云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体感染状况及影响因素分析论文

2020年6月29日16:12:12云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体感染状况及影响因素分析论文已关闭评论

云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体感染状况及影响因素分析论文

摘要

云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体感染状况
及影响因素分析

研究生:俞丹

导师:尹家祥

目的

明确云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体感染情况及其影响因素,分 析巴尔通体流行株基因型,为有效预防控制云南鼠疫自然疫源地巴尔通体病发生 和流彳丁提供基础数据。

方法

  1. 样本来源:2015-2016年,在云南玉龙鼠疫疫源地、剑川鼠疫疫源地和梁河 鼠疫疫源地捕获野外小型兽类共2611只。将捕获的小型兽类带回实验室进行分类 鉴定并记录捕获小型兽类的采样地点、季节、种类、性别、海拔、栖息环境等,无 菌操作取小型兽类的肝脾,置于0 mL冻存管中,编号标记后,-40弋保存。
  2. 样本抽样:采用分层抽样在采集的2549份肝脾样本中,抽取1605份样本 作为巴尔通体感染检测对象。
  3. DNA提取:采用磁珠法微量细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,运用全自 动核酸提取仪提取DNAo
  4. 核酸浓度测定:若核酸浓度<50隔/山或A260/A280比值8或>2.1时, 重新提取该样本DNAo
  5. 聚合酶链反应及序列分析:利用聚合酶链反应检测巴尔通体,首先采用荧 光定量PCR扩增巴尔通体非编码RNA基因(ssrA),根据标准曲线判定结果,若 Cq<35为阳性,Cq值N35为阴性,将阳性样本进一步采用普通PCR扩增ssrA基 因片段,将扩增产物送公司测序,将测序所得序列放在NCBI进行同源性比对,利 用0构建系统发育树,分析进化关系。
  6. 统计分析:所有数据用0录入,运用R软件,采用率进行统计描 述,率的组间比较用/‘Logistic回归分析野外小型兽类感染巴尔通体的影响因素。 结果
  7. 野外小型兽类分布:1605份野外小型兽类肝脾样本分别为玉龙550份,剑 川648份,梁河407份。其中齐氏姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠及黄胸鼠样本量占优 势,分别为471份、305份、157份、104份。不同地区优势鼠种不同,玉龙鼠疫 疫源地和剑川鼠疫源地的优势鼠种为齐氏姬鼠、大绒鼠及中华姬鼠;梁河鼠疫疫源 地的优势鼠种为黄胸鼠、斯氏家鼠及锡金小鼠。
  8. 野外小型兽类巴尔通体感染率:在3目6科19属30种1605只野外小型兽 类中,25种野外小型兽类感染巴尔通体,野外小型兽类巴尔通体感染率为 85%(768/1605)o其中短尾齣属(短尾齣)感染率为80.00%(20/25)、白腹鼠属(针毛 鼠、社鼠、白腹鼠)为59.55%(53/89)、姬鼠属(齐氏姬鼠、中华姬鼠、大耳姬鼠)为 55.01%(383/697)、小鼠属(锡金小鼠)为54.55%(24/44)、家鼠属(黄胸鼠、斯氏家鼠、 褐家鼠、大足鼠)为51.22%(105/205)、长吻松鼠属(珀氏长吻松鼠)为47.62%(10/21)、 齣鼠青属(高山齣鼠青、臭齣鼠青)为45.95%(17/37)、绒鼠属(大绒鼠、玉龙绒鼠、滇绒鼠、 黑腹绒鼠)为36.34%(129/355)、麝齣属(灰麝齣、长尾大麝齣)为32.35%(11/34)、毛 猬属(毛猬)为32.14%⑼28)、巨鼠属(青毛鼠)为11.11%(1/9)、树齣属(树齣)为 2.17%(l/46)o 2只滇攀鼠和板齿鼠均感染巴尔通体,巢鼠、高山齣縮、赤腹松鼠、 侧纹岩松鼠、滇绒鼠均未感染巴尔通体。
  9. 地区:玉龙、剑川和梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率分别为 91%(280/550)、39.97%(259/648)和 56.27%(229/407),其中梁河鼠疫疫源地野外 小型兽类巴尔通体感染率显著高于玉龙和剑川疫源地(加二29.74, P<0.05)o
  10. 季节:野外小型兽类春夏秋冬四个季节均有巴尔通体感染,感染率分别为 63%(171/359)、56.52%(208/368)> 44.99%(211/469)、43.52%(178/409),夏季感染 率高于秋季和冬季(%2二15.71, P<0.05)o
  11. 性别:雄性小型兽类巴尔通体的感染率(50.12%)显著高于雌性小型兽类 (45.11%)(%2二99, P<0.05)o
  12. 栖息环境:捕获野外小型兽类主要以林地、耕地、林地耕地交界、耕地灌 丛交界和灌丛5种栖息环境,其中每种栖息环境野外小型兽类巴尔通体的感染率 分别为 16%(530/1036)、39.66%(92/232)、42.54%(77/181)、48.33%(58/120)> 30.56%(11/36),林地感染率最高(加二 17.16, P<0.05)o
  13. 海拔:随海拔升高,野外小型兽类巴尔通体感染呈升高趋势,但对其中某 一海拔梯度具有高度适应性,具体情况为:玉龙鼠疫疫源地2400〜2600m感染率为 15%、2600〜2800m 为 36.84%、2800〜3000m 为 61.54%、3000 米以上为 48.87%, 其中2800〜3000m野外小型兽类巴尔通体感染率最高(%2二18.44, P<0.05);剑川鼠 疫疫源地 2250〜2450m 感染率为 35.56%、2450〜2650m 为 38.05%、2650〜2850m 为 47.97%,剑川不同海拔梯度野外小型兽类感染巴尔通体无差异(加二5.31,尸>0.05); 梁河鼠疫疫源地1000〜1200m 感染率为48.72%、1200〜1400m 为39.50%、 1400〜1600m为78.18%、1600米以上为63.93%,其中1400〜1600m野外小型兽类 巴尔通体感染率最高(咒$二35.76, P<0.05)o
  14. 影响因素:云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类感染巴尔通体与采样地区、 季节、海拔、鼠种有关。与剑川疫源地相比,玉龙疫源地野外小型兽类巴尔通体感 染率增加44倍,梁河疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率增加9.16倍;以春季 相比,夏季野外小型兽类巴尔通体感染率增加1.32倍,秋季野外小型兽类感染率 降低30%,冬季野外小型兽类感染率降低25%;以齐氏姬鼠相比,中华姬鼠巴尔 通体感染率降低5%,大绒鼠巴尔通体感染率降低49%,黄胸鼠巴尔通体感染率降 低45%,斯氏家鼠巴尔通体感染率降低59%,其它鼠种巴尔通体感染率降低64%; 以1000〜1500m海拔带相比,1500〜2000m海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率增 加2.21倍,>3000m海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率增加1.27倍,2500〜3000m 海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率增加1.07倍,2000〜2500m海拔带野外小型兽 类巴尔通体感染率降低33%O
  15. 巴尔通体遗传进化分析:小型兽类中检测到的巴尔通体基因型包括罗莎利 马巴尔通体(Bartonella rochalimae)>日本巴尔通体(Bartonella japonica)特利波契 巴尔通体(Bartonella tribocorum)>森林巴尔通体(Bartonella sylvatica)>马赛巴尔通 ^(Bartonella rattimassiliensis)禾口 Bartonella washoensis o

结论

  1. 云南玉龙鼠疫疫源地、剑川鼠疫疫源地及梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴 尔通体感染率为85%,且巴尔通体宿主具有多样性。
  2. 云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类感染巴尔通体受采样地区、季节、海拔、 鼠种四个因素影响。梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率最高,剑川鼠疫 疫源地最低;春夏秋冬四个季节均有野外小型兽类感染巴尔通体,夏季感染率最高; 随海拔升高,野外小型兽类巴尔通体感染率呈上升趋势,但对其中某一海拔具有高 度适应性。
  3. 云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体基因型具有多样性,其中3种 对人群致病。

关键词:巴尔通体,小型兽类,影响因素,ssrA,鼠疫自然疫源地

Abstract

The Infection Status and Influencing Factors of
Bartonella in Wild Small Mammals on the Plague
Natural Foci of Yunnan Province

Postgraduate: YU Dan

Supervisor: YIN Jia-xiang

Objective

To identify the infection status and influencing factors of Bartonella in wild small mammals on the plague natural foci of Yunnan province, and genotypes of Bartonella epidemic strains were analyzed. Meanwhile, this paper can also be used to provide basic data for Bartonellosis to effectively prevent and control the occurrence and epidemic on natural plague foci of Yunnan province.

Methods

  1. Sample sources: From 2015 to 2016, 2611 wild small mammals were captured in Yulong plague foci, Jianchuan plague foci and Lianghe plague foci of Yunnan province. The small mammals of captured were translated back to the laboratory for classificating and identificating, and their collection sites, seasons, species of small mammals, gender, altitude and habitats were recorded. The livers and spleens of the captured small mammals were collected by aseptic operation and stored in 2.0 mL cryopreservation tube, numbered and labeled, and stored at -40°C.
  2. Sample sampling: A total of 1605 samples from 2549 samples of liver and spleen was selected by stratified sampling as the object for detecting Bartonella
  3. DNA extraction: DNA was extracted by automatic nucleic acid extractor in accordance with the procedure of magnetic bead microcell/tissue genomic DNA extraction kit.
  4. Determination of nucleic acid concentration: If the nucleic acid concentration is <50 ng/|nl or the A260/A280 ratio is <1.8 or >2.1, the sample DNA is re-extracted.
  5. Polymerase chain reaction (PCR) and sequence analysis: The Bartonella was detected by polymerase chain reaction. Firstly, the Bartonella non-coding RNA gene (ssrA) was amplified by real-time PCR. According to the standard curve,讦 quantification cycle (C q) < 35 was positive and Cq>35 was negative. Then, the ssrA gene fragment of positive samples was amplified by ordinary PCR. The amplified products were directed to the company for sequencing, and the sequence was compared by homologyin NCBI. Phylogenetic tree was constructed by MEGA7.0 and evolutionary relationship was analyzed.
  6. Statistical analysis: All data were entered by EpiData 3.0 and were analyzed under R software. The infection rates were described using descriptive statistics and were compared using Chi-square test. Logistic regression analysis was used to analyze influencing factors that the wild small mammals were infected

