海洋细菌胞外多糖EPS11抗肿瘤转移机制研究论文

2020年5月12日17:05:49海洋细菌胞外多糖EPS11抗肿瘤转移机制研究论文已关闭评论

海洋细菌胞外多糖EPS11抗肿瘤转移机制研究论文

摘要

癌症作为世界范围内的主要公共卫生问题之一,严重威胁人类生命健康,并 且其发病率和死亡率均呈现持续攀升的趋势。其中,转移作为癌症患者预后不良 的重要因素,仍然是恶性肿瘤患者的主要死因之一。目前,针对肿瘤转移的临床 治疗手段主要是化学治疗,然而市场上大多数化疗药物都存在一定的毒副作用O 长期的化疗会诱导癌细胞产生耐药性,将进一步降低化疗药物在肿瘤临床治疗中 的效果。海洋微生物多糖因其具有生物相容性好,低毒以及容易获得等优势,已 经成为海洋科学研究的重点之一,能够为研发高效低毒的抗肿瘤转移新药提供候 选化合物。EPS11是我们实验室前期发现的一种有抗肿瘤效果的海洋细菌多糖, 具有潜在的抗肿瘤转移的潜力,但相应的分子机制并不清晰。本论文结合蛋白质 组学、细胞生物学等手段从体外和体内两个层次详细研究了 EPS11抗肿瘤转移 的分子机制,为开发多糖类抗肿瘤转移药物提供了可靠的理论依据和药物前体。

本研究首先通过MTT法检测EPS 11对多种肝癌细胞的毒性,表明其能够浓 度和时间依赖性地抑制肝癌细胞Huh7.5、Bel-7402和HepG2的增殖。同时,利 用光学显微镜观察发现EPS 11能够引起肝癌细胞Huh7.5、Bel-7402和HepG2的 聚集成团、脱黏附。进而,我们通过结晶紫染色法定量检测了 EPS11对肝癌细 胞黏附率的影响,并利用扫描电镜(SEM)观察了 EPS 11对细胞表面结构的作 用。结果显示,EPS11能够浓度和时间依赖性地降低肝癌细胞的黏附能力,破坏 肝癌细胞表面的伪足状结构。细胞黏附率的降低与细胞伪足状结构数量的减少相 一致,表明细胞表面伪足状结构在肝癌细胞黏附方面扮演着重要的角色。为了深 入探究EPS 11抑制肿瘤细胞转移的功能,本研究进一步利用划痕和Transwell实 验证明了 EPS11能够通过降低肝癌细胞Huh7.5的黏附能力并破坏其表面结构而 抑制肝癌细胞Huh7.5的迁移。

本研究通过蛋白质组学全面分析了 EPS 11对肝癌细胞Huh7.5生物学的进程 影响,进一步揭示EPS 11抑制肝癌细胞Huh7.5生长增殖和转移的机制。通过数 据分析发现EPS 11作用Huh7.5细胞后,大量细胞黏附分子的表达水平显著下调。 其中,细胞黏附分子CD99下调最为显著。由于CD99在细胞增殖、黏附、迁移 以及分化等方面均发挥重要的作用,我们将其作为EPS 11作用的关键效应分子 进行深入研究。通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和Western blotting对蛋白质 组的结果进行验证,发现EPS 11在mRNA和蛋白水平上均能够显著下调CD99 的表达,尤其是在蛋白水平。进而我们在肝癌细胞Huh7.5中过表达CD99分子, 并检测此时EPS 11对肝癌细胞Huh7.5增殖率、黏附能力和迁移能力的影响,进 而验证CD99在EPS 11抑制肝癌细胞Huh7.5增殖和迁移进程中的重要性。结果 表明,过表达CD99能够部分逆转EPS 11引起的肝癌细胞Huh7.5增殖率、黏附 能力和迁移能力的降低,进一步证实CD99在EPS 11的抗肝癌转移机制中发挥着 重要作用,同时也为CD99作为肝癌靶向治疗的重要标志分子提供了证据。

为进一步探究EPS 11在体内抑制肿瘤细胞转移的效果,本研究采用黑色素 瘤细胞肺转移小鼠模型进行验证。与对照组相比,注射了 EPS 11后能够显著减 少小鼠体内黑色素瘤细胞的肺部转移灶,但并不影响小鼠的体重等生长指标,证 实了 EPS 11在动物体内具有良好的抗肿瘤转移的作用效果,是一个潜在的抗肿 瘤转移候选药物。

关键词:海洋细菌,多糖EPS11,癌症,黏附,转移

ABSTRACT

Cancer, as one of the major public health problems in the world, has seriously threatened human life and health, and its morbidity and mortality rates continue to rise. Metastasis, as the main factor of poor prognosis in cancer patients, is still one of the main causes of death in patients with malignant tumors. Nowadays, the clinical treatment for tumor metastasis is mainly through chemotherapy. But most of the chemotherapy drugs used in the market have certain toxic side effects. Long term chemotherapy can induce cancer cells to produce drug resistance, which will further reduce the effectiveness of chemotherapy drugs in the clinical treatment of tumors. Marine microbial polysaccharides have become one of the key points in marine scientific research because of their good biocompatibility, low toxicity and easy to get, which can provide candidate compounds for the development of high efficiency and low toxicity new drugs for anti-tumor metastasis. EPS 11 is a marine bacterial exopolysaccharide found by our laboratory in the early stage, which has an anti-tumor effect. It has potential anti-tumor metastasis effect, but the corresponding molecular mechanism is not clear. In this paper, the molecular mechanism of EPS 11 anti-tumor metastasis was studied in detail from in vitro and in vivo two levels by proteomics and cell biology, which provided a reliable theoretical basis and drug precursor for the development of polysaccharide anti-tumor metastatic drugs.

In this study, MTT assay was used to detect the cytotoxic effects of EPS 11 on hepatocellular cancer cells Huh7.5, Bel-7402 and HepG2, and the results indicate that EPS 11 could inhibit the growth and proliferation of hepatocellular carcinoma cells in a dose- and time-dependent manner. At the same time, optical microscope observation showed that EPS 11 could cause the aggregation and detachment in hepatocellular carcinoma cells. Furthermore, the effects of EPS 11 on the adhesion rate and cell surface structure of hepatocellular carcinoma cells Huh7.5, Bel-7402 and HepG2 were detected by crystalline purple in quantity, scanning electron microscope (SEM), respectively. The results showed that EPS 11 could both reduce the adhesion ability

and destroy the cell filiform structure on the surface of hepatocellular carcinoma cells Huh7.5, Bel-7402 and HepG2 in a dose- and time-independent manner. We found that the decrease of cell adhesion rate was consistent with the decrease of cell filiform structure, which indicated that the cell filiform structure of cell surface plays an important role in the adhesion of hepatocellular carcinoma cells. In order to further explore the function of EPS 11 anti-tumor metastasis, we used wound healing assay and Transwell Boyden chamber assay to prove the fact that EPS 11 could inhibit the migration of hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 by reducing its adhesion ability and destroying their surface structure.

In this study, we used proteomics technology to reveal the mechanism of EPS 11 on the biological process of hepatocellular carcinoma cells Huh7.5, such as inhibiting the growth, proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma cells. According to the data, we found that the expression levels of mainly cell adhesion molecules were significantly decreased in hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 after EPS 11 treatment. Among them, the cell adhesion molecule CD99 was most obviously decreased. CD99 plays an important role in cell proliferation, adhesion, migration and differentiation, so we select it as a key effector molecule to deeply study the role of EPS 11. After verifying it with quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and Western blotting, we found that EPS 11 could significantly reduce the expression of CD99 at mRNA and protein levels, especially in protein level. In turn, we overexpress CD99 molecules in hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 to detect the effects of EPS 11 on the proliferation, adhesion and mobility, and which were aimed to verify the importance of CD99 in EPS 11 inhibiting the proliferation and migration ability of hepatocellular carcinoma cells Huh7.5. The results showed that CD99 could significantly rescued the proliferative rate, adhesion ability and migration ability decrease of hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 after EPS 11 treatment, which further confirmed that CD99 played an important role in the mechanism of anti-hepatocellular carcinoma metastasis for EPS11. It also provides evidence that CD99 can be an important marker for the target treatment of hepatocellular carcinoma.

In order to further explore the effect of EPS 11 inhibition on tumor cell metastasis in vivo, the model of pulmonary metastasis of melanoma cells was used to verify the result. Compared with the control group, the pulmonary metastasis of melanoma tumor lung colonization in mice could be significantly reduced after injection of EPS11, but it has no effect on the growth indicators in mice such as weight. It is proved that EPS 11 has a good anti-tumor metastasis effect in animals and can be a potential anti-tumor metastasis candidate drug.

Key Words: Marine bacterium, Polysaccharide EPS11, Cancer, Adhesion, Metastasis

第一章绪论

1.1癌症研究概述

1.1.1癌症发病机制及治疗

癌症因其具有癌细胞生长不受控制、易发生转移等生物学特点,使其发病率 和死亡率居高不下,已成为世界最严重的公共卫生问题之一。尽管在流行病学、 免疫学、基因组学、手术治疗和药物发掘方面做出了大量的努力,癌症依然大肆 横行,对人类生命造成越来越大的危害。目前对癌症的防治依然处于较低的水平, 主要原因之一就是对癌症发病机制尚不清楚。

癌症从最开始的发生发展到最后完成转移的整个过程,是一个高度调控、极 其复杂的病理学进程。其涉及因素复杂多样,与遗传因素、抽烟、不良饮食作息 及不利生活环境等紧密相关,为肿瘤学研究带来了很大困难。近年来,随着医药 科学的高度发展,在肿瘤的发生发展方面开展了大量研究,对其发病机制有了初 步的认识。癌症的生物学基础主要是基因的异常,具体就是体细胞基因受致癌因 素影响,导致正常基因失常或表达紊乱,从而影响细胞的生物学活性与遗传学特 性,形成了与正常细胞在形态、代谢与功能上均有所不同的癌细胞。致癌因素主 要包括:化学致癌物,物理致癌因素以及致癌病毒(Amosetal., 1962)。这些致 癌因素导致不同的基因发生突变,而基因的不同突变最终形成了不同类型的肿瘤。 同时,肿瘤细胞的生长动力学、血管生成以及氧化应激等因素均会影响肿瘤的发 展进程(Auyeung et al., 2017; Gilead et al., 2004; Vacca et al., 2000)o

传统肿瘤治疗方法包括手术治疗、放射治疗和化学治疗等(Perry et al„ 2006)o 手术治疗主要通过切除癌症病灶进行治疗,是目前肿瘤治疗最重要的治疗手段, 针对早、中期没有发生转移的癌症比较适用,但对于血液类癌症以及晚期转移性 癌症患者却不适用,主要是因为癌细胞扩散至局部或全身而导致的复发和术后效 果不好,因此癌细胞转移是手术治疗难以解决的问题。放射治疗主要是通过抑制 肿瘤细胞生长发挥作用,但其杀死肿瘤细胞的同时也会杀死正常细胞,且高强度 的放疗会抑制或破坏人体的免疫系统,且只能最大限度的消灭局部肿瘤,但仍然 解决不了癌细胞转移的问题。化学治疗主要是针对肿瘤转移的治疗,虽然可以抑 制癌细胞的转移,但因其产生的毒副作用以及耐受性,使得化学治疗的广泛应用 受到一定的限制,其制约因素是高效低毒化疗药物的发展。随着对癌症发病机制 的研究,出现了靶向治疗和免疫治疗等新兴治疗方法,肿瘤治疗效果有所改善, 但长期疗效仍然需要改善,复发和转移仍然是影响患者预后的主要因素(Ooi et al„ 2018; Sudhakar, 2009)o因此解决肿瘤转移仍然是必须攻破的医学难题,寻找 有效的治疗药物势在必行。目前大多数抗肿瘤药物主要是通过抑制癌细胞生长增 殖起到抗肿瘤作用,但是正常细胞也因此受到损伤,特别是对一些生长旺盛的骨 髓细胞等,因此寻找特异性抑制肿瘤生长并可以抑制肿瘤转移的治疗药物既重要 又急迫。

1.1.2肿瘤转移概况

癌症转移是大多数恶性肿瘤患者死亡的主要原因(Steeg, 2006),当携带不 稳定基因的癌细胞远离原发肿瘤组织并适应远处靶向组织器官的微环境时,就会 发生转移(Gupta et al., 2006)。研究人员对转移的研究已有200多年的历史,癌 症生物学家一直认为,转移是肿瘤细胞与其转移的靶向组织相互作用的结果 (Talmadge et al., 2010)。Stephen Paget 早在 1889 年就提出“种子和土壤”学说, 即转移依赖于特定癌细胞(种子)和特定器官微环境(土壤)之间的相互作用, 这一观点至今仍然成立(Fidler, 2003)o目前关于癌症的大多数基础研究主要集 中在癌症形成的原因方面,关于肿瘤细胞如何转移(即通过改变癌细胞所处的微 环境,进入淋巴和血液循环,定殖在远处靶向器官)的问题研究却有限。同时, 又由于肿瘤转移是90%实体瘤患者的主要死因(Liu etal., 2008),大部分恶性肿 瘤发现时已经处于晚期并发生了转移。毫无疑问,对肿瘤转移进程理解有待提高 和深入探究。

近些年,我们逐渐了解原发性肿瘤产生转移性细胞的机制以及某些类型的肿 瘤倾向于转移到特定器官的原因。基因组的内在不稳定性以DNA突变、染色体 重排和表观遗传学改变的形式提供了肿瘤进化过程需要的异质性,并从这种异质 性中选择有利的性状。肿瘤面临着选择具有侵袭性表型的压力,肿瘤细胞的不适 当增殖受到抑制肿瘤形成的多层机制的挑战。其中一些障碍是细胞固有的(如致 癌基因引起的基因毒性应激、生长抑制通路的表达、凋亡和衰老通路以及端粒损 伤),逃避这些肿瘤抑制通路是原发性肿瘤的一个特征(Agaliotietal.,2000)。然 而,一种完全不同的压力是来自于癌细胞的外部微环境(如细胞外基质组分、基 底膜、活性氧、营养、氧气以及免疫系统的监视等),改变任何一个因素都将改 变肿瘤发展的命运。来自肿瘤细胞群的高转移性克隆细胞株比来自同一肿瘤的非 转移性克隆细胞株具有更高的遗传变异率,这一证据为肿瘤转移和遗传不稳定性 之间提供了早期联系(Fidler, 2003)。

转移是一个复杂的连续的生物学过程,每一步都会影响这个进程的顺利进行, 所有这些步骤都必须成功完成(Poste et al., 1980)o这些步骤包括细胞从原发肿 瘤病灶脱落进入淋巴和血液循环,细胞在循环中存活,被新器官捕获,渗透进入 周围组织,定殖在新组织并生长增殖(Simpson et al., 2008; Fidler, 2003; Chambers et al., 2002; Pass et al., 1998)。转移的结果取决于肿瘤细胞的内在特性以及细胞与 宿主之间的相互应答,及患者个体的差异性(Carter, 1973)。原则上,所有具有 转移特性的肿瘤均包含相同的转移步骤,同时都需要发展一个完善的血管网络以 及逃逸宿主的免疫应答(Nicolson, 1988;Naito et al., 1987)o 一旦癌细胞做到了这 些,便可以再次侵入宿主细胞基质、渗透进入血管组织、进入循环并产生二次转 移(CaiteT, 1986; Kim et al., 1980; Sugarbaker, 1979 )□被宿主器官捕获也是肿瘤转 移过程中非常重要的步骤,就像“种子和土壤”学说一样,宿主器官提供的环境 对肿瘤细胞存活起决定性作用。另外,通过对乳腺癌和前列腺癌患者的尸检研究, 支持了转移性骨髓瘤的癌症发展基础是血流因素引起的。因此,血流的特点和血 管系统也可以影响癌细胞的转移扩散(Fidler et al., 2003; Chambers et al., 2002 )o

原发性肿瘤中只有少部分细胞被认为具有发生转移的能力(Fidler, 1970)o 这是由于在转移过程中,一些肿瘤细胞进入循环系统后会被立刻消除,不能完成 所有的转移步骤。这个过程的复杂性在一定程度上解释了为什么转移过程被认为 是低效的(Fidler, 1970)。研究表明,小鼠尾静脉注射具有放射性标记的B16黑 色素瘤细胞,24小时后发现仅有小于0.01%的黑色素瘤细胞在循环系统中存活, 并进一步转移至小鼠肺部(Fidler, 1970)。因此,转移的发展到底是少数肿瘤细 胞转移过程中偶然存活并增殖引起的,还是一种独特的具有转移特性的恶性肿瘤 细胞亚群的选择性生长引起的,是目前肿瘤转移问题争论的焦点。由于相关问题 的研究主要在啮齿动物身上进行,而应用于临床研究却存在很多困难。远离肿瘤 原发病灶的地方岀现肿瘤细胞并不能证明是发生了转移,肿瘤细胞在循环系统中 会被迅速的清除,即使进入毛细血管或骨髓也不能证明肿瘤转移灶的形成或即将 形成。因此,深入的了解肿瘤转移的发生发展机制,对于恶性肿瘤治疗是非常有 必要的。

1.1.3癌细胞的黏附和迁移

细胞黏附是细胞与其周围环境相互作用的基本形式之一 (Buttenschon et al., 2017)。主要涉及细胞与细胞间联系和细胞与细胞外基质(ECM)的联系。生理 学方面,细胞通过细胞与细胞间黏附或细胞与细胞外基质的黏附等被紧密固定在 其限定的边界内,有助于在细胞之间以及细胞与基质之间建立紧密的联系。此外, 细胞黏附不仅仅是细胞与细胞或者细胞与细胞外基质的一种连接,它通过整合蛋 白与下游分子相互作用的机制来激活细胞增殖和生存通路(Alizadeh et al., 2014)。 癌细胞自身黏附能力的下降和癌细胞与基质黏附力的改变都是癌细胞侵袭和转 移的重要因素,包括从原发病灶脱黏附以及与远处定殖器官的黏附。

肿瘤细胞表面黏附分子在细胞黏附过程中,发挥着非常关键的作用。细胞黏 附分子与细胞外基质或者细胞表面的配体相互作用,引发一系列信号通路,进而 改变细胞相应的生物学进程。细胞与细胞和细胞与基质的相互作用是通过几个不 同的受体家族介导的。这些受体除了靶向细胞使其黏附到邻近细胞的特定细胞外 基质蛋白和配体外,还影响许多不同的过程,包括细胞生长、分化、连接形成和 细胞极性。已经研究确定的黏附受体家族成员如下:整合素(细胞基质和细胞黏 附受体的异二聚体膜表面黏附分子),免疫球蛋白超家族黏附分子(参与细胞与 细胞的黏附进程,特别在胚胎发生、伤口愈合、炎症反应等过程中尤为重要), 钙粘蛋白(即钙依赖的同源细胞与细胞黏附蛋白),凝集素类黏附分子(具有凝 集素样结构域的细胞黏附分子,介导白细胞/内皮细胞黏附),归巢受体(介导淋 巴细胞到特定的淋巴组织)(Albeldaetal., 1990)o

细胞迁移与许多生物学过程密切相关,如胚胎形态形成、免疫监视、组织修 复和再生。细胞迁移的过程主要包括:细胞前端伸岀板状伪足;板状伪足于细胞 外基质形成新的黏着斑;细胞体进一步收缩;解离细胞表面膜状突起和周围基质 的黏着斑使细胞向前端运动。细胞迁移的异常调控导致许多疾病的进展,包括癌 症的侵袭和转移(Condeelis et al., 2005; Sahai, 2005; Yamaguchi et al., 2005)o 肿 瘤转移的许多步骤中均需要细胞迁移,细胞迁移常常伴随着细胞运动能力的改变, 细胞运动由肌动蛋白聚合、细胞脱黏附和肌动蛋白收缩驱动完成的(Olson et al., 2009)o细胞运动能力的改变往往伴随着细胞骨架的重排以及应力纤维的形成 (Cox et al., 2001 )o细胞脱黏附涉及机械力和蛋白酶参与的切割,由肌动球蛋白 驱动收缩所产生的机械力被认为有助于解离细胞内部位和细胞外部位粘连的基 质。细胞在二维基质上迁移时,在前缘形成膜状突起,这些膜状突起称为丝状伪 足和片状伪足。在3D环境下,位于ECM顶部的肿瘤细胞和血管周围的细胞侵 入到ECM中,侵入前需要形成膜状突出物,如具有ECM重构活性的侵袭性伪 足,这些结构是由肌动蛋白聚合驱动形成的。在恶性肿瘤中,参与形成这些膜状 突出物的蛋白质经常被上调,主要参与细胞侵袭和转移进程(Yamaguchi et al., 1999)o

1.2海洋来源天然活性物质研究进展

1.2.1海洋来源活性产物研究

海洋覆盖了地球表面70%以上的面积,生存着地球上80%以上的物种,拥 有地球上最复杂的生态系统和丰富的物种资源。来自80多个国家的2700多名科 学家对海洋进行了一次普查,对海洋生物的多样性、分布和丰富程度进行了评估, 普查结果发现了 6000多种潜在的新物种(Gennan et al., 2011; Butler et al., 2010; Daphne et al., 2010; Patricia et al., 2010)。从 20 世纪 70 年代开始,人们便已经开 始把寻找药物的目光投向海洋。1969年至1999年间大约有300项具有海洋来源 生物活性天然活性产物获得专利。近年来,很多活性物质从不同的海洋生物中分 离提取,比如海鞘、海绵、软珊瑚、苔薛、海姑虫俞等(Harvey, 2000)o在过去的 十年,每年有超过1000种新的海洋天然化合物被分离提取(Altmaim,2017)。海 洋环境具有分布广泛的热量、压力和营养范围,并包含光照区和非光照区,因此 大量可变的因素导致了从微生物到哺乳动物等各类生物生长发育的特异性和多 样性。尽管海洋环境的生物多样性超过了陆地环境,但利用海洋天然产物作为药 物制剂的研究还处于起步阶段。部分原因是海洋生物采样比较困难,后期分离培 养等条件有限,使得海洋生物资源获得较难,进一步限制了海洋天然产物的挖掘 (Jha et al., 2004)。但随着新的潜水技术、遥控设备等深海装备的发展,为收集 海洋样品提供了便利和可能。

海洋生物产生的活性化合物(如次生代谢物)的初衷,主要是海洋生物产生 用来抵御环境压力以及保护自己免受捕食者和病原体的伤害。化学生态学研究表 明,海洋生物的次级代谢不仅在生产者的代谢中发挥不同的作用,还是一种在特 定生存环境下的生存策略,而研究这种策略可以为人类健康造福。许多无柄无脊 椎动物,如海绵、珊瑚和海鞘,都以过滤的海水为生。为了避免海水中高密度的 细菌的侵害,它们会产生抗生素保护自己。从而可以把海绵等滤食动物能够产生 抗菌作用与人类抗生素的使用提供了可能的联系。然而,为什么海绵可以产生抗 肿瘤药物呢?研究发现,当两个海绵在有限的生存空间内生存时,它们通过产生 非常有效的化学物质去杀死相邻海绵的快速分裂的细胞,来获得生存空间,这与 化学治疗中利用化疗药物杀死处于快速分裂期的细胞的治疗策略相一致。理想的 抗癌药物应该具备杀死快速增殖的细胞但不损害正常健康细胞,这种海洋生物的 化学生态学研究为海洋来源活性产物发展为抗癌药物提供了强有力的依据。

基于这些研究结果,可以很清楚的认识到,海洋环境是一个尚待开发的具有 很多丰富未知天然化合物的储藏库,这些化合物将具有广阔的药用前景。

1.2.2海洋来源抗肿瘤活性物质研究

海洋因其独特的生态环境,产生了许多结构新颖且药理作用显著的活性天然 产物,加之近年来陆源性活性资源开发越来越难,使得海洋来源活性天然产物的 研究成为热点,其中抗肿瘤药物的研究占据着主导地位。

海洋来源抗肿瘤活性化合物包括菇类、生物碱、聚酮类、多肽、莽草酸衍生 物、多糖以及类固醇等化合物,来源覆盖海洋植物、海洋动物及海洋微生物等。 这些具有抗肿瘤活性的化合物作用机制主要包括以下几种方式:废除生长信号的 自给自足、重新建立对生长抑制信号的敏感性、诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制新生 血管的生成、抑制细胞增殖以及抑制肿瘤细胞侵袭和转移能力(Schumacher et al., 2011)o目前,已经有8个海洋来源天然活性产物被FDA批准上市(表1.1),其 中5个用于肿瘤治疗,包括:阿糖胞昔(Cytarabine)>齐考诺肽(Ziconotide)> 曲贝替定(Trabectedin)、甲磺酸艾日布林(Eribulin mesylate)和泊仁妥西凡多 汀(Bwntuximab vedotin);此外,处于临床试验阶段的海洋来源抗肿瘤药物有 20 种(Mudit et al., 2016; Bourguet-Kondracki et al., 2014; Gerwick et al., 2012)o 阿 糖胞昔用于急慢性淋巴细胞和髓性白血病及少数实体瘤的治疗;齐考诺肽主要通 过缓解疼痛用于癌症治疗;曲贝替定主要用于治疗软组织肉瘤和卵巢癌的治疗, 二期临床对卵巢癌、直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤等效果也比较显 著;甲磺酸艾日布林主要用来治疗转移性乳腺癌;泊仁妥西凡多汀主要用于治疗 系统间变性大细胞淋巴瘤(Muditet al., 2016)o

1.1FDA批准并上市的的海洋天然产物来源药物(Mudit et al., 2016)

Tablel.l Commercially available FDA approved drugs derived from MNPs (Mudit et

al., 2016)

Compound Class Trade name Year approved Indication
Cytarabine Nucleoside Cytosar-U FDA 1969 Anticancer
Vidarabine Nucleoside Vira-A FDA 1976 Antiviral
Ziconotide Peptide Prialt FDA 2004 Anticancer
Omega-3 acide ethyl esters Fatty acid esters Lovaza FDA 2004 Hypertriglyceridemia
Trabectedin Tetrahydroisoquinoline Yondelis FDA 2007 Anticancer
  alkaloid      
Eribulin mesylate Macrocyclic ketone Halaven FDA 2010 Anticancer
Brentuximab vedotin Antibody drug conjugate Adcetris FDA 2011 Anticancer
Iota-Carrageenan Sulfated galactose Carragelose FDA 2013 Antiviral
  polymers      

目前,海洋来源抑制肿瘤转移的化合物也发展迅速,表1.2总结了近年来抑 制肿瘤转移的化合物。我们从海洋中发掘这些具有显著生物活性的化合物,最终 目的是使这些化合物成为治疗人类重大疾病的临床前药物。以下这些抗肿瘤活性 化合物大多只完成了体外试验,需要进一步探究其抗肿瘤作用机制并进行体内药 理学和药代动力学代谢研究,最终使这些海洋来源抗肿瘤转移的活性化合物成为 造福患者的一线抗肿瘤药物。同时,还要加大对海洋来源抗肿瘤转移活性化合物 的筛选和机制研究,以期为临床前抗肿瘤药物提供更多的候选化合物。

1.2海洋来源具有潜在靶向肿瘤转移和侵袭途径的化合物(Muditet al., 2016)

Table 1.2 Marine-derived compounds with the potential to target cancer migratory

and invasive cascades (Mudit et al., 2016)

Compound Source Total synthesis Compound identifier
BU-4664L Micromono spar a sp. - PubChem:9868980
Dieckol Ecldonia cava - PubChem: