山西太原淋球菌多抗原序列分型以及mtrRv porBIb耐药基因的研究论文

2020年6月29日16:05:52山西太原淋球菌多抗原序列分型以及mtrRv porBIb耐药基因的研究论文已关闭评论

山西太原淋球菌多抗原序列分型以及mtrRv porBIb耐药基因的研究论文

摘要

目的:

  1. 研究山西太原地区淋球菌临床分离株对头抱曲松、头抱克月亏、阿奇霉素、环丙沙 星、大观霉素、四环素、青霉素七种药物的敏感性;
  2. 采用NG-MAST初步探索山西太原地区淋球菌的基因型,把握本地区淋球菌不同基 因型的流行状况,为疾病防控提供理论依据。
  3. 分析山西太原地区淋球菌头抱菌素敏感性改变和耐药基因mtrR和porBIb的关系。 方法:
  4. 收集2017年9月-2018年12月间,山西医科大学第二医院皮肤科、泌尿外科、 药敏室、山西疾病预防控制中心的淋球菌61株,用琼脂稀释法检测头抱曲松、头抱 克月亏、阿奇霉素、环丙沙星、大观霉素、四环素、青霉素七种药物的药敏。
  5. 提取其DNA,对por和tbpB基因片段进行扩增并测序,并在NG-MAST官网中分析 每株菌的por和tbpB对应的等位基因号,以及NG-MAST基因序列,用MegaX软件对 por和tbpB基因序列做进化树,用Bootstrap法对进化树的可靠性进行检验,分析 序列的同源性。
  6. 对药敏中的头抱曲松和头抱克月亏低敏和耐药的菌株和其中一株敏感的菌株的DNA 进行提取,扩增mtrR和porBIb基因片段并测序,对比分析其潜在突变。

结果:

  1. 头抱曲松、头抱克月亏、阿奇霉素、四环素、大观霉素、环丙沙星、青霉素的耐药 率分别为 0、0、92%、34. 43%, 9. 8%, 100%, 100%。
  2. ①61株淋球菌经测序分析,por —共得到44种等位基因,其中基因型porll32, por2001, por6993, por581是山西地区por的优势基因型。②tbpB —共得到26种等 位基因型,其中tbpB4, tbpB186, tbpB1058, tbpB566是山西地区的优势菌型。③一 共发现49种NG-MAST基因分型,其中新的基因型别有21种一共22株,而

NG-MAST3305、NG-MAST2083是山西地区流行的MAST基因型。

  1. ①9株低敏株中都发现了 mtrR启动子位置的33位A的删失,A39T、G45D、H105Y 氨基酸置换在低敏株中不完全发现,而敏感株中没有发现此突变。②9株低敏株和低 敏株的porBlb氨基酸序列中全存在M18T、Q143K、S258R的置换,而A121D、A121G 以及G120K只在低敏株中发现,在215位点所有菌株都存在置换。

结论:

  1. 四环素、大观霉素、环丙沙星、青霉素已不再适合山西地区淋球菌治疗,而头抱 曲松、头抱克月亏和阿奇霉素仍可用于山西太原地区淋球菌的治疗。
  2. ①por等位基因号90、5692、1123可能为短链上同一来源基因型。②淋球菌的 tbpB的进化图可以发现tbpB4、1601、446、75、447、156、1058的亲缘关系比较近, 它们可能是短链上来源相同的基因型。③山西太原淋球菌新的基因型别较多,山西地 区的淋球菌基因分型需要持久的监测。
  3. ①mtrR启动子区第33位A的缺失与淋球菌药物敏感性降低可能有关,而A39T、 G45D以及H105Y氨基酸的置换与淋球菌药物敏感性降低可能没有关系;②porBlb第 120、121位点氨基酸序列突变可能影响淋球菌对头抱菌素的药物敏感性。

关键词:淋球菌,多抗原序列分型,药物敏感性

Research on the multiantigen sequence typing and the
resistance genes mtrR and porBl of Neisseria gonorrhoeae in
Taiyuan Shanxi

Abstract

Objective:

  1. To study the sensitivity of clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae to the seven drugs of ceftriaxone, cefixime, azithromycin, ciprofloxacin, spectinomycin, tetracycline and penicillin in Taiyuan, Shanxi.
  2. Using the method of the multiantigen sequence typing to explore the genotype of Neisseria gonorrhoeae in Taiyuan, Shanxi Province, and grasping the prevalence of different genotypes of Neisseria gonorrhoeae in this area, and providing theoretical basis for disease prevention and control.
  3. To analyze the relationship between the sensitivity of cephalosporin in Taiyuan, Shanxi and the resistance genes mtrR and porBlb .

Method

  1. From September 2017 to December 2018 , 61 strains of Neisseria gonorrhoeae in the Second Hospital of Shanxi Medical University of Department of Dermatology , Urology, Drug Sensing , and Shanxi Center for Disease Control and Prevention , were used to detect seven drugs , sputum , azithromycin , ciprofloxacin , spectinomycin , tetracycline , and penicillin , by agar dilution method to study the drug sensitivity.
  2. The DNA of 61 strains was extracted, and the por and tbpB fragments were amplified and sequenced. The por and tbpB alleles and NG-MAST gene sequences of each strain were analyzed in NG-MAST official website, and the MegaX software was used. The por and tbpB gene sequences were used as phylogenetic trees, and the reliability of the phylogenetic tree was tested by the Bootstrap method to analyze the sequence homology.
  3. The DNA of the sensitive and resistant strains of ceftriaxone and cefecoxime and one sensitive strain were extracted, and the mtrR and porBlb gene fragments were amplified

and sequenced, and the potential mutations were analyzed.

Result

  1. The resistance rates of ceftriaxone, cefixime, azithromycin,tetracycline, spectinomycin, ciprofloxacin and penicillin were 0, 0, 4.92%, 34.43%, 9.8%, 100%, 100%,
  2. ©After sequencing of 61 strains of Neisseria gonorrhoeae, 44 alleles were obtained from por. The genotypes porll32, por2001, por6993, and por581 were the dominant genotypes of por in Shanxi .②A total of 26 alleles were obtained from tbpB, among which tbpB4, tbpB186, tbpB1058 and tbpB566 were dominant strains in Shanxi.. (3)A total of 49 NG-MAST genotypes were found, of which 22 were 21 new strains, and NG-MAST3305 and NG-MAST2083 were popular MAST genotypes in Shanxi.
  3. ①The deletion of 33 A in the position of the mtrR promoter was found in 9 strains of low-sensitivity strains.Amino acid substitutions of A39T, G45D and H105Y were not completely found in low-sensitivity strains, but not in sensitive strains.(DThe mutations of M18T, Q143K, and S258R were present in the amino acid sequence of porBlb of 9 low-sensitivity strains and the sensitive strain, while A121D,A121G,G120K was only found in low-sensitivity strains.All strains at positions 215 were replaced.

Conclusion:

  1. Tetracycline, spectinomycin, ciprofloxacin and penicillin are not suitable for the treatment of Neisseria gonorrhoeae in Taiyuan Shanxi, while ceftriaxone, cefixime and azithromycin are still suitable for the treatment of Neisseria gonorrhoeae in Taiyuan, Shanxi.
  2. ①The por allele number 90, 5692, 1123 may be the same source genotype on the short chain. ② The evolution map of the tbpB of Neisseria gonorrhoeae can be found that the relative relationship of tbpB4, 1601, 446, 75, 447, 156, and 1058 is relatively close.They may be the same genotypes on the short chain. (3)There are many new genotypes of Neisseria gonorrhoeae in Shanxi, and the genotyping of Neisseria gonorrhoeae in Shanxi requires long-term monitoring.
  3. ①The deletion of 33-position A of the mtrR gene,while amino acids the mutations of A39T, G45D, H105Y may not be related to the decreased sensitivity of the gonococcal drug ;(2)Mutations in the amino acid sequences at positions 120 and 121 of porBlb may

affect the drug sensitivity of gonococcal to cephalosporins.

Key words : Neisseria gonorrhoeae; Multiantigen sequence typing; Susceptibility;

淋病是世界上常见的性传播疾病之一,据世界卫生组织估计2012年每年大约出 现7800万新的淋病患者⑴。迁延不愈的淋球菌感染可诱发多种并发症:如不孕不育、 盆腔炎、异位妊娠及早产等,所以及时有效的淋球菌防治显得尤为重要。在20世纪 30年代中期,磺胺类药物首先用于治疗淋病,随着药物的广泛使用,让淋球菌进化 逐渐获得超凡的耐药性能力,而后相继对磺胺类、青霉素类、四环素类、大环内酯类 和氟卩奎诺酮类等药物产生耐药⑵。目前,淋球菌的治疗首选是头抱菌素类药物(头抱 曲松和头抱克月亏)。而日本在20世纪初也出现全世界的最早出现耐药头抱菌素的淋 球菌H041⑶。随后开始在多个国家蔓延,很多国家逐渐产生了高度耐药的淋球菌,如 2010年法国的F89、2011年西班牙的F89、2013年澳大利亚的A8806、2014年日本 的GU140106、以及2015年日本的FC428和FC460,而在2017年加拿大、澳大利亚、 丹麦也出现了 FC428的传播宀也。国际上,淋球菌对头抱菌素的耐药形势十分严峻。

我国部分地区也出现了淋球菌头抱菌素低敏和耐药的报道,如国内学者陈绍春等 ^在2014年间,进行全国淋球菌的耐药性检测,也发现了耐头抱曲松的菌株,而其 他城市南京、杭州、四川、重庆、海南、长沙、广西、广东、新疆、安徽等多地区都 报道了头范菌素低敏和耐药的淋球菌:13_17]-合肥市虽然没有发现耐头范菌素的淋球 菌,但是发现了头抱菌素的低敏株,说明耐药可能是一种趋势口役但是近十年内山西 地区并没有学者研究淋球菌药物药物敏感性析。所以本文主要研究山西太原地区淋球 菌的药敏情况,探讨山西太原地区淋球菌适用药物状况,初步建立山西太原地区淋球 菌耐药监测,了解山西地区淋球菌的流行状况,为有效的淋病防治提供依据。

