压力应激导致血糖代谢紊乱的中枢神经环路机制论文

2020年7月10日16:54:18压力应激导致血糖代谢紊乱的中枢神经环路机制论文已关闭评论

压力应激导致血糖代谢紊乱的中枢神经环路机制论文

摘要

中枢神经环路与外周器官、组织协同作用,控制生命体的生理、代谢反 应。中枢神经系统启动的应激反应,需要外周器官、组织提供及时准确的反应 才能帮助动物抵抗恶劣环境,保护自己的生命;这些反应包括自主神经系统活 动、内分泌系统活动以及焦虑情绪等行为学的改变。在急性应激条件下,中枢 神经环路招募各个神经核团以及神经环路产生焦虑行为躲避危险环境,调用基 础血糖升高为应激反应提供能量以及调控应激激素的合成、释放维持应激反 应。在长期应激条件下,动物行为、生理和代谢系统被长期激活,导致动物焦 虑、II型糖尿病以及骨质疏松等疾病。在本研究中,我们探索了压力应激后, 基础血糖和基础代谢的变化;压力应激导致基础血糖变化的中枢神经环路机 制;压力应激导致焦虑情绪反应的中枢神经环路机制;压力应激后,导致骨质 疏松的神经环路机制等。

压力应激扰乱啮齿类动物基础血糖的波动

基础血糖是评估血糖代谢和诊断糖尿病的重要指标。在生理状态下,基础 血糖受到日常活动和外界刺激的影响,处于动态平衡中,并且保持昼夜节律。 压力应激可以导致血糖升高,然而压力应激如何影响基础血糖的波动却并不清 楚。通过持续监测生理状态下小鼠的基础血糖,我们发现采血操作和轻体重引 起小鼠基础血糖波动增加。24小时持续监测基础血糖浓度,我们发现基础血糖 严格地遵循昼夜节律;而给予压力应激刺激时,基础血糖的昼夜节律受损;持 续压力应激刺激后,基础血糖的昼夜节律仍然没有恢复。我们的研究表明急性 压力应激导致小鼠基础血糖的不规则波动增大,相对长期的压力应激导致基础 血糖的昼夜节律会改变。该研究结果,为压力应激刺激导致的基础血糖紊乱机 制提供了新视角,为临床诊断糖代谢紊乱、二型糖尿病等提供了新的可能的诊 断指标。

纹状体床核前侧中Y •氨基丁酸投射到弓状核的神经环路介导应激反应

压力应激刺激导致焦虑情绪以及内分泌变化。中枢神经系统中多个脑区的 多种神经元以及神经环路,参与压力应激反应的调控。前人研究指出,纹状体 床核(The bed nucleus of the stria terminalis, BNST)参与压力应激反应调控;然而, 纹状体床核中Y ■氨基丁酸能神经元(GABAergic)以及钙依赖的蛋白激酶 II(CaMKII)标记的神经元以及其神经环路,如何参与压力应激调控仍没有被完 全阐释。在本研究中,我们用光遗传手段操纵纹状体床核前侧中的GABAergic 神经元以及CaMKII标记的神经元以及神经环路,检测在光遗传学刺激过程中小 鼠的焦虑样行为以及应激激素的变化。发现在激活aBNST投射到弓状核(Solitary nucleus, ARC)的GABAergic神经环路会导致小鼠出现明显的焦虑样行为,且皮 质酮、肾上腺素、去甲肾上腺素等应激激素水平都升高。光遗传学抑制aBNST 投射到ARC的GABAergic神经环路,导致小鼠产生抗焦虑行为且逆转由于束缚 应激导致的皮质酮、去甲肾上腺素以及肾上腺素水平的升高。用药遗传学抑制 弓状核到孤束核(Solitary tract, NTS)的GABAergic神经环路后,再用光遗传学激 活aBNST到NTS的GABAergic神经环路,未看到小鼠有焦虑样行为。该研究结 果表明,ARC到NTS的GABAergic神经环路介导由aBNST到ARC的GABAergic 神经元激活产生的焦虑样行为。该研究为进一步阐述应激反应中焦虑行为的分 子机制奠定了基础,为治疗应激刺激导致的焦虑情绪障碍提供了可能的治疗靶 点。

介导压力应激反应的Y •氨基丁酸能神经环路介导高血糖反应

压力应激如何调用基础血糖为应激反应提供能量?本研究中,我们用光遗 传学方法激活aBNST中的GABAergic神经元导致急性高血糖反应,而激活或者 抑制CaMKII标记的神经元不会引起急性血糖的变化,激活aBNST中谷氨酸能神 经元(Glutamatergic)也不能导致急性血糖变化。激活aBNST中Glutamatergic到下 丘脑腹内侧核(Ventromedial hypothalamus, VMH)的神经回路,未能直接引起基 础血糖的变化。但是aBNST投射至血糖调控中枢ARC的GABAergic神经环路的 激活,引起急性高血糖反应;在切除肾上腺后,该神经环路的激活仍引起高血 糖反应;该结果揭示了介导压力应激反应的aBNST至ARC的GABAergic神经环 路,通过交感神经系统调用血糖为应激反应提供能量。用药物遗传学特异性抑 制ARC投射到中缝核(Raphe obscurus nucleus, ROb)的GABAergic神经回路后,再 激活aBNST投射至ARC的GABAergic神经环路,导致基础血糖水平迅速下降, 表明ARC到ROb的GABAergic神经回路介导压力应激导致的高血糖反应。综合 以上结果,我们发现了一条自上而下的Y ■氨基丁酸能神经环路,介导压力应激 下,基础血糖调用的神经环路机制。该研究为进一步研究神经环路调控胰岛功 能奠定基础,为治疗压力应激导致的血糖紊乱提供了重要的靶核团。

压力应激导致的基础代谢失衡的神经环路机制

长期过度的压力导致代谢紊乱,例如导致肥胖、导致体重减轻、导致骨质 疏松等。在本研究中,我们探索了压力应激导致骨质疏松的神经机制。我们给 小鼠长期的压力应激刺激后,检测小鼠胫骨骨量的变化,发现与对照组相比小 鼠的平均骨量比对照组明显减少。药物遗传学抑制BNST中的生长抑素 (Somatostatin, SST/SOM)标记的神经元能逆转压力应激刺激导致的骨质疏松;进 一步探索到,交感神经系统分泌的去甲肾上腺素抑制骨髓间充质干细胞分化成 成骨细胞。综上结果,纹状体床核前侧中生长抑素神经元介导压力应激刺激导 致的骨质疏松,且在外周神经系统中,通过交感神经系统抑制骨髓间充质干细 胞分化成成骨细胞来减少成骨,导致骨质疏松。该研究为压力应激导致的骨质 疏松找到了可能的治疗靶点,为进一步探索中枢神经换环路调控骨代谢奠定基 础。

关键词:纹状体床核,弓状核中缝,核血糖焦虑

Abstract

The central nervous system combined with the organs and tissues peripheral to control the physiological and metabolic reactions of the living body. The stress response initiated by the central nervous system requires peripheral organs and tissues to provide timely and accurate responses to help animals resist harsh environments and protect their lives; these reactions include autonomic nervous system activity, endocrine system activity, and anxiety. During acute stress response, the central nervous system recruits various nerve nuclei and neural circuits to generate anxiety behaviors to avoid dangerous environments, calls for elevated basal blood glucose to provide energy for stress response, and regulates the release of stress hormones to maintain stress reaction. Underlying long-term stress circumstances, behavior, physiology, and metabolism are disrupted, animal suffering from anxiety, type 2 diabetes, and osteoporosis. In this study we explored the changes in basal blood glucose and basal metabolism after stress stimulation; the central nervous system mechanism of stress-induced anxiety responses; the central nervous system mechanism of stress-induced basal blood glucose changes; the nervous system mechanism of stress-induced osteoporosis.

Stress disrupts fluctuations in basic blood glucose in rodents

Basic blood glucose is an important indicator for assessing blood glucose metabolism and diagnosing diabetes. Under physiological conditions, the basic blood sugar is affected by daily activities and external stimuli, is in a dynamic balance, and maintains a circadian rhythm. Stress can lead to elevated blood sugar, but how stress affects fluctuations in basal blood glucose is unclear. By continuously monitoring the basal blood glucose of mice under physiological conditions, we found that blood collection operations and light body weight caused an increase in basal blood glucose fluctuations in mice. Continuous monitoring of basal blood glucose levels for 24 hours, we found that basal blood glucose strictly follows the circadian rhythm; when given stress stimulation, the basal blood glucose circadian rhythm is impaired; after three days of stress stimulation, the circadian rhythm of basal blood glucose is still not restore. It is proved that acute stress leads to an increase in irregular fluctuations in basal blood glucose in mice, and relatively long-term stress causes an irreversible

change in the circadian rhythm of basal blood glucose in mice. The results of this study provide a new perspective for the mechanism of blood glucose disorders caused by stress stimulation, and provide possible indicators for clinical diagnosis of glucose metabolism disorders and type 2 diabetes.

The GABAergic neural circuit from the aBNST to the ARC mediates stress response

Stress stimulation elicits anxiety and endocrinal function changes. A set of overlapping neurocircuits mediate the behavioral and endocrinal components of the stress responses. Previous studies have shown that the aBNST is involved in stress response; however, How the GABAergic neurons and the calcium-dependent protein kinase II (CaMKII)-labeled neurons and neural circuits in the aBNST to participate the stress regulation has not been clearly explained. In this study, we used optogenetic technique to manipulate the GABAergic neurons and CaMKII neurons in the aBNST to study anxiety-like behavior and stress hormones in mice. We found that the activation of GABAergic projecting from the aBNST to the ARC mediates anxiety­like behavior, and elevated levels of stress hormones such as corticosterone and adrenaline. Optogenetics inhibits the GABAergic projecting from the aBNST to the ARC produced anxiolytic behavior in mice and reversing the increasing of the corticosterone and norepinephrine due to restraint stress. Pharmacogenetics inhibits the GABAergic pathway from the arcuate nucleus (ARC) to the solitary tract nucleus (NTS) and then, activates the GABAergic projecting from the aBNST to the ARC by optogenetics, mice show no anxiety-like behavior. The results of this study suggest that the GABAergic pathway from the ARC to the NTS mediates the transfer of anxiety-like behavior information, produced by activation of the GABAergic projecting from the aBNST to the ARC. This study lays the foundation for further elucidating the sub-type neurons mechanism of anxiety behavior in stress response and provides a potential therapeutic target for the treatment of anxiety caused by stress anxiety.

GABAergic neural circuit mediated stress response mediated hyperglycemia

How does stress call for increasing of basal blood sugar called? In this study, we used optogenetic to manipulate GABAergic and CaMKII neurons in the aBNST. We found that activation of GABAergic neurons of the aBNST lead to hyperglycemia,while CaMKII inhibition or activation do not changes the blood glucose, and activation of glutamatergic neurons in the aBNST does not affect acute glycemic. Activation of the glutamatergic neural pathway from the aBNST to the VMH failed to directly change the basal blood glucose, but induced a delayed hyperglycemia. However, activation of the GABAergic neural circuits from aBNST to the ARC causes acute hyperglycemia; After removal of the adrenal gland, activation of the GABAergic pathway from the aBNST to the ARC still elicits hyperglycemia; After pharmacogenetics specifically inhibits the GABAergic projection from the ARC to the Raphe Obscurus (ROb), the activation of the GABAergic pathway from the aBNST to the ARC causes a rapid decline in basal blood glucose levels. This result reveals a GABAergic pathway of the aBNST-ARC mediates calling for blood glucose to provide energy for the stress response. This study lays the foundation for further study of the regulation of islet function by the neural circuit and provides an important target nucleus for the treatment ofblood glucose disorders caused by stress.

Stress affects bone metabolism by activating the sympathetic nervous system

Long-term excessive stress leads to metabolic disorders, such as obesity, weight loss, and osteoporosis. In this study, we explored the neural mechanisms underlying stress-induced osteoporosis. We tested the changes in the amount of tibia bone after long-term stress stimulation in mice. It was found that the average bone mass of the mice was significantly lower as compared with the control group. Pharmacogenetics inhibits somatostatin-labeled neurons in the aBNST reverse bone loss caused by stress; In further exploration, the norepinephrine secreted by the sympathetic nervous system inhibits differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblast. This study found a possible therapeutic target for bone loss caused by stress, and laid the foundation for further exploration of central nervous system to regulate bone metabolism.

Key Words: Bed Nucleus of the Stria terminalis, Arcuate Nucleus, Raphe Obscurus Nucleus, Blood Glucose, Anxiety

1.1背景知识 1.1.2压力应激

压力应激反应也被称为“攻击或者逃避''反应,是动物趋利避害的一种自我保 护机制。在应激反应中,情绪、行为以及内分泌等系统被调用为动物抵御或者逃 离恶劣环境提供情绪、行为以及能量的支持(图1.1) [l]o具体来说,在压力应激 下,基础血糖升高为动物抵御恶劣环境提供足够能量;焦虑样行为让动物逃避危 险环境[2];应激激素升高使心跳加快、汗液分泌等调动全身器官应对应激刺激, 让动物维持应激状态[3, 4]o长期高强度的压力,例如长久担忧失业、通宵工作等 都是过度的压力应激。这种高强度的压力应激会导致机体出现情绪障碍、代谢类 疾病等。因此,对于解释压力应激的神经环路机制,以及压力应激下情绪以及生 理、内分泌反应的机制对于寻找治疗由于压力应激导致的各种慢性疾病的药物非 常重要。压力应激反应被认为是机体受到应激刺激后,中枢神经系统启动一系列反应

1.1.2.1压力应激反应的神经环路机制

来应对这些内外刺激的过程。目前认为,压力应激反应是由下丘脑(Hypothalamus) 启动,通过神经冲动传导到外周神经系统以及神经■内分泌接头处,控制身体各个 器官、组织响应应激反应。在神经控制的压力刺激反应中,下丘脑的室旁核 (Paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN)被激活[5],招募大脑多个脑区启 动压力应激反应[6]。压力应激信号在被传导出颅后,通过交感神经系统分泌去甲 肾上腺素直接作用于效应器官,启动快速的行为、内分泌以及生理反应对压力应 激刺激做出反应(图1.2)⑺;在内分泌控制的压力刺激反应中,下丘脑室旁核启 动应激反应后,经过下丘脑■垂体■肾上腺轴,分泌应激激素[8, 9],控制器官和组 织对压力应激刺激做出慢速、持久的反应。

12压力刺激中大脑启动快速和慢速的应激反应

(E. Ron de kloet, Nature Reviews Neuroscience, 2005)

在中枢神经系统中,多个脑区被探明参与压力应激反应的调控(图1.3)

  • o如果压力刺激机体外周,应激信号会通过外周感觉神经系统传输到脑干核 团,例如孤束核(The solitary tract, NTS)[11],孤束核将压力应激调控信号输送到 下丘脑室旁核。在PVN脑区,压力应激刺激信号被整合后,发出调控信号[12, 13] 到下游核团。其中,蓝斑(The locus coeruleus, LC)以及腹外侧延髓(The ventrolateral medulla, VLM)作为交感神经的节前核团介导来自孤束核和下丘脑室 旁核发出的应激调控信号下行到外周器官、组织[14-17];迷走神经背外侧运动核 (The dorsal motor nucleus of the vagus nerve, DMX) [18]和疑核(Ambiguous nucleus, NA)作为副交感神经系统的节前核团[19],在应激刺激中被下丘脑室旁核所抑 制。大脑稳态被改变时所产生的应激刺激,会直接激活下丘脑室旁核或者纹状体 床核[20-23],启动应激反应。此时,调控应激反应的信号将会经过众多脑区下行 到外周的效应器官。其中,介导应激反应调控信号的脑区被研究的不是很透彻。 例如,用遗传学操纵海马(Hippcampus)、前额叶皮层(The medial prefrontal cortex, mPFC)([24・26]以及杏仁核(Amygdala),可以检测到自主神经系统活动的变化,表 现为心率、血压、应激激素的变化等[27-30]o然而以上核团是如何参与压力应激 反应?目前为止,还是存在很大争议。

图1・3整合压力应激的神经环路

(Yvonne M・ Ulrich-Lai et al, Nature Reviews Neuroscience, 2013)

值得关注的是,长期的压力应激后导致机体对于应激刺激做出过度的反应。 这种过度的反应往往会导致动物的焦虑、抑郁等情绪障碍[31];导致前驱性高血 糖以及糖尿病[32, 33];导致骨质疏松[34]等等一系列慢性疾病。世界卫生组织公 布的数据称,在1990年到2013年全球患有焦虑抑郁的人数增加了50%;糖尿病人 数增加到4.22亿人,还有半数没有被统计。糖尿病、精神障碍等慢性疾病对卫生 系统和预算造成很大负担[35]o除此之外,压力应激造成的代谢类疾病也不容忽 视[36]o因此,压力应激作为精神障碍和高血糖等慢性疾病的致病因素,探索其
致病机制尤为重要。

1.1.2.2压力应激导致焦虑行为

焦虑是压力应激反应中最重要的行为表型[37]o急性的焦虑状态可以让动物 逃离或者改善不良环境;长期的焦虑状态可以蓄积能量,在危险环境再一次到来 时可以立即做出应对。然而,长期的压力应激导致的焦虑行为是一种情绪障碍疾 病[38],研究其机理对于治疗压力应激导致的焦虑障碍很重要。

在大脑中,有许多脑区参与焦虑行为的调控(图1.4).边缘系统中的杏仁核 (Amygdala)和下丘脑是调控应激■焦虑行为的两大重要脑区[39-41]o杏仁核和下丘 脑核团整合大脑其他脑区的焦虑信息发出调控信号给下游核团,进行焦虑行为的 调控[42-44]o光遗传激活杏仁核到纹状体床核前侧的CaMKII+神经投射产生焦虑 样行为[45],光遗传激活下丘脑腹内侧核团导致小鼠产生逃避反应[46]。除杏仁核 以及下丘脑外,核磁共振扫描发现,在焦虑病人中纹状体床核前侧活动增强 [47];光遗传激活纹状体床核前侧投射到外侧下丘脑、下丘脑腹侧被盖核团的神 经环路,分别导致焦虑行为中的不同表型,包括条件性位置偏好、厌恶行为等[45, 4& 49]。光激活蓝斑中的去甲肾上腺素能神经元导致小鼠在十字高架迷宫开放 臂、以及旷场中心区域中探索时间下降,即产生焦虑样行为[50],证明多个脑区 参与应激■焦虑行为的调控。

(Facial paq (Spinal Fl eflex expression) (Defense Startle) (Endocrine Analgesia) TACTH)

14大脑中调控焦虑行为的神经核团和神经环路

(M.J. Millan et al. Progress in Neurobiology, 2003)

综上可见,多个脑区中的多种神经元类型构成复杂的神经网络在调控焦虑行 为。然而在压力应激下,哪个脑区参与焦虑行为的调控研究仍不明确。

1.1.2.3压力应激导致高血糖反应

压力应激导致II型糖尿病的频发,导致糖尿病患者的预后管理效果差[51, 52]。但是对压力应激导致高血糖反应的神经机制的研究积累并不多,近年来这一 研究突飞猛进。例如,腹外侧延髓中儿茶酚胺类神经元的敲除,导致应激刺激下 高血糖反应的消失[53];光遗传激活下丘脑室旁核的谷氨酸能神经元导致小鼠基 础血糖升高[53];下丘脑腹内侧核团SF・1神经元的激活导致急性高血糖反应,同 时伴随有强烈的防御行为[54, 55]o进一步研究压力应激导致高血糖反应的神经机 制很必要。

1.1.2.4压力应激影响代谢

压力应激导致心血管疾病、骨质疏松等代谢类疾病[36]o有研究证明,经历 过地震等巨大变故的人,有心血管等慢性代谢类疾病的概率比较大;在年轻时, 经历过繁重工作压力的人也容易患心血管疾病

1.1.2.5压力应激影响体温调控

正常情况下,机体的体温维持在一定范围内;过高或者过低的体温都会导致 机体功能减弱甚至丧失。体温的调控中枢核团在视前区(Preoptic area, POA),光遗 传激活视前区中的Y ■氨基丁酸能神经元导致小鼠体温降低,而抑制Y ■氨基丁酸 能神经元导致小鼠体温升高[58]; 2015年发表在Science的研究成果,进一步挖掘出 视前区中的TRPM(Traiisieiit receptor potential melastatin)通道蛋白可以控制机体的体 温,即光遗传调控视前区中的TRPM通道可以控制小鼠体温的变化[59]。视前区 神经元投射到下丘脑视交叉上核(Suprachiasmatic nucleus, SCN)的Y ■氨基丁酸能神 经纤维被重塑会导致动物体温节律消失。

1.1.3焦虑行为的调控

1.1.3.1 焦虑

焦虑是指对未发生的事情莫名的担忧并伴随有心率加快、内分泌改变等一系 列情绪活动的变化,更多的是主体展示出对未来威胁的期待。与压力应激中主体 展示出“战斗和逃跑沖勺自主神经觉醒和逃跑行为不同;焦虑展示出主体对未来危 险做准备的回避、警觉等行为[60]o

1.1.3.2焦虑障碍

焦虑障碍是指主体对未来威胁多度的害怕以及担忧,甚至是对假想中的威胁 做出过度反应,焦虑比压力应激反应持续更久。2017年,世界卫生组织披露的数 据指出,1999年到2013年抑郁焦虑症病人增加了50%.抑郁焦虑症导致每年超过一 万亿美元的经济损失。因此,研究焦虑症的发病机制对于治疗焦虑症至关重要。 解析焦虑症的神经环路机制,目前最常用的模式动物是啮齿类动物,以及非人灵 长类。为模拟人类的焦虑障碍状态,科学家在大小鼠和猴子上,设计出多种焦虑 模型。这些模型帮助科学家理解焦虑的发病机制以及治疗方案。

1.1.3.3焦虑模型

Charles Darwin在动物和人类表达情感的方式是一样的,因此我们常常用动物 模型来研究情感的发生过程以及治疗情感药物的药效。在研究过程中,我们首先 要解决的问题是造模问题,即如何快速有效地造成啮齿类动物的焦虑[61]o根据 动物焦虑原因不同,将焦虑分成两类,一类是非条件性的焦虑;另一类是条件性 焦虑模型。

非条件性焦虑模型是在实验室室内模拟啮齿类动物在自然环境中遇到的刺 激,让动物尽可能展示出在自然环境中遇到刺激时候的作出的反应。Montgomery 首次将大鼠放在一闭合、两开放臂的Y迷宫中。理想条件下,在实验环境一致的 情况下,大鼠在每个臂中探索的时间应该是一致的。然而实验结果并非如此,发 现大鼠更偏向于在闭合臂中探索。原因是开放臂存在威胁大鼠生存的安全隐患, 因此大大降低大鼠探索开放臂的时间和次数;此外,对整个迷宫的熟悉程度,大 鼠在实验时候的状态以及整个环境的复杂度都会影响大鼠在开放臂和闭合臂之间 探索的时间和次数。

Handley & Mithani首次提出用高架十字迷宫作为检测动物焦虑模型的器具, 后来File验证这个模型的有效性。高架迷宫是一个高于地面的器具,有两条闭合 臂垂直地与两条闭合臂相对[62-64]o检测中,大鼠会躲避不受保护的,明亮的地 方,因此更偏向于躲避去开放臂探索的时间。大鼠在开放臂探索,会诱发生理性 应激反应,从而造成焦虑。

基于高架十字迷宫,设计了 迷宫,一半是开放臂一半是闭合臂,检测 原理和参数与高架十字迷宫类似[65]。以及迷宫[66, 67]o

1962年,Boissiex和Simon首次提出用钻孔实验测试小鼠的焦虑行为。在四方 的一个盒子地板上刻四个洞,能容许动物的头钻出来。测试动物在试验时间内, 探头次数以及钻头时间[68-70] o

File & Hyde提出,社会交互实验可以检测动物的焦虑行为(File, 1978 #466).将 动物放在一起,统计动物之间接触的时间和次数。

1980年,Crawley & Goodwin提出,用暗■亮箱检测小鼠的焦虑行为。暗■亮箱 是由暗场和亮场两个箱子构成,将动物放在两个箱子中间,检测动物分别在两个 箱子之间探索的时间和次数。