Results

  1. Distribution of wild small mammals: 1605 samples of liver and spleen of wild small mammals were 550 in Yulong, 648 in Jianchuan and 407 in Lianghe. Among them, Apodemus chevrieri, Eothenomys miletus, Apodemu sdraco and Rattus tanezumi were dominant, with 471, 305, 157 and 104 samples, respectively. The dominant species were different in different areas. Apodemus chevrieri, Eothenomys miletus and Apodemus draco were dominant species in Yulong plague foci and Jianchuan plague foci, while Rattus tanezumi, Rattus steini and Rattus norvegicus were dominant species in Lianghe plague foci.
  2. Infection rate of Bartonella in wild small mammals: Among 1605 samples of 30 species, 18 genera, 6 families, 3 orders, 25 wild small mammals were infected with Bartonella and the infection rate of Bartonella in wild small mammals was 47.85% (768/1605). Among them, the infection rate of the genus Anourosorex aquamipes (Anourosorex aquamipes) was 80.00% (20/25), the genus Rattus coxigiandersoni (Rattus fulvescins, Rattus niviventer, Rattus coxigiandersoni) was 59.55% (53/89), the genus Apodemus (Apodemus chevrieri, Apodemus draco, Apodemus latronum) was 55.01% (383/697), the genus Mus {Mus pahari) was 54.55% (24/44), the genus Mus (Rattus tanezumi, Rattus steini, Rattus norvegicus, Rattus nitidus) was 51.22% (105/205),the genus Dremomys (JJremomyspemyi) was 47.62%(10/21),the genus Sorex (Sorex alpinus, Suncus murinus) was 45.95% (17/37), the genus Eothenomys (Eothenomys miletus, Eothenomys proditor, Eothenomys eleusis, Eothenomys melanogaster) was 36.34% (129/355), the genus Crocidura {Crocidura attenuata, Crocidura draculadracula) was 32.35% (11/34), the genus Hylomys (Hylomyssuillus) was 32.14% (9/28), the genus Cricetomys (Berylmys bowersi) was 11.11% (1/9), the genus Tupaia (Tupaia belangeri) was 2.17% (1/46). Two Vernaya fulva and Bandicota indica were infected Micromys minutus, Sorex alpinus, Callosciurus erythraeus, Sciurotamias forresti, Eothenomys eleusis were not infected Bartonella.
  3. Areas: The infection rates of Bartonella in wild small mammals in Yulong, Jianchuan and Lianghe plague foci were 50.91% (280/550), 39.97% (259/648) and 56.27% (229/407), respectively. The infection rates of Bartonella in wild small mammals in Lianghe plague foci were significantly higher than Yulong and Jianchuan plague foci (咒2 二74,尸 vO.05).
  4. Season: The wild small mammals were infected with Bartonella in four seasons and the infection rates were 47.63% (171/359) in spring, 56.52% (208/368) in summer, 44.99% (211/469) in autumn and 43.52% (178/409) in winter. The infection rates in summer were higher than autumn and winter (咒?二 71,尸<0.05).
  5. Gender: The infection rate of Bartonella in male small mammals (50.12%) was higher than female small mammals (45.11%) (x2=3.99,P<0.05).
  6. Habitat environment: The wild small mammals were captured from Five habitats, including forest land, cultivated land, forestland-cultivated land junction, cultivated land shrub junction and shrub. The infection rates of Bartonella were 51.16% (530/1036) in forest land, 39.66% (92/232) in cultivated land, 42.54% (77/181) in forestland-cultivated land junction, 48.33% (58/120) in cultivated land shrub junction, 30.56% (11/36) in shrub. The highest infection rate was found in forest land (^2=17.16,P<0.05).
  7. Altitude: With the increase of altitude, the infection of Bartonella in wild small mammals has an increasing trend, but it has certain adaptability to one of the wave gradients. The specific conditions were as follows: the infection rates of Bartonella in wild small mammals in Yulong plague foci were 31.15% in 2400〜2600m, 36.84% in 2600〜2800m, 61.54% in 2800〜3000m and 48.87% over 3000m, and the infection rates of Bartonella in wild small mammals between 2800 and 3000m was the highest (咒2二 44,7 <0.05). the infection rate of wild small mammals with Bartonella in Jianchuan plague foci were 35.56% in 2250〜2450m, 38.05% in 2450〜2650m, 47.97% in 2650〜2850m. There was no significant difference in the infection rate of Bartonella in wild small mammals for the different altitude gradients in Jianchuan plague foci (咒2二5.31,尸>0.05). The infection rates of Bartonella in wild small mammals in Lianghe plague foci were 48.72% in 1000〜1200m, 39.50% in 1200〜1400m, 78.18% in 1400〜1600m and 63.93% in above 1600m. The infection rates of Bartonella in wild small mammals were the highest at altitude of 1400〜1600m (^2=35.76,P<0.05).
  8. influencing factor: The infection of Bartonella in wild small mammals on the plague natural foci of Yunnan province are related to the factors sampling area, season, altitude and species of small mammals. Compared with Jianchuan plague foci, the infection rate of wild small mammals in Yulong plague foci increased by 1.44 times and that of wild small mammals in Lianghe plague foci increased by 9.16 times. Compared with spring, the infection rate of wild small mammals in summer increased by 1.32 times, that of wild small mammals in autumn decreased by 30%, and that of wild small mammals in winter decreased by 25%.Compared with Apodemus chevrieri, the infection rate of Bartonella in Apodemus draco reduced by 5%,the infection rate of Bartonella in Eothenomys miletus reduced 49%, the infection rate of Bartonella in Rattus tanezumi reduced by 45%, the infection rate of Bartonella in Rattus steini was reduced by 59%, the infection rate of Bartonella in other species of small mammals was reduced by 64%. Compared with the altitude range of between 1000m and 1500m, the infection rate of Bartonella in wild small mammals increased by 2.21 times in the altitude range of between 1500m and 2000m,the infection rate of Bartonella in wild small mammals increased by 1.27 times at over 3000m altitude and the infection rate of Bartonella in wild small mammals increased by 1.07 times in the altitude range of between 2500m and 3000m altitude, and the infection rate of Bartonella in small mammals reduced by 33% from the altitude range of between 2000 and 2500m.
  9. Genetic evolution analysis of Bartonella'. Bartonella genotype were detected in small mammals including Bartonella rochalimae, Bartonella japonica, Bartonella tribocorum, Bartonella sylvatica, Bartonella rattimassiliensis, Bartonella washoensis. Conclusion
  10. The infection rate of Bartonella in wild small mammals is 47.85% in Yulong plague foci, Jianchuan plague foci and Lianghe plague foci in Yunnan province, and the host of Bartonella is diverse.
  11. The infection of Bartonella in small mammals is affected by four factors: sampling area, the species of small mammals, season and altitude. Bartonella infection rate of small mammals was the highest in Lianghe plague foci, followed by Yulong plague foci, and the lowest is in Jianchuan plague foci. In the four seasons, there are wild small mammals infected with Bartonella and the infection rate was highest in summer. With the increase of altitude, the infection rate of wild small mammals showed an upward trend.
  12. There are diversity of Bartonella genes in wild small mammals on the plague natural foci of Yunnan province, three of them are pathogenic to human.

Key words: Bartonella} small mammals; influencing factor; ssrA; plague natural foci

前言

小型兽类作为多种病原体的宿主,对环境有极强的适应能力且能导致人类和 动物患许多疾病。小型兽类因栖息地的改变而扩大活动范围,导致与人群密切接触, 增加人兽共患病传播给人群的机会。其中由细菌引起的新发传染病,特别是人兽共 患细菌病越来越受到重视,而巴尔通体是近年来新发传染病之一的病原体,备受国 内外关注,它广泛存在于自然界中,储存宿主种类及其数量广泛,传播媒介丰富, 小型兽类是巴尔通体的自然宿主,也是巴尔通体最主要的贮存宿主⑴。小型兽类巴 尔通体感染在全球分布广泛且感染率较高,在中国,研究区域覆盖全国,各地区小 型兽类感染巴尔通体的阳性率为2.3%〜57.26%[2】。

  1. 巴尔通体

巴尔通体是一种革兰氏阴性、嗜血性的、氧化酶阴性、兼性细胞内寄生的需氧 菌⑶,形态多样,属变形菌纲、a亚纲、根瘤菌目、巴尔通体科、巴尔通体属⑷。 它培养条件苛刻,培养基需含多种营养成分,因此多选用含5%羊血/兔血的胰酶大 豆琼脂培养基或者巧克力琼脂培养基。大多数巴尔通体培养条件为37°C>5% CCh, 而大部分致病巴尔通体通常在35〜3且CCh丰富的环境中生长,但Bartonella bacilliformi最适培养温度相对较低为25〜30。(2⑸。液体培养使五日热巴尔通体在生 长速度和菌量都优于汉赛巴尔通体,菌量几乎是汉赛巴尔通体的2倍⑹,因此液体 培养基也越来越多运用到临床及实验研究中。大部分巴尔通体菌对强力霉素、阿奇 霉素等14种抗生素敏感,但对克林霉素、丁胺卡那霉素等5种不敏感⑺。

巴尔通体的储存宿主种类广泛,包括小型兽类、猫科动物、犬科动物、蹄类动 物、兔科动物等,但在野生动物中也发现感染巴尔通体。Bartonella henselae主要 储存宿主为猫和狗,但从白鲸中也检测到该种巴尔通体⑻。野生食肉动物中也存在 显着的巴尔通体宿主特异性,在加利福尼亚州北部灰狐中检测到Bartonella clarridgeiaeBartonella vinsonii subsp. berkhoffii 两种巴尔通体,感染率分别为 42% 和9.4%,灰狐被认为是Bartonella clarridgeia的储存宿主⑼;在美国东南部,从野 猪中检测到 Bartonella koehlerae,从浣熊中分离出 Bartonella henselaeBartonella koehlerae,且认为浣熊为这2种巴尔通体的潜在宿主口叫 从狮子和猎豹中检测到 Bartonella henselae,感染率分别为17%和31%[11];在伊拉克从豺狼中分离出 Bartonella vinsonii subsp. berkhoffii并在豺狼中首次发现新的巴尔通体Bartonella merieuxii[12]o 在美国加利佛尼亚州郊狼中分离到 Bartonella vinsonii berkhoffii[13\ 在扌弥猴中检测到Bartonella quintana[i^ ,从德国的犯子中检测到Bartonella schoenbuchensis[15]□然而,小型兽类是巴尔通体最主要及最广泛的贮存宿主且在全 球感染率较高。由于频繁的基因重组和突变的积累因素的影响,存在于小型兽类体 内巴尔通体基因型从小型兽类的进化中得到了潜在的加速进化[⑹,越来越多巴尔 通体在小型兽类中被检测和分离出。