为了更好的监测淋球菌对药物的敏感性,淋球菌药物敏感性的监测目前常用的纸 片法、琼脂稀释法、E-test法。纸片法主要适用于临床上对淋球菌的药物敏感性的 评估,琼脂稀释法和E-test法主要是科研实验室分析淋球菌药物敏感性,但E-test 试剂条的成本太高,所以实验室一般选用琼脂稀释法分析淋球菌的药物敏感性。此次 实验也是采用琼脂稀释法对山西太原地区的淋球菌的药敏进行测定。

基因分型是利用生物学检测方法测定个体基因型的一种方法,通过基因分型能很 好地把握淋球菌的不同型别的流行状况和传播。目前常用的淋球菌基因分型有3种: MAST、MLST (多位点序列分型,mult订ocussequence typing)、STAR (抗菌素耐药 性序列分型,Sequence Typing for Antimicrobial Resistance) MLST 基因分型 方法分析7个位点(abcZ、adk> aroE> fumC> gdh、pdhC、pgm )的基因,在数据库 里得到其的等位基因编号,最后获得基因序列型(Sequencetype, ST)。STAR基因 分型方法也是分析 7 个位点(penA、mtrR、porB、ponA、gyrA> parC> 23S rRNA), 然后在数据库里对比获得ST。此两种方法实行起来相对比较复杂,测序的基因比较 多,耗费的时间也比较长。STAR基因分型主要用于监测淋球菌的多重耐药。MLST主 要用于区分淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌和乳糖奈瑟菌,由于MLST是直接检测核昔酸 序列的变异,对于分析某些插入突变的菌株存在局限性。MAST基因分型主要分析两 个基因位点(por. tbpB),所以此方法操作比较简单,节省资源。MAST基因分型可 用于不同地区临床分离株的遗传相关性,可以对某种基因型在世界各地的流行分布情 况进行监控,主要用于多地区淋球菌的流行病学和抗生素耐受的研究,也是目前最常 见监测淋球菌基因分型的方法。国际上普遍采用淋球菌多抗原序列分型分析丽。 NG-MAST (Neisseria gonorrhoeae Multiantigen sequence typing, 淋球菌多抗原 序列分型)基因分型是由Martin等血学者创建的,在基因数据库里每一种淋球菌基 因型别应有对应的分型编号,根据por和tbpB的基因序列,进行淋球菌基因分型,在 分析淋球菌对类似药物敏感性的同时,结合NG-MAST基因分型的序列号,更加利于 读者查询,若是出现类似淋球菌对药物类敏感性时,可以分析淋球菌的敏感性和耐药 情况,把握淋球菌不同基因型别的流行状况,从而指导临床的用药情况,有效的防控 淋病。目前国际上如日本,阿根廷,意大利、波兰、巴西、西班牙常用此方法对当地 淋球菌的情况进行持续的监测[18>2°-24]o国内的部分城市如杭州,广西,合肥,南京, 四川,长沙等也是用MAST分析持续的监测当地的情况而山西地区并没有相 应的的研究探讨山西地区淋球菌MAST基因分型,故本文将探讨山西地区淋球菌-MAST 基因分型。

目前淋球菌耐药形势十分严峻,对耐药基因地检测也是目前研究热点。有学者认 为耐药主要是由与penA基因有关,其编码蛋白的不同,可能是导致淋球菌耐头抱菌 素的主要原因;有学者认为是porBlb的氨基酸序列的改变是导致耐药的主要原因; 也有学者认为mtrR启动子区基因是缺失和氨基酸位点的突变是导致淋球药物敏感性 降低的主要原因,而很多学者认为porBlb的101、102、201、202位的氨基酸的置换 使淋球药物敏感性改变25_28]o然而山西地区淋球菌的药物敏感性,基因分型以及耐药 基因相关性尚无报道。

长期以来,山西地区并没有相应的淋球菌耐药监测和NG-MAST基因分型,面对低 敏和耐药不断上升地淋球菌,进行本地区淋球菌地耐药监测和基因分型是必然趋势。 故本文将对山西太原地区的分离出头抱菌素敏感株、低敏和耐药的淋球菌mtrR和 porBlb基因进行分析,了解本地淋球菌药物敏感性和耐药性的基本情况,分析与淋 球菌药物敏感性相关的基因,以及基因突变对淋球菌药物敏感性的影响。

第一部分山西太原地区淋球菌对药物敏感性检测

1材料与方法

采用美国临床实验室标准化研究所(Clinical Laboratory and Standards Institute, CLSI)推荐的淋球菌敏感性耐药性检查方法M100-S21琼脂稀释法,对 头抱曲松、头抱克月亏、阿奇霉素、环丙沙星、大观霉素、四环素、青霉素等七种药物 进行药敏实验,以CLSI推荐的淋球菌ATCC49226标准菌株作为对照组,以分析山西 太原地区淋球菌临床菌株对药物的敏感性。

1 ■ 1材料

1.1.1主要试剂、仪器及设备

  • 主要试剂及厂家

大观霉素                                   北京泰泽嘉业科技发展有限公司

环丙沙星                                            北京索莱宝试剂公司

青霉素                                             北京索莱宝试剂公司

1.1.2菌株

临床菌株:收集山西太原地区于2017年9月至2018年12月山西医科大学第二 医院皮肤科、泌尿外科、药敏室、山西省疾病预防控制中心的淋球菌临床株一共61 株。其中男性58株,女性3株,并详细记录病人的临床资料。

标准菌株:选择CLSI推荐的ATCC49226,购买自太原正合试剂公司。

1.1.3试剂的制备

(1)巧克力琼脂平板:用电子天平称精密称取34g的巧克力琼脂基础培养基粉于三 角烧瓶中,用1000ml量筒量取900ml的蒸馆水,倒入于三角烧瓶,微波炉加热2min, 用玻璃棒搅拌直到粉末完全溶解,将其于121°C、20min高压灭菌,高压后将烧瓶置 于生物安全柜中,待配置好的培养基温度降至60°C左右,倒入无菌脱纤维羊血100ml, 在90°C的水浴箱里震荡5min,待血从鲜红色完全溶解至颜色变为巧克力色时,取出 待温度降至50°C左右,再加入10皿的增菌剂于培养基里,轻轻震荡混匀后,用灭菌 后的注射器抽取15ml培养基分装到直径0. 90cm的一次性培养皿中。冷却后,取一块 配置好的培养基平板到36°C的5%的C02培养箱里培养24小时,观察有无杂菌生成, 若无杂菌,则培养皿配置成功,将剩余的培养基用封口膜密封后于4°C冰箱里保存, 配置的平板应在1月内用完。

  • 增菌剂的配制:用电子天平称精确称取下列药物: IgL-胱氨酸,0. 03g盐酸 鸟卩票吟,3mg盐酸硫胺,13mg对氨基苯甲酸,0. Olg维生素B12, 0. lg辅竣酶,0. 25g NAD, l.Og腺瞟吟,10gL-谷氨酰胺,100g葡萄糖,0.02g硝酸铁,共11种药物在 将溶于1L的灭菌蒸馆水中,在无菌生物安全柜里用孔径为0. 22um的针头过滤器进行 物理灭菌,每10ml分装于10ml的灭菌离心管中,保存在-80°C冰箱里。
  • 氧化酶试剂配制:用电子天平称精确称取lg的盐酸四甲基对苯二胺,溶于100ml 的无水乙醇中,放在棕色的试剂瓶避光保存,保存于4°C冰箱里。
  • 20%脫脂牛奶的配置:用电子天平称精确称取20g脱脂牛奶,用100ml量筒量取 100ml蒸馆水,在121°C>20min高压,取lml分装于灭菌 5ml的EP管,保存于-80°C 冰箱里。
  • 药敏药物储存液的配制:根据抗生素的纯度,配置药敏板药物的储存液的浓度, 用电子天平称精确称取每一种药物,然后将其溶于在相应的试剂中,用孔径 22um 的针头过滤器物理灭菌后,取400ul试剂分装在0. 6ml的EP管,操作在无菌生物安 全柜里,随后于-80°C保存。青霉素溶液购买至索莱宝试剂公司,浓度为lOOmg/mlo

表1.1.3六种药物工作液浓度的方案

  • 工作液浓度稀释:于-80°C冰箱中取配置好的药物液体,用200ul移液器取200ul 的药物对应的存储液于 OmlEP管中,用200ul移液器移取200ul取配置药物的溶液 于装有储存液的EP管中,用旋涡振荡器震荡混匀,等比例稀释得到对应梯度的工作 液浓度。

头抱曲松工作液的浓度为:200mg/L> 100 mg/L. 50 mg/L> 25 mg/L. 12. 5 mg/L. 6.2 mg/L、3. 1 mg/L、1. 6 mg/L> 0. 8 mg/L、0. 4 mg/L 共 10 个梯度。

头抱克月亏工作液的浓度为:200mg/L. 100 mg/L. 50 mg/L、25 mg/L、12. 5 mg/L、6.2 mg/L、3. 1 mg/L、1. 6 mg/L、0. 8 mg/L、0. 4 mg/L 共 10 个梯度。

阿奇霉素工作液的浓度为:12800 mg/L、6400 mg/L、3200 mg/L、1600 mg/L、800 mg/L、 400 mg/L> 200 mg/L> 100 mg/L> 50 mg/L、25 mg/L、12. 5 mg/L、6. 2 mg/L、3. 1 mg/L、 1. 6 mg/L、0. 8 mg/L 共 15 个梯度。

四环素工作液的浓度为:6400 mg/L. 3200 mg/L、1600 mg/L, 800 mg/L、400 mg/L.