1934年,Hall提出新环境会影响动物进食。第一天将动物禁食24小时,第二 天将动物放在有食物的长方形笼子里,在食物处给一束很强的光,检测动物去寻 找食物的时间和次数[71, 72]o

条件性焦虑模型是指动物在受到环境改变刺激时候,做出的自发反应[73]o 环境刺激可以是积极的;也可以是负性的,比如是巴甫洛夫实验[74]。

条件性恐惧实验,在刺激期间,给动物光、声音或者其他信号之后,再给动 物足底电刺激;在检测时候,给条件刺激检测动物冻结行为、自主神经系统活动 以及内分泌变化等[75, 76] o

天敌捕食模型,将动物暴露于有天敌的环境,或者有天敌气味、声音的环境 中,检测动物呆板行为或者生殖等其他行为[77, 78]o以上的动物模型为我们研究 焦虑行为的神经环路机制提供了多种模型。

1.1.3.4焦虑的神经机制

同一脑区中不同类型的神经元在焦虑行为调控中起到不同作用。焦虑行为 下,发现海马、杏仁核中的Y ■氨基丁酸能神经元被抑制[79];蓝斑核团中Y ■氨基 丁酸能神经元能够抑制其中的去甲肾上腺素能神经元调控焦虑行为[80];激活中 缝核中的5■瓮色胺能神经元导致焦虑行为的发生[81, 82];光遗传激活纹状体床核 中Y ■氨基丁酸能神经元投射到下丘脑腹侧被盖核中的Y ■氨基丁酸能神经元介导 焦虑反应[49];杏仁核中谷氨酸能神经元的激活导致小鼠在高架十字迷宫中,在 开放臂探索时间下降[48],表明产生了焦虑行为;激活纹状体床核前侧中的多巴 胺能神经元,导致小鼠在旷场测试中在中心区域探索的时间明显下降[83]o压力 应激后,多巴胺mRNA表达发生改变[84,85]。

1.1.4血糖代谢的调控

葡萄糖是机体维持生命的直接能量来源。在正常生理状态下,受到运动、饮 食、睡眠以及情感状态等日常活动的影响[86, 87];或者在外界压力、缺氧等剧烈 环境改变刺激下,血糖会出现短暂可逆的波动。在病理状态下,血糖处于不受控 制的状态,长期的高血糖称为糖尿病,高血糖对器官有不可逆的损伤;而短期的 低血糖状态会直接导致大脑由于供能不足出现不可逆的神经细胞损伤,而且低能 状态影响神经控制下的生物过程包括自我控制和决策等[88]o在动物中,葡萄糖 是大脑的唯一能量来源。

1.1.4.1葡萄糖的来源以及功能

1947年,Andreas Marggraf第一次从葡萄干中分离得到单糖。葡萄糖(Glucose, 图1.6)由法语Greek yXBKog衍生而来。化学名称为C6Hi2O6?即2,3,4,5,6■五轻基己 醛。无色晶体,易溶于水,微溶于乙醇。葡萄糖是大多数有机体的直接能量来 源。在机体中,葡萄糖通过酵解、有氧呼吸、无氧呼吸产生ATP为生命

16葡萄糖的结构

(摘自:Wikipedia)

机体中的糖主要以单糖■葡萄糖的形式存在在机体的循环系统中。血糖浓度是 判断机体能量代谢状态的一种重要指标。在20世纪70年代,专门监测血液中葡萄 糖的血糖仪开始出现,原理是基于葡萄糖的氧化还原反应,血糖测定有Folin■吴宪 法,Benedict法,磷甲苯胺法。Tindei•反应如下:

葡萄糖+ 02葡萄糖氧化酶》葡萄糖内酯+ H2O2

葡萄糖+ ATP型邑►葡萄糖・6 ■磷酸+ ADP

葡萄糖・6■磷酸+NADP的脱氢酶》6・磷酸葡萄糖酸+NADPH

1.1.4.2葡萄糖的代谢

葡萄糖存在于机体的血液中,是机体主要的能量来源。一般情况下,人体的 血糖维持在79.2至IJ110 mg/dL左右。饮食中的碳水化合物被摄入后,机体将其降 解形成多糖和单糖,单糖就是葡萄糖。单糖直接进入循环系统进行分解,为机体 提供能量;而饮食中的氨基酸、脂类等其他物质需要通过糖异生途径合成葡萄 糖。法国生理学家Claude Bemard证明,葡萄糖在肝中以糖原的形式存在肝脏中, 是非进食下血液中葡萄糖的重要来源。

在单细胞生物中,细胞直接从外界环境中吸收葡萄糖,在线粒体中分解葡萄 糖产生ATP进行供能[89]。但是这个阶段,生物对于葡萄糖的分解并不完全,会 产生丙酮酸、醋酸、有机酸等;

在线虫中,单糖、半乳糖、果糖等都通过线虫细胞上的FGT-1转运体转运到 线虫细胞中,在细胞中糖类可以被生成糖原存储起来也可以进入糖酵解途径,进
行分解产生能量[90];而葡萄糖的摄取量取决于葡萄糖转运体FGT-1以及类胰岛素 信号(AGE-1和DAF-2)的调控[91]。

在果蝇中,葡萄糖在肠道中被吸收,在脂肪组织中以糖原的形式存储;心侧 体可以感受血糖浓度,在血糖浓度出现过低的时候,分泌AKH升高血糖[92]。在 低血糖状态下,机体分泌dILP,降低血糖[93]。

在哺乳动物中,葡萄糖的转运更加特异,专门有葡萄糖装运体2将葡萄糖转运 到细胞中;胰岛素信号可以调控葡萄糖的摄入量;在哺乳动物中,葡萄糖的吸收 在胃里,存储在肝脏组织中;胰腺作为葡萄糖的感受器官,分泌胰岛素和胰高血 糖素对葡萄糖的产生和利用进行调控[94]。

17哺乳动物和果蝇中代谢组织的比较

(Rita T Brookheart, et al. Metabolic programming in the fly, 2016)

1.1.4.3葡萄糖代谢的调控

血糖在激素和神经调控下保持平衡(图1.8)[95].

激素调控:1889年,JosefVon Mering及Oskar Minkowski对狗进行胰脏全切除 术发现,切除胰腺后的狗出现多饮、多尿、多食、消瘦等症状,且有高血糖及尿 糖反应,就此Minkowski提出了胰脏中存在能特异性控制糖代谢的物质。Hedon 在切除胰脏后,发现出现糖尿病。Paul Langerhans在1970年的博士论文中描述了 一种存在于胰脏中,但是不同于胰腺外分泌细胞以及管道组织的细胞。1893年, Edward Lagues将这些细胞集落命名为朗氏小岛,并提出可能是胰腺内分泌组织。 1909年,Jean de Meyer设想朗氏小岛即胰岛中,可能存在有降血糖的激素,并起 名“胰岛素"(Insulin,拉丁文insula为岛)。在Minkowski发现胰腺切除可以导致糖尿 病之后,许多学者将胰腺的提取物给糖尿病动物及患者口服,但是发现胰腺提取 物的降低尿糖作用不稳定重复性差,且常引起发热及其他严重不良反应。德国的 Georg Zuelzer和罗马尼亚的Nicolas Paulesco虽然坚持并取得一些进展,但未能克 服提取物的毒性。在1919年,美国洛克菲勒研究所Wlsreal Kleiner将新鲜的胰腺 组织磨碎,将其水溶液静脉注射给糖尿病动物后,发现可稳定降低血糖,但是仍 然会引起不良反应。1920年 10月末,加拿大Frederick Banting, Macleod, Charles Best, Collip共同从胰腺组织中提取并得到胰岛素。1922年1月,多伦多总医院一名14岁 患有严重糖尿病的男孩接受胰腺提取液的治疗后,尿糖消失。20世纪中期,免疫 学科的迅猛发展促成了糖尿病基础研究的一系列突破。1954年,发现胰岛素是以 二硫键相连接的双肽键结构,用晶体衍射技术发现了胰岛素分子的三维结构。

1959年,用反射免疫测定法开始测定胰岛素浓度。20世纪60年代初,中、德、美 三国生化专家分别独立地用氨基酸合成了胰岛素。1967年,在胰岛素前体在胰岛 素瘤中被发现,即在胰岛素合成前期,生物体先合成胰岛素前体,之后经过肽酶 剪切形成成熟的,有功能的胰岛素肽链。20世纪70年代,随着分子生物学手段的 兴起,科学家开始了对糖代谢以及糖尿病的分子机制的研究。在1977年,大鼠的 胰岛素基因结构被阐述,接着在1980年,科学家解释了人类的胰岛素基因结构。

胰腺中胰岛B细胞分泌的胰岛素促进肝脏、肌肉、脂肪组织加快葡萄糖的利 用;抑制肝脏组织中,糖原的分解代谢以及糖异生;胰岛A细胞分泌的胰高血糖 素,抑制肝脏、肌肉、脂肪组织利用葡萄糖的效率,加快肝脏中糖原的分解以及 糖异生[96]。

胰岛素和胰高血糖素的分泌受到神经和激素的调控。肾上腺在应激过程中快 速分泌肾上腺素,促进胰岛素的分泌、抑制胰高血糖素的分泌;也分泌少量去甲 肾上腺素,抑制胰岛素的分泌,促进胰高血糖素的分泌;在应激反应启动之后, 肾上腺素释放皮质酮,激活胰岛素的分泌,抑制胰高血糖素的分泌[97]o此外, 脂肪组织分泌的瘦素[98],旁分泌到胰腺组织影响胰岛素的分泌;胃分泌的饥饿 激素,旁分泌到胰腺中调控胰岛素的分泌;免疫反应中,产生的白介素・6,也影 响胰岛素的分泌[99]o此外,交感神经系统分泌去甲肾上腺素,抑制胰岛素的分 泌,促进胰高血糖素的分泌[100] o

神经调控:法国生理学家Claude Bernard (1813-1878)在兔子上用钝针刺其延脑 可引起一过性的高血糖及糖尿,首次证明中枢神经系统与糖代谢的关系[101]o

在基础血糖发生明显的波动时,下丘脑腹内侧核团感受低血糖和高血糖状 态,激活血糖调控细胞,将基础血糖调控信号进行整合之后,向下一级中枢神经 发出血糖调控信号[102]。信号传递到孤束核中,孤束核下行的神经纤维,将调控 信号送至肝脏、脂肪、胰岛、肾上腺等组织器官,这些器官组织通过自分泌或者 旁分泌的激素进行基础血糖的调控[103, 104] o

1.1.4.4葡萄糖的影响因素

遗传因素:HLA系统是人类主要组织相容性复合体(m^or histocompatibility complex, MHC)位于人类第6号染色体短臂6P21.31亚带,占人类基因组DNA约1%. IDDMI全基因组扫描确认由HLA关联分析检验出的IDDMI是I型糖尿病关联的 一组连锁位点。CTLA4位于2号染色体长臂。PTPN22基因编码淋巴细胞特异性 的酪氨酸磷酸S|Lyp[105]; Beta细胞功能缺陷;空腹胰岛素分泌量缺陷;胰岛素分 泌模式不正常及胰岛素原的变化[106];胰岛beta细胞对葡萄糖的敏感性下降;肠 促胰岛激素分泌不足或生物活性下降及胰高糖素分泌过多;葡萄糖毒性;脂毒 性;压力应激、炎症、瘦素分泌等可以影响血糖代谢[107-110]o

1.1.4.5病理状态下葡萄糖代谢

古今中外,对于糖尿病和低血糖的记载以及研究从未间断[lll]o血糖是指血 液中葡萄糖的含量。血糖平衡的调节是生命活动的一部分,当人体的血糖平衡被 打破并且机体无法正常及时调节血糖后,会引起机体的许多代谢疾病,当血糖长 期处于高血糖状态时,引起许多血糖长期的健康疾病,包括心脏病、眼睛、肾脏 以及神经系统等的损坏,最主要也是危害最大的是糖尿病[88]o当血糖长期处于 低血糖状态时,会导致机体精神不振,颤抖,四肢虚弱和意识薄弱等。

糖尿病是一类由于机体内胰岛素分泌不足或者人体无法有效利用胰岛素时, 出现的高血糖慢性病[112]o当机体长期处于不控制的高血糖状态时,会导致机体 许多系统受损,主要是神经系统。糖尿病最早出现在西元一千五百年前的古埃 及,我国对糖尿病的最早记录是在《黄帝内经•素问》以及《灵枢》中,帝曰:

“有病口甘者,病名为何?何以得之?”岐伯曰:“此五气之溢也,名曰脾痺。夫 五味入口,藏于胃,脾为之行其精气,津液在脾,故令人口甘也;此肥美之所发 也。肥者令人内热,甘者令人中满,故其气上溢,转为消渴。治之以兰,以除陈 气也” o世界卫生组织,将糖尿病分为四种类型:I型糖尿病以前被称为胰岛素 依赖性,特征是胰岛B细胞被破坏,胰岛素分泌能力不足[112]o临床症状包括多 尿、口渴、常有饥饿感、体重减轻、视力减退。其病因尚不明确;II型糖尿病, 即非胰岛素依赖型糖尿病,胰岛B细胞没遭到破坏,胰岛素分泌正常,但是在肝 脏等利用胰岛素的组织中产生胰岛素抵抗导致胰岛素不能被有效利用[94]o妊娠 期糖尿病,症状类似于II型糖尿病;糖耐量受损和空腹血糖受损,是指人体血糖 值介于正常和糖尿病血糖值之间的状态,二者极大可能发展成为二型糖尿病。临 床症状不明显。据世界卫生组织的数据统计,全世界糖尿病患者中90%的患者为 二型糖尿病;2014年11月世界卫生组织公布数据显示:全世界有3.47亿人患有糖 尿病,2012年一年,约有150万人死于糖尿病。到2030年糖尿病将会成为第7位人 类主要死因[113]o因此,明确糖尿病的致病因素,以及致病机理在今天亟不可 待。

糖尿病的致病原因尚不明确,多种因素和糖尿病有关系,遗传、饮食、作息 规律、精神压力,抑郁和焦虑等。

1.1.4.6血糖的节律波动

血糖在生命中存在的意义非常重大。生活习性不同的动物,血糖的基线存在 不同的特征。啮齿类动物昼伏夜行,进食没有固定的时间,用电化学血糖仪检测 出来的血糖值在一天中并没有太大差异。在人类中,进食时间固定,因此血糖在 餐后升到最高。在有了连续检测系统之后,发现基础血糖存在不规则的波动和规 则的昼夜节律震荡的特征。昼夜节律的形成,是在神经系统以及其他器官的相互 作用下保持的[95] o

基础血糖的波动是糖尿病的诊断和治疗的重要指标。超过正常的血糖波动范 围,可能个胰岛素抵抗,beta细胞功能缺陷有关,这种状态被定义为前驱糖尿病 [114]o前人研究表明,基础血糖的波动可以区分出健康女性,I型糖尿病女性患 者和I型糖尿病妊娠妇女[115]o大脑视交叉上核中节律神经元核外周神经系统相 互调整下,基础血糖处于规则的昼夜节律震荡中[116]o尽管目前为止,血糖的昼 夜节律震荡并没有引起临床的关注。但是相关的研究一直在继续,比如,昼夜节 律重要指标一一睡眠剥夺会简单滴血糖耐受并且增加高血糖发生的风险[117]o

1.1.5研究技术

1.1.5.1光遗传学技术研究

光遗传学技术将遗传学和光学技术结合(图1.8),将特异性的启动子与光敏感蛋 白ChR2或者eNpHR的基因连接,在其后端连接有GFP, eYFP或者mCherry作为报告 基因的一段基因序列装载在慢病毒或者腺相关病毒载体。特异性的启动子是指在 某类具有电活动的细胞中特异表达的一类基因的启动子,该启动子插入基因组中 能开启表达,将光敏蛋白和报告基因在该类细胞中表达。光敏蛋白是一类离子通 道,用特定波长的波照射时,会使该离子通道开放或者关闭,使细胞内外发生离 子流的交换,激活或者抑制细胞活动[118]o利用定点注射,将载体注射入特定的 位点,一段时间后,光敏蛋白和报告基因在该位点的一类细胞中表达。利用 488nm或者594nm波长的蓝光和黄光分别照射感染ChR2与eNpHR的细胞,细胞被 激活或者抑制,通过和行为学,电生理,免疫组化等手段结合,可知该类细胞的 功能[118,119]。

这项技术被发明以来,广泛应用于神经环路的解析,具有实时、高效、特异 性强的特点。

19光遗传刺激

(Kay M・ Tye, et al. Nature, 2012; Karl Deisseroth, Nature Methods, 2019)

1.1.5.2药物遗传学技术

药物遗传学技术是将遗传学和药物结合,将药物敏感性通道hM4Di与报告基 因eYFP或者mCherryil接在特异性启动子后面,并且被载入腺相关病毒中[39],可 感染特定脑区特定神经细胞。将腺相关病毒注射入目的脑区之后,根据遗传学的 原理,hM4Di/mCherry将表达在病毒携带的启动子细胞中。待药物敏感通道在特 定脑区中的特定细胞中表达后,给小鼠腹腔注射CNO药物,CNO与hM4Di结合之 后,神经元细胞膜上的氯离子通道将会打开,抑制目的脑区中目的神经元的活 动,起到抑制神经元的作用。若将hM4Di换成hM3Di, hM3Di是一种钠通道,与 CNO结合打开Na+离子通道,起到兴奋目的神经元的作用。

1.10药物遗传学技术

(Gomez et al., Science, 2017)

1.1.5.3膜片钳技术

将脑组织在低温下,1分钟内快速取出,并且切成300um左右的脑片。脑片放 在模拟生理状态的条件下,组织会存活几个小时。用电极将组织中的活细胞钳制 在一定电位下,给予特定的刺激。根据细胞在刺激条件下的电位变化,判断神经 元在功能。结合光遗传学、药物遗传学技术,判断表达在细胞膜上的通道蛋白的 功能(图 l.ll)[120]o

1.11膜片钳技术

(Uwe Czubayko, PNAS, 2002)

1.1.5.4免疫组织化学技术、原位杂交技术

免疫组化技术是利用抗原■抗体结合原理,将特定抗体溶液与组织在一定条件 下孵育,再用带着荧光基团的可以结合抗体的抗体在一定条件下孵育,检测荧光 蛋白表达的技术。利用该技术可以检测目的蛋白在组织中的表达,加上对表达目 的蛋白细胞的计数可以进行定量分析表达目的蛋白的细胞数。

原位杂交技术是利用RNA碱基互补配对原理,将特定的基因片段做成探针, 检测目的组织中表达RNA的细胞的含量。其作用与免疫组化相同,且将两种技术 相结合可以实现对目的组织中一种细胞中不同蛋白的标记。

1.1.5.5行为学研究

旷场检测小鼠焦虑行为:空旷的场地与小鼠的生活习性不同,导致其在空旷 场地中会在能带来安全感的侧边沿着墙壁走,而小鼠的好奇心促使小鼠去空旷的 中心区域探索。在安全的侧边和空旷的中心区域之间徘徊,体现小鼠的焦虑行为 [121]o

高架十字迷宮检测小鼠焦虑彳丁为:利用小鼠有恐高的天性,将小鼠放在lm高 的十字形架子上,十字横臂是开放臂,十字竖臂是闭合臂即臂四周有墙壁阻挡, 且这个架子宽度只能容纳一只小鼠通过。小鼠在1H1高的架子上,在不安全的开放 臂探索和安全的闭合臂之间徘徊,出现焦虑样行为。统计小鼠在开放臂探索的次 数和时间能量化小鼠的焦虑样行为[62]。

位置偏好检测小鼠厌恶或者偏好行为:将长方形的箱子平均分成两半,分别 涂成不同的颜色。实验第一天,我们将小鼠关在一侧箱子中,并同时给刺激(光刺 激或者药物刺激)。实验第二天,我们再将小鼠放在长方形的箱子中,检测小鼠在 两侧箱体中探索的时间和次数。若小鼠更偏向在有刺激一侧的箱体中探索,即探 索时间和次数明显大于另一侧箱体,证明小鼠对刺激有明显的偏好行为;若小鼠 在非刺激侧待的时间和次数明显大于刺激箱体侧的,证明小鼠对刺激产生厌恶行 为[122]。

攻击行为:将实验小鼠和陌生小鼠放在一个箱子中,给与实验小鼠刺激,观 察两个小鼠之间行为。若实验鼠在刺激过程中,表现出明显的攻击陌生小鼠的行 为,证明该刺激导致小鼠产生攻击行为[123,124].

112小鼠焦虑行为检测范式

(Andrews, N.A., et al. Neurobiology of Disease. 2014)

1.1.5.6血糖代谢的研究手段

血糖在肝脏中通过糖原降解以及糖异生途径生成。胰岛分泌的胰岛素和胰高

血糖素调控肝脏中糖生成和其他组织器官中对糖的利用速度。因此,在糖代谢研

究中,可以注射胰岛素或者2■脱氧葡萄糖造动物的低血糖血糖模型,研究低血糖 情况下,机体产生葡萄糖的速率[125];注射葡萄糖,可以研究高血糖情况下,机 体利用葡萄糖的效率[126];或者直接检测机体的基础血糖变化。除此之外,可以 用血糖钳制技术,将动物的基础血糖钳制在一定水平,研究血糖的消耗和利用以 及影响血糖变化的因素。

1.1.5.7病毒示踪技术

神经环路结构连接的解析,除了电生理外,还可以用病毒示踪技术。狂犬病 毒(RV)、伪狂犬病毒(PRV)和疱疹病毒(HSV)等主要感染神经细胞,且能通过神经 突触传播。利用遗传学方法将病毒的制毒序列剪掉,加一段荧光蛋白基因。病毒 在感染神经细胞后,可以通过检测荧光报告蛋白的表达读取神经元之间的具体解 剖连接。若能结合免疫组织化学或者原位杂交的方法,共标记被病毒感染的神经 元类型,可以读取具体的神经元类型之间的结构连接。

RV病毒在感染神经细胞后,逆向跨神经元突触传播。RV跨突触传播能力由 其基因组上的糖蛋白(glycoprotein, G)决定,因此可以通过遗传学手段改造改 基因获得可控制跨级的RV病毒工具。Wickersham[127]将RV基因组的G蛋白基因 取出后插入一段荧光蛋白报告基因,之后将G蛋白表达在扩增RV病毒的细胞系 中,这样产生了没有跨跨突触能力的假病毒粒子。没有跨突触能力的假病毒粒 子,可以被神经纤维吸收,逆向沿着神经纤维表达在神经胞体中,这样实现了单 级神经元的逆向标记,得到清晰的神经元投射,同时也是实现了两个脑区之间的 神经元的投射标记。此外,RV病毒的逆向标记功能被保留后,还可以被写入其他 基因组序列,实现更加精细的功能。在禽类细胞中有一种特殊的病毒手提TVA病 毒受体,是禽类肉瘤病毒感染禽类细胞所必须的,禽类肉瘤病毒的外膜蛋白 (EnvA)和TVA识别结合,实现病毒的侵染。科学家将这一系统借鉴到RV病毒 中,即在RV病毒中写入EnvA序列,在另一种辅助病毒中写入TVA序列,两者在 同一细胞中相遇结合后,可以实现感染细胞的能力。其中,TVA辅助病毒可以同 时写入Cre系统,将辅助病毒表达在Cre■依赖的细胞中,能实现在特异性神经元中 表达TVA,进一步RV・EnvA病毒可以特异性标记Cre细胞。这个系统能让我们获 得清晰的亚神经投射。将EnvA・TVA和G蛋白组合,构成G蛋白缺陷型RV-EnvA- △G病毒,可以实现追踪特异性神经元投射图谱的功能[128]。

PRV病毒也是嗜神经病毒,天然的宿主是猪,但是在灵长类动物中感染效果 差。野生型的PRV可以顺向跨突触传播也可以逆向跨突触传播。科学家将PRV病 毒改造后,用于逆向示踪。Kobiler组,在PRV基因组中毒性元件敲除并且加了荧 光报告基因序列[129]。PRV-152感染肾上腺后,在脑干和中脑中检测到多个核团 表达GFP,表明这些脑区可能参与肾上腺功能的调节。在本项目中,我们用PRV 注射胰腺和心脏,标记可以调控心脏和胰腺的脑区[130]。改造后的PRV以每24小 时跨一级神经元的速度感染,利用这个特性可以逆向标记两级神经元之间的投射 关系。

HSV病毒是从脑炎患者中分离得到的[131]o科学家发现HSV病毒能跨突触顺 向感染神经细胞,因此可以用来顺向跨突触标记神经网络。Lo和Anderson组,对 HSV进行了改造,将HSV病毒中的TK基因片段敲出,构建TK缺陷型病毒株 HSV129ATK;将TK表达在辅助病毒中,若能同时装载Cre系统,可以将辅助病 毒注射在Cw动物中。实现特异神经元类型的顺向跨突触标记[132]o在本文中, 我们将AAV・DIO・TK注射在Gad-cre小鼠的aBNST中,21天后,在aBNST注射HSV ATK-tdtomato在弓状核检测到红色荧光细胞的表达,表明aBNST中的Gad神经元 能投射到弓状核中。

1.2国内外研究现状分析

1.2.1基础血糖的研究

在日常活动中,基础血糖水平在中枢神经系统和其他器官严格调控下,处于 波动状态。基础血糖的波动包括不规则的波动和规则的昼夜节律震荡。压力应激 刺激是扰乱基础血糖代谢的重要因素,甚至可以导致前驱糖尿病或者二型糖尿 病。然而,并没有研究指出压力应激刺激如何影响基础血糖波动。

基础血糖不规则的波动是糖尿病诊断和治疗的重要指标。在临床诊断中,基 础血糖波动幅度大于正常生理状态下基础血糖波动的情况被称为前驱性糖尿病 [133]O有研究指出,前驱糖尿病与胰岛素抵抗、胰岛B细胞功能缺陷等疾病的频 发有很大关联。2014年的一项研究指出,基础血糖的不规则波动在健康女性,I型 糖尿病女性和妊娠期糖尿病女性中存在显著差异[115]o

此外,基础血糖水平在外周器官和视交叉上核神经元相互协调控制下保持着 昼夜节律[134-136] o尽管基础血糖的昼夜节律在临床上并没有被关注,但是昼夜 节律和血糖代谢的关联性研究并不罕见[137, 138] o例如,睡眠扰乱降低血糖耐受 并增加高血糖发病风险[139, 140]o相似的研究也曾在糖尿病人中开展,睡眠扰乱 导致糖尿病病人预后效果降低[117, 141]o因此,昼夜节律在糖尿病的发病病程和 治疗中的作用有待被研究、解释。

1.2.2压力应激导致焦虑行为的神经环路机制的研究

目前认为焦虑的产生和纹状体床核脑区(The bed nucleus of the stria terminalis, BNST)中神经元的活动异常有关。纹状体床核即终纹床核,被认为是杏仁核体的 延伸核团,属于大脑边缘系统结构[142]o位于外侧隔核腹侧和下丘脑视前叶背 侧,包绕着前连合区域。

在纹状体床核中,大多数神经元表达Y ■氨基丁酸。纹状体床核是整合压力应 激反应中情绪和自主神经系统活动表型的中继核团之一[143]o传统化学药物给予 和电刺激表明,纹状体床核前侧中的神经元能调控应激反应中的焦虑样行为和内 分泌功能。除了纹状体床核前侧核团本身,纹状体床核前侧亚核团的输入和输出 回路在行为和内分泌调控中的功能也被解析[144]o例如,纹状体床核中Y ■氨基 丁酸能神经元投射到外侧下丘脑可以介导焦虑样行为中的逃避行为[49]。同时, 纹状体床核前腹侧亚核团接收来自弓状核中刺鼠色蛋白相关蛋白(Agouti gene- related protein, AGRP)神经元的抑制性输入,能加强胰岛素的敏感性,即加速小鼠 在低血糖状态下血糖的回调[145] o

焦虑行为的产生和纹状体床核中神经元的活动异常有很大关系[146]o利用核 磁共振技术,发现在焦虑症病人中,纹状体床核活动增强[47] o纹状体床核前侧 投射到大脑多个脑区[147] o光遗传学激活纹状体床核会导致小鼠焦虑样行为的产 生(图1.10),且纹状体床核下行到外侧下丘脑、臂旁核、丘脑腹外侧核团分别编码 了焦虑样行为中的危险逃避、呼吸、位置偏好等表型(图1.13)[45];纹状体床核投 射至下丘脑室旁核区域,调控小鼠的交配和摄食行为[148]o纹状体床核激活导致 的焦虑影响不但影响动物的行为,同时很多证据表明可以引起摄食等代谢改变 [149],但是,目前没有关于纹状体床核引发的焦虑对血糖代谢的影响的报道。

1.13纹状体床核激活导致焦虑样行为

(Joshua p. Johansen, Nature, 2013)

1.2.3情感障碍引起的血糖代谢异常的研究

国内外临床研究数据显示,糖尿病患者常常会伴随焦虑和抑郁症。国内外 的临床数据表明,抑郁焦虑和II型糖尿病有很大关系[52]o在II型糖尿病中抑 郁症患病率几乎是非糖尿病的2倍。2005年,挪威Levanger医院的Dr. Anne Engum及其同事在对59329名非糖尿病患者,223名I型糖尿病患者以及958名II 型糖尿病患者的研究中发现,糖尿病的病人患抑郁症的几率和正常人群无差 异。在2007年,该研究组报道经过对37291名人士的10年随访研究中发现,患有 糖尿病的病人后期并不一定会产生焦虑和抑郁症,而前期有抑郁和焦虑症状的 人群,十年后患有II型糖尿病的几率大大上升[33]。Eriksson根据10年的随访研 究发现,在血糖正常的情况下,有心理障碍包括焦虑、抑郁、冷漠、疲劳以及 失眠等的人,十年后比没有心理障碍的人更容易得糖尿病[150]。瑞典科学家随 机抽取了2127名男性和3100名女性,口服葡萄糖测试他们的糖耐受量,然后志 愿者通过自我报告给出自己的心理状况[150];之后研究组对这些志愿者进行8・10 年的随访研究,发现自我报告有心理困扰包括焦虑、抑郁、疲劳、失眠等的志 愿者,出现前驱性糖尿病或者II型糖尿病症状的概率明显比正常心理的志愿者 多。在2006年,经过10年随访研究发现焦虑和抑郁症患者,在10年后患糖尿病 的几率更高且该统计发现患病率并没有性别差异[151]o焦虑抑郁是如何导致血 糖代谢紊乱最终导致糖尿病的产生的?利用模式动物模拟人类情感障碍,研究 其对血糖的代谢的影响进而阐明其机制至关重要;另外明确焦虑和抑郁是如何 导致糖代谢的紊乱,会给临床上预防心理障碍引起的糖代谢紊乱甚至糖尿病奠 定基础。

下丘脑腹内侧核(Ventromedial Nucleus, VMH)位于第三脑室侧面,是血糖 感受的中枢核团(图1.14),也是血糖信息的整合中枢和调控信号发出中枢核团 [152]o电刺激下丘脑腹内侧核会引起胰高血糖素的升高[153],导致基础血糖的升 高。切除下丘脑腹内侧核导致大鼠失去对低血糖的反馈调控;在低血糖状态下, 抑制下丘脑腹内侧核团的GABA受体后,刺激胰高血糖素分泌,但是不会影响 HPA轴活动[154, 155]O

图1.14调控血糖代谢的中枢核团

(Johan Ruud, Nature communication, 2016)

下丘脑腹内侧核中主要为SF・1阳性细胞,SF・1在血糖代谢中的作用逐渐被解 释。光激活SF・1神经元,导致小鼠急性血糖升高,抑制SF・1神经元不能影响基础 血糖的变化[54]。SF・1的输入和输出神经环路,在血糖调控的信息传递中被逐渐 解析。SF・1接受来自臂旁核中CCK神经元的抑制性输入,调控低血糖状态下血糖 的升高,这一神经环路被认为是外周低血糖信号的传入途径[156];而后SF・1神经
元投射到纹状体床核前侧,将血糖调控信号传出到外周神经系统,完成低血糖状 态下对基础血糖的调控[54]。

SF・1中的神经元又可被各种特异性的抗体标记,进而被分成不同的细胞亚 类。这些被特异标记的神经元在基础血糖的调节中的作用也逐渐被解析[157].大 鼠中,下丘脑腹内侧核的腺昔酸激活蛋白激酶(AMP・Activated Protein Kinase, AMPK)表达下调,可以抑制低血糖状态下胰高血糖素和肾上腺素水平的升高,导 致机体不能从低血糖状态下恢复;在血糖钳制实验中,腺昔酸激活蛋白激酶表达 下调的大鼠需要更多外源葡萄糖来维持恒定的血糖,表明其产血糖能力明显下降 [158]O此外,下丘脑腹内侧核中神经元亚型都与基础血糖的调节有关[152],比如 AMPA, CCK 和PREP。

弓状核(Arcuate nucleus^ ARC)位于腹内侧下丘脑的下方,主要表达Y ■氨基 丁酸能神经递质(Decavel, 1990 #313).近年来,弓状核在基础血糖代谢中的作用逐 渐被挖掘(图1.14),也是血糖调控信号整合的中枢核团(Ruud, 2017 #215).经典电刺 激和化学药物实验证明,激活弓状核导致基础血糖升高。遗传学手段特异性敲除 弓状核中刺鼠色蛋白相关蛋白神经元中瘦素受体基因,会导致小鼠基础血糖升 高,导致小鼠出现类似II型糖尿病的症状(Lin, 2010 #275)(Xu, 2018 #153).类似的一 项研究证实,在弓状核核团中,将刺鼠色蛋白相关蛋白标记的神经元以及阿片■促 黑素细胞皮质素原标记的神经元中的核糖体基因S6K1敲除后,导致小鼠处于长期 的高血糖状态[159]O

Glucose disposal / Hepatic glucose

Hypoglycaemia and AMPK, ghrelin 丿

Leptin

Insulin

Glucose and fatly acids

115弓状核调控代谢

(Martin G. Myers Jr, Nature, 2012)

弓状核中Y ■氨基丁酸能神经元中可以被多种多肽标记[160],他们在血糖调控 中的作用也逐渐被解释[161-164],弓状核中的瘦素受体在中枢调控外周血糖代谢中 有很重要作用[165]O刺鼠色蛋白相关蛋白标记的神经元在药物遗传学激活后,使 外周组织产生胰岛素抵抗,加速小鼠在低血糖状态下基础血糖的回调;而激活阿 片■促黑素细胞皮质素原标记的神经元中却不能导致这一现象[145]O

除了血糖调控功能以外,弓状核中对与代谢、情绪相关的研究也很多[166]. 激活弓状核中阿片■促黑素细胞皮质素原标记的神经元中抑制小鼠的进食量[167]; 而激活弓状核核团中刺鼠色蛋白相关蛋白标记的神经元被发现能增加小鼠摄食量 [168-170],并且增加小鼠在十字高架迷宫实验中在开放臂探索的时间,表明弓状核 中刺鼠色蛋白相关蛋白标记的神经元具有增加能量消耗以及抵抗焦虑的功能[171]

其他核团调控血糖,2014年的研究指出,臂旁核接受孤束核发出的投射可以 感受低血糖信号,之后将低血糖信号输送到下丘脑腹内侧核。血糖调控信号在下 丘脑腹内侧核团整合后,再投向纹状体床核前侧去发送血糖调节信号到臂旁核, 再到外周器官中将基础血糖调回到正常状态,这是低血糖状态下对基础血糖的反 馈调节[54]。

脑干腹外侧核团中的儿茶酚胺类神经递质标记的神经元,介导由下丘脑室旁 核团中谷氨酸能神经元激活引起的应激反应中,基础血糖的升高[53, 172]o

缺失臂旁核投射至下丘脑腹内侧核的神经元时,会导致大鼠对于低血糖反馈 调节的失败[156]O胰腺接受来自由NTS发出的迷走神经和由脊髓发出的交感神经 的调节,迷走神经分泌的儿茶酚胺类神经递质和交感神经分泌的去甲肾上腺素均 可以调节胰腺分泌[173]血糖调控激素.胰岛A细胞分泌的胰高血糖素,在低血糖时 促进糖原分解和糖异生。胰岛B细胞分泌胰岛素,在高血糖时促进糖酵解和生糖 原降低血糖。二者相互作用,以维持机体的血糖平衡[174]。

综上证据表明,纹状体床核前侧和下丘脑腹内侧核团、弓状核在基础血糖和 焦虑样行为调控方面均有作用。结构连接上,单突触狂犬病毒逆向标记实验证明 弓状核中的神经元接收纹状体床核前侧的大量投射[175]O同时,弓状核到孤束核 有很强的输出;弓状核到中缝核的输入也被探索[176, 177]o并且跨多突触逆向标 记的伪狂犬病毒实验发现,在胰腺中感染伪狂犬病毒后,在中缝核、孤束核等脑 干核团、弓状核等大脑核团可以看到报告蛋白的表达[113]o因此,纹状体床核投 射到弓状核,弓状核下行到孤束核[175],直接或者间接与胰腺相连接,这一自上 而下的神经连接在结构上被解析[113]o然而,这一神经环路在压力应激反应和血 糖调控中的具体作用仍待解析。

1.3我们的研究

1.3.1压力应激扰乱啮齿类动物基础血糖的波动

在本研究中,我们研究压力应激刺激是如何影响啮齿类动物基础血糖的不规 则波动和昼夜节律变化。我们发现超低体重和血液采集刺激增加小鼠基础血糖的 波动。持续三天的压力应激刺激擦除了大鼠的基础血糖的昼夜节律。此外,我们 监测了温度和活动度两个指标,发现压力应激刺激导致温度和活动度的昼夜节律 移位。综上,压力应激刺激导致的基础血糖节律变化以及非节律波动变化对于压 力应激刺激引起的基础血糖代谢紊乱提供了新的视角。

1.3.2纹状体床核前侧中到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经环路介导焦虑反应

本研究中,我们首先从前人研究比较透彻的纹状体床核前侧核团入手,光遗 传激活纹状体床核前侧Y ■氨基丁酸能神经元以及钙依赖蛋白激酶II神经元,并没 有导致焦虑样行为的产生。因此,我们用顺行标记技术找到,纹状体床核前侧的 下游脑区弓状核以及下丘脑腹内侧核团进行研究,发现而在光激活纹状体床核前 侧到下丘脑腹内侧核团的神经环路时,并没有看到直接的焦虑样行为;光遗传学 激活纹状体床核前侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经环路导致焦虑样行为的产生, 并且检测到内分泌的变化。在进一步抑制弓状核到孤束核的Y ■氨基丁酸能神经环 路时,我们发现焦虑样行为被抑制。综合来看,我们发现弓状核到孤束核的神经 环路介导焦虑信号的下行。

1.3.3介导压力应激反应的Y ■氨基丁酸能神经环路介导高血糖反应

在本研究中,我们用单突触顺行疱疹病毒标记方法,证实纹状体床核投射到 弓状核的生长抑素标记的神经元、刺鼠色蛋白相关蛋白标记的神经元;初步数据 证实弓状核中生长抑素标记的神经元投射至中缝核团、刺鼠色蛋白相关蛋白标记 的神经元投射到孤束核;且中缝核和孤束核都可以被从胰腺感染的伪狂犬病毒所 标记到,进一步证实前人纹状体床核前侧神经纤维可以下行至弓状核,接这弓状 核。探索这条通路的功能时,我们用光遗传学和药物遗传学手段结合,激活纹状 体床核前侧投射至弓状核的抑制性神经通路导致延时的焦虑样行为、并发高血糖 反应、应激激素升高反应,综合来看是导致应激反应。

用药物遗传学方法抑制弓状核到中缝核抑制性通路情况下,再去光遗传学激 活纹状体床核前侧投射至弓状核的抑制性神经通路,我们发现,小鼠仍表现出明 显的焦虑样行为,而基础血糖比基线下降了,证明弓状核到中缝核通路可以介导 由纹状体床核前侧到弓状核神经通路诱发出的血糖调控信号(图1.16).压力应激中 血糖调用机制的发现为解决压力应激引起的代谢类疾病提供可能的治疗靶点;我 们首次揭示了弓状核到中缝核这一神经通路在血糖调控中的作用,为进一步研究 其降血糖功能奠定基础。

1.16应激下基础血糖调控机制

134压力应激导致的基础代谢失衡的神经环路机制

随机选择束缚、悬尾、高架方式等刺激小鼠一周后。将C57BL/J小鼠单独放在 代谢笼中,自由进食、进水3小时。记录小鼠进食量、进水量,排便量和排尿 量。结果显示在经历一周的压力应激刺激后,小鼠代谢表现分为两种情况,一种 情况,进食量比对照组高10倍,进水量也高,排便数量和排尿量都明显升高;而 另一种小鼠的代谢表现和对照组没有差异。同一种基因型小鼠在经历压力应激刺 激后,出现两种截然不同的代谢表现。

将长时间经过压力刺激后的小鼠的代谢,发现经过压力刺激后,小鼠骨质疏 松。在压力应激中,交感神经系统被激活分泌去甲肾上腺素。我们发现去甲肾上 腺素,可以抑制骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞,调控骨代谢。抑制纹状体床 核中的生长抑素神经元能逆转由于压力刺激导致的骨质疏松。

1.4本研究的意义

总之,本课题拟解决应激条件下,基础血糖是如何变化?以及导致基础血糖 变化的神经环路机制是什么?同时,也探索了应激刺激对基础代谢、骨代谢的影 响,阐释了应激刺激导致骨质疏松的神经环路机制。

压力应激导致基础血糖波动增加,对于临床中前驱性糖尿病的发病机制,提 供了新的视角;对于临床中,糖尿病的继续分型提出了新的方向。压力应激导致 基础血糖昼夜节律消失,可以为临床诊断糖尿病提供了新的诊断指标。

压力应激中出现高血糖反应,以及焦虑样行为。我们用光遗传学激活纹状体 床核前侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经环路,可以模拟出这一压力应激过程,我 们进一步发现弓状核到中缝核的Y ■氨基丁酸能神经环路介导这一压力应激过程 中,血糖调控信号的下行。这一成果对于临床治疗焦虑应激下,难降低的高血糖 发提供了可能的治疗靶点,为进一步研究其分子机制奠定了基础。我们发现弓状 核到孤束核的Y ■氨基丁酸能神经环路,介导了压力应激中焦虑样行为信号的下 行。这一研究对于治疗压力应激导致的焦虑障碍提供了可能的治疗靶点。

压力应激导致基础代谢增加,出现吃多、排多的现象,为进一步解释压力应 激导致的代谢紊乱提供可能的模型。压力应激导致骨质疏松,药物遗传学抑制纹 状体床核时会逆转压力应激导致的骨质疏松;交感神经系统分泌的去甲肾上腺 素,抑制骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞,可能是压力应激导致骨质疏松的机 理。为治疗压力应激导致的骨质疏松提供了可能的靶点;为进一步找到压力应激 导致的骨质疏松的分子靶点奠定了基础。

1.5本论文的组织安排

本论文将五年的研究工作综合起来,分成六个部分阐释:

第一部分是前言,包括了五部分,一是背景知识,主要总结前人在压力应激 反应、焦虑情绪以及血糖代谢方面的研究成果,属于教科书级别的基础理论知 识;二研究现状,基于我们的研究目的,收集了目前在压力应激反应的神经环路 机制方面的研究,焦虑的神经环路基础的研究,血糖代谢的神经环路机制的研究 以及外周神经系统调控骨代谢的研究;最重要的内容是压力应激导致的血糖代谢 紊乱以及焦虑障碍的现状;三是简单介绍了,在本次研究工作中研究内容、研究 思路以及研究结果;四是研究成果的意义;五是概述了本论文的整体架构。

第二部分是材料和方法,本论文中所用材料、方法的具体细节;在材料方法 中,我们尽可能详细地回顾了,实验中的每一个细节,具体到动物饲养环境;免 疫组化中抗体的浓度等。

第三部分是结果,将我们本次研究的结果,用最详细的方式列出;描述了科 问题探索的思路,实验设计以及实验结果;实验结果用图表表示,并为每张图配 有图例;研究成果展示的逻辑上,我们尽可能按照摘要中的逻辑结构进行排列。

第四部分是讨论,我们讨论了本次研究的过程、结果。我们尽可能解释了, 每一个能想到的可能给读者带来困惑的研究内容;总结了在本次研究中不足的地 方,以及接下来需要继续研究的内容。

第五部分展望,阐述我们工作未来可能在临床、在基础研究中的贡献。

第六部分参考文献,我们将论文以及研究过程中,参考和借鉴的每一个研究 成果列出,以示对前人研究的尊重和感谢。

第七部分致谢,作者感谢在这六年的研究生涯中,给予作者帮助的所有人。

第八部分作者简介,详细介绍了本研究的执行人,以及本论文撰写的作者的 信息;以及在过去六年,在焦虑导致血糖代谢紊乱的神经环路机制,这一研究工 作中取得的成果;以及其他相关的成果和奖励。

 

第二草材料和方法

2.1动物来源和饲养

所有动物实验购买、饲养和使用获得中国科学院深圳先进技术研究院动物 管理委员会批准,并在其指导下进行。其中,8周龄大小的野生型C57BL/6J雌鼠 和雄鼠从广东省医学实验室购买,在中国科学院深圳先进技术研究院C区604实 验室SPF级动物房饲养;200g SD大鼠在湖南斯莱克公司购买,在中国科学院深 圳先进技术研究院C区13楼SPF级实验室饲养。实验操作在603屏障环境实验室 进行,或者在504实验室普通环境中饲养。所有动物饲养环境中温度20-26° , 湿度40・70%, 12/12小时周期的光■暗交替。除有禁水、禁食要求的实验外,所有 动物均不限制食物和无菌水供应,每周更换一次垫料(Wei, 2015 #12)(Lu, 2016 #208).

