益气活血中药治疗糖尿病周围神经 病变的临床与实验研究论文

2020年6月1日18:01:16益气活血中药治疗糖尿病周围神经 病变的临床与实验研究论文已关闭评论

益气活血中药治疗糖尿病周围神经 病变的临床与实验研究论文

中文摘要

一、临床研究

【目的】

观察益气活血中药糖痛方治疗2型糖尿病周围神经病变气虚血瘀证患者的 临床疗效,评价治疗的有效性与安全性,从而为临床应用提供客观依据。

【方法】

选取2016年12月-2018年12月中国中医科学院广安门医院、首都医科大学 宣武医院内分泌科门诊西医诊断为糖尿病周围神经病变,中医辨证属于气虚血瘀 证的2型糖尿病患者作为研究对象。共纳入符合诊断标准患者60例,按照随机、 平行、对照原则分为:治疗组和对照组各30例。两组患者均在糖尿病基础治疗 (如合理饮食、适量运动)、控制血糖、降压、调脂等基础上,对照组采用甲钻 胺片,0.5mg/次,3次/日,口服;治疗组在对照组的基础上,加用益气活血中药 糖痛方治疗,每日1剂,早晚2次,温服,以4周为1个疗程,观察3个疗程。 采集患者的一般资料,包括年龄、性别、糖尿病病程、体重指数等指标;采用中 医临床症状积分表,评估两组患者治疗前、后的中医症状情况;检测两组患者治 疗前、后的空腹血糖(FPG)、餐后2小时血糖(2hPG)、糖化血红蛋白(HbAlc)、 血脂水平(CHO、TG、LDL-C)、肝功能(ALT、AST)、肾功能(CR、BUN)等指 标,使用丹麦Dantec公司生产的Keypoint四导肌电图诱发电位仪检测两组 患者治疗前、后的运动神经和感觉神经传导速度。采用SPSS19.0统计学软件分 析两组患者数据,多方面综合评价益气活血中药糖痛方治疗DPN (气虚血瘀证) 患者的疗效性与安全性。

【结果】

1・中医症状积分比较:治疗前,治疗组与对照组在中医单项症状积分比较上, 差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,治疗组可明显改善患者倦怠乏力、气短 懒言、自汗多汗、腰膝酸软、肢体麻木、肢体刺痛、肢端发凉、肌肤甲错等症状, 与治疗前比较,存在明显统计学差异(P<0.01),且在改善倦怠乏力、气短懒言、 自汗多汗、肢体麻木、肢体刺痛等气虚血瘀症状方面疗效优于对照组(P<0.01 或PV0.05);对照组仅在缓解患者肢体麻木、肢体刺痛两个症状上疗效显著

(P<0.01) o在中医症状总积分比较上,两组患者治疗前不存在统计学差异,具 有可比性(P>0.05);经药物干预后,治疗组患者中医症状总积分较治疗前明显 下降(PV0.01),而对照组患者中医症状总积分未见明显改变(P>0.05);与对 照组比较,治疗组在改善中医症状总积分上疗效更为显著(P<0.01)-

2•综合疗效比较:经药物治疗后,治疗组综合疗效为:显效11例,有效10 例,无效6例;对照组综合疗效为:显效6例,有效7例,无效13例。治疗组 总有效率达77.78%,优于对照组的50%,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05) o

3•血糖相关指标比较:治疗前,比较两组患者FPG、2hPG、HbAiC,两组间 不存在统计学差异(P>0.05),二者具有可比性。治疗后,两组患者FPG、2hPG、 HbAiC与治疗前比较,未见明显改变(P>0.05)。

4.脂代谢指标比较:治疗前,比较治疗组与对照组患者的CHO、TG、LDL-C 水平,不存在统计学差异(P>0.05),表明两者具有可比性。治疗后,两组患者 的CHO、TG、LDL-C水平与治疗前比较,未见明显改变,差异无统计学意义(P>0.05) o

5•神经传导速度比较:治疗前,治疗组与对照组患者在胫神经、腓总神经、 腓浅神经、腓肠神经传导速度比较上,均不存在统计学差异(P>0.05) o治疗后, 两组患者神经传导速度与治疗前比较,均有显著提高(PV0.01),且治疗组在改 善神经传导速度方面疗效明显优于对照组(P<0.01) o

【结论】

本次研究发现益气活血中药糖痛方在治疗2型糖尿病周围神经病变(气虚血 瘀证)患者中,能有效改善患者气虚血瘀症状,缓解局部不适,未见明显不良反 应,同单纯甲钻胺片治疗相比较,具有一定的优势。

二、实验研究

【目的】

观察不同浓度高糖对RSC96细胞凋亡的影响,以及采用益气活血中药糖 痛方干预后,高糖状态下RSC96细胞凋亡的变化情况。

【方法】

L采用体外培养的RSC96细胞作为本次实验的研究对象,用不同浓度葡 萄糖培养基(25mmol/L、50mmol/L> 75mmol/L、100mmol/L)培养 48h,筛选 并建立RSC96细胞凋亡损伤模型。实验设立正常对照组(Con)、G50组、G75 组、G100组4个组别,最后采用AV/PI双染法检测不同浓度葡萄糖环境下RSC96 细胞的凋亡情况。

  1. 在上述实验基础上,筛选出50mmol/L的DMEM高糖培养基建立RSC96 细胞凋亡损伤模型,采用终浓度为lmg/ml的糖痛方进行干预,实验设立2组, 分别为 G50 组(50mmol/L)、G50+TTF 组(lmg/ml),干预 48h 后,观察 RSC96 细胞的凋亡变化。
  2. 数据处理采用0软件进行统计分析,计量资料以均数士标准差(7 土s)表示,多组间比较采用ANOVA方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

【结果】

1•本次研究发现,经不同浓度高糖干预48h后,与正常对照组比较,G50 组、G75组、G100组3个高糖组RSC96细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学 意义(P<0.05或PvO.Ol);且随着培养基中葡萄糖浓度的升高,细胞调亡率相 应增加,呈现一定的相关性。

2•经糖痛方干预48h后,细胞凋亡率较前下降,与G50组比较,存在统计 学差异(P<0.05) o

【结论】

  1. 高糖环境刺激下,RSC96细胞凋亡明显增加。

2*益气活血中药糖痛方具有抑制高糖所致的RSC96细胞凋亡作用,从而 为临床应用糖痛方防治糖尿病周围神经病变提供一定的理论支持。

【关键词】:糖尿病周围神经病变;益气活血中药;临床研究;RSC96细胞;细胞凋亡

ABSTRACT

  1. Clinical Research

Objective: To observe the clinical effect of Tangtong Formula,a traditional Chinese medicine for tonifying qi and activating blood circulation, in treating type 2 diabetic peripheral neuropathy with qi deficiency and blood stasis syndrome, and to evaluate the efficacy and safety of the treatment, so as to provide an objective basis for clinical application.

Method: We selected outpatients from December 2016 to December 2018, department of endocrinology of Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, and Xuanwu Hospital, Capital Medical University, who were diagnosed as type 2 diabetic peripheral neuropathy, and were classified as qi deficiency and blood stasis syndrome by TCM syndrome differentiation.A total of 60 patients who met the diagnostic criteria were enrolled, according to the principle of randomization, parallel and control, they were divided into treatment group and control group with 30 cases respectively.Both groups of patients were treated with basic treatment of diabetes (such as reasonable diet, moderate exercise), hypoglycemia, antihypertensive therapy, lipid lowering and so on according to their actual situation.The control group was asked to take mecobalamin tablets, 0.5mg a time, 3 times per day. Based on the control group treatment, the treatment group also took the Chinese herbal Tangtong Formula, 1 dose a day, twice per day, in the morning and evening, 4 weeks were used as a course of treatment, the test period lasts 3 courses of treatment. Collect general information of patients, including age, gender, course of diabetes, body mass index and other indicators.Use TCM clinical symptom score table to evaluate the TCM symptoms before and after treatment in both groups. Detect fasting plasma glucose (FPG), 2 hours postprandial blood glucose (2hPG), glycosylated hemoglobin (HbAlc), blood lipid levels (CHO, TG, LDL-C), liver function (ALT, AST), renal function (CR, BUN) and other indicators in the two groups before and after treatment. The motor and sensory nerve conduction velocities were measured before and after treatment with Keypoint quadruplex electromyographic evoked potential instrument produced by Dantec Company in Denmark. All the data of the two groups of patients were analyzed by SPSS 19.0 statistical software. The efficacy and safety of Tangtong Formula in the treatment of patients with DPN (qi deficiency and blood stasis syndrome) were evaluated comprehensively.

Result:

  1. Comparison of TCM symptom scores: Before treatment, there was no significant difference in the scores of single TCM symptom between the treatment group and the control group (P>0.05). After treatment, the treatment group can significantly improve the patient*s fatigue and lack of strength , shortness of breath and no desire to speak, spontaneous perspiration and excessive sweating, weak waist and knees, numbness of limbs, stabbing pain of limbs, cold extremities, and skin dysfunction syndromes, there were significant statistical differences between the two groups before and after treatment(P<0.01), and the results were better than the control group in improving fatigue and lack of strength , shortness of breath and no desire to speak, spontaneous perspiration and excessive sweating, numbness of limbs, stabbing pain of limbs and other qi deficiency and blood stasis symptoms (P <0.05).At the same time,the study found that the control group only was more effective in relieving numbness and stabbing pain of limbs (P<0.01). In the comparison of total scores of TCM symptoms, there was no statistical difference between the two groups before treatment, which was comparable (P>0.05). After drug intervention, the total score of TCM symptoms in the treatment group was significantly lower than that before treatment (P < 0.01), while the total score of TCM symptoms in the control group did not change significantly (P > 0.05), compared with the control group, the treatment group was more effective in improving the total score of TCM symptoms (P<0.01).
  2. Comparison of comprehensive curative effect: After drug treatment, the comprehensive curative effect of the treatment group was as follows: 11 cases were markedly effective, 10 cases were effective and 6 cases were ineffective. In the control group, 6 cases were markedly effective, 7 cases were effective and 13 cases were ineffective. The total effective rate of the treatment group was 77.78%, which was better than 50% of the control group, and the difiference was statistically significant (P<0.05).
  3. Comparison of blood glucose-related indicators: Before treatment, in the comparison of FPG, PBG, and HbAlC blood glucose-related indicators, there was no statistical difference between the two groups, which was comparable (P>0.05). After treatment, there were no significant changes in FPG, 2hPG and HbAlC between the two groups (P > 0.05).
  4. Comparison of lipid metabolism indicators: Before treatment, there was no significant difference in the levels of CHO, TG and LDL-C between the treatment group and the control group (P>0.05), indicating that the two groups were comparable. After treatment, the levels of CHO, TG and LDL-C in the two groups were not significantly different from those before treatment (P>0.05).

5- Comparison of nerve conduction velocity: Before treatment, there was no significant difference in the conduction velocity of tibial nerve, common peroneal nerve, superficial peroneal nerve and sural nerve between the treatment group and the control group (P > 0.05). After treatment, the nerve conduction velocity of the two groups was significantly higher than that before treatment (P < 0.01), and the therapeutic effect of the treatment group was significantly better than that of the control group in improving nerve conduction velocity・

Conclusion:This clinical study found that Tangtong Formula, a traditional Chinese medicine which has the function of invigorating qi and activating blood circulation, can effectively improve the symptoms of qi deficiency and blood stasis in patients with type 2 diabetic peripheral neuropathy (qi deficiency and blood stasis syndrome), alleviate local discomfort, and has no obvious adverse reactions. Compared with the treatment of mecobalamin tablets alone, Tangtong Formula has certain advantages.

  1. Experimental Research

Objective: To observe the effect of different concentration of high glucose on RSC96 cell apoptosis, and the changes of RSC96 cell apoptosis under high glucose state after the intervention of Tangtong Formula.

Method:

  1. RSC96 cells cultured in vitro were used as the research object in this experiment, they were cultivate by DMEM mediums which contains different concentrations of glucose (25 mmol/L, 50 mmol/L, 75 mmol/L, 100 mmol/L) for 48 hours to build the model of apoptosis.there are four groups in this experiment: Normal control group (Con), G50 group, G75 group and G100 group , the apoptosis of RSC96 Cells was detected by flow cytometry Annexin V/PI.
  2. On the basis of the above experiments, 50mmol/L DMEM high glucoser medium was selected to establish RSC96 cell apoptosis injury model. Tangtong Formula with the final concentration of lmg/ml was used to intervene. Two groups were set up, namely G50 group (50mmol/L) and G50+TTF group (lmg/ml). To observe the apoptotic changes of RSC96 cells after 48 hours of interventiort
  3. Data processing was performed by SPSS 19.0 software. The measurement data were expressed as mean土standard deviation (x ±s). ANOVA analysis of variance was used among groups. P<0.05 was considered statistically significant.