200 mg/L共6个梯度。

大观霉素工作液的浓度为:12800 mg/L、6400 mg/L、3200 mg/L、1600 mg/L、800 mg/L、 400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L 共 8 个梯度。

环丙沙星工作液的浓度为:1600 mg/L、800 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、 50 mg/L、25 mg/L、12. 5 mg/L、6. 2 mg/L、3. 1 mg/L、1. 6 mg/L、0. 8 mg/L 共 12 个梯度。

青霉素工作液的浓度为:1600 mg/L、800 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、 50 mg/L、25 mg/L、12. 5 mg/L 共 8 个梯度。

  • 药敏板的配制:用电子天平称称取36g的GC琼脂粉于三角烧瓶中,量取1000ml 的蒸馆水,并放置于三角烧瓶微波炉加热,不断用玻璃棒搅拌直到粉末完全溶解,将 其于121°C、20min高压灭菌,高压后将烧瓶置于生物安全柜中,待配置好的培养基 温度降至60°C左右,再加入10ml的增菌剂于培养基里,轻轻震荡混匀后,放至生物 安全柜里备用。用对应的溶剂按比例稀释储存液的浓度,在生物安全柜里将每个浓度 工作液用灭菌枪头吸取200ul于 90cm的一次性培养皿中。取20皿配好的培养基液 体和相应工作浓度的药物溶液放于直径0. 90cm的一次性培养皿中,放凉至室温,用 封口膜封包后,于4°C冰箱保存备用。

1 - 2实验方法

1.2. 1淋球菌的取材

男性病人取材前憋尿两小时,再用男性棉拭子进入尿道口 1-2厘米,停留5秒取 后分泌物。女性患者先蘸取无菌盐水的拭子将宫颈口的分泌物擦去,再用无菌拭子插 入宫颈内1厘米处,旋转并停留10s后取出拭子。鉴定为淋球菌后培养,保存在-80°C 冰箱里。并且详见记录淋球菌患者的临床资料。

1.2.2淋球菌的鉴定

1.2.2.1淋球菌涂片:

收集的淋球菌拭子经涂于载玻片上,经酒精灯外焰2〜3次固定,再用革兰染色 后显微镜观察淋球菌的形态,镜下可见红色的菌体呈卵圆形、豆形或双肾形,呈对排 列。

1.2.2.2淋球菌培养:

用四区划线法将收集的拭子标本接种于TM培养板上,于在36°C、5%C02培养箱 里培养48h,观察菌落形态。淋球菌培养后可见凸起、光滑、湿润、浅白或浅灰色半 透明的圆形有黏性的细小菌落。挑取少许菌落,革兰染色法可见典型的红色双肾型细 小菌体,初步鉴定为淋球菌。

1.2.2.3氧化酶试验鉴定:

挑取可疑单个菌落干滤纸条上,加一滴氧化酶试剂(盐酸四甲基对苯二胺),如 果显示深紫蓝色并保持20秒以上,证明该可疑菌落为淋球菌。

1.2.3淋球菌的保存

将培养好的淋球菌用高压灭菌后的拭子洗脱于20%的脱脂牛奶管里,并将菌置于 -80°C冰箱保存。

1.2.4淋球菌的复苏

从-80°C冰箱中取出保存在脱脂牛奶里的淋球菌,置于37°C水浴箱里冻融,用灭 菌的拭子将菌液涂板到于巧克力琼脂平板上,于36°C、5%C02培养箱里培养20-22ho

1.2.5淋球菌的传代

用接种环挑取复苏后菌株,涂至新配置的巧克力琼脂培养基上,于36°C的5%C()2 培养箱里培养20-22ho操作于生物安全柜里完成。

1.2.6菌悬液的制备

挑取传代培养后的菌落,用灭菌拭子将菌落洗脱于装有ImL生理盐水中的比浊 管中,用比浊仪将菌悬液浓度调整为0.6。

1.2.7药敏试验菌接种与结果的判读:

将61株菌和ATCC49226标准株从-80°C冰箱取出,复苏培养,传代培养后,配置 各株菌的菌悬液。用多位点接种仪将配置好的淋球菌的菌悬液,接种在相应浓度梯度 的药敏板上,再接种一份菌在不含有药物的琼脂平板上作为对照。接种后平板置于 36°C、5%C02培养箱里培养24h,后观察结果。在生物安全柜中通风处,观察各株菌 株的生长情况,观察培养皿上有无污染的情况,若接种点内有一个菌落则为生长,接 种点内无任何菌落为无生长;详细记录各种抗生素培养皿淋球菌的生长情况,及对应 淋球菌临床分离株标号的MIC值,MIC值即抗生素能够抑制细菌生长的最小浓度,单 位为mg/L o

1.2.8药敏实验结果:

MIC的判定依据欧洲抗菌药敏感性试验委员会制定的标准

http://www. eucast.org/clinical_breakpoints/。

表1.2.8七种药物药敏截点

1-2.9统计学分析方法:

临床菌株的数据,采用SPSS22. 0软件对数据进行统计学分析。

2结果

  1. 1淋球菌对七种药物的敏感性分析(表2T)

(96. 72%)

表2T: 61株菌的七种药物的敏感性分析

注:头抱曲松CFO、头抱克月亏CFX、阿奇霉素AZM、四环素TET、大观霉素SPE、环丙沙星CIP、 青霉素PEN

2.2淋球菌临床资料的分析:

淋球菌临床资料的分析:一共收集淋球菌61株,其中男性58株,平均年龄33. 16 ±12. 57岁,其中最高61岁,最低17岁;女性3株,平均年龄26. 33 + 8. 74岁,其 中8人就诊前服用过抗生素占13. U%o

2.3淋球菌对药物耐药性分析:

淋球菌对头抱曲松和头抱克月亏药物没有出现耐药的菌株,而阿奇霉素、四环素, 大观霉素,环丙沙星,青霉素的耐药率分别为4.92%、34. 43%, 9. 8%, 100%, 100%, 其中 TPNG 为 22. 95%O

2.4淋球菌对药物低敏性分析:

61株的淋球菌对各种药物的低敏性如下:头抱曲松为3. 28%,头抱克月亏为14. 75%, 阿奇霉素为21.31%,四环素为57. 38%,大观霉素为18.03%。

3讨论

淋病是由淋球菌感染引起的一种常见的性传播疾病,目前治疗主要是头抱菌素。 但是有很多国家已经报道了对头抱菌素类耐药的淋球菌,从1995日本报道了头抱克 月亏耐药的案例,1996年后头抱克月亏耐药和低敏的比例显著的增加⑴】。美国在 2006-2014年间淋球菌对头抱克月亏的耐药率从0.1%上升到1.4%[29】。阿根廷Gianecini 等[20]学者研究2011-2016年间的收集的3478例菌株,其中头抱曲松低敏和耐药的菌 株共为158,占4. 54%o淋球菌对头抱菌素的耐药率在全世界都呈一个显著的上升趋 势。而我国Chen等问 学者在2012-2013年间研究全国多地区1257株淋球菌药物敏 感性时,也发现了对头抱曲松耐药的菌株,广东为4.1%(9/221),r西为0.6%( 1/156), 海南为 13.0% (32/258),重庆为 1.3% (1/76),四川为 6.9% (11/159),新疆为 4.5% (1/23) o而Ting等[闵学者在研究长沙地区2015-2016年间的淋球菌,发现对头 范曲松低敏和耐药的菌株为口% (14/128) Jiang等问 研究人员也在合肥2014-2015 年间的淋球菌时,发现了 □』% (14/126)的头抱菌素低敏菌株。可见头范曲松低敏 和耐药的菌株在中国也开始存在多地区出现的现象。

本实验探讨2017年至2018年间山西太原地区淋球菌药物敏感性。通过此次实验 的分析,青霉素、大观霉素、环丙沙星、四环素、阿奇霉素耐药率分别为100%. 9.84%、 100%、34.43%、4.92%,但头范曲松、头抱克月亏目前尚没出现耐药的菌株,可见山西 太原地区淋球菌的对头抱菌素类的药物敏感性仍然乐观。而学者Jiang等问 在研究合 肥2014-2015年间合肥地区126株淋球菌药敏性时发现,所有的菌株都对环丙沙星耐 药,四环素耐药率为81.7% (103/126),青霉素耐药率73.8% (93/126),阿奇霉素

耐药率为28.6% (36/126),而高度四环素耐药率为31.7% (40/126),没有出现头抱曲松 耐药的菌株,但是有发现□』% (14/126)的头抱菌素低敏菌株。可能由于各个地区 的用药方案的差异,导致不同地区的淋球菌对同一药物的敏感性呈现差异。而青霉素、 大观霉素、环丙沙星、四环素耐药率太高,它们已不适合山西太原地区的淋球菌的使 用,可能也不适合中国的其它地方的淋病的治疗。

山西地区淋球菌对头抱菌素药物敏感性较高,故用头抱菌素类抗生素仍是治疗山 西地区淋病的首选。而在Chen等网学者2007-2012年研究的淋球菌的敏感性,278 株菌种全部对环丙沙星耐药,而高度四环素耐15(MIC>16 mg/L)为34.9%,头抱曲松耐 药率为5.4%,南京地区头抱曲松的耐药率比较高,为此推荐当地的淋球菌治疗方案 改为500mg头抱曲松肌注加上阿奇霉素口服。在山西地区出现9.84%的淋球菌 对大观霉素耐药,而南京地区的所有的菌株对大观霉素都敏感,显然山西地区淋球菌 对大观霉素的敏感性与南京地区的仍然不同,可能是与不同地区出现的用药差异不同 有关。但是山西地区全部菌株出现环丙沙星的耐药与合肥和南京都类似,耐药率高达 100%o在日本从2000年到2015年间收集了 2471株淋球菌分析其药敏性,显示青霉 素,四环素,左氧氟沙星,头抱克月亏和阿奇霉素的高度不敏感性,为了防止头抱曲松 耐药的淋球菌高度扩散,建议将头抱菌素治疗淋球菌的剂量升高网。目前山西地区的 淋球菌对头抱菌素的耐药现象比较乐观,所以头抱菌素类药物仍在可以作为淋球菌的 一线用药。

4结论

四环素、大观霉素、环丙沙星、青霉素已不再适合山西地区淋球菌治疗。头抱曲松、 头抱克月亏和阿奇霉素仍适合山西太原地区淋球菌的治疗。

第二部分 淋球菌菌株的NG-MAST基因分型、por和tbpb等位基

因关系的研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1主要仪器设备型号及生产厂家:

MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit                                  TaKaRa 工程大连有限公司

1.1.3主要试剂的配制以及菌株来源:

  • 10 x TBE Buffer试剂的配制:用电子天平精密称取108g的Tris, 55g硼酸, Na2. 2H20,溶于1000ml双蒸水中,在置于高压锅里121°C、20min高压灭菌, 取出室温放置备用。
  • 1 x TBE Buffer 试剂的配制:用 100ml 量筒量取 100ml 的 10 x TBE Buffer 试 剂于1000ml锥形瓶内,再用1000ml量筒量取900ml灭菌蒸憾水于锥形瓶内,混匀, 后置于高压锅里121°C、20min高压灭菌,取出室温放置备用。
  • 2%琼脂糖凝胶的配置:若是30ml的板,用电子天平精密称取6g琼脂糖于锥 形瓶内,然后量取1 x TBE Buffet试剂30ml于锥形瓶内,用微波炉加热60s,取出 放凉,待冷却到室温,在生物安全柜的通风处加入2ul的EB溶液,轻微振荡混匀, 将凝胶液倒在板上,待冷却凝固后备用。若是20ml则取0. 4g琼脂糖和20ml的1 x TBE Buffer试剂于锥形瓶内,用微波炉加热30s,取出放凉,待冷却到室温在生物安全柜 的通风处加入lul的EB溶液,轻微振荡混匀,将凝胶液倒在板上,待冷却凝固后备 用。
  • 菌株来源:第一部分收集临床的淋球菌61株。

1 ■ 2实验方法

1.2. 1 DNA的提取:

从-80°C冰箱里取保存淋球菌于生物安全柜里复苏,在36°C、C02培养箱里培养 24小时,用灭菌拭子将培养的淋球菌洗脱至2nd灭菌生理盐水中,用分光光度计测 菌悬液浓度0D600二1,放置于生物安全柜中。DNA的提取方法参考小型细菌基因组DNA 提取试剂盒的提取DNA说明书。提取后的DNA,按淋球菌编号标记,保存于-20°C冰 箱。

  • PCR反应体系:

pot基因和tbpB基因扩增:por基因扩增的引物,正

向:5' -CAAGAAGACCTCGGCAA-3',反向:5, -CCGACAACCACTTGGT -3',扩增片段长度为

650bp;扩增 tbpB 基因的引物,正向:5'-CGTTGTCGGCAGCGCGAAAAC-3',反

向:5' -TTCATCGGTGCGCTCGCCTTG-3',扩增片段长度为 550 bp。反应体系 50ul: Mix

25ul ,正、反引物各3ul, DNA4ul,灭菌蒸憾水17 ul, por基因PCR反应条件:95°C 的条件下预变性4min,变性、退火、延伸共35个循环分别是95°C (30s)、58°C (30s)、 72°C (1 min),在72 °C的条件下延伸lOmin,并于4 °C条件下保存至少20min, tbpB 基因PCR反应条件:95°C的条件下预变性4min,变性、退火、延伸共35个循环分别 是 95°C (30s)、69°C (30s)、72°C (1 min),在 72 °C的条件下延伸 lOmin,并 于4 °C条件下保存至少20min[19]o

  • PCR扩增产物的检测:

取PCR产物越3ul,放在2%的琼脂糖凝胶胶孔中电泳,电泳液为1 x TBE溶液, 收集反应结束后的琼脂糖凝胶结果,采用GeldocXR+凝胶成像系统,并照相,分析并 保存图片,并记录实验结果。

1.2.4基因测序:

取扩增产物20ul,上下引物各20ul,送往华大基因测序公司,委托测序。

1.2.5 por、tbpB 以及 NG-MAST 序列:

将扩增的por和tbpB基因片段在淋球菌NG-MAST的官网 (http://www. ng-mast. net/)里进行对比,得到por和tbpB对应的等位基因号,通 过pot和tbpB的等位基因号在NG-MAST的官网里比对得到NG-MAST对应的基因序列。 1 ■ 2. 6基因分析:

用bioedit软件查看峰图,采用megaX软件对淋球菌por和tbpb基因序列图进 行进化树分析,用megaX中的Bootstrap法对进化树的可靠性进行检验。

M 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 Y

2-2 61株菌tbpB (550bp)凝胶电泳图

注:第一条泳道为maker (M),最后一空为阴性对照(Y),序号依次为-61

2.2 tbpB、por等位基因以及NG-MAST基因分型分布图(表2.2):

tbpE等位基因(个数)      pcxr等位基因(个数)        对应的NG-MAST基因分型(个数)

  1. 3 por的等位基因分布情况:

61株淋球菌经测序分析,por-共得到44种等位基因。其中porll32, por2001, por6993, por581 分别有 3 株,por90, por206, por833, por2754, por 2978, por3099, por5924, por7586, por7910,各有 2 株。而 porll32, por2001, por6993, por581 是山西地区pot的优势基因型。pot等位基因进化树分布图(图2. 7. 1):可见por 进化树大致可以分为2组,一组为有4株菌3个等位基因序列(por 5692, porll23, por90)组成,另一组由41个等位基因组成共57株菌。

  • tbpB的等位基因分布情况:

tbpB 一共得到26种等位基因数,其中tbpB4的基因型共有10株,tbpB186的基 因型共有8株,tbpB1058的基因型共有7株,tbpB566基因型共有6株,tbpB29的 基因型有 3 株,tbpB447, tbpB 543, tbpB907, tbpB75, tbpBUO, tbpB 156 的基因 型各有2株,其余tbpB基因型各占1株。相对而言基因型tbpB4, tbpB186, tbpB1058, tbpB566是山西地区的优势菌型。tbpB等位基因进化树分布图(图2. 7.2):可见tbpB 进化树大致分为两组,其中一组为7个tbpB等位基因型共25株菌,另一组为36株 菌共19个等位基因型别。

  • NG-MAST基因分型情况:

一共有49种基因型别,其中新的基因型别有21种一共22株,NG-MAST3305和 NG-MAST2083 各有 3 株,NG-MAST4007, NG-MAST4022, NG-MAST10091, NG-MAST12479, NG-MAST 5061, NG-MAST13051, NG-MAST14781, new9 各有两株,其余基因型各有一 株,但通过NG-MAST基因分型共发现21种新的基因型。

  1. 6 Bootstrap法检验进化树的可靠性

进化树大部分的Bootstrap值大于50,说明进化树的可靠性较好。

  1. 7 por和tbpB等位基因进化树图(图2.7. 1,图2. 7. 2 ):

3讨论

淋病是全世界主要的性传播疾病。目前,由于国际上淋球菌对头抱菌素的耐药率 较高,且互相传播速度比较快,为了更好的监测淋球菌的药物敏感性等情况,Martin 等问学者建立的淋球菌多抗原序列分型即NG-MAST基因分型。NG-MAST基因分型可 十分有效把握淋病的传播和监测流行趋势,NG-MAST是目前最常用于检测淋球菌基 因分型的方法。目前已经建立数据库的淋球菌基因分型共有3种:MLST、STAR、MAST。 MLST 主要分析七个基因位点(abcZ、adk> aroE. fumC、gdh、pdhC、pgm ),主要 用于区分淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌和乳糖奈瑟菌,由于MLST是直接检测核昔酸序 列的变异,对于分析某些插入突变的菌株存在局限性。STAR基因分型也主要分析七 个基因位点(penA、mtrR> porB> ponA、gyrA> parC> 23S rRNA),用于监测淋球菌 的多重耐药。而MAST基因分型主要分析两个基因位点(por、tbpB),其操作简单, 节省资源。MAST基因分型可用于不同地区临床分离株的遗传相关性,可以对某种基 因型在世界各地的流行分布情况进行监控,主要用于多地区淋球菌的流行病学和抗生 素耐受的研究,也是目前最常见监测淋球菌基因分型的方法。目前国内大部分地区都 用NG-MAST方法监测淋球菌的耐药趋势[13'16]o如Chen等阴学者在监测全国淋球菌的 流行趋势时选用了淋球菌的NG-MAST基因分型,通过对全国各地共1257株淋球菌进 行药敏和NG-MAST基因分型从而了解耐药株和淋球菌NG-MAST基因分型的关系,了解 某些菌型的淋球菌的药敏情况如何,从而监测淋球菌的耐药。本研究是首次对山西地 区淋球菌进行基因分型。

本研究61株淋球菌por的基因分析,一共得到44种por等位基因序列。其中 porll32, por2001, por6993, por581是山西地区pot的优势基因型。por等位基因 进化树分布图:可见por进化树可以分为2组,一组为有4株菌3个等位基因序列(por 5692, porll23, por90)组成,此组的Bootstrap值全都大于50,说明此组3个等 位基因型的同源性高,第二组57株菌共有41个基因型,其中流行菌型porll32、 por2001, . por6993、por581都在此组,说明此组的优势菌群比例很高。遵义地区在 2013年间分析当地淋球菌多抗原序列分型时发现当地的优势菌型为porll35, porll32, por90[3i]但长沙地区优势菌型为 por3466, por2978、por4197 和 por90[32]o 而在太原地区优势菌株有porll32,这与遵义地区的pot优势等位基因类似⑼。在长 沙和遵义地区por90都是优势基因型,而在山西por90也占有较高比例,可能由于 菌数的受限,所以po<90未能成为山西地区的por优势基因型,但它可能是一个潜在 的流行菌型,这同时也说明各个地方的流行菌型有不一样的,但是也有相同的。

从tbpB等位基因的进化树可以将其分为两组,第一组有7种基因型共25株菌, 其中优势菌型tbpB4、tbpB1058都在此组中,说明此组的优势菌型比例较高。且此组 的Bootstrap值全都大于50,说明此组7个等位基因型的同源性高,它们可能来自 于同一个起源。第二组有36株菌共有19种基因型,而山西地区tbpB的优势基因型 tbpB186和tbpB566都在第二组中。而分析遵义地区的tbpB基因分型时发现tbpB33, tbpB4, tbpB21为当地的优势基因型a o tbpB4在山西和遵义都是流行菌型,它也可 能是全国流行的菌型。