蚤、虱、脾、嫡、白蛉等吸血节肢动物是传播巴尔通体的主要媒介。吸血节肢 动物通过吸食动物或人类含有巴尔通体病原菌的血液或排泄物的方式进行传播扩 散。易感动物可以受到吸血节肢动物的叮咬,或者由于受到抓破、摩擦等活动造成 伤口使含有巴尔通体病原菌的污染物进入动物或者人体内而感染巴尔通体o目 前,许多国家对吸血节肢动物巴尔通体感染进行研究。蚤在巴尔通体的传播和获取 中充当重要作用,这种传播和获取由宿主特异性、啮齿动物与蚤之间的交换和蚤的 丰富度介导。在德国萨克森莱比锡,蚤和蜩的感染率分别为54.1%和16.3%,其中 蚤中发现了 Bartonella grahamiiBartonella elizabethae,虫卑中检测到 Bartonella chomelii[1S]。另外的实验研究证实在小型兽类及其寄生蚤中检测到Bartonella grhamii>Bartonella tayloriiBartonella rochalimae,以及从虫卑体内检测到 Bartonella grahamiio在南美洲,杆菌样巴尔通体多由白蛉传播给人类,导致被叮咬的人群患 卡瑞恩病口刀。体虱是Bartonella quintana储存库,能作为传染媒介导致人群患战壕 热[19]。一些研究人员提供了脾在巴尔通体传播中潜在作用的证据,但争论作为载 体的作用,其中某些研究表明脾能够通过唾液内容传播Bartonella henselae,但未 发现令人信服的证据表明脾是巴尔通体的载体。国外研究表明从大鼠收集的寄生 物巴尔通体感染率根据寄生物的类型而存在差异,巴尔通体感染率较高分别为虱 (57.1%)和蚤(25.8%),而脾(3.5%)和嫡(1.7%)感染率较低㈤】。

  1. 巴尔通体病

巴尔通体病(Bartonellosis)是由吸血节肢动物为传播媒介的病原体巴尔通体感 染引起的一种在全世界范围内分布的人兽共患病。现已发现38种及亚种,其中17 种及亚种与动物和人类疾病有关⑸。其中疾病的严重程度不一,轻为急性发热、咳 嗽、关节疼痛等,严重可出现心内膜炎、心肌炎、溶血性贫血、淋巴结炎、眼部综 合症、感觉及运动神经障碍等症状。致病性的巴尔通体可引起猫抓病、心内膜炎、 Oroya热(奥罗亚热)、战壕热、卡里翁氏病、杆菌样血管瘤、溶血性贫血等疾病㈤, 其中猫抓病(Cat scratch disease, CSD)是最常见的巴尔通体病。

巴尔通体几乎在全球都有报道。2005年Mcgill等Qi报道瑞典498例健康人中, Bartonella elizabethae 血清阳性率为 14.1%, Bartonella quintana 为 0.2%, Bartonella henselae为1.2%。2012年Sayin等报道土耳其63例养牛饲养员和27例兽医, Bartonella henselae的血清阳性率是其他人群的2倍。2014年Aydin等〔刑报道土耳 其333例健康人中,Bartonella henselae血清阳性率为3.3%,女性(4.1%)高于男性 (3.2%),巴尔通体血清阳性率无显著差异。2017年Hea等匚习报道韩国300例健康 成年人中,Bartonella henselae血清阳性率为15%,比预期的高,男性(51.1%)高于 女性(48.9%)。国外几项研究报告表明,猫感染巴尔通体的感染率最高可达36%, 在大约四分之一的健康猫中,血培养发现菌血症。在美国,每年约2.2万例感染猫 抓病,主要高发于2月至8月a】。在我国,巴尔通体病呈散发状态,其中以猫抓 病报道较多。我国除青海、内蒙古无CSD报道外其他地区均有发现,其中以浙江、 江苏、广东、福建、湖北、四川、安徽等东南部省市较多。2007年杨慧等〔27]研究 表明在云南不同地区和人群中采集血清379份,结果显示西双版纳地区不明原因 发热病人Bartonella henselae阳性率为18.42%,大理地区不明原因发热病人 Bartonella quintana阳性率为5.10%,放牧人群中Bartonella henselae和布鲁菌病 (Bracellosis)阳性率分别为14.28%和17.07%,提示放牧人群中可能有巴尔通体与布 鲁菌混合感染的情况。2014年王跃兵等曲研究发现云南省不明原因发热病人 Bartonella henselae 阳性率高达 30.17%, Bartonella quintana 阳性率高达 18.10%, Bartonella henselaeBartonella quintana 混合感染率为 14.22%。综上所述,在云 南省大部分发热人群中存在致病型巴尔通体感染,因此应加强巴尔通体感染人群 特别是不明原因发热病人的检测及监测。

  1. 巴尔通体国内外流行现状

巴尔通体感染小型兽类呈世界性分布。各地区感染率差距较大,在美国堪萨斯 州和加利福尼亚州小型兽类感染率差距较大,其中美国堪萨斯州食蝗鼠感染率高 达90.04%[29],而加利福尼亚州褐家鼠Bartonellarochalimae感染率仅为18.5%[30], 表明小型兽类感染巴尔通体可能受地区、鼠种及巴尔通体种类等的影响。Kim等刖 研究调查日本、韩国、俄罗斯、台湾和泰国小型兽类巴尔通体感染率,分别为56.3%、 54%、28.8%、78%和61%,总体小型兽类巴尔通体感染率为54.1%,其中日本姬 鼠巴尔通体的感染率可达69%,泰国屋顶鼠感染率最高可达到68%。在非洲(刚果、 贝宁、南非、西非、肯尼亚、埃塞俄比亚等),小型兽类巴尔通感染率地区差异较 ,其感染率在3.6%〜60%之间国-37]。

1999年白瑛等在[澗云南省首次证实巴尔通体在小型兽类中开始流行,我国对 小型兽类巴尔通体感染的研究逐渐深入,现已在云南、浙江、福建、海南、内蒙古、 山西、宁夏、黑龙江、陕西、广东和新疆等进行相关研究。2010年在浙江省首次 从黑线姬鼠中分离出巴尔通体,且与致病型巴尔通体遗传关系较近㈤],浙江省的 多次调查中,均发现致病型巴尔通体,提示浙江省小型兽类中携带对人群致病的巴 尔通体。福建省首次发现臭齣赭感染巴尔通体,这一发现表明在我国臭齣縮也能携 带巴尔通体。随着研究的深入,我国已发现齐氏姬鼠、大林姬鼠、黄胸鼠、大绒鼠、 褐家鼠、小家鼠、社鼠、针毛鼠、屋顶鼠、黄毛鼠、臭齣鼠青、黑线姬鼠、达乌尔黄 鼠、五趾跳鼠、布氏田鼠、阿拉善黄鼠、高原鼠兔、长爪沙鼠等小型兽类感染巴尔 通体,且部分小型兽类能感染多种巴尔通体。云南省对小型兽类感染巴尔通体已进 行研究,1999 年成功 分离到 Bartonella elizabethaeBartonella tribocorum Bartonellayunnnannensis三种基因型,其中两种属致病型巴尔通体,表明在云南省 巴尔通体基因的多样性且存在致病型巴尔通体。栗冬梅等㈤]和张耀允等"I]的研究 表明巴尔通体在不同鼠种、地区和气候环境均有分布,呈现出巴尔通体对各种气候 与不同地理环境高适应性及宿主多样性的特征。杨卫红等舵]在云南德宏州分离到 昆州巴尔通体和森林巴尔通体,是云南省首次分离到的巴尔通体,提示云南省德宏 州黄胸鼠能感染多种巴尔通体且巴尔通体的遗传具有多样性。

  1. 巴尔通体检测

近年来,随着分子生物学和基因检测技术的应用,我们对巴尔通体的检测和遗 传多样性有了进一步的研究。1990年Reiman等妙首次用PCR的方法鉴定出巴尔 通体,之后就大量用于巴尔通体的分类鉴定。目前检测巴尔通体主要基于16rRNA. 16S-23SrRNAITS> gltA> groEL、ftsZ、ribC、rpoB、groEL、ftsZ 和 ssrA 基因片段 进行PCR扩增。普通PCR已是快速鉴定巴尔通体常用的一种技术,但是还存在很 大缺陷,引物缺乏特异性、实验室污染等出现假阳性,特别是巢式PCR,提高了特 异性,但易于污染。实时荧光定量PCR缩短了实验时间,同时也克服常规PCR技 术的不足,并可对未经PCR扩增的原始模板进行定量,特异性、敏感性和重现性 相对更好。但探针比较昂贵,设计较困难,灵敏度太高对模板太敏感造成大量假阳 性。国内外大量报道通过扩增ssrA基因片段建立实时荧光探针PCR方法检测巴尔 通体师44]。

  1. 云南鼠疫自然疫源地的简述

云南鼠疫自然疫源地是我国主要鼠疫疫源地,与新疆的天山、青藏高原的三江 源构成我国核心鼠疫疫源地,自北向南分为野鼠鼠疫疫源地和家鼠鼠疫疫源地两 种类型,疫源地长期处于活跃或较活跃状态。云南鼠疫自然疫源地所表现的生物多 样性主要体现在小型兽类,其体表寄生蚤、嫡生物,生态系统复杂多样和鼠疫菌株 基因分型的遗传多样性宙],很大程度上反映了云南鼠疫疫源地的复杂及特殊性。 云南家鼠鼠疫流行时间长、强度大、面积广,它是一块独立稳定的自然疫源地,主 要分布于云南西南、中部和东部地区,以居民区农田生境为主,海拔400〜2100m的 平坝(盆地),主要宿主为黄胸鼠(Rattus tanezumi),优势蚤种为印鼠客蚤(Xenopsylla cheopi^K 1974年云南剑川野鼠鼠疫源地被发现和证实,该疫源地以山谷及山间 盆地为主要地理景观,分布在海拔2300〜3500m的云南林地耕地混交林带,主要宿 主为齐氏姬鼠和大绒鼠,优势蚤种为方叶栉眼蚤(Ctenophthalmus quadrarus)和特新 蚤指名亚种(Neopsyllas pecialis specialis)[41]o玉龙鼠疫疫源地具有独特的生态学特 征[购,疫源地分布在古城区和玉龙鼠疫疫源地两个区域,坝子这一特殊的地貌类 型一定程度上对鼠疫的发生存在影响,且气候特征与疫情的季节流行特征密切相 关,因此这块疫源地存在着独特的生态交换系统。因此云南鼠疫自然疫源地生态环 境很适合小型兽类的生存及巴尔通体的传播。

本研究以云南鼠疫自然疫源地即剑川鼠疫自然疫源地、玉龙鼠疫自然疫源地 和梁河鼠疫自然疫源地小型兽类为研究对象,分析该区域小型兽类巴尔通体感染 状况及其不同地区、鼠种、季节、海拔、栖息环境、性别、年龄、是否带蚤等因素 对小型兽类巴尔通体感染的影响,了解该区域巴尔通体的基因型,为巴尔通体的防 控提供基础数据。

第一章材料与方法

1.1材料

1.1.1米样点的选取

本次调查选取云南鼠疫自然疫源地即玉龙鼠疫疫源地、剑川鼠疫疫源地和梁 河鼠疫疫源地远离村落的野外环境为调查区域,根据各疫源地生态地理景观,按海 拔高度划分不同海拔带作为研究样区,每个海拔带随机选取2〜3个研究样点。

  • 玉龙鼠疫疫源地:以文笔山及周围地区为调查区域,按海拔高度选取 2400〜2600m、2600〜2800m、2800〜3000m及>3000m四个海拔梯度进行野外捕小型 兽类。