Result:

L This study found that the apoptosis rate of RSC96 cells in G50 group, G75 group and G100 group was significantly higher than that in normal control group after 48h intervention with different concentrations of high glucose. The difference was statistically significant (P<0.05 or P<0.01); and with the increase of glucose concentration in the medium, the cell apoptosis rate increased correspondingly, showing a certain correlation.

  1. After 48 hours of intervention with Tangtong Formula, the apoptosis rate decreased compared with that of G50 group (P<0.05).

Conclusion:

1 ・ Under the stimulation of high glucose environment, the apoptosis of RSC96 cells increased significantly.

  1. Yiqihuoxue Chinese medicine Tangtong Formula can inhibit the apoptosis of RSC96 cells induced by high glucose, which provides theoretical support for the clinical application of Tangtong Formula in the prevention and treatment of diabetic peripheral neuropathy.

Keywords: Diabetic peripheral neuropathy; Yiqihuoxue traditional Chinese medicine; clinical research; RSC96 cells; apoptosis;

英文缩略语对照表
英文缩写 英文全名 中文译名
ADA American Diabetes Association 美国糖尿病协会
AGEs Advanced Glycation End Products 晚期糖基化终末产物
AR Aldose Reductase 醛糖还原酶
BMI Body Mass Index 身体质量指数
CHO Cholesterol 胆固醇
DM Diabetes Mellitus 糖尿病
DMEM Dulbecco^ Modified Eagle Medium 细胞培养基
DMSO Dimethylsulfbxide 二甲基亚砚
DPN Diabetic Peripheral Neuropathy 糖尿病周围神经病变
FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清
FPG Fasting Plasma Glucose 空腹血糖
HbAlC Glycosylated Hemoglobin 糖化血红蛋白
IDF International Diabetes Federation 国际糖尿病联盟
IGF Insuline-like Growth Factors 胰岛素样生长因子
LDL-C Low-density Lipoprotein Cholesterin 低密度脂蛋白
MNCV Motor Nerve Conduction Velocity 运动神经传导速度
NGF Nerve Growth Factor 神经生长因子
NTF Neurotrophic Factor 神经营养因子
PBG Postprandial Blood Glucose 餐后血糖
PBS Phosphate Buffer Solution 磷酸盐缓冲液
PKC Protein Kinase C 蛋白激酶C
ROS Reactive Oxygen Species 活性氧簇
RSC 96 Rat Schwann Cells 96 大鼠雪旺细胞
SDH Sorbitol Dehydrogenase 山梨醇脱氢酶
SNCV Sensory Nerve Conduction Velocity 感觉神经传导速度
TG Triglycerides 甘油三酯

前言

糖尿病(diabetes mellitusQM)是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征 的代谢性疾病,是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起。目前在世界范围内, 糖尿病患病率、发病率和糖尿病患者数量急剧上升,据国际糖尿病联盟(IDF) 统计:2017年全球20-79岁成年人糖尿病患者已达4.25亿,患病率约为8.8%, 预计到2045年将增加至6.29亿,患病率达9.9%,成为严重威胁人类健康的世界 性公共卫生问题。

近40年来,随着我国经济高速发展、人们生活方式改变和人口老龄化,肥 胖率上升,我国糖尿病患病率也呈快速增长趋势,2013年调查显示我国2型糖 尿病患病率为10.4%。更为严重的是我国约有63%的糖尿病患者未被诊断,而已 接受治疗者,糖尿病控制状况也很不理想。长期碳水化合物以及脂肪、蛋白质代 谢紊乱可引起多系统损害,眼、肾、神经、心脏等。

DPN是糖尿病最常见的慢性并发症之一,据中国医师协会内分泌代谢科医 师分会流行病学调查显示:糖尿病诊断10年内60%・90%的患者有不同程度的 DPN, 30%-40%的患者无自觉症状。在吸烟、年龄>40岁以及血糖控制差的患者 中患病率更高。中华医学会糖尿病学分会在1991年1月至2000年12月对24496 例DM患者的分析发现神经病变占603%, 1型44.9%, 2型61.8%。DPN患者 由于丧失痛温觉,容易发生烫伤、冻伤、刺伤,微循环改变可导致糖尿病足,严 重影响患者的生活质量,甚至危及生命。

该病发病机制复杂,治疗较为棘手。目前现代医学治疗主要包括控制血糖、 神经修复、抗氧化应激、改善微循环、改善代谢紊乱等对因治疗;以及使用抗惊 厥药、抗抑郁药、阿片类止痛药等对症治疗。虽然近年临床研究证实:严格控制 血糖可使患者从中获益,但血糖的控制并不能遏制DPN的进一步发展。药物治 疗中尚存在有费用高、疗效不确切、患者不耐受等局限性。中药复方糖痛方具有 益气活血、温经通络之效,在改善DPN患者症状、提高神经传导速度、改善血 液流变学和微循环等方面疗效肯定。因此,研究其作用机制对于防治DPN的发 生发展具有重要的意义。

本实验研究依托国家自然科学基金面上项目:基于PARP信号通路探讨益 气活血中药治疗糖尿病周围神经病变分子机制(81473464)。

第一部分 文献综述

综述一现代医学对糖尿病周围神经病变的认识

  1. 概述

糖尿病周围神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy, DPN)是指在排除其 他因素的前提下,糖尿病患者在疾病过程中出现了与周围神经功能障碍有关的症 状和(或)体征,病变可影响到患者的运动神经、感觉神经及自主神经,其中以 糖尿病远端对称性多发性神经病变(DSPN)最为多见,临床表现为双侧肢体麻 木、疼痛、感觉减退、蚁行感等,是糖尿病患者足部溃疡、坏疽的常见原因,严 重者甚至导致截肢,研究发现50%-75%非外伤性截肢由DPN所致[讥

  1. 流行病学

大量流行病学调查表明,DPN为糖尿病患者常见的慢性并发症之一,甚至 导致糖尿病患者致残、致死。随着我国经济的发展,人口老龄化加剧,生活方式 不断变化,糖尿病发病率不断升高。据国际糖尿病联盟(IDF)最新研究显示, 2017年我国糖尿病患者约1.14亿,居世界各国之首,预计到2045年我国糖尿病 患者人数将达到1.34亿⑵。

DPN在糖尿病患者中的发病率较高,据报道,糖尿病患者在确诊后的10年 病程中,临床上都会出现不同程度的神经受损症状或体征⑶。但是目前由于诊断 标准的不一致,且检测方法各异,DPN患病率存在较大的差异,波动在10%-96% 左右【罠 国外研究发现1型糖尿病患者病程在20年以上时DSPN发病率至少达 到20%,而新诊断的2型糖尿病患者,DSPN的发病率也较高,至少可达到 10%・15%〔他 并且随着病程延长至10年以上,其患病率可达50%【隔。痛性糖 尿病周围神经病变(Painful Diabetic Peripheral Neuropathy, PDPN)在 T1DM 患 者中的发病率大约为5%, T2DM患者中PDPN的发病率大约为20%〔刃,这类患 者会伴随着严重疼痛,而且很难治愈,不仅严重降低患者生活质量,威胁患者的 生命健康,同时在慢性病的管理上也给个人、社会、乃至国家带来沉重的负担。

  • 发病机制

已有研究发现血糖叫口2]、吸烟[⑶、血压、体重和血脂ZE等因素与糖尿病 周围神经病变的发生密切相关,但是DPN的发病机制尚未完全清楚,目前国内 外学者提出的糖尿病周围神经病变发病机制的假说涉及以下几种:代谢紊乱,包 括多元醇通路的激活、已糖胺途径的激活、蛋白激酶C (protein kinase, PKC) 途径的激活、糖基化终产物(advanced glycosylation and products, AGEs)的形 成;以及其他诸如氧化应激、血管功能障碍、神经营养因子缺乏和免疫机制异常 等。

以下为美国糖尿病协会在2017年的《糖尿病神经病变立场声明》中“〕提出 的可能发病机制(图1・2):

图 1-2 Mechanisms of diabetic neuropathy
Factors linked to type 1 diabetes (yellow), type 2 diabetes (blue), and both (green) cause DNA damage, endoplasmic reticulum stress, mitochondrial dysfunction, cellular injury, and irreversible damage・

3.1代谢紊乱学说

3.1.1多元醇通路的激活

多元醇通路(Polyol・pathway),又称山梨醇通路(Sorbitol-pathway),是由醛糖 还原酶(aldose reductase, AR)与山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase, SDH)^ 者共同参与下的糖代谢通路。在AR的作用下,细胞内葡萄糖首先被转变成山梨 醇,然后再经SDH作用而氧化为果糖[⑺。

在多元醇通路中,醛糖还原酶是关键的限速酶,正常情况下,糖酵解是机体绝 大部分葡萄糖的代谢途径,因而进入多元醇通路的葡萄糖很少,低于3%,所以山 梨醇生成很少。但是由于糖尿病患者机体长期处于慢性高血糖的非正常状态,AR 活性明显增强,介导了多元醇通路的激活,此时进入多元醇通路的葡萄糖增加至 33%Zi920],造成山梨醇和果糖等物质生成的增加,而不断地在神经组织内聚集, 从而损伤神经细胞,引起细胞水肿、变性、坏死,进而神经纤维发生阶段性脱髓 鞘,导致传导速度降低0Q】。此外,山梨醇在神经细胞内大量聚集,还会引起神 经组织摄取肌醇减少,最终导致Na+-K+-ATP酶的活性受抑制,引起神经细胞 相应的生理功能障碍【讥Vinik在动物实验中发现,早期通过给予足够的肌醇和 应用醛糖还原酶抑制剂有助于提高糖尿病鼠的神经传导速度[却。另外,细胞质 中的还原型尼克酰胺腺瞟吟二核苜酸磷酸(NADPH)以及还原型谷胱甘肽 (GSH)则会因高糖状态下多元醇通路的激活而被大量消耗,从而导致机体对 活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)清除能力下降,细胞更容易受到 自由基所致的氧化应激的损伤[24'25]o Uehara等[绚人采用过量表达人AR的转 基因小鼠探索多元醇通路的过度激活对背根神经节(DRG)的影响,发现AR的 过度活化会促使大量二酰甘油产生,进而导致蛋白激酶C途径的激活。

32己糖胺通路激活

己糖胺通路(Hexosamine Pathway)是机体代谢葡萄糖的正常途径之一, 正常情况下进入这一通路的葡萄糖只有1%・3%左右,并在谷氨酰胺果糖・6- 磷酸盐转移酶的参与下转变为葡萄糖胺・6•磷酸盐,而后再进一步形成二磷酸尿 昔葡萄糖醛酸(UDPGlcNac)"】。高血糖状态下会造成线粒体活性氧自由基生 成增多,从而在一定程度上抑制了 3•磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性,导致 氧化代谢产物的蓄积,尤其是6•磷酸果糖的累积则为6-磷酸果糖氨基转移 酶(GFAT)提供了大量的底物,己糖胺通路因此过度激活[旳,介导了 UDPGlc Nac的高表达,并导致特异性B1糖蛋白的激活,而特异性B1糖蛋白与诸如糖尿 病周围神经病变的糖尿病多种并发症密切相关卩刃。

3.13蛋白激酶C途径激活

蛋白激酶C (Protein kinaseC, PKC)是一种分子量为80-90ku的一类丝/苏 氨酸蛋白激酶,存在于细胞内多个信号通路中心,具有特殊的生理功能。高血 糖时增多的活性氧自由基会使GAPDH的活性受抑制,因此增加了磷酸二轻 丙酮(DHAP)转化为二酯酰甘油(DAG),当体内二酯酰甘油浓度增加时,可以 大量激活PKCE 30k PKC途径被活化后,可造成血管内皮功能上的异常、基底 膜增厚、以及通透性增加等等。同时,蛋白激酶C的活化还会进一步激活丝裂 原活化蛋白激酶(MAPK),使转录因子发生磷酸化,继而改变基因表达。近年 来有诸多学者研究蛋白激酶C途径与DPN的潜在关系,如韩静,陈磊等人 研究发现PKC的表达在DPN大鼠坐骨神经和背根神经节中均有所增加 辺,而Nakamura等図人发现,糖尿病大鼠坐骨神经的血流以及传导速度在PKC 未活化的情况下,均可恢复到正常水平。

34非酶促糖基化

非酶糖基化概指在没有酶参与情况下,非还原糖的醛基或酮基先跟蛋白质、 脂质等的游离氨基发生反应,在早期生成的是可逆的糖基化产物Schiff碱以 及Amadori产物,接着这些产物再通过复杂的重组、脱氢等环节,转变为不可 逆的糖基化终末产物(advancedglycation end products,AGEs)o