NG-MAST基因分型常用于淋球菌的耐药监测,但此次进行NG-MAST基因分型也是 为了监测山西地区淋球菌基因分型的情况。本研究共收集病例61例,没有发现头抱 菌素耐药的菌株,其中头范菌素低敏有9例,其NG-MAST序列号分别为ST12778. ST225、ST2318、ST17251. ST2841. ST13738. ST15153、ST205K ST10209。山西地 区的淋球菌对头抱菌素的药物敏感性仍然可观,头抱菌素低敏株的菌型没有成为山西 地区的流行菌型。本研究发现山西地区流行菌株型是ST3305和ST2083,这与其他省 份的情况有显著的差异,在长沙是ST506K ST9176、STnewl (por3466, tbpB1058), 浙江是ST4846,广东是ST1866和ST1766,广西是ST10380,天津是ST10290,重庆 是ST11119,四川是ST5062,地区的不同呈现的流行菌型也同样存在差异號旧。而国 外Cobo等丽学者对南部西班牙的134株菌进行多抗原序列分型,发现72个不同的菌 型其中最常见的是ST1407, ST 1495& ST7192, ST13251和ST5405。而波兰学者洌在分 析了 2010-2012年培养的淋球菌显示在2010年间最常见的ST是ST5421 (17.9%), ST1405 (17.9%)和ST225 (14.3%) ; 2011年间最流行的基因型是耐头抱菌素的 ST1407 (13.0%) , ST2992 (13.0%)和 ST8379 (8.7%);在 2012 年间,近一半 的分离株耐头抱菌素的菌株为ST1407 (44.3%),可见菌型ST1407很快占据了波兰 地区耐头抱菌素淋球菌的主导地位。同样,在2009到2010年间,欧洲最常见的STs 为 ST1407 (15.6%) , ST2992 (7. 1%) , ST225 (4. 7%)在多个个国家(如法国, 挪威,西班牙,阿根廷,日本、中国等)都有报道ST1407 (por908, tbpBllO)菌型, 该菌型也是头抱菌素类低敏和耐药的流行株^'咏3,33两。ST1407在欧洲国家的基因分 型占着重要的地位,斯洛文尼亚,西班牙,瑞士,英国,还有加拿大和美国主导的优 势菌型为ST2992,而在2013年,欧洲最常见的多抗原序列分型的基因型略微有所变 化,但ST1407 (7.6%)仍然是最主要的分型,其余为ST2992 (6.7%) , ST2400泗。 可见不同地区的基因分型也是有相似性和不同性。这可能与当地的淋球菌药物敏感性 相关,如用药习惯和当地人群的对不同药物的耐受性的不同,导致的基因的分型也不 一样,故建立山西地区的基因分型监测淋球菌药物敏感性十分必要。国内学者Chen 等^学者在研究全国基因分型时也发现了 ST1407型别菌株,此型菌株显示出高度耐 药。ST1407是por908和tbpBll0两种基因型组成,目前山西地区只出现了 tbpBllO, 尚没有发现por908基因型,在山西地区并没发现ST1407菌型,也可能与临床标本量 较少有关,或本地区目前尚无淋球菌对头抱菌素类药物耐药株,因此,应建立长期的 淋球菌基因分型和药物敏感性的监测。

多抗原基因分型在国外比较常见,而国内部分地区也逐渐建立起监测点,这也是 山西地区首次同时监测淋球菌基因分型和药物敏感性。针对淋球菌的基因分型提供的 信息可以指导淋球菌的临床用药情况。总之,多抗原基因分型可以持续的监测山西地 区淋球菌的流行趋势。及时了解和把控本地区的淋球菌的流行分布状况,有助于更有 效地进行淋病的防治。

3讨论

porB ( porin B ,孔蛋白B)主要编码两种蛋白porBla和porBlb两种蛋白,淋 球菌只表达一种,普遍认为淋球菌对头抱菌素低敏主要是由于porB基因的改变导致 porBlb蛋白的变化所致。porBlb是主要作用于淋球菌外膜蛋白物质转运,此氨基酸 序列的改变导致外膜蛋白结构改变从而产生淋球菌对头抱菌素的耐药。目前部分研究 都报道了头抱菌素低敏株中发现了 porBlb基因的改变,最常见的改变就是在101、 102、201、202位氨基酸的序列的置换,淋球菌对头抱菌素药物敏感性降低从而产生 低敏和耐药,可能是由于此位置的porBlb蛋白改变⑵冏。本实验主要通过琼脂稀释 法和porBlb基因的扩整测序,探讨porBlb蛋白和淋球菌药物敏感的关系。但是此次 研究只发现了 G120K, A121D> A121G,此3种突变可能主要作用于淋球菌对头抱菌 素敏感性降低,这与学者Thakur的研究结果类似阪旳。

在研究的9株低敏株的porBlb ( porin B )氨基酸序列中第18, 143, 120, 258, 121, 215, 257, 259的氨基酸序列9株菌都有氨基酸的置换,在氨基酸序列第213, 297位有8株菌有氨基酸的置换,其中17,21,57,61此4株淋球菌同时出现了 V242A 和 A256To 而敏感株中同时也出现 M18T、D41K、Q143K、T215V、S217G、P219S、 M257G、S258R、G259A、V279L的氨基酸置换。17和21号菌株同时出现D41K、Q188R、 T215F、V242A、A256T、T292S、H298Y突变,但A26T的突变它们中只有1株菌有此 突变,而它们的药物敏感性略有不同,说明此位点的突变很可能是导致两者基因突变 的关键突变点,其结果有待进一步验证。在第18、41、143> 215、217、219、257、 258、259、279的位点既有低敏株的突变也有敏感株的突变,可见这些位点的突变的 序列可能不是导致药物敏感变化的主要原因,也可能是某些位点的共同作用不是导致 突变的主要原因。从氨基酸对比序列图上可看到无论是低敏还是敏感株中的氨基酸序 列212-219, 256-259此两处氨基酸置换的频率较高,该区可能与淋球菌的耐药和低 敏有着密不可分的联系。

mtrR( multiple transfer resistance repressor,多重耐药阻遏蛋白)主要抑制 MtrCDE 外排泵的合成,使淋球菌菌内物质的排出减少,从而可以保持维持菌体平衡。其启动 子区和编码区序列的突变使MtrCDE外排泵的过表达,使淋球菌菌内药物外排增加, 使其对多种药物敏感性降低。既往研究表明mtrR启动子处基因突变、mtrR氨基酸的 改变都与头抱菌素耐药有着密不可分的联系⑵屈。很多文献都报道了头抱菌素低敏 株的淋球菌都有启动子区的33处A的缺失,本研究发现山西地区的淋球菌低敏株的 mtrR基因的启动区也出现了 33位A的缺失。学者Serra-Pladevall[21]也认为头抱菌素 低敏株与mtrR氨基酸序列的改变有关主要是A39T、G45D、H105Y氨基酸的置换。在 第105位氨基酸序列有DNA二聚化结构域,此位点的突变可能导致淋球菌对药物的 外排增加⑵。此次研究中低敏株中部分的菌株也出现了此三种氨基酸的突变,有5 株菌出现A39T的置换,7株出现G45D的置换,有6株出现H105Y的置换。此次研 究的mtrR基因的氨基酸序列的敏感株中只有163V置换为T,无其它的置换,说明低 敏株A39T、G45D、H105Y置换与头抱菌素敏感性降低可能没有关系。还有Lee等旳 学者在低敏株中发现了 L47P的突变,而此次研究却没有发现。可见此研究结果与学 者Serra-Pladevall[21]研究结果相似。但因目前标本量较少,是否存在其他突变,目前 尚不能肯定。

此次研究主要是探讨porBlb和mtrR耐药基因与淋球菌头范菌素类药物敏感性的 关系,探究了 mtrR基因A39T、G45D、H105Y氨基酸的置换可能与淋球菌对药物敏感 性降低可能没有关系,但与启动子区第33位A的缺失可能与淋球菌对药物敏感性降 低有关,但D79N, T86A此两处氨基酸的置换与药物敏感新的联系并没有证实相关的 可能性,目前也没有其他文献报道此两处突变与药物敏感性的联系,以后研究可以扩 充敏感株样本量,探索敏感株是否出现此两处氨基酸的置换。而porBlb基因主要与 G120K、A121D> A121G> V242A、A256T的氨基酸突变有关,但在以往文献值报道了 G120K. A121D. A121G,目前没有另三者突变的相关文献报道,此次研究也没有发 现101、102位氨基酸的突变,所以应持续监测耐药位点的变化,便于发现耐药潜在 的突变位点,从而了解淋球菌的药物敏感性和基因之间的关系。总之,淋球菌头范菌 素耐药和低敏是一种大的趋势,探索其耐药低敏和耐药基因的联系也是为更好的了解 耐药原理,以便更好的指导临床用药情况。