转基因小鼠包括Gad2-ires-cre (No. 028867, RRID: IMSR_JAX:028867); Vgat-ChR2 (H134R)-eYFP (No. 01454& RRID: IMSR_JAX:014548); Vglut2-ires- cre (No. 028863, RRID: IMSR_JAX:028863); Som-ires-cre (No. 013044, RRID: IMSR_JAX: 013044)等从Jackson实验室引进,在中国科学院深圳先进技术研究 院SPF级动物房繁殖和饲养。转基因小鼠出生21天后,进行母婴分离,在7・8周 龄的时候进彳丁病毒注射等实验。

2.2小鼠血糖检测

2.2.1小鼠基础血糖检测

将小鼠放入血糖监测器具(专利:ZL20161124569&9)中,用75%的医用酒精 消毒小鼠尾巴;无菌干棉花擦干小鼠尾巴,消毒过的剪刀剪掉l-2mm的小鼠尾 巴;挤掉第一滴血;收集第二滴血,用电化学血糖检测仪(Data Sciences International, 47160)检测血液中血糖的含量。根据实验需要进行禁食控制,具 体在每个实验中详细阐述。

2.2.2小鼠在光刺激中的血糖检测

将小鼠放在血糖监测器具中,将小鼠头上的光纤头与外置光纤连接好。用 75%的医用酒精擦拭小鼠尾巴消毒,用干棉花擦干,用眼科剪剪下l・2mni小鼠 尾巴。每隔5min采一次小鼠尾巴的血,检测血液中基础血糖。其中,在5mim lOmin期间是光刺激时间。

2.3大鼠基础血糖的监测

2.3.1血糖植入子植入

200g雄性大鼠用戊巴比妥钠(80mg/kg,腹腔注射)麻醉,并在手术过程中 持续保温。在无菌环境中,消毒后的手术刀打开大鼠腹腔,将血糖植入子(Data Sciences International, HD-XG)[178]的芯片段插入大鼠腹主动脉中;用组织胶水 粘合植入子芯片端和血管处,固定好植入子的参考线和植入子实体;用无菌缝 合线缝合腹部;保温直到大鼠苏醒。

图2・1血糖植入子

(Fig 2.1 Implantable Glucose Monitoring)

2.3.2血糖植入子校准

血糖植入子植入手术需要恢复三天,第四天进行血糖耐受检测(GTT).按 2g/kg的剂量给大鼠灌胃葡萄糖溶液,之后用电化学血糖仪检测小鼠尾部血液中 的血糖。将测试的血糖值输入血糖监测系统中,进行血糖植入子校准。此后, 每周在大鼠尾巴采血一次,检测血糖,进行血糖植入子校准。

2.3.3血糖数据采集和处理

将饲养大鼠的笼子放在数据采集板上,3天换一次垫料;进行基础血糖监 测。每天持续采集24小时,血糖数据用1HZ频率采集;检测1周基础血糖后,进 行应激刺激;应激刺激后继续进行监测1周基础血糖。

从血糖数据采集软件(Data Sciences International, Data acquire set)中,将基础 血糖数据导出,用Matlab进行傅里叶分析。

2.4压力应激刺激

2.4.1小鼠压力应激刺激

束缚应激刺激后C・ft)s染色:将C57; C57:aBNST::CaMKII-mCherry; Gad2- cre:aBNST:: DIO-mCherry小鼠包裹在棉花中且放在束缚筒中,给予束缚应激刺 激。

在C<fos染色实验中,一组C57小鼠在离心管中被放置30min;另一组C57小 鼠放置2小时;将小鼠释放出来,暂停1.5小时后,灌流固定。

在压力应激条件下的血糖测试:将Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-eNpHR3.0- mCherry/DIO-mCherry小鼠包裹在棉花中,将头部的光纤头裸露出来连接光纤。 每隔5min采集一次小鼠尾巴血液,进行血糖检测。其中5-10min期间,小鼠受到 光遗传刺激。

2.4.2大鼠压力应激刺激

连续给SD大鼠三天的压力应激刺激,压力应激方式包括高架刺激、束缚刺 激和悬尾刺激,每天给一种应激刺激,三种压力应激刺激方式随机抽取一种。 高架刺激是将大鼠放在只能容纳1只大鼠且能自由移动的1米高高架上,等2小 时;束缚刺激是将大鼠装在只能容纳大鼠的锥形容器中,大鼠不能自由活动2 小时;悬尾刺激是将大鼠尾巴悬挂起来,导致双侧后腿不能着地,持续2小时。

2.5脑立体定位注射和光纤埋植

2.5.1病毒注射

将小鼠用无巴比妥纳(75mg/kg,腹腔注射)麻醉。用消毒过的眼科剪剪去 头皮上的毛,用75%的医用酒精擦拭小鼠头皮消毒。将小鼠固定在脑立体定位 仪上,用消毒过的眼科剪剪开头皮,保证小鼠颅骨的前囱和后囱全部裸露出 来。将前囱定为参比0点,后囱定为调平0点,调整固定小鼠适配器的鼻夹保证 小鼠的前囱和后囱的0点在同一水平面上,即高度相同;以小鼠颅骨骨缝为对称 轴线,在左右两侧颅骨处各取一个调平点,调整固定小鼠适配器的两侧耳棒使 左右两个调平点在同一水平面上,即两个调平点高度相同。调整定位仪的夹持 臂回到前囱位置,找到目标位点处,用颅钻将目的位点处的颅骨钻开。然后, 在微量注射泵的控制下,用病毒注射针吸取浓度为1012颗粒每微升浓度的定量 的病毒溶液,干棉花将病毒注射针外壁擦干净,夹持臂带着病毒注射针下行到 目的脑区。用微量注射泵控制病毒注射速度为50 nL/min,将病毒注射到目的脑 区。待病毒注射完成后,停针5min,之后缓慢提针。将小鼠手术切口用手术缝 合针线缝合好,涂碘伏以及利多卡因在手术切口处。

光遗传刺激中,各个脑区注射位点以及病毒(1X1012 particle/ul)注射剂 量:纹状体前侧床核(300nl/单侧),AP: +0.2 mm; ML: 0.5 mm; DV: -4.5 mm; 弓状核(200nl/单侧),AP: -1.50 mm; ML: 0.2 mm; DV: -5.88 mm;下丘脑腹内 侧核(200nl/单侧),AP: -1.55 mm; ML: 0.3 mm; DV: -5.5 mm;中缝核(100nl/ 单侧),AP: -6.95 mm; ML: 0 mm; DV: -5.75 mm;孤束核(200nl/单侧),AP:- 7.75 mm; ML: 0.25 mm; DV: -4.5 mm.

纹状体床核中Gad/vGLUT和CaMKII神经元分布模式:在纹状体床核病毒注 射的剂量位500nl/单侧。

2.5.2光纤埋植

待病毒载体表达后,胞体表达需要4周,神经末端表达需要6周;我们将200 um直径的光纤头埋植在光刺激脑区的上方,光纤前端距离目的脑区为0.3-0.5 mm.光纤埋植过程为:将小鼠用75mg/kg无巴比妥纳腹腔注射注小鼠进行麻醉; 眼科剪剪掉头皮上的毛;将小鼠固定在立体定位仪的适配器上,在头皮上剪开 一个缺口,使整个颅骨暴露出来;在颅骨上钻三个孔,且三个孔尽量将目的脑 区围在中心位置;将三颗颅钉旋进颅骨上的三个孔中,用牙科水泥涂抹将三颗 颅钉连接且前囱和后囱都不被牙科水泥覆盖。待牙科水泥凝固后,调平小鼠脑 袋,即保证前囱后囱在同一水平面上,左右调平点在同一水平面上。之后,从 前囱出发找到目的脑区位点,用夹持器将光纤固定且在夹持器帮助下将光纤埋 植在目的脑区上方0.3-0.5毫米处。最后,用牙科水泥固定光纤和三颗颅钉,等 科水泥完全凝固,从立体定位仪上取下;小鼠完全苏醒后,送回动物房正常饲 养。

光遗传刺激中,各个脑区光纤埋植位点:纹状体前侧床核,AP: +0.2 mm;

ML: 0.5 mm; DV: -4.0 mm;弓状核,AP: -1.50 mm; ML: 0.2 mm; DV: -5.5 mm;下 丘脑腹内侧核,AP: -1.55 mm; ML: 0.3 mm; DV: -5.0 mm.

2.6光遗传刺激

小鼠在光纤埋植手术后,需要康复1周,可进行光刺激实验。光遗传刺激实 验,需要的装置为可以发射固定波长的光源,473nni波长的蓝光光源,594nni波 长的黄光光源是本项目所需要的,可以是LED光源,也可以是激光光源;波形 发生器:实验中需要用脉冲波来进行光激活目的脑区,波形发生器输出特定波 形的波。在本项目中,蓝光的波形为方形脉冲波,光强度在激活胞体时为5・10 毫瓦,神经末梢激活用10-20mW;方波占空比为5ms;黄光强度为50mW以上, 用连续波即可,波形发生器和激光器通过BNC线连接;激光器通过光纤跳线与 小鼠头上的光纤头连接。光刺激时间通过手动拨波形发生器的开关进行控制。 在本研究中,我们用蓝光刺激C57:aBNST::Syn-ChR2-eYFP/Syn-eYFP; C57:aBNST::CaMKII-ChR2-eYFP/ CaMKII-eYFP; Gad2-cre:aBNST::DIO-ChR2- mCherry/DIO-mCherry 小鼠的纹状体床核前侧,Gad2-cre:aBNST-ARC:: DIO- ChR2-mCherry/DIO-mCherry, Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-eYFP&ARC- ROb::fDIO-hM4Di-mCherry&ROb::CAV-FLEX-FLP, Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO- ChR2-eYFP&ARC-NTS::fDIO-hM4Di-mCherry&NTS::CAV-FLEX-FLP 小鼠的弓 状核脑区,用黄光刺激C57:aBNST:: CaMKII-eNpHR3.0-mCherry/DIO-mCherry; Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-eNpHR3.0-mCherry/DIO-mCherry小鼠的弓状核脑 区。

2.7药物遗传学

给            Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-eYFP &ARC・ROb::fDIO・hM4Di・

mCherry&ROb::CAV-FLEX-FLP, Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-eYFP&ARC- NTS::fDIO-hM4Di-mCherry&NTS::CAV-FLEX-FLP 小鼠注射CNO(0.5mg/kg, i.p.) 抑制弓状核中GadZ^c-ROb和0词2应"河5细胞,30分钟后即可开展正式实验。

2.8焦虑行为测试 2.&1旷场测试

旷场是一个50 x 50 x 50厘米边长的白色塑料不透明正方体,顶端无盖。根 据小鼠喜欢探索中心区域的天性,以及在偏好在侧边安全区域躲避危险的习 性,小鼠将在中心区域和侧边区域抉择,表现出焦虑样行为。在正式实验前一 天,先将小鼠 Gad2-cre:aBNST-ARC:: DIO-ChR2-mCherry/DIO-mCherry, Gad2- cre:aBNST-ARC::DIO-eNpHR3.0-mCherry/DIO-mCherry?                                                                 Gad2-cre:aBNST-

ARC: :DIO-ChR2-eYFP&ARC-ROb:: fDIO-hM4Di-mCherry&ROb: :CAV-FLEX- FLP,    Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-eYFP &ARC・NTS::fDIO・hM4Di・

mCherry&NTS::CAV-FLEX-FLP放在旷场中适应5min.在测试时,用摄像机全程 对整个旷场区域进行拍摄。我们将连接好光纤激光器的小鼠放在旷场中心区 域。让其自由探索20min,其中5-10min期间是给予光刺激时间。实验完成后,用 anymaze分析小鼠在旷场中的轨迹,其中将旷场底部边长为1/2的部分作为中心 区域。其他区域作为侧边区域。分析小鼠在光刺激前5miii、5miii刺激期间以及 刺激后5min内,小鼠在旷场中运动距离,去中心区域探索的时间以及去中心区 域探索的次数。

2.8.2十字高架迷宫测试

十字高架迷宫的高为50cm,迷宫臂为5cm的十字形的器具,开放臂和闭合 臂相间隔。该器具是利用动物恐高,一方面喜欢去开放臂探索,另一方面习惯 待在安全的闭合臂的习惯设计,小鼠在安全臂和开放臂之间抉择表现出焦虑情 绪。在本研究中,我们正式实验前一天,先将Gad2-cre:aBNST-ARC:: DIO- ChR2-mCherry/DIO-mCherry,  Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-eNpHR3.0-

mCherry/DIO-mCherry,                Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-eYFP&ARC-

ROb::fDIO-hM4Di-mCherry&ROb::CAV-FLEX-FLP, Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO- ChR2-eYFP&ARC-NTS::fDIO-hM4Di-mCherry&NTS::CAV-FLEX-FLP小 鼠放在 十字高架迷宫中适应5min.在测试中,我们将光纤连接好的小鼠放在十字高级迷 宫的中心区域,让小鼠在十字高架迷宫中自由探索20min.其中5-10min期间是光 刺激时间。测试完成后,用Anymaze分析小鼠在十字高架迷宫中的运动轨迹。 统计小鼠在光刺激前、中、后每5min的运动距离,去开放臂探索的次数和时 间。

2.8.3条件位置偏好行为测试

条件性位置偏好箱子有黑白两个颜色不同的箱子组成,中间连通,可以容 小鼠自由通过。在一侧箱体中给予光刺激或者药物刺激,之后检测小鼠在两个 箱体中自由活动的时间和次数。若小鼠喜欢在光刺激或者药物刺激一侧探索, 证明小鼠偏好光刺激或药物刺激;若小鼠更喜欢在非光刺激或者药物刺激一侧 探索,证明小鼠对光刺激或者药物刺激有厌恶反应。在本研究中,我们在实验 第一天让Vglut2-cre:aBNST-VMH:: DIO-ChR2-mCherry/DIO-mCherry小鼠在箱体 中自由探索lOmin;在实验第二天,我们将小鼠放在白色箱体一侧,让其在白色 侧箱体中自由探索5min,期间接受到光刺激;在实验的第三天,让小鼠在两侧 箱体中自由活动lOmin.我们分析小鼠在白色箱体中自由探索的时间和次数。

2.9免疫组织化学

压力应激后C・fbs染色:将压力应激刺激后的小鼠,用水合氯醛(80mg/kg, i.p.)麻醉小鼠;接着,用生理盐水冲血,4%的多聚甲醛灌流固定小鼠;灌流之 后,将小鼠脑袋取出,放在4%的多聚甲醛中4。过夜,用25%的蔗糖在4。脱水3 天。OCT包埋后,用冰冻切片机切成30umo在常温下,用0.3%的PBST稀释的 羊血清(200:1)封闭1小时;之后用0.1%PBST稀释的c<fos抗体(#2250, 1:400, CST, Boston, USA)孵育1小时;PBST洗三次,每次洗5min;用PBS稀释的羊抗 兔(Jackson ImmunoResearch, 1:500, Pennsylvania, USA)二抗孵育 1 小时;PBS 洗三次,每次5min;用PBS稀释的DAPI溶液(D9542, Sigma, 1:5000, Darmstadt, Germany),染色3min; PBS洗三次,每次5min;用圭寸片剂圭寸片后,共聚焦显微 镜拍照(Leica, STP6000)。

光激活之后的C<fos染色:光刺激小鼠5min后,再暂停1.5小时用PBS冲血, 然后用4%的多聚甲醛灌流固定。之后的实验过程与压力应激刺激后小鼠C<fos染 色过程相同。

其 他抗体染色:兔抗 CAV2 (#SAB2100345, Sigma, 1:500, Darmstadt, Germany),鼠抗GFP (#11814460001, 1:500, Sigma, Darmstadt, Germany),兔抗 DsRed (#632496, Clontech, 1:500, Japan)的染色同C・ft)s相同。

2.10原位杂交

将小鼠用水合氯醛(80mg/kg)W醉后,生理盐水冲血之后用4%的多聚甲醛固 定;将小鼠脑袋取出;在4。条件下,4%的多聚甲醛溶液中固定过夜;用30% 的DEPC水蔗糖溶液脫水3天;

O.C.T包埋后,冰冻切片成15um的切片,放在・80。保存。做原位杂交时,我 们将片子取出,吹干;用去除RNA酶的PBS洗2次,每次5 min; 3%的双氧水处 理15min;去除RNA酶的PBS洗2次,每次5 min; 6 ug/ml的蛋白酶K,处理10 min;用0.2%的甘氨酸处理3min;去除RNA酶的PBS洗三次,每次5min; 200ng/ml的探针■探针缓冲液在56°孵育过夜;2乂33(2溶液65°处理5min; 0.2XSSC溶液在65°处理2次,每次20min; 0.2XSSC溶液常温处理5min;用 DIG-POD(一抗)-TNB (1:500)溶液37。孵育1小时;PBST洗三次,每次5min; 5%小牛血清-Triton-PBS封闭液,溶解鼠来源的GFP和兔来源的DsRed抗体在 37°孵育3小时;PBS洗三次,每次5min; DAPI-羊抗鼠488■羊抗兔594・ PBST(l:50:50: 5000)溶液37°孵育30min; PBST洗2次,每次5min;封片剂封片 后,共聚焦拍照。

2.11酶联免疫吸附测定

小鼠 Gad2-cre:aBNST-ARC:: DIO-ChR2-mCherry/DIO-mCherry、 Gad2- cre:aBNST-ARC: :DIO-eNpHR3.0-mCherry/DIO-mCherry?                                               Gad2-cre:aBNST-

ARC: :DIO-ChR2-eYFP&ARC-ROb:: fDIO-hM4Di-mCherry&ROb::CAV-FLEX- FLP,     Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-eYFP &ARC・NTS::fDIO・hM4Di・

mCherry&NTS::CAV-FLEX-FLP在光刺激5min结束后,小鼠 Vglut2-cre:aBNST- VMH:: DIO-ChR2-mCherry/DIO-mCherry7t刺激结束5min后,立刻用异氟烷麻醉 小鼠,摘眼球取全血;4°静置过夜;1500 g, 15 min离心,取上清,得到血清; 血清存放在-80°,备用;之后,我们用按照试剂盒说明书,测试皮质酮 (KGE009, R&D Systems, Minnesota, USA)、肾上腺素(KA3837, Abnova, Taipei, Taiwan)、去甲肾上腺素(KA1891, Abnova, Taipei, Taiwan),胰岛素 (abl00578, Abeam, Cambridge, England )和胰高血糖素(KGE009, R&D Systems, Minnesota, USA)在血清中的浓度;吸光值用BioTek Synergy 4检测;标 准曲线用mycurvefit模拟。瘦素(Leptin),胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide, GLP)和白介素-6(iL-6)用小鼠代谢磁珠板(#MMHMAG-44K, Millipore,

Massachusetts, USA)测得。数据用MAGPIX板子读取。

2.12荧光定量逆转录聚合酶链反应

在            Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-eYFP &ARC・ROb::fDIO・hM4Di・

mCherry&ROb::CAV-FLEX-FLP, Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-eYFP&ARC- NTS::fDIO-hM4Di-mCherry&NTS::CAV-FLEX-FLP小鼠光刺激5min结束后,我 们立即取小鼠肝脏组织,在液氮中研磨;提取肝脏组织中RNA(catalogue no. 15596-026, EnsureBio);用一步法逆转录荧光定量PCR(Roche, 4897030001)在检测 肝脏组织中糖代谢相关基因[179, 180],包括葡萄糖激酶(glucokinase, GCK)磷酸 烯醇丙酮酸竣激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase gene 1? PEPCK),葡糖・6■磷 酸激酶(glucose-6-phosphatase catalytic subunit, G6PC),胰岛素受体底物(insulin receptor substrate 1, IRS-1),叉头转录因-fl (forkhead transcription factor 1? FoxO-1), TATA-box结合蛋白(TATA-box-binding protein, TBP-1),胰岛素受体底物(insulin­like growth factor binding protein 1, IGFBP-1);用2-AACT方法分析差异表达基 因。

用膜片钳取出弓状核中的单细胞,用单细胞RT-PCR试剂盒(Cat. 4458237,AmbionSingleCell-to-CT, Life Technologies)提取单细胞RNA,并反转成 cDNA;用单细胞荧光定量逆转录聚合酶链反应检测单细胞中AGRP, POMC, SST 以及NPY四种基因的表达量。

2.13膜片钳

Gad2-cre:aBNST-ARC::DIO-ChR2-mCherry小 鼠用异氟烷麻醉,1 分钟内将 小鼠脑袋取出,放在通氧气/二氧化碳(95%O2/ 5%CO2)的冰中切片溶液中(110 mM choline chloride, 25 mM NaHCO3, 2.5 mM KC1? 1.3 mM NaH2PO4, 7.0 mM MgC12, 0.5 mM CaC12, 1.3 mM Na ascorbate, and 0.6 mM Na pyruvate),用震动切 片机(Leica VT 1000s vibratome, Germany)切成中300-mm厚度脑片。将脑片放在 已经通氧(95% 02/5% CO2) 30min的32° 的人工脑脊液(125 mM NaCl, 2.5 mM KC1, 1.3 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 1.3 mM Na ascorbate, 0.6 mM Na pyruvate, 10 mM glucose, 2 mM CaC12, and 1.3 mM MgC12; PH7.35;渗透压280-300; ACSF).在常温25°下,至少孵育30min.电极内液(130 mM CsCl, 2 mM MgC12, 0.5 mM ethylene glycol-bis (P-aminoethyl ether)-NjNjN^N^tetraacetic acid, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic acid, 0.25 mM Na guanosine triphosphate, and 2.5 mM Mg adenosine triphosphate, pH 7.2-7.4, 280 mOsm).全细 胞记录在30-32°C环境中,用700B膜片钳放大系统(Molecular Devices)记录突触 后电位。电生理数据用过滤在1 kHz〜10 kHz (DigiData 1440A, Molecular Devices).膜电位钳制在・70 mV.脑片用40x水镜放大(NIR-Apo, Nikon, Japan),电 极记录脑片在470nm波长的蓝光刺激前后,弓状核细胞中的抑制性突触后电 位。

2.14小鼠骨髓间充质细胞提取、培养以及诱导成骨分化

提取:将8周龄的小鼠的胫骨取出,放入无菌PBS中,将胫骨表面的组织剔 除干净,PBS冲洗;将胫骨两端剪开,用无菌注射针吸取含100U/ml青霉素和 100ug/ml链霉素的DMEM培养基将骨髓冲洗出来;在lOOOrpm下离心,将细胞用 加了10%胎牛血清以及双抗的DMEM培养基重悬;接种在6孔板中。培养:在 37°温箱,5% CO2的条件下培养。3天后第一次换液,之后每2天换一次;9天 后,用3%胰蛋白酶消化,传代。诱导分化:待传代细胞长到80%时,用加了 O.lum地塞米松、0.2mM抗坏血酸磷酸盐和10mM beta■甘油磷酸钠的成骨诱导分 化培养基进行诱导培养,3天换液一次,诱导21天。

2.15茜素红细胞化学染色

将诱导分化后的细胞在4%多聚甲醛中浸泡10min进行固定;0.1%的茜素红. tris■盐酸溶液在37°处理30mim蒸馆水洗2次,每次3mino在明场显微镜下, 进行观察、拍照。

2.16石蜡切片伊红■苏木素组织化学染色

取材:取出小鼠的胫骨,在4%的多聚甲醛溶液中进行固定1周。包埋:蒸 馆水冲洗骨头后,进行梯度酒精脱水,依次将组织浸泡在50%、75%、80%、 90%、100%的酒精溶液中,每次30mim在二甲苯和无水乙醇等比溶液、二甲 苯溶液中分别浸泡30min进行透明;在56。的石蜡溶液中浸泡组织30min;在 58°的石蜡溶液中浸泡组织60min;将组织浸泡于融化的石蜡中,在常温中冷却 进行包埋。切片:在石蜡切片机上,将小鼠胫骨切成7um厚度的切片;脱蜡: 将包埋好的小鼠胫骨进行脱蜡,依次放在二甲苯、100%、95%、90%、80%、 70%酒精中浸泡5min,蒸Y留水洗5min;在苏木素染液中浸泡lOmin;水洗3min; 伊红染色5min;在无水乙醇、酒精二甲苯等比溶液、二甲苯中分别浸泡3min进 行透明。用中性树胶封片;在明场显微镜下观察、拍照胫骨的组织形态。

2.17骨量分析

Micro-CT扫描到的胫骨组织,将胫骨顶端的CT片子中的选取软骨组织作为 ROI.对胫骨顶端的软骨组织的骨量进行分析,统计了骨密度(BMD),骨表面积 (BS),骨体积(BV),选取ROI体积(TV),骨小梁数量(Tb.N),骨小梁分离度(Tb.Sp), 骨小梁厚度(Tb.Th),骨表面积和骨体积的比值(BS/BV),骨表面积和组织体积的 比值(BS/TV)等参数。

2.18数据分析

小鼠血糖数据全部用Graphpad Software软件分析组间统计学差异、作柱状 图,两组之间统计学差异用Studenft检验;变异系数用Bootstrap Method计算和 modified signed-likelihood ratio test分析统计学差异。大鼠血糖数据用MATLAB 程序分析、作曲线图;血糖、活动度和温度的频谱分布用傅里叶变换;血糖、 温度和活动度的昼夜变化用Graphpad Software软件分析。

2.19重要试剂、病毒等

第三章结果

3.1压力应激扰乱啮齿类动物基础血糖的波动

3.1.1压力应激增加小鼠血糖的波动

之前研究证明,动物性别不同,其基础血糖水平以及血糖代谢水平不同 [181-184];并且在禁食6小时、12小时之后血糖会明显下降[185, 186]。在本研 究中,为确认我们搭建的系统具有稳定性,我们重复了以上结果。经过对两组 同一周龄雌、雄小鼠的血糖进行检测,我们的数据也证实雄性小鼠血糖略高于 雌性小鼠2mmol/L(®3.1 a).并且将雄性小鼠禁食过夜后,基础血糖明显下降(图

  • b).受此启发,在后续实验计划中,我们只选用雄性小鼠,并且所有小鼠的 食物供给量完全一致。

3.1性别和禁食对基础血糖的影响

(a)性别差异导致基础血糖不同;在同一时间点测量得到的雄性小鼠基础血糖水平比雌性 小鼠高2mmol/l (N= 58,雄;N= 43,雌.***, P< 0.001). (b)雄性小鼠在禁食12小时之后,基础 血糖水平比正常进食的小鼠明显降低(N=16,禁食雄性小鼠;N=16,正常进食雄性.**, P= 0.0028).

