体结构 已破解,但其4b・4c环的原有残基中,有26个被删除了且有18个被突变了,因 而无法反映4bMc环天然的结构信息。考虑到4b・4c环与EAATs的功能及亚细胞 定位密切相关,我们推测环上可能存在某些影响蛋白活性的关键氨基酸残基; 另外,由于4l>4c环在转运过程中还支持螺旋发卡环(helical hairpim HP) 1、 HP2及跨膜区段(transmembrane domain, TM) 7参与局部变构,我们推测4b-4c 环与TM8之间也可能存在密切的相互运动关系。因此,为验证以上推测,我们 进行了以下两部分研究。

第一章 丙氨酸扫描突变鉴定EAAT1 4b-4c环上的关键氨基駿残基

我们首先利用丙氨酸扫描突变的方法对EAAT1 4b-4c环上的所有残基进行 逐一筛查,发现突变体T192A、Y194A、N242A和G245A的转运活性显著降 低,还发现T192A和Y194A在膜蛋白表达水平下降了 80%左右,而在胞浆蛋白 水平明显升高。另外,保守突变的突变体T192S和Y194F的转运活性和膜蛋白 的表达水平都得到了明显恢复,它们的g值也与野生型相当;相比之下,N242 和G245被保守的氨基酸残基替代后,蛋白的转运活性并没有获得明显改善,说 明N242和G245氨基酸残基在底物转运过程中不可替代。这部分结果证明4b-4c 环上的T192、Y194、N242和G245是EAAT1转运底物所必需的氨基酸残基, 而T192和Y194对EAAT1的膜蛋白表达水平还具有决定性的影响。

第二章 EAAT1 4b-4c环与TM8在转运周期中的相对运动

为了探讨4b-4c环在转运周期中的空间位移与蛋白功能的关系,我们在 CL-EAAT1 (无半胱氨酸的EAAT1)的4b-4c环与TM8之间引入了成对的半胱 氨酸突变。结果发现氧化剂Cu(II)(l510-phenanthroline)3 (CuPh)可显著抑制突 变体V238C/I469C和A243C/I469C的转运活性,但对相应的单点突变体和其他 20多个双点突变体均无明显抑制。二硫苏糖醇对细胞的处理可部分逆转CuPh 对突变体V238C/I469C和A243C/I469C的抑制效应,证明CuPh对蛋白活性的 抑制确实源于突变体内二硫键的形成。另外,在培养基中添加谷氨酸、KC1和 DL-TBOA均可减弱CuPh对突变体V238C/I469C活性的抑制,但只有KC1能减 弱CuPh对突变体V243C/I469C活性的抑制,说明4b-4c环和TM8a在EAAT1 向内开放过程中会互相远离。这部分结果证明EAAT1的4b・4c环和TM8在转运 过程中会发生相互靠近,但在向内开放时相中相距较远。

总之,本研究发现EAAT1的4b-4c环上有四个关键的氨基酸残基可能通过 影响蛋白的表达、对底物的亲和力以及局部变构而显著影响EAAT1的摄取活性: 接着,我们又证明了 4b・4c环与TM8a在转运过程中能够相互靠近,从而揭示了 4b・4c环与转运核心区之间存在着涉及面更广的互动关系。

关键風丙氨酸扫描,EAATs,谷氨酸,4b4c,TM8

Identification and functional study of the
critical amino acid residues in the 4b-4c
loop of glutamate transporter

Name: Suifen He

Supervisor: Shaogang Qu

ABSTRACT

In the central nervous system, glutamate is the most important excitatory amino acid transmitter. Since no enzyme systems in extracellular fluid can metabolize glutamate, the extracellular glutamate can only be removed by glutamate transporter for intracellular recycling. Otherwise, excessive glutamate between synapses will result to excitotoxic damage of nerve cells. Therefore, glutamate transporters actually paly a very important role in the prevention of neuroexcitotoxicity.

Glutamate transporters of eukaryotes and prokaryotes are very similar in their structure, and both of them are comprised of three identical wedge-shaped subunits. However, the 4b-4c loop of eukaryotic glutamate transporter (EAAT) possesses more than 50 amino acid residues, which is much shorter in that of procaryotic glutamate transporter. It implys that the 4b・4c loop of EAATs probably undertake some special function. Recently, the crystal structure of EAATlCryst has been solved, however, 26 of the original residues of the 4b-4c loop were deleted and 18 were mutated, so that it can not reflect the structure information of the native loop. Considering that it has been proved that the 4b-4c loop is closely implicated with the function and subcellular localization of EAATs, we speculate that there may be some critical residues involved in the loop. During the transport cycle, since the 4b・4c loop also support helical hairpin (HP) 1, HP2 and transmembrane domain (TM) 7 to complete local conformational changes, we conjecture that there may be a certain relative motion between the 4b-4c loop and TM& Therefore, in order to verify our conjecture, we carried out the following two parts of the study.

Part L Alanine scanning mutagenesis identifing critical amino acid residues in EAAT1 4b-4c loop involved in substrate transport

To investigate the role of the 4b-4c loop, we performed alanine-scanning mutagenesis on and observed dramatically decreased transport activity in T192A, Y194A, N242A, and G245A mutants. The surface expression of T192A and Y194A mutants even decreased by more than 80%, and most of them were detained in the cytoplasm. However, when T192 and Y194 were substituted with conservative residues, the transport activities and the surface expression of T192S and Y194F were largely recovered, and tiieir Km values were comparable to the wild type EAAT1 as well. In contrast, N242 and G245 substituted with conservative amino acid could not rescue the uptake function, suggesting that N242 and G245 may play an irreplaceable role in the process of glutamate uptake. These results indicate that the 4b-4c loop of EAAT1 may not only affect glutamate uptake activity, but also influence the surface localization ofEAATl by T192 and Y194.

Part II. Investigating substrate-induced motion between 4b-4c loop and TM8 of EAAT1

To explore the spatial position and function of TM4 during the transport cycle, we introduced pairwise cysteine substitutions between the 4b-4c loop and TM8 in a cysteine-less version ofEAATl (CL-EAAT1). We observed pronounced inhibition of uptake activity by Cu(II)( 1,10-phenanthroline)3 (CuPh) for doubly substituted V238C/I469C and A243C/I469C mutants, but not for corresponding singly substituted CL-EAAT1 or for more than 20 other double-cysteine mutants. Dithiothreitol (DTT) treatment partially restored the uptake activity of the CuPh-treated V238C/I469C and A243C/I469C doubly substituted mutants, confirming that the efifects of CuPh on these mutants were due to the formation of intramolecular disulfide bonds. Glutamate, KC1, and D,L-threo-P-benzyloxy-aspartate

(DL-TBOA) weakened CuPh inhibition of tfie V238C/I469C mutant, but only KC1 weakened CuPh inhibition of the V243C/I469C mutant, suggesting that the 4b-4c loop and TM8 are separated from each other in the inward-facing conformations of EAAT1. Our results suggest that the 4b-4c loop and TM8 are positioned in close proximity during tiie transport cycle, but are less closely spaced in the inward-facing conformation.

In conclusion, this study found that there are four critical amino acid residues in the 4b-4c loop of EAAT1, which may significantly affect the uptake functio口 of EAAT1 by altering the surface expression of EAAT1, substrate affinity and local conformational change. This study also proved that the 4b-4c loop and TM8a of EAAT1 can approach each other during the transport process, so then we reveal a wider range of interaction between the 4b-4c loop and the transport core of EAAT.

KEYWORDS: Alanine scanning mutagenesis; EAATs; Transport activity; 4b-4c loop; TM8

前言

一・谷氨酸的生物学概述

谷氨酸是构成蛋白质的氨基酸原料,也是脑内最重要的兴奋性氨基酸神经 递质⑴,它几乎影响着哺乳动物神经系统所有的感知觉、运动及自主加工过程 [2-4]

在谷氨酸能神经体系中,谷氨酸递质首先由神经元的突触小泡负责募集, 然后再以胞吐的方式经突触前膜释放到突触间隙,最后扩散到突触后膜激活膜 上的谷氨酸受体。由于谷氨酸受体包括两大类,一类是离子型谷氨酸受体 (ionotropic glutamate receptors, iGluRs),负责介导兴奋性信号的传递⑸;另一 类是代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors, mGluRs),负责联合 第二信使系统介导细胞内的信号转导⑵,因而谷氨酸递质实际上可以引起两种不 同的生物学效应,也因此,胞外谷氨酸如果蓄积过多,多余的谷氨酸不仅会引 起神经元的兴奋性毒性效应⑷,还会造成细胞的代谢性毒性损伤⑵,所以胞外谷 氨酸的浓度必须受到严格的调控。

二、谷氨酸柚体的生物学功能磁

谷氨酸不能轻易透过血脑屏障⑹,细胞外液又缺乏谷氨酸的代谢酶体系,因 而脑内谷氨酸的合成⑺叨、代谢和转化[⑶只能在细胞内进行,但胞外谷氨酸的回 收利用则主要依靠谷氨酸转运体(Excitatory amino acid transporters, EAATs)的 跨膜转运。鉴于EAATs的正常运作不仅能限制胞外谷氨酸浓度在兴奋性毒性水 平以下,还可促进脑内谷氨酸的代谢和转化,所以EAATs成为了中枢神经系统 赖以维持谷氨酸稳态的重要调控元件【5】。

人们发现帕金森氏病(Parkinsorfs disease , PD )冋、阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease, AD) ll5\ 肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)网、发作性共济失调(EpisodicAtaxia, EA)〔⑺、癫痫【旳和精神分裂症【⑼* 等多种神经系统疾病都与EAATs的功能失常密切相关。UniProt数据库也收录了 人类EAATs突变导致严重神经系统疾病的若干信息,据报道,EAAT1的290位 点突变(P290R)可导致EA6[]8]; EAAT2的82、85或289位点突变(G82R, L85P, P289R)会导致癫痫性脑病㈤】;EAAT3的395位点缺失及445位点突变 (R445W)会导致二竣基氨基酸尿症(Dicarboxylic aminoaciduria, DCBXA) f2I]o 据此,EAATs结构和功能的异常很可能参与了多种神经系统疾病的发生、发展 过程,因而EAAT蛋白结构和功能的研究具有非常重要的医学意义。

三、EAATs的分类、分布

真核生物的EAATs是高亲和力的谷氨酸转运体,共有EAAT1(GLAST)W1、 EAAT2 (GLT-1)【叫 EAAT3 (EAAC1)【约、EAAT4 [25)和 EAAT5 凶 五种亚 型。在同一物种中,五种亚型的序列同源性约为50%〜60%【叫但不同物种相同 亚型的序列同源性却可高达90%[叭

从表达情况看,EAAT1和EAAT2遍布全脑且在大脑半球和脑干区呈大致平 行分布,而在星形胶质细胞上它们通常同时表达,只是在不同脑区两种亚型的 表达比例有所不同门刃。另外,由于星型胶质细胞的EAAT1和EAAT2对胞外多 余的谷氨酸具有强大的清除力,所以这两种亚型是防止神经细胞兴奋性毒性损 伤的主要力量I。⑶】。eaAB和EAAT4主要表达于神经元国31,其中,EAAT3 主要位于海马及皮质的椎体细胞膜,EAAT4主要位于小脑的浦肯野细胞膜,但 它们也可见于星形胶质细胞[32* 34~373o EAAT5则主要见于视网膜的光感细胞和双 极细胞【地3役后三种谷氨酸转运体在调控神经兴奋性及细胞生物学功能方面可 能发挥着更为微妙的作用。总的来说,各亚型EAAT都能改变胞外谷氨酸的浓 度水平及影响邻近谷氨酸受体的生物学效应,但各亚型的分布、表达量及不同 的占比也与它们在局部神经组织中所介导的特定生物学作用密切相关〔伦4»

四、谷氨酸转运体的拓扑结构

原核生物的谷氨酸转运体中,人们研究最多的是源自掘越氏热球菌的谷氨 酸转运体同源物 Gltph (glutamate transporter homologue of Pyrococcus horikoshii) o 基于Gltph的晶体结构(向外开放构象[阿、底物结合构象畑】和向内开放构象 451L人们可清晰地看到形如碗状的Gltph蛋白其实是由三个完全相同的楔形亚基 紧密组装而成,而且各亚基都有各自独立的底物转运通道。从拓扑结构角度来 看,Gltph单体由八个跨膜区段(transmembrane domain, TM)及两个方向相反 的螺旋发夹结构(helicalhairpin, HP)组成(见图1)。其中,TM7、TM8、HP1 和HP2属于Gltph的转运区域,是蛋白完成底物转运的核心部分。HP2为外侧闸 门,主要负责控制底物从胞外向底物结合带转移的转运通道部分;HP1为内侧 闸门,主要负责控制底物从底物结合带向胞内转移的转运通道部分。HP1、HP2 的顶端、TM7的NMDGT模序及TM8上的若干极性残基联合构成一个动态的极 性腔[42.44,46],腔内富集的、高度保守的极性残基不仅参与形成底物结合带,还 包含多个重要的离子结合位点,因而是直接结合和转运底物的核心区域。TM1-6 区段则构成蛋白的支架区,主要负责稳定蛋白结构及支持底物转运〔42]。另外, 三亚基的聚合会形成一个巨大的、面向胞外的中央腔,该腔可容纳大量溶液, 腔底深达脂质双层膜的中线水平且非常接近底物结合袋,这种结构不仅非常有 利于蛋白缩短跨膜转运底物的路程及降低转运底物所要克服的能障,还能高效 地防止底物从腔中逸出旳。

1. Gltph拓扑结构4T*意图.

Figure 1. Schematic representation of GItPh topology structure

Yemool D, Boudker O, Jin Y, et al. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii[J]. Nature. 2004, 431(7010): 811-818.

Glgh与EAATs的同源序列在总序列中只占25%-37%,但在转运核心区却可 高达67%陀],这些高度保守的同源序列被认为是同源蛋白分子作用机制相似的 重要结构基础。2017年,人源EAAT1 (EAATlciyst)的晶体结构被破解【翎,人 们可以清楚地看到真核和原核的谷氨酸转运体具有非常相似的分子结构。然而, 由于野生型EAAT1的晶体极难获得,EAATlciyst其实是一种人为突变后仍具有 较强转运活性的EAAT1突变体。EAATlcryst与野生型EAAT1的总序列有〜25% 的差异,C端核心区也相差10%左右,但是与原核谷氨酸转运体相比,EAATlcyt 的分子结构,尤其是蛋白的刚性结构域部分,显然能更贴切地还原野生型EAAT 的天然结构。EAATlcyt也呈现了一些EAAT蛋白区别于Gltph的结构特点,例如 EAAT蛋白的转运区范围更大,涉及HP1、HP2、TM3及TM6-8区段;支架区 则形似螺旋桨,由TM1、TM2、TM4和TM5构成〔他。此外,EAAT和Gltph的 TM4区段虽然都由三个高度分散的a螺旋及螺旋间的环状肽链构成,但野生型 EAAT的4b-4c环比Gltph足足多了 50多个氨基酸残基问,提示该环在真核谷氨 酸转运体中可能具有某些特殊的生物学作用。然而,由于EAATlcryst的4b・4c环 被删除或突变了大量氨基酸残基而无法呈现天然的4b-4c环构象,所以我们还需 要想其他办法对该环的结构和功能作进一步的研究和分析[4叫

五、EAAT蛋白的转运机制

EAATs本质上是一种双重作用的通道蛋白,因为它们除了转运底物(谷氨 酸或天冬氨),还转运多种离子,而且它们依靠特殊的转运机制,不仅能将胞外 的谷氨酸高效摄入胞内,还能在很大的浓度范围内持续执行对谷氨酸的转运⑸。 EAAT蛋白转运底物的驱动力主要源于细胞内外巨大的Na\ K*离子浓度梯度, 而这一电化学梯度主要由与之相耦合的N匸ATP酶(Na+・K+・ATPase)间接提 供删。研究证明,EAAT蛋白在由外而内的Na离子浓度梯度、由内而外的K离 子浓度梯度以及膜内所带负电荷的共同驱动下,每向胞内转运一个谷氨酸,会 同时向胞内转运3个Nf离子和1个IT离子[弘叫 然后再逆向转出1个K+离子

  • (详见图2)。由于每个转运周期总共可向胞内净转入两个正电荷,所以谷氨 酸的转运过程其实是一个生电的过程。谷氨酸转运体结合底物和Na+离子时还会 激活一股非耦合的氯离子流,该氯离子流的渗透方向指向细胞内,对蛋白的转 运活性也有影响,但其渗透路径与底物的转运路径并不相同〔旳。

近年来,越来越多的人们开始利用分子动力学模拟技术对谷氨酸转运体的 动态转运过程进行研究和分析。经模拟,人们发现谷氨酸转运体通过时间分辨 机制识别、结合和转运底物,具体而言,外闸门HP2开放后首先与Nfl结合, 随后,Nfl结合到结合袋更深处并使HP2稳定在开放状态,而当暴露的结合位 点捕获底物后,底物会被诱导契合并进入由HP1、HP2、TM7和TM8形成的极 性腔,而与此同时,结合袋再捕获Na+2,然后外闸门HP2关闭【5叫但也有人认 为事件的顺序应该是Nf3首先被结合,其次是Na+1、底物、Na+2的结合以及 HP2的关闭,而在转运周期的最后阶段,细胞内的离子需与转运体结合,才 能促使转运体恢复向外构象,从而为下一个转运周期做准备

2. EAATs的转运模式。

正常情况下,向外开放的、空载的谷氨酸转运体(1)与谷氨酸、H*和3个NA+结合(2), 变成满载状态(3),继而向胞内释放底物和离子(4),转为向内开放的的空载状态(5),

然后,K*再与向内开放的转运体结合(6),使转运体转变成负载K+的状态(7),最后,转 运体将K+释放到胞外(8),再恢复到向外开放的空载状态(1)。

Zhang Y, Tan F, Xu P, et al. Recent Advance in the Relationship between Excitatory Amino Acid Transporters and Parkinson's Disease[J]. Neural Plast. 2016, 2016: 8941327.

Figure 2. The transport mode of EAATs.

Normally, the outward facing empty protomer of EAAT (1) binds glutamate, and 3 Na+ (2) and turns into the fully loaded state (3). Followed by releasing substrates at the intracellular face (4), the carrier turns into the inward facing empty state (5). Afterwards, K+ binds to the inward facing transporter (6) and turns into the K+ loaded transporter state (7). Finally, the carrier releases K+ at the extracellular face (8) and recover the outward facing empty glutamate transporter state (1).

Zhang Y, Tan F, Xu P, et al. Recent Advance in the Relationship between Excitatory Amino Acid Transporters and Parkinson's Disease[J]. Neural Plast. 2016,2016: 8941327.

人们认为“交替接近机制',也可用于理解谷氨酸转运体的转运机制,即脂质双 层膜内底物结合位点的侧面为蛋白的内外闸门,而内外闸门的运动使底物得以 交替接近细胞内外的溶液〔°叫 从而表现为蛋白在向外开放时相、底物结合时相 以及向内开放时相之间的循环变构(图3)。在变构过程中,外侧闸门HP2首先 移向胞外并暴露底物的结合位点,然后在转运体与底物、离子结合后恢复闭合 态,接着,底物结合区(主要包括HP1、HP2、TM7及TM8的部分区段)向胞 浆侧移动,转运体逐渐过渡到向内开放构象,直至内侧闸门HP1向内开放并将 底物和离子释放至胞内〔任⑷,最后,K*与向内开放的转运体结合,进而促使转 运体变构为向外开放的初始态由于最后一步是整个转运周期的限速步骤, 因而对蛋白的周转速率具有决定性的影响。

3G%h不同时相结构示童图

G%h不同时相结构示意图:(A)向外开放构象(PDBID:2NWW) [42], (B)底物结合 构象(PDB ID: 1 XFH)㈣和(C)向内开放构象(PDBID:3KBC) [44]0

Figure 3 Structure diagram of Gltph in different phase.

Schematic diagrams of Gltph in the outward-facing (A) (PDB ID: 2NWW)叫】, substrate-binding (B) (PDB ID: 1XFH)[43] and inward-focing (C) (PDB ID: 3KBC)[44] structures.

为了解转运过程中谷氨酸转运体空间变构的更多细节,我们曾对EAAT蛋 白转运过程中不同区段的相对运动做过大量研究。我们发现由TM2、4、5区段 构成的相对固定的三聚体界面与EAATs的转运核心区之间存在非常复杂的相对 运动关系。具体而言,外侧闸门HP2在转运过程中会不断地向前、向后运动, 从而允许底物从胞外进入底物结合袋深处⑹];而在转运区向内运动过程中,HP2 会与TM5相互靠近,但我们发现HP2移向胞内的运动并不是简单的直线运动, 而是以旋转的方式偏离TM5上的1283残基佝;还发现EAAT1 HP2上的440位 点和TM7上的395位点在转运过程中也能够相互接近回】,而HP2与TM8的相 对位置则在不断改变〔佝。另外,EAAT1 HP1上的S366与TM2上的V96在向内 开放时相中距离较远,但在向外开放时相中则会相互接近【涸,由于TM2在转运 循环中位置相对固定,所以我们认为HP1在向内转运底物的过程中会向细胞内 滑动。有研究表明转运蛋白HP1向胞内开放并释放底物的过程需依赖HP2的移 动【呦,而HP1与HP2之间的这种紧密协作关系也从侧面印证了我们之前提出的 反向拓扑结构对转运体在向外开放构象和向内开放构象之间进行切换的重要意 义【闵。TM5和TM8之间也存在复杂的相对运动关系,它们在蛋白向外开放时相 互靠近,但在向内开放时相互远离;此外,TM8还全程参与转运通道的组成【殉, 而水相通透性实验证明TM5胞外区段的部分残基也可能参与形成蛋白的转运通 道⑹】。由于TM4区段是原核与真核谷氨酸转运体中结构差异最大的区段,所以 我们又把目光集中到了 TM4上。我们发现在EAAT1 TM4上的A243位点与HP1 或HP2之间构建半胱氨酸对,这些半胱氨酸残基在转运过程中会发生相互靠近 从而能够交联形成二硫键,但在蛋白的向内开放时相中,HP1的S366和HP2的 1453、T456又会远离TM4的A243,提示转运区向内运动会拉开HP1、HP2顶 端与TM4之间的距离[叫 另外,GLT-1 4b-4c环上的V241位点(相当于EAAT1 的A243位点)与TM2上的193、197残基在蛋白转为向内开放构象时会相互靠 近,但相对于转运体的其余部分,4b・4c环上的V241位点可能会移向转运核心 区内部或围绕TM2上的】93、197残基发生旋转性移位㈣;此外,不管在向内还 是向外开放时相,4b-4c环上的A243位点与EAAT1 TM7的p桥之间都非常靠 近[呵。虽然TM4与TM8之间的相对运动关系至今尚未见报道,但我们认为相 对于三聚体界面而言,EAATs的转运核心区(包活HP1、HP2、TM7及TM8) 很可能是以集体的方式向胞内运动,因而探明TM4和TM8的互动关系将有助 于我们发现更多谷氨酸转运体转运机制的重要线索。

六、谷氨酸转K4b4c环的研究进展

人类和褐家鼠EAAT1的4b・4c环均含57个氨基酸残基,相比之下,GltPh 的4b・4c环只有5个氨基酸残基(见图4 A, B),提示EAATs的4b・4c环可能是 EAAT蛋白为适应多细胞生物神经系统微环境而进化的一段环状多肽,事实上, 该结构也是多细胞生物谷氨酸转运体特有的一段插入序列。另外,EAATlcryst的 4b-4c环只有20%的序列与野生型EAAT1相同,因而EAATlcyt也无法呈现天然 4b・4c环的构象,尤其是最外层的Y200-V210区段(见图4C)。再从4b・4c环所 处的位置分析,GltPh的TM 4b-4c环与底物结合袋的位置相当靠近【他相比之下, EAATs的4b-4c环特别长,环上的大部分氨基酸残基可能暴露于胞外溶液并突出 于中央前庭,而在蛋白内则可能与相同亚基或相邻亚基的其他部分广泛接触

  • 而也有人认为EAAT蛋白的4b・4c环可能始于中央前庭的底部,然后再向 蛋白的外缘延伸,最后再折返于蛋白的中心【小。

4. 4b-4c环与底物结合区之间的空间关系。

Gltph (PDB ID: 1 XFH, GltPh)和 EAAT1 (PDB ID: 5LLM)底物结合点的相邻区域 分别位于图(A)和图(B),其中,被公认为底物结合区的HP1、HP2、TM7和TM8区段 分别以不同颜色突出显示,而4b-4c环则用红色突出显示。(C) EAAT1与Glgh的4b/c环 进行序列比对。图中所示氨基酸序列由上而下分别为人源EAAT1 (P43003)、褐家鼠来源的 EAAT1 (P24942)、已知晶体结构的人源耐热型EAATlcryst及原核生物Pyrococcus horikoshii 来源的Gltph (NP_143181)。本研究发现的EAAT1 (褐家鼠来源)4b・4c环上的四个关键氨 基酸残基用红色方框突出显示,并与其他类型谷氨酸转运体相应位点的氨基酸残基进行比 较。

Figure 4. Spatial relationship between the substrate binding pocket and the 4b-4c loop

The neighbor regions of the substrate binding sites in Gltph (PDB ID: 1XFH, Gltph) (A) and EAAT1 (PDB ID: 5LLM) (B). Protein regions in HP1, HP2, TM7, and TM8 considered to be the substrate-binding regions are highlighted in different color, while the 4b-4c loop is highlighted in red. (C) Multiple sequence alignments of the 4b-4c loop from EAAT1 and Gltph- Amino acid sequences are Homo sapiens EAAT1 (P43003), Rattus norvegicus EAAT1 (P24942), EAATlciystand Pyrococcus horikoshii Gltph (NP143181). Residues identified in the present investigation are boxed in red and compared with other proteins at the same sites.

EAATs4b-4c环的结构和功能方面,目前已知该环含有两个保守的、可被糖 基化修饰的N糖基化模序,抑制这两个模序的糖基化修饰对同源多聚体的形成 及蛋白的转运活性都有影响〔7驾事实上,EAAT1和EAAT2的糖基化异常会导致 精神分裂症的发生⑺】。而截除4b-4c环会改变EAAT1和EAAT2在星型胶质细 胞膜上的具体定位,虽然具体的定位机制尚不清楚,但这一实验结果可有力地 证明4b-4c环与EAAT蛋白的亚细胞定位密切相关网。另外,有人发现GLT-1 的4b・4c环也存在构象依赖的胰蛋白酶酶切位点,这意味着该环在转运过程中也 可能会发生某种变构活动卩%又有人通过荧光共振能量转移实验(FRET)发现 EAAT3的胞外区段(含4b・4c环)在蛋白转运过程中并未发生大规模的变构〔儿沟, 但再行电压钳荧光测量却发现EAAT3在结合谷氨酸和Nf时,4b-4c环上的荧光 信号确实发生了一定的变化,综合分析两种实验结果后,人们认为4b・4c环可能 仅经历非常小的构象改变以至于4b-4c环的变构信号不能被FRET所识别卩戈考 虑到FRET数据实际代表的是蛋白在转运过程中变构信号变化的均值,而相同时 间内谷氨酸转运体的转运时相又不可能完全一致,我们分析FRET技术可能无法 准确反映环上某些位点位移的实际情况。除此以外,4b-4c环与TM2画、 HP1/HP2[斶及TM7[70]之间存在密切的相对运动关系,这些结果也从多个视角提 示EAAT的4b-4c环很可能参与底物诱导的变构。

七、本研究的目的和意义

EAATs是中枢神经系统赖以维持谷氨酸稳态的关键调控元件,它们的正常 运作需要依靠分子内各区段严格秩序的势能变换、关键氨基酸残基间的相互作 用以及功能结构域的局部变构。近几十年来,人们借助生化实验、电生理实验、 免疫学实验、分子生物学实验、X射线晶体衍射实验及分子动力学模拟技术等对 谷氨酸转运体的结构及功能进行了大量的研究,研究的成果为揭示多种神经系 统疾病的致病机理奠定了非常重要的理论基础,也为疾病的预防和治疗提供了 重要的实验依据。鉴于谷氨酸转运体4b-4c环结构和功能的关系尚未完全阐明, EAAT各区段对蛋白的功能和活性又具有各自不同的贡献,所以我们认为研究 4b-4c环的结构信息及生物学作用对充分阐明EAAT的分子作用机制具有非常重 要的意义。

综上所述,真核生物EAAT的4b-4c环与原核生物谷氨酸转运体的结构差异 巨大,又与转运体的糖基化、多聚化、亚细胞定位及蛋白变构密切相关,因此, 在第一部分研究中,我们决定对EAAT1的4b-4c环采用丙氨酸扫描突变等方法 进行研究,旨在探查环上可能影响蛋白转运活性的关键氨基酸残基,继而分析 它们的潜在作用。另外,因为4b・4c环的首尾两端非常接近底物结合袋,又与转 运核心区中的HP1、HP2、TM7区段之间存在密切的互动,所以在第二部分研 究中,我们选择在4b・4c环和TM8区段引入半胱氨酸对,然后通过检测蛋白活 性,分析4b-4c环与TM8在不同时相、不同处理条件下的位置变化关系,进而 评估4b-4c环与整个转运核心区之间的相互运动关系,旨在进一步阐明4b・4c环 的潜在作用机制及生物学功能。

■轴文献

  • Fonnum F. Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain[JJ. J Neurochem. 1984, 42(1): 1-lk
  • Lexverenz J, Maher P. Chronic Glutamate Toxicity in Neurodegenerative Diseases-What is the Evidence?[J]. Front Neurosci. 2015, 9: 469.
  • Mcdonald J W, Johnston M V. Physiological and pathophysiological roles of excitatory amino acids during central nervous system development^]. Brain Res Brain Res Rev. 1990, 15(1): 41-70.
  • Zhou Y, Danbolt N C・ Glutamate as a neurotransmitter in the healthy brain[J]・ J Neural Transm (Vienna). 2014, 121(8): 799-817.
  • Danbolt N C. Glutamate uptake [J]・ Prog Neurobiol. 2001, 65(1): 1-105.
  • Sibson N R, Dhankhar A, Mason G F, et al. Stoichiometric coupling of brain glucose metabolism and glutamatergic neuronal activity[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 199& 95(1):316-321.
  • Dienel G A. Astrocytic energetics during excitatory neurotransmission: What are contributions of glutamate oxidation and glycolysis?[J]. Neurochem Int. 2013, 63(4): 244-258.
  • Mckenna M C. Glutamate pays its own way in astrocytes]J]. Front Endocrinol (Lausanne). 2013, 4: 191.
  • Schousboe A, Scafidi S} Bak L K, et al. Glutamate metabolism in the brain focusing on astrocytes[J]. Adv Neurobiol. 2014? 11: 13-30.
  • Sonnewald U. Glutamate synthesis has to be matched by its degradation - where do all the carbons go?[J]. J Neurochem. 2014, 131(4): 399-406.
  • Schousboe A, Bak L K, Waagepetersen H S. Astrocytic Control of Biosynthesis and Turnover of the Neurotransmitters Glutamate and GABA[J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2013,4: 102.
  • Zhu H, Wang N, Yao L, et al. Moderate UV Exposure Enhances Learning and Memory by Promoting a Novel Glutamate Biosynthetic Pathway in the Brain[J]. Cell. 2018,173(7): 1716-1727.
  • He S, Zhang X, Qu S. Glutamate? glutamate transporters, and circadian rhythm sleep disorders in neurodegenerative diseases[JJ. ACS Chem Neurosci. 2018.
  • Zhang Y, Tan F, Xu P, et al. Recent Advance in the Relationship between Excitatory Amino Acid Transporters and Parkinson's Disease[JJ. Neural Plast. 2016, 2016:8941327.
  • Masliah E, Alford M, Deteresa R, et al. Deficient glutamate transport is associated with neurodegeneration in Alzheimer's disease [J], Ann Neurol. 1996, 40(5): 759-766.
  • Lin C L, Bristol L A, Jin L, et al. Aberrant RNA processing in a neurodegenerative disease: the cause for absent EAAT2, a glutamate transporter, in amyotrophic lateral sclerosis[J]. Neuron. 1998, 20(3): 589-602.
  • Winter N, Kovermann P, Fahlke C・ A point mutation associated with episodic ataxia 6 increases glutamate transporter anion currents[J]. Brain. 2012, 135(Pt 11): 3416-3425.
  • Jen J C, Wan J, Palos T P, et al. Mutation in the glutamate transporter EAAT1 causes episodic ataxia, hemiplegia, and seizures[J]. Neurology. 2005, 65(4): 529-534.
  • Bauer D, Haroutunian V, Meador-Woodruff J H, et al. Abnormal glycosylition of EAAT1 and EAAT2 in prefrontal cortex of elderly patients with schizophrenia]J]. Schizophr Res. 2010, 117(1): 92-98.
  • De Novo Mutations in SLC1A2 and CACNA1A Are Important Causes of Epileptic Encephalopathies [J]. Am J Hum Genet. 2016, 99(2): 287-298.
  • Bailey C G, Ryan R M, Thoeng A D, et al. Loss-of-function mutations in the glutamate transporter SLC1A1 cause human dicarboxylic aminoaciduria[J]. J Clin Invest. 2011, 121(1): 446-453.
  • Storck T, Schulte S, Hofinann K, et al” Structure, expression, and functional analysis of a Na(+)-dependent glutamate/aspartate transporter from rat brain [J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1992, 89(22): 10955-10959.
  • Pines Danbolt N C, Bjoras M, et al. Cloning and expression of a rat brain L-glutamate transporter[JJ. Nature. 1992, 360(6403): 464-467.
  • Kanai Y, Hediger M A. Primary structure and functional characterization of a high-affinity glutamate transporter[J], Nature. 1992, 360(6403): 467-471.
  • Fairman W A, Vandenberg R J, Arriza J L, et al. An excitatory amino-acid transporter with properties of a ligand-gated chloride channel [J]. Nature. 1995, 375(6532): 599-603.
  • Arriza J L, Eliasof S, Kavanaugh M P, et al. Excitatory amino acid transporter 5, a retinal glutamate transporter coupled to a chloride conductance]J]. Proc Natl Acad Sci USA. 1997, 94(8): 4155-4160.
  • Slotboom D J, Konings W N, Lolkema J S. Structural features of the glutamate transporter family [J]. Microbiol Mol Biol Rev. 1999, 63(2): 293-307.
  • Levenson J, Sherry D M, Dryer L, et al. Localization of glutamate and glutamate transporters in the sensory neurons of AplysiafJ]. J Comp Neurol. 2000, 423(1): 121-131.
  • Lehre K P, Levy L M, Ottersen O P, et al. Differential expression of two glial glutamate transporters in the rat brain: quantitative and immunocytochemical observations[J]. J Neurosci. 1995, 15(3 Pt 1): 1835-1853.
  • Domereq M, Etxebarria E, Perez-Samartin A, et al. Excitotoxic oligodendrocyte death and axonal damage induced by glutamate transporter inhibition[JJ. Glia. 2005, 52(1): 36-46.
  • Rothstein J D, Martin L, Levey A I, et al. Localization of neuronal and glial glutamate transporters [J]. Neuron. 1994, 13(3): 713-725.
  • Furuta A, Martin L J, Lin C L, et al. Cellular and synaptic localization of the neuronal glutamate transporters excitatory amino acid transporter 3 and 4[J]. Neuroscience. 1997,81(4): 1031-1042.
  • Aoyama K, Suh S W, Hamby A M, et al. Neuronal glutathione deficiency and age-dependent neurodegeneration in the EAAC1 deficient mouse [J]. Nat Neurosci. 2006, 9(1): 119-126.
  • Nieoullon A, Canolle B, Masmejean F, et al. The neuronal excitatory amino acid transporter EAAC1/EAAT3: does it represent a m可or actor at the brain excitatory synapse?[J]. J Neurochem. 2006,98(4): 1007-101 &
  • Dehnes Y, Chaudhry F A, Ullensvang K, et al. The glutamate transporter EAAT4 in rat cerebellar Purkirye cells: a glutamate-gated chloride channel concentrated near the synapse in parts of the dendritic membrane facing astroglia[J]. J Neurosci. 1998,18(10): 3606-3619.
  • Massie A, Vandesande F, Arckens L. Expression of the high-affinity glutamate transporter EAAT4 in mammalian cerebral cortex[J]. Neuroreport. 2001, 12(2): 393-397.
  • Massie A, Cnops L? Smolders I, et al. High-aflfinity Na+/K+-dependent glutamate transporter EAAT4 is expressed throughout the rat fore- and midbrainfJ]. J Comp Neurol. 200& 511(2): 155-172.
  • Pow D V, Barnett N L. Developmental expression of excitatory amino acid transporter 5: a photoreceptor and bipolar cell glutamate transporter in rat retina[J]. Neurosci Lett. 2000,280(1): 21-24・
  • Wersinger E, Schwab Y, Sahel J A, et al. The glutamate transporter EAAT5 works as a presynaptic receptor in mouse rod bipolar cells[J]. J Physiol. 2006, 577(Pt 1): 221*234.
  • Sonders M S, Amara S G. Channels in transporters[J]. Curr Opin Neurobiol.

1996, 6(3):294-302.

  • Seal R P, Amara S G Excitatory amino acid transporters: a family in flux[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1999, 39: 431-456・
  • Yemool D, Boudker O, Jin Y, et al. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii[J]. Nature. 2004,431(7010): 811-81 &
  • Boudker O, Ryan R M, Yemool D, et al. Coupling substrate and ion binding to extracellular gate of a sodium-dependent aspartate transporter]J]. Nature. 2007, 445(7126):387-393.
  • Reyes N, Ginter C, Boudker O. Transport mechanism of a bacterial homologue of glutamate transporters]}]. Nature. 2009, 462(7275): 880-885.
  • Verdon G, Boudker O. Crystal structure of an asymmetric trimer of a bacterial glutamate transporter homolog[J]. Nat Struct Mol Biol. 2012, 19(3): 355-357.
  • Qu S, Kanner B I. Substrates and non-transportable analogues induce structural rearrangements at the extracellular entrance of the glial glutamate transporter GLT-1/EAAT2[J]・ J Biol Chem. 200& 283(39): 26391-26400.
  • Leary G P, Holley D C, Stone E F, et al. The central cavity in trimeric glutamate transporters restricts ligand diffusion] J]. Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108(36): 14980-14985.
  • Canul-Tec J C, Assal R, Cirri E, et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1[J]. Nature. 2017, 544(7651): 446-451 ・
  • Rose E M, Koo J C, Antflick J E, et al. Glutamate transporter coupling to Na,K-ATPase[J]. J Neurosci. 2009, 29(25): 8143-8155.
  • Kanai Y, Nussberger S, Romero M F, et al. Electrogenic properties of the epithelial and neuronal high affinity glutamate transporter[J]・ J Biol Chem. 1995, 270(28): 16561-16568・
  • Zerangue N, Kavanaugh M P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter[J]. Nature. 1996, 383(6601): 634-637.
  • Barbour B, Brew H, Attwell D. Electrogenic glutamate uptake in glial cells is activated by intracellular potassium[JJ. Nature. 198& 335(6189): 433-435.
  • Levy L M, Warr O, Attwell D. Stoichiometry of the glial glutamate transporter GLT-1 expressed inducibly in a Chinese hamster ovary cell line selected for low endogenous Na+-dependent glutamate uptake [J]. J Neurosci. 1998, 18(23): 9620-962&
  • Owe S G, Marcaggi P, Attwell D. The ionic stoichiometry of the GLAST glutamate transporter in salamander retinal gliafj], J Physiol. 2006, 577(Pt 2): 591-599.
  • Cheng M H, Torres-Salazar D, Gonzalez-Suarez A D, et al. Substrate transport and anion permeation proceed through distinct pathways in glutamate transporters[J]. Elife. 2017, 6.
  • Shrivastava I H, Jiang J, Amara S G. et al. Time-resolved mechanism of extracellular gate opening and substrate binding in a glutamate transporter[JJ. J Biol Chem. 2008,283(42): 28680-28690.
  • Zhang W, Zhang X, Qu S. Cysteine Scanning Mutagenesis of TM4b-4c Loop of Glutamate Transporter EAAT1 Reveals Three Confbrmationally Sensitive Residues[J]. Mol Pharmacol. 2018, 94(1): 713-721.
  • Zhang Y, Zhang X, Qu S. Cysteine mutagenesis reveals alternate proximity between transmembrane domain 2 and hairpin loop 1 of the glutamate transporter EAAT1[J]. Amino Acids. 2014,46(7): 1697-1705.
  • Bergles D E, Tzingounis A V,Jahr C E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters[J]. J Neurosci. 2002, 22(23): 1015340162.
  • Kanner B I? Bendahan A. Binding order of substrates to the sodium and potassium ion coupled L-glutamic acid Uansporter from rat brainfj]. Biochemistry. 1982, 21(24): 6327-6330.
  • Qu S, Kanner B I. Substrates and non-transportable analogues induce structural rearrangements at the extracellular entrance of the glial glutamate transporter GLT-1/EAAT2[J], J Biol Chem. 2008, 283(39): 26391-26400.
  • Rong X, Zhang X, Qu S. A complex relative motion between hairpin loop 2 and transmembrane domain 5 in the glutamate transporter GLT-1 [J]. Int J Biochem Cell Biol. 2015,60: 1-7.
  • Leighton B H, Seal R P, Watts S D, et al. Structural rearrangements at the translocation pore of the human glutamate transporter, EAAT1[J]. J Biol Chem. 2006, 281(40): 29788-29796.
  • Zomot E, Bahar I・ Intracellular gating in an inward-facing state of aspartate transporter Glt(Ph) is regulated by the movements of the helical hairpin HP2[J]. J Biol Chem. 2013,288(12): 8231-8237.
  • Crisman T J, Qu S, Kanner B I, et al. Inward-facing conformation of glutamate transporters as revealed by their inverted-topology structural repeats [J]. Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106(49): 20752-20757.
  • Zhang X, Qu S. Proximity of transmembrane segments 5 and 8 of the glutamate transporter GLT-1 inferred from paired cysteine mutagenesis[J]. PLoS One. 2011, 6(6): e21288.
  • Zhang X, Qu S. The accessibility in the external part of the TM5 of the glutamate transporter EAAT1 is conformationally sensitive during the transport cycle[J]. PLoS One. 2012, 7(1): e30961.
  • Rong X, Zomot E, Zhang X, et al・ Investigating substrate-induced motion between the scaffold and transport domains in the glutamate transporter EAAT1[J]. Mol Pharmacol. 2014, 86(6): 657-664.
  • Rong X, Tan F, Wu X, et al. TM4 of the glutamate transporter GLT-1 experiences substrate-induced motion during the transport cycle [J]・ Sci Rep. 2016, 6: 34522.
  • Zhang W, Zhang X, Qu S. Substrate-Induced Motion between TM4 and TM7 of the Glutamate Transporter EAAT1 Revealed by Paired Cysteine Mutagenesis[J]. Mol Pharmacol. 2019, 95(1): 33-42.
  • Koch H P, Hubbard J M, Larsson H P. Voltage-independent sodium-binding events reported by the 4B-4C loop in the human glutamate transporter excitatory amino acid transporter 3[J], J Biol Chem. 2007, 282(34): 24547-24553.
  • Conradt M, Storck T, Stoffel W. Localization of N-glycosylation sites and functional role of the carbohydrate units of GLAST-1, a cloned rat brain L-glutamate/L-aspartate transporter[J]. Eur J Biochem. 1995,229(3): 682-687.
  • Bauer D, HaroutuniM V, Meador-WoodrufF J H, et al. Abnormal glycosylation of EAAT1 and EAAT2 in prefrontal cortex of elderly patients with schizophrenia[J]t 2010, 117(1): 92-98.
  • Hayashi M K, Yasui M. The transmembrane transporter domain of glutamate transporters is a process tip localizer [J]. Sci Rep. 2015, 5: 9032.
  • Grunewald M, Kanner B. Conformational changes monitored on the glutamate transporter GLT-1 indicate the existence of two neurotransmitter-bound states[J]・ J Biol Chem. 1995,270(28): 17017-17024.
  • Koch H P, Larsson H P・ Small-scale moJecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters[J]. J Neurosci. 2005, 25(7): 1730-1736.

 

第一章 丙氨酸扫描突变鉴定EAAT1 4b-4c环上的关键氨
基酸残基

1.1引言

丙氨酸扫描突变是指在蛋白质的目标序列中逐一引入丙氨酸,继而观察不 同位点的丙氨酸突变对蛋白质功能的影响,从而鉴定出关键活性位点的方法。 丙氨酸残基侧链是体积小且无其他官能团的甲基,对蛋白质结构影响较小,因 而将某些关键氨基酸残基替换成丙氨酸,可去除其侧链上的活性基团,从而导 致蛋白质功能的减弱甚至丧失。由于EAAT蛋白4b・4c环的具体构象及生物学功 能迄今尚未阐明,因此,在这部分研究中,我们选择采用丙氨酸扫描突变等方 法对EAAT1的4b-4c环进行探查和分析,旨在探明EAAT1的4b-4c环是否存在 影响底物转运的关键氨基酸残基。

1.2材料和方法

121主要材料

  • 细胞:人宫颈癌细胞株(HeLa细胞),购自美国ATCC公司。
  • 细菌菌株:TOP 10 (Escherichia coli^突变实验所用的大肠杆菌菌株),由 本实验室保存。
  • 质粒:突变所用质粒 EAAT1 及 CL-EAATl (Rattus norvegicus, GenBank: X 1),由本实验室保存。
  • 生工生物工程(上海)股份有限公司协助完成突变引物的合成及突变质粒 的测序任务。
  • 使用试剂和生产公司:

双蒸水定容至500 mb

  • 10%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)

取10 g SDS溶于100 ml双蒸水,溶解后室温保存。

  • lMTris-HCl (pH 6.8)

称取12.11 g Tris-Base于烧杯中,随后加入80 ml双蒸水,加入搅拌转子, 低速旋转至溶解。用pH计测量Tris・Base溶液的pH值,缓慢滴加浓盐酸,直至 溶液pH值调至6.8。将烧杯中的液体转移到量筒,最后用双蒸水定容至100 mb

  • 5MTris-HCl (pH 8.8)

称取18.16 g Tris-Base于烧杯中,随后加入80 ml双蒸水,加入搅拌转子, 低速旋转至溶解。用pH计监测Tris-Base溶液的pH值,缓慢滴加浓盐酸,直至 溶液pH值调至&8。将烧杯中的液体转移到量筒,最后用双蒸水定容至100 ml。

8)  lOmMTris-HCl (pH 9.0)

称取1.21 lg Tris-base于烧柢屮,随后加入800 ml双蒸水,加入搅拌转子, 低速旋转至溶解©用pH计测量Tris・base溶液的pH值,缓慢滴加浓盐酸,直至 溶液pH值调至9.0。将烧杯中的液体转移到量筒,最后用双蒸水定容至1000 mlo

9)  含 36%蔗糖的 10 mM Tris-HCl

称取1.211 g Tris-base于烧杯中,随后加入800 ml双蒸水,加入搅拌转子, 低速旋转至溶解。用pH计测量Tris・base溶液的pH值,缓慢滴加浓盐酸,直至 溶液pH值调至9.0o将烧杯中的液体转移到量筒,最后用双蒸水定容至1000 ml, 高压保存备用。取上述溶液60 ml,加入36 g蔗糖,放置转子,旋转混合溶解。 转移至容量瓶,双蒸水定容至100 ml, 0.22 pM滤膜过滤后密封备用,注意无菌 操作。

10) 不同浓度未标记底物L-Glutamic acid溶液的配制

先配 25 mM Tris-HCl 溶液(pH 7.5) 500 mL (Tris-base 1.52 g 加双蒸水 300 ml,再用HC1调溶液pH至7.5,加双蒸水定容至500 mL,充分混匀);接着配 10mM 的 L-Glutamic acid 溶液 10 mL (称取 L-Glutamic acid 14.7 mg,加1 25 mM 的 Tris-HCl 溶液 10 mL,充分混匀。再配 1 mM L-Glutamic acid 100 ml (即取 10 mM 的 L・Glutamic acid 10 ml,再加 NaCl Solution 90 mb 充分混匀)。

再配 八个终浓度的L-Glutamic acid溶液(各10 ml),如下表:

125实验方法

一、TOP 10大肠杆菌感受态细胞制备(氯化钙法)

取菌种TOP10划平板,置于37匕细菌培养箱中培养16〜18h©挑取单克隆 菌落,接种于3 ml LB液体培养基,37°C, 225 rpm,震荡培养16〜18 h。取1 ml *e

菌液接种于100 ml LB液体培养基,37°C, 225 rpm,震荡培养至OD 590在0.5-0.6 之间,培养时间约需3 h。将菌液移入50 ml离心管,冰浴放置20 min,目的在 于使菌液冷却,减少细菌的代谢。4°C, 4500rpni,离心10mino弃上清,每个 50 ml离心管各加入25 ml预冷的85 mM CaCl2溶液,用枪吹打重悬。再将菌液 移入预冷的新50 ml离心管,冰浴30 min。4°C, 4500 rpm,离心10 min。弃上 清,加入10 ml预冷的85 mM CaCl2溶液,用枪吹打重悬。最后在冰上分装后(200 四管),-80°C冰箱保存。

二、定点突变实验

(1)定点突变引物的设计

引物的设计长度约为25 ~45 bp,以突变位点为中心,在突变位点的两端分 别加11-12 bp的碱基,最好以碱基G或C为结尾。计算引物的Tm值,所得Tm 值最好大于78°C (常规增加GC含量,GC总数最好大于40%引物总的碱基数)。 如果Tm值不足78°C,则适当改变引物的长度或GC的含量,使其Tm值能达到 78°C (GC含量也应大于40%)0 一般将突变点设在引物的中央位置,如果不能 满足Tm值和GC含量,也可以适当调整突变位点的位置。最好使用经过PAGE 纯化或者更高纯度的的引物。Tm值公式:Tm = 0.41 x (%ofGC) -675/L + 81.5

CL:引物的碱基数;%ofGC:引物的GC百分比九

定点突变PCR体系:

试剂                             体积(pl)

蕊永                             31

25 mM MgSO4                                           2

2mMdNTPs (-20°C 保存)           5

10 x KOD-plus Buflfer                              5

KOD-plus DNA Polymerase( -20 °C 保存)1

模板(含WWEAAT1基因的质粒)      2

正向突变引物(125ng/gl)                             .

  • PCR产物纯化

55山的PCR产物移至灭菌的1.5 ml离心管中,按顺序加入5卩1的3 M醋 酸钠(PH5.2)和150卩1的冰冻无水乙醇(・2(TC)。静置・20°C冰箱过夜沉淀后, 13200 rpm离心30 min。小心的移去上清(勿触碰管底沉淀);加入1 ml 70%的 乙醇清洗沉淀,7500 rpm,离心15 min,两次,弃上清液;将离心管静置于超净 台10 min,待多余乙醇充分挥发;最后用10闪无菌水重悬沉淀,・2(TC存放, 备用。

  • 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物

配胶(琼脂糖凝胶):0.25gagorase (琼脂糖)溶于25 ml 1 x TAE溶液;微 波炉中高火2 min,煮沸;取出冷却至室温40°C左右加入1.25 ml核酸染色剂(Gold viewl型);倒胶,插入梳子,待凝胶凝固后拔梳;取1山的DNA产物加入2卩1 的上样缓冲液(1 x Gel loading Dye),混匀后加样至琼脂糖凝胶的梳孔中,最后 一孔加入5卩1 Marker (DS10000);设电流100 V,电泳30 min;电泳结束后凝 胶置于凝胶成像分析仪成像,目标条带位于5000〜6000 bp之间e

  • 转化

恒温水浴的温度调至42°C:冰箱取出一管100小感受态细胞(TOP10), 冰浴15 min待溶解;2 ml EP管中分别加入5皿PCR产物和50 ^1感受态细胞, 混匀后,冰上静置30 min;接着将EP管放到42°C水浴锅中,水浴热击45秒, 取出后迅速放回冰上,静置2 min;移至超净工作台,将2 ml EP管中的感受态 细胞全部移入,再加500 MSOC培养基,混匀,37C震荡lh;在超净工作台中, 取上述转化混合液200 jih涂布到含氨节西林钠的固体LB平板培养皿中,于37°C 烤箱倒置孵育16-18 h,观察是否有菌落产生;分别挑取3个单克隆到含氨节青 霉素的液体LB培养基中,37°C摇床,225 rpm培养16〜18 h;最后取800 ml菌 液送测序,通过与野生型EAAT1的DNA序列比对,确定突变体点突变成功。

(6) 菌液培养与保存:

对于成功突变的菌种,取850小的菌液,加入150 甘油,充分混匀后保 存于were冰箱。

(7) 质粒的提取:

在50 ml离心管里加入8 ml含氨节青霉素液体LB和20 pl菌液,37°C摇床, 250 rpm培养16〜18 ho取出50 ml离心管菌液,4500 rpm,离心20 min。按天 根高纯度质粒小提中量试剂盒(离心柱型)的操作说明书操作。具体如下:

1)  将RNaeA全部加入溶液Pl,混匀,置2-8°C保存;

2)  使用前先检查平衡液BL,溶液P2和P3是否出现浑浊;如有浑浊现象,3TC 水浴中加热几分钟即可。

3)  实验前使用平衡液BL处理吸附柱,可以最大限度激活硅基质膜,提高得率, 用BL处理过的柱子当天使用。

4)  使用前先在漂洗液PW中加入无水乙醇,加入体积依照瓶上标签;

5)  各溶液使用后及时盖紧,以防失效。

6)  加入500卩1溶液Pl RNase A),吹打重悬,移入2mlEP管。

7)  加入500以溶液P2,上下翻转6〜8次,使充分混匀。

8)  加入700田溶液P3,温和地上下翻转6〜8次,充分混匀,此时白色沉淀产

生。

9)  13000 rpm离心20 min,收集上清分次加入过滤柱中(800 0/次)。

10) 向吸附柱中加入500 pl平衡液BL,润洗吸附举,4°C, 13000 rpm, 1 min, 弃去废液。

11) 将上述过滤后的滤液加入到已润洗的吸附柱中(800

12) 4°C, 13000 rpm, 1 min,弃掉滤液,此时DNA吸附于吸附柱上。

13) 加入500 “I去蛋白液PD, 13000 rpm离心1 mill后弃滤液。

14) 加入600卩1漂洗液PW,静置3 min, 13000 rpm离心1 min后弃滤液。

15) 重复步骤14o

16) 14°C, 13000 rpm, 2 min,彻底甩干吸附柱。

17) 将吸附柱置于超净王作台内风干,室温静置3n)im加入100山双蒸水,使 吸附柱中的DNA溶解到水中,4°C, 13000 rpm, 2 min。收集DNA,检测 DNA 浓度(ng/gl), ・80°C保存。

三、HeLa细胞培养

(1)  HeLa细胞的常规培养

75 cn?细胞培养瓶的HeLa细胞贴壁长满后,弃培养基,加入3 ml 0.25%的 胰酶,在37°C培养箱中消化3 min,弃胰酶,加入15 ml DMEM完全培养基(含 DMEM基础培养基+ 10%胎牛血清+ 1%青链霉素的培养基),用吹打管将细 胞吹落并吹打成细胞悬液,1 :3传代培养,37°C, 5%CO2,培养48小时。

(2) 细胞转染实验

1)  细胞消化3 min后,终止消化,1:6稀释种植到24孔板,每孔细胞量约为 2.5xl05, 37C, 5%CO2,培养 18^24 h 后进行转染。

2)  制备DMEM十DNA+Lipo6000复合物(不含抗生素),按照每孔加入0.5憾 DNA + 200 pl无血清DMEM + 1 ^1 Lipo6000进行配置,轻柔混匀。

3)  制备缺陷牛痘病毒复合物,按照1 : 2000的比例将virus稀释到DMEM基础 培养基,充分混匀。

4)  移除24孔板中的培养基,每孔加入lxPBSlml,洗涤,彻底移除洗液。

5)   加入3)中制备的缺陷牛痘病毒复合物,150^1/孔,37°C孵育30 mine

6)  加入2)中制备的DMEM + DNA + Lipo6000复合物,200叩孔,37°C孵育 16 〜18 h。

四、 突变体转运功能分析

(1)谷氨酸转运体摄取活性检测

实验前准备:NaCl Solution置于冰水混合物中,ChCl Solution用前需恢复 至室温,含 155 nM 的 D-[3H]-Aspartic acid 的 NaCl Solution (或含 100 nM 的 L-[3H]-Glutamic acid 的 NaCl Solution), 1% SDS 裂解液(若浑浊,可置于 37C 水浴,直至无沉淀),调好十分钟计时器准备计时。

HeLa细胞分别转染突变质粒、野生型质粒、SK质粒(即空载质粒),培养 18〜20小时后取出细胞,弃培养基,置于37°C恒温板上,每孔加入1 ml ChCl 溶液,洗涤1次,真空泵吸除废液;加入含D-[3H]-Aspartic acid的NaCl Solution (或含 L-[3H]-Glutamic acid 的 NaCl Solution) 200 pl/孔,室温孵育 10 min,真 空泵充分抽吸干净;用NaCl Solution洗涤细胞2次,每次、每孔加lml,真空 泵吸干(洗涤过程切勿吹打细胞,以免细胞脫落损失);加入1%的SDS裂解液 裂解细胞,每孔500 M细胞裂解后,将细胞裂解液全部收集到闪烁管中,每管 再加入闪烁液3 ml,盖紧后震荡混匀。另取一支闪烁管分别加入20 jil含155 nM 的 D-[3H]-Aspartic acid 的 NaCl Solution (或含 100 nM 的 L-[3H]-Glutamic acid 的NaCl Solution 500 pl的1%SDS裂解液及3 ml闪烁液,盖紧后震荡混匀, 作为阳性对照。最后,闪烁计数仪检测3H的CPM值。

五、 表面生物素化实验& Western blot

(1)细胞膜蛋白提取

1)  75 cm2细胞培养瓶长满后,0.25%的胰酶消化3 miti后,加入DMEM完全培 养基,吹打成细胞悬液后,1 : 5稀释,2 ml/well分到6孔板。

2)  培养18〜24 h后,转染相应质粒(5^1 Lipo6000 + 2.5 gg质粒+ 1 ml DMEM 基础培养基+ 750 gl病毒混合液)后,3TC, 5% CO2培养24h。

  • 取出培养板,吸走培养基,冰冻lxPBS (pH &0)洗两次,每孔加入25 ml 浓度 0.5 mg/ml 的 NHS-SS-Biotin 试剂[0.5 mg NHS-SS -Biotin + 2.5 ml 1 xPBS (PH 8.0) +3gl CaCl2 (IM) + 3 gl MgCl2 (IM) / 孔)],冰上孵育 20 mine
  • 吸干,每孔再次加25 mlNHS-SS-Biotin试剂,冰上孵育20 min。
  • 配 100 mM 甘氨酸(冰上):2 ml lxPBS (PH 8.0) + 015 g 甘氨酸 +2.4 ^1 CaCb + 2.4 p] MgCh®
  • 吸干,用5 ml (lOOmM)甘氨酸洗细胞一次。
  • 吸干,加入2・5ml/孔(lOOmM )甘氨酸,冰上孵育20 min。
  • 吸干,每孔加入5 ml冰的lxPBS (PH &0)洗细胞两次。

刃 每孔加入375 gl Western及IP裂解液(含lOOmM PMSF 3.75 pl),摇床上 剧烈摇动20 min (注意此步骤的培养板应一直置于冰上九

  • 将细胞吸到预冷的新的5 ml EP管中,做好标记,安置于4°C冰箱内的旋 转混匀仪上进一步裂解40 mine
  • 4°C, 13200rpm,离心 20min°
  • 4°C冰箱取出beads (按100 pl/孔计算总用量),充分混匀后吸取试剂,离心 后去上清,用含PMSF的Western及IP裂解液重复洗涤3次,每次1 ml, 13200 rpm,离心1 min,去上清,用裂解液将体积补足至原体积,充分混匀 后分装(100 gl/well)o
  • 继11)步,样本离心后的上清为总蛋白,各取40卩1总蛋白,标记后留作总 蛋白的WB实验用,其余转移到含100 gl Beads混合液的5 ml EP管中, 做好标记。
  • 含beads的上清放入4°C冰箱,在4°C冰箱的旋转混匀仪上旋转反应1 h0
  • 准备好pH 74的1 xPBS及55°C水浴箱。
  • ・20°C冰箱取出5 x变性缓冲液,解冻。
  • 样本 4°C, 13200 转/min,离心 1 min。
  • 留40川上清(胞浆蛋白)到新的预冷的5mlEP管中,做好标记,小心去*掉其余上清。

19) 用裂解液洗beads (已结合膜蛋白)3次,离心13200 rpm> 4°C, lmin,去 上清,重复3次,最后用1 x PBS(PH7・4)洗一次,1 ml/管,离心13200 rpm, 4C, lmim吸净上清。

20) 每管beads加入9卩1的5 x变性缓冲液及30卩1的1 x PBS (PH 7.4),混匀 后55°C变性30 min,放凉至室温待上样(上样前需在掌上离心机上稍离心, 取上层液体加样)。

(2) SDS-PAGE蛋白电泳

实验前准备:配胶仪器或试剂——50ml离心管、干净玻璃板、配胶底座、 11孔梳子、电泳槽、1 X电泳缓冲液、彩色预染蛋白分子量标准Marker^已煮沸 的变性蛋白样品。准备APS和TEMED,并将上述的液体配制好(准备好干净 的50 ml离心管),30min后确定密封性完好后,将双蒸水倒掉,此时加APS和 TEMED混匀,沿边缘缓缓均匀加入,距离板顶约2.5 cm处停止加入,迅速加 入双蒸水覆盖胶面,目的在于压平胶面。

1) 用洗洁精彻底清洗玻璃板,再用双蒸水冲洗,然后进行装板,装板后加入双 蒸水约30 min检测玻璃板间的密封性。如果不漏水,则在50 ml离心管中依 照方法学中介绍的方法配制12%分离胶和5%浓缩胶。

2) 灌胶:分离胶振荡混匀后,分别加到玻璃板间,大概7.5 mh加完后立即加 入无水乙醇压平胶面,室温静置30 min后,倒去无水乙醇,用滤纸沾干; 现配的浓缩胶震荡混匀后,于玻璃板间加入3.5 ml浓缩胶,立即插入梳子, 注意避免气泡,室温静置约30 min,待浓缩胶聚合成凝胶状。

3) 上样:待胶凝固后,拔梳,用双蒸水洗掉未聚合的丙烯酰胺,将制胶器安置 于电泳槽内,缓缓加入1 x电泳缓冲液,按照顺序依次将4 “1彩色预染蛋白 分子量标准Marker、40 pl样品加入孑L内,避免样本溢出,样品和Marker加 完后,再往中间槽内加满1 x电泳缓冲液。

4) 电泳:浓缩胶电压设置为恒压80 V,当Mari©和蛋白样品开始压成一条直 线时,提示样品进入分离胶(整个过程约40 min),此时电压调为恒压120 V, 持续电泳到染料到达分离胶底部为止,电泳时间约为120 mino电泳期间定 时检查中间槽内是否有足够的电泳缓冲液。

5)停止电泳后,用硬尺轻轻撬开玻璃板,避免伤及凝胶。暴露凝胶后,根据实 验需要切下含目标条带的部分。

(3)    免疫印迹杂交

实验前准备:浅塑料盘、lx电转缓冲液(使用前稀释)、甲醇、PVDF膜、 尺子、滤纸、锻子、剪刀、一抗、二抗、内参抗体、BSA、手套、TBST、摇床、 平皿、抗体孵育盒。

1)  撬开玻璃板后,用双蒸水冲洗凝胶,将凝胶置于盛有电转移缓冲液的浅盘内, 保持凝胶浸泡于缓冲液内。剪6张合适大小的滤纸和1张PVDF膜,防止 手上的蛋白遗留膜上,影响结果),将PVDF膜用适量甲醇浸泡约2 min至 半透明状,再用蒸惚水反复冲洗以去除膜上的油脂,然后将PVDF膜放在 lx电转缓冲液浸泡,滤纸浸泡15 min即可。

2)  凝胶PVDF膜平铺:由下而上分别叠放海绵垫、3层滤纸、PVDF膜、胶块、 3层滤纸、海绵垫,各层之间不能存有气泡,凝胶面向阴极(黑色面)。PVDF 膜面向阳极(红色面)。盖上电泳槽盖,电转参数设置为恒流200 mA转移 120 mino

3)  电转移结束后取出PVDF膜放于干净的滤纸上微微吸干,稍作标记(注意 区分正反面),将PVDF膜浸入封闭液(含5%BSA, 2gBSA + 40ml不含 吐温的1 xTBST)进行封闭,室温轻轻震荡2小时。

4)  含0.1%吐温-20的1 xTBST漂洗PVDF膜5 min x 3次,浸入一抗稀释液, 4°C孵育过夜。所有抗体按照抗体说明书进行稀释。

5)  孵育二抗:次日取出PVDF膜后,1 xTBST洗膜3次,每次5 min。加入辣 根过氧化物酶(HRP)标记的二抗稀释液后,置于摇床,室温震荡反应1小 时。

6)  1 x TBST洗膜3次,每次5 mino

(4)     化学发光法曝光蛋白条带

取HfPVDF膜,用滤纸将膜轻轻吸干,h 1混合ECL发光液A液和B液, 混匀后涂于膜上,置于天能凝胶成像仪内进行曝光,Tanon Gis分析软件采集图 片后,图片存为8 bittif格式。使用Image J软件对条带灰度值进行分析,分析 所得数据应用SPSS 20.0软件进行分析。

六、制备缺陷重组牛痘病毒

(1)    细胞扩大培养

待Hela细胞长满后(75CH?培养,四瓶),分别加入3 ml胰酶消化3 min, 然后加入15 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基,吹打成细胞悬液。将所有 细胞悬液转移到200 ml蓝盖瓶后,加入155 ml含10%胎牛血清的DMEM培养 基,充分混匀,接种到半径为15 cm的细胞培养皿中,20 m"皿。37°C, 5% CO2, 培养24h°感染细胞:一次操作2〜3个平皿。弃去培养基,用10 ml不含胎牛 血清的DMEM洗一次,弃液,然后每平皿加2 ml缺陷重组牛痘病毒混合液(配 方:25 ml DMEM + 15 gl缺陷重组牛痘病毒)。37C, 5% CO2, 30 mine再加入 20 ml DMEM + 5% FBS, 37"C,孵育 72 ho

(2)     收病毒

每平皿先移除15 ml的DMEM培养基,用细胞刮刀将10个皿的细胞充分刮 下,再将细胞液分别转移到2个50 ml的离心管中,每管约25 ml,注意整个过 程在冰上操作(10个皿细胞悬液共50 ml)o 1000 rpm, 4°C离心5 min,小心去 上清。用20ml 10mMTRIS-HCl (pH9.0)重悬细胞(每管加10ml重悬)。将 两管细胞都转移到研磨器中,然后在冰上研磨40〜60次(注意无菌操作)。将 充分研磨的溶液转移到50 ml离心管中,800 rpm, 4°C,离心5 min。在2个超 速离心机专用的TST28管中事先加入25 ml无菌的含36%蔗糖的10 mM TRIS-HC1 (pH 9.0)溶液,然后沿管壁缓缓加入10 ml均浆化的溶液。预约的超 速离心机使用TST28转头,23000 rpm, 4°C,离心60 min。小心去上清,每离 心管用1〜1.5 ml的1 mM TRIS-HC1 (pH 9.0)重悬沉淀,确保沉淀完全打散, 分装,・809保存。

■    1.2.6统计学分析

本研究采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计学分析,统计方法为单因 素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA),统计结果以均数士标 准差(mean 土 SD)表示。实验数据如果方差齐,则用LSD检验分析;方差不 齐,则用Dunnett9 s T3 post-hoc test分析。检验水准a =0.05, P < 0.05认为差异 有统计学意义。

1.3结果与分析

13J EAAT14b»4c环单点丙氨酸突变及转运活性检测

EAAT1的4b・4c环由57个氨基酸残基构成,为探查环上的关键氨基酸位点, 我们采用丙氨酸扫描突变技术对环上的氨基酸残基进行定点突变。其中,环上 53个非丙氨酸残基被逐一突变为丙氨酸(A), 4个原有的丙氨酸残基(A205、 A212、A220和A243)被突变为绩氨酸(因颂氨酸也是非极性氨基酸,且侧链 比丙氨酸的侧链稍大),这步突变的目的在于查看四个原有的丙氨酸残基是否也 显著影响EAAT1的正常功能。结果如图所示,与野生型EAAT1相比,超过 90%的突变体对DfH卜Aspatate仍保留了 60%以上的摄取活性。而T192A、 Y194A、N242A及G245A突变体的摄取活性显著下降,它们对D-[3H]-Aspatate 的摄取活性分别为(4.25 ±2.25) %、(12.82 ±7.21) %、(9.01 ±2.57) %和(8.10 ±4.59) % (n = 3)o我们发现T192、Y194、N242及G245四个氨基酸残基恰巧 集中分布于4b・4c环两端,而这两端也是4b・4c环最接近转运体底物结合袋的部 位(图1.1 B)o综合以上结果分析,T192、Y194、N242和G245很可能是EAAT1 完成底物转运所必需的关键氨基酸残基,因此,本研究选择围绕这四个位点的 氨基酸残基做进一步分析。

1-1. EAAT1 4b-4c环突变体转运活性检Sk

表达野生型EAAT1或4b-4c环突变体的HeLa细胞先用ChCl溶液洗涤两次,然后再行 D•广H]■天冬氨酸的摄取功能检测。实验数据源自三次独立的功能活性检测(n=3),结果以 与野生型EAAT1的摄取活性的百分比表示,且记为均值土标准差(SD)。

Figure 1-1 Transport activity of EAAT1 4b-4c loop mutants.

HeLa cells expressing EAAT1 or the 4b-4c loop mutants were washed twice with choline chloride-containing solution, and subsequently D-[3H]-Aspartate uptake was assayed. The results represent data obtained from three experiments (n = 3). The data is provided as a percentage of D-[3H]・Aspartate uptake by EAAT1 and shown as mean 士 SD.

1.3.2 EAAT1 4b-4c环的疏水性分析

氨基酸的亲疏水性是影响蛋白质折叠的重要驱动力,可促使蛋白质在折叠 过程中自动形成疏水性内核和亲水性表面,而在潜在的跨膜区段也可能出现高 疏水性区域。依据Kyte-Doolittle疏水性分析量表(1982年)计算所得的EAAT1 4b-4c环的亲水性分布图(Hydropathy profile),我们发现位于TM4b端的T192 和Y194残基所在区域具有高亲水性,而TM4c端的N242和G245残基所在区 域仅表现出轻微的疏水性(图1-2),说明T192、Y194残基很可能暴露于蛋白质 分子的亲水性表面,而N242和G245残基则可能与水溶液的接触较少,提示在 转运底物过程中,EAAT1蛋白的T192和Y194残基可能与N242和G245残基 的作用大不相同。

12・EAAT1 4b・4c环亲水性分布图。

4b-4c环的亲水性分布图是根据Kyte-Doolish疏水性标准(1982年),利用9个氨基酸 残基为一组综合计得的疏水性指数描绘而成。TM4b端(含T192和Y194残基的区域)用 圆形实心红点表示,而TM4c端(含N242和G245残基的区域)则用红色实心三角形表示。 Figure 12 Hydropathy profile of the 4b4c loop in EAAT1.

The hydropathy plot of the 4b-4c loop was generated according to Kyte-Doolittle Hydrophobicity Scale (1982) by using a window of 9 amino acids. The position of the TM4b end (which including residues T192 and Y194) is highlighted with a red dot, while the position of the TM4c end (which including residues N242 and G245) is expressed as a red triangle.

133额外突变体的转运活性检测

为了进一步评估T192、Y194、N242和G245残基的侧链结构是否影响EAAT1的转运功能,我们对这四个位点进行了相似氨基酸的额外突变。具体而言,我 们将T192位点突变成丝氨酸(S),因丝氨酸侧链同样含有一个龛基,只是侧链 整体较苏氨酸(T)的侧链小;而将Y194位点突变为苯丙氨酸(F),因苯丙氨 酸也具有苯环结构,只是比酪氨酸(Y)少了一个疑基。结果我们发现,保守突 变后,与野生型EAAT1、突变体T192A及Y194A相比,T192S和Y194F突变 体的底物摄取活性均得到了显著回升(图1-3),表明T192的羟基和¥194的苯 环结构均与EAAT1的底物摄取活性密切相关。

另外,我们将N242位点突变为天冬氨酸(D),因为天冬氨酸虽然具有酸性 侧链,但其侧链大小与天冬酰胺残基的侧链相似;再将N242位点额外突变为谷 氨酰胺(Q),因为谷氨酰胺也具有酰胺基团,只是侧链整体较天冬酰胺(N)的 稍大。而G245位点则被突变为脯氨酸(P),因脯氨酸残基和甘氨酸残基(G) 均可助蛋白质分子在它们所在位点形成一个“kink”(“扭结”)结构⑴;另外,G245 位点还被额外突变为缴氨酸(V),因为丙氨酸的甲基侧链比甘氨酸大,但较缄 氨酸小,因此,用缠氨酸替代该位点的残基,有助于分析是否是G245残基侧链 的增大妨碍了蛋白对底物的转运。结果如图1-3所示,与N242A和G245A相比, 额外突变体N242Q、G245P和G245V的底物摄取活性未获改善,只有N242D 蛋白的摄取活性较其丙氨酸突变体N242A略高。因此,我们认为N242和G245 位点的氨基酸残基对于EAAT1的底物摄取活性都是不可替代的,尤其是G245 残基。

图1-3. EAAT1 4b去环补充突变体转运活性检测。

DfH卜天冬氨酸摄取数据源自三次独立的功能活性检测(n=3),结果以与野生型EAAT1 的摄取活性的百分比表示,且记为均值土标准差(SD)o实验数据采用单因素方差分析(one -way ANOVA)进行统计,P < 0.05表示具有统计学差异,用’表示;P<0.01表示显著的统 计学差异,用^表示。

Figure 1-3. Transport activity of additional EAAT1 mutants.