4结论

1、 mtrR启动子区第33位A的缺失与淋球菌药物敏感性降低可能有关,而A39T、G45D 以及H105Y氨基酸的置换与淋球菌药物敏感性降低可能没有关系。

2、 porBlb第120、121位点氨基酸序列突变可能影响淋球菌对头范菌素的药物敏感 性。

参考文献

  • Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, LowN, Stevens G, Gottlieb S, Kiarie J, Temmerman M, Global Estimates of the Prevalence and Incidence of Four Curable Sexually Transmitted Infections in 2012 Based on Systematic Review and Global Reporting[J]. PLoS One, 2015, 10(12):
  • Unemo M, Shafer WM, Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae in the 21st century: past, evolution, and future [J]. Clin Microbiol Rev, 2014, 27(3): 587-613.
  • Deguchi T, Yasuda M, Yokoi S, Ishida K, Ito M, Ishihara S, Minamidate K, Harada Y, Tei K, Kojima K, Tamaki M, Maeda S, Treatment of uncomplicated gonococcal urethritis by double-dosing of 200 mg cefixime at a 6-h interval [J]. J Infect Chemother, 2003, 9(1): 35-39.
  • Ohnishi M, Golparian D, Shimuta K, SaikaT, Hoshina S, Iwasaku K, Nakayama S , Kitawaki J, Unemo M, Is Neisseria gonorrhoeae Initiating a Future Era of Untreatable Gonorrhea?: Detailed Characterization of the First Strain with High-Level Resistance to Ceftriaxone [J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
  • 55(7): 3538-3545.
  • Unemo M, Golparian D, Nicholas R, Ohnishi M, Gallay A, Sednaoui P, High-level cefixime- and ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae in France: novel penA mosaic allele in a successful international clone causes treatment failure [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(3): 1273-1280.
  • Camara J, Serra J, Ayats J, Bastida T, Carnicer-Pont D, Andreu A, Ardanuy C, Molecular characterization of two high-level ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates detected in Catalonia, Spain[J]. J Antimicrob Chemother,
  • 67(8): 1858-1860.
  • Lahra MM, Ryder N, Whiley DM, A new multidrug-resistant strain of Neisseria gonorrhoeae in Australia[J]. N Engl J Med, 2014, 371(19): 1850-1851.
  • Deguchi T, Yasuda M, Hatazaki K, Kameyama K, Horie K, Kato T, Mizutani K, Seike K, Tsuchiya T, Yokoi S, Nakano M, Yoh M, New Clinical Strain of Neisseria gonorrhoeae with Decreased Susceptibility to Ceftriaxone, Japan]J]. Emerging Infectious Diseases, 2016, 22(1): 142-144.
  • Nakayama S, Shimuta K, Furubayashi K, Kawahata T, Unemo M, Ohnishi M, New Ceftriaxone- and Multidrug-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain with a Novel Mosaic penA Gene Isolated in Japan]J]. Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(7): 4339-4341.
  • Lefebvre B, Martin I, Demczuk W, Deshaies L, Michaud S, Labbe AC, Beaudoin MC , Longtin J, Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae, Canada, 2017[J]. Emerg Infect Dis, 2018, 24(2).
  • Terkelsen D, Tolstrup J, Johnsen CH, Lund O, Larsen HK, Worning P, Unemo M, Westh H, Multidrug-resistant Neisseria gonorrhoeae infection with ceftriaxone resistance and intermediate resistance to azithromycin, Denmark, 2017[J]. Euro Surveill, 2017, 22(42).
  • Lahra MM, Martin I, Demczuk W, JennisonAV, Lee KI, Nakayama SI, Lefebvre B, Longtin J, Ward A, Mulvey MR, Wi T, Ohnishi M, Whiley D, Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain[J]. Emerg Infect Dis, 2018, 24(4).
  • Chen SC, Yin YP, Dai XQ, Unemo M, Chen XS, First nationwide study regarding ceftriaxone resistance and molecular epidemiology of Neisseria gonorrhoeae in China[J]. J Antimicrob Chemother, 2016, 71(1): 92-99.
  • Chen SC, Yin YP, Dai XQ, Unemo M, Chen XS, Antimicrobial resistance, genetic resistance determinants for ceftriaxone and molecular epidemiology of Neisseria gonorrhoeae isolates in Nanjing, China[J]. J Antimicrob Chemother, 2014, 69(11): 2959-2965.
  • Jiang FX , Lan Q , Le WJ , Su XH, Antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae isolates from Hefei (2014-2015): genetic characteristics of antimicrobial resistance[J]. BMC Infect Dis, 2017, 17(1):
  • Peng T, Lin H, Liu Q, Cao W, Ding H, Chen J, Tang L, Ceftriaxone susceptibility and molecular characteristics of Neisseria gonorrhoeae isolates in Changsha,

China[J]. J Infect Chemother, 2017, 23(6): 385-389.

  • YanJ, Xue J, ChenY, Chen S, Wang Q, Zhang C, WuS, Lv H, YuY, van der Veen S, Increasing prevalence of Neisseria gonorrhoeae with decreased susceptibility to ceftriaxone and resistance to azithromycin in Hangzhou, China (2015-17)[J]. J Antimicrob Chemother, 2019, 74(1): 29-37.
  • Cobo F, Cabezas-Fernandez MT, Avivar C, Typing and antimicrobial susceptibility of 134 Neisseria gonorrhoeae strains from Southern Spain[J]. Rev Esp Quimioter, 2019.
  • Martin IM, Ison CA, Aanensen DM, Fenton KA, Spratt BG, Rapid sequence-based identification of gonococcal transmission clusters in a large metropolitan area[J]. J Infect Dis, 2004, 189(8): 1497-1505.
  • Gianecini RA, Golparian D, Zittermann S, Litvik A, Gonzalez S, Oviedo C, Melano RG, Unemo M, Galarza P, Genome-based epidemiology and antimicrobial resistance determinants of Neisseria gonorrhoeae isolates with decreased susceptibility and resistance to extended-spectrum cephalosporins in Argentina in 2011-16[J]. J Antimicrob Chemother, 2019.
  • Serra-Pladevall J, Barbera MJ, Rodriguez S, Bartolome-Comas R, Roig G, Juve R, Andreu A, Neisseria gonorrhoeae antimicrobial susceptibility in Barcelona: penA, ponA, mtrR, and porB mutations and NG-MAST sequence types associated with decreased susceptibility to cephalosporins[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2016, 35(9): 1549-1556.
  • Carannante A, Vacca P, Ghisetti V, Latino MA, Cusini M, Matteelli A, Vocale C, Prignano G, Leli C, Ober P, Antonetti R, Poletti F, Stefenelli P, Genetic Resistance Determinants for Cefixime and Molecular Analysis of Gonococci Isolated in Italy [J]. Microb Drug Resist, 2017, 23(2): 247-252.
  • ShimutaK, Watanabe Y, Nakayama S, Morita-Ishihara T, Kuroki T, Unemo M, Ohnishi M? Emergence and evolution of internationally disseminated cephalosporin-resistant Neisseria gonorrhoeae clones from 1995 to 2005 in Japan[J]. BMC Infect Dis, 2015, 15:
  • Mlynarczyk-Bonikowska B, Malejczyk M, Majewski S, Unemo M, Antibiotic resistance and NG-MAST sequence types of Neisseria gonorrhoeae isolates in Poland compared to the world[J]. Postepy Dermatol Alergol, 2018, 35(6): 346-551.
  • Thakur SD, Starnino S, Horsman GB, Levett PN, Dillon JR, Unique combined penA/mtrR/porB mutations and NG-MAST strain types associated with ceftriaxone and cefixime MIC increases in a Susceptible1 Neisseria gonorrhoeae population [J]. J Antimicrob Chemother, 2014, 69(6): 1510-1516.
  • Thakur SD , Levett PN , Horsman GB , Dillon JR, Association of Neisseria gonorrhoeae genogroups and specific PBP2/MtrR/PorB mutation patterns with susceptibility to penicillin in a susceptible gonococcal population [J]. J Antimicrob Chemother, 2018, 73(10): 2682-2686.
  • Lee SG, Lee H, Jeong SH, Yong D, Chung GT, Lee YS, Chong Y, Lee K, Various penA mutations together with mtrR, porB and ponA mutations in Neisseria gonorrhoeae isolates with reduced susceptibility to cefixime or ceftriaxone [J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2010, 65(4): 669-675.
  • Zhao L , Liu A, Li R, Zhao S, Trends in antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae and molecular characteristics of N. gonorrhoeae with decreased susceptibility to ceftriaxone in Shandong, China, 2007 to 2014[J]. Int J Antimicrob Agents, 2018, 51(1): 52-56.
  • Kirkcaldy RD, Hook EW, 3rd, Soge OO, del Rio C, Kubin G, Zenilman JM, Papp JR, Trends in Neisseria gonorrhoeae Susceptibility to Cephalosporins in the United States, 2006-2014[J]. Jama, 2015, 314(17): 1869-1871.
  • Yasuda M, Hatazaki K, Ito S, Kitanohara M, Yoh M, Kojima M, Narita H, Kido A , Miyata K , Deguch T, Antimicrobial Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae in Japan from 2000 to 2015[J]. Sex Transm Dis, 2017, 44(3): 149-153.
  • 黄美容,黄健,闵迅,杨昌伟,张绍基,颜利江,淋球菌por,tbpB基因序列变 异和系统进化探讨[J].中国皮肤性病学杂志,2015, 29(12): 1221-1223+1247.
  • Peng T, Hui L, Liu Q, Wei C, Hui D, Chen J, Tang L, Ceftriaxone susceptibility and molecular characteristics of Neisseria gonorrhoeae isolates in Changsha,

China[J]. Journal of Infection & Chemotherapy, 2017, 23(6): 385-389.

  • Gianecini R, Romero MLM, Oviedo C, Vacchino M, Galarza P, Emergence and Spread of Neisseria gonorrhoeae Isolates With Decreased Susceptibility to Extended-Spectrum Cephalosporins in Argentina, 2009 to 2013[J]. Sex Transm Dis, 2017, 44(6): 351-355.
  • Unemo M, Golparian D, Syversen G, Vestrheim DF, Moi H, Two cases of verified clinical failures using internationally recommended first-line cefixime for gonorrhoea treatment, Norway, 2010[J]. Euro Surveill, 2010, 15(47).
  • Chisholm SA, Unemo M, Quaye N, Johansson E, Cole MJ, Ison CA, Van de Laar MJ, Molecular epidemiological typing within the European Gonococcal Antimicrobial Resistance Surveillance Programme reveals predominance of a multidrug-resistant clone [J]. Euro Surveill, 2013, 18(3).
  • Ilina EN, Vereshchagin VA, Borovskaya AD, Malakhova MV, Sidorenko SV, Al-Khafaji NC, Kubanova AA, Govorun VM, Relation between genetic markers of drug resistance and susceptibility profile of clinical Neisseria gonorrhoeae strains [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(6): 2175-2182.
  • Liao M, Bell K, Gu WM, YangY, Eng NF, Fu W, WuL, Zhang CG, Chen Y, Jolly AM, Dillon JA, Clusters of circulating Neisseria gonorrhoeae strains and association with antimicrobial resistance in Shanghai [J]. J Antimicrob Chemother, 2008, 61(3): 478-487.