⑵剑川鼠疫疫源地:以石龙、东山为调查区域,按海拔高度选取2250〜2450m、 2450〜2650m及2650〜2850m三个海拔梯度进行野外捕小型兽类。

(3)梁河鼠疫疫源地:以芒东、河西、囊宋等地区为调查区域,按海拔高度选取 1000〜1200m、1200〜1400m、1400〜1600m及>1600m四个海拔梯度进行野外捕小型 兽类。

1.1.2样本采集

⑴捕鼠:每个疫源地分别在春季、夏季、秋季、冬季采用鼠夹进行野外捕小型 兽类,捕获小型兽类2611只。

(2)     鼠种鉴定:捕获的小型兽类带回采集地疾控中心实验室,用乙醸麻醉后,依 序进行编号,记录其性别、年龄、种类、体重、体长、尾长、耳高、后足长及采集 时间、地点、海拔、生境与寄生虫等情况,同时备注缺失部位情况。

(3)     组织解剖:实验人员做好防护措施,用75%的消毒酒精擦拭小型兽类皮肤, 然后用准备的消毒剪刀、银子无菌取肝脏和脾脏组织,分别装入2.0ml冻存管中, 对应鼠种编号,-4(TC保存。

1.1.3样本抽样

云南鼠疫自然疫源地共捕获小型兽类3目(啮齿目、食虫目、攀齣目)6科(鼠科、 仓鼠科、树齣科、齣購科、猬科、松鼠科)19属30种共2611只,采集肝脾标本2549 份,采用分层抽样抽取1605只小型兽类肝脾样本用于实验。三个地区实验样本量 分别为剑川鼠疫疫源地648份,玉龙鼠疫疫源地550份,梁河鼠疫疫源地407份, 见表l.lo

表1.1云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类采样情况

1.1.4实验主要仪器

本研究中主要实验仪器及来源,见表1.2所示

表1.2实验仪器

验主要试剂

本研究中所用的主要实验试剂及来源,见表1.3所示。

1.3实验试剂

1.1.6实验耗材

本研究中实验主要耗材及来源,见表1.4所示

表1.4实验耗材

实验耗材                                                                        来源

8连管                                                  美国Bio-Rad公司

96 孔板(PCR-96-C)                                          墨西哥 AXYGE

1.5ml离心管                                         美国Axygen公司

眼科剪刀                                              上海医疗器械厂有限责任公司

银子                                                     上海医疗器械厂有限责任公司

1.2方法

1.2.1病原核酸提取

用无菌剪刀将小型兽类肝、脾剪碎后取大约5〜10mg,采用磁珠法微量细胞/组 织基因组DNA提取试剂盒,加入裂解液、蛋白酶K、RNA酶,运用全自动核酸提 取仪提取核酸,提取的核酸移至1.5ml的离心管,测其浓度。

1.2.2核酸浓度的测定

将提取的核酸用核酸浓度测定仪进行检测,检测完毕,若短期内使用-2(rc保 存,长期保存应放置在-8(rc冰箱中,避免反复冻融。若核酸浓度v50ng/pil或 A260/A280比值V1.8或>2.1时,重新提取该样本DNA。

1.2.3聚合酶链反应

⑴荧光定量PCR反应

选取具有种属特异性的引物ssrA(巴尔通体非编码RNA基因),见表1.5,对上 述提取的核酸进行荧光定量PCR反应。反应体系为20ul, HR qPCR Master Mix: lOul, lOumol/L,上下游引物各0.8ul,探针0.4ul,加去离子水定容至20ul,反应 条件:预变性:94 °C, 5min,扩增:94 °C, 15s; 60 °C, 45s;扩增40个循环,在 60弋时收集荧光,荧光通道选择FAM。每次实验为了防止出现污染,造成假阳性, 样本处理,配制反应体系,PCR扩增都在不同区域进行,并设定空白对照与阳性 对照。采用质粒标准品绘制标准曲线,根据标准曲线判定结果,若Cq值<35为阳 性,Cq值匕35为阴性。

(2)普通PCR扩增

将荧光定量PCR扩增ssrA基因片段的阳性样本,按照上述反应体系和反应条 件用普通PCR扩增ssrA基因。

1.2.4凝胶电泳

(1)凝胶制备:将 5xTBE buffer 稀释成 0.5xTBE buffer,取 100ml 0.5xTBE buffer

加入约1.5g琼脂糖,用微波炉加热约2〜3min至溶解,待冷却到6(TC左右,加lul 核酸染料,摇晃均匀,倒入插有卡槽的凝胶板中,尽量不要出现气泡,待胶完全冷 切并凝固,放置约45min效果较佳。

  • 上样:待胶体完全凝固后,垂直向上取出梳子,将胶体放置在加有5XTBE buffer电泳槽中,取3ulPCR扩增产物加入上样孔中,于1.5%凝胶琼脂糖经120V、 80mA, 40min电泳,设置标准分子质量,Marker 700bpo
  • 使用凝胶成像系统观察和拍摄,若出现清晰明亮的目的条带则送去测序, 其它位置出现条带或未出现条带等则为阴性。

1.2.5测序

将普通PCR ssrA扩增的阳性产物送至测序公司测序,因感染程度不同,某些 目的条带清晰度较弱无法测序,挑选目的条带清晰明亮的送去测序。

1.2.6序列对比分析

实验获得的阳性样本扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测 序。运用SeqMan软件将测序获得的序列进行拼接,拼接完成的序列置于美国国立 生物技术信息中心(NCBI),通过BLAST对基因进行同源性比较,初步得到菌株的 基因型。运用MegAlign软件进行同源性分析,采用MEGA7.0软件,导入ssrA对 应参考序列和全部获得的测序序列,采用邻接法(Neighbor-joining method)和最大似 然法(Maximum Likelihood Method), bootstrap 1000 构建系统发育树。

1.2.7统计分析

本文所有数据用Epidata3.0录入,运用SPSS17.0、R软件进行统计分析,采用 率进行统计描述,率的组间比较用分,分析不同鼠种、季节、地区、疫源地类型、 性别、栖息环境、海拔等小型兽类感染巴尔通体感染率的差异;采用Logistic回归 分析小型兽类感染巴尔通体的影响因素(鼠种、性别、季节、地区、栖息环境、海 拔),按照0=0.05检验水准确定最优模型。

第二章结果

2.1小型兽类分布

1605只小型兽类包括3目19属30种,其中齐氏姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠及 黄胸鼠样本量占优势,分别为471份(29.35%)、305份(19.00%)、157份(9.78%)、 104份(6.48%),见表2.1。不同地区种群构成比不同,玉龙鼠疫疫源地优势鼠种分 别为齐氏姬鼠(33.64%)、大绒鼠(16.55%)及中华姬鼠(16.00%);大耳姬鼠、玉龙绒 鼠、社鼠、树齣、长尾大麝齣种群构成比分别为9.45%、7.09%、4.73%、4.18%、 1.09%,其它鼠种均小于1%;剑川鼠疫疫源地的优势鼠种分别为齐氏姬鼠(44.14%)、 大绒鼠(31.94%)及中华姬鼠(10.65%),大耳姬鼠、树齣、灰麝齣、社鼠种群构成比 分别为2.93%、2.78%、1.70%、1.39%,其余鼠种均小于1%;梁河鼠疫疫源地以黄 胸鼠(24.57%)、斯氏家鼠(19.90%)及锡金小鼠(10.81%)为优势种,臭齣購、毛猬、大 足鼠、青毛鼠、大绒鼠种群构成比为7.86%、6.88%、3.44%、2.21%、1.72%,其余 鼠种均小于1%。黑腹绒鼠(2只)、高山齣購(2只)、赤腹松鼠(1只)、侧纹岩松鼠(1 只)、滇攀鼠(1只)和板齿鼠(1只)为稀有种,见表2.2。

表2.1云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类种群构成及捕获情况

续表2.1云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类种群构成及捕获情况

2.2荧光定量PCR结果

将所有核酸样本采用实时荧光定量PCR扩增ssrA片段,鉴定结果如图2.1, 样本扩增的曲线呈光滑的S形,空白对照没有出现扩增曲线或者Cq值,说明实验 的反应体系无污染,能进一步判定结果。Cq值V35且通过与阳性对照进行比较可 以判定为阳性。

图2.1 ssrA片段荧光定量PCR结果

实时荧光定量PCR扩增ssrA片段判定为阳性样本为768份,送去测序费用昂 贵及工作量较大,故将判定为阳性的样本用普通PCR扩增ssrA片段,电泳结果如 图2.2,挑选目的条带清晰明亮的扩增产物送去测序,共94份样本测序成功。

注:M:Maker:分子量为 700bp,从上往下依次为 700bp, 600bp, 500bp, 400bp, 300bp,

200bp, lOObp; JC-3-1O至SL-4-46为扩增的样本编号°

图2.2阳性样本用普通PCR扩增ssrA基因产物的凝胶电泳图

2.3小型兽类巴尔通体感染率

在3目6科19属30种1605份野外小型兽类样本中,25种野外小型兽类感染 巴尔通体,小型兽类巴尔通体感染率为47.85%(768/1605)o其中短尾齣属(短尾齣) 感染率为80.00%(20/25)、白腹鼠属(针毛鼠、社鼠、白腹鼠)为59.55%(53/89)、姬 鼠属(齐氏姬鼠、中华姬鼠、大耳姬鼠)为55.01%(383/697)、小鼠属(锡金小鼠)为 54.55%(24/44)、家鼠属(黄胸鼠、斯氏家鼠、褐家鼠、大足鼠)为51.22%(105/205)、 长吻松鼠属(珀氏长吻松鼠)为47.62%(10/21)、齣鼠青属(高山齣鼠青、臭齣鼠青)为 45.95%(17/37)、绒鼠属(大绒鼠、玉龙绒鼠、滇绒鼠、黑腹绒鼠)为36.34%(129/355)、 麝齣属(灰麝齣、长尾大麝齣)为32.35%(11/34)、毛猬属(毛猬)为32.14%(9/28)、巨 鼠属(青毛鼠)为11.11%(1/9)、树齣属(树齣)为2.17%(l/46)o 2只滇攀鼠和板齿鼠均 感染巴尔通体。巢鼠、高山齣縮、赤腹松鼠、侧纹岩松鼠、滇绒鼠未感染巴尔通体。 巴尔通体在云南鼠疫自然疫源地感染率较高,呈现出宿主多样性的特征。不同属种 间巴尔通体感染率具有显著性差异(%2二159.495,尸V0.01),针毛鼠感染率最高 (85.37%),树齣(2.17%)感染率较低,巢鼠未感染巴尔通体,见表2.2。

2.4不同地区小型兽类巴尔通体感染率

玉龙鼠疫疫源地、剑川鼠疫疫源地和梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体 感染率分别为 50.91%(280/550)> 39.97%(259/648)和 56.27%(229/407)。三个鼠疫疫 源地野外小型兽类巴尔通体感染率具有显著差异(咒$二29.74,尸V0.05),剑川鼠疫疫 源地感染率均低于玉龙鼠疫疫源地和梁河鼠疫疫源地,提示三块鼠疫疫源地中梁 河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率最高,剑川鼠疫疫源地最低。玉龙鼠疫 疫源地18种,13种检出感染巴尔通体,分别为齐氏姬鼠巴尔通体感染率为 65.95%(122/185)、中华姬鼠为 65.91%(58/88)> 大耳姬鼠为 67.31%(35/52)、大绒鼠 为38.46%(35/91)、玉龙绒鼠为15.38%(6/39)、社鼠为19・23%(5/26)、白腹鼠为 33.33%(1/3)、长尾大麝齣为33.33%⑵6)、印度长尾齣为75.00%(3/4),黄胸鼠为 50%(1/2), 2只大足鼠和滇攀鼠均感染巴尔通体;剑川鼠疫疫源地17种小型兽类 中11种被检测出感染巴尔通体,分别为齐氏姬鼠巴尔通体感染率为 46.50%(133/286)、中华姬鼠为 37.68%(26/69)、大耳姬鼠为 55.56%(10/18)、大绒鼠 为 37.20%(77/207)、褐家鼠为 25.00%(1/4)、社鼠为 44.44%(4/9)、白 腹鼠为 66.67%(4/6)、灰麝齣为9.09%(1/11)、长尾大麝齣为33.33%(1/3),短尾齣和黑腹绒 鼠样本量较少;梁河鼠疫疫源地17种小型兽类样本全都检出感染巴尔通体,见表 2.2o

2.5不同季节小型兽类巴尔通体感染率

春夏秋冬四个季节均有野外小型兽类感染巴尔通体,感染率分别为 47.63%(171/359)、56.52%(208/368)> 44.99%(211/469)、43.52%(178/409),不同季节 野外小型兽类巴尔通体感染率具有显著差异(加二15.71,尸V0.05),夏季感染率高于 秋季和冬季。不同季节各属种间巴尔通体感染率不同,春季捕获23种小型兽类, 其中17种感染巴尔通体,春季各属种间巴尔通体感染率具有显著差异(咒2二49.97, PvO.05),麝齣属(71.43%)、白腹属鼠(68.18%)、小鼠属(66.67%)、姬鼠属(60.77%)、 家鼠属(51.28%)感染率均高于绒鼠属(24.75%);夏季捕获26种小型兽类,22种感 染巴尔通体,夏季各属种间巴尔通体感染率均无差异(%2二25.47,尸>0.05);秋季捕 获22种小型兽类,19种感染巴尔通体;冬季捕获22种小型兽类,18种感染巴尔 通体;白腹鼠属、绒鼠属、家鼠属在四个季节巴尔通体感染率均无差异(尸>0.05), 姬鼠属在夏季巴尔通体(64.61%)的感染率高于秋季(49.78%)和冬季(47.17%)(尸 <0.05),巢鼠在四个季节中均未感染,树齣仅在夏季感染巴尔通体,见表2.3。玉龙 鼠疫疫源地春、夏、秋、冬四个季节小型兽类巴尔通体感染率分别为50.40%(63/125)、 66.12%(80/121)> 48.88%(87/178)> 39.68%(50/126),玉龙鼠疫疫源地不同季节野外 小型兽类巴尔通体感染率具有显著差异(%2二17.86,尸V0.05),夏季感染率最高,见 表2.4;剑川鼠疫疫源地春、夏、秋、冬四个季节小型兽类巴尔通体感染率分别为 37.59%(53/141)、43.79%(74/169)、36.26%(62/171)、41.92%(70/167),剑川鼠疫疫源 地不同季节野外小型兽类巴尔通体感染率无差异"二2.61,尸〉0.05)见表2.5;梁河 鼠疫疫源地春、夏、秋、冬四个季节小型兽类巴尔通体感染率分别为59.14%(55/93)、 69.23%(54/78)、51.67%(62/120)、50.00%(58/116),梁河鼠疫疫源地不同季节野外小 型兽类巴尔通体感染率均无差异(咒2二8.52,尸>0.05),见表2.6

表2.5剑川鼠疫疫源地不同季节野外小型兽类感染巴尔通体情况(阳性数/样本数(%)

表2.6梁河鼠疫疫源地不同季节野外小型兽类感染巴尔通体情况(阳性数/样本数(%))

2.6不同类型鼠疫疫源地小型兽类巴尔通体感染率

野鼠鼠疫疫源地和家鼠鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率分别为 44.99%(539/1198)和56.27%(229/407),两种类型鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体 感染率具有显著性差异Ge?二15.02,尸V0.05),家鼠鼠疫疫源地野外小型兽类感染率 高于野鼠鼠疫疫源地,提示不同类型鼠疫疫源地野外巴尔通体感染率不同。野鼠鼠 疫疫源地捕获的24种小型兽类,17种感染巴尔通体,7种未感染巴尔通体,分别 为斯氏家鼠、树齣、高山齣購、臭齣縮、巢鼠、赤腹松鼠和侧纹岩松鼠,而家鼠鼠 疫疫源地捕获的17种小型兽类均感染巴尔通体,见表2.7。

表2.7云南鼠疫自然疫源地不同类型鼠疫疫源地野外小型兽类感染巴尔通体的情况(阳性数/样本数(%))

续表2.7云南鼠疫自然疫源地不同类型鼠疫疫源地野外小型兽类感染巴尔通体的情况(阳性数/样本数(%))

2.7不同性别小型兽类巴尔通体感染率

此次研究的样本雌性小型兽类巴尔通体的感染率为45.11%(337/747),雄性小 型兽类为50.12%(427/852),其中6只小型兽类样本性别不明确,不同性别巴尔通 体感染率有差异(/二3.99,尸V0.05),雄性鼠巴尔通体感染率高于雌性鼠,见表2.8。

2.8不同栖息环境小型兽类巴尔通体感染率

捕获野外小型兽类主要以林地、耕地、林地耕地交界、耕地灌丛交界和灌丛5 种栖息环境,其中以林地捕获的野外小型兽类种类及数量最多,主要生存的是姬鼠 属、绒鼠属和家鼠属。每种栖息环境野外小型兽类巴尔通体的感染率分别为林地 51.16%(530/1036)、耕地灌丛交界 48.33%(58/120)> 林地耕地交界 42.54%(77/181)> 耕地39.66%(92/232)、灌丛30.56%(11/36),不同栖息环境小型兽类巴尔通体感染 率具有显著性差异(加二17.16, P<0.05),林地小型兽类感染率高于耕地、灌丛及耕 地林地交界小型兽类感染率,见表2.8。

2.9不同海拔小型兽类巴尔通体感染率

随海拔升高,野外小型兽类巴尔通体感染率呈升高趋势,但对其中某一海拔梯 度具有高度适应性,具体情况为:玉龙鼠疫疫源地2400〜2600m野外小型兽类巴尔 通体感染率为 31.15%(19/61)、2600〜2800m 感染率为 36.84%(28/76)> 2800〜3000m 感染率为61.54%(64/104)、3000m以上感染率为48.87%(151/309),玉龙鼠疫疫源 地不同海拔梯度野外小型兽类巴尔通体感染率具有显著差异(加二18.44, P <0.05), 其中2800〜3000m野外小型兽类巴尔通体感染率最高;剑川鼠疫疫源地2250〜2450 m野外小型兽类巴尔通体感染率为35.56%(32/90)、2450〜2650感染率为38.05%(1 56/410)、2650〜2850m感染率为47.97%(71/148),剑川鼠疫疫源地不同海拔梯度野

外小型兽类巴尔通体感染率无差异(咒2二5.31, P >0.05);梁河县1000〜1200m野外 小型兽类巴尔通体感染率为48.72%(57/117)、1200〜1400m感染率为39.50%(47/1 19)、1400〜1600m 感染率为 78.18%(86/110)> 1600m 以上感染率为 63.93%(39/61), 梁河鼠疫疫源地不同海拔梯度野外小型兽类巴尔通体感染率具有显著性差异(/2= 35.76, P <0.05),其中1400〜1600m野外小型兽类巴尔通体感染率最高,见表2. 9-

表2.9不同海拔梯度野外小型兽类巴尔通体感染率情况

2.10小型兽类感染巴尔通体的影响因素

将小型兽类是否感染巴尔通体为因变量,以小型兽类采样地区、季节、鼠种、

性别、年龄、栖息环境、海拔及是否带蚤为自变量,进行Logistic回归分析,见表

2.10。结果显示,采样地区、季节、海拔、鼠种4个因素对野外小型兽类感染巴尔 通体有影响。以剑川鼠疫疫源地相比,玉龙鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染 率是剑川鼠疫疫源地的1.44倍,梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率是 剑川鼠疫疫源地的9.16倍,因此野外小型兽类巴尔通体感染率从剑川鼠疫疫源地 —玉龙鼠疫疫源地一梁河鼠疫疫源地依次增大;以春季相比,夏季野外小型兽类巴 尔通体感染率是春季1.32倍,秋季较春季野外小型兽类感染率降低30%,冬季较 春季野外小型兽类感染率降低25%;从夏季一春季一冬季一秋季,野外小型兽类 感染率依次减小;以齐氏姬鼠相比,中华姬鼠巴尔通体感染率降低5%,大绒鼠巴 尔通体感染率降低49%,黄胸鼠巴尔通体感染率降低45%,斯氏家鼠巴尔通体感 染率降低59%,其它鼠种巴尔通体感染率降低64%,齐氏姬鼠一中华姬鼠一黄胸 鼠一大绒鼠一斯氏家鼠一其它鼠种巴尔通体感染率依次减小;以1000〜1500m海拔 梯带相比,1500〜2000m海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率增加2.21倍,>3000m 海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率增加1.27倍,2500〜3000m海拔带野外小型兽 类巴尔通体感染率增加1.07倍,2000〜2500m海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率 降低 33%。2000〜2500m—2500〜3000m—33000m—1000〜1500m—1500〜2000m 野外 小型兽类巴尔通体感染率依次增大。

表2.10变量赋值说明

表2.11影响云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率的Logistic回归分析结果

尔通体遗传进化分析

2.11.1 NCBI序列比对结果

将94份ssrA基因阳性样本测序,经NCBI Blast序列比对,样本JC-1-076、

JC-2-038、JC-2-06K JC-3-010、JC-3-068、SL-1-01K SL-1-08K SL4008、SL-4- 107、YL-2-005、YL-2-040、LH-3-013、LH-4-031 等 22 份样本与巴尔通体(Bartonella sp. ARI5-3)同源性高达 98% 以上;样本 JC-2-033、SL-l-088> YL-1-110. LH-1-103 等28份样本与特利波契巴尔通体(Bartonella tribocoruni)同源性在96%〜100%之间, 其中样本LH-1-115和LH-1-068同源性高达100%,而样本SL-3-028与与特利波 契巴尔通体同源性仅为 95.70%;样本 JC-2-046、JC-4-069、YL-2-076、LH-1-088 等 10份样本与罗莎利马巴尔通体{Bartonella rochalimae)同源性高达99%以上,其中 LH-3-206 同源性高达 100%;样本 JC-2-035、SL-1-118> SL-3-026、SL-4-03K YL- 1-033、YL-2-087> YL-3-135、LH-3-056 等 19 份样本与日本巴尔通体(Bartonella japonica)同源性达96%以上,其中样本LH-3-063同源性高达98%以上;样本YL- 1-011、YL-3-230、LH-3-056 与泰勒巴尔通体(Bartonella taylorii)同源性高达 98%以 上;样本 JC-3-026、YL-2-00K YL-3-258、SL-4-108、LH-1-079 5 份样本与伊丽莎白 巴尔通体{Bartonella elizabethae)同源性达96%以上,其中样本LH-1-079同源性高 达98%以上,样本JC-3-054、SL-1-026与伊丽莎白巴尔通体同源性为96%以上, 样本YL-2-026与伊丽莎白巴尔通体同源性仅为94.80%;样本LH-4-186和样本LH- 4-189与巴尔通体(Bartonella sp.)同源性高达99%;样本YL-1-094与格拉汉姆巴尔 通体(Bartonella grahamit)同源性达96%以上。

2.11.2系统发育分析

将94份基于ssrA基因阳性测序成功后,经Blast后在GenBank中选择基于 ssrA基因的27个参照菌株构建系统发育树(图2-3)。该阳性样本检测出的巴尔通 体为 Bartonella rochalimaeBartonella japonicaBartonella tribocorumBartonella washoensis> Bartonellasylvatica> Bartonella rattimassiliensis 六种基因型。样本 LH-

  • 206 与 BartonellarochalimaeMFl55651 相互聚集,同源性高达 100%,样本 YL-3- 147、JC-2-048、JC-4-069、YL-2-008、YL-2-076、YL-2-158 Bartonella mchalimae MF755651聚为一个分支,LH-1-088, LH-2-065、LH-1-046处于同一分类大支;样 本 YL-1-094 与 Bartonella washoensis JN029786 聚为一个分支;样本 YL-3-026、JC- 2-035、SL-1-118. SL-3-026、SL-4-03K YL-1-033、YL-2-087、YL-3-026 等 17 份 样本与 Bartonella japonica JN029784 相互聚集;样本 LH-1-106 与 Bartonella sylvatica JN029782聚为一个分支;样本YL-3-230、YL-1-011和样本LH-1-094聚为一个分 支;样本 LH-3-058 与 Bartonella rattimassiliensis KT355804 聚为一个分支;LH-1- 068 和 LH-1-115 与 Bartonella tribocorum MF765680 相互聚集,样本 LH-3-088 和 LH-3-198 与 Bartonella tribocorum 聚为一个分支;样本 YL-4-084、YL-2-181、JC-
  • 009、SL-1 -026、LH-1 -012、LH-1 -098 单独聚集为一个分支,与 Bartonella tribocorum 最大相似值为97%,样本YL-2-026与Bartonella elizabethae相似值为8%,样 本 YL-3-002、YL-1-110、SL-l-088> JC-3-087、JC-3-026、YL-4-070、YL-3-258、 JC-3-070、YL-3-202、JC-2-033、JC-3-01K JC-3-053、SL亠 107、SL-3-05K SL-4- 081、SL-4-108、SL-3-135、YL-2-001属同一分类大支,提示这19份样本可能为巴 尔通体的亚型,目前为确定种名,但样本SL-3-028、YL-3-002等8个样本聚集为 一个分支,JC-3-070、YL-3-202等11个样本聚集为一个分支,2个小分支亲缘关 系较近。

D.OOS

注:▲表示由该基因确定的巴尔通体种
图2-3基于ssrA基因构建的系统发育树

第三章讨论

我国于1999年白瑛等[覘在云南省首次研究后,越来越多的学者开始关注并研 究巴尔通体,我国几乎每年从不同宿主动物中分离出巴尔通体,研究区域覆盖全国, 感染率较高,地区差异性较大,其中我国北部和西南部感染率较高[伺。在云南,已 从不同气候类型、生境等MO】对小型兽类感染巴尔通体进行了研究,呈现出对不同 气候与不同地理环境的高适应性,而且证实在我省西北部地区存在巴尔通体的自 然疫源地跑。

3.1小型兽类感染情况

本研究1605只野外小型兽类包括3 g 19属30种,其中有3 g 15属25种 768只小型兽类感染巴尔通体,感染率为47.85%,说明巴尔通体在云南鼠疫自然 疫源地具有较高的感染率,且在小型兽类中普遍存在。2017年马洁琼等对我国 小型兽类巴尔通体感染的研究中,云南小型兽类巴尔通体感染率为23.66%,低于 此次研究,可能由于采样地、鼠种、数量不同或检测方法的差异等影响。小型兽类 巴尔通体感染的地区差异较大,临近省份贵州、广西和西藏小型兽类巴尔通体感染 率分别为28.86%[17]> 2.3%卿、55.38%[17],临近国家越南小型兽类巴尔通体感染率 为14.9%,黄胸鼠感染最高(49.2%),褐家鼠次之(20.7%),巴尔通体感染率受鼠种、 虫前的数量及栖息环境影响[50]o 1999年白瑛等[附在云南鼠疫自然疫源地的研究小型 兽类感染巴尔通体的阳性率为44.3%,阳性率低于本次研究,非鼠疫自然疫源地小 型兽类的阳性率为10.47%〜39.20%肌41,51,52],鼠疫自然疫源地的感染率明显高于非 鼠疫自然疫源地。鼠疫自然疫源地巴尔通体感染率为什么高于非鼠疫自然疫源地, 是否与鼠疫、宿主动物、传播媒介及生态环境有关,有待进一步研究。本调查发现 家鼠鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率高于野鼠鼠疫疫源地,可能由于云 南家、野两型鼠疫自然疫源地种群构成不同,家、野鼠疫源地的主要宿主分别为黄 胸鼠和齐氏姬鼠,这2种小型兽类感染巴尔通体感染率都较高,分别为57.00%和 54.14%,表明家鼠鼠疫自然疫源地小型兽类更易感巴尔通体,其次由于两种类型的 鼠疫自然疫源地生态环境等的不同,可能也会导致病原菌在整个循环体系中的差 异。

于1999〜2018年在云南某些地区从黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠、小家鼠、锡金小 鼠、齐氏姬鼠、中华姬鼠、大绒鼠、臭齣購、社鼠、针毛鼠等小型兽类中检测到巴 尔通体,在不同地区同一鼠种的感染率也不同,其中黄胸鼠、齐氏姬鼠研究较多。 黄胸鼠是我国主要家栖鼠种之一且与人群关系密切,分布较广,繁殖能力强,具有 季节迁移等特点,也是我省家鼠鼠疫疫源地的主要宿主动物。滇西地区6次小型 兽类巴尔通体感染的调查显示黄胸鼠感染巴尔通体,且感染率具有差异(41.4%、 42.0%、、30.1%、28.99%、23.05%、28.99%、14.8%);其次,齐氏姬鼠巴尔通体的 感染率差异较大(62.5%、25.27%),且已有研究证实黄胸鼠和齐氏姬鼠携带致病性 巴尔通体。上述情况表明这两种小型兽类在作为巴尔通体主要宿主中占有重要地 位。

本文对云南鼠疫自然疫源地展开了较为系统的调查,结果显示30种小型兽类 中25种感染巴尔通体,表明巴尔通体具有较高宿主多样性的特征,目前基于全基 因组数据集的巴尔通体系统发育已经揭示了四个谱系,在进化过程中,这些谱系已 经适应了多种宿主,提示巴尔通体能感染不同宿主。不同鼠种间巴尔通体感染率具 有显著差异(尸V0.01),与姜亚运等[利的研究一致。短尾齣属(短尾齣)、白腹鼠属(针 毛鼠、社鼠、白腹鼠)、姬鼠属(齐氏姬鼠、中华姬鼠、大耳姬鼠)、小鼠属(锡金小 鼠)、家鼠属(黄胸鼠、斯氏家鼠、褐家鼠、大足鼠)感染率较高,此次调查样本数量 较大,涉及鼠种及数量较多,发现短尾齣属(80.00%)巴尔通体最高,白腹鼠属 (59.55%)次之,短尾齣样本绝大部分来自梁河鼠疫疫源地,此鼠种在该地区属于常 见种,表明短尾齣在该地区是易感宿主且能携带巴尔通体,具有传播该病原菌的能 力,针毛鼠、社鼠、白腹鼠巴尔通体感染率差异较大,其中针毛鼠感染率较高,针 毛鼠作为野鼠,在家鼠鼠疫疫源地分布广泛,易于巴尔通体的传播。巢鼠、高山齣 赭、赤腹松鼠、侧纹岩松鼠、滇绒鼠未感染巴尔通体,可能鼠种和样本数量较少有 关。不同地区小型兽类巴尔通体感染率不同,梁河鼠疫疫源地为56.27%,玉龙鼠 疫疫源地为50.91%,剑川鼠疫疫源地为39.97%,各地区野外小型兽类巴尔通体感 染率具有显著差异(尸<0.05),此结果与文献中一致,可能与各个地区小型兽类的种 类及数量差异有关[河。梁河鼠疫疫源地优势鼠种为黄胸鼠、斯氏家鼠及锡金小鼠, 感染率较高且这三种小型兽类是该地区巴尔通体重要宿主,其中栗冬梅等so】的调 查中,锡金小鼠巴尔通体感染率较高为66.7%,高于此次调查(54.55%),但总体来 说锡金小鼠对巴尔通体易感;玉龙鼠疫疫源地优势鼠种为齐氏姬鼠、大绒鼠及中华 姬鼠,也是主要宿主动物,齐氏姬鼠(65.95%)和中华姬鼠(65.91%)巴尔通体感染率 高于大绒鼠(38.46%),与白瑛等跑研究姬鼠属感染率较高一致。

不同性别小型兽类巴尔通体感染的结果表明,雄性小型兽类巴尔通体感染率 高于雌性小型兽类(P<0.05)o本次调查中,雄性鼠样本为852份,雌性鼠样本747 份,感染率较高,但与肖方震等昭和Kleynhans DJ等跑研究结果不同,可能因地 区、鼠种、样本数量较少等的不同有关。但Welc-Faleciak R等〔切研究结果与本文 研究结果一致,即雄性鼠感染率高于雌性鼠,可能的原因为雄性鼠活动范围较大, 其与病原体接触的机会更大且可能作为传染源大范围传播。