既往研究发现1型和2型糖尿病患者的血清和周围神经中AGEs水平均较 正常者增加【“洌,说明糖尿病患者持续高血糖,导致体内AGEs的形成增快、蓄 积增高,这与DPN发生关系密切。周围神经中AGEs的蓄积一方面直接影响结 构和功能蛋白,另一方面间接激活AGEs受体,最终造成神经损伤卩6旳。此外, 目前较多研究还发现机体内AGEs含量的增加所引起的生化损伤可损害糖尿病 患者的神经血供,神经组织得不到充足的营养

3・1・5脂代谢异常

早在2001年Me Garry就已经提出“脂毒性"学说,认为脂代谢紊乱与糖 尿病有密切联系,长期的、高浓度的血浆游离脂肪酸可在一定程度上改变 神经酰胺的浓度,从而导致了胰岛卩细胞的凋亡。无论是1型还是2 型糖尿病患者其发病病理基础均存在胰岛素相对不足或绝对缺乏,因而可 引起神经组织的脂代谢紊乱,如神经细胞内的脂质合成异常、亚麻酸转化 上障碍以及雪旺细胞内存在脂质沉积等等,这些变化通常在早期就可导致 神经传导速度的降低。肌醇磷脂代谢可受到脂代谢紊乱的影响,从而导致其 产物三磷酸肌醇和二酰甘油减少,最终导致DNA合成障碍,细胞增殖活力受 抑制[40]。4•疑基壬烯酸(4-hydroxynonenal, HNE)加合物在脂质过氧化过程中 的蓄积也会引起、推动DPN的发生

3.2氧化应激学说

Vincent早在2003年就指出DPN的发生机制都与氧化应激中的某条通路有 关〔他 继之Banting奖的得主Brownlee又提出高血糖诱发线粒体产生过多的活 性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS),其所介导的氧化应激反应,是导致包 括糖尿病周围神经病变及其他糖尿病并发症的统一机制⑷】。氧化应激是指机体 在遭受各种有害刺激时,体内活性氧自由基(ROS)以及活性氮自由基(RNS)等 高活性分子的产生就会大量增多,超出机体的清除能力时,氧化系统与抗氧化系 统则处于失衡状态,从而导致了神经组织的损伤高糖环境下,ATP合成酶 被抑制,致02-生成增多,由02-生成的H2O2亦增多。02-和H202增多以及还原 型谷胱甘肽(GSH)的减少,最终使ROS和RNS生成亦增多径呦,引发神经组 织严重的缺血、缺氧,最终导致神经传导速度降低、神经血管功能异常以及DPN 特征性的形态学改变146]。

33血管障碍学说

周围神经通过神经滋养血管来提供营养。Dyck等研究发现DPN患者存在 神经微血管异常,推测微血管炎所致的神经缺血性损伤是主要的病理生理机制, 如节段性脱髓鞘可能继发于缺血性轴索营养不良H7],因此,高血糖是DPN发病 的中心环节,神经损伤和血管内皮损伤贯穿于DPN的整个病理过程,二者同时作 用下所导致的糖尿病微血管并发症。

3.3.1血管结构异常

研究发现糖尿病患者容易出现大血管与微血管的病变。大血管病变比如血栓 形成或斑块。微血管病变主要表现为毛细血管基底膜的增厚,内皮细胞的肿胀, 糖蛋白沉积,导致管腔变窄,引起神经缺血缺氧,发生变性和坏死[倒,Leif等人 认为毛细血管功能障碍,可以减少组织在给定血流中提取的氧和葡萄糖的量【4% 且有研究发现神经组织在高糖环境下对缺血缺氧表现的更为敏感,因而容易受损 卩叭Ogawa等人临床研究表明糖尿病患者周围神经功能障碍可能与微血管病变 的进展平行发展,从躯体感觉神经功能障碍进展为自主神经功能障碍,然后进展 为躯体运动神经功能障碍⑸上铁

3.3.2血液流变学异常

糖尿病长期慢性高血糖状态下,患者的微血管中可出现大量的纤维 素沉积和血小板聚集,血液中凝血物质增多导致高凝状态,易引起血管阻 塞,加重缺血缺氧⑴亠]。Cameron等人研究发现,血液动力学和血液流变 学的异常可出现于糖尿病周围神经的微血管内,动静脉分流也有助于减少神 经内膜灌注【旳。卜献春等人也发现糖尿病大鼠造模一个月后,下肢所测得的血 流量有明显下降,且血液黏滞度增高,血液流变性降低[殉。

3.3.3血管活性因子

有研究表明,血管活性因子一氧化氮(NO)、前列腺素(PGI2)、内皮素 (ET)等也参与了 DPN的发生。高血糖时AR被激活,NADPH被大量的消耗 甚至耗竭,NO严重减少。NO水平下降引起微血管内皮稳定性降低,舒张功能 受抑,对收缩因子敏感[切,导致周围神经微循环血流减少。PGI2 —方面具有抑 制血小板聚集的作用,另一方面能增加血管平滑肌细胞内的cAMP含量而扩张 局部血管。朱旭萍等研究发现,采用前列腺素E1治疗能有效缓解DPN患者的神 经系统症状[刑。ET是一种血管收缩肽,具有调节血管张力的作用。吕翠岩等在动 物实验中发现,ET含量在DPN模型大鼠血浆中显著增多3】,并可进一步引起组 织微血管的收缩,加重神经组织缺血、缺氧。

3.4神经营养因子缺乏学说

神经营养因子(eurotrophic factors , NTF)具有诱导神经元形态差异、促进 神经再生和刺激神经递质表达等多种生理特征【他,其中神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、胰岛素样生长因子(insuline-like growth factors,IGFs)^ 与 DPN 发生发展密切相关。

在诸多的神经营养因子中,NGF是发现最早、目前研究最多的一类生长因 子,能诱导神经递质的合成、蛋白磷酸化、甲基化等等,从而维持神经元功能的 正常⑹既往众多研究均提示NGF表达减少与DPN有关,如Murakawa等人研 究发现神经生长因子的mRNA和蛋白表达在糖尿病大鼠坐骨神经中均明显降低 【罔;Tender等人研究显示,改变神经生长因子的表达通路,可以在一定程度上缓 解痛性神经病变患者的临床症状佝等等。

3・5免疫异常学说

已有研究发现,免疫因素参与DPN的发生。Tamburin等从1例随访长达8 年的复发性DLRPN患者的治疗中发现,采用静脉注射免疫球蛋白能够减轻患者 的疼痛,据此推测免疫系统可能参与神经病理性疼痛的发生【64〕。近年来研究发 现在1型和2型糖尿病患者血清中存在有卩微球蛋白抗体、抗微球相关蛋白抗体 等自身抗体,这些抗体可引起神经组织产生自身免疫性的病理损伤,但其详细的 作用机制目前仍未明确,有待于进一步的研究探讨。

4•预防

目前临床尚缺乏治疗糖尿病神经损伤的特异性治疗方法,预防尤其是糖尿病 护理的关键环节。预防DPN重点是控制血糖和改善生活方式〔⑹。现代循证医学 主流观点是,高血糖是促进DPN进展的重要危险因素。英国前瞻性糖尿病研究 显示,2型糖尿病患者良好的血糖控制,能够降低与DPN、肾病和视网膜相关的 微血管终点风险佝。目前研究表明,T1DM患者强化血糖控制可显著降低DSPN 发生率,相对风险降低78%阴6性T2DM患者通过加强血糖管理可以使DSPN 发生相对风险降低5%-9%[妙70】。因此,严格的血糖控制,始终是防治DPN的首 要策略,可预防和延缓DPN的发生,且开始越早,治疗效果越明显[7】]。其次, 是改变生活方式。近年来欧洲多项糖尿病基础研究表明DPN的发生除高血糖外, 且与高血压、高血脂等因素独立相关。因此在控制血糖的同时,还需调整生活方 式,低盐、低脂、低卩票吟饮食,纠正机体代谢紊乱,在防治DPN过程中同样具 有重要的影响。此外,目前的糖尿病预防项目网、Steno-2研究⑴〕等也显示了通 过调整饮食或者联合个体化的运动,DPN患者可能从中受益。

5.治疗

虽然目前开展了较多关于DPN的研究,但DPN目前临床尚无特异性的治疗 方法,早期诊断和合理治疗可减慢病情的发展。在积极预防的基础上,其次针对 病因治疗,根据机制的不同,选择相应的药物,主要包括抗氧化应激药物、醛糖 还原酶抑制剂、神经营养与修复药物、改善微循环药物、糖基化终末产物抑制剂 (此类药物目前处于实验阶段)等。最后对于疼痛明显的患者,常用药物有抗惊 厥药、抗抑郁药、阿片类及外用药物等,总体上以缓解患者的疼痛和提高生活质 量为目的。

5.1对因治疗

  • 抗氧化应激药物:以一硫辛酸为代表,具有很强的抗氧化作用,通 过抑制脂质过氧化,对血管内皮细胞功能以及神经营养血管的血流量均有 改善作用,从而使周围神经获得充足的营养支持0】,目前临床上广泛用于

DPN的治疗。其他如依达拉奉、谷胱甘肽、VitC.以及中药提取物银杏叶 制剂等也具有抗氧化作用。

  • 醛糖还原酶抑制剂:代表药物依帕司他,能可逆性的抑制醛糖还原酶的 活性,且其抑制作用具有选择性。刘斌等用依帕司他治疗DPN患者36例,发现总 有效率达83%,与对照组比较有统计学差异(P<0.01) 1751; Matsuoka> Hotta等研 究发现依帕司他能有效改善患者临床症状,防止神经功能恶化盹77]。而在动物实 验中,乌卩磊等人发现依帕司他能有效抑制AR的活性,提高Na・K・ATP酶活性,增 加cAMP、cGMP含量,从而减弱DPN大鼠周围神经损伤的作用【叫
  • 神经营养与修复药物:本类药物有甲钻胺、神经生长因子等。甲钻胺 属于内源性的辅酶B12,彭颜晖等研究表明,甲钻胺具有减轻DPN患者的临 床症状作用El。Li等发现外源性甲钻胺可通过上调IGF-1基因表达延缓糖尿 病周围神经病变的发生,在血糖控制良好的情况下,尤其是糖尿病早期,可获得 较好的神经保护作用【8
  • 改善微循环药物:抗血小板常用药物为双吨达莫、阿司匹林等,扩血 管药物有钙离子拮抗剂、贝前列素钠、前列腺素E1、胰激肽原酶、己酮可 可碱及中药单体川茸嗪、丹参酮等一类具有活血化淤作用的中药⑺】,均有不 同程度改善DPN患者症状的作用。

5.2疼痛管理

PDPN严重干扰患者的正常生活,且往往伴有焦虑、抑郁,临床常用的药物 如下:(1)抗惊厥药:目前常用的有普瑞巴林、加巴喷丁、丙戊酸钠和卡马西 平等。普瑞巴林可以作为初始治疗药物卩6】,Freeman等⑻]人研究表明普瑞巴林可 显著减少与DPN相关的疼痛以及和疼痛相关的睡眠干扰,且疗效、安全性与剂 量呈正相关。(2)抗忧郁药物:如度洛西汀、阿米替林、丙米嗪和西肽普兰等。 其中度洛西汀可以作为疼痛的初始治疗药物[l6],Wernicke等人双盲、随机、安慰 剂对照临床研究充分肯定了度洛西丁在治疗中国DPN患者中的疗效〔跖。梅斌等 人研究证实度洛西丁在治疗DPDN有效,且不良反应发生明显少于阿米替林[删。 (3)阿片类药物:如曲马多,耗考酮等,以及其他药物辣椒素等。考虑阿片类 药物具有很强的成瘾性和容易诱发其他并发症,因此多不推荐曲马多作为治疗糖 尿病周围神经病变疼痛的一线、二线药物。

6.小结

糖尿病患者中,DPN较为多见,起病隐匿,高达50%的DPN患者可能无任 何临床症状,因此早期发现和早期干预对糖尿病患者尤为重要,有助于减少并发 症的发生和改善生活质量。尽管目前关于DPN的研究取得了一定进展,但由于 发病机制尚未明确,影响因素多样化,故临床尚缺乏有效的治疗方法,对于糖尿 病患者要注重预防,以控制血糖为首要前提,其次改善生活方式。同时,糖尿病 神经病变的筛查应在所有新诊断的2型糖尿病患者以及诊断5年以上的1型糖尿 病患者人群中实施,随后至少每年筛查1次;长期使用二甲双肌的患者应重视潜 在维生素B12的缺乏早期筛查;糖尿病病程较长或合并有其他微血管并发症的 患者应该每隔3・6个月检查,力求早期诊断,早期治疗,延缓进展。再者,痛性 周围神经病变的患者要加强疼痛管理,减轻患者生理、心理上的痛苦。最后,虽 然有关于DPN发病机制的研究较多,但供临床应用药物偏少,如PDPN的治疗, 且疗效不理想,药物费用昂贵(以-硫辛酸为例,目前临床多采用静脉给药, 口服制剂仍处于自费阶段),难以达到令患者满意的效果。部分药物副作用较 大,对同时合并有肝肾等脏器损害的DPN患者多不适用。因此,对于DPN的治 疗,仍然是目前医学领域的难点,研发治疗DPN的特异性药物仍是有待于解决 的关键问题。