综述

淋球菌对头鞄菌素低敏耐药现状及机制研究进展

摘要:淋球菌(即淋病奈瑟菌)极易产生耐药,头抱菌素是治疗淋病的首选。近几年 国内外相继出现对第3代头抱菌素类药物耐药和低敏的淋球菌,因此淋球菌耐药机制 的研究显得格外重要。目前研究显示淋球菌耐药的机制主要集中在以下3个方面:一 是抗生素作用的位点的改变,如青霉素结合蛋白的改变,影响抗生素和淋球菌的结合; 二是细菌的膜外孔蛋白的改变,影响药物的内流;三是外排系统的改变,使药物的外 排作用增强,从而药物产生耐药。研究和探讨淋球菌耐药机制对淋病的防治有着极为 重要的意义。

关键词:淋病奈瑟菌;头抱菌素抗药性;头抱菌素类

淋病是由淋球菌(即淋病奈瑟菌)感染引起的一种常见的性传播疾病,2008年WHO 数据显示,每年全球有106百万人感染淋球菌⑴。长期慢性反复的泌尿生殖道淋球菌 感染,可引起盆腔炎、异位妊娠、男女不孕不育、早期流产等并发症。同时,泌尿生 殖道淋球菌感染使得人类免疫缺陷病毒(HIV)传播风险增加5倍⑵。目前,国际上 淋病的治疗主要首选第3代头抱菌素类药物,但是,随着对头抱菌素的敏感性下降和 高度耐药菌株的不断出现,使淋病的治疗面临极大挑战。本文主要就国内外淋球菌对 头抱菌素的耐药及敏感性降低现状和机制进行综述。

一、淋球菌对头抱菌素的耐药和敏感性降低的现状

淋球菌具有超凡的抗生素耐药进化能力,随着淋球菌出现对青霉素、四环素、卩奎 诺酮类药物的普遍耐药,第3代头抱类菌素类药物头抱曲松成为治疗淋病的一线药 物。自从2003年日本Deguchi等⑶首次报道头抱克月亏治疗男性尿道淋病失败的8例 病例,其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC) >0.125mg/L,其他 国家(澳大利亚、英国、法国、加拿大、南非、西班牙)也相继报道了第3代头范菌 素类耐药现象⑷迥。且随着淋球菌耐药水平不断上升,多个国家相继报道了淋球菌高 度耐头抱曲松的现象,如2009年日本,2011年法国和西班牙相继报道了同时对头抱 曲松和头抱克月亏高度耐药的淋球菌菌株H041W】和F89【6]。

2000-2010年,美国疾病预防控制中心共收集了 5865株淋球菌临床菌株,调查 头抱菌素的敏感性情况,显示头抱克月亏MIC ^0.25mg/L的淋球菌菌株的比例从2000 年的0.2%增长到2010年的1.4%,而头抱曲松MIC ^0.125 mg/L从0.1%增长到

0.3%;淋球菌对头抱菌素敏感性呈现明显的地区差异,夏威夷的头抱克肪MIC 2 0.25mg/L淋球菌菌株的比例从0%上升7.7%,而加利福尼亚州从0%上升到4.5%,头 抱曲松的MIC20.125 mg/L从0%增长到0.6%[12],提示美国各地区头抱菌素耐药现象 普遍呈上升趋势。由于一线治疗药物的治愈率达95%以上,而美国的淋球菌耐药现象 极其严峻,故美国疾病预防控制中心于2015年将第3代头抱菌素类联合阿奇霉素作 为治疗淋病的首选问,但最近又有学者报道头抱菌素联合阿奇霉素耐药的案例回⑸。 2014年Fifer等网报道的1例异性恋有2周的尿道炎男性患者病例,采用500mg头抱 曲松肌注联合lg阿奇霉素口服治疗失败,后加量为lg头抱曲松肌注加阿奇霉素2g 口服治疗才有效。Katz等问报道夏威夷2016年4月到10月8例高度阿奇霉素耐药

(MIC>16mg/L)及5例头抱曲松敏感性降低(MIC=0.125mg/L)的病例资料。

我国对淋病菌的耐药情况的研究较少。目前我国仍以头抱曲松作为治疗淋病的首 选。Chen等阴收集的2012-2013年我国多个省份的11个淋病监测点的淋球菌菌株 1257株病例,发现4.4% (55株)的菌株产生了头抱曲松耐药,其中西部和西南部占 T 52.7% (29株),四川和海南头抱曲松耐药的比例分别为6.9%和13.0%,北方和东 部没有发现头抱曲松耐药株。Jiang等Vi学者发现在中国合肥2014年至2015年2年 间126株菌株中11.1%(14)株产生头抱菌素敏感性降低(头抱曲松(MIC三0.125 mg/L, 10株)和头抱克月亏(MIC 2 0. 25 mg/L, 1株),显示较高的耐药性。Peng等[叫攵集 T长沙2015年4月到2016年6月期间128株淋球菌菌株,发现有11%(14株)的菌株 对头抱曲松敏感性降低和耐药。

二、耐药机制的研究进展

目前淋球菌相关耐药机制的研究主要集中在3个方面:一是药物作用的靶向点的 改变(如大环内脂类、大观霉素耐药),主要影响药物与细菌间的结合从而耐药;二 是细菌的细胞膜外孔蛋白的改变(如四环素类耐药),使药物对细菌细胞膜的通透性 降低,从而药物内流减少产生耐药;三是外排系统的改变,使进入淋球菌内的药物外 排增多,从而产生耐药。淋球菌对头抱菌株类耐药或敏感性降低的机制尚未完全明确, 据有关文献报道,机制主要表现在染色体介导的基因突变上,与之相关的耐药基因主 要有 penA、ponA、porB、mtrR 和 pilQ。

1.青霉素结合蛋白(Penicillin-binding proteinsfBP)结构的改变:头抱菌素是B类 酰胺类抗生素,其杀菌主要依赖于PBP, PBPs是一些位于淋球菌细胞膜上的酶类,参 与淋球菌细胞壁生物合成的终末阶段,对维持细菌胞壁的稳定起着重要作用。抗生素 与细菌PBP的转肽酶结合,抑制细胞壁的肽聚糖交联,从而导致胞壁破坏和细菌死亡, PBP与抗菌药的结合能力下降对淋球菌产生耐药有着重要的意义。PBPs有3种:PBP1> PBP2、PBP3o PBP1、PBP2是主要的作用靶点。PBP2由penA基因编码,penA基因 在头抱菌素耐药菌株中发挥着重要的作用。penA基因分为镶嵌状和非镶嵌状,镶嵌 状的结构是紧密联系的细菌中其DNA同源重组基因,散布20%差异的核昔酸。近年 国际上出现的数例高度耐头抱菌素菌株都和镶嵌状的penA基因有着密切的关系。 Tomberg等问研究了 H041菌株的基因结构,发现镶嵌状的penA可使淋病菌产生高 度耐药(头抱曲松的MIC是2mg/L),同时发现penA基因中A311V, T316P, T483S的 突变基因。Nakayama等如研究认为,镶嵌状penA基因与头抱曲松耐药及多重耐药 有关,其可能的机制与PenA基因的3'端的基因的改变有关。非镶嵌式的penA基因 的突变也与头抱菌素的敏感性降低有关,Peng等[闵研究发现非镶嵌式的penA基因 A501V/T和P551S突变可能引起头抱曲松的敏感性降低和耐药,Chen等[闵在监测中 国各地区的淋球菌耐药的情况时,也发现非镶嵌式的penA基因的A501T的突变。

PBP1由ponA基因编码产生。ponA基因的突变也与头抱曲松敏感性的降低有关, 最常见突变是L421PO Carannante等㈤研究2011-2014年间头抱克月亏敏感性下降和 耐药的菌株65株,ponA基因的L421P突变参与了耐药的发生。

2.药物外排的增加和内流的减少:

  • 药物外排的增加:外排泵在淋球菌耐药中的地位。与淋病有关的外排系统 主要有以下4个,为MtrR、MacAB、NorM和FarAB。MacAB是大环内酯特异性ABC 型外排转运蛋白(macrolide-specific ABC-type efflux transporter)的简称。NorM 为编 码诺氟沙星外排泵蛋白(norfloxacin efflux protein)的基因。所以MacAB外排泵和NorM 外排泵分别主要排出大环内酯类和氟卩奎诺酮类药物。脂肪酸耐药系统(fattyacids resistance, Far)主要排出淋球菌菌体内的长链脂肪酸,其中关系最为密切的是多重 耐药外排(multipletransferrable resistance, MtrR)系统,也是研究的热点。该系统由 调节基因mtrR和结构基因mtrC> mtrD> mtrE组成,分别编码相应的功能蛋白(MtrR、 MtrC、MtrD> MtrE)。mtrR基因编码阻遏蛋白对mtrCDE结构基因的转录表达起调 节作用。mtrR基因突变会导致mtrCDE的外排泵表达量增加,从而产生耐药。mtrR 调控基因和mtrCDE的结构基因之间有一段250 bp的片段,包含了 13〜35区域的13 bp的反向重复序列,很多研究都显示该序列的单核昔酸A的缺失和mtrR编码序列的 改变,以及在mtrC起始密码子上游120 bp处C-T置换(mtrl20),使mtrCDE外排泵表 达增加,促进细菌体内的药物排出[17,18,22]o Carannante等㈤研究的65株头抱克月亏 耐药和敏感性下降的的菌株中都有mtrR的启动子单核昔酸A的缺失和氨基酸的置换 H105Y和G45D,即第105位的组氨酸(histidine, H)被酪氨酸(tyrosine, Y)置换, 第45位的甘氨酸(glicine,G)被天冬氨酸(aspartic acid, D)替换。此研究和Gianecini[23] 的研究类似。中国Chen等[24】研究南京地区淋病对头抱曲松耐药现状发现,4% (15/278)的头抱曲松耐药,耐药株中有93.3% (14/15)的菌株有mtrR的启动子单 核昔酸A的缺失,还发现氨基酸的置换A39T、G45D、H105Y,还有使mtrCDE泵过度 表达的mtrC起始密码子上游120 bp的C-T置换。mtrR基因与头抱菌素的耐药性有着 重要的关系。
  • 药物内流减少:药物内流与外膜蛋白基因编码的外孔膜蛋白有关,外孔膜 蛋白包括porBla和porBlb两种,porB的基因突变导致外孔膜蛋白的结构改变,可引 起药物内流减少,并在外排泵的作用下从而产生耐药。目前已发现的突变位点有 G101> A102、G120> A121o Gianecini等㈤在阿根廷收集的42株头抱克月亏和头抱曲松 低敏株,所有菌株都有porBlb蛋白的G120和A121氨基酸突变,包括G120K/A121N、 G120K/A121D> A121G 和 A121S/N122K (其中 K、A、N、S 分别为赖氨酸(lysine), 丙氨酸(alanine),天冬酰胺(asparagine)丝胺酸(serine)),证实porBlb蛋白 的改变对头抱菌素低敏性有着重要的作用。Serra-Pladevall等购也发现,在头抱菌素 敏感性降低的菌株中出现porBlb蛋白的101和102氨基酸改变。Martin等%】发现 淋球菌的porB和tbpB (tbpB基因编码转铁结合蛋白transferrin-binding protein)的基 因多态性可以进行MAST基因分型,用于检测淋病耐药趋势,了解菌株的流行趋势。
  • 其他原因:pilQ是外膜上促胰液素多聚体,淋球菌通过它分泌产生菌毛。 有研究表明,pilQ的基因产物是淋球菌IV型菌毛生长必不可少的因子【"I,也有学者 推测PilQ与药物内流有关,当pilQ发生E666K突变,青霉素和多西环素的MIC不受 影响,但与mtrR、penB突变同时存在时,pilQ突变可能会使药物内流减少四。但 Whiley等[29】研究认为,pilQ突变只在实验室淋球菌被发现,由于突变干扰了 IV菌毛 的合成,而IV菌毛是淋病菌的主要致病因素,对临床菌株头抱菌素耐药性不起作用。 pilQ的作用还需要进一步研究。

淋病菌耐药和低敏现状逐年升高,且其耐药具有明显的地区差异,建立和加强对 淋球菌的耐药监测,有助于及时了解和把握淋病的发病现状,以及淋球菌的耐药及低 敏的分布情况。目前,淋球菌的耐药机制并不十分清楚,检测耐药基因、分析耐药机 制,对淋病的防治具有重要意义。国内对淋球菌耐药的监测只在部分经济发达地区可 以持续,耐药和低敏的淋球菌呈局部地区分布并处于缓慢上升趋势。淋病耐药头抱菌 素的机制未完全明确,因此需要更多的研究探讨淋病的机制,而加强淋病的管理和监 测对更好地控制淋球菌耐药的发展具有重要意义。

参考文献

  • Organization WH.Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008[J]. Reproductive Health Matters, 2012, 20(40):207-209.
  • Organization WH. Emergence of multi-drug resistant Neisseria gonorrhoeae: threat of global rise in untreatable sexually transmitted infections [DB/OL]. World Health Organization .(2012-11-14)[2018-6-14].
  • Deguchi T,Yasuda M,Yokoi S,et al.Treatment of uncomplicated gonococcal urethritis by double-dosing of 200 mg cefixime at a 6-h interval [J]. J Infect Chemother, 2003, 9(1):35-39.DOI:10.100刀S10156-002-0204-&
  • Unemo M,Golparian D, Stary A,et al.Fir st Neisseria gonorrhoeae strain with resistance to cefixime causing gonorrhoea treatment failure in Austria, 2011[J]. Euro Surveill, 2011, 16(43).
  • Ison CA,Hussey J,Sankar KN,et al.Gonorrhoea treatment failures to cefixime and azithromycin in England, 2010[J]. Euro Surveill, 2011, 16(14).
  • Unemo M,Golparian D,Nicholas     R,et al.High-level cefixime- and

ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae in France: novel penA mosaic allele in a successful international clone causes treatment failure [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(3):1273-1280.

  • Allen VG,Mitterni L,Seah C,et al.Neisseria gonorrhoeae treatment failure and susceptibility to cefixime in Toronto, Canada]J]. Jama, 2013, 309(2):163-170.
  • Singh AE,Gratrix J,Martin I,et al.Gonorrhea Treatment Failures With Oral and Injectable Expanded Spectrum Cephalosporin Monotherapy vs Dual Therapy at 4 Canadian Sexually Transmitted Infection Clinics, 2010-2013[J]. Sex Transm Dis, 2015, 42(6):33卜
  • Lewis DA,Sriruttan C,Muller EE,et al.Phenotypic and genetic characterization of the first two cases of extended-spectrum-cephalosporin-resistant Neisseria gonorrhoeae infection in South Africa and association with cefixime treatment feilure[J]. J Antimicrob Chemother, 2013, 68(6):1267-1270.
  • Camara J,Serra J,细ats J,et al.Molecular characterization of two high-level ceftriaxone-resistant Neisseria gonorrhoeae isolates detected in Catalonia, Spain[J]. J Antimicrob Chemother, 2012, 67(8):1858-1860.
  • Ohnishi M,Golparian D,Shimuta K,et al.Is Neisseria gonorrhoeae initiating a future era of untreatable gonorrhea?: detailed characterization of the first strain with high-level resistance to ceftriaxone [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(7):3538-3545.
  • Cephalosporin susceptibility among Neisseria gonorrhoeae isolates-United States, 2000-2010[J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2011, 60(26):873-877.
  • Workowski KA,Bolan GA.Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015[J]. MMWR Recomm Rep, 2015, 64(Rr-03):l-137.
  • Fifer H,Natarajan U,Jones L,et al.Failure of Dual Antimicrobial Therapy in Treatment of Gonorrhea[J]. N Engl J Med, 2016, 374(25):2504-2506.
  • Katz AR,Komeya A^Kirkcaldy RD,et al.Cluster of Neisseria gonorrhoeae Isolates With High-level Azithromycin Resistance and Decreased Ceftriaxone Susceptibility, Hawaii, 2016[J]. Clin Infect Dis, 2017, 65(6):918-923.
  • Chen SC,Yin YP,Dai XQ,et al.First nationwide study regarding ceftriaxone resistance and molecular epidemiology of Neisseria gonorrhoeae in China[J]. J Antimicrob Chemother, 2016, 71(1):92-99.
  • Jiang FX,Lan Q,Le WJ,et al.Antimicrobial susceptibility of Neisseria gonorrhoeae isolates from Hefei (2014-2015): genetic characteristics of antimicrobial resistance[J]. BMC Infect Dis, 2017, 17(1):366.
  • Peng T,Lin H,Liu Q,et al.Ceftriaxone susceptibility and molecular characteristics of Neisseria gonorrhoeae isolates in Changsha, China[J]. J Infect Chemother, 2017, 23(6):385-389.
  • Tomberg J,Unemo M,Ohnishi M,et al.Identification of amino acids conferring high-level resistance to expanded-spectrum cephalosporins in the penA gene from Neisseria gonorrhoeae strain H041[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(7):3029-3036.DOI:10.1128/aac.00093-13.
  • Nakayama S,Shimuta K,Furubayashi K,et al.New Ceftriaxone- and Multidrug-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain with a Novel Mosaic penA Gene Isolated in Japan[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(7):4339-4341.
  • Carannante A,Vacca P,Ghisetti V,et al.Genetic Resistance Determinants for Cefixime and Molecular Analysis of Gonococci Isolated in Italy [J]. Microb Drug Resist, 2017, 23(2):247-252.
  • Ohneck EA,Zalucki YM,Johnson PJ,et al.A novel mechanism of high-level, broad-spectrum antibiotic resistance caused by a single base pair change in Neisseria gonorrhoeae[J]. MB io, 2011, 2(5).
  • Gianecini R,Romero MLM,Oviedo C,et al.Emergence and Spread of Neisseria gonorrhoeae Isolates With Decreased Susceptibility to Extended-Spectrum Cephalosporins in Argentina, 2009 to 2013[J]. Sex Transm Dis, 2017, 44(6):351-355.
  • Chen SC,Yin YP,Dai XQ,et al.Antimicrobial resistance, genetic resistance determinants for ceftriaxone and molecular epidemiology of Neisseria gonorrhoeae isolates in Nanjing, China[J]. J Antimicrob Chemother, 2014, 69(11):2959-2965.
  • Serra-Pladevall J,Barbera MJ,Rodriguez S,et al.Neisseria gonorrhoeae antimicrobial susceptibility in Barcelona: penA, ponA, mtrR, and porB mutations and NG-MAST sequence types associated with decreased susceptibility to cephalosporins [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2016, 35(9):1549-1556.
  • Martin IM,Ison CA,Aanensen DM,et al.Rapid sequence-based identification of gonococcal transmission clusters in a large metropolitan area[J]. J Infect Dis, 2004, 189(8):1497-1505.
  • Drake SL,Koomey M.The product of the pilQ gene is essential for the biogenesis of type IV pili in Neisseria gonorrhoeae[J]. Mol Microbiol, 1995, 18(5):975-986.
  • Zhao S,Tobiason DM,Hu M,et al.The penC mutation conferring antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae arises from a mutation in the PilQ secretin that interferes with multimer stability [J]. Mol Microbiol, 2005, 57(5):1238-1251.
  • Whiley DMJacobsson S,Tapsall JW,et al.Alterations of the pilQ gene in Neisseria gonorrhoeae are unlikely contributors to decreased susceptibility to ceftriaxone and cefixime in clinical gonococcal strains [J]. J Antimicrob Chemother, 2010, 65(12):2543-2547.