3.2自然环境对巴尔通体感染率的影响

本研究分别在春、夏、秋、冬四个季节捕获小型兽类,结果显示四个季节均有 野外小型兽类感染巴尔通体,感染率分别为47.63%、56.52%、44.99%、43.52%, 各季节巴尔通体感染率具有显著差异(P <0.05),其中夏季最高,这一结果与 Meheretu Y等[涸研究结果不同,小型兽类巴尔通体感染率无明显季节性差异,旱 季早期(11-12月)感染率增加,产生此结果的原因可能与宿主动物繁殖、气候差异 和栖息环境等因素有关。而Tawisa J等卩刃在越南、老挝及泰国的研究与本文结果 一致,夏季感染率最高,可能与病原体的传播速率,宿主的动态变化,小型兽类大 量繁殖和蚤、虱、婢、嫡等传播媒介的丰度有关,在宿主和巴尔通体感染之间宿主 密度对外寄生物交换至关重要,且有研究证实气温对跳蚤幼虫的生长具有较大影 响,因此可能间接影响巴尔通体的传播,同时小型兽类与所生存栖息环境发生物质 能量交换,导致某些营养植被的摄入减少,也增加了巴尔通体感染的机会屮]。玉龙 鼠疫疫源地与剑川鼠疫疫源地宿主动物及传播媒介具有高度的相似性,且地理位 置毗邻,自然景观相似,但是仅玉龙鼠疫疫源地不同季节小型兽类感染巴尔通体感 染率存在差异,表明玉龙鼠疫疫源地与剑川鼠疫疫源地的生态圈可能不同,且巴尔 通体的感染模式也存在差异,有待进一步研究。以上情况提示巴尔通体对不同地区 及气候环境具有较高的适应性,且感染率与栖息环境有较大关系。加之该研究区域 为鼠疫自然疫源地,小型兽类密度较高,对当地居民具有致病隐患,因此应加强对 该区域巴尔通体的研究及监测。

不同海拔梯度的结果总体呈现出野外小型兽类巴尔通体感染率随海拔升高而 上升的趋势特征,但对其中某一海拔梯度具有高度适应性。剑川鼠疫疫源地虽然各 海拔梯度中物种丰富度、多样性指数及生态优势度指数不同,但不同海拔梯度中野 外小型兽类均有巴尔通体感染的存在。剑川疫源地海拔梯度的变化未对不同海拔 带宿主动物的群落特征和该地区整体结构产生波动变化,这也体现出该疫源地生 态系统的稳定性20],因此该地区各海拔梯度巴尔通体感染的整个生态系统较稳定。 玉龙鼠疫疫源地2800〜3000m海拔带野外小型兽类感染率最高为61.54%,其次是 3000m以上海拔带(48.86%),这2个海拔带野外小型兽类群落生态学特征较接近, 物种丰富度较大导致种间竞争加剧,促使整个生态系统生产力提高,加大该区域小 型兽类活跃度,有利于巴尔通体的传播。梁河鼠疫疫源地4个海拔带中1400〜1600m 海拔带野外小型兽类巴尔通体感染率最高为78.18%。1400〜1600m海拔带和1600m 以上海拔带群落相似度较高,物种多样性优于1000〜1200m海拔带和1200〜1400m 海拔带。此外优势鼠种随海拔升高而增加,优势鼠种逐渐向野鼠的转变,特别是针 毛鼠,在该疫源地分布广泛。

本研究采样地区主要以林地、耕地、耕地林地交界、耕地灌丛交界、灌丛5种 栖息环境为主,每个栖息环境野外小型兽类巴尔通体感染率具有显著差异(尸V0.01), 与姜亚运等mi]在宁夏研究结果一致。本文中不同栖息环境均检测出野外小型兽类 感染巴尔通体,感染均较高,其中以林地为栖息环境的野外小型兽类感染率最高 (51.16%),其次耕地灌丛交界(48.33%),表明巴尔通体能在不同的栖息环境进行物 质交换、传播等。林地物种丰富、水源丰富等构成一个小型生态系统,不同动物之 间密切接触,传播媒介丰富多样,使得巴尔通体在这一生态系统中不间断进行循环, 导致不同种动物、同种动物之间的相互传播机会增大。耕地灌丛交界这一栖息环境 有利于小型兽类的繁殖,鼠洞较多,食物充沛且易于觅得。小型兽类的大量繁殖, 使其接触并传播的可能性增大,加大感染机会。

云南鼠疫自然疫源地小型兽类巴尔通体的感染率影响因素分析结果提示,感 染率可能受采样地区、季节、海拔、鼠种的影响。TawisaJ等网研究结果也显示地 区、季节、鼠种对小型兽类巴尔通体感染存在影响。本文3个地区优势鼠种不同且 自然环境也存在差异,可能由于小型兽类种群密度和动态变化以及某一特定鼠种 的受检数量的影响。此外,巴尔通体的流行也有季节性变化。例如PaweczykA等 g]发现巴尔通体感染在夏季和秋季很常见。在本文研究中也得到类似结果,即夏 季感染率高于秋季和冬季。SpitalskaE等〔何研究发现秋季感染率高于春季。这种季 节性差异在以往的研究中没被发现,这可能是由于样本量较低。不同海拔带植被、 土壤、水资源等存在差异,导致小型兽类分布不同,从而影响到各海拔区间捕获的 鼠种之间的差别,1500〜2000m海拔带主要是梁河鼠疫疫源地,黄胸鼠分布广泛且 数量较多,是许多种巴尔通体的储存宿主,因此这一海拔期间小型兽类巴尔通体感 染的可能性最大。从2000m以上的海拔捕获的小型兽类属于剑川鼠疫疫源地和玉 龙鼠疫疫源地,总体呈现出随海拔升高感染率上升的趋势。张耀允等⑷]的研究也 证实巴尔通体各海拔均有分布且也呈现出随海拔升高巴尔通体感染升高,说明巴 尔通体在云南不同地理环境分布广泛及高度适应性。

3.3遗传进化特征的分析

本研究基于筛选出的94个阳性样本,共检测出Bartonella rochalimae> Bartonella japonicaBartonella tribocorumBartonella washoensisBartonella sylvatica> Bartonella rattimassiliensis A种基因型的巴尔通体,表明云南鼠疫自然疫 源地野外小型兽类中巴尔通体基因具有多样性。不同基因型的巴尔通体对宿主具 有特异性,2010年首次从大林姬鼠分离出Bartonellasylvatica,感染的仅大林姬鼠 和黑线姬鼠,而本文中样本LH-1-106锡金小鼠感染该种巴尔通体,说明在梁河鼠 疫疫源地可能存在Bartonella sylvaticao同种基因型的巴尔通体对不同宿主具有广 泛的适应性,Bartonella elizabethae可感染多种宿主,包括褐家鼠、黄胸鼠、臭齣 鼠青、板齿鼠等,Bartonella grahamii宿主分布广泛,6个鼠属16个鼠种均有分布, 其中主要从姬鼠属检测出“勺。本文中检测出的Bartonella japonicaBartonella tribocorum感染的宿主较多,包括姬鼠属、绒鼠属、家鼠属、小鼠属等,其中姬鼠 属感染较多。Bartonella japonica主要分布在剑川鼠疫疫源地和玉龙鼠疫疫源地的 齐氏姬鼠和中华姬鼠中,玉龙鼠疫疫源地春、夏、秋、冬四个季节均有分布,表明 该基因型巴尔通体在玉龙鼠疫疫源地广泛存在且对不同季节的高度适应性。 Bartonella tribocorum主要分布在梁河鼠疫疫源地,黄胸鼠、针毛鼠均能感染该种 巴尔通体。Bartonella rattimassiliensis来源于梁河鼠疫疫源地斯氏家鼠,存在于林 地,受季节和栖息环境影响。Bartonella rochalimae> Bartonella tribocorum^ Bartonella washoensis能导致人群患病,引起菌血症、发热、心内膜炎等,因此在云南鼠疫自 然疫源地应加强小型兽类监测,与小型兽类密切接触人群应定期进行血清学检测 塞

第四章结论

4.1云南玉龙鼠疫疫源地、剑川鼠疫疫源地及梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴 尔通体感染为47.85%,且巴尔通体宿主具有多样性。

4.2云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类感染巴尔通体受采样地区、季节、海拔、 鼠种四个因素影响。梁河鼠疫疫源地野外小型兽类巴尔通体感染率最高,剑川鼠疫 疫源地最低;春夏秋冬四个季节均有野外小型兽类感染巴尔通体,夏季感染率最高; 随海拔升高,野外小型兽类巴尔通体感染率呈上升趋势,但对其中某一海拔具有高 度适应性。

4.3云南鼠疫自然疫源地野外小型兽类巴尔通体基因型具有多样性,其中三种 对人群致病。

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文献综述

鼠形动物自然感染巴尔通体的研究进展

俞丹,尹家祥

摘要:巴尔通体为革兰染色阴性杆菌,寄生于脊椎动物红细胞内,可引起巴尔通 体病。随着交通、旅游业的发展和原生环境的开发,人类与鼠形动物的接触机会增 多,可能导致巴尔通体病大范围传播,对人类健康造成潜在的威胁。本文从巴尔通 体的生物学特性、宿主动物、传播媒介以及流行现状等方面进行了综述。

关键词:巴尔通体;鼠形动物;流行病学

Research progress on natural infection of small mammals with Bartonella species

YU Dan, YIN Jia-xiang

School of Public Health, Dali University, Dali 671000,China

Corresponding author. Yin Jz6z-xz^ng,Email:chinayjx@hotmail.com

Abstract: Bartonella species is a gram-negative bacillus that is parasitic on the vertebrate erythrocyte and causes Bartonellosis. With the development of transportation, tourism and the exploitation of the native environment, human have more opportunities to contact with small mammals, thus may lead to the spread of Bartonellosis in a wide range and potential threats to human health. This paper summarizes the biologicalproperty of Bartonella, host animals, vectors and epidemic situation.

Key words: Bartonella; small mammals; epidemiology

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (81460485),the Yunnan Provincial Training of Youth Leader in Academic and Technical Reserve Talents(2013HB080)and Dali University Doctoral Scientific Research Foundation (KYBS201302)

基金项目:国家自然科学基金项目(81460485);云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目 (2013HB080);大理学院博士科研启动费项目(KYES201302)

作者单位:大理大学公共卫生学院,大理671000

作者简介:俞丹,女,云南省曲靖市人,在读硕士,研究方向:自然疫源性疾病流行病学。

通讯作者:尹家祥,

收稿日期:2017-11-22

巴尔通体{Bartonella)是一种引起人和动物患病的新发现的古老病原体。1905 年在秘鲁首次发现人类巴尔通体病Oroya热的致病因子⑴;1919年Battistini等⑵ 分离出该病原体。巴尔通体在世界范围内广泛存在,现已发现36种及亚种,其中 至少17种及亚种对人与动物致病⑶。目前已从鼠形动物分离出巴尔通体22种及亚 种,其中7种可导致人患病⑷。随着越来越多致病巴尔通体被发现,该病原体也越 来越受到生物医学界的重视,巴尔通体病也被我国定为14种新发传染病之一。因 此密切监测鼠形动物巴尔通体感染情况,制定相应的防治措施,对防控巴尔通体病 的发生和流行有重要意义。

1病原体

巴尔通体属变形菌纲、a亚纲、根瘤菌目、巴尔通体科、巴尔通体属,是一种 革兰氏阴性、嗜血性的、氧化酶阴性的兼性细胞内寄生的需氧菌⑸,形态多样呈杆 状、细小球状、环状等,大部分无鞭毛,仅克氏巴尔通体(B.clarridgeiae)和杆菌样 巴尔通体(B.bacilliform)^鞭毛。目前,有21种巴尔通体基因组已被测序,与大多 数细菌(如Escherichia coli>4 M)相比,巴尔通体有1个较小的环状基因组,大小 范围是1.45 Mb(l 268个编码基因)〜2.62Mb(2 360个编码基因),平均为1.85 M⑹。 系统发育分析物种的特征表明,除B.rochalimaeB.tamiae以外,大多数巴尔通 体在一个共同的谱系中聚集,证明这些病原体在啮齿动物中的适应性进化的发生 ⑷。巴尔通体生化反应不活泼,营养要求十分苛刻。巴尔通体生长的最适pH是 6.S-7.2,在体外培养生长缓慢,很难进行分离培养和增殖培养。在固体培养基上巴 尔通体的生长比在液体培养基上慢,而且以鼠形动物为宿主的巴尔通体的生长速 度较猫、犬、人等为宿主的巴尔通体生长快⑺。巴尔通体主要寄生在动物宿主和人 的血管内皮细胞、上皮细胞和红细胞内,能够引起人类猫抓病、心内膜炎、战壕热、 卡里翁氏病和其他系统性病变等,在临床上以猫抓病较为多见⑻。

2宿主动物

巴尔通体广泛存在自然界中,除五日热巴尔通体、杆菌样巴尔通体的宿主是人 类外,其余均可存在自然界中的动物体内,包括猫科动物、小型兽类、犬科动物、 有蹄类动物、兔科动物等,而鼠形动物是巴尔通体的自然宿主,也是巴尔通体最主 要的贮存宿主⑼。宿主感染巴尔通体后,巴尔通体不能直接定殖在红细胞中,而是 通过迁移细胞将巴尔通体转运到血管内皮细胞中,并在其繁殖,细菌通过脉管系统

进入血液,感染红细胞,在红细胞中增殖后,仍然留在红细胞中,宿主免疫系统不 能识别和清除,因此导致长期感染a】。但Deng等Mi]的研究提出IalB有利于巴尔 通体进入红细胞,用抗IalB抗体进行干扰,抑制B.birtlesii对小鼠红细胞的侵袭, 这说明感染巴尔通体受效应器的影响。不同种及亚种巴尔通体的宿主动物不同(表 l)o由于频繁的基因重组、水平基因的重合和突变的积累,存在于鼠形动物体内巴 尔通体基因型从鼠形动物的进化中得到了潜在的加速进化[1現 鼠形动物与人类关 系密切,它作为巴尔通体的宿主,对人群健康有潜在的威胁,因此对鼠形动物研究 至关重要,以确定作为人群感染源的程度。

表1不同种及亚种巴尔通体感染宿主动物的类型

Tablet Types of host animals infected with Bartonella species

3传播媒介

蚤、虱、脾、嫡等节肢动物是鼠形动物的寄生物,且对巴尔通体十分易感。吸 血节肢动物也是巴尔通体的生物学传播媒介,巴尔通体之所以呈世界性的分布,与 其密切相关。当吸血节肢动物叮咬感染的宿主时,其寄生在红细胞内的巴尔通体可 进入吸血节肢动物体内,当它叮咬健康宿主时,可将巴尔通体传播给该宿主,使其 患病,如此反复,形成媒介和宿主间的传播链。在媒介和宿主这一传播系统中,蚤 起到重要作用,因为它们能携带多样性的巴尔通体,并且在啮齿类动物中传播这些 细菌时表现出高效率。因此,跳蚤不能单独作为载体,而是代表这些细菌的附加储 藏库。此外,通过巴尔通体OE1-1(—种与B.elizabethae密切相关的菌株)感染客蚤 (Xenopsylla)的实验证明巴尔通体和蚤之间的相互适应性,这种变异巴尔通体的感 染并不影响雌性蚤的代谢率、血液消耗、寿命、生育力或繁殖力,也不影响发育时 间[⑶。鼠形动物的栖息地,行为和寄生物的寄生可能是影响巴尔通体传播的重要 条件,而且这些条件通常在物种和地理区域上是不同的。因此,如果条件不利于寄 生物的生存,对巴尔通体的传播具有很大影响,可能导致细菌感染的脆弱性增加, 并且可能限制或增强在这些动物群落中观察到的巴尔通体的多样性。国外研究表 明从大鼠收集的寄生物巴尔通体感染率根据寄生物的类型而存在差异,巴尔通体 感染率较高分别为虱(57.1%)和蚤(25.8%),而蝉(3.5%)和嫡(1.7%)感染率较低冋。 另外的实验研究证实在鼠形动物及其寄生蚤中检测到B.grhamii> B.tayloriiB. rochalimae,以及从脾体内检测到B. grahamiio但是目前还未能证实B.grhamii能 通过蚤和脾将疾病传播给人类及其他动物。由此可见,鼠形动物的寄生物传播巴尔 通体的机制,携带病原体的能力和对人类的潜在威胁等尚不清楚,有待进一步研究 和探讨。

4巴尔通体感染鼠形动物流行现状

巴尔通体感染鼠形动物呈世界性分布。在北美洲,巴尔通体感染率较高,在美 国堪萨斯州北部地区,科罗拉多鹿^{Peromyscus maniculatus)和食蝗鼠(Onychomys leucogaster)感染率分别高达82.4%[15]和90.4%[16],表明宿主和病原体之间相互适 应。而在美国加利福尼亚州洛杉矶鼠形动物Bartonella rochalimaeBartonella tribocorum感染率分别为18.5%和57.5%[17]O墨西哥西北部鼠形动物巴尔通体感染 率为50.1%[18]o在欧洲,鼠形动物感染巴尔通体非常普遍,俄罗斯远东地区,东方 田鼠(Microtusfortis)感染率高达83%[19]O在立陶宛,鼠形动物和寄生物(蚤和脾)中 均检测到巴尔通体[201。在亚洲,日本最早研究鼠形动物的巴尔通体感染,并从鼠形 动物中分离到 6 种巴尔通体,即 B. acomydis> B. callosciuri> B. jaculi> B.japonica> B.pachyuromydis> B. sylvatic^□ Kim等〔乃]的研究表明鼠形动物巴尔通体感染率为 54.1%,姬鼠、家鼠、田鼠、齣鼠青是最常见的宿主动物。在非洲,鼠形动物巴尔通 感染率地区差异较大,其感染率在3.6%〜60%之间[22-27]。鼠形动物感染巴尔通体在 多数国家均存在,巴尔通体病已成为世界性的公共卫生问题,各国应相互协作,建 立和完善疾病监测网络,以利于巴尔通体病传播的早期预警。

近几年我国对鼠形动物巴尔通体感染的研究逐渐深入,并已在云南、浙江、福 建、海南、内蒙古、山西、宁夏和黑龙江等进行相关研究。1999年云南省首次证 实巴尔通体在鼠形动物中流行,感染率在27.3%〜44.3%,以黄胸鼠(7?加处 flavipectus)> 褐家鼠(Rattus norvegicus)^ 齐氏姬鼠(Apodamus chevrieri)> 大林姬鼠 {Apodamus speciosus)带菌率较高,分别为 42.0 %、42.9 %、62.2 %和 71.4 %[28]O 2013年研究表明云南省西北部地区(怒江州和迪庆州)存在巴尔通体的自然疫源地, 巴尔通体呈现出对各种气候环境与不同地理高适应性特征[29〕。浙江省鼠形动物中 广泛存在巴尔通体感染,2010年首次从黑线姬鼠(Apodamus agrarius)脾中分离出一 株巴尔通体,并且遗传进化分析检测到的巴尔通体与对人类致病巴尔通体 B .grahamii的遗传关系最近卩切;2014年首次从小家鼠musculus bactrianus)检 测到巴尔通体,平均阳性率为4.44%(28/630),并检测到其巴尔通体与汉赛巴尔通 体(B henselae)遗传关系最近刖,提示浙江省鼠形动物所携带的巴尔通体可能对人 类致病,存在感染人的风险。2006年叶曦等在福建省首次报道我国臭^(Suncus murinus)感染巴尔通体,感染率为20.55%[32],与2010年他们再次研究结果的相近 (21.43%)®]。2010年海南省分离出6株巴尔通体,其中黄毛鼠{Rattus losed)和屋顶 鼠(7?加加$ brunneusculue)各2株,针毛鼠(Niniventer fulvescens)和臭齣凤青各1株[珂。 在内蒙古调查显示2012年8种鼠形动物均培养出巴尔通体菌,阳性率为 56.41%(66/117), 2013年13种鼠形动物中有8种检出巴尔通体,阳性率为 38.37%(33/87),其中达乌尔黄鼠(Spermophilusdauricus)感染率最高(75%)[35]O 在宁 夏鼠形动物巴尔通体感染率为21.79%(51/234),其中以阿拉善黄^(Spermophilus alaschanicus)感染率最高45.45%(5/11)阳。在黑龙江省林区鼠形动物巴尔通体的感 染率为13.81%(71/514),11种鼠形动物中有10种感染巴尔通体卩刀。2013年在青海 省从高原鼠兔(Ochotona curzoiae^分离出15株巴尔通体,阳性率为18.99%,其 中12株的基因型与致病的菌株B. grahamii密切相关阴。2011年栗冬梅等的研究 显示,在中国黑瞎子岛啮齿动物巴尔通体的感染呈现出高流行率(57.7%)和高多样 性(属于8个分支的14种独特基因型)的特征卩9】。上述鼠形动物感染处于活跃、感 染率高的状态,有可能波及人群的风险,提示疾控防治工作者应该引起重视。

综上所述,巴尔通体感染鼠形动物在全球流行,巴尔通体病作为一种新发传染 病,给人和动物的健康带来威胁,需要加强其风险评估。鼠形动物巴尔通体的动态 和演化受到不同因素的影响,包括宿主特异性、节肢动物载体的能力、环境因素、 宿主行为以及宿主和载体中其他微生物的存在。虽然已有研究报道了这些生态因 素,但各种因素都在发生变化,应综合考虑多方面因素,才能得到较为准确科学的 结论。随着交通、旅游业的发展和一些重点项目的开发和建设,增加了人群与野生 动物和带菌媒介接触的机会,可能导致巴尔通体病向人类传播。因此,深入研究巴 尔通体致病机理、传播媒介种类、传播途径等,不仅可以进一步明确鼠形动物巴尔 通体传播尚未清楚的问题,而且可以提供切实可行以及针对性较强的预防措施,对 保护人群健康起着重要作用。

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