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综述二中医药对糖尿病周围神经病变的认识

  1. 中医病名

祖国传统医学将糖尿病称之为“消渴病J糖尿病周围神经病变是现代医学病 名,古代文献并无此称谓,但关于DPN的临床表现已早有记载,如元•朱丹溪《丹 溪心法》中载有:“消渴肾虚受之,腿膝枯细,骨节酸疼=“手足麻者属气虚, 手足木者有湿痰死血,十指麻木是胃中有湿痰死血珂明・《普济方》中论:“肾 消口干,眼涩阴痿,手足烦痛珂叫 清代《王旭高医案》中述:“消渴日久,但见 手足麻木,肢凉如冰惦]。从古今记载上看,中医学多将其归属于“血痹S “麻木”、 “痛证J “痿证汀等病证范畴,现代医家仝小林对本病进行分期论治,提出早期属 “消渴痹症J而晚期属“消渴痿证”的范围⑷;吕仁和则将其统称为勺肖渴病痹痿 病珂叫2010年庞国明等人在《糖尿病周围神经病变中医诊疗规范初稿》中,明 确将本病中医病名称为“消渴痹症珂6]o

  1. 中医病因病机

消渴痹症是在饮食、情志、体质、外邪等多种因素综合作用下,其中尤以 阴虚体质最易罹患。久病多虚,阴伤气耗,筋脉失养;或久病多瘀,血脉瘀滞而 成。

自古以来,中医学对DPN的病机就有较为深刻的认识,《灵枢.五变》:“血 气皆少,善痿厥,足痹叩];《素问•举痛论》中云:“脉泣则血虚,血虚则痛J 周学海《经书笔记》中道:“血如像舟,津如像水,水津充沛,舟才能行,是 为阴虚致瘀S叶天士认为“久病入络”,在《临证指南医案》中指出:“积 伤入络,气血皆能致瘀S如上所述,DPN病位主要在肌肉、筋脉,病机有 不荣则痛、不通则痛两个方面。消渴日久,气血亏耗,阴阳俱虚,筋脉失养, 故见肢体发凉、麻木、疼痛,甚至肌肉痿缩等,即所谓的“不荣则痛J气为血 帅,气虚无力推动血行成瘀,或阴损及阳,阳虚寒凝而瘀等,即属于“不通则痛覽

当代医家结合自身的临床实践,对DPN病机做了深入的探讨和研究。林兰 教授认为本病是由于消渴日久、耗气伤血,致气血亏损、络脉空虚,气血运行受 阻而成,病理性质为本虚标实,以气血亏虚为致病之本,兼夹血瘀等病理产物。

“络病理论,'是糖尿病周围神经病变的主流观点,许公平【叭 王德惠⑼、郭俊杰[0 等人认为,本病是在气阴亏虚基础上,又兼有痰瘀阻络为患。张玉琴主张对 DPN病机进行分期,早期属气虚血瘀,痹阻脉络;后期则为痰湿瘀阻、阳虚寒凝, 瘀血贯穿于疾病发生发展的全过程。在国医大师周仲瑛教授“瘀热致消,学术思想 的影响下,王旭【叨倡导瘀热阻络,久则耗伤气阴的发病理念。

其次,以“藏象学说^为主导,肝为“疲极之本”,主筋,在肝藏象理论的指导 下,孙素云等[⑶认为,DPN患者因肝血亏损,血行迟缓,而导致四肢不温、麻 木、疼痛,甚则萎废等临床表现。张兰冋提出“脏腑虚损,因虚致瘀啲理论,其 中以肝、脾、肾三脏尤为重要。脏腑虚弱,则易起祸端,肾脏气化失司,肝脏疏 泄失常,脾脏肌肉失养,共同导致了本病的发生。张露露等I⑸认为脾失健运、肝 失柔润致气血失和是DPN主要发病基础,络脉痹阻为病变结局。

总体而言,消渴病的发生是以阴虚为关键;气虚是迁延不愈的症结;阳虚是 发展的必然趋势;血瘀是造成本病的主要原因⑹。

3 •辨证论治

3・1辨证分型论治

郑亚琳等【⑹总结林兰教授治疗DPN经验,将本病分为四型辨证论治:(1) 阴阳两虚脉络瘀阻型:治宜益气养阴、活血化瘀,方选自拟糖痛方(太子参、 黄罠、川茸、红花、桃仁、丹参、土鳖虫、牛膝、生地黄);(2)阴阳两虚寒 湿痹阻型:治宜温补气血、散寒除湿,方选黄罠桂枝五物汤合独活寄生汤加 减;(3)肝肾阴虚血不荣经型:治宜滋补肝肾、缓急止痛,方选虎潜丸合 芍药甘草汤加减;(4)脾胃两虚痰瘀互阻型:治宜健脾益气、化痰通络, 方选指迷茯苓丸合桃红四物汤加减。

吕仁和E提出“以正虚定证型、以邪实定证侯”的辨证思路,DPN主 要证型有:(1)气阴两虚:治宜补益气阴,常用药物太子参、麦冬、五味 子、生地黄等;(2)肝肾阴虚:治宜补益肝肾,常用药物熟地黄、山药、 桑寄生、黄精、狗脊等;(3)脾肾阳虚:治宜温补脾肾,常用药物党参、 肉桂、制附片、生英、地黄等;(4)精亏髓乏:治宜填精补髓,常用药物 人参、熟地黄、鹿角胶、龟板胶、枸杞、紫河车等。主要证候有肺胃燥热、 肝郁气滞、脾胃湿热、胃肠结滞、瘀血内阻、痰湿阻滞、湿热下注、肝胆 湿热。在DPN的早、中、晚期,上述证型和证候均可单独岀现,或参互并 见。治疗上恪守标本同治的原则,急则治标为主,兼以治本;缓则治本为 主,兼以治标。

刘国岭[凶归纳方家选教授临证经验,将DPN分为五型辨证论治:(1) 气阴双虚证:治以益气养阴为法,方选生脉散加减。(2)肝肾阴虚证:治以补 肝肾阴为法,方选六味地黄汤加减。(3)瘀血阻络证:根据临床主症分为4度, I度"感觉异常",治以益气和营、化瘀兼以通络为法,方选黄罠桂枝五物汤合四 物汤加减;II度“时有缓解肢痛3治以益气和营、通络化瘀为法,方选黄罠桂 枝五物汤合四物汤三藤(鸡血藤、夜交藤、忍冬藤)一地龙;III度“肢体 静息痛,紫暗成块=治以补气、活血、通络为法,方选补阳还五汤合三藤加减; IV度感觉消失,“运动神经受累汁岀现肌萎缩、瘫痪等,治以益气养营,活 血行瘀为法,方选圣愈汤合补阳还五汤加减。(4)痰湿内阻证:治以燥湿化 痰,理气和中为法,方选二陈汤加减。(5)阴阳两虚证:治以滋补阴阳,补肾 固涩为法,方选金匮肾气丸加减。

林达秋[切根据DPN患者的临床症状和体征,按中医理论将本病分为五 型辨证论治:(1)气血两虚型:又可分为气虚血瘀和气滞血瘀,气虚血瘀治宜 益气养血、温经通络,方选黄罠桂枝五物汤加减;气滞血瘀治宜活血化瘀、 通痹止痛,方选补阳还五汤加味。(2)寒湿阻滞型:治宜行气舒筋活络、 散寒除湿,方选独活寄生汤加减。(3)肝肾亏虚型:治宜补肝益肾、活血 通脉,方选虎潜丸、芍药甘草汤加减。(4)脾虚痰阻型:治宜益气健脾、 化痰通痹,方选茯苓丸合补中益气汤加味。(5)湿热阻络型:治宜清热利 湿、活血通络,方选加味二妙散。

3.2专方治疗

陈秀雅等㈤]用益气养阴通络汤,治疗气阴两虚兼血瘀型DPN患者30 例,总体有效率达90』%。钱宝珊等01以滋阴消痹方治疗肝肾亏虚证DPN患者 30例,治疗后组间比较,观察组患者的中医证候积分、MNSI体格检查评分改善 程度明显优于甲钻胺组(P<0.05),总有效率为83.3%O李贺赞【22】用自拟痛痹汤 治疗DPN35例,显效15例,有效12例,无效8例,治疗后治疗组患者临床症 状、周围神经传导速度明显改善(PV0.05)。丁伟等采用当归四逆汤治疗寒凝 血瘀型DPN 40例,总有效率达85.0% (P<0.05);两组患者神经传导速度、TCSS 评分较治疗前改善明显,且实验组与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。毛晶 京【列用黄罠桂枝五物汤治疗DPN38例,研究发现甲钻胺联合黄英桂枝五物汤治 疗能有效改善患者的血液流变学指标,总体有效率为94.74%,优于对照组的 78.95%O刘祎琳等1绚用消麻汤治疗气阴两虚夹瘀型DPN 60例,观察组患者疗效 明显,神经病变症状、体征改善程度均优于对照组(P<0.05)。靳思思逊]等用益 气养阴降糖方,治疗气阴两虚兼血瘀型DPN40例,结果显示观察组疗效显著, 临床总有效率95.00% o房其军等Bl用益气活血方治疗DPN31例,结果显示 试验组可有效缓解患者的临床症状,总有效率为87.1% (PvO.05) o王珏等[绚 基于李佃贵教授创立的“浊毒理论以解毒化浊为原则,采用解毒化浊方治疗 DPN3 0例,总有效率高达96.70%,治疗过程中未见明显不良反应。

  • 中成药治疗

中医药治疗疾病历史悠久,除了传统汤剂外,随着现代新技术、新工艺的发 展,如超滤技术、快崩技术、冷冻浓缩技术等普及,目前临床上治疗DPN的药 物主要有片剂、颗粒、胶囊、丸剂等多种剂型。

屠亦文等1291用桃蛭通瘀片(桃仁、水蛭、黄罠、大黄、首乌、葛根、海藻 等)治疗气虚络阻型DPN 89例,结果显示治疗组可有效改善DPN患者的中医 证候评分及Toronto评分,同时在降低TNF-a及提高神经传导速度方面优于对照 组。徐涛等凶用木丹颗粒(黄罠、三七、丹参、鸡血藤、延胡索、红花、赤芍、 苏木等)联合甲钻胺治疗DPN 25例,结果显示患者TCSS、TSS评分及刺痛、 感觉减退、烧灼感VAS评分均明显改善,正中神经的感觉传导速度明显提高。 李宏伟等⑶]用参英降糖胶囊(人参茎叶皂昔、五味子、黄罠、山药、地黄、 覆盆子、麦冬、茯苓、天花粉、泽泻、枸杞子等)治疗DPN 44例,结果总 有效率93.18% (P<0.05),且观察组治疗后血清ET-K IL-6及TNF・a水平均 明显低于对照组。刘华珍等[珂用羊董通络丸(炙淫羊霍、桂枝、人参、秋炒白 术、茯苓、炒白芍、川苇)治疗DPN 160例,结果总有效率81.88% (P<0.01)。 靳丽萍㈤]用消渴罠参止痛胶囊(黄罠、桂枝、川茸、丹参、白芍、地龙、当归、 熟地、杜仲、桑寄生、鸡血藤、淫羊蕾)治疗DPN 54例,有效率90.74%(P<0.05)。 肖若然等[3勺用葛英降糖颗粒(生黄罠,葛根,当归,川茸,泽泻,山楂,鬼箭 羽,漏芦)联合甲钻胺治疗肾虚毒滞型DPN患者30例,结果显示中西医结合组 能明显降低中医证候积分和密歇根评分,总有效率93.30%,优于西药组70.00% (p<0.01),且能显著抑制血清8-iso-PGF2a活性,推测其发挥效应机制可能与 减弱机体氧化应激有关。

  • 中药注射液

王凌宵等[35]研究发现使用葛根素注射液治疗DPN后,患者的血液流变学指 标、TSS评分均有改善,总有效率91.67%o陈平胸用舒血宁(银杏叶提取物) 治疗DPN,发现其具有降低血糖、改善血流变、抗氧化等作用。焦传军等卩7】用 水蛭、地龙提取物一疏血通注射液治疗DPN,结果显亦治疗组的总有效率76.0%, 优于对照组的40% (P<0.05) o毛红[殉用玄参、牛膝、金银花、石斛提取物一脉 络宁注射液治疗DPN40例,有效率为87.50% (P<0.05)。邓霞卩刃临床研究提示 血栓通注射液(三七总皂昔为主要成分)治疗DPN疗效良好,总有效率为8&40%。