此外,血糖检测过程中,需要进行切小鼠尾巴采集血液,再进行血糖检 测,然而切小鼠尾巴进行血液采集会导致小鼠产生快速的应激反应[187]O然而 采血是血糖检测实验所必须,因此我们探索应激反应是否会影响基础血糖水平 的变化?小鼠是否能适应采血过程?因此,我们连续四天在9点,11点,13点,1 st day ■— 2nd day —3rd day 4th day15点,17点和17点钟检测了小鼠的基础血糖(图3.2 a),将四天内小鼠血糖值做成 绘制成曲线,看得出小鼠在第一、第二天检测的基础血糖值明显高于第三天和 第四天检测到的血糖值,表明急性应激导致高血糖反应[188]O基础血糖的波动 在这四天中是否也会变化?因此,我们计算了这四天中基础血糖的波动,我们 用变异系数估计基础血糖波动。第一天第二天检测到的基础血糖波动接近于 15%,明显大于第三天和第四天检测到基础血糖波动(图3.2 b-c).结果表明,第 一二天采血进行基础血糖检测过程中会明显增加基础血糖值以及基础血糖的波 动。因此,我们建议至少两天的模拟采血在电化学血糖仪测量血糖过程中是需 要的。

9:00   11:00 13:00 15:00 17:00 19:009:00 11:0013:0015:0017:0019:00

32采血操作增加了小鼠基础血糖波动

(a-b)采集小鼠血液的操作影响血糖波动.(a)连续四天在9, 11, 13, 15, 17, 19点钟监测到的 C57BL/6J/J、鼠基础血糖值(N=28,第一无N=28,第二天;N=28,第三天;N=28,第四天).(b)第 一天和第二天监测到的基础血糖水平波动大于第三天和第四天监测到的(**, P=0.0095. t检 验).(c)去掉第一天和第二天的数据之后,小鼠基础血糖值。

在测量基础血糖的同时,我们监测了小鼠对应的体重数据。根据Jackson实 验室的数据(https://www.jax.or叨,15周龄的小鼠体重在28・30克,然而在我们监 测到体重数据中有低于28克的体重数据。之前也有研究表明,正常大鼠的体重

下降到正常体重的80%时,大鼠会产生生理性应激[98]o为了探索低体重的小鼠 是否会有应激反应,进而影响小鼠的基础血糖值。我们将连续检测到的基础血 糖值根据其对应的体重值进行排序,我们收集了低体重和正常体重小鼠尿液, 进行可的松浓度的检测。我们发现低于28克体重的小鼠表现出较高浓度的可的 松水平(图3.3 a),表明低体重小鼠正在处于压力应激中。我们分析了每个体 重阶段对应的血糖水平(图3.3 b) o我们发现体重值和血糖值之间只有低的相 关性。同时,我们分析了每个体重范围内的基础血糖波动水平(图3.3 c)我 们发现在体重低于28克的小鼠中,基础血糖变异系数约是正常体重范围小鼠的2 倍。该结果表明,低体重的小鼠受到压力应激导致基础血糖波动增大。

图3・3低体重的小鼠基础血糖波动较大

(a)小于28g的小鼠皮质酮水平和大于28g小鼠的(**, P=0.0038. t检验)。(b)小鼠体重值和对 应的基础血糖值,两者之间没有相关性(N=8,小于28克;N=38,大于28克)。(c)小于28克的 小鼠其基础血糖水平波动是大于28克小鼠基础血糖水平的2倍。

3.1.2大鼠基础血糖具有昼夜节律

在电化学血糖仪检测基础血糖过程中,在切小鼠尾巴进行采血时会诱发小 鼠压力应激反应,导致基础血糖水平升高,并且基础血糖波动增加。因此,可 以实时监测大鼠基础血糖的植入子在研究基础血糖变化中显得尤为重要。将大 鼠血糖植入子置入到大鼠腹主动脉中,能实时监测基础血糖,很好地避免了电 化学血糖仪监测基础血糖时需要采血的弊端[189]o此外,实时监测基础血糖的 植入子在监测基础血糖时,动物对应的温度和活动度水平都可以被记录。然 而,血糖植入子目前只适用于大鼠。因此我们选用SD大鼠作为模式动物进一步 来研究基础血糖节律。我们用血糖植入子连续实时监测SD大鼠基础血糖、体温
和活动度。其中,具有代表性三天的基础血糖数据、体温和活动度绘制成曲线 图(图3.4 a-c)。从三天的基础血糖数据、体温和活动度曲线中我们能明显看 到,基础血糖、体温和活动度随着昼夜节律发生改变。我们将每只大鼠的基础 血糖、体温和活动度做了傅里叶变换[190],企图分析基础血糖、体温和活动度 的变化是否存在节律性(图3.4 d-f)。时频分析结果表示,基础血糖、体温和 活动度水平在24点处有一个峰值。表明,基础血糖、体温和活动度随着昼夜节 律变化在改变。进一步分析夜晚和白天的基础血糖、体温和活动度水平差异

(图3.4 g-i),结果表明夜晚基础血糖水平高于白天,夜晚体温和活动度也高于 白天。以上结果表明,基础血糖、体温和活动度随着昼夜节律变化在变化;并 且基础血糖、温度和活动度水平夜晚高于晚上,符合啮齿类动物昼伏夜出的生 活习惯。

3.4SD大鼠基础血糖、温度和活动度展示出昼夜节律

(a・c) SD大鼠三天内基础血糖、体温和活动度的水平;黑色和白色矩形分别代表 夜晚时间和白天时间。(a)基础血糖水平;(b)基础体温和(c)基础活动度水平。

(d-e)基础血糖,体温和活动度水平的傅里叶变换。(d)基础血糖的频谱在24小时 处遇到处于峰值;(e)温度的频谱在24小时处有个峰值;(f)活动度在24小时也有 个峰值。(g-i)白天和夜晚的基础血糖水平、温度和活动度相比较。@)夜晚基础 血糖水平高于白天;*, P=0.0351; (h)夜晚体温高于白天;*, P=0.0386o⑴夜晚 活动度高于白天;*p=0.0252。DT:白天,NT:夜晚,AMP:幅度。

3.1.3外部压力应激刺激急性扰乱了大鼠基础血糖的昼夜节律

压力应激刺激是否会影响基础血糖、体温和活动度?我们对大鼠进行连续 三天的压力应激刺激,每天随机进行一种压力应激刺激,共持续一周。一周中 基础血糖值、体温值和活动度被记录(图3.5 a-c) o从曲线中看出一周中基础 血糖值、体温和活动度不再保持规则的变化。将基础血糖、体温值和活动度分 别做傅里叶变换(图3.5 d-f) o结果表明,基础血糖时频在24小时处的不再有 明显的最高点,表明基础血糖节律被压力应激扰乱了;体温和活动度时频分析 也没有明显的高点,说明体温和活动度的节律也被压力应激刺激影响了。同 时,白天和夜晚的基础血糖值、体温水平和活动度相比较(图3.5 g-i),发现 均没有明显的差异。进一步证明,基础血糖、体温和活动度的节律变化被压力 应激扰乱了。

图3・5压力应激刺激扰乱基础血糖、温度和活动度的节律变化

(a・c)三天压力应激刺激过程中,基础血糖、温度和活动度水平。黑白相间的矩形分别代表 夜晚时间和白天时间。有颜色的线代表大鼠压力应激方式。(a)基础血糖水平;(b)体温变 化和(c)活动度变化.(d・f)在三天的压力应激刺激过程中,基础血糖水平、体温和活动度水 平的傅里叶变化;(d)在压力应激过程中,血糖水平的傅里叶变化在24小时处没有峰值;(e) 压力应激刺激过程中,体温在24小时有峰值;(f)活动度傅里叶变化在24小时处有峰值。(g- i)压力应激刺激过程中,三只大鼠夜晚和白天的基础血糖水平、体温和活动度相比较;(g) 夜晚平均基础血糖水平和白天没有差异;P=0.5616. (h)夜晚和白天的活动度没有差异;

P=0.3198. (i)夜晚和白天的温度没有差异;P=0.0902.

3.1.4外部压力应激刺激导致血糖节律长期消失

在压力应激刺激后的一周,我们继续监测基础血糖、体温和活动度(图3.6 a-c),发现基础血糖的并没有随着压力应激刺激的撤销而出现,体温和活动度 的节律变化逐渐恢复。之后,我们对每只大鼠三天中的基础血糖、体温和活动 度做时频分布(图3.6 d-f),发现在24小时处基础血糖仍然没有最高点,而体 温和活动度的时频分析结果在24小时处出现最高点。此外,白天和夜晚的平均 基础血糖水平、温度和活动度比较(图3.6 g-i),发现夜晚血糖水平低于白天 血糖水平;与图2中基础血糖数据相比较,压力应激刺激过后,夜晚基础血糖下 降;同时,夜晚体温和活动度均比压力应激刺激之前明显下降。

36压力应激引起大鼠基础血糖、体温和活动度变化

®c)压力应激刺激后,基础血糖、体温和活动度水平。黑白相间的矩形代表夜晚时间 和白天时间。(a)基础血糖水平;(b)体温变化和(c)活动度变化。(d・f)基础血糖水平、体温和 活动度水平的傅里叶变换。(d)基础血糖水平的时频分布在24小时处没有峰值;(e)体温的傅 里叶变换在24小时处有峰值;(f)活动度的傅里叶变化在24小时处有峰值。(g-i)白天和夜晚 基础血糖水平、体温和活动相比较。(g)血糖水平没有差异;P=0.7125. (h)夜晚体温低于白 天;P= 0.0300. (i)白天活动度比夜晚高;P=0.0256.

  • aBNSTGad2-ARC神经环路介导应激反应

3.2.1 aBNST中GABAergic神经元参与压力应激反应

压力应激过程中,有许多大脑核团及其神经环路参与其中,以实现动物的 趋利避害。束缚模型是一种经典的应激模型,不但能造成动物生理性应激反应 还能造成物理性应激反应[191, 192]O之前的研究证实,纹状体床核的前侧亚核 团(aBNST),下丘脑(hypothalamus),杏仁核(amygdala)和海马(hippocampus)都参 与压力应激调控[193-197]O为了进一步验证这四个核团在束缚应激中的作用, 我们用束缚压力应激方式刺激小鼠2小时之后,用免疫组织化学方法检查了标记 神经元活动的蛋白,即C・fbs的表达水平[198]O压力应激刺激后的小鼠跟非压力 应激刺激组相比较,纹状体床核、外侧下丘脑、弓状核、腹内侧下丘脑以及背 侧下丘脑中的c<fos表达水平明显升高(图3.7 a和图3.8 a-b),下丘脑中表达下 降,杏仁核中的表达增加。纹状体床核接收来自脑干、下丘脑、前额叶和边缘 系统的投射,参与调控压力应激反应,包括焦虑样行为、摄食、心血管功能、 内分泌和自主神经系统功能等表型[199-201]o在本研究中,我们的目的是研究 焦虑过程中基础血糖的变化。因此,在本研究中我们专注于两个功能都有的纹 状体床核。

为了更清楚地了解Y ■氨基丁酸能和谷氨酸能神经元在压力应激中活动模 式,我们比较了纹状体床核中Y ■氨基丁酸能和钙信号依赖的蛋白激酶II所标记 的神经元分布。我们用双病毒标记方法标记纹状体床核前侧中的Y ■氨基丁酸能 和钙信号依赖的蛋白激酶II神经元的分布。将同等数量的携带CaMKII/eYFP或 者DIO/mCheny元件的腺相关病毒颗粒注射进经Cre修饰过的Y ■氨基丁酸能神经 元小鼠的纹状体床核前侧脑区中。我们发现mCheny报告基因主要表达在前背侧 纹状体床核中,而eYFP报告基因主要表达在前腹侧纹状体床核中(图3.8 c), 表明Y ■氨基丁酸能神经元主要表达在前背侧纹状体床核中,钙信号依赖的蛋白

激酶II能神经元主要表达在纹状体床核前腹侧亚核团中。此外,我们也分析了 纹状体床核中其他亚核团中Y ■氨基丁酸能和钙信号依赖的蛋白激酶II神经元的 表达模式,包括内腹侧纹状体床核(图3.8 d),内背侧纹状体床核(图3.8

d),以及后侧纹状体床核(图3.8 d和图3.8 e)。

接下来的实验中,我们进一步探索纹状体床核中Y ■氨基丁酸能神经元和钙 信号依赖的蛋白激酶II标记的神经元在压力应激中的反应。30分钟束缚应激刺 激导致的C<fos的表达能和Y ■氨基丁酸能神经元共标记(图3.8 f),也能和钙信 号依赖的蛋白激酶II神经元共标记(图3.8 g) o同时,纹状体床核前侧中谷氨 酸能神经元也被C<fos共标记(图3.8 h),前人的研究结果也表明纹状体床核前 侧中的谷氨酸能神经元和心血管系统有关[202]o综合上述结果,我们发现纹状 体床核前侧中Y ■氨基丁酸能神经元,钙信号依赖的蛋白激酶II标记的神经元以 及谷氨酸能神经元都参与进压力应激反应。

38纹状体床核前侧参与压力应激反应

(a). 30分钟,60分钟的束缚应激刺激导致纹状体前侧中的C・fos表达增加;(b).除纹状体床核 前侧外,杏仁核、弓状核、下丘脑腹外测核团、下丘脑腹内侧核团、下丘脑背侧核团脑区 中的C・fos表达明显增加;在海马中,束缚应激刺激导致C・fos表达下降(n=3,0min; n=3, 30min; n=3; n=3, 120min); (c).在Gad-cre小鼠的双侧纹状体床核前侧注射DIO/mCherry的病 毒,在单侧纹状体床核前侧注射CaMKII/eYFP病毒,发现在纹状体床核前侧中Gad神经元 和CaMKII的分布分别处于背侧和腹侧;(d).在纹状体床核中侧以及后侧中,Gad神经元和 CaMKII神经元的分布;(e).统计纹状体床核中每个亚区之中的Gad神经元和CaMKII神经元 的分布,发现在前侧背侧主要为Gad神经元,腹侧为CaMKII神经元;在中部主要是Gad神 经元腹侧为CaMKII神经元在后侧,主要是Gad神经元(n=3); (f).给纹状体床核前侧注 射DIO/mCherry^毒的Gad小鼠,进行30分钟的束缚应激刺激后染C-fos,发现在纹状体床核 前侧中,C・fos和Gad神经元可以共染;(g).给纹状体床核前侧注射过CaMKII/mCheny病毒 的野生型小鼠经过30分钟束缚应激刺激,检测到在纹状体床核前侧中C・fos和CaMKII共 染;(h).野生型小鼠经过30分钟束缚应激刺激,检测到在纹状体床核前侧中Gfos和Vglut2 共染。数据用平均值土标准误展示。*, p<0.05;**, p<0.01;***, p <0.001,双因素实验 通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著性测定;单因素两组之间比较用f检验显著性。

3.2.2光激活aBNST中CaMKII神经元和GABAergic神经元不影响小鼠焦虑样 行为

我们想要探索压力应激激活的纹状体床核前侧核团是否参与焦虑样行为的 调控。我们用载有光敏蛋白ChR2/eYFP的CaMKII启动子腺相关病毒注射在野生 型小鼠纹状体床核前侧中(图3.9 a)。待病毒表达后,将光纤埋植在纹状体床 核前侧上方。一周后,检测小鼠在光刺激前后在十字高架迷宫箱中的行为表 现。我们发现在光刺激期间,小鼠在十字高架迷宫开放臂侧探索的时间没改变 (图3.9 b),进入开放臂探索时间也没改变(图3.9 c) o说明,小鼠纹状体床 核前侧中的CaMKII神经元激活不会导致小鼠产生在十字高架迷宫中的焦虑样行 为。光遗传抑制纹状体床核前侧中的CaMKII神经元会不会影响小鼠在十字高架 迷宫中的行为学表现,我们在纹状体床核前侧注射了 eNpHR3.0/mCherry的 CaMKII启动子的腺相关病毒,待病毒表达后,将双侧光纤埋植在小鼠纹状体床 核上方。检测小鼠在光遗传刺激前后,在十字高架迷宫中的行为,发现与对照 组相比,小鼠在十字高架迷宫并没有表现出在开放臂探索的时间(图3.9 b)和 次数(图3.9 c)的不同。因此,我们认为纹状体床核前侧中的CaMKII神经元不 直接参与焦虑行为的调控。

我们接下来探索纹状体床核前侧中的Y ■氨基丁酸能神经元是否参与焦虑样 行为的调控。我们用到了Vgat・ChR2・Eyfb的小鼠,Vgat是Y ■氨基丁酸神经递质 的转运体,该小鼠的Vgat神经元中表达有光敏通道蛋白ChR2以及报告蛋白Eyfjx 我们将光纤埋植在纹状体床核前侧上方(图3.9 d);纹状体与纹状体床核相连 接,且其中有大量的Y ■氨基丁酸能神经纤维(Lago, 2017 #251)。为了确保是纹 状体床核前侧的作用,我们在纹状体上方也埋植了光纤作为对照(图3.9 d); 且在另一个焦虑相关核团,杏仁核[203]埋植了光纤作为对照(图3.9 d) o光刺 激前后,我们采集小鼠在十字高架迷宫中的行为。发现光刺激纹状体床核、纹 状体或者杏仁核并不能影响小鼠在十字高架迷宫中开放臂探索的时间(图3.9

e)和次数(图3.9 f)。我们选择了旷场测试,检测小鼠在光遗传刺激纹状体床 核前侧、纹状体以及杏仁核前后,小鼠在旷场行为箱中的行为学反应。我们发 现在光刺激期间,小鼠在旷场中心区域探索的时间没有明显差异(图3.9 g); 在旷场中心区域探索的次数也没有明显差异(图3.9 h) o因此我们认为光激活 纹状体床核前侧中的Y ■氨基丁酸能神经元不会导致小鼠在高架十字迷宫以及旷 场中的焦虑样行为。

C57:BNST 二 CaMKII

图3・9激活aBNST中CaMKII或GABAergic神经元不能产生焦虑样行为

(a).小鼠纹状体床核前侧核团,病毒注射位置以及光纤埋植位置;(b).光激活或者抑制C57: aBNST: :CaMKII小鼠前后,并不能影响小鼠在十字高架迷宫开放臂中探索的时间(n=7, ChR2; n=9, eNpHR3.0; n=7, Control); (c).光激活或者抑制C57: aBNST::CaMKII/J、鼠前后, 小鼠在十字高架迷宫开放臂中探索次数(n=7, ChR2; n=9, eNpHR3.0; n=7, Control); (d).光 纤埋植在小鼠纹状体床核前侧上方、纹状体上方、以及杏仁核上方的示意图;(e).光激活 纹状体床核前侧、纹状体以及杏仁核不会影响小鼠在十字高架迷宫开放臂探索时间("6, Amygdala; n=6, aBNST; n=2, Striatum); (f).光激活纹状体床核前侧、纹状体以及杏仁核不 会影响小鼠在十字高架迷宫开放臂探索次数(n=6, Amygdala; n=6, aBNST; n=2, Striatum); (g).光激活纹状体床核前侧、纹状体以及杏仁核不会影响小鼠在旷场中心区域探索的时间 (n=10, Amygdala; n=7, aBNST; n=10, Striatum); (h).光激活纹状体床核前侧、纹状体以及杏 仁核不会影响小鼠在旷场中心区域探索的次数(n=10, Amygdala; n=7, aBNST; n=10, Striatum).数据用平均值土标准误展示。*, p<0.05;**, p<0.01;***, p <0.001,双因素实 验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著性测定;单因素两组之间比较用f检验显著 性。

3.2.3 aBNST中的GABAergic和CaMKII+神经元投射到下丘脑

为了探索纹状体床核前侧下游核团,我们在Gad-cre小鼠的纹状体床核前侧 注射等剂量的DIO/mCherry以及CaMKII/eYFP病毒(图3.10 a)。我们在下丘脑 腹内侧核团中神经纤维内主要有eYFP蛋白的表达(图3.10 b),在弓状核核团 内的神经纤维内主要有mCheiry蛋白的表达。

为了进一步确认纹状体床核前侧到下丘脑中的投射,我们将跨多级神经元 的伪狂犬病毒[204],注射在弓状核中(图3.10c) o伪狂犬病毒表达24小时后, 在纹状体床核前侧检测到有伪狂犬病毒携带的报告基因eYFP的表达(图3.10 d) o接着,我们用原位杂交技术在纹状体床核前侧标记Gad2神经元,发现 Gad2神经元可以和伪狂犬病毒共标记(图3.10d) o

综合以上结果,纹状体床核前侧Gad神经元主要投射到弓状核中,而纹状 体床核前侧中的CaMKII神经元主要投射到下丘脑腹内侧核团。

图3.10纹状体床核前侧CaMKII或GABAergic神经元投射到下丘脑

(a).在纹状体床核前侧双侧注射DlO/mCheny病毒,在单侧注射CaMKII/eYFP病毒(n=3); (b). 在下丘脑腹内侧核中,主要检测到红色荧光;在弓状核中主要检测到绿色荧光。(c).在弓 状核中注射伪狂犬病毒;(d).在纹状体床核前侧检测到伪狂犬病毒的表达,且原位杂交技 术发现伪狂犬病毒和God2探针可以共标记。

3.2.4 aBNSTCaMKII-VMH神经纤维的激活产生抗焦虑行为

我们尝试探索在纹状体床核前侧投射到下丘脑中CaMKII神经元是否参与焦 虑样行为的调控。我们先探索纹状体床核前侧到下丘脑腹内侧核团神经环路是 否参与调控焦虑样行为。在野生型小鼠的纹状体床核前侧注射携带着光敏蛋白 以及报告基因的Syn启动子的腺相关病毒(图3.11 a)。在病毒表达后,我们将 光纤埋植在纹状体床核前侧上方。一周后,我们检测小鼠在光刺激前后,小鼠 在旷场测试中的行为学表现。在光激活纹状体床核前侧神经元时期,小鼠的运 动速度没有改变(图3.11 b),因此我们直接统计小鼠在旷场中心区域的探索时 间以及探索次数。小鼠在旷场中心区域的探索时间与对照组相比,没有差异 (图3.11 c);小鼠去旷场中心区域的探索次数与对照组相比也没有差异(图 3.1 Id)。因此,我们认为纹状体床核前侧投射到下丘脑的神经环路的激活不能 导致小鼠焦虑行为。

我们探索小鼠纹状体床核前侧中CaMKII标记神经元投射到下丘脑的神经环 路是否参与焦虑样行为。在野生型小鼠的纹状体床核前侧注射CaMKII启动子的 带有光敏蛋白的腺相关病毒。在病毒表达后,将光纤埋植在纹状体床核前侧上 方(图3.11 e) o光纤埋植一周后,检测小鼠在光刺激前后在旷场中的行为。我 们发现5min的光刺激期间,小鼠的运动速度明显加快(图3.11 f)。因此,我们 统计小鼠在中心区域探索时间与侧面探索时间比,发现小鼠在光刺激期间小鼠 在中心区域探索时间与侧面探索时间比明显增加(图3.11 g),但光刺激并不能 改变小鼠在中心区域探索次数与侧面探索次数比(图3.11 h) o

我们探索小鼠在光刺激期间是否有偏好或者厌恶情绪。我们检测小鼠在光 刺激期间在条件性位置偏好行为学中的反应。在测试第一天,我们将小鼠放在 条件性位置偏好性检测箱中,统计小鼠在适应两侧箱体中探索时间和次数。我 们发现小鼠在两侧箱体中探索时间没有明显差异(图3.11 i),探索次数没有差 异(图3.11J),在两侧箱体中探索的速度没有差异(图3.11 k) o在实验第二天, 我们将小鼠放在一侧箱体中进行光刺激5分钟。在实验第三天,我们让小鼠在两 侧箱体中自由探索,统计小鼠在两侧箱体中探索时间(图3.11 i),探索次数

(图3.11J)以及探索速度没有明显差异(图3.11k)。

因此,我们得出结论,激活纹状体床核前侧投射到下丘脑腹内侧核团中的 CaMKII神经环路产生抗焦虑样行为,不会导致厌恶以及偏好行为。

C57:aBNST-VMH::Syn-ChR2-eYFP

Conditional place preferece

图3.11 aBNSTCaMKII-VMH激活产生抗焦虑行为

(a).在纹状体床核前侧注射Syn/ChR2/eYFP病毒,光纤埋植在下丘脑腹内侧核团上方;(b). 光激活纹状体床核前侧投射到下丘脑腹内侧核团的神经纤维,不改变小鼠在旷场中运动的

速度(n=3, ChR2; n=2, eYFP) ; (c).不改变小鼠去旷场中心区域探索的时间(n=3, ChR2; n=2, eYFP) ; (d).不改变小鼠去旷场中心区域探索的次数(n=3, ChR2; n=2, eYFP)。(e). 在小鼠纹状体床核前侧注射CaMKII/ChR2/eYFP病毒,在下丘脑腹内侧核检测到eYFP蛋白 表达,光纤埋植在下丘脑腹内侧核团上方;(f).光激活小鼠纹状体床核前侧投射到下丘脑腹 内侧核团的CaMKII神经纤维,导致小鼠运动速度明显增加(n=3, ChR2; n=2, eYFP) ; (g). 导致小鼠在旷场中心区域探索时间与侧面探索时间比明显升高(n=3, ChR2; n=2, eYFP); (h).导致小鼠在旷场中心区域探索次数与侧面探索次数比没有变化(n=3, ChR2; n=2, eYFP) ;   (i).小鼠在条件性位置偏好测试箱中在适应期以及提取期在两侧箱体中探索时间

没有差异(n=4, No stimulation; n=4, Stimulation) ; (j).小鼠在条件性位置偏好测试箱中在 适应期以及提取期在两侧箱体中探索次数没有差异(n=4, No stimulation; n=4, Stimulation) ; (k).小鼠在条件性位置偏好测试箱中在适应期以及提取期在两侧箱体中探索 速度没有差异(n=4, No stimulation; n=4, Stimulation)。数据用平均值土标准误展示。*, p <0.05;**, p <0.01; ***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著 性测定;单因素两组之间比较用f检验显著性。

3.2.5光激活aBNSTGad2-VMH神经环路导致小鼠焦虑

之后我们想解析纹状体床核前侧投射到弓状核的Gad神经环路以及Vglut神 经环路在焦虑应激反应中的作用。我们将DIO/ChR2/mCherry病毒表达在Gad・ ere小鼠的纹状体床核前侧中,将光纤埋植在小鼠弓状核上方(图3.12 a)。在 光刺激前后,检测小鼠在旷场和十字高架迷宫中的行为。我们发现光刺激不会 影响小鼠运动速度(图3.12 C),但是明显降低了小鼠在十字高架迷宫中去开放 臂探索的时间(图3.12 b和d)以及次数以及去十字高架迷宫开放臂探索次数 (图3.12 e);在旷场实验中,光刺激不会影响小鼠去旷场中心区域运动的速度 (图3.12 g),但是会降低小鼠去中心区域探索时间(图3.12 541),小鼠在中 心区域探索次数没有变化(图3.12 i)。以上结果表明,纹状体床核前侧投射到 弓状核的GABAergic神经环路的激活,导致小鼠产生焦虑样行为。为了进一步 确认该结论,我们在光刺激之后,监测了小鼠的应激激素水平。发现光刺激导 致小鼠的可的松,和去甲肾上腺素水平都升高 03.12 j-k)。表明,激活纹状体 床核前侧到弓状核的GABAergic神经环路,导致小鼠产生明显的应激行为。

此后,我们抑制纹状体床核前侧中的GABAergic神经元到弓状核的神经环 路的功能,检测小鼠的焦虑样行为。我们在双侧纹状体床核前侧核团注射 DIO/eNpHR3.0/mChen*y病毒,在病毒表达后,将光纤埋植在弓状核上方。在黄 光抑制前后,检测小鼠在十字高架迷宫以及旷场中的行为反应。我们发现在光 刺激前后,小鼠在旷场中的运动速度没有变化(图3.12 m),小鼠在旷场中心 区域探索的时间与对照组相比明显增加(图3.12 l&n),小鼠去旷场中心区域探 索的次数没有变化(图3.12 o) o之后,我们测试Gad-cre/ht在黄光刺激前后 在十字高架迷宫中的行为学。发现黄光刺激没有改变小鼠的运动速度(图3.12 p),导致小鼠去十字高架迷宫开放臂中探索时间没有变化(图3.12 q),去开 放臂探索次数没有变化(图3.12 r);之后,我们检测黄光刺激后,小鼠应激激 素分泌的变化。发现黄光刺激没有改变小鼠可的松和去甲肾上腺素分泌的变 化,但是在应激刺激条件下,黄光抑制纹状体床核前侧投射到弓状核的GABA 能神经环路逆转由于束缚应激刺激导致的可的松(图3.12 s)以及去甲肾上腺素 (图3.12 t)水平的升高。综合以上结果,我们得出结论光遗传学抑制纹状体床 核前侧GAB A神经元投射到弓状核的神经环路产生抗焦虑行为。

我们探索了纹状体床核前侧的谷氨酸能神经元投射到下丘脑腹内侧核团神 经环路的功能。在Vglut2-cre小鼠的纹状体床核前侧注射DIO/eNpHR3.0/mCherry 病毒,在下丘脑腹内侧核上方埋植光纤(图3.12 u) o在黄光刺激前后,检测小 鼠在十字高架迷宫中的行为学反应。我们发现黄光刺激不会影响小鼠在十字高 架迷宫中的运动速度(图3.12 v),不会改变小鼠在十字高架迷宫开放臂中的探 索时间(图3.12 w)以及次数(图3.12 x) o接着,我们在Vglut2-cre小鼠的纹状 体床核前侧注射DIO/ChR2/mCherry病毒,在下丘脑腹内侧核上方埋植光纤。在 光刺激前后,检测小鼠在旷场和十字高架迷宫中的行为,发现在光刺激过程中 小鼠的运动明显加快,即光刺激加速小鼠的运动速度(图3.12 y) o检测小鼠在 光刺激后,应激激素水平的变化。我们发现蓝光刺激结束5分钟后,小鼠的可的 松水平明显升高(图3.12 z),以及去甲肾上腺素水平明显升高(图3.12 A)表明激活纹状体床核前侧中的谷氨酸能神经元投射到下丘脑腹内侧核团的神经 环路导致小鼠运动速度增加。

综合以上结果,我们得出结论纹状体床核前侧GABAergic神经元投射到弓 状核的神经环路介导应激反应,即介导焦虑样行为,以及内分泌变化;而纹状 体床核前侧谷氨酸能神经元投射到下丘脑腹内侧核团的神经环路介导小鼠运动 速度的增加。

Vg/uf2-cre::aBNST-VMH:eNpHR3.0

图3.12 aBNSTGad2-ARC介导小鼠应激反应 (a).在Gad・cre小鼠的纹状体床核前侧注射DI0/ChR2/mCherry病毒,在弓状核上方埋植光 纤;(b).蓝光刺激导致小鼠在十字高架迷宫开放臂的探索距离明显下降;(c).蓝光刺激没有 改变小鼠运动总距离(n= 12, ChR2; n = 6, mCherry); (d).蓝光刺激导致小鼠在十字高架迷宫 开放臂侧探索时间明显下降(n = 12, ChR2; n = 6, mCherry); (e).蓝光刺激导致小鼠在十字高 架迷宫开放臂探索次数明显下降(n = 12, ChR2; n = 6, mCherry)o (f).蓝光刺激导致小鼠在旷 场中心区域探索距离下降;(g).蓝光刺激不会改变小鼠在旷场中运动的总距离(n=8, ChR2; n = 6, mCherry); (h).蓝光刺激导致小鼠在旷场中心区域探索时间明显下降(n = 8, ChR2; n = 6, mCherry); (i).蓝光刺激没有改变小鼠去中心区域探索的次数(n = 8, ChR2; n = 6, mCherry)o (j).蓝光刺激导致小鼠可的松水平升高(n = 4, mCherry; n = 6, ChR2) ; (k).蓝 光刺激导致小鼠的去甲肾上腺素水平升高(n = 5, mCherry; n = 3, ChR2)。(1).黄光抑制小 鼠纹状体床核投射到弓状核的GABA神经环路导致小鼠在旷场中心区域探索的距离增加(n

=5, eNpHR3.0; n = 10, mCherry) ; (m).黄光抑制没有改变小鼠在旷场中运动总距离(n = 5, eNpHR3.0; n = 10, mCherry) ; (n).黄光抑制导致小鼠在旷场中心区域探索时间明显增加

(n = 5, eNpHR3.0; n = 10, mCherry) ; (o).黄光抑制导致小鼠去旷场中心区域探索次数明 显增加(n = 5, eNpHR3.0; n = 10, mCherry) ; (p).黄光抑制没有改变小鼠在十字高架迷宫 中探索的总距离(n = 6, eNpHR3.0; n=5, mCherry); (q).黄光抑制没有改变小鼠在十字高架迷 宫中开放臂中探索的时间(n = 6, eNpHR3.0; n=5, mCherry); (r).黄光抑制没有改变小鼠去十 字高架迷宫开放臂中探索的次数(n = 6, eNpHR3.0; n=5, mCherry); (s).黄光抑制纹状体床核 前侧投射到弓状核的GABA神经环路逆转由于束缚应激刺激导致的小鼠皮质酮水平升高(n = 3, stress, eNpHR3.0; n = 3, stress, mCherry; n = 8, no stress, mCherry); (t).黄光抑制小鼠逆转 由于束缚应激刺激导致的去甲肾上腺素水平(n = 3, stress, eNpHR3.0; n = 4, stress, mCherry; n =3, no stress, mCherry)o (u).在Vglut2小鼠的纹状体床核前侧注射DIO/eNpHR3.0/mCherry病 毒,光纤埋植在下丘脑腹内侧核团上方;(V).黄光抑制纹状体床核到下丘脑腹内侧核团的 谷氨酸能神经环路不影响小鼠在旷场实验中运动速度(n= 5, eNpHR3.0; n = 7, Control); (w). 黄光抑制不影响小鼠在旷场中心区域探索时间(n = 5, eNpHR3.0; n = 7, Control); (x).黄光抑 制不影响小鼠去旷场中心区域探索次数(n = 5, eNpHR3.0; n = 7, Control); (y).蓝光激活纹状 体床核前侧投射到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神经环路导致小鼠运动速度明显增加(n = 12, ChR2; n = 6, mCherry); (z).蓝光激活纹状体床核前侧投射到下丘脑腹内侧核团的谷氨 酸能神经环路,导致被激活小鼠血液中皮质酮水平明显升高(n=3, mCherry; n=5 ChR2); (A).蓝光激活纹状体床核前侧投射到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神经环路,导致小鼠血 液中去甲肾上腺素水平升高(n=3, mCherry; n=5 ChR2)o数据用平均值土标准误展示。*, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著 性测定;单因素两组之间比较用f检验显著性。

3.2.6 ARCGad2-NTS介导由aBNSTGad2-ARC激活产生的焦虑反应

我们探索了弓状核的下游脑区,在弓状核注射顺行跨单突触标记的疱疹病 毒HSV。24小时后,在脑干区域检测到有HSV/eYFP信号的表达(图3.13 a)。 其中,中缝核(图3.13 b)以及孤束核(图3.13 c)是被感染的两个脑区。

图3.13 ARC投射到ROb以及NTS

(a).在野生型小鼠弓状核区域注射HSV/eGFP病毒;(b).在中缝核检测到疱疹病毒携带的报 告基因的表达;(c).在孤束核检测到疱疹病毒携带的报告基因的表达。

在前人的研究里,发现孤束核是有介导焦虑样行为(Schwaber, 1982 #388)。 因此,我们用三级神经环路操纵系统特性地标记弓状核到孤束核的GABAergic 神经环路的投射。具体来说,是在Gad・cw小鼠的孤束核注射一种被突触吸收的 病毒,CAV-flex-flp病毒,CAV载着flex/flp元件,从孤束核逆行到其上游脑区。 此时,在弓状核注射一种fDIO/hM4Di/mCherry病毒,在fDIO的选择表达下,病 毒将会在弓状核中表达ere且顺行到孤束核的细胞中表达(图3.14 a)

之后,我们用药物遗传学技术,将表达hM4Di的细胞抑制,然后用光遗传 学激活纹状体床核前侧到弓状核的GABA能神经环路。在光激活前后,检测小 鼠在旷场以及十字高架迷宫中的行为。我们发现,在腹腔注射CNO半小时以 后,我们再光激活纹状体床核前侧到弓状核的GABA能神经环路时,小鼠在旷 场中心区域探索时间没有变化(图3.14 b-c);小鼠在旷场中心区域探索次数没 有变化(图3.14 d),光刺激没有改变小鼠的运动距离(图3.14 e) o其次,在 腹腔注射CNO半小时以后,我们再光激活纹状体床核前侧到弓状核的GABA能 神经环路时,我们检测小鼠在十字高架迷宫中开放臂的时间没有变化(图3.14 tg),小鼠去十字高架迷宫中开放臂的次数没有变化(图3.14 h),光刺激没 有影响小鼠的运动总距离03.14 i) o在腹腔注射CNO半小时以后,我们再光 激活纹状体床核前侧到弓状核的GABA能神经环路时,我们检测小鼠应激激素 变化。我们检测到小鼠在光刺激后,皮质酮水平没有变化(图3.14 j);去甲肾 上腺素水平没有变化(图3.14k);肾上腺素水平没有变化(图3.14 1) o

综合以上结果,可以看出弓状核到孤束核的GABA能神经环路被抑制后, 纹状体床核前侧到弓状核GABA神经环路激活产生的焦虑信号不能被传递到外 周。即弓状核到孤束核的GABAergic神经环路介导由纹状体床核前侧到弓状核 GABA神经环路激活产生的焦虑信号的下行。

14抑制ARCGad2-NTSJS,再激活aBNSTGad2-ARC小鼠没有焦虑样行为

(a).三级神经环路病毒注射简图;(b).在腹腔注射CNO后,蓝光激活aBNSTGad2-ARC神经环 路,没有改变弓状核到孤束核神经环路被抑制组小鼠在旷场中心区域探索距离(n = 9, ROb; n = 7, NTS); (c).未改变弓状核到孤束核神经环路被抑制组小鼠在旷场中心区域探索时间(n =9, ROb; n = 7, NTS); (d).不改变弓状核到孤束核神经环路被抑制组小鼠在旷场中心区域 探索次数(n = 9, ROb; n = 7, NTS), (e).不影响小鼠运动总距离(n = 9, ROb; n = 7, NTS); (f). 在CNO腹腔注射后,蓝光激活aBNSTG^.ARC神经环路,没有改变弓状核到孤束核神经环 路被抑制组小鼠在十字高架迷宫开放臂中探索距离(n = 9, ROb; n = 7, NTS); (j).未改变弓 状核到孤束核神经环路被抑制组小鼠在十字高架迷宫开放臂区域探索时间(n = 9, ROb; n = 7, NTS); (h).未改变弓状核到孤束核神经环路被抑制组小鼠在十字高架迷宫开放臂区域探 索次数(n = 9, ROb; n = 7, NTS); (i).未改变弓状核到孤束核神经环路被抑制组小鼠在十字 高架迷宫中运动总距离(n = 9, ROb; n = 7, NTS); (j).未改变弓状核到孤束核神经环路被抑制 组小鼠的皮质酮水平(n = 4, ROb; n = 4, NTS); (k).未改变弓状核到孤束核神经环路被抑制 组小鼠的去甲肾上腺素水平(n = 4, ROb; n = 4, NTS); (1).未改变弓状核到孤束核神经环路被 抑制组小鼠的肾上腺素水平(n = 4, ROb; n = 4, NTS).数据用平均值土标准误展示。*, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著 性测定;单因素两组之间比较用f检验显著性。

3.3压力应激导致的高血糖反应的神经环路机制

3.3.1激活aBNST中GABAergic神经元引起高血糖反应

纹状体前核不但参与焦虑行为调控,也参与自主神经系统活动以及内分泌 的调控[205],因此我们选定纹状体床核(图3.15 a)继续探索,压力应激下高血 糖的反应。为探索纹状体床核前侧中神经元如何影响基础血糖水平,我们用光 遗传学技术操纵纹状体床核前侧中的神经元,且选取最简单的实验范式作为研 究过程(图3.15 b) o

首先,突触角蛋白I是神经末梢的一种磷酸化蛋白,主要表达在神经元中 [206]o我们用突触蛋白I作为启动子将光敏感蛋白・2表达在纹状体床核前侧亚核 团中,即将携带hSyn/ChR2/e¥FP元件的腺相关病毒颗粒注射入野生型小鼠纹状 体床核前侧亚核团中,待eYFP报告基因表达后,将光纤埋在注射过腺相关病毒 的纹状体床核前侧亚核团上方(图3.15 c),注射过携带hSyn/eYFP元件的野生型 小鼠作为对照组。在正式监测光调控下小鼠的基础血糖前,在第一天和第二天 连续给小鼠采血让小鼠适应采血操作。第三天,用473nm波长的蓝光连续刺激5 分钟小鼠纹状体床核前侧,同时每5分钟测一次小鼠的基础血糖水平。与对照组 相比,实验组的基础血糖在5分钟光刺激期间内急速升高,保持高血糖状态到光 刺激后10分钟(图3.15 d)。纹状体床核前侧的Y ■氨基丁酸能神经元还是钙信 号依赖的蛋白激酶II标记的神经元导致高血糖反应?

接着,我们用同样的技术手段操纵纹状体床核前侧亚核团中钙信号依赖的 蛋白激酶II标记的神经元。在纹状体前侧亚核团中,单侧注射载有 CaMKII/ChR2/eYFP元件的腺相关病毒到野生型小鼠的纹状体床核前侧亚核团 中,将光纤埋植在注射过病毒侧的纹状体床核亚核团上方(图3.15 e) o在携带 光敏蛋白元件的组和没有携带光敏蛋白元件组的小鼠中,473nni波长的蓝光刺 激后两组小鼠的基础血糖水平并没有差异(图3.15 f) o接着,我们尝试用 Enhanced Natronomonas pharaonis halorhodopsin 3.0去抑制纹状体床核前侧亚核 团中钙信号依赖的蛋白激酶II标记的神经元(eNpHR3.0;图3.15 g)。然而, 593nm波长的黄光刺激纹状体床核前侧亚核团并没有导致有eNpHR3.0元件的小 鼠组和没有eNpHR3.0元件小鼠组之间基础血糖的差异(图3.11 h)。综上实验 结果,纹状体床核前侧亚核团中钙信号依赖的蛋白激酶II标记的神经元激活不 足以引起高血糖反应。

之后,我们尝试用光遗传学操纵纹状体床核前侧亚区中的Y ■氨基丁酸能神 经元。我们将载有DIO/ChR2/mCherry元件的腺相关病毒注射在Gad-cre小鼠的纹 状体床核前侧亚区中,光纤埋置在病毒注射侧纹状体床核前侧亚区的上方(图 3.15 i).由于Y ■氨基丁酸能神经元是快放电神经类型[120, 207],我们选用20HZ 和50HZ光刺激模式操纵纹状体床核前侧脑区的丫・氨基丁酸能神经元。在用 473nm波长的光刺激Gad・cre小鼠的纹状体床核前侧亚区时,50HZ模式的光刺激 引起Gad・cre小鼠基础血糖水平的升高(图3.15j)。

图3.15 aBNST中GABAergic神经元控制咼血糖症。

(a).纹状体床核前侧区域的示意图;(b).显示光遗传学实验时间的示意图;(c).将rAAV・ Syn・ChR2・eYFP重组病毒注入纹状体床核前侧,并将光纤单侧植入纹状体床核前侧上方。光 刺激诱导C・fbs表达(红色荧光);(d).在20Hz, 5mW的473nni光刺激纹状体床核前侧增加血 糖水平。蓝条表示光刺激的时间(ChR2, n = 7; eYFP, n = 9); (e).将rAAV-CaMKII-ChR2- eYFP病毒注入纹状体床核前侧,并将光纤单侧植入纹状体床核前侧上方。光刺激诱导C-fos 表达(红色荧光);(f). 473nm光刺激不影响基础葡萄糖水平(ChR2, n = 14; eYFP, n = 23). 蓝色条表示光刺激的时间;(g).将rAAV-CaMKII-eNpHR3.0-mCherry病毒双侧注射到纹状体
床核前侧中,并将光纤双侧植入纹状体床核前侧上方;(h). 100Hz, 100mW 593nm黄光刺激不 影响葡萄糖水平(eNpHR3.0, n = 10; mCherry, n = 22).黄色条表示光刺激的时间。⑴.将 rAAV-DIO-ChR2-mCherry病毒单侧注射到纹状体床核前侧中,并将光纤单侧植入纹状体 床核前侧上方。光刺激诱导c・fos表达(绿色荧光);(j). 50Hz, 473nm光刺激诱导高血糖反 应(n = 7, aBNST, 20Hz; n = 7, aBNST, 50Hz).蓝色条表示光刺激时间。数据用平均值土标准 误展示。*, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001,双因素实验通过双因素

图3.18激活aBNSTGad2-ARC引起高血糖反应

(a).单侧rAAV-DIO-ChR2-mCherry^毒注入aBNST,并在Gad2・cre小鼠中植入ARC上方的光 纤示意图;(b). mCherry荧光蛋白在Gad2-cre小鼠的aBNST中选择性表达;(c). mCherry在 ARC神经末梢中选择性表达;(d). ARC(upper)冠状切面中,全细胞记录位置的图像。光诱 发的IPSCs (抑制性突触后电流)痕迹记录在ARC神经元中;(e).光遗传学实验示意图;⑴. 光刺激增加血糖水平,刺激后5分钟持续高血糖状态(n = 10, ChR2; n = 10, mCherry) (g).身 上腺素水平升高(n =3, mCherry; n = 3, ChR2). (h).胰岛素水平降低(n = 10, mCherry; n = 6, ChR2).数据用平均值土标准误展示。*, p<0.05;**, p<0.01;***, p <0.001,双因素实验 通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著性测定;单因素两组之间比较用f检验显著性。

3.3.3抑制aBNSTGad2-ARC逆转由压力应激导致的高血糖反应

纹状体床核前侧投射到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经纤维是高血糖反应所必 须?我们将载有DIO/eNpHR3.0/mCherry元件的腺相关病毒双侧注射入纹状体床 核前侧,将光纤埋置在弓状核脑区上方(图3.19 a) o在病毒注射6周后,检测 到纹状体前侧亚区mCherry®告蛋白的表达,在弓状核检测到来自纹状体床核前 侧Y ■氨基丁酸能神经元神经纤维(图3.19 b) o黄光刺激后过程中,我们的实 验范式(图3.19 c)。

接下来,我们在抑制纹状体床核前侧到弓状核中的神经环路时,检测小鼠 基础血糖水平,发现小鼠的基础血糖并没有变化(图3.19 d) o在压力应激中, 纹状体床核前侧到弓状核的神经纤维Y ■氨基丁酸能神经环路如何调控基础血 糖?我们在束缚压力应激刺激条件下,监测小鼠在黄光抑制前后的基础血糖水 平。发现,束缚压力应激刺激引起的高血糖反应在黄光抑制纹状体床核前侧到 弓状核的Y ■氨基丁酸能神经环路时会消失(图3.19 e) o

为了进一步确认该结果,我们取了处于压力应激条件中,受到黄光抑制且 感染过eNPhR3.0的小鼠组和未感染过Enphr3.0小鼠组的血液。用酶联免疫方 法,检测血清胰岛素水平以及免疫因子白介素・6水平(图3.19 tg) o发现黄光 抑制纹状体床核前侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经回路能逆转由束缚压力应激 刺激导致胰岛素,但是没有逆转免疫因子的升高。综合以上结果,纹状体床核 前侧亚区投射到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经纤维抑制产生抗焦虑行为;能逆转 压力应激引起胰岛素升高。

图3.19 aBNSTGad2-ARC是应激诱导的高血糖所必须

(a).将rAAV-DIO-eNpHR3,0-mCherry^毒双侧注射到aBNST中,并将光纤植入Gad2-cre小鼠 的ARC上方;(b). mCherrySaBNST^申经元和ARC神经纤维中表达;(c).光遗传学实验安排。

(d). 593 nm的光刺激不影响葡萄糖水平(n = 6, eNpHR3.0; n = 9, mCherry); (e).逆转由束缚应 激诱导的高血糖反应(n = 14, eNpHR3.0; n = 8, mCherry).黄色条表示光刺激的时间;(f).应激 诱导的胰岛素水平变化(n = 4, Stress+eNpHR3.0; n = 3, Stress+mCherry ; n = 4, mCherry). 1.逆 转由应激诱导的IL-6水平 的增加(n = 4, Stress+eNpHR3.0; n = 3, Stress+mCherry; n = 4, mCheny).数据用平均值土标准误展示。*, p <0.05;               p<0.01;***, p <0.001,双因素实

验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著性测定;单因素两组之间比较用丫检验显著 性。

3.3.4光激活aBNSTGad2-ARC引起的高血糖反应并非依赖肾上腺

激活纹状体床核前侧亚核团投射到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经环路导致基 础血糖水平升高的环路机制是什么?在胰岛素发现以来,基础血糖的调控的研 究由中枢转入外周的胰岛.经过10多年的不懈努力,前人发现胰岛B细胞分泌的 胰岛素和胰岛A细胞分泌的胰高血糖素共同协调作用于肝脏[209],肌肉和脂肪 组织得以维持动物基础血糖的稳定平衡[210]o而胰岛素和胰高血糖素的分泌同 时受到肾上腺和交感神经系统的调控[94]o交感神经系统分泌的去甲肾上腺素 抑制胰岛分泌胰岛素,而肾上腺分泌的皮质酮,肾上腺素促进胰岛素的分泌, 抑制胰高血糖素的分泌。因此我们探索了是交感神经系统作用于胰岛抑制胰岛 素的分泌还是肾上腺皮质分泌调控了胰岛减少胰岛素的释放。

我们在将纹状体床核前侧Y ■氨基丁酸能神经元感染过光敏蛋白的小鼠做肾 上腺切除(图3.20 a) o然后在蓝光激活纹状体床核前侧到弓状核通路的Y ■氨 基丁酸能神经纤维时,监测小鼠基础血糖。我们发现在蓝光激活纹状体床核前 侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经通路时,肾上腺切除的小鼠基础血糖仍然升高 03.20 c) o在蓝光激活纹状体床核前侧到弓状核丫・氨基丁酸能神经通路5分 钟时,我们采集小鼠的血清用酶联免疫方法检测小鼠血清中皮质酮,肾上腺 素,去甲肾上腺素以及胰岛素和胰高血糖素的含量。发现皮质酮和肾上腺素在 肾上腺切除的小鼠中水平很低(图3.20 b和d)。但是在光激活纹状体床核前侧 到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经纤维时,小鼠的胰岛素水平下降(图3.20 f), 去甲肾上腺素依然升高(03.20 e) o

综合上述结果,纹状体床核前侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经通路可以经 过交感神经系统抑制胰岛素分泌,从而升高基础血糖。在此过程中,肾上腺不 是必须的。

图3. 20肾上腺对激活aBNSTGad2-ARC诱导的高血糖是不必要

(a).肾上腺切除术实验示意图,病毒在aBNST中的Gad2神经元表达。(b).光刺激没有改变皮 质酮水平(n = 3, mCherry; n = 3, ChR2). (c).光遗传激活增加了肾上腺切除的Gad2小鼠中 的葡萄糖水平(n = 14, ChR2; n = 14, mCherry)蓝条表示光刺激的时间。(d).光刺激期间肾 上腺素水平没有变化(n = 3, ChR2; n = 3, mCherry); (e).光刺激增加去甲肾上腺素水平(n =

  • ChR2; n = 3, mCherry); (f).光刺激降低胰岛素水平(n = 6, mCherry; n = 3, ChR2). (g).降 低GIP水平(n = 7, mCherry; n = 3, ChR2); (h).光刺激不会影响瘦素水平(n = 6, mCherry; n =
  • ChR2 ); (i).光刺激不会影响IL・6水平(n=5, mCherry; n = 6, ChR2 )数据用平均值土标准 误展示。*, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析, Bonfernmi检验显著性测定;单因素两组之间比较用f检验显著性。

3.3.5弓状核通过脑干中的孤束核和中缝核与胰腺连接

伪狂犬病毒在标记交感神经系统中有非常大的优势。用跨多突触的伪狂犬 病毒注射入野生型小鼠的胰腺组织内(图3.21 a),在胸节骨髓神经束中检测到
有报告蛋白eGFP的表达(图3.21 b)-之后,在脑干中的孤束核和中缝核,中

脑的中脑导水管核团和下丘脑中的室旁核也检测到报告蛋白的表达(图3.21

b)。

图3. 21 ARC通过NTS和ROb连接到胰腺

(a).使用伪狂犬病病毒(PRV)从胰腺逆行追踪。(a). PRV・CMV・eGFP注到野生型小鼠胰腺 中的示意图(n = 3) ; (b). eGFP在由胸干脊髓,NTS和脑干ROb的PRV逆行转运感染的细胞 中表达;在中脑的PAG中;在下丘脑的PVN, DM和ARC中;在边缘系统的杏仁核中;c-e. 使用Cre依赖性单纯疱疹病毒(HSV)从ARC进行顺行追踪;(c). AAV / DIO / Tk和HSV /△ Tk /tdtomato注射到ARC中的示意图和在Gad2-cre小鼠的ARC中的tdtomato表达(n = 3); (d). tdtomato在NTS中表达,方框区域在右侧放大;(e). tdtomato在ROb中表达,方框区域在右侧 放大;亡g.使用逆行AAV从ROb或者NTS逆行追踪;(f). Cre依赖的rAAV-Efl a -DIO-EYFP- WPRE-pA输注到ROb中的示意图,以及在Gad2-cre小鼠的ROb中的eYFP表达;(g).取单细 胞的位置;(h).弓状核中eYFP的表达;⑴.在弓状核中取19个单细胞,用Q-PCR分析POMC, AGRP, POMC 和SST基因的表达。NTS,孤束核;ROb, raphe obscurus nucleus; PAG,导水 管周围灰色;PVN,下丘脑室旁核;DM,背内侧下丘脑核

纹状体床核前侧到弓状核Y ■氨基丁酸能神经回路是通过什么样的神经机制 将基础血糖调控信号传出到交感神经系统的?从伪狂犬病毒标记实验得到启 发,孤束核和中缝核是两个值得考虑的区域。因此我们进一步确定,弓状核到 中缝核或者孤束核的神经连接。我们将载有DIO/TK/tm的腺相关病毒注射入 Gad-cre小鼠的弓状核中(图3.21 c),待腺相关病毒表达后,将装载着tdtomato 荧光蛋白的tk缺陷型疱疹病毒注射入弓状核中。一周后,我们在脑干检测到有 tdtomato荧光蛋白的表达,孤束核和中缝核是其中的两个核团(图3.21 d-e) o

之前的跨单突触狂犬病毒标记技术,证明在孤束核注射狂犬病毒,在弓状 核能检测到报告蛋白的表达[110],为弓状核和孤束核之间直接的神经连接提供 了最强有力的证据。然而,弓状核和中缝核之间的逆行标记还未报道。因此, 我们将可以被神经末梢吸收的腺相关病毒注射在中缝核或者孤束核中(图3.21

f),在弓状核神经元中我们检测到报告蛋白eYFP的表达(图3.21 h) o

弓状核中的多个神经元类型已经被阐释与血糖代谢有关,药物遗传学抑制 AGRP神经元增加小鼠的胰岛素敏感性[145]O因此,我们探索弓状核中的那种 Y ■氨基丁酸能神经元投射到中缝核以及孤束核?分别在中缝核和孤束核注射逆 行标记的腺相关病毒。3周之后用膜片钳在弓状核(图3.21 g)取带荧光的细胞 进行反转录聚合酶链式反应,检测在每个荧光细胞中AGRP, POMC, SST以及 NPY基因的相对表达量(图3.21 i)。我们发现逆行标记病毒注射在孤束核的小 鼠其弓状核中的荧光细胞,其AGRP和POMC基因的表达量比病毒注射在中缝 核的小鼠高;而病毒注射在中缝核的小鼠弓状核的荧光细胞表达SST大于病毒 注射在孤束核的小鼠。该实验说明,弓状核的AGRP神经元投射到孤束核,而 弓状核的SST神经元投射到中缝核。然而,由于该实验中每组动物只有3只,细 胞数量只有6例和4例,样本量太小,不够支持该结论。因此,我们之后对于功 能学的探索只停留在弓状核中的Y ■氨基丁酸能神经元。

3.3.6 ARCG血・ROb介导压力应激导致的高血糖反应

弓状核投射到中缝核的Y ■氨基丁酸能神经纤维以及弓状核投射到孤束核的 Y ■氨基丁酸能神经纤维是否介导由纹状体床核前侧亚区到弓状核Y ■氨基丁酸 能神经纤维激活导致的血糖调控信号的下行?为解决这一科学问题,我们尝试 设计可以同时操纵三级神经环路的实验[211]o

CAV病毒是一种被神经元纤维吸收的病毒。若将ere和flp系统嵌入CAV病毒 中,可以实现特异细胞类型的特异神经环路的标记。该实验方案为:将三级神 经核团分别定义为A, B, C脑区。将载有flex/flp元件的CAV病毒注射入ere小鼠的 C脑区,CAV病毒会带着flex/flp元件逆行到C脑区的上游脑区,B脑区是其中之 一。在B脑区表达ere蛋白的细胞中,CAV启动flp蛋白的表达。之后我们在B脑 区注射载有fDIO/hM4Di/mCherry元件的腺相关病毒,在flp蛋白表达的ere细胞 中,hM4Di表达,因此可以用药物遗传学系统操纵B脑区中ere细胞到C脑区的神 经环路。此后,在A脑区注射载有光敏蛋白的腺相关病毒,将光纤埋在B脑区上 方,可以用光遗传学实时操纵A・B神经环路(图3.22 a)。

在我们的实验中,我们将载有dio条件型表达光敏蛋白以及eYFP报告元件 的腺相关病毒注射在Gad2・cre小鼠的纹状体床核前侧脑区,并将光纤埋在纹状 体床核前侧脑区的上方(图3.22 b);在中缝核或者孤束核脑区注射载有flex/flp 元件的CAV病毒,在弓状核脑区注射载有hM4Di/mCherry元件的腺相关病毒。 在6周后,我们在弓状核检测到有表达mCherry蛋白的细胞以及表达eYFP的神 经纤维(图3.22 c) o

在进行实验时,我们用药物遗传学在抑制弓状核到中缝核的Y ■氨基丁酸能 神经通路下,用光遗传学激活纹状体床核前侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经纤 维,再进行小鼠基础血糖的监测。在注射药物遗传学诱导剂CNO 30分钟之后, 监测Gad・cre小鼠在光刺激前后的基础血糖。在抑制弓状核到中缝核的Y ■氨基丁 酸能神经通路时,纹状体床核前侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经回路激活后会 导致基础血糖下降 03.22 e) o而抑制弓状核到孤束核的丫 ■氨基丁酸能神经 通路时,纹状体床核前侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经通路激活仍然导致高血 糖反应(图3.22 f) o

为了进一步确认基础血糖变化,我们取了在光激活弓状核到孤束核的Y ■氨 基丁酸能神经通路且弓状核到孤束核组以及中缝核组的Y ■氨基丁酸能神经回路 被抑制的条件下的小鼠血样。用酶联免疫方法,检测血清中胰岛素含量。结 果,在弓状核到中缝核的Y ■氨基丁酸能神经通路被抑制时,激活纹状体床核前 侧到弓状核的Y ■氨基丁酸能神经通路导致皮质酮水平升高,去甲肾上腺素水平 升高,肾上腺素没变化,胰岛素没变化(图3.22 g) o而在抑制弓状核到孤束核 的Y ■氨基丁酸能神经环路时,光激活纹状体床核前侧到弓状核的Y ■氨基丁酸 能神经通路导致胰高血糖素升高,胰岛素和肾上腺素没变化。

AAV-FLF^^-ChRZ-eYFP

yAAV-FLExFRT-hM4D(

图3・22ARCGad2-ROb环路介导来自应激回路引起的高血糖调节信号

(a).阐明三级神经环路操纵系统策略;(b).病毒注射以及光纤埋植示意图;(c).弓状核中病 毒表达,mCherry与Gad2共同标记(Gad2为黄色荧光);(d). NTS (upper )和ROb (down)中的CAV染色显示病毒输注部位;(e)腹腔注射氯氮平N・氧化物(CNO) 30min后, SARCGad2-NTS抑制组中,473nm光刺激降低葡萄糖水平(n = 8,光照+CNO组;n = 8,光照+ 生理盐水组;n = 10,光照+ CNO组;n=5,光照+盐水组);(f).腹腔注射氯氮平N・氧化物(CNO) 30分钟后,在ARCGad2-NTS抑制组中,相同的刺激增加葡萄糖水平(n = 12,光照组+CNO; n =9,非光照+生理盐水组;n = 10,非光照+CNO组;n = 10,光照+生理盐水组);(g).胰岛素水 平不变(n = 4, NTS;n=4, ROb)o 数据用平均值土SEM展示。*, p<0.05;**, p<0.01;***, p <0.001,双因素头验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显者性测定;单因素两组之间 比较用t检验显著性。

其中胰高血糖素是否改变?我们检测了胰高血糖素的水平。发现在ARC・

NTS组,激活aBNST・ARC神经环路导致胰高血糖素升高(图3.23 a)。

3. 23光刺激期间的胰高血糖素水平

(a).胰高血糖素在aBNSTGad2-ARC途径激活组(ChR2),应激组(Stress, mCheny)和ARCGad2- NTS神经环路抑制组增加,是aBNSTG^.ARC神经环路激活组(ChR2::ARChM4D1-NTS)(n = 9, mCherry; n = 4, ChR2; n = 4, ana:ChR2; n = 4, Stress: mCherry; n = 4, Stress:eNpHR3.0; n = 4, ChR2::ARChM4D1-NTS; n = 4, ChR2::ARChM4D1-ROb )数据用平均值土标准误展示。*, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著 性测定;单因素两组之间比较用f检验显著性。

血糖代谢基因有没有变化?我们将光刺激后的两组小鼠的肝脏取出,提取 RNA,分析血糖代谢相关基因的表达。我们发现己糖激酶基因,磷酸烯醇式丙 酮酸竣激酶以及葡萄糖六磷酸激酶表达发生改变(图

3. 25光照后质谱分析胰腺中蛋白表达

(a).在腹腔注射氯氮平氧化物(CNO) 30分钟后,即药物遗传学抑制ARCGad2-NTS以及 ARCGad2-ROb神经环路后,光激活aBNST g^arc神经通路对胰岛中蛋白表达水平的影响 (n = 3, ARCGad2-NTS; n=3, ARCGad2-ROb; n=3, no light stimulation)。数据用平均值土标准 误展示。*, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析, Bonferroni检验显著性测定;单因素两组之间比较用f检验显著性。

3.3.7激活aBNSTv§lut2没有引起血糖变化

在上一节研究中,我们探索了纹状体床核前侧中Y ■氨基丁酸能神经元以及 其下行至弓状核中的神经环路在焦虑样行为、基础血糖以及内分泌中的作用。 在纹状体床核前侧亚核团中,除了 Y ■氨基丁酸能神经元外,还有一部分谷氨酸 能神经元,我们也研究了它的作用。在研究中,我们将ere依赖的载有光敏蛋白 的腺相关病毒注射入Vglut2-cre小鼠的纹状体床核前侧脑区中(图3.26 a)。等 病毒表达四周后,我们在纹状体床核前侧检测到腺病毒载体中报告基因mCheiry 的表达;将光纤埋在纹状体床核前侧亚区的上方;光纤埋植一周后,光刺激引 起纹状体床核前侧亚区中谷氨酸能神经元的激活,即Cfi)s表达(图3.26 b),说 明光敏蛋白在谷氨酸能神经元中可以激活神经元作用。之后,我们研究纹状体 床核前侧中谷氨酸能神经的激活如何影响基础血糖。将小鼠在血糖监测器中适 应两天,每天5分钟;在第三天,每隔5分钟采血一次进行小鼠基础血糖的测 量。其中在5到10分钟期间,给予473nm波长的蓝关脉冲波刺激。我们发现,在 光刺激期间小鼠的基础血糖和非光刺激期间相比并没有发生明显的变化(图

  • d)。因此,我们认为光遗传激活纹状体床核前侧中的谷氨酸能神经元并不 会导致基础血糖的急性变化。

下丘脑腹内侧核团是血糖代谢调控的中枢核团。纹状体床核前侧投射到下 丘脑腹内侧核团中的谷氨酸能神经环路如何影响基础血糖?我们在纹状体床核 前侧注射ere依赖的载有光敏蛋白的腺相关病毒,在下丘脑腹内侧核团上方埋植 光纤(图3.26 c)。在光激活纹状体床核前侧到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神 经回路前后,检测小鼠基础血糖的变化。我们发现激活纹状体床核前侧到下丘 脑腹内侧核团中的谷氨酸能神经环路不能直接导致基础血糖的升高。但是在光 刺激停止5分钟后,激活纹状体床核前侧到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神经环 路组的基础血糖明显升高(图3.26 e) o表明,纹状体床核前侧投射到下丘脑腹 内侧核团的谷氨酸能神经环路间接导致基础血糖的升高。在光刺激结束5分钟 后,我们去小鼠的血液进行血液中胰岛素,胰高血糖素的分析。我们发现在光 刺激纹状体床核前侧到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神经通路结束5分钟后,小 鼠的胰岛素升高(图3.26e),胰高血糖素升高(图3.26 f)。综合以上结果表 明,激活纹状体床核前侧到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神经通路导致延时的 基础血糖升高。

图3. 26 aBNSTVglut2-VMH途径的激活引起延时高血糖反应

(a).将rAAV-DI0-ChR2-mCherry病毒注入aBNST,并将光纤植入Vglut2-cre小鼠的aBNST或 者VMH上方;(b). mCherry报告基因在aBNST中表达,并且光激活诱导C<fos表达;(c). mCheny在VMH中的神经纤维中表达,光激活诱导VMH神经元中的C・fos表达;(d). 473nm蓝 光刺激结束5分钟后,葡萄糖水平明显升高(n=8, ChR2;n=10, mCherry); (e).光刺激结束5 分钟后,小鼠的胰岛素水平升高(n = 6, ChR2; n=12, mCherry. t(16)= 6.618, p <0.0001); f.光 刺激结束5分钟后,小鼠的胰高血糖素增加(n = 3, ChR2; n=4, mCherry. t(5)=2.764, p=0.0396). (g). 593nm光抑制,不会增加rAAV-DIO-eNpHR3,0-mCherry双侧输注小鼠的葡萄糖水平 (n=12, eNpHR3.0; n=10, mCherry)o 数据用平均值土标准误展示。*, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著性测定;单因素两组 之间比较用f检验显著性。

3.3.8抑制aBNSTVglut2-VMH没有引起血糖变化

纹状体床核前侧到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神经环路的抑制是否会影 响基础血糖?我们将cw依赖的光敏蛋白用腺相关病毒载体表达在双侧纹状体床 核前侧亚区。光纤埋植在下丘脑腹内侧核团上方。黄光抑制纹状体床核前侧亚 区到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神经环路前后,我们监测了小鼠的基础血 糖。我们发现,在黄光刺激期间,小鼠的基础血糖并没有变化(图3.26 f) o表 明,光遗传学抑制纹状体床核前侧投射到下丘脑腹内侧核团的谷氨酸能神经环 路不会导致基础血糖的变化。

3.4压力应激导致基础代谢变化

3.4.1长期压力应激导致代谢失衡

在上一节中,我们研究了急性高血糖反应的中枢神经环路机制。其实,在 日常的工作中,熬夜、长久的担忧生活的窘境能是一种长期的压力应激。因 此,我们研究长期的压力应激是否会影响代谢的变化。给予野生型小鼠连续4周 的压力应激刺激,刺激方式包括高架、束缚、悬尾、湿垫料等,每天一种应刺 激,连续四周。四周后,检测小鼠的基础血糖、焦虑样行为,进食量、进水 量、排泄量以及骨代谢变化(图3.27 a) o在连续给予压力应激刺激四周后,小 鼠在旷场行为学检测中,去旷场中心区域探索的次数(图3.27 b)以及探索的时 间03.27 c-d)明显下降。表明长期的压力应激会导致明显的焦虑样行为。在 连续四周的压力应激刺激后,我们在代谢笼中检测小鼠的进食量,进水量排泄 量。三小时内,小鼠的进食量明显增加(图3.27 e);进水量也明显增加(图

  • f);我们也检测了小鼠的排尿量和粪便量。我们发现在四周的压力应激 后,小鼠在3小时的检测时间内,排尿量明显增加(03.27 g),粪便数量也明 显增加(图27 h)。我们检测经过四周应激刺激后小鼠血液中,皮质酮的水 平,发现在接受过应激刺激后的小鼠血清中皮质酮水平明显升高(图3.27 i) o 表明4周的应激刺激,导致小鼠基础代谢发生改变,表现为吃多、排多。

在4周的应激刺激后,我们检测小鼠基础血糖。发现在四周的应激刺激停止 后,应激刺激组小鼠的基础血糖明显高于没有经过应激刺激的对照组的(图

  • j);再停止刺激一周之后,应激刺激组小鼠基础血糖仍然高于非应激刺激 组(图27 k);之后,我们检测小鼠血液中胰岛素以及胰高血糖素的量。发 现,经过四周的应激刺激,小鼠的胰高血糖素水平明显升高(图3.27 1),也胰 岛素水平没有明显变化(图3.27 m)。我们检测小鼠的糖耐量,即灌胃给小鼠 20mg/Kg (1:1W/V)的葡萄糖之后,检测小鼠血糖。我们发现,经过四周应激刺 激后的小鼠在葡萄糖灌胃15分钟后,小鼠的血糖值明显高于没有经过压力应激 刺激的小鼠组 03.27 n) o以上结果表明,长期的压力应激刺激不但导致基础 血糖升高,而且会导致小鼠葡萄糖不耐受。

我们取小鼠的胫骨,分析压力应激刺激后,小鼠的骨量变化。在4周的应激 刺激后,我们将小鼠的胫骨取出,并进行Micro-CT扫描分析。发现经过压力应 激刺激后的小鼠组,其软骨骨量明显低于没有经过任何压力应激刺激的小鼠组 (03.27 0)o我们分析了骨体积分数BV/TV;骨小梁的厚度Tb.T扎骨小梁的数 量Tb.N;骨小梁的分离度Tb. Sp;骨连接度Conn.D.结果显示,在四周的压力应激 刺激后,受到应激刺激的小鼠组骨体积分数明显下降(图3.28 p);骨小梁的厚 度没有明显改变(图3.27 q);但是骨小梁的数量明显下降(图3.27 r);骨连 接度也没有明显变化(图3.27 s)。综合以上结果,经过四周压力应激刺激的小 鼠明显产生骨量的下降,即压力应激导致骨质疏松。

3. 27压力应激导致代谢失衡

(a).压力应激后范式,以及代谢检测流程图;(b).压力应激组与对照组相比,在四周压力应 激后,小鼠在旷场测试中去中心区域探索的次数明显降低(n=6, control; n=6, model); (c).压 力应激组与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠在旷场测试中去中心区域探索的时间明 显降低(n=6, control; n=6, model); (d).压力应激组与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠 在旷场测试中示意图(n=6, control; n=6, model)o e-i.在四周的压力应激刺激后,小鼠代谢 的变化。(e).压力应激组与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠进食量明显增加(尸6, control; n=6, model); (f).压力应激组与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠进水量明显 增加(n=6, control; n=6, model); (g).压力应激组与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠排 尿量明显增加(n=6, control; n=6, model); (h).压力应激组与对照组相比,在四周压力应激 后,小鼠排便量明显增加(n=6, control; n=6, model); (i).压力应激组与对照组相比,在四周 压力应激后,小鼠血液中皮质酮水平明显升(W(n=6, control; n=6, model)o j-n.四周压力应激 刺激后,小鼠血糖代谢变化(n=6, control; n=6, model); (j).压力应激组与对照组相比,在四 周压力应激后,小鼠血液中基础血糖水平明显升高(n=6, control; n=6, model); (k).压力应激 组与对照组相比,经历过四周压力应激刺激以及暂停一周压力应激刺激后,小鼠血液中基 础血糖水平明显升高(n=6, control; n=6, model); (1).压力应激组与对照组相比,在四周压力 应激后,小鼠血液中胰高血糖素水平明显升高(n=6, control; n=6, model); (m).压力应激组 与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠血液中胰岛素水平明显升高(n=6, control; n=6, model); (n).压力应激组与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠血糖耐受水平明显下降 (n=6, control; n=6, model)o o-s.四周压力应激刺激后,小鼠骨代谢变化。(o).压力应激组与 对照组,在四周实验后,胫骨正面以及侧面观;(p).压力应激组与对照组相比,在四周压 力应激后,小鼠胫骨骨体积分数明显下降(n=5, control; n=5, model); (q).压力应激组与对照 组相比,在四周压力应激后,小鼠骨小梁厚度没有明显变化(n=5, control; n=5, model); (r). 压力应激组与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠胫骨骨小梁数量明显下降(n=5, control; n=5, model); (s).压力应激组与对照组相比,在四周压力应激后,小鼠骨连接度没有明显变 化(n=5, control; n=5, model).数据用平均值土标准误展示。*, p<0.05;**, p<0.01;***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著性测定;单因素两组之间比 较用f检验显著性。

3.4.2交感神经系统激活抑制成骨分化

外周交感神经系统在调控代谢中起着不可替代的作用。交感神经通过分泌 去甲肾上腺素,影响组织器官内物质分泌,我们发现在肌肉、脂肪、胰腺、肝 脏、骨以及骨髓质中观察到有酪氨酸轻化酶(Tyrosine Hydroxylase, TH)神经 纤维的表达(图3.28 a)。在本小节中,我们以骨代谢为例,研究交感神经系统 如何影响骨代谢。我们体外培养骨髓间充质干细胞(图3.28 b),在细胞膜上检 测到有去甲身上腺素受体beta2以及beta3 (图3.28 c)的表达;之后,我们用地 塞米松,抗坏血酸以及beta■甘油磷酸钠来诱导骨髓间充质干细胞分化成成骨细 胞,在诱导21天后,我们用茜素红检测钙结节,发现骨髓间充质干细胞经过21 天的诱导,在酸性茜素红下产生红色的钙结节(图3.28 d) o之后,在诱导过程 中有一组我们加了的去甲肾上腺素,我们检测了在诱导完成后,成骨 细胞中骨代谢相关基因的表达,包括Cxcl, Oste, mALP, Runx2? mCOL等基因的 表达。我们发现在进行21天成骨诱导后,去甲肾上腺素组成骨细胞中cxcll2表 达水平明显下降,Oste表达水平明显下降,mALP表达水平明显下降,Run2表 达水平不变(图3.28 e) o在诱导过程中,我们检测碱性磷酸酶的表达水平,发 现在诱导过程中,去甲肾上腺素组碱性磷酸酶表达水平明显降低(图3.28 f) o 综合以上结果,表明去甲肾上腺素抑制骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞。

3. 28去甲肾上腺素抑制骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞

(a).在肌肉、脂肪、胰腺、肝脏、骨以及骨髓质中检测到有酪氨酸轻化酶标记的神经纤 维;(b).体外培养骨髓间充质干细胞;(c).骨髓间充质干细胞中,检测到去甲肾上腺素受体 beta2以及去甲身上腺素受体beta3的表达;(d).骨髓间充质干细胞诱导成骨分化21天后,茜 素红染色检测到有钙结节形成;(e).在21天诱导分化后,检测到成骨细胞中骨代谢相关基 因的表达变化,即cxcll2, Oste, mALP, Runx2, mCOL表达的变化;(f).在骨髓间充质干细 胞被诱导分化成成骨细胞过程中,碱性磷酸酶的表达水平。*, p <0.05; **, p<0.01;***, p <0.001,双因素实验通过双因素方差分析,Bonferroni检验显著性测定;单因素两组之间 比较用丫检验显著性。

3.5其他:初步探索与中枢调控外周相关研究

3.5.1下丘脑感受血糖的机制探索

中枢和外周协同调控基础血糖的平衡[104, 212]o外周胰岛细胞直接感受基 础血糖的变化,在血糖波动比较大的时候分泌胰岛素以及胰高血糖素等调控基 础血糖的变化。中枢神经系统也可以感受基础血糖的变化[213]O然而,其机制 研究的不是很确切。我们曾试图探索下丘脑中感受基础血糖的神经元。给小鼠 腹腔注射葡萄糖溶液后,检测到下丘脑有神经元被激活 03.29 a);我们用体 外电生理记录进一步研究该问题,发现在给体外脑片2.5mM的葡萄糖孵育后, 下丘脑腹内侧核团中的神经元放电增加 03.29 b);在给小鼠葡萄糖溶液后, 我们将下丘脑取出,分析小鼠下丘脑转录组。发现在用葡萄糖灌胃的小鼠组与 生理盐水灌胃的小鼠组相比,有许多嗅觉受体基因差异表达(图3.29 c)。我 们用原位杂交的方式去筛选这些嗅觉受体,发现只有O1&912受体在下丘脑背侧 核团以及外侧下丘脑核团表达 03.29 d) o下丘脑中

After glucose injection i.p.

图3. 29下丘脑感受高血糖

(a).腹腔注射葡萄糖(20%, 1:1W/V)后在下丘脑腹内侧核团有Gfos表达;(b).体外电生理 记录,在2.5mM的葡萄糖溶液孵育下,下丘脑腹内侧核团神经元放点频率增加;(c).腹腔注 射葡萄糖后,取出下丘脑,进行转录组分析,发现差异表达基因最多的是嗅觉受体基因; (d).用原位杂交技术筛选出,在下丘脑中只有O1&912在背内侧核团以及外侧核团中表达。

3.5.2中枢调控外周的结构基础

中枢调控外周生理代谢。需要很强的结构连接。尽管在几十年的研究中, 科学家已经解析了在外周神经系统中交感神经系统,副交感神经系统以及感觉 神经系统,在外周器官组织中均匀分布,并对外周的生理代谢起着调控作用 [214]o然而,大脑中神经元如何与外周神经系统连接对外周生理代谢进行调控 的目前了解不是很详细。目前,中枢■外周神经系统标记技术的大力发展促使我 们能进一步解释中枢■外周之间的结构连接。

在本研究中,我们探索了心脏逆向标记到大脑的神经环路结构连接;以及 肾上腺与胰腺共同逆向标记到中枢的神经结构连接。在心脏注射跨多级的逆向 标记病毒伪狂犬病毒(图3.30) 6天后,切全脑进行扫描,发现在大脑多个脑区 有伪狂犬病毒载体携带的报告基因mCherry的表达(图3.30 a)。这些脑区包括 脑干中的面神经核(fecial nucleus, 7N),巨细胞网状核(Gigantocellular Reticular Nucleus, Gi),内侧前庭核(Medial Vestibular Nucleus, MvePC),中缝核(Raphe Obscurus Nucleus, ROb),中脑导水管(Periaqueductal Gray, PAG),初级运动皮层 (Primary Motor cortex, Ml)等。

我们从胰腺以及肾上腺共逆向标记到大脑。在胰腺中注射载有绿色报告基 因的伪狂犬逆向标记病毒,在肾上腺中注射载有红色报告基因的伪狂犬逆向标 记病毒(图3.30 b) o在6天后,检查大脑中伪狂犬病毒载的报告基因的表达。 我们发现在脑干中的孤束核,中缝核,下丘脑(Hypothalamus)中有两种荧光蛋白 共标记的细胞(图3.30 b) o以上结果表明,大脑到外周器官组织通过神经纤维 连接。

(a).将PRV-CMV-mRFP注到心脏中,在大脑中多个脑区观察到有mRFP的表达;在大脑中 多个脑区观察到mRFP荧光蛋白的表达,包括面神经核(facial nucleus, 7N),巨细胞网状核

(gigantocellular reticular nucleus, Gi),内侧前庭核(medial vestibular nucleus, MvePC),中缝 核(raphe obscurus nucleus, ROb),中脑导水管(periaqueductal gray, PAG), 初级运动皮层

(Primary Motor cortex, Ml) ; (b).将PRV-CMV-eGFP注到胰腺中,并将PRV-CMV-mRFP 输注到肾上腺后,在脑干以及下丘脑中观察至tJeGFP和mRFP的共表达。

第四章讨论

4.1压力应激扰乱啮齿类动物基础血糖的波动

过去十年中,二型糖尿病的早期诊断和干预策略仍然不够完善[215]O其中 一部分原因可能是,我们对生理状态下血糖代谢的机制以及糖尿病发病机制的 理解不是很全面。基础血糖水平不规则的波动和规则的昼夜节律震荡一直被人 们所忽视。在此次研究中,我们探索了压力应激刺激如何影响小鼠基础血糖的 不规则波动,以及压力应激刺激如何影响大鼠基础血糖的昼夜节律变化。本研 究为压力应激刺激引起的前驱性糖尿病或者二型糖尿病的发病机制提供了新的 方向,提供了可能有效的诊疗指标。

在研究小鼠基础血糖中,前两天连续采血操作后,测量得到的基础血糖值 明显高于第三天和第四天,其基础血糖值的不规则波动也明显高于第三天和第 四天,证明第一天和第二天的采血操作引起小鼠应激反应,进而影响测量得到 的基础血糖值的准确度和稳定性。因此,我们建议在用电化学血糖仪检测血糖 时,至少连续两天的基础血糖测量有助于减少由于采血引起的动物应激反应导 致的基础血糖值的不稳定。同时,我们发现低于正常体重的小鼠比正常体重的 小鼠分泌更多的应激激素,且低于正常体重的小鼠其基础血糖不规则波动明显 大于正常体重小鼠。我们认为,在血糖研究中,严格的体重标准是获得可靠、 稳定基础血糖数据的因素。

在研究基础血糖的节律变化中,我们选用可以连续监测基础血糖的植入 子。遗憾的是,该植入子只适用于大鼠,因此我们不得不选用SD大鼠作为模式 动物研究基础血糖的昼夜节律变化。在用大鼠研究基础血糖中,我们每天连续 24小时监测基础血糖、体温和活动度,发现基础血糖、体温和活动度的波动遵 循昼夜规律,并且夜晚的基础血糖、体温和活动度明显高于白天,这个结果和 之前的研究一致[216]o之后我们研究压力应激刺激是否会影响基础血糖、体温 和活动度的昼夜节律变化?在压力应激刺激中,基础血糖、体温和活动度的昼 夜节律波动明显被扰乱,其基础血糖、体温和活动度的时频分布结果在24小时 处展示出很弱峰值,并且夜晚和白天的基础血糖值、体温和活动度相比较没有 差异。其中的原因,有可能是由于在白天进行压力应激刺激期间,基础血糖、 体温和活动度都升高导致白天平均的基础血糖、体温和活动度与夜晚的值没有 差异。然而,出乎意料的是压力应激刺激过后一周,大鼠基础血糖的昼夜节律 仍然没有恢复,压力应激长时间扰乱了基础血糖的节律;同时,大鼠体温和活 动度的昼夜节律也被移位,夜晚的体温和活动度从原来的高于白天降低到低于 白天。该结论为压力应激刺激所造成的前驱性糖尿病或者二型糖尿病的发病机 理机制提供了新的方向,基础血糖波动可能成为二型糖尿病的诊疗指标。

压力应激刺激导致基础血糖波动的机理机制是什么?借助前人的研究结 果,我们对此作出以下的假设。动物的代谢在自主神经系统和中枢神经系统中 的视交叉上核团相互调控下展示出明显的昼夜节律变化[217, 218]o并且,视交 叉上核神经元投射到不同的下游核团介导不同类型的生理节律[217]o例如,视 交叉上核投射到腹侧腹膜区域,调控活动度的昼夜节律变化[219];视交叉上核 投射到背侧腹膜区域对调控体温的昼夜节律有很重要的作用[220]o且下丘脑会 导致应激激素周期性分泌消失[221]o因此,我们猜测,压力应激刺激导致视交 叉上核投射到下丘脑的神经元突触连接被改变[222],进而引起基础血糖昼夜节 律的改变。

从临床获得的数据表明,长期高强度的工作或者不规律的生活方式容易导 致代谢性疾病的产生,压力应激刺激导致的基础血糖昼夜节律改变可能为这个 临床现象提供了新的机理机制和诊疗指标。

在本次研究中,我们探索了纹状体床核前侧中CaMKII标记神经元以及GABA 能神经元在调控焦虑中的作用。用经典的十字高价迷宫和旷场测试作为范式, 没有检测到纹状体床核前侧中的GABA能以及CaMKII标记神经元激活会影响小 鼠在十字高架迷宫以及旷场实验中的行为。最大的原因是我们的实验样本量比 较少,在未来的研究中需要进一步扩大样本量;其次,测试多个焦虑检测的范 式才能更准确地得出现有的结论。

之后,我们研究纹状体床核前侧CaMKII标记神经元投射到下丘脑腹内侧核 团的神经纤维在焦虑行为中的作用。发现激活纹状体床核前侧的CaMKII标记神 经元投射到下丘脑腹内侧核团的神经纤维导致小鼠快速运动。但是在光激活纹 状体床核前侧CaMKII神经元投射到下丘脑腹内侧核团的神经环路时,小鼠在旷 场中心区域时间与去侧面时间比明显增加。表明在激活纹状体床核前侧的 CaMKII神经元投射到下丘脑腹内侧核团的神经环路导致小鼠产生抗焦虑样行 为;之后,我们研究纹状体床核前侧的GABA能神经元投射到弓状核的神经环 路,在焦虑中的作用。光激活纹状体床核前侧的GABA能神经元投射到弓状核 的神经环路导致小鼠在十字高架迷宫以及旷场中探索危险区域的时间下降,表 明产生了焦虑样行为。CaMKII标记神经元可以是兴奋性的也可能是抑制性的, 在本研究中并没有解释它的性质,是本研究的一大缺憾。

4.2介导压力应激反应的GABAergic神经环路介导高血糖反应

压力太大增加了患情绪障碍和代谢综合征的风险。然而作为应激反应的器 官,大脑如何调控葡萄糖平衡还没有被解释。在本次研究中,我们用光遗传学 激活aBNST-ARC GABAergic神经环路引发急性应激反应合并急性高血糖反应; 切除肾上腺后激活aBNST-ARC GABAergic神经环路仍可以导致急性高血糖反 应;使用细胞特异性的药物遗传学抑制,我们发现ARC-ROb GABAergic神经回 路是激活aBNST^^ARC神经环路动员能量所必须的。

压力应激需要启动促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)系统,用于整合情 绪,内分泌系统和自主神经系统,以保护动物免受恶劣环境的威胁[223, 224]o CRF可以和PVN中的谷氨酸能神经元[225, 226]以及aBNST中的GABAergic神经 元共表达[227, 228],因此,PVN和aBNST是整合应激信息的两个大脑区域[229, 230]o PVN激活下丘脑■垂体■肾上腺轴(HPA),分泌应激激素驱动焦虑样行为 和自主神经活动[231-234] o事实上,光遗传学激活PVN谷氨酸能神经元到腹外 侧髓质中的神经末端诱导肾上腺依赖性高血糖反应[53] o同时,光遗传激活 aBNST投射到VMH和ARC的神经纤维分别导致急性高血糖反应和产生胰岛素敏 感性[54, 145]o因此,aBNST神经元可能在葡萄糖平衡调节中起重要作用。在 我们的研究中,发现aBNST中的GABAergic神经元在应激后被激活,其投射到 ARC的神经环路的激活引发焦虑样彳丁为状态,且引起内分泌反应并诱导高血糖 症,综合考量是产生急性应激反应。

出乎意料的是,aBNSTCaMKI啲抑制不会导致基础葡萄糖水平的升高。这一 结果与最近的一项研究结果也在最近的研究中被阐述,激活ARCAGRP到avBNST 的神经环路加速了低血糖状态下血糖的恢复,因此avBNST中神经元可能根据基 础条件的不同从而对葡萄糖水平做出不同的调控。其次,不同的细胞类型可能 也是造成这个结果不一致的原因,在之前的研究中ARC中AGRP神经元投射到 腹侧纹状体床核前侧导致低血糖状态下高血糖反应;在我们的研究中,激活或 者抑制aBNST中的CaMKII神经元不会影响基础血糖的变化,纹状体床核中接受 来自弓状核中AGRP神经元投射的细胞不限于CaMKII,这一猜测在我们实验 3.17中的结果也得到证实。

多个脑区中的GABA能神经元与能量调节有关[235, 236]。例如,向脑干中 的NTS中注射GABA-B受体激动剂受体导致高血糖反应[237]。同样,将GABA- B受体激动剂注射到脊髓中可增加血糖水平[238, 239]o遗传学敲除GABAergic RIP-cre神经元,而不是谷氨酸能RIP-cre神经元,降低了小鼠能量消耗[240]□据 推测,能量信号通过ARC-PVN-NTS-Rob的GABAergic神经环路最终到棕色脂肪 组织,调控动物的能量状态。在本研究中,特异性抑制ARC-ROb的GABAergic 神经环路后,再激活aBNST-ARC的GABAergic神经环路通过交感神经系统动员 葡萄糖。基于所有证据,我们推测ARC-ROb的GABAergic神经回路动员急性血 糖升高,而ARC-PVN-NTS神经环路将在长期能量代谢中发挥重要作用。值得注 意的是,尽管DREADD驱动的ARCGad-NTS抑制组和ARCGad-ROb抑制组基础血 糖存在10 mmol/I的差异,但相对于血糖基线没有显著性的改变。一个可能的原 因是只有一部分ARCGad2-ROb神经元被hM4Di感染。所以导致DREADD的影响 可能受到限制,导致腹腔内注射CNO后葡萄糖水平的变化不明显。另一个潜在 原因是葡萄糖水平的变化可能不但需要弓状核中投射到NTS的神经元参与还需 要不投射到NTS的神经元的参与。在随后的研究中,需要进一步探讨这一假 设。在ARC中,多种肽类标记的神经元类型被解释[241]o在本次研究中,最遗 憾的是没能解释弓状核中投射到ROb或NTS的神经元是哪一类肽类神经元。更 精准去解释这个问题,需要单细胞测序技术来解决。

NTS是大脑发出到外周神经系统的最后脑区,其可以在几秒的时间尺度上 通过副交感神经系统和交感神经系统快速控制内脏功能。交感神经系统在应激 条件下被强烈激活,导致去甲肾上腺素大量排出到所有器官中[242]o在胰腺 中,交感神经系统分泌去甲肾上腺素抑制胰岛素分泌并增加胰高血糖素水平。 压力应激同时激活肾上腺髓质,释放皮质酮,肾上腺素和去甲肾上腺素,以调 节胰岛B细胞的功能[94]o事实上,交感神经和交感神经肾上腺系统都参与了 aBNSTGad2-ARC激活。我们的研究结果显示,肾上腺切除术并未阻断aBNSTGad2- ARC激活后观察到的高血糖症,这表明交感神经肾上腺系统对aBNSTG血.ARC 激活诱导高血糖症是不必要的。我们看到的在敲除ARC中AGRP神经元中的瘦 蛋白受体后,胰岛素水平反而升高,说明在基因敲除后,机体为了代偿代谢, 启动调控机制,导致胰岛素水平升高的慢性变化以维持正常的日常活动。相 反,光遗传学刺激通过aBNST-ARC GABAergic途径导致急性身体反应,此时是 神经系统对胰岛做出做直接的反应。

总之,我们的研究描绘了在应激反应期间调节葡萄糖水平的神经回路机 制。来自aBNST・ARC・ROb・NTS的葡萄糖调节信号由交感神经系统接收,分泌 去甲肾上腺素,引起胰岛素分泌的抑制并加速胰高血糖素分泌,最终调控基础 血糖的升高。葡萄糖动员信号如何从ROb传递到NTS,然后传递到胰岛需要进 一步研究。在我们的下一项研究中,我们想用电生理学记录和细胞成像技术来 探索在激活或者抑制中枢神经系统中单个细胞,来了解腹腔神经节纤维在胰岛 中的功能。

总之,我们发现GABAergic神经回路(aBNST・ARC・ROb)介导压力应激反 应中基础血糖的动员,特异性调节葡萄糖水平;肾上腺参与了这个过程,但是 不是必须的。该结果对于治疗由慢性应激引起的能量代谢紊乱提供了可能的治 疗靶点。

4.3压力应激导致的基础代谢失衡的神经环路机制

虽然我们没有探索ROb到胰腺组织中的外周神经环路如何介导基础血糖调 控信号的下行。我们探索了交感神经系统在骨髓间充质干细胞中的作用,实验 结果得到去甲肾上腺素抑制骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞。至此,从中枢 外周调控生理代谢的环路机制被阐述。但是交感神经系统的发射核团NTS到外 周器官中间的神经环路机制没有被解释也是本研究的缺憾。基于本研究的一些 探索,我们推测在NTS出颅后,交感神经系统在脊髓胸节段换元投射到腹腔神 经节,腹腔神经节进一步投射到胰腺肾上腺等器官组织中,调控生理反应以及 代谢。在未来的研究中,结合细胞成像技术和中枢外周追踪技术,可以非常明 确的阐述交感神经系统在调控外周生理代谢中的作用,若能结合单细胞测序技 术,可以明确到细胞机制。

第五章展望

5.1压力应激扰乱啮齿类动物基础血糖的波动

基础血糖是临床中诊断和治疗糖尿病相关疾病的重要指标。尽管在本次研究 中,我们发现压力应激能增加基础血糖的波动,且会导致基础血糖昼夜节律消 失。但是我们并没有探索压力应激导致基础血糖波动增加的机制是什么?以及 压力应激导致血糖昼夜节律消失的机制是什么?解释其中的机制,才能考察基 础血糖波动以及血糖的昼夜节律参数对于临床中,诊断和治疗糖尿病的意义。 在未来的研究中,我们会探索基础压力应激导致基础血糖节律消失的神经环路 机制。

  • aBNSTGad2-ARC神经环路介导应激反应

纹状体床核前侧在焦虑应激中的作用被多方解释(Sullivan, 2004 #396)。但是Y ■氨基丁酸以及CaMKII+标记神经元如何调控焦虑样行为还不明确。虽然在我们 的研究中,试图探索光遗传激活这两种神经元后,小鼠焦虑样行为的变化,但 是由于样本量不够,在未来的研究中还需要进一步探索。

其次,CaMKII+神经元在皮层中,大多数为Vlgut阳性细胞,即是兴奋性神经 元。但是在皮层下,纹状体床核这种神经核团中,CaMKII+神经元中有多少表 达Vlgut,多少位Gad阳性的细胞还没有被解释。目前我们正在做相关的内容。

  • aBNSTGad2-ARC神经环路介导高血糖反应

在探索纹状体床核前侧谷氨酸能神经元投射到下丘脑腹内侧核团的神经纤 维在基础血糖调控中的作用时。我们发现光刺激结束5分钟测得的基础血糖明显 升高,直到光刺激结束后15分钟仍处于高血糖状态。光遗传刺激是一种急性操 纵神经元活动的技术,因此基础血糖在光刺激后5分钟的变化已经不是纹状体床 核前侧谷氨酸能神经元投射到下丘脑腹内侧核团神经通路的激活导致的。那么 这里生理性血糖升高的机制是什么?也是未来研究的一大问题。

  • aBNSTGad2-ARC的神经环路介导应激反应

下丘脑感受基础血糖的机制已经被研究很多年。但是是GPCR受体还是AMPK 受体介导神经元感受血糖的目前并不知晓。在本研究,我们探索到嗅觉受体可 能参与下丘脑感受血糖。然而,机制还没有探究,也是未来我们需要集中力量 去解释的一大问题。

5.5其他:初步探索与中枢调控外周相关研究

中枢调控外周生理代谢是热门话题。近几十年的研究中,人们将科学视野放 在外周系统的,发现脂肪组织分泌的瘦素受体等旁分泌到胰岛中,调控基础血 糖的变化[243,244]。在治疗糖代谢紊乱时,通常用胰岛素等方式。然而,糖尿 病等疾病在全世界仍然没有得到很好的控制。原因可能是糖尿病的分型还不够 对症,导致有些糖尿病类型用传统的手段并不能治疗;也可能是糖尿病人的病 程处在不同的阶段,用统一种手段治疗难免会延误最佳治疗时间。在本研究 中,探索了压力应激导致基础血糖波动增大,昼夜节律消失等现象,可能为临 床糖尿病分型以及不同病程的糖尿病治疗过程中的指标提供很好的指导。但是 其中的机制并没有被解释,在未来的研究中,我们也需要大力研究。

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