D-[3H]-Aspartate uptake was measured in three experiments (n - 3). The data are provided as a percentage of D-[3H]-Aspartate uptake by EAAT1, and shown as mean ± SD. Values that are statistically different from WT EAAT1 were evaluated with one-way ANOVA: * p <0.05; ** p <0.01.

1.3.4 EAAT1 4b-4c环突变体盐水平检测

EAAT1作为一种跨膜蛋白,只有正确定位到细胞膜才可能正常发挥转运底 物的功能。因此,为了验证EAAT1突变体转运活性的受损(图14A和1・5A) 是否与蛋白质在细胞膜上的表达水平降低有关,我们进行了 EAAT1的细胞表面 生物素化和Western blot实验。因生物素标记分子可特异性标记膜蛋白,结合 EAAT1抗体的特异性识别作用再行Western blot分析,即可获得蛋白样本分别在 总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白表达水平的半定量信息。结果如图所示(图卜4B和 C),与野生型EAAF1相比,丙氨酸突变体T192A、Y194A及额外突变体T192S 和Y194F的总蛋白表达水平并无显著差异,但T192A和Y194A在细胞膜上的 表达水平却呈显著降低(图1・4 B和D),而在细胞浆中的表达水平却明显升高

(图14 B和E),提示突变蛋白T192A和Y194A可能因无法正常定位到细胞膜 上而被大量滞留在胞浆中。又因为在细胞膜水平(图1・4B和D)和细胞浆水平

(图14 B和E), T192S和Y194F突变蛋白的表达情况与野生型EAAT1相似, 说明突变后的残基侧链很可能有助于蛋白分子的上膜。最后,我们用各蛋白的 膜蛋白表达水平对其相应的转运活性进行标准化处理(图1・4A, D和F),发现 T192A和Y194A与野生型相比,标准化后的摄取活性依然较弱(图14F)。

(A)突变体的底物摄取活性以与野生型EAAT1的百分比形式表示。(B)参照前面的 材料和实验方法,各蛋白的总蛋白、生物素化膜蛋白和非生物素化蛋白行免疫印迹分析。(C) 在总蛋白的免疫印迹条带中,突变蛋白的灰度值经总蛋白内参(Actin)标准化处理后,再 与野生型EAAT1标准化后的值相比,最后以百分比形式表示该突变体在总蛋白中的表达水 平。(D)在生物素化标记的膜蛋白免疫印迹条带中,突变蛋白的灰度值经膜蛋白内参 (Integrin)标准化处理后,再与野生型EAAT1标准化后的值相比,最后以百分比形式表示 该突变体的膜蛋白表达水平。(E)在非生物素化的胞浆蛋白免疫印迹条带中,突变蛋白的 灰度值经胞浆蛋白内参(a-Tublin)标准化处理后,再与野生型EAAT1标准化后的值相比, 最后以百分比形式表示该突变体在胞浆中的表达水平。(F)用突变蛋白的膜蛋白表达量对 蛋白各自的D-[3H]-天冬氨酸摄取活性行标准化处理,再与野生型EAATI标准化后的值相 比,最后以百分比形式表示,数值记为均值土 SD (n-3)o采用单因素方差分析(one-way ANOVA),与野生型EAAT1相比具有统计学差异则表示为:><0.05; *><0.01 o

Figure 1-4. Protein expression and transport activity ofT192 mutants and Y194 mutants

(A) Uptake activities of the mutants are shown as a percentage of the WT EAATI. (B) Representative western blots for the total protein, biotinylated membrane protein, and non-biotinylated protein were measured as described in Materials and Methods. (C) Densitometric analysis of the total protein for each mutant normalized to internal marker (Actin) and represented as a percentage of the WT EAATI. (D) Densitometric analysis of the biotinylated membrane protein for each mutant normalized to internal marker (Integrin) and represented as a percentage of the WT EAATI. (E) Densitometric analysis of the non-biotinylated protein for each mutant normalized to internal marker (a-Tublin) and represented as a percentage of the WT EAATI. (F) D-[3H]-Aspartate uptake of each mutant was normalized to respective cell surface expression and represented as a percentage of the WT EAATI. The results are shown as means 士 SD (n = 3). Differences from WT EAATI were evaluated with one-way ANOVA: *P<0.05; ** P <0.01.

另外,N242A突变体的表达量在总蛋白水平(图1-5 B, C)和膜蛋白水平 (图1-5 B, D)与野生型EAAT1无明显差异。G245A突变体的膜蛋白表达量下 降了 20%左右(图1-5 B, D),但胞浆中的表达水平却显著升高(图1-5 B, E), 因而G245A突变体的总蛋白表达量与野生型EAAT1相比明显升高(图1-5 B, C)o G245V突变体在总蛋白、膜蛋白及胞浆蛋白中的表达水平均呈明显升高(图 1-5 B-E)o再用突变体的膜蛋白表达水平对各蛋白相应的转运活性行标准化处理 (图1-5 A, D, F),我们发现N242A和G245A突变体标准化后的摄取活性依 然很低(图1-5 A, F)o因此,我们认为N242A和G245A的转运活性受损是由 突变体内在的功能缺陷所致,而非膜蛋白表达量减少造成。此外,G245突变为 丙氨酸或绳氨酸后,虽然G245A及G245V突变体的蛋白表达水平均明显提高(图 1-5 B, C),但我们的结果表明它们的底物摄取活性极低,存在明显的转运功能 缺陷(图1-5 F)o

图1-5. N242突变体和G245突变体的蛋白表达及转运活性检测。

(A)突变体的底物摄取活性以与野生型EAAT1的百分比形式表示。(B)参照前面的 材料和实验方法,各蛋白的总蛋白、生物素化膜蛋白和非生物素化蛋白行免疫印迹分析。(C) 在总蛋白的免疫印迹条带中,突变蛋白的灰度值经总蛋白内参(Actin)标准化处理后,再 与野生型EAAT1标准化后的值相比,最后以百分比形式表示该突变体在总蛋白中的表达水 平。(D)在生物素化标记的膜蛋白免疫印迹条带中,突变蛋白的灰度值经膜蛋白内参 (Integrin)标准化处理后,再与野生型EAAT1标准化后的值相比,最后以百分比形式表示 该突变体的膜蛋白表达水平。(E)在非生物素化的胞浆蛋白免疫印迹条带中,突变蛋白的 灰度值经胞浆蛋白内参(wTublin)标准化处理后,再与野生型EAAT1标准化后的值相比, 最后以百分比形式表示该突变体在胞浆中的表达水平。(F)用突变蛋白的膜蛋白表达量对 蛋白各自的D-『珂■天冬氨酸摄取活性行标准化处理,再与野生型EAAT1标准化后的值相 比,最后以百分比形式表示,数值记为均值土 SD (n=3)o釆用单因素方差分析(one-way ANOVA),与野生型EAAT1相比具有统计学差异则表示为:><0.05; *><0.0L

Figure 1-5. Protein expression and transport activity of N242 mutants and G245 mutants.

(A) Uptake activities of the mutants are shown as a percentage of the WT EAAT1. (B) Representative western blots for the total protein, biotinylated membrane protein, and non-biotinylated protein were measured as described in Materials and Methods. (C) Densitometric analysis of the total protein for each mutant normalized to internal marker (Actin) and represented as a percentage of the WT EAAT1. (D) Densitometric analysis of the biotinylated membrane protein for each mutant normalized to internal marker (Integrin) and represented as a percentage of the WT EAAT1. (E) Densitometric analysis of the non-biotinylated protein for each mutant normalized to internal marker (a・Tublin) and represented as a percentage of the WT EAAT1. (F) D・『H卜Aspartate uptake of each mutant was normalized to respective cell surface expression and represented as a percentage of the WT EAAT1. The results are shown as means 土 SD (n = 3). Differences from WT EAAT1 were evaluated with one-way ANOVA: * p< 0.05;                                                                                                                    <0.01.

1.3.5单点丙氨酸突变体底物最大结合能力及动力学参数检测

考虑到EAAT1突变体的底物摄取活性受损不能完全归因于膜蛋白表达水平 的改变,我们对突变体作了进一步的动力学实验分析,旨在分析原残基被突变 后是否会引起转运体动力学参数的改变。在本部分实验中,我们选择对四个关 键的丙氨酸突变体(T192A、Y194A、N242A和G245A)及三个底物摄取活性 有改善的EAAT1额外突变体(T192S、Y194F和N242D)进行了动力学实验分 析。结果如表所示,与野生型EAAF1相比,四个丙氨酸突变体的底物亲和 力参数值明显升高,V^ax则显著降低。保守突变的突变体T192S和Y194F 的Km值与野生型EAAT1相比没有统计学差异,它们的与其他突变体相比 也明显较高。让人意外的是,N242D突变体的K®值也与野生型EAAT1相当, 只是其仅为野生型EAAT1的10~20%左右。

1-1.EAAT1及其突变体动力学参数分析。

实验基于Hill方程应用Origin 7.5软件(Northampton, MA, USA)对实验 数据进行非线性拟合,进而得出相应的动力学参数值(>^和Vmax)o各蛋白的 Vmax再以与野生型EAAT1的Vmax的百分比表示。所有结果记为均值士 SD (口=3)。星号表示与野生型EAAT1相比具有统计学差异(S<0』5; ><0.01)0

Table 1-1. Kinetic parameter analysis of EAAT1 and its mutants

The transport kinetics parameters (Km and Vmax) were calculated with the Hill equation by using non-linear in Origin 7.5 software (Northampton, MA, USA). Vmax was expressed as a percent of the Vmax of WT EAAT1. And all results are shown as mean ± SD (n = 3). Asterisks indicate values statistically different ( P <0.05; ** P <0.01) from WT EAAT1.

1.4讨论

哺乳动物的中枢神经系统中,谷氨酸是介导兴奋性信号传递的重要神经递 质囚,正常情况下,谷氨酸递质在脑内的传递及代谢过程有条不紊,病理情况下, 突触间隙内谷氨酸积累过多会对神经细胞产生兴奋性毒性效应【“】。由于神经系 统的细胞外液缺乏谷氨酸的代谢酶体系,因此,脑组织需要依赖谷氨酸转运体 (EAATs)对突触间隙内的谷氨酸进行回收利用,并将胞外谷氨酸的浓度控制在 毒性水平以下。因而人们认为EAATs(尤其是星形胶质细胞的EAAT1和EAAT2) 是哺乳动物赖以维持中枢神经系统谷氨酸稳态的极重要的调控元件⑹。

虽然人们已经破解了 Gltp」"。]和EAATlcgW啲晶体结构,并对它们的结构和功能进行了深入分析,但由于EAATlcryst的4b-4c环残缺不全,野生型 EAAT4b-4c环的相关信息我们知之甚少。为了探究EAAT1的4b・4c环与蛋白转 运活性之间的关系,我们采用丙氨酸扫描突变技术对环上各残基进行了排查, 结果发现了四个显著影响蛋白转运活性的关键氨基酸残基(T192、Y194、N242 和G245) o这四个位点的残基突变为丙氨酸后,突变体的底物摄取活性出现大 幅度下降,它们的动力学参数与野生型EAAT1相比也发生了显著的改变(表 1J),说明T192、Y194、N242和G245在EAAT1的底物转运过程中必不可少, 动力学实验结果则可证明它们与蛋白对底物的亲和力密切相关。Koch等人曾通 过电压钳荧光测量实验(Voltage Clamp Fluorometry Technique, VCF)发现 EAAT3结合谷氨酸和钠离子时,4b-4c环上的荧光信号会发生一定的变化【⑴,这 一结果提示不同亚型EAAT蛋白的4b-4c环在影响蛋白与配体的结合事件上可能 具有相似的作用。

仔细观察Gltph〔"W]和EAATlcytZl的晶体结构,不难发现两者4b・4c环的 两端均靠近中央腔的底部且离底物结合袋不远(图1-6) e尽管晶体EAATlcryst 无法呈现4b・4c环的天然结构,但该环似乎倾向于朝着三聚体的中央前庭延 伸。我们过去曾研究过野生型EAAT1 4b・4c环的水相通透性,发现该环很可能 是一段穿插于细胞膜表面的折返环,而并非简单地定位在细胞膜外侧。另外, 我们还发现位于该环两端的Q189、A243、L244残基不仅溶液可及,而且还具 有构象敏感性卩习,这些结果提示4b-4c环两端氨基酸残基的拓扑位置相对复杂。 EAATlcryst 的 T198、Y200、N222 及 G225 残基相当于野生型 EAAT1 的 T192、 Y194、N242和G245⑴】(见图1・6及前言部分的图4),因此,这四个氨基酸残 基在EAATloyst晶体中的空间位置特点和局部构象特点对野生型EAAT1的相应 残基而言仍具有重要的参考意义。在Gltph向外开放的晶体结构中,用Pymol软 件测得4b-4c环上的V151与HP2尖端的S279之间a碳的距离仅为7 A (A,埃 格斯特朗,简称埃,长度单位)【叫 而在向内开放构象中,GLT-1 (EAAT2)4b・4c 环上的V241残基(相当于Gltph的V151氨基酸残基)与TM2的193和197之 间会发生相互靠近,说明4b-4c环相对于GLT-1单体的其余部分,该环的部分区 段可能会向转运核心区的内部移动,又或者在蛋白向内转运底物时,会围绕 TM2的193和197位点发生旋转性的移位何。此外,EAAT1的A243位点(相 当于Gltph的V151)与HP1、HP2或TM7的B桥之间均会出现相互靠近的情况 M2叭 综合以上结果,我们认为EAAT1的底物结合袋与4b・4c环残基之间的距 离如此接近,环上氨基酸残基(尤其是4b・4c环两端的氨基酸残基)的静电作用 不可忽视。另外,4b・4c环的两端插于三聚体的中央腔,该腔充满了大量溶液且 腔底深达脂质双层膜的中线水平,中央腔的这种特殊结构非常有利于降低蛋白 跨膜转运配体的能障,并能高效防止配体从中央腔逸出,因此,人们认为中央 腔的这种特殊结构有助于谷氨酸转运体用极短的时间完成转运周期[⑹°鉴于 4b-4c环上四个关键氨基酸残基的敏感位置,我们认为它们很可能通过静电作用 或空间位阻因素等参与影响配体在中央腔的扩散,进而增强蛋白对底物的捕获 效率。

16脂质双层膜上EAAT1C肿的T198, Y200, N222, G225氨基赵基(相当于野生 型EAAT1T192, Y194, N242G245氨基駿残基)的位置及N222N222Q氮基酸

残基侧链长度的比较。

EAAT1 cryst的转运核心区用彩色部分表示(图A. PDB ID: 5LLM;图B和图C. PDB ID: 5LLU),其中HP1为洋红色;HP2为橙色;TM7为淡橙色;TM8为粉红色° EAAT^戢的 T198, Y200, N222, 1223, G225 相当于野生型 EAAT1 的 T192, Y194, N242, A243 和 G245O 氨基酸残基 T198、Y200、N222、N222Q、1223 和 G225 用彩色棒状表示。N222 (B) 与N222Q (C)的侧链长度相比较。结合袋内结合着一个L-天冬氨酸(L・Asp)和一个Na 离子。图B、图C中,EAATlcryst的TM4ab区段被删除,只为更清晰地呈现目标视野。

Figure 1-6. T198, Y200, N222, and G225 of EAATlcryst (the equivalent residues of T192, Y194, N242, and G245 of WT-EAAT1) shown in the reference frame of the lipid membrane and comparison of the side-chain length of N222 and N222Q.

The transport core of EAATlciy$t (PDB ID: 5LLM for A; 5LLU for B and C) is indicated in different colour (HP1S magentas; HP2, orange; TM7, light orange; TM8, pink). T19& Y200, N222, 1223, and G225 of EAATlcryst are equivalent to T192, Y194, N242, A243, and G245 of WT-EAAT1. Residues T19& Y200, N222, N222Q, 1223, and G225 are rendered as colored sticks. The side-chain length of N222 (B) is compared with that of N222Q (C). L-Aspartate (L-Asp) and a sodium ion (Na) are bound in the binding pocket. The TM4a-b of EAATlciyst in B and C were omitted for clarity.

为了探讨四个关键氨基酸残基的侧链是否在底物摄取过程中发挥了特殊的 作用,我们对这四个位点采用保守氨基酸替代的突变策略进行了额外的定点突 变。我们的结果表明只有T192S和Y194Y突变体能够较大程度地保留蛋白的底 物摄取活性(图l-3)o结合EAAT1 4b-4c环的亲水性分布图进行分析(图1-2), 我们发现T192和Y194残基位于4b・4c环的亲水区域,而N242和G245残基位 于4b・4c环的弱疏水区域,因此,我们推测与N242和G245残基相比,T192和 Y194残基在4b-4c环上的作用可能有较大区别。

为了分析突变体底物摄取活性的受损是否与其膜蛋白表达量的减少有关, 我们采用细胞表面生物素化标记技术联合Western blot实验对各突变体的表达情 况进行分析。结果发现突变体T192A和Y194A的总蛋白表达水平与野生型 EAAT1相近(图1・4B, C),但在细胞膜的表达水平显著降低(图1-4B, D), 而在胞浆中的表达量却明显增加(图1・4B, E),表明T192和Y194位点的丙 氨酸突变可能导致突变蛋白被滞留在胞浆。有人曾证明截除EAAT2的整段 4b・4c环没有导致蛋白质的错误折叠呵,因此 我们认为T192或Y194位点的丙 氨酸突变造成EAAIT蛋白发生折叠错误的可能性不大,它们的突变可能主要阻 碍蛋白的上膜或定位。另外,由于突变体T192S和Y194F能够在很大程度上恢 复它们的膜蛋白表达水平及底物的摄取活性,提示T192的瓮基和Y194的苯环 可能是EAAT1上膜或定位的关键官能团。类似的结果在Hayashi和Yasui的研 究中也有出现,他们的研究证明SLC1转运体的4b-4c环为丝状足尖定位所必 需,该区段在丝状足尖端的信号分选中具有一定的功能,但是他们的实验也证 明仅靠4b・4c环还不足以实现蛋白在脂质双层膜中的转移或在丝状足中的定位 [,7]o EAAT1 TM4b上的C186S突变也可能阻碍突变体在丝状足尖的适当定位 【叫 因此,综合上述结果,我们推测EAAT1的T192或Y194残基如果不能与 它们的锚定点正常结合,那么蛋白可能无法在细胞膜上正确定位,或蛋白即使 能嵌入细胞膜,也可能嵌在一个不合适的细胞膜平面,其结果或许会造成蛋白 的底物结合位点被脂质双层膜分子覆盖,从而导致底物结合位点与底物接触的 概率大幅度降低。

对于N242位点,N242D突变体对底物表现出了让人意外的高亲和力(表 bl) o我们的结果表明,N242位点引入天冬氨酸残基(D)后,替代残基的负 电荷并未影响蛋白质的底物亲和力,但N242D的Vmax非常低,鉴于突变体 N242D的膜蛋白水平与野生型基本一致,我们认为N242D蛋白摄取活性受损主 要是摄取底物的周转速率严重下降造成,对于其中的具体原因,我们推测N242 位点被天冬氨酸(D)替代后可能改变了蛋白的pKa值及底物结合位点附近的局 部pH值,因而蛋白对底物的周转率显著下降。相比之下,N242Q突变体的摄 取活性受损则可能由于替代残基(谷氨酸酰胺,Q)的侧链过大所致。如图1・6 (B和C)所示,N242的侧链长3.8入,而N242Q的侧链稍长,为5.1 由于 N242Q不能恢复转运体的摄取活性,提示N242Q增大的侧链可能妨碍了蛋白局 部构像的改变。对于这一推测,N242的相邻残基A243提供了以下多条重要的 线索:(DA243残基在底物的转运过程中密切参与了 EAAT1的局部变构▽乂 261; (2)我们过去也曾证明A243残基不仅溶液可及,而且还具有构象敏感性【⑶;

(3)在本研究的第二部分,我们用还原剂DL-二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol,

DTT)处理被氧化的EAAT1突变体后,发现A243C/I469C突变体仅恢复了 60% 的底物摄取活性Ml,我们推测DTT分子有可能在接近A243C与I469C之间所形 成的二硫键上存在一定的困难,所以DTT难以将两残基间的二硫键彻底还原。 因此,综合以上结果和实验依据,我们认为A243残基很可能位于中央腔底部的 一个非常狭窄的罅隙,而与A243相邻的N242残基所处空间也可能存在相似的 特点;另外,由于N242残基的位置非常靠近底物转运通道,因而N242Q增大 的侧链便可轻易阻碍蛋白关键部位的局部变构,继而不能对蛋白活性位点与底 物的结合起到正向协同的作用。

因为相似氨基酸残基的替代(如脯氨酸)不能挽救突变体G245A的摄取活 性(图1・3),所以我们认为G245残基是不可替代的。我们分析,甘氨酸(G) 是唯一的非手性氨基酸,其侧链只含有一个氢原子且介于极性和非极性之间, 因而甘氨酸残基既能适应疏水性环境也能适应亲水性环境,在蛋白质的局部变 构中还可表现出很高的灵活性。大量的研究证明,EAAT完成一个转运周期, 其单体的转运核心区和支架区之间会发生一系列复杂的构象变化[13・15」8-24],因 此,谷氨酸转运体转运底物的过程实质上是一个非常复杂的变构过程。我们过 去已经证明,在底物的转运过程中,EAAT1的TM4与转运核心区的HP1/HP2, TM7及TM8之间都会经历相互靠近、相互远离的位移变化M 25s旳,而GLT-1 的TM2与TM4之间也会经历复杂的位置变动卩】,鉴于G245位点邻近底物结合 袋,我们推测G245位点的甘氨酸残基很可能是变构区域内支持局部区段大幅度 转动的关键节点之一,而其主要的贡献很可能是帮助局部区段在转运过程中实 现极大灵活性的变构运动。另外,G245A的动力学参数明显异于野生型EAAT1

(见表M),证明G245位点的突变会显著影响蛋白对底物的亲和力,提示G245 残基可能支持的是转运通道形成过程中所需要的变构。在EAATlciyst的结构中, N242残基侧链的指向背离底物结合袋(见图1・6),提示N242残基也可能需要 通过某种的局部变构以实现其侧链方向的转变,进而发挥其特殊的作用。此外, 因为丙氨酸侧链比甘氨酸大,为分析侧链增大后的影响,我们决定将G245位点 再额外突变为颂氨酸(绳氨酸侧链较丙氨酸的侧链更大),结果发现突变体G245V的底物摄取活性较G2H5A的活性更低(图1・3)。综合以上结果和分析, 我们认为G245的残基侧链可能位于扭转关节的中心或靠近底物结合位点,以致 于它的变构灵活性及侧链的大小都可影响蛋白质和底物之间的相互作用。

综上所述,本研究在EAAT1的4b-4c环上找到了四个影响底物转运的关键 氨基酸残基。我们的研究结果提示4b・4c环可能依靠这些残基协助EAAT1在细 胞膜上正确定位,并参与蛋白的变构及协调底物的转运。考虑到EAAT1主要表 达于星型胶质细胞膜表面,并集中分布于面向神经元的交界面,其4bMc环突出 于三聚体的中央前庭,可能更靠近与神经元接触部位附近的、神经元的谷氨酸 释放位点,所以该环还有可能在神经传导过程中承担着其他某些特殊的生物学 功能。

站文献

  • Hong W, Wu Z, Fang Z, et aL Amino Acid Residues in the Putative Transmembrane Domain 11 of Human Organic Anion Transporting Polypeptide 1B1 Dictate Transporter Substrate Binding, Stability, and Trafficking]J]. Mol Pharm. 2015, 12(12): 4270-4276.
  • Fonnum F. Glutamate: a neurotransmitter in mammalian brain [J]. J Neurochem. 1984, 42(1): 1-11・
  • Zhang Y, Tan F, Xu P, et al. Recent Advance in the Relationship between Excitatory Amino Acid Transporters and Parkinson's Disease [J]. Neural Plast. 2016, 2016:8941327・
  • Zhou Y, Danbolt N C. Glutamate as a neurotransmitter in the healthy brain[J]. J Neural Transm (Vienna). 2014, 121(8): 799-817.
  • Platt S R. The role of glutamate in central nervous system health and disease—a review[J], Vet J. 2007, 173(2): 278-286.
  • He S, Zhang X, Qu S. Glutamate, glutamate transporters, and circadian rhythm sleep disorders in neurodegenerati ve diseases [J]. ACS Chem Neurosci. 2018 ・
  • Yemool D, Boudker O, Jin Y, et al. Structure of a glutamate transporterhomologue from Pyrococcus horikoshii[J]. Nature. 2064,431(7010): 811-818.
  • Boudker O, Ryan R M, Yemool D, et al. Coupling substrate and ion binding to extracellular gate of a sodium-dependent aspartate transporter]J]. Nature. 2007, 445(7126): 387-393.
  • Reyes N, Ginter C, Boudker O. Transport mechanism of a bacterial homologue of glutamate transporters[J]・ 2009, 462(7275): 880-885.
  • Verdon G, Boudker O. Crystal structure of an asymmetric trimer of a bacterial glutamate transporter homolog[J]. Nat Struct Mol Biol. 2012, 19(3): 355-357.
  • Canul-Tec J C, Assal R, Cirri E, et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1[J]. Nature. 2017, 544(7651): 446*451.
  • Koch H P, Hubbard J M, Larsson H P. Voltage-independent sodium-binding events reported by the 4B-4C loop in the human glutamate transporter excitatory amino acid transporter 3卩].J Biol Chem. 2007, 282(34): 24547-24553.
  • Zhang W, Zhang X, Qu S. Cysteine Scanning Mutagenesis of TM4b-4c Loop of Glutamate Transporter EAAT1 Reveals Three Conformationally Sensitive Residues [J]. Mol Pharmacol. 201& 94(1): 713-721.
  • Rong X, Zomot E, Zhang X, et al. Investigating substrate-induced motion between the scaffold and transport domains in the glutamate transporter EAAT1[J]. Mol Pharmacol. 2014, 86(6): 657-664.
  • Rong X, Tan F? Wu X, et al. TM4 of the glutamate transporter GLT-1 experiences substrate-induced motion during the transport cycle[J]. Sci Rep. 2016, &
  • Leary G P, Holley D C, Stone E F, et al. The central cavity in trimeric glutamate transporters restricts ligand diffusion[J]・ Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 108(36): 14980-14985.
  • Hayashi M K, Yasui M. The transmembrane transporter domain of glutamate transporters is a process tip localizer[JJ. Sci Rep. 2015, 5: 9032・
  • Zhang Y, Zhang X, Qu S. Cysteine mutagenesis reveals alternate proximity between transmembrane domain 2 and hairpin loop 1 of the glutamate transporter EAAT1[J]. Amino Acids. 2014,46(7): 1697-1705.

[1 刃 Zhang X, Qu S. The accessibility in the external part of the TM5 of the glutamate transporter EAAT1 is conformationally sensitive during the transport cycle[J]・ PLoS One. 2012, 7(1): e30961 ・

  • Zhang X, Qu S. Proximity of transmembrane segments 5 and 8 of the glutamate transporter GLT-1 inferred from paired cysteine mutagenesis[J]. PLoS One. 2011, 6(6): e21288・
  • Crisman T J, Qu S, Kanner B I, et al. Inward-facing conformation of glutamate transporters as revealed by their inverted-topology structural repeats[J]. Proc Natl Acad Sci USA. 2009,106(49): 20752-20757.
  • Qu S, Kanner B I. Substrates and non-transportable analogues induce structural rearrangements at the extracellular entrance of the glial glutamate transporter GLT-1/EAAT2[J]. J Biol Chem. 200& 283(39): 26391-26400.
  • Leighton B H, Seal R P, Watts S D, et al. Structural rearrangements at the translocation pore of the human glutamate transporter, EAAT1[J]. J Biol Chem> 2006, 281(40): 29788-29796・
  • Rong X, Zhang X, Qu S. A complex relative motion between hairpin loop 2 and transmembrane domain 5 in the glutamate transporter GLT-1[J]. Int J Biochem Cell Biol. 2015, 60:1-7.
  • Zhang W, Zhang X, Qu S. Substrate-Induced Motion between TM4 and TM7 of the Glutamate Transporter EAAT1 Revealed by Paired Cysteine Mutagenesis[J]. Mol Pharmacol. 2019, 95(1): 33-42.
  • Qu S, Zhang W, He S, et al, Paired-Cysteine Scanning Reveals Conformationally Sensitive Proximity between the TM4b-4c Loop and TM8 of the Glutamate Transporter EAAT1 ACS Chem Neurosci. 2019.

第二章EAAT1 4b・4c环与TM8在转运周期中的相对运动

2.1引言

通过定点突变技术构建半胱氨酸对突变体,若两个被引入的半胱氨酸残基 间能够交联形成二硫键,则可证明两位点的空间位置非常靠近(<5A),因此, 突变体的半胱氨酸对交联实验可用于评估两个氨基酸残基位点间的距离,常用 于分析蛋白质分子内或分子间局部区域的相互位置关系。在过去的研究中,我 们曾借此技术证明了 4b-4c环在EAAT转运底物的过程中会与转运核心区的 HP1、HP2⑴及TM7【2]相互靠近,说明4b・4c环与转运核心区之间可能存在非常 重要的相互协作关系。然而,因为转运体的底物结合袋由HP1、HP2、TM7及 TM8共同组成[兀⑼,所以只有也了解了 4b・4c环与TM8之间的相互运动关系, 才能对4b・4c环与转运核心区之间的位置变化关系做更确切的评估。为此,在本 部分的研究中,我们以无内源性半胱氨酸的EAAT1 (CL-EAAT1, cystein less EAAT1)为母本,重点研究4b-4c环在转运周期的不同时相中与TM8之间的空 间位置变化。

2.2材料和施

2.2.1主要材料

参见121

2.2.2主要仪器设备

参见1.2.2

223主要试剂配制

细菌培养基的配制、抗生素的配制、感受态细胞TOP 10的制备试剂、定点
突变相关试剂配制、Western blot试剂配制、细胞培养相关试剂配制、检测转运
功能相关试剂(NaCl 溶液、KC1 溶液、ChCl 溶液)、0.5 M L-glutamic acid (L ・ glu)、
10% sodium dodecyl sulfate (SDS)、10 mM TRIS^HCKpH 9.0)、36%蔗糖的 10 mM
TRIS-HC1的配制参见1.1.3

  • Copper (II) (1 ? 10-Phenanthroline)3 (CuPh)

储存液为 150 mM CuPh: 37.0 mg (CuSO4*5H2O)溶于 600 gl 预冷双蒸水, 99.0 mg (1,10-Phenanthroline)溶于400 pJ 50%预冷的无水乙醇,两者混合。储 存液分装后存于-80°Co使用前用NaCl solution稀释到所需浓度。

注:CuPh具有强氧化性,可氧化相邻的两个半胱氨酸残基从而产生二硫键 交联。

  • DL-Dithiothreitol (DTT)

储存液为1 M DTT:用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液(pH 5.2)溶解3.09 g DTT,贮存于-20°C,使用前用NaCl溶液稀释成20mM°

注:DTT具有强还原性,可还原蛋白质半胱氨酸残基形成的分子内或分子 间二硫键。

  • 5 mL-glutamic acid (L- glu)

称取735 mg L-glu溶于10 ml IM的HC1溶液,调节pH = 74,分装后存于 -80°C o使用前用NaCl solution稀释到工作浓度。

  • D, L-threo-p-benzyloxyaspartate (DL - TBOA)

储存液为 100 mM DL-TBOA: 10 mg DL-TBOA 溶于 382 卩1 DMSOo 储存液 分装后存于-80°Co使用前用NaCl solution稀释至所需浓度。

  • 2-Aminoethyl methanethiosulfonate hydrobromide (MTSEA)

储存液1 M MTSEA: 236.15 mg溶于1 ml双蒸水,储存液分装后存于・8(TC。 使用前用NaCl solution稀释至所需浓度。

  • 2*Trimethylammonium methanethiosulfonate (MTSET)

储存液IM MTSET: 278.24 mg溶于1 ml双蒸水,储存液分装后存于・80°C使用前用NaCl solution稀释至所需浓度。

2.2.4实验方法                                          *

一、 大肠杆菌感受态细胞TOP10的制备

参见1.2.4

二、 定点突变实验

参见1.2.5

三、 HeLa细胞培养

常规HeLa细胞培养及细胞转染实验操作参见L1.7

四、 突变体转运功能分析

1  转运活性检测

参见128

(2) 测氧化剂CuPh对突变体转运活性的影响

1)  HeLa细胞转染野生型EAAT1和突变质粒18 - 20小时后,取出细胞,移除 培养基,置于379恒温板上,每孔加入1 ml ChCl溶液洗涤2次,吸除洗液。

2)   加入不同浓度CuPh,室温孵育5mina

3)   每孔加入1 ml ChCl Solutiom洗涤2次,吸除洗液。

4)   加入含 D-[3H]-Asp 的 NaCl Solution, 200 小/孔,室温孵育 10mino

5)  NaCl Solution置于冰水混合物中,每孔加入1 ml NaCl Solution,洗涤2次, 吸除洗液,洗涤过程切勿吹打细胞,以免细胞脱落。

6)   加入1%的SDS裂解液裂解细胞,500 pl/JLo

7)  将裂解后的细胞混合液加入样品管,每管再加3 ml闪烁液,充分震荡混匀, 做好标记,液闪仪检测俎的CPM值。

(3) DTT还原实验

1)  HeLa细胞转染野生型和突变质粒18-20小时后,取出细胞,移除培养基, 置于37°C恒温板上,每孔加入1 ml ChCl Solution,洗涤2次,吸除洗液。

2)   加入CuPh,室温孵育5 mine

3)  每孔加入1 ml ChCl Solution,洗涤2次,吸除洗液,加入20 mM DTT,室 温孵育5 mine

4)  每孔加入1 ml ChCl Solution,洗涤2次,吸除洗液。

5)  加入含 D-[3H]-Asp 的 NaCl Solution, 200 pl/孔,室温孵育 10 mine

6)  NaCl Solution置于冰水混合物中,每孔加入1 mlNaCl溶液,洗涤2次,吸 除洗液,洗涤过程切勿吹打细胞,以免细胞脱落。

7)  加入1%SDS裂解细胞,500 gl/?Lo

8)  将裂解后的细胞混合液加入到样品管中,每管加入3 ml闪烁液,充分震荡 混匀,标记,液闪仪检测临的CPM值。

(4) 不同细胞外介质对CuPh氧化抑制效应的影响

1)  HeLa细胞转染野生型EAAT1和突变体质粒18-20小时后,取出细胞,移除 培养基,置于379恒温板上,每孔加入1 ml ChCl Solution,洗涤2次,吸 除洗液。

2)  加入含 CuPh 的 NaCl Solution> 或含底物 L-glutamate 的 CuPh Solution、或含 底物抑制剂 DL-TBOA 的 CuPh Solution,或含 KC1 的 CuPh Solution,或含 ChCl 的 CuPh Solution, 200 jil/孔,室温孵育 5 min。

3)  每孔加入1 ml ChCl Solution,洗涤2次,吸除洗液。

4)  加入含 D-[3H]-Asp 的 NaCl Solution, 200 gl/孔,室温孵育 10 min。

5)  NaCl Solution置于冰水混合物中,每孔加入1 ml NaCl Solution,洗涤2次, 吸除洗液,洗涤过程勿吹打细胞,以免细胞脱落损失。

6)  加入1% SDS裂解细胞,500 pl/?Lo

7)  将裂解后的细胞混合液加入到样品管中,每管加入3 ml闪烁液,充分震荡 混匀,标记,放到液闪仪检测殖的CPM值。

(5) 细胞外介质对单个位点水相通透性的影响

HeLa细胞转染野生型和突变体18・20小时后,取出细胞,吸除培养基,放 在37匸恒温板上,每孔加入1 ml ChCl Solution,洗涤2次,吸除洗液。加入含 MTSET的NaCI Solution、或含底物L-glutamate的MTSET溶液、或含底物抑制 剂DL-TBOA的MTSET溶液、含MTSET的KC1溶液、含MTSET的ChCl溶 液,200卩"孔,室温孵育5 mine ChCl Solution洗涤2次,吸除洗液。加入含 D-[3H]-Asp 的 NaCl Solution, 200 卩1/孔,室温孵育 10 min,吸除废液°NaCl Solution 置于冰水混合物中,每孔加入1 mlNaCl Solution,洗涤2次,吸除洗液,洗涤过 程切勿吹打细胞,以免细胞脱落。加入1%SDS裂解细胞,500叩孔。将裂解后 的细胞加入到样品管中,每管加入3 ml闪烁液,彻底混匀,检测咗的CPM值。

注:同样的操作,将含MTSET试剂替换成含MESEA的试剂,测处理后样 本的3H的CPM值。

五、 Western blot

参见129

六、 制备缺陷重组牛痘病毒

参见L2.10

225统计学分析

参见1.2.11

2.3结果与分析

2.3.1 V238C/I469C和A243C/I469C突变体内的半胱氨酸交联降低了 CL-EAAT1 的底物轄肆

为了研究EAAT1 4b・4c环的位置与蛋白功能的关系,我们选择在CL-EAAT1 4b-4c环上的V238位点.A243位点与TM8a或TM8b上的不同位点之间构建半 胱氨酸对(总共26对),然后用强氧化剂CuPh处理表达突变体的HeLa细胞, 促使半胱氨酸残基间发生氧化交联反应,最后再检测它们对底物的摄取活性。 结果发现,经600 pM的CuPh溶液处理后,突变体V238C/I469C和A243C/I469C 的活性显著下降,而CL-EAAT1及其他突变体的转运活性未受到影响(图2・1 A)。 此外,随着CuPh浓度的增加,突变体V238C/I469C和A243C/I469C对Df H卜 天冬氨酸的摄取活性降低得更加明显(图2-1 B),并在CuPh浓度为600 nM时, 两突变体的活性均降到了 10%以下。而V238C、A243C和I469C单点突变蛋白 即使在两两突变体共转染的情况下也不受CuPh的氧化抑制(图2“ C)o因为 I469C位于TM8a,所以我们认为EAAT1在转运底物过程中,4b・4c环在单体内 会与TM8a之间发生相互靠近的情况。

2-1. CuPh对突变体V238C/I469CA243C/I469C转运活性的抑制效应分析。

(A)二硫交联剂CuPh对CL-EAAT1及26个不同的两点半胱氨酸突变体的D^H]■天 冬氨酸摄取活性的影响;(B)不同浓度的CuPh对突变体CL-EAAT1、V238C/I469C和

A243C/I469C的d£h]•天冬氨酸摄取活性的影响:(C) 600nMCuPh处理后,CL-EAATK 单点半胱氨酸突变体(V238C、A243C和I469C)、两点半胱氨酸突变体(V238C/I469C和 A243C /I469C),及共转染单点半胱氨酸突变体V238C和I469C或A243C和I469C对

天冬氨酸的摄取活性。所有蛋白均表达于HeLa细胞,并用含CuPh的NaCI solution室温孵 育5 min,继而测定蛋白对DfH]・天冬氨酸的摄取活性。数值均以转运体经CuPh处理的摄 取活性占未经CuPh处理的摄取活性的百分比表示,所有数据源自三次不同实验的均值士 SDo所有结果与CL-EAAT1比较,采用one-way ANOVA单因素方差分析进行分析,><0.05 或*><0.01表示具有统计学差异。

Figure 2-1. The inhibition effect of CuPh on the transport activity of mutants V238C/I469C andA243C^469C.

(A) Effect of the disulfide crosslinking agent CuPh on the transport activity of Wild-type CL-EAAT1 and 26 different double cysteine mutants was determined by measuring D・[3H]・aspartate uptake; (B) Effect of different concentrations of CuPh on D-[3H]-aspartate uptake of CL-EAAT1, V238C/I469C and A243C/I469C; (C) Effect of 600 nM CuPh on D-[3H]-aspartate uptake in cells expressing CL-EAAT1; single cysteine mutants V238C, A243C and I469C; double cysteine mutants V238C/I469C and A243C/I469C; and cotransfected V238C and I469C or A243C and I469C single mutants. All proteins were expressed in HeLa cells. Cells were treated with CuPh in NaCI solution for 5 min at room temperature, and subsequently D-[3H]・aspartate transport was assayed. Data represent the percentages of uptake activity after incubation with CuPh relative to the uptake in the absence of CuPh and represent the mean 士 SD of at least three different experiments done in triplicate. Values that are significantly different from those of CL-EAAT1 were determined by one-way ANOVA (*P<0.05, **P<0.01).

2.3.2 EAAT1半胱氨酸突变体的转运活性下降并非分子内在功能缺陷造成

为了进一步评估这些半胱氨酸突变对EAAT1转运功能的影响,我们检测了 突变体未经CuPh处理的摄取活性。结果发现除了突变体A243C以外,V238C、 I469C、V238C/I469C 和 A243C/I469C 比 CL-EAAT1 的底物转运活性都低了 30% 以上(图2-2A)0

由于突变体膜蛋白表达量的减少和蛋白内在的转运功能缺陷都可能损害突 变体的摄取活性,因此,为鉴别突变体转运活性降低的原因,我们分析了 CL-EAAT1和其他半胱氨酸突变体的蛋白表达情况(图2-2 B)o经统计发现,与CL-EAAT1相比,A243C/I469C突变体的总蛋白表达水平略微下降,而其他突变 体的表达水平基本相同(图2-2 C)o为了进一步分析突变体的膜蛋白表达水平, 我们首先用生物素试剂孵育表达EAAT1突变体的HeLa细胞,然后用链霉亲和 素珠子分离生物素化的细胞膜蛋白组分和非生物素化的细胞浆蛋白组分,最后 再行Western blot分析。结果如图2-2 (B, D, E)所示,突变体V238C、1469C、 V238C/I469C和A243C/I469C的生物素化蛋白量明显降低,但非生物素化的胞 浆蛋白水平却与CL-EAAT1基本相同。与此一致的是,这些突变体的生物素化 蛋白与非生物素化蛋白的表达量比值也呈下降趋势(图2-2F),说明这些半胱氨 酸突变蛋白在膜蛋白的表达方面可能存在内在缺陷。通过用CL-EAAT1及上述 突变蛋白的膜蛋白表达量对它们各自的转运活性进行标准化处理,我们发现相 同蛋白量的突变体对底物的摄取活性与CL-EAAT1基本一致(图厶2 G),说明 这些突变体膜蛋白的表达减少基本可以解释蛋白活性下降的原因。换言之,上 述位点的半胱氨酸突变虽然会降低突变体的膜蛋白表达水平,但并没有影响突 变体的底物转运能力。

22•突变体蛋白表达检测

用CL-EAAT1和单点、两点半胱氨酸突变质粒转染HeLa细胞,并用转染空载质粒(SK) 的样本作为抗体特异性的阴性对照。(A)通过检测突变体对D-[3H]-天冬氨酸的摄取,分析 其转运底物的功能活性;(B)采用Western blotting方法检测总蛋白、生物素化蛋白和非生 物素化蛋白的表达水平。并以肌动蛋白Actin.细胞膜蛋白标志物Integrin和胞浆蛋白标志 物a/p-tubulin分别作为总蛋白、生物素化膜蛋白及非生物素化胞浆蛋白的内参,以此确定 生物素化和非生物素化蛋白得到了有效分离。(C・E)蛋白表达灰度值分析,分别用p-actin (C)、Integrin (D)及a/p-tubulin (E)的灰度值对突变体总蛋白、生物素化膜蛋白及非生 物素化胞浆蛋白的表达水平进行标准化处理,所得比值再与CL-EAAT1标准化后的值相比, 以百分比形式表示。(F) CL-EAAT1和突变体生物素化膜蛋白表达量与非生物素化蛋白表 达量的比值。(G)突变体的D-[3H]-天冬氨酸摄取活性与相应膜蛋白表达量的比值。所有数 值源自三次重复的独立实验,结果记为均值土 SD (n=3)o结果与CL-EAAT1比较,釆用 one-way ANO\^单因素方差分析进行分析,><0.05或**P<0.01表示具有统计学差异。 Figure 2-2. Protein expression of mutants.

HeLa cells were transfected with CL-EAAT1 and single or double cysteine mutants of CL-EAAT1. Where indicated, an empty vector (SK) was transfected as a control for antibody specificity. (A) The transport activity of the proteins was determined by measuring D-[3H]-aspartate uptake; (B) The expression of total proteins, biotinylated membrane proteins and non-biotinylated proteins was measured by western blotting with anti-EAATl antibody. Actin was also assessed as a loading control for total protein; and the internal plasma membrane marker-integrin and endogenous cytosolic protein a/p-tubulin were assessed to confirm efficient separation of biotinylated and non-biotinylated proteins; (C-E) Densitometric analysis of the total proteins, normalized to p-actin (panel C); biotinylated membrane proteins, normalized to integrin (panel D); and non-biotinylated proteins, normalized to a/p-tubulin (panel E). Each value is represented as a percentage of CL-EAAT1; (F) The ratio of the biotinylated membrane protein expression to non-biotinylated protein expression of CL-EAAT1 and mutants; (G) D-[3H]-Asp uptake activity normalized to relative cell surfece expression. Values represent the means ± SE of three different experiments done in triplicates. Values that are significantly different from that of CL-EAAT1 were determined by one-way ANOVA (*P < 0.05; "P <0.01).

2.3.3二硫苏糖醇(DTT)可逆转V238C/I469C或A243C/I469C的半胱氨酸对 交联效应对蛋白转运活性的影响

为了证明突变体V238C/I469C和A243C/I469C活性下降的原因是由于蛋白 内半胱氨酸残基间形成了二硫键,我们首先用600 gM的CuPh孵育表达突变体 的HeLa细胞,然后再加入还原剂DL■二硫苏糖醇(DL-dithiothreitoh DTT)对 细胞进行处理,结果发现突变体V238C/I469C和A243C/I469C的转运活性分别 恢复到〜50%和〜60% (图2・3A, B),这些结果表明V238C与I469C残基之间, 和A243C与I469C残基之间确实可以形成二硫键。此结果也可证明CuPh对 V238C/I469C和A243C/I469C两点突变蛋白确实具有促氧化交联的作用。 A                          V238C/I469C     B     A243C7I469C

2-3. DTTCuPh抑制效应的影响

表达 V238C/I469C (A)或 A243C/I469C (B)的 HeLa 细胞,用含或不含 600 gM CuPh 的溶液孵育5 min,再加入20 mM的DTT处理,然后检测蛋白的D-[3H]-天冬氨酸摄取活性。 结果源自三次独立的重复实验,数值以均值士 SD的方式表示。采用one-way ANOVA单因 素方差分析进行统计,*><0.01时,提示与对照组相比具有显著性差异。

Figure. 2-3. The effect of DTT on the CuPh mediated inhibition of double mutants.

HeLa cells expressing V238C/I469C (A) or A243C/I469C (B) were pre-incubated for 5 min in the presence or absence of 600 gM CuPh and then incubated with or without 20 mM DTT. D-[3H]・Asp uptake was measured. Values are shown as a percentage of the uptake in mutants without CuPh and DTT treatment and represent mean 士 SD for three independent experiments.

Values that are significantly dififerent from that of the control were determined by one-way ANOVA(*><O.Ob n=3)

234改变半胱氨酸对突变体的构象可减弱CuPh对蛋白的抑制作用

为了判断CuPh对突变蛋白转运活性的抑制是否与蛋白的变构有关,我们设 计在不同的培养条件下检测蛋白质的底物转运活性。结果发现突变体 V238C/I469C在添加L・谷氨酸后(增加转运体向内开放构象的比例)血刀,CuPh 对蛋白活性的抑制作用有所减弱,而添加TBOA后(增加转运体向外开放构象 的比例)罔,CuPh对蛋白活性的抑制作用也被减弱了(图2-4 A),而用ChCl 代替溶液中的NaCl时两种突变体的摄取活性均未受到影响。这些结果表明,半 胱氨酸残基V238C和I469C在蛋白的向外开放时相及向内开放时相都相距较远。 相比而言,只有KC1能抵抗CuPh对突变体A243C/I469C转运活性的氧化抑制 作用(注:添加KC1同样可增加转运体向内开放构象的比例)。这些结果说明半 胱氨酸残基V243C和I469C在向内开放构象中均相距较远(图2・4 B)。

2-4.不同细胞外溶液对CuPh抑制效应的影响

表达突变体V238C/I469C (A)或A243C/I469C (B)的HeLa细胞,用含或不含600

CuPh的以下其中一种细胞外介质溶液室温预孵育5 min: NaCl solutionNaCl solution +

1 mM L-glutamate^ NaCl solution 十 20 TBOA、KC1 solution 或 ChCl solution.洗涤细胞 后检测蛋白对D-[3H]-天冬氨酸的摄取活性。所有数据均以与未经CuPh处理的摄取活性的 百分比表示。数据源自三次重复的独立实验,表示为均值士 SD。采用one-way ANOVA单 因素方差分析逬行统计,当巾< 0.05或"P < 0.01时,提示与NaCl solution组相比具有显著 性差异。

Figure. 2-4. Effect of external media on the inhibition of transport activity by CuPh

HeLa cells expressing V238C/I469C (A) or A243C/I469C (B) were pre-incubated for 5 min in the presence or absence of 600 |1M CuPh. The indicated pre-incubation solutions contained NaCl solution, NaCl solution +1 mM L-glutamate, NaCl solution +20 gM TBOA, KC1 solution, and ChCl solution. After washing, D-[3H]-aspartate uptake was measured. Results represent the mean 土 SD of three experiments performed in triplicates and are given as a percentage of the transport activity of samples pre-incubated in the same medium without CuPh. Wlues that are significantly different from that of the NaCl group were determined by one-way ANOVA (*P < 0.05; **P < 0.01).

2.3.5单点半胱氨酸突变体I469C的水相通透性

鉴于本研究中两点突变体的半胱氨酸交联具有构象依赖性,我们认为蛋白 的变构也可能影响TM8a 1469位点的溶液可及性。因此,为了分析被引入的半 胱氨酸残基在1469位点的水相通透性,我们用能与蛋白表面游离的半胱氨酸残 基共价结合的两种蔬基试剂处理表达突变体I469C的HeLa细胞。其中,MESET (2-trimethylammonium ethyl methanethiosulfbnate)是非透膜的疏基试剂,只能 在细胞外表面与半胱氨酸残基上的疏基发生反应;MESEA (2-aminoethyI methanethiosulfonate)则是可透膜的蔬基试剂,在细胞膜内外都能与半胱氨酸残 基发生反应。结果发现,MTSET和MTSEA都能与突变体I469C发生反应,证 明TM8a上的1469位点应该位于细胞外表面且具有溶液可及性。另外,随着 MTSET和MTSEA浓度升高,突变体I469C的转运活性逐渐下降,并且分别在 200 MTSET和4 pM MTSEA的条件下,活性降到了 10%以下(图2-5A, B)。 然而,细胞外介质(谷氨酸、KC1和TBOA)都能保护I469C抵抗MTSET对蛋 白转运活性的抑制(图2・5 C),说明蛋白在向内开放时相或向外开放时相中, I469C残基的溶液可及性都会被减弱。相比之下,只有谷氨酸和KC1能保护I469C 抵抗MTSEA的抑制(图2-5 D),表明该位点在向内开放时相中的溶液可及性更

大。综合上述结果,我们认为转运体的不同构象对I469C残基形成二硫键的影 响也可以用该位点的溶液可及性来解释。

25.不同细胞外溶液对MTSETMTSEA抑制I469C转运活性效应的影响

MTSET (A)或MTSEA (B)对CL-EAAT1和I469C摄取Df H卜天冬氨酸活性的剂量 效应;表达I469C的HeLa细胞在含或不含100 口M MTSET (C) 或2.5 gM MTSEA (D) 及不同细胞外介质〈NaCl、NaCl+1 mM L-glUs NaCl + 20 mM TBOAs KC1、ChCl)的溶液 中预先孵育5 min,再行蛋白对DfH卜天冬氨酸的摄取活性检测。数值为所测活性与未经 MTSET或MTSEA处理的摄取活性之比,结果以百分比的形式表示。所有数据源自重复三 次的独立实验,结果表示为均值土 SD。采用one-way AN0VA单因素方差分析进行统计, 7 <0.05或0.01,提示与NaCI溶液组相比具显著性差异。

Figure* 2-5. Effect of external media on the inhibition of transport activity by MTSET and

MTSEAin I469C

Dose-response effects of MTSET (A) or MTSEA (B) on D-[3H]-Asp transport activity of CL-EAAT1 and I469C; HeLa cells expressing I469C were pre-incubated in the presence or absence of 100 yM MTSET (C) or 2.5 jxM MTSEA (D) for 5 min in different external media contained one of the following in NaCl solution, NaCl solution + 1 mM L-glutamate, NaCl solution + 20 gM TBOA, KC1 solution, ChCl solution. D-[3H]-aspartate uptake was measured. Values are shown as percentages of the uptake without MTSET or MTSEA treatment and represent the means 土 SD for at least three independent experiments. Wlues that are significantly different from that of the NaCl group were determined by one-way ANOVA (*P < 0.05; "P < 0.01).

2.4讨论

虽然真核生物和原核生物的谷氨酸转运体具有相似的结构和功能,但细菌 和哺乳动物谷氨酸转运体之间的同源序列只有35%左右【3, 6,8・10],它们的4b-4c 环则是两类转运体中差异最大的区段。如图2・6 A所示,EAATs的4b-4c环比 GItph多了 一段含50多个氨基酸残基的插入序列,这段插入被认为是真核生物谷 氨酸转运体进化的结构。然而,该环的空间结构及作用机制至今尚未完全阐 明,而2017年新破解EAATlcryst的4b-4c环也残缺不全㈣。我们之前已证明 4b・4c环与转运核心区的HP1、HP2[,]和TM7【习之间,以及与支架区的TM2[⑴之 间存在密切的空间邻近关系和相对运动关系,但是该环与TM8之间的位置变化 关系依然未知,这在一定程度上妨碍了我们对4b-4c环在蛋白变构中的作用和 意义的判断和分析。

目前己知TM8可划分为胞外区段TM8a>跨膜区段TM8b及胞浆内区段 TM8c三个部分(图2-6 B)〔叫 其中,EAAT1 TM8a区段的半胱氨酸突变可导 致蛋白转运活性的显著下降(I2]; TM8b会影响蛋白的折叠及功能的运作[叫TM8c 在转运过程中会与TM3及TM7a相互作用,另外,截除TM8c还会对蛋白的转 运功能及膜蛋白运输造成严重损害〔°叫 为了解4b・4c环与TM8之间的相互运 动关系,我们选择在TM8a或TM8b区段的不同位点和4b・4c环的V238位点及 A243位点之间设计了 26对半胱氨酸残基对。我们选择TM8a和TM8b作为半胱

2・6 GltphEAATI序列比对及EAAT1拓扑结构示意图

Gltph和EAAT1的4b-4c环(A)及TM8 (B)的氨基酸序列比对。GltPh的TM4b和TM4c 之间缺失的部分用表示。箭头分别指示的位点为EAAT1的V238、A243、1469,以及 Git珂上相应的位点:①”(代表无相应残基)、V151、T387o (C) EAAT1的膜拓扑结构,红 色圆点表示EAAT1的V238、A243和1469的大概位置。

Figure. 2-6. Sequence alignment of GItph and EAAT1 and the topology structure of EAAT1

(A), (B) Sequence alignment of the 4b-4c loop (panel A) and TM8 (panel B) of GitPh and EAAT1. The insertion in eukaryotic transporters between helices 4b and 4c is not included in GItph and is marked by “■—The arrows show residue V238 of EAAT1, which is absent in GltPh; and residues A243 and 1469 of EAAT1, which align to V151 and T387 of GltPh. (C) Representation of EAAT transmembrane topology. The red dots show the approximate locations of the following cysteine substitutions: V238, A243, and 1469 of EAAT1.

虽然突变体V238C/I469C和A243C/I469C对CuPh的氧化抑制作用非常敏 感,但单点突变体V238C、A243C> I469C以及两两共转染的单点突变体(V238C co I469C和A243C co I469C)都能抵抗CuPh对蛋白转运活性的抑制(图24 C), 说明这些突变残基间二硫键的交联发生在亚基内而非亚基间。再用DTT孵育 V238C/I469C和A243C/I469C后,两种突变体的底物摄取活性得到了一定程度 的恢复(图2・3 A, B),再一次证明两残基间确实形成了二硫键并能被DTT还 原。另外,与CL-EAAT1相比,除了突变体A243C外,其他单点突变体和两点 突变体的转运活性均明显降低(图2-2 A),然而结合膜蛋白表达的分析,我们 发现几个半胱氨酸突变体活性下降的原因主要是因为膜蛋白表达量下降,而非 蛋白转运功能的内在缺陷(图2-2 B-G)o

接着,我们又研究了不同细胞外介质对CuPh抑制突变体V238C/I469C和 A243C/I469C转运活性的影响。TBOA是谷氨酸的结构类似物,和蛋白结合的初 始位置与谷氨酸相同,只是不能被蛋白继续向内转运,因此,如果用TBOA处 理细胞,转运体向外开放构象的比例会增加叫而用谷氨酸或KC1处理细胞,转 运体的向内开放构象的比例会增加匣刀。通过比较不同介质存在的条件下蛋白的 转运活性,我们发现在胞外溶液中添加TBOA、L-谷氨酸和KC1都能帮助突变 体V238C/1469C抵抗CuPh的氧化抑制作用,说明V238C/I469C半胱氨酸对在 转运体的向外和向内开放时相中都相距较远(图2-4A)o而突变体A243C/I469C 只有KC1的处理对其转运活性具有保护作用(图2-4 B)o另外,虽然L・谷氨酸 与KC1对V238C/I469C蛋白的活性都有保护作用,但两种介质的保护效果存在 较大的差异,提示L•谷氨酸和KC1在促进蛋白变构为向内开放构象的作用机制 明显不同©我们对此的理解是细胞外用K+离子替换Nf离子时,会增加蛋白向 内开放构象的比例【⑹,但蛋白向外转运钾离子的步骤是蛋白转运周期中的限速 步骤,因而在调控转运体变构方面,KC1的作用和影响可能比L•谷氨酸更广泛。 如图2-4所示,尽管L-谷氨酸和TBOA对突变体V238C/I469C转运活性的保护 作用只有15%左右,但L•谷氨酸、TBOA或KC1的处理均可减弱CuPh的抑制 作用。相比之下,只有KC1的处理对突变体A243C/A496C的活性产生了保护性 效应。换句话说,KC1的预处理对这两种半胱氨酸对突变体都产生了确切的、可 复制的保护性作用。

另外,考虑到细胞外介质也可通过影响I469C残基的溶液可及性而遏制 CuPh对蛋白活性的抑制,我们决定验证细胞外介质是否会影响I469C残基在 TM8a±的溶液可及性。为此,我们增加了两种疏基试剂(即不透膜的MTSET 和透膜的MTSEA)对表达突变体I469C的HeLa细胞进行处理,结果发现,用 MTSET或MTSEA处理细胞后,I469C蛋白的摄取活性显著下降(图2・5 A,B), 这个结果与Amam等人的研究结果基本一致口叫接着,我们在细胞外介质中分 别添加L■谷氨酸、KC1和TBOA处理细胞,发现三种介质均可逆转MTSET对 I469C蛋白转运活性的抑制(图2-5 0,表明I469C残基在蛋白的向内、向外开 放构象中都不容易与疏基试剂接触和反应,相比之下,MTSEA对细胞处理的结 果与MESET略有不同,因为只有L■谷氨酸和KC1能遏制MTSEA的抑制作用, 提示MTSEA对I469C的可及性比MTSET更大,这些结果表明I469C残基在转 运体的向内开放时相中较难接近。另外,•与MTSET相比,MTSEA的抑制效应 被L■谷氨酸和KC1逆转的程度相对较小,如果不考虑构象改变的因素,这一现 象的原因可能与MTSET和MTSEA的分子大小差异有关,即分子较大的MTSET 对蛋白转运活性的抑制程度可能更大些。我们过去的研究结果表明,MTSET可 以接触A243C,且在DL-TBOA存在的条件下可发挥更强的抑制作用⑴,而V238 位点则位于胞外溶液可及的位置,MTSET或MTSEA对它的抑制作用都不受 TBOA、KC1或谷氨酸的影响[叭因此,综合以上结果分析,不同的细胞外介质 可减弱CuPh对蛋白的氧化抑制作用,这在一定程度上可能要归因于I469C残基 在向内和向外开放时相中溶液可及性降低,以及A243C残基在向外开放构象中 溶液可及性增加。

另一方面,在转运底物的过程中,EAAT的4b・4c环和TM8之间也可能存 在底物诱导的分子内结构重排。据报道,4b・4c环中含有构象依赖的胰蛋白酶酶 切位点,在转运过程中其构象可能会发生一定的变化【切,而这一可能性与我们 的研究结果基本一致。在Gltph的底物结合态和向外开放的晶体结构中,Gltph亚 基上的V151和L387残基(相当于EAAT1的A243和1469)的Ca-Ca距离近似, 用PyMol软件测得的结果分别为27.1 A和27.0 A;在向内开放构象中,两残基 相距较近,测得的距离为20・2 A (图2・7 A-C)o然而,我们的实验结果与这些 数据有所不同,我们分析可能是因为野生型的4b・4c环比Gltph多了 50多个氨基 酸残基(图2・7 D, E)〔©°在热稳定型的EAATlpst晶体结构上,我们发现不 管蛋白与竞争性抑制剂TFB-TBOA结合还是与L-天冬氨酸结合(相应晶体PDB ID为5MJU和5LLU), I469C与V238C或A243C间的距离均相距较远,我们 分析可能是因为EAATlcryst 4b-4c环的大多数氨基酸残基被删除了或被突变了, 因而不能准确反映4b-4c环在转运过程中的实际运动情况(图2-7 D, E)o与此 可能性一致的是,VCF和荧光共振能量转移(FRET)的实验结果提示EAAT4b-4c 环在底物转运过程中可能只发生了非常小的构象变化[闻,尽管FRET的分析不 能确切地反映谷氨酸转运体转运过程中复杂的构象变化,但通过单分子荧光共 振能量转移成像技术(SmFRET),人们还是能观察到细菌的谷氨酸转运体在转 运过程中,其转运区发生了大规模的变构活动"I。因此,原核与真核谷氨酸转 运体可能在这一点上存在某种结构性差异。此外,EAATs的4b-4c环还含有N- 糖基化位点,因此人们认为该环在谷氨酸转运体的翻译后加工过程中也可能发 挥着重要的作用卩叭

综上所述,EAAT1在转运过程中,其4b・4c环和TM8之间会发生相互靠近的 情况。因此,4b・4c环很可能在协调底物转运的过程中发挥了一定的作用,而这 一点与我们第一部分的研究结论基本上也是一致。尽管如此,EAAT蛋白的分子 作用机制与TM4区段的功能之间还有待进一步的研究。

2-7. Glgh的底物结合时相、向外开放时相、向内开放时相及EAAT1吶的底物结合时相、 TBOA结合时相结构示意图

GltPh的底物结合态(A)、向外开放时相(B)、向内开放时相(C),以及EAATlcryst 的底物结合态(D)和TBOA结合态(E)的晶体结构(相应的PDB ID分别为1XFH, 2NWW, 3KEC, 5LLU 和 5MJU),其中,TM1 (蓝色),TM2 (紫色),TM4 (青色),TM5 (绿色), TM8 (紫色)。Gltph的V151残基和L387残基相当于C1-EAAT1的A243和1469残基,图 中分别用它们的Ca■原子表示,而两种残基间的距离则用黑色虚线表示。

Figure 2-7. Substrate-binding, outward- and inward-facing structures of GltPh and substrate/TBOA-binding structures of EAATIcryst.

The crystallized substrate binding (A), outward-feeing (B), inward-fiacing (C) forms of GltPh and substrate-binding (D), TBOA-binding (E) forms of EAATICfyst are shown (respective PDB ID codes 1XFH, 2NWW, 3KBC, 5LLU, and 5MJU), aligned using the TM1 (blue), 2 (purple), 4 (light green), 5 (green) and 8 (lavender). Ca-atoms of the indicated residues V151 and L387 are equivalent to A243 and 1469 of CL-EAAT1, respectively. The distances between the two amino acids are represented by black dotted lines.

轴文献

  • Rong X, Zomot E, Zhang X, et al. Investigating substrate-induced motion between the scaffold and transport domains in the glutamate transporter EAAT1[J]・ Mol Pharmacol. 2014, 86(6): 657-664.
  • Zhang W, Zhang X, Qu S. Substrate-Induced Motion between TM4 and TM7 of

the Glutamate Transporter EAAT1 Revealed by Paired Cysteine Mutagenesis[J]. Mol Pharmacol. 2019, 95(1): 33・42.

  • Slotboom D J, Konings W N, Lolkema J S. Structural features of the glutamate

transporter family[J]. Microbiol Mol Biol Rev. 1999, 63(2): 293-307.

  • Groeneveld M, Slotboom D J. Rigidity of the subunit interfaces of the trimeric glutamate transporter GltT during translocation[J]. J Mol Biol, 2007, 372(3): 565-570.
  • Hanelt I, Wunnicke D, Bordignon E, et al. Conformational heterogeneity of the

aspartate transporter Glt(Ph)[JJ. Nat Struct Mol Biol. 2013, 20(2): 210-214.

  • Reyes N, Ginter C, Boudker O・ Transport mechanism of a bacterial homologue

of glutamate transporters[J]. Nature. 2009, 462(7275): 880-885.

  • Shlaifer I, Kanner B I. Confbrmationally sensitive reactivity to permeant sulfhydryl reagents of cysteine residues engineered into helical hairpin 1 of the glutamate transporter GLT-1[J]. Mol Pharmacol. 2007, 71(5): 1341-134&
  • Boudker O, Ryan R M, Yemool D, et al. Coupling substrate and ion binding to

extracellular gate of a sodium-dependent aspartate transporter[JJ. Nature・ 2007, 445(7126):387-393.

  • Yemool D, Boudker O, Jin Y, et al. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii[J]. Nature. 2004,431(7010): 811-81 &
  • Canul-Tec J C, Assal R, Cirri E, et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1 [J]. Nature. 2017, 544(7651): 446-451.
  • Rong X, Tan F, Wu X, et al. TM4 of the glutamate transporter GLT-1 experiences substrate-induced motion during the transport cycle[J]. Sci Rep.

2016,6:34522.

  • Seal R P, Leighton B H, Amara S G. A model for the topology of excitatoiy amino acid transporters determined by the extracellular accessibility of substituted cysteines[J]. Neuron. 2000, 25(3): 695-706.
  • Leinenweber A, Machtens J P, Begemann B, et al. Regulation of glial glutamate

transporters by C-terminal domains [J]. J Biol Chem. 2011,286(3): 1927-1937.

  • Leighton B H, Seal R P, Watts S D, et aL Structural rearrangements at the translocation pore of the human glutamate transporter, EAAT1 [J]. J Biol Chem. 2006, 281(40): 29788-29796.
  • Zhang W, Zhang X, Qu S. Cysteine Scanning Mutagenesis of TM4b-4c Loop of

Glutamate Transporter EAAT1 Reveals Three Conformationally Sensitive Residues]!]. Mol Pharmacol. 201& 94(1): 713-721.

  • Bergles D E, Tzingounis A V, Jahr C E. Comparison of coupled and uncoupled

currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters [J]. J Neurosci. 2002, 22(23): 10153-10162.

  • Grunewald M, Kanner B. Conformational changes monitored on the glutamate transporter GLT-1 indicate the existence of two neurotransmitter-bound states[J]. J Biol Chem. 1995, 270(28): 17017-17024.
  • Koch H P, Hubbard J M, Larsson H P. Voltage-independent sodium-binding events reported by the 4B-4C loop in the human glutamate transporter excitatory amino acid transporter 3[J]. J Biol Chem. 2007, 282(34): 24547-24553・
  • Akyuz N, Altman R B, Blanchard S C, et al. Transport dynamics in a glutamate

transporter homologue[J]・ Nature. 2013, 502(7469): 114-11 &

全文总结

哺乳动物的谷氨酸转运体在预防神经系统的谷氨酸毒性方面发挥着非常重 要的作用,其结构和功能的异常可能参与了多种神经变性性疾病的发生和发展 过程。虽然人源EAAF1的晶体结构已破解,但其柔性环部分的结构信息我们依 然知之甚少。由于EAATs的4b4c环与蛋白的糖基化修饰、多聚化、亚细胞定位 及蛋白变构方面都有密切的关系,但该环的具体作用机制至今尚未完全阐明, 因此,为了探讨EAAT1的4b-4c环是否参与协调底物转运及蛋白的空间变构,我 们进行了以下两部分的研究。

1.丙氨酸扫描突变鉴定EAAT1 4b-4c环上的关键氨基酸残基

EAAT1的4b-4c环共有57个氨基酸残基,为了探查4b・4c环上是否存在影 响蛋白转运活性的关键氨基酸残基,我们采用丙氨酸扫描突变的方法对环上的 氨基酸残基逐一进行筛查。结果发现,与野生型EAATI相比,大部分的丙氨酸 突变体仍能保留60%以上的底物摄取活性,但突变体T192A、Y194A、N242A 及G245A的摄取活性显著降低。于是,我们选择对这四个位点的氨基酸残基做 了进一步的分析。首先,我们采用相似氨基酸替换的策略对T192、Y194、N242 及G245四个位点进行了额外突变,继而检测额外突变体T192S、Y194F、N242Q、 N242D、G245P及G245V的转运活性,结果发现突变体T192S及Y194F的转运 活性获得较大程度的恢复;N242D的转运活性比其相应的丙氨酸突变体略高; 其余突变体的转运活性均无改善。接着,我们又用生物素化标记技术及免疫印 迹实验对突变体的膜蛋白表达水平进行分析,结果发现T192及Y194是保证 EAAT1正常膜蛋白表达水平所必需的氨基酸残基,而保守残基替换后,额外突 变体的膜蛋白表达结果证明T192侧链上的轻基及Y194侧链上的苯环应该是影 响EAAT1膜蛋白水平的关键基团;相比之下,N242及G245残基对于蛋白的转 运活性而言是不可替代的。此外,我们还分析了突变体T192A、Y194A、N242A、 G245A、T192S、Y194F 及 N242D 的动力学参数,结果发现 T192、Y194、N242 及G245位点的残基对蛋白的底物最大结合能力及动力学参数均具有显著的影 响,它们都能明显改变蛋白的动力学特性。综合上述结果分析,我们认为T192 及¥194是保证EAAT1膜蛋白表达水平的两个关键氨基酸残基;N242可能非常 接近底物转运通道,且对底物的结合和转运可能有正协同作用;G245则可能是 支持转运区关键局部实现大幅度变构的关键节点,因而均与蛋白的动力学特性 密切相关。

  1. EAAT1 4b-4c环与TM8在转运周期中的相对运动

谷氨酸转运体的转运核心区由HP1、HP2、TM7和TM8共同构成,过去, 我们已证明EAAT1的HP1、HP2及TM7在转运过程中会与TM4相互靠近,提 示TM4与转运核心区的变构活动之间关联紧密。由于TM4与TM8之间的相互 运动关系尚不清楚,因此,TM4与转运核心区的互动关系无法得到全面的评估。 为探明EAAT1的TM4与TM8之间的相互运动关系,我们分别在CL-EAAT1 4b-4c环的V238、A243位点与TM8a或TM8b区段上的不同位点间分别构建了 26对半胱氨酸对。经研究发现,当突变体V238C/I469C和A243C/I469C暴露于 氧化剂CuPh时,突变体的底物转运活性被显著抑制,但单点突变体V238C> A243C和I469C以及两两共转染的单点突变体的转运活性均不受CuPh的影响, 证明4b-4c环上的V238C和A243C残基仅在单体内与TM8a上的I469C残基发 生了半胱氨酸交联。接着,为了进一步评估这些半胱氨酸突变是否会影响EAAT1 的底物转运能力,我们又检测了半胱氨酸突变体在未经CuPh处理条件下的底物 转运活性以及它们的膜蛋白表达水平,结果发现这些突变体的膜蛋白表达水平 明显降低,但突变蛋白本身并没有内在的转运功能缺陷。随后,我们先用CuPh 孵育He"细胞,再用还原剂DL■二硫苏糖醇(DTT)对细胞进行处理,结果发 现突变体V238C/I469C和A243C/I469C的转运活性分别恢复到了〜50%和〜60%, 说明V238C与I469C之间以及A243C与I469C之间确实形成了二硫键。然后, 在表达突变体V238C/I469C和A243C/I469C的HeLa细胞培养基中,我们分别 添加不同细胞外介质(L•谷氨酸、TBOA、KC1或ChCl)以增加蛋白的向内或向 外开放构象比例,进而通过检测蛋白的底物摄取活性,分析不同时相中半胱氨 酸残基对之间是否能形成交联,从而判断残基间距离的远近,结果发现V238C 和I469C残基在蛋白的向外和向内开放时相中均相距较远,而V243C和I469C 残基则仅在向内开放时相中相互远离。此外,残基是否暴露于溶液也会影响残 基间二硫键的形成,因此,我们还分析了 I469C残基的水相通透性,结果发现 转运体的不同构象与I469C残基的水相通透性也密切相关。

综上所述,我们鉴定了 EAAT1 4b・4c环上四个显著影响底物转运的关键氨 基酸残基(T192、Y194、N242及G245),发现T192、Y194可能影响蛋白上膜, N242可能对底物的结合有正协同作用,G245可能支持蛋白关键区段的局部变 构,虽然四残基的作用有所不同,但它们对EAAT1蛋白的动力学特征均有重要 的贡献。接着,我们还证明了 EAAT1的TM8a在转运过程中与4b-4c环会出现 相互靠近的情况,从而揭示了 4b・4c环与转运核心区之间存在着涉及范围更广的 互动关系,而这一结果提示EAAT4bMc环的部分区段很可能也参与底物诱导的 变构,并在核心转运区的运动过程中提供了非常重要的协调和支持作用。总的 来说,本研究所获结果为更好地阐明谷氨酸转运体的结构和功能关系做了必要 的补充,而在分子机制上也为解释EAAT蛋白的转运过程提供了一定的理论基 础。