  • 中医外治法

中医外治法包括中药熏洗、足浴、穴位贴敷等多种疗法,能在一定程度上改 善DPN患者肢端发凉、麻木、刺痛等主观症状,作用迅速,历史悠久,具有简、 便、廉、验''之特点,药物作用于局部,直达病所,且不经肝肾代谢,对合并肝 肾等脏器损害者无明显使用禁忌,与内治法相比,具有“殊途同归、异曲同工汀 之妙,在DPN防治中发挥着不可替代的作用。

李鸣鏑等[40】用糖痛方(生黄罠、川茸、川牛膝、片姜黄、桂枝等)熏洗 治疗DPN患者31例,总有效率为45.20%。王建伟⑷]用三藤二草汤(络石藤、 鸡血藤、忍冬藤、伸筋草、透骨草、艾叶、桃仁、红花)足浴治疗DPN40 例,总有效率92.50%,优于对照组的57.50% (P<0・05)。黄俊臣等刚用足浴2 号方(黄罠、当归、红花、鸡血藤、没药、甘松、海风藤、透骨草、威灵仙)足 浴治疗DPN 69例,显效53例,有效12例,无效4例,总有效率94.20%。王学 铐⑷】用透骨散(透骨草、寻骨风、乌梢蛇、补骨脂、桂枝、桑枝、艾叶)熏 洗治疗DPN 53例,患者症状、体征及神经传导速度方面都有较大改善,总有效 率90.57%o陈翠芝等屮]用足痹通络方(当归、桂枝、细辛、透骨草、赤芍、红 花、鸡血藤)足浴治疗DPN45例,总有效率达91.10%,临床疗效明显优于对照 组(PV0.05) o

  • 针灸治疗

周超昭通过针刺双侧曲池、外关、合谷、三阴交、足三里、肾俞、胰月俞、脾 脸。治疗4周后,观察组总有效率为94.34%。卓晓纯【他选用腹针联合十二井穴 放血疗法,总有效率达86.7%,显著优于对照组的60% (PV0.05)。吴明娟【例 等采用针刺治疗DPN患者44例,主穴为胰月俞、脾月俞及肾腌,另外还包括上肢穴 位(外关、曲池、合谷等)与下肢穴位(足三里、三阴交、血海等),治疗结束 后,观察组总有效率为95.45%0汤娜、班颖等【创采用雷火灸中医技术操作治疗, 分别在治疗后3d、7d使用疼痛VAS评分法Barthel评定对比患者日常生活活动 能力,与对照组比较,治疗组患者VAS疼痛评分改善明显,差异具有统计学意 义(PvO.Ol)。

  • 小结

综上所述,近年来中医药如专方、中成药、中药注射液、针灸等在DPN的 治疗中都取得了一定的成就。然而,通过总体文献报道来看,目前研究仍然存在 一些问题:(1)目前研究多停留于小样本的临床疗效观察,缺乏大样本、多中 心的临床研究与深层次的基础研究。(2)各家学术思想众多,对于DPN的辨证 分型及疗效评定尚无统一的标准。因此,今后研究应建立规范的辨证分型,开展 大样本多中心的临床研究,加强中医药对糖尿病病周围神经病变作用机制的基础 研究等等,从而能够更好地发挥中医药在防治DPN中的重大价值。

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第二部分临床研究

  1. 研究对象

1.1病例来源

选取2016年12月-2018年12月至中国中医科学院广安门医院、首都医科大 学宣武医院内分泌科门诊就诊患者,符合本次研究的纳入标准,共计60例。

1.2病例选择标准

1.2.1西医诊断标准

1・21糖尿病诊断标准

采用1999年WHO糖尿病专家委员会提出的诊断标准⑴。具体为:糖尿病 的症状加任意时间血浆葡萄糖>ll.lmmol/L (200mg/dl),或空腹静脉血浆葡萄 糖(FBG) >7.0mmol/L (126mg/dl),或OGTT试验中,2小时静脉血浆葡萄糖 >1 l.lmmol/L (200mg/dl)。

注:以上三项标准中,只要一项达到标准并在随后的一天选择上述三项中的任何 一项重复检查也符合标准者,即可确诊为糖尿病。

1・22糖尿病周围神经病变的诊断标准

参照2009年《糖尿病周围神经病变诊疗规范》⑵

(1) 明确的糖尿病病史。

(2) 在诊断糖尿病时或之后出现的神经病变。

(3) 临床症状和体征与DPN的表现相符。

(4) 以下5项检查中如果有2项或2项以上异常则诊断为DPN:温度觉异常; 尼龙丝检查,足部感觉减退或消失;震动觉异常;踝反射消失;神经传导速度有 2项或2项以上减慢。

排除其他病变,如颈腰椎病变(神经根压迫、椎管狭窄、颈腰椎退行性变)、 脑梗塞、格林-巴利综合征、严重动静脉血管病变(静脉栓塞、淋巴管炎)等,

尚需要鉴别药物尤其是化疗药物引起的神经毒性作用以及肾功能不全引起的代 谢毒物对神经的损伤。

1.2.2中医诊断标准

参照中华中医药学会糖尿病分会2016年制定的《糖尿病周围神经病变中医 临床诊疗指南》⑶、2002年《中药新药临床研究指导原则(试行)》⑷及中华中 医药学会2011年颁布的《糖尿病周围神经病变的中医防治指南》⑸。

气虚证:倦怠乏力、气短懒言、自汗多汗、腰膝酸软。

血瘀证:肢体麻木、肢体刺痛、肢端发凉、肌肤甲错。

舌脉象:舌质淡紫、或舌有紫斑、或舌下络脉怒张,苔薄白,脉沉涩。

满足气虚、血瘀证各两项,结合舌脉即可诊断。.

1中医症状积分表
症状体征 无 轻度 中度 重度
倦怠乏力 不耐劳力 可坚持体力劳动 勉强支持日常活动
气短懒言 劳累后气短 一般活动即气短 懒言,不活动也气短
自汗多汗 活动后多汗 不活动也易出汗 平素汗湿衣被
腰膝酸软 稍有,不影响活动 较明显,活动减少 症状明显,不欲活动
肢体麻木 肢端发麻 持续麻木,仅限手足 膝以下或肘以下持续麻木
肢体刺痛 肢端偶尔刺痛 肢端持续刺痛 肢端持续刺痛,难以入寐
肢端发凉 肢端不温 肢端寒凉,身畏寒 肢冷畏寒,得温难减
  皮肤粗糙不起鳞屑, 皮肤粗糙起鳞屑, 皮肤粗糙,鳞屑脱落,下
肌肤甲错 下肢皮肤颜色加深 下肢皮肤呈紫纟甘色 肢皮肤呈紫黑色

无无症状者计0分,轻度计2分,中度计4分,重度计6分。

1.2.3病例纳入标准

  • 符合糖尿病诊断标准;
  • 符合糖尿病周围神经病变的诊断标准;
  • 符合中医气虚血瘀证的诊断标准;
  • 年龄范围在18・70岁之间;

(5) 愿意接受本治疗方案,已签知情同意书,能遵医嘱坚持完成治疗者;

(6) 临床资料完整;

1.2.4病例排除标准

(1) 不符合病例纳入标准者;

(2) 年龄在小于18岁以及大于70岁者;

(3) 妊娠、准备妊娠或哺乳期妇女;

(4) 由于其他原因(职业性、药物性、营养性、中毒性或感染性等)导致 的多发性神经病或炎;

(5) 过敏体质,或对本研究课题中药过敏者;

(6) 一个月内反复出现低血糖反应,有糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等 急性并发症或严重感染者;

(7) 具有严重的心、脑、肾等慢性并发症或其他系统有严重疾病的患者;

(8) 2型糖尿病以外的其他类型的糖尿病;

(9) 受试者依从性差,未按规定服药或不愿意配合完成相关检查的患者;

(10) 精神类疾病者;

(11) 近3个月内有合用其他治疗糖尿病周围神经病变药物者;

125病例剔除标准

(1) 纳入后发现不符合纳入标准的病例,需予以剔除。

(2) 受试者未按规定用药、资料不全、发生严重不良事件或特殊生理变化不宜 继续受试者、自动退出者均应剔除。

1.2.6病例脱落标准

(1) 实验过程中,受试者依从性差,影响有效性和安全性评价者;

(2) 发生严重不良事件、并发症和特殊生理变化,不宜继续接受试验者;

(3) 试验过程中自行退出者;

(4) 因其他各种原因疗程未结束退出试验、失访或死亡的病例;

(5) 资料不全,影响有效性和安全性判断者;

1.2.7脱落病例处理

  • 当患者脱落后,应釆取登门、预约随访、电话、信件等方式,尽可能与 患者联系,询问理由、记录最后一次服药时间、完成所能完成的评估项目。
  • 因过敏或其他不良反应、治疗无效而退出试验病例,应根据患者实际情 况,采取相应的治疗措施。
  • 脱落病例均应妥善保存有关试验资料,既作留档,也是进行全分析集统 计所需。脱落患者无需另补。

2 •研究方法

2.1分组

根据随机对照原则,将符合纳入标准的病例,分为治疗组和对照组各30例。

2・2治疗方法

  • 治疗方案

两组患者都采用常规的基础治疗,包括进行健康教育、合理饮食、适当运动、 控制血糖、血压等。

对照组:基础治疗+西药常规降糖治疗+甲钻胺片,每次0.5mg, 3次/日,口 服;

治疗组:对照组基础上+益气活血中药糖痛方治疗,每日一剂,水煎服,分 2次温服;

  • 药物来源

甲钻胺片:华北制药股份有限公司,国药准字H20031126o

糖痛方:由生黄罠30g,桂枝10g,白芍10g,细辛3缶土鳖虫10g,姜黄15g, 川茸10g组成,饮片由中国中医科学院广安门医院中药房提供。

  • 疗程:每4周为1个疗程,两组均观察3个疗程。

(1) 一般项目
2.3
观测指标

包括年龄、性别、身高、体重、病程等情况。

(2) 疗效性指标

中医临床症状积分、神经传导速度、空腹血糖(FPG)、餐后血糖(PBG)、 糖化血红蛋白(HbAlc)、血脂水平(CHO、TG、LDL-C)等指标。

(3) 安全性指标

血常规、尿常规,肝肾功能,心电图,并询问患者有无自觉不适症状。

2.4疗效判断标准

2.4.1中医证候疗效评定标准

参照《中药新药临床研究指导原则》⑸和国家中医药管理局颁布的《中医病 证诊断疗效标准》⑹制定:

临床痊愈:中医临床症状、体征消失或基本消失,证候积分减少>90%; 显效:中医临床症状、体征明显改善,证候积分减少>70%;

有效:中医临床症状、体征均有好转,证候积分减少N 3 0%;

无效:中医临床症状、体征均无明显改善或加重,证候积分减少<3 0%; 注:计算公式(尼莫地平法)为:[(治疗前积分一治疗后积分)/治疗前 积分]xl00%o

2.4.2综合疗效评定标准

显效:患者临床症状明显好转,中医证候积分减少>70%;肌电图神经传导 速度提高5m/s以上;

有效:患者临床症状有所改善,中医证候积分减少>30%,但V70%;肌电 图神经传导速度提高5 m/s以内;

无效:患者临床症状无改善,中医证候积分减少不足30%;肌电图神经传 导速度无提高。

2.5安全性评价标准

1级:安全,无任何不良反应。

2级:比较安全,如有不良反应,不需要做任何处理可继续给药。

3级:有安全性问题,有中等程度的不良反应,做处理后可继续给药。

4级:因不良反应中止服药。

2.6统计学方法

  • 采用SPSS 19.0统计软件进行分析:
  • 计量资料,釆用均数土标准差(匚土s)表示,对于满足正态性和方差齐性的 数据釆用独立样本的检验,对于不满足正态性和方差齐性的数据釆用非参数秩和 检验。
  • 计数资料,四格表数据釆用x2检验,等级资料釆用秩和检验。显著性水平 设定为a=0.05o

3 •研究结果

疗程结束后,两组共脱落7例患者,实际完成试验53例,其中治疗组27 例,对照组26例。

3.1 一般资料分析

3.1.1性别比较

治疗组的男性为16例,占59.3%,女性为11例,占40.7%;对照组的男性 为14例,占53.8%,女性为12例,占46.2%0经过卡方检验,P=0.691>0.05, 表明两组性别构成比较,不存在统计学差异,具有可比性。见表2,图2。

表2两组患者性别的比较

性别

组别 人数 男(人数/百分比) 女(人数/百分比) P值

32年龄比较
图2 两组患者性别的比较

两组患者年龄服从正态分布,采用独立样本t检验,P=0.641>0.05,表明两 组患者年龄不存在统计学差异。见表3.

表3 两组患者年龄比较
组别 人数 平均年龄(三土S P
治疗组 27 55.43±9.11 0.641
对照组 26 56.57±9.60  

3.1.3糖尿病病程比较

治疗组糖尿病病程5年以内(含5年)患者人数为4例,5至10年之间患 者人数为5例,10年以上(含10年)患者人数为18例;对照组糖尿病病程5 年以内(含5年)患者人数为4例,5至10年之间患者人数为6例,10年以上 (含10年)患者人数为16例。经统计学分析,两组患者糖尿病病程比较,差异 无统计学意义(P>0.05) o见表4,图3。

表4 两组患者糖尿病病程比较

组别 人数 S5年 5-10 年 210年 平均病程(三士S) P值
治疗组 27 4 5 18 11.22±4.50 0.992
对照组 26 4 6 16 11.50±4.99  

两组患者病程比较

3.1.4体重指数比较

治疗组平均 BMI 26.61i2.88 kg/m2,对照组平均 BMI26.72±3.28 kg/m2, 两组比较不存在统计学差异(P>0.05),具有可比性。见表5。

表5 两组患者BMI比较(V±s)

组别 人数 平均 BMI (kg/m2) P值
治疗组 27 26.61i2.88 0,874
对照组 26 26・72±3・28  

3.2临床疗效比较

3.2.1单项中医症状积分比较

治疗前,治疗组与对照组在中医单项症状积分比较上,差异无统计学意义

(P>0.05) o治疗后,治疗组可明显改善患者倦怠乏力、气短懒言、自汗多汗、 腰膝酸软、肢体麻木、肢体刺痛、肢端发凉、肌肤甲错等症状,与治疗前比较, 存在明显统计学差异(PVI01),且在改善倦怠乏力、气短懒言、自汗多汗、肢 体麻木、肢体刺痛等气虚血瘀症状上疗效优于对照组,差异具有统计学意义

(P<0.05);对照组仅在缓解患者肢体麻木、肢体刺痛两个症状上疗效显著

(P<0.01) o 见表 6・1、6-2. 6-3,图 4・1、图 4・2、图 4・3。

表6-1 两组患者单项中医症状积分比较

组别 N   倦怠乏力 气短懒言 自汗多汗
  治疗前 3.60±1.99 3.20±1.94 3.27±1.34
治疗组27        
  治疗后 2.07±1.53▲“ 2.13±1.42 2.34±1.52▲“
  治疗前 3.67±1.67 3.33±1.92 3.20±1.63
对照组26        
  治疗后 3・13±1.55 3.01±1.72 3・12±1・55

表6-2 两组患者单项中医症状积分比较
图4-1 两组患者单项中医症状积分

组别 N 腰膝酸软 肢体麻木 肢体刺痛
治疗前 3.00±1・80 3.33±1.69 3.80±1.21
治疗组27      
治疗后 1.53±1.36" 1.60±1・43" 2.00±1.05▲▲“
治疗前 2.87±1.46 3.13±1.55 3.87±1.57
对照组26      
治疗后 2.33±1.49 2.33±l・30i 2.87±1.01"

图4・2两组患者单项中医症状积分

表6-3 两组患者单项中医症状积分比较

组别 N 肢玄揣发凉 肌肤甲错
  治疗前 3.13±1.80 2.40±1.43
治疗组 27    
  治疗后 1.53±1.46・ 1・31±1・25▲“
  治疗前 3.00±1.88 2.20±1.77
对照组 26    
  治疗后 2.40±1.43 1.97±1.66

注:治疗前后比较▲ P<0.05, AAP<0.01;治疗后,治疗组与对照组比较*P<0.05 ,

图4-3两组患者单项中医症状积分

3.2.2中医症状总积分比较

在中医症状总积分比较上,两组患者治疗前不存在统计学差异,具有可比 性(P>0.05)经药物干预后,治疗组患者中医症状总积分较治疗前明显下降

(P<0.01),而对照组患者中医症状总积分未见明显改变(P>0・05),与对照组 比较,治疗组在改善中医症状上疗效显著(PV0.01),差异具有统计学意义。见 表7,图5。

表7 两组患者中医症状总积分比较

组别 N 中医症状总积分
    治疗前 25.73±7.39
治疗组 27 治疗后 14.67±5”05
    治疗前 24.93±7.39
对照组 26 治疗后 22.87±5.32

3.2.3综合疗效比较
图5 两组患者中医症状总积分

经药物治疗后,治疗组综合疗效为:显效11例,有效10例,无效6例。对 照组综合疗效为:显效6例,有效7例,无效13例。治疗组总有效率达到力.78%, 优于对照组的50%,与对照组比较差异具有统计学意义。见表8,图6。

表8 两组患者综合疗效比较

组别 N 痊愈 显效 有效 无效 总有效率
治疗组 27 0 11 10 6 77.78% *
对照组 26 0 6 7 13 50%

注:治疗组与对照组比较*P<0.05o

图5 两组患者综合疗效

3.2.4血糖相关指标比较

治疗前,比较两组患者FPG、2hPG、HbAiC水平,两组间不存在统计学差 异(P>0.05),表明二者具有可比性。治疗后,两组患者FPG、2hPG、HbAiC 水平与治疗前比较,未见明显改变(P>0.05);组间比较,差异无统计学意义 (P>0.05) o 见表 9。

表9 两组患者血糖相关比较

组别 N FPG (mmol/L) PBG (mmol/L) HbAiC (%)
  治疗前 7.69±1.16 11.08±1.53 7.39±1.13
治疗组 27      
  治疗后 7.73±1.23 11.02±1.45 7.42±1.08
  治疗前 7.72±1.08 11.14±1.50 7.36±1.04
对照组 26      
  治疗后 7.66±0.99 11.06±1.47 7.40±1.01

注:治疗前后比较aP<0.05, ▲▲PvO.OI;治疗后,治疗组与对照组比较*P<0.05 ,

**P<0.01o

325脂代谢指标比较

治疗前,比较治疗组与对照组患者的CHO、TG、LDL-C水平,两组间不存 在统计学差异(P>0.05),表明两者具有可比性。治疗后,两组患者的CHO、 TG、LDL-C水平与治疗前比较,未见明显改变(P>0.05),差异无统计学意义。 见表10o

表9 两组患者脂代谢指标比较

组别 N CHO (mmol/L) TG (mmol/L) LDL-C (mmol/L)
    治疗前 5.29±0.90 1.75±0.62 3.32±0.39
治疗组 27        
    治疗后 5.24±0.91 1.74±0.59 3・29±0.35
    治疗前 5.22±0.94 1.78±0.59 3.30±0.45
对照组 26        
    治疗后 5.26±0.90 1.76±0.48 3.28±0.36

注:治疗前后比较aP<0.05, ▲▲P<0.01;

3.2.6神经传导速度比较

治疗前,治疗组与对照组患者在胫神经、腓总神经、腓浅神经、腓肠神经传 导速度比较上,均不存在统计学差异(P>0・05) o治疗后,两组患者神经传导速 度与治疗前比较,均有显著提高(PV0.01),且治疗组在改善神经传导速度方面 疗效明显优于对照组(P<0.01) o见表11,图6。

表11两组患者神经传导速度比较

MNCV (m/s) SNCV (m/s)

组别 N —_

胫神经 腓总神经 腓浅神经 腓肠神经

  治疗前 3&05±1.32 3& 12±1.29 38.51il.07 38.52±0.99
治疗组 27          
    治疗后 41.57±1.03— 41.08±0.99" 41.45±0.84▲▲” 41.50±1.15"
    治疗前 38.18±1.29 3&46±1.28 3 & 65±0.92 3&36±0.70
对照组 26          
    治疗后 39.92±1.21- 40・36±1.04— 40.67±0.89^ 40.52±0.88^

注:治疗前后比较aP<0.05, ▲▲P<0.01;治疗后,治疗组与对照组比较*P<0.05 ,

甸治疗组治疗前

0治疗组治疗后 /■对照组治疗前

Q对照组治疗后

图6两组患者神经传导速度

3.3安全性指标

3.3.1肝功能比较

治疗前,比较治疗组、对照组患者AST、ALT,差异均无统计学意义(P>0.05); 治疗后,治疗组与对照组患者AST、ALT水平与治疗前比较无明显变化,且两 组间比较差异无统计学意义(P>0.05) o见表12。

表12 两组患者ALT、AST比较

组别 N ALT (U/L) AST (U/L)
    治疗前 20.00±3.18 21.81±2.39
治疗组 27 治疗后 19.92±2.84 21.59±2.21
    治疗前 19.90±3.71 21.52±2.24
对照组 26 治疗后 19.51±3.50 21.41±1.95

3.3.2肾功能比较

治疗前,比较两组患者CR、BUN,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗 后,治疗组与对照组患者CR、BUN水平与治疗前比较无明显变化,且两组间比 较差异均无统计学意义(P>0*05) o见表13。

表13 两组患者Ci*、BUN比较
组别 N CR (umol/L) BUN (mmol/L)
  治疗前 56.98±13.66 5.82±1.09
治疗组 27    
  治疗后 55.37±10.74 5.73±1.01
  治疗前 55.47±11.28 5.78±0.94
对照组 26    
  治疗后 54.47土 8.32 5.74±0.86

4 •讨论

糖尿病是全球周围神经病变的主要原因,积极控制血糖是治疗DPN最根本 和最重要的手段,早期积极有效的神经修复与积极严格的控制血糖同样重要,也 是DPN必不可少的干预措施。

4.1对照药的选择

本次研究我们选择甲钻胺作为对照,虽然目前对DPN治疗药物进行了大量 的研究,但很少有药物被明确证实具有促进DPN患者神经再生的功能。甲钻胺 是一种内源性的辅酶B12,参与一碳单位循环,在由同型半胱氨酸合成蛋氨酸的 转甲基反应过程中起重要作用⑺。既往研究表明,甲钻胺可参与核酸、蛋白质、 脂类代谢【叫易被神经细胞的亚微结构,如细胞核、线粒体等摄取,促进神 经细胞内核酸、蛋白质和神经髓鞘磷脂的合成,促进轴突运输功能和轴突再 生,加速突触传递的恢复和脑内乙駄胆碱含量的正常化,从而修复被损伤的 神经组织【9•叫现临床广泛应用于糖尿病引起的周围神经病变,如Shibuya等人 研究证实对于患有周围神经病和慢性轴突变性的患者,静脉内超高剂量甲钻胺治 疗是安全且潜在有效的疗法〔⑴。但是Yaqub BA等人在一项双盲研究中发现患者 容易耐受甲钻胺,4个月后的运动和感觉神经传导无统计学改善I】铁 4.2立论依据

DPN隶属于中医“消渴痹症”范畴,东汉时期张仲景就有关于“血痹”描述, 与DPN临床表现颇为相似。《金匮要略•血痹虚劳病脉症并治第六》云:“血痹阴 阳俱微,寸口关上微,尺中小紧,外证身体不仁,如风痹状…二祖国医学认为 消渴日久,伤阴耗气,气虚血液运行无力,而导致血痹(血瘀)。瘀血内停,脉 络瘀阻,气血不能通达四末,四肢肌体失于温养而发生麻木,肢端发凉甚至肢体 刺痛。其中医病机“瘀血内停,脉络瘀阻^与现代医学神经缺血、缺氧、血液粘滞 度增加的病机特点十分吻合。

我国著名的中西医结合糖尿病专家,中国中医科学院首席研究员林兰教授, 根据几十年的临床实践,将DPN分为四型辨证论治〔"I。益气活血中药“糖痛方" 是林兰教授治疗气虚血瘀型DPN的经验方,临床应用已有20余年,前期临床 实践表明其能提高神经传导速度,改善患者临床症状,减轻局部不适,疗效较为 确切[⑷⑸。此外,动物实验也证实糖痛方可提高DPN大鼠坐骨神经传导速度,其 可能的机制为降低血浆sICAM-1、MPO,坐骨神经ICAM-1. TNF-a. MPO以及 8-OHdG的表达,减弱血管神经组织的氧化应激和炎症反应卩叫 糖痛方是由生黄 罠、桂枝、白芍、姜黄、土鳖虫、细辛、川莒七味药物组成,配伍精当,温补、 散邪、通经三者并用,为治疗消渴痹症之常用方。

4.3组方分析及现代药理研究

生黄罠性微温,味甘,《医学衷中参西录》言:“能补气,兼能升气…", 为补中益气要药。《本经疏证》云:“浚三焦之根,利营卫之气,故凡营卫间 阻滞,无不尽通。”气能生血、气能行血,可有效改善营血虚滞证候,在方中用 为君药。现代药理研究表明,生黄罠主含黄罠皂昔、黄罠多糖、氨基丁酸以 及多种微量元素山],黄罠多糖能够明显降低2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠的血糖, 以及血清TG、CH、LDL含量,升高血清HDL含量,改善体内脂质代谢紊乱阴。 其次,•清除自由基,抗脂质过氧化,保护线粒体的结构和功能此外,黄罠 还能改善DM大鼠的血液流变学特性,从而降低血液的高凝状态,增加组织 和器官的血液供应和营养,减轻DM的微血管病变I?。]。

桂枝性温,味辛、甘,《本草经疏》曰:“实表祛邪。主利肝肺气, 头痛,风痹骨节疼痛既能温散血中之寒凝,又可宣导活血药物,以增 强化瘀止痛之效。在方中与生黄罠相配伍,用为臣药,益气温阳,和血通 经。现代药理学研究表明,桂枝含挥发油,其主要成分为桂皮醛等,在抗 炎、镇痛、减少血小板聚集、改善微循环等方面都具有显著活性,桂枝与白芍配 伍,抗炎活性显著增强0创1。

白芍性微寒,味苦酸,《神农本草经》言:“主邪气腹痛,…止痛”具有养 血敛阴,柔肝止痛之功,为臣药。现代药理学研究表明,白芍含芍药昔、轻基芍 药昔、芍药内酯昔、挥发油、牡丹酚等多种化学成分,具有抗炎、镇痛、保肝、 改善血液流变学等作用[却。体外实验发现芍药昔能减弱缺氧诱导的HEUVC损 伤,其可能通过增加eNOS活和NO的产生;抑制NF-KB的活性,减少ICAM-1 和VCAM-1的表达1旳。秦亚东等发现白芍醇提物和水提物均有镇痛作用[27]o夏 颖等发现白芍中有效成分五没食子酰基葡萄糖(pentagalloylglucose, PGG),具有 较强的清除自由基及抗氧化活性,且PGG的抗氧化作用远大于阳性对照药维生 素C【2叽

川莒性温,味辛,《本草汇言》曰:“上行头目,下调经水,中开郁结,血 中气药…尝为当归所使,非第治血有功,而治气亦神验也…味辛性阳,气善走窜 而无阴凝黏滞之态,虽入血分,又能去一切风,调一切气。”具有活血行气,祛 风止痛之功,为臣药。现代药理学研究表明,川茸含川穹嗪、阿魏酸钠、川茸内 酯等多种成分,具有扩张微血管、降低血黏度、调节血小板等功能[羽。李拮等体 外研究证实川茸水提物能显著拮抗缺氧对HEUVC的损伤卩叭保护血管内皮的功 能。林乔等发现川茸提取物对实验性痛经动物有明显的镇痛作用,其镇痛机制可 能与调节血浆PGE2, PGF2a, TXB2, 6-Keto-PGFla水平有关卩氏

姜黄性温,味辛苦,《新修本草》云:“主心腹结积,珪忤,下气,破血” 《本草纲目》言:“治风痹臂痛”,具有活血行气,通经止痛之功,为佐药。现 代药理研究表明,姜黄中主要含姜黄素、挥发油等成分,具有抗炎、抗氧化、降 低血脂血糖、修复血管内皮等作用少】。Kunwar等发现姜黄素能直接清除体内的 氧自由基卩3];杨耀光等研究表明姜黄素可以增加细胞表面LDLR的表达,增加 LDL向细胞内的转移而发挥降血脂作用张俊梅等发现姜黄胶囊可降低糖尿 病大鼠FPG、TC、TG、LDL-C,升高HDL-C,具有显著的降糖调脂作用卩习。朱 成圣等认为姜黄素具有促进内皮祖细胞NO分泌并增强eNOS表达,通过改善内 皮祖细胞的功能活性来修复COPD患者损伤的血管内皮功能〔36】。

土鳖虫性寒,味咸,《本草经疏》云:“咸能入血,故主心腹血积癥痕血闭 诸证,和血而营已通畅,寒热自除,经脉调匀…”,具有破血逐瘀,续筋接骨之 功,为佐药。现代药理研究表明,土鳖虫含氨基酸卩7〕、生物碱、不饱和脂肪酸 等活性成分,具有抗血栓、抗缺血缺氧、调节血脂等作用【3叭赵志壮等研 究发现土鳖虫冻干粉够降低高血脂家兔血清中CHO、TG、LDLC,升高HDLC, 具有良好的降血脂作用卩叭 黄镇林等证实土鳖虫活性组分F2・2能够延长急性血 瘀证模型大鼠PT/APTT,降低FIB含量、血小板聚集率与血液最大凝固程度,具 有良好的体内抗凝药效[40]。杜清华等发现f2・2在250~4000mg/L浓度范围内能 使LDH漏出率降低,显著升高SOD、GSH- Px含量,抑制MDA生成,通过抑 制脂质过氧化,提高损伤的内皮细胞NO分泌,保护血管内皮细胞⑷】。

细辛性温,味辛,《神农本草经》曰:“主咳逆,头痛脑动,百节拘挛,风 湿痹痛…”,具有解表散寒,祛风止痛之功,为佐使药。现代药理研究表明,细 辛主含挥发油、有甲基丁香酚、细辛醞等成分,具有解热、镇痛、抗炎等作用[创。 黄世佐等发现细辛水提液和挥发油均有较强的镇痛作用⑷1。袁晓琴等认为其镇 痛机制可能与降低NO、PGE2、MDA含量及NOS活性,提高SOD活性有关 [44】。何玉萍等发现细辛中所含成分B■细辛醯能降低血小板的活性,抗血小板 的聚集和黏附【4讥 4.4临床疗效分析

本研究通过对60例气虚血瘀型2型糖尿病周围神经病变患者进行12周的干 预,结果脱落7例,完成试验53例。研究显示治疗组显效11例,有效10例, 无效6例;对照组显效6例,有效7例,无效13例。治疗组总有效率达力.78%, 优于对照组的50% (P<0.05) o在改善中医临床症状方面,治疗组可明显改善 DPN患者倦怠乏力、气短懒言、肢体麻木、肢体刺痛等气虚血瘀症状,而对照 组仅在缓解患者肢体麻木、肢体刺痛两个症状上疗效明显,治疗组优于对照组 (P<0.01或PV).O5),表明在改善DPN患者主观症状上糖痛方联合甲钻胺比单 纯甲钻胺治疗更具有优势。在糖代谢、脂代谢指标方面,两组患者治疗前后FPG、 2hPG、HbAiC、CHO、TG、LDL-C水平未见明显改变,表明短期内应用糖痛方 治疗DPN无明显的降糖、降脂效应。在神经传导速度方面,治疗后,两组患者 神经传导速度与治疗前比较,均有显著提高(P<0.01),且治疗组在改善神经传 导速度方面疗效明显优于对照组(P<0.01),表明糖痛方能在一定程度上促进损 伤的周围神经修复作用,但是其具体作用机制还有待于在后期研究中进一步深入 探讨。

4.5安全性分析

运用糖痛方治疗DPN,对患者的血尿常规,肝肾功能,心电图均无明显不 良影响,表明临床应用糖痛方治疗DPN较为安全。

5・结论

1.益气活血中药糖痛方在治疗2型糖尿病周围神经病变(气虚血瘀证)患 者中,能有效改善患者气虚血瘀症状,缓解局部不适,同单纯甲钻胺片治疗相比 较,具有一定的优势。

2•治疗过程中未见明显不良反应,安全性良好,值得在今后临床及基础研 究中不断深入挖掘、推广。

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第三部分实验研究

实验一高糖对RSC96细胞凋亡的影响

1.实验材料

1.1实验细胞

RSC96细胞系,购自中国医学科学院基础医学研究所国家细胞资源中心。

1.2主要试剂

试剂 来源
DMEM高糖培养基 美国,Hyclone
DMEM低糖培养基 美国,Hyclone
FBS 美国,Gibco
PBS 美国,Coming
胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)不含酚红 中国,Solarbio
青霉素-链霉素双抗溶液 美国,Gibco
DMSO 中国,拜尔迪
D・葡萄糖 中国,Solarbio
AV/PI凋亡检测试剂盒 美国,BD公司

13主要仪器设备.实验耗材

名称 来源
T25/T75细胞培养瓶 美国,Coming
15ml/50ml离心管、2ml冻存管 美国,Coming
移液枪头 美国,KIRGEN
96孔板/12孔板/6孔板 美国,Costar
封口膜 美国,Parafilm
微量加样器 德国,Eppendorf research plus
超净工作台 北京,昌平长城空气净化工程公司
37°C、5%CO2细胞培养箱 美国,Thermo
低速离心机 中国,白洋离心机厂
倒置相差显微镜 日本,Nikon
4°C, ・2(TC冰箱 中国,海尔公司
Saitorrius BS400S 电子天平 北京,赛多利斯天平有限公司
流式细胞仪 美国,BD公司
流式细胞管 美国,BD公司

1.4主要溶液及试剂配制

  • DMEM完全培养基(500ml) : DMEM高糖培养基(4500mg/LD・葡萄 糖,谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES) 445ml+FBS 50ml+青链霉素双抗(每毫升 含10000IU青霉素、lOOOOpg链霉素)5ml;即DMEM完全培养基中含有葡萄 糖、谷氨酰胺(终浓度V4mmol/L) >丙酮酸钠(终浓度Vlmmol/L)、HEPES

(终浓度<lmmol/L)、10%的胎牛血清、100IU青霉素、lOOgg链霉素。经0.22pm 滤器过滤,50ml离心管分装后,置于4°C冰箱,保存备用。

  • 冻存液:按照DMEM培养基:FBS:DMSO=5:4:1比例,现用现配。
  • PBS用50ml离心管分装、青链霉素双抗用1.5ml EP管分装。
  • 25%胰蛋白酶用1.5ml EP管分装,置于・20°C冰箱,保存备用。灭活后 的FBS采用0.22gm滤器过滤,50ml离心管分装后,置于・20°C冰箱,保存备用。
  1. 实验方法
    • RSC96细胞复苏及培养
  • 复苏前准备:用75%的酒精擦拭超净工作台的操作台面,将细胞复苏所需 的DMEM完全培养基、移液器、培养瓶、枪头、15ml离心管等材料放入操作台 合理位置,打开紫外灯照射30mino照射完成后,点燃酒精灯,调整火焰大小。
  • 从液氮罐中快速取出RSC96细胞冻存管,手持冻存管顶端,将下端放入事 先准备好的37°C水浴中快速解冻(lmin左右),解冻过程中注意冻存液面在水 浴液面以下,并且轻轻地摇动冻存管,加速管中细胞悬液的融化,待液体完全溶 解后用含75%酒精棉球将冻存管周围水迹擦干,然后再拿入操作台中;
  • 撕去管口的封口膜,打开冻存管,用移液器将管中的细胞悬浮液(1ml)吸 入一 15ml离心管内并加入1ml DMEM完全培养基,混匀后置入低速离心机中离 心、,1000rpm/min, 5min;
  • 取出离心管,弃上清,加入2ml DMEM完全培养基,混匀后均分到2个 T25的细胞培养瓶中,再分别加入3ml DMEM完全培养基;
  • 轻轻将培养瓶口在酒精上烧一下以消毒后盖好瓶盖,将培养瓶置于37°C、 5%CO2的细胞培养箱中培养。
  • 培养24h待细胞完全贴壁后更换培养基以祛除DMSO对细胞生长的影响。
    • RSC96细胞传代及培养

显微镜下观察复苏的RSC96细胞生长状态,当细胞生长状态良好且铺满T 25培养瓶的90%时可进行细胞传代。

  • 传代前准备:将细胞复苏所需的DMEM完全培养基、PBS、移液器、培养 瓶、枪头、15ml离心管等材料放入操作台内合理位置,将超净工作台的操作台 面用75%的酒精擦拭,打开紫外灯照射30mim照射完成后,点燃酒精灯,调整 火焰大小;
  • 从培养箱中取出培养瓶,用75%的酒精棉球擦拭瓶口后置入超净工作台的 操作台面并用酒精灯外焰轻轻烧一下瓶口以消毒;
  • 轻轻打开瓶口,用移液器吸尽瓶中旧培养基后用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞

2・3次,加入1 ml 0.25%胰酶/ EDTA溶液,置于培养箱中孵育lmin左右;

  • 取出培养瓶,镜下观察细胞消化情况,见细胞周围突起回缩、变圆变亮时, 即刻加入2ml DMEM完全培养基终止消化;
  • 移液枪轻轻吹打细胞制成细胞悬液,并移至15ml离心管中,置于低速离心 机中离心,lOOOrpm/min, 5min;
  • 取出离心管,弃上清,加入4ml DMEM完全培养基,轻轻吹打制成细胞悬 液,按照1:3稀释接种到新的培养瓶中,并加入新的培养基,于瓶身记下细胞 名称,代数,传代时间,实验员姓名等信息;
  • 用酒精灯消毒瓶口,显微镜下观察细胞接种密度后置于3代、5%CO2的培 养箱中,一般1・2天换一次液,2-3天传一次代。取处于对数生长期的RSC96细 胞进行后续实验。

23高糖对RSC96细胞凋亡的影响

  • 用DMEM完全培养基和D・葡萄糖粉配制3种不同浓度的高糖培养基:

50mmol/ L、75mmo" L、1 OOmmol/ L ;

  • 取对数生长期的细胞按照细胞传代的(1) -(5)步骤操作,收集细胞;
  • 取岀离心管,弃上清,加入适量DMEM完全培养基,轻轻吹打制成细胞 悬液,并计数;
  • 调整细胞浓度,以5xl04每孔的浓度接种于6孔板中,分为4组,每组3 个复孔;
  • 待细胞完全贴壁后,吸净原培养液,加入不同浓度的培养基(25mmol/L、 50mmol/L、75mmol/L 1 OOmmol/L ),放入培养箱中培养48h,期间换液一次;
  • 采用25%胰酶(不含EDTA)消化收集各组细胞,PBS冲洗2次,重悬 并计数,每组收集1-5 xlO5个细胞,低速离心机lOOOrpm/min,离心5min;
  • 加500吐稀释1倍的Binding Buffer并轻轻重悬细胞,加入5 pL

AnnexinV-FITC混匀,再加入5 |iL PI混匀,室温下避光反应10~15min后筛网 过滤;

(8) 1 h内进行流式细胞仪检测,激发波长488 nm,发射波长530 nm,按照试 剂盒说明书进行操作。应用流式软件分析结果,左上象限为坏死细胞,左下象限 为正常细胞,右上象限为晚期凋亡细胞,右下象限为早期凋亡细胞。实验重复3 次。

(9) 计算细胞凋亡率[凋亡细胞数一(凋亡细胞数+正常细胞数)xl00%]o

  1. 统计方法

数据处理采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料以均数土标准差(?土s) 表示,多组间比较采用ANOVA方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

4 •实验结果

经不同浓度葡萄糖干预48h后,与正常对照组比较,G50、G75、G100组 RSC96细胞凋亡率明显增加,以晚期凋亡为主(aP<0.05或▲▲P<0.01),差异 具有统计学意义。且细胞调亡率随着葡萄糖浓度升高而增加,呈现明显的正相关 性。见表1、图2。

表1 高糖对RSC96细胞凋亡的影响

组别 细胞凋亡率(7±s)

Con 组(25mmol/L) 3.60±0<79

G50 组(50mmol/L) 6.92±0.38*

G75 组(75mmol/L) 8.56±0.42"

G100 组(100mmol/L) 9・59±0・74"

注:与对照组比较,aP<0.05, aaP<0.01o

图2不同高糖浓度下细胞凋亡情况

实验二 糖痛方对高糖状态下RSC96细胞凋亡的影响

  1. 实验材料

1.1实验细胞

同实验一。

1.2主要试剂

同实验一。

13主要仪器设备、实验耗材

同实验一。

  1. 实验方法

2.1糖痛方药物制备

(1) 将糖痛方(生黄罠30g、桂枝10g、白芍10g、细辛3g、土鳖虫10g、姜 黄15g、川茅10g组成),饮片由康美药业提供,煎取水煎液,浓缩为约lg/mL 浓度,本院煎药室提供。

(2) 冷却后,3000 r/min,离心15min,取上清液,0.22|im滤器过滤,-20°C 保存备用。

2.2糖痛方对高糖培养的RSC96细胞凋亡的影响

(1) 根据实验一中筛选的高糖浓度,选取50mmmol/L高糖培养基作为诱导 RSC96细胞凋亡损伤浓度。

(2) 采用上述实验所用的50mmmol/L DMEM高糖培养基配置lmg/mL糖痛方 培养基。

(3) 按照实验一中的步骤,培养出生长状态良好的RSC96细胞,收集细胞,并 重悬;

  • 调整细胞浓度,以5xl04每孔的浓度接种于6孔板中,分为2组,每组3 个复孔;
  • 待细胞完全贴壁后,吸净原培养液,加入不同浓度的培养基(G50、 G50+lmg/mlTTF),放入培养箱中培养48h,期间换液一次;
  • 干预48h后,按照实验一中步骤收集细胞,进行流式细胞术检测。
  1. 实验结果

经糖痛方干预48h后,G50+TTF组细胞凋亡率下降,同治疗前比较,差异 具有统计学意义("<0.05)。见表2、图2

表2 糖痛方对高糖对RSC96细胞凋亡的影响
组别 细胞凋亡率(7±s)
G50组 6.91±0.17
G50+TTF 组 5.33±0.92a
注:与治疗前比较, aP<0.05o

图2 糖痛方对高糖诱导的RSC96细胞凋亡的影响

4・讨论与结论

1965年Lockshin等人最早发现细胞凋亡这一现象,1972年Kerr等首先提出 细胞凋亡的概念C细胞凋亡或称程序性细胞死亡,是指局部环境生理或病理性变 化引起的、由自身内部机制调节的一种主动的、按~定程序进行的细胞自发性死 亡方式⑴,发生在生命个体生长发育的各个阶段。有利于清除有害的、多余的、 无用的细胞,维持器官、组织、细胞数目相对平衡,在肿瘤、神经退行性疾病、 AIDS、中风、心肌梗塞、自身免疫疾病的发生发展中扮演重要的角色。

DPN以四肢远端对称性感觉和运动障碍,运动、感觉神经传导速度减慢以及 髓鞘和轴突变性为特点。其病理显示节段性脱髓鞘改变与雪旺细胞损害,同时伴 有明显的神经内膜微血管病。细胞凋广是细胞损伤的早期表现,周闱神经受到损 伤,或出现病变时,神经细胞会发生凋亡口。

DPN同时存在轴突及雪旺细胞的功能异常,而轴突功能异常部分是由 雪旺细胞功能异常及支持作用减弱引起的⑶。雪旺细胞是周闱神经系统特有 的神经胶质细胞,在周闌神经的损伤、再牛和修复中貝有重要的作用,可合成 和分泌多种神经营养内子,如神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子 (Ciliary neurotrophic factor,CNTF)、神经营养素(Neurenergen.NT )等, 其凋亡与DPN的发半密切相关据报道,高糖状态下培养的雪吐细胞, 能通过诱导触发氧化应激,激沽线粒体途径损伤细胞和促进细胞凋广。閃 此,氧化应激和线粒体功能障碍是细胞凋广的帀[要川动因素,Vincent等研 究显小在STZ诱导的DM大鼠模型屮,可见糖尿病背根神经节细胞(DRG) 和雪旺细胞典型的凋亡变化及线粒体畴的肿胀和破裂,而且在DPN患者腓 肠神经活检时也可见到线粒体悄的肿胀和破裂⑸。既往研究发现,由雪旺 细胞填充神经导管在大鼠正中神经2cm缺损的干预过程屮具有诱导周围神 经系统再生的币;要作用⑹,但对长的神经缺损莫再生潜力仍然受限⑺。

高糖状态下诱导的雪旺细胞是研究DP\•的良好体外模型【"I,本次研究我们 选取的RSC96细胞系,是原代大鼠雪旺细胞经长时间培养后自发转化而成 的永生化细胞2川,查阅相关文献高糖干预浓度们0・150Mm不等木次研 允我们选定25Mm、50Mm> 75Mm> lOOMmH个梯度浓度进行筛选,由于所用 R3C96细胞株购买时培养环境为4.5g/LDMEM高糖培养基,故选取25Mm为止常对 照组。

对于细胞凋亡的检测,我们采用流式细胞仪(flow cytometry, FCM).磷脂酸 结合蛋白V (Annexin V) /PI双染法,1980年Lemgbois首先使用FCM分析了 凋亡细胞的染色体[⑶,FCM可对浮在液相中且分散着的生物细胞进行定性、定 量分析与分选,不仅速度快、敏感性和精确度高,而且对于不同细胞发生凋亡进 度不同的过程,FCM的检测更准确[⑷。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS), 位于正常细胞膜内侧,在细胞凋亡早期,PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面 【⑴。Annexin V是一种+依赖性磷脂结合蛋白,可与PS特异性结合,且亲和 力高。用荧光素或生物素标记的Annexin V作为荧光探针,采用FCM或荧光显 微镜进行检测,适用于细胞凋亡早中期。碘化丙噪PI是一种核酸染色剂,不可透 过正常的细胞膜,可透过凋亡中晚期以及坏死细胞的细胞膜,与细胞核结合将细 胞核染为红色,适用于在排除细胞坏死的前提下细胞凋亡中晚期检测[⑹。将 Annexin V与PI同时使用,有助于区分凋亡早晚期的细胞以及死亡细胞【皿1戮

本次研究发现,随着培养基中葡萄糖浓度的升高,RSC96细胞凋亡增加, 高糖组细胞主要分布在右上象限,以晚期凋亡细胞为主。实验中未能排除高渗透 压所致的干扰,而杨春梅等人研究表明高糖可诱导雪旺细胞的损伤,这与高 糖引起的高渗透压无关,而与雪旺细胞内氧化应激水平升高引起的细胞毒 性有关[⑻。RSC96细胞在50Mm高糖浓度中培养48h发生了明显的凋亡,因此 我们选取50Mm高糖浓度作为诱导RSC96细胞凋亡损伤浓度,以糖痛方(lmg/ml) 终浓度进行干预48h,研究结果显示糖痛方可以抑制高糖所致的RSC96细胞凋 亡。在前期研究中我们发现糖痛方含药血清对高糖导致的SCs增殖能力下降具有 显著的逆转作用[19〕。据此,我们推测糖痛方治疗DPN的可能机制是促进高糖刺激 下的RSC96细胞增殖,抑制细胞凋亡;但是对于其发挥作用的分子机制,通过哪 一信号转导通路实现,有待于在后续实验中进一步研究。

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问题与展望

1・本次临床研究共纳入60例DPN患者,样本量偏小;其次,以4周为一个 疗程,两组共观察3个疗程,观察时间偏短;再者,研究病例来源于中国中医科 学院广安门医院和首都医科大学宣武医院内分泌门诊,地域分布局限,分中心少, 研究结果可能存在一定的误差,有待于在后期开展大样本、多中心、随机双盲对 照临床研究。

  1. 本次实验研究方案的设计上还有待于进一步完善,对于诱导RSC96细胞凋 亡损伤模型中高糖浓度的筛选,只观察了 48h这一时间点,后期研究中还有待于 观察RSC96细胞在不同高糖环境中、不同时间点的凋亡情况;对于细胞凋亡检 测只是单一采用流式细胞仪、磷脂酸结合蛋白V( Annexin V) /PI双染法,在后 期研究中可结合免疫组化、透射电镜等进行细胞凋亡的形态学检测,Western Blot 和RT-PCR法等检测凋亡通路相关分子Bcl・2、Caspase-9. Caspase-3的基因和蛋 白表达,以更好地对RSC96细胞凋亡进行全面多方位探讨。

3•以中药复方糖痛方进行干预,但对于糖痛方上清液中具体药物成分未进行 进一步检测分析,在后期研究中有待于通过质谱仪测定以明确糖痛方的有效成 分。

  1. 基础实验中对细胞凋亡探讨只停留于表面观察,缺乏其作用机制的深入研 究,如具体通过哪一信号转导通路实现,有待于在后续研究中进一步完善。

致谢

硕士研究生的学习即将结束,三年的时光如白驹过隙,有过憧憬、有过迷茫。 值此论文完成之际,献上我诚挚的谢意。衷心的感谢三年来关心和帮助过我的老 师、同学和朋友们。

首先衷心感谢我的导师李鸣鏑主任医师,在我攻读硕士研究生期间,您在百 忙之中始终给予我悉心的指导和亲切的关怀,引领我不断学习和探索,在我的理 论学习、课题设计、论文撰写、临床学习中都倾注了大量的心血,使我能得以顺 利完成硕士期间的学习和工作。您渊博的知识、严谨的科学态度、精益求精的工 作作风深深地感染和激励着我,为我树立了终生学习的典范,对我今后的学习和 工作有着极大的帮助,是我今后人生前进的目标。

感谢广安门医院糖尿病实验室、肿瘤实验室老师、师兄、师姐们对我毕业课 题的悉心指导,感谢首都医科大学宣武医院鲁梅花主任医师在科研道路上给予的 帮助和支持。

感谢中国中医科学院、广安门医院的培养,感谢临床各科室的带教老师们, 感谢老师们提供的每个临床实践机会,硕士三年规培学习,使我受益匪浅。感谢 我的同门、师妹们,三年的学习,大家相聚在一起,朝夕相处,谢谢你们伴我渡 过了这三年的美好时光。

最后,衷心的感谢我的家人对我的关心、支持和理解,你们的鼓励和支持始 终是我前进的动力,你们永远是我避风的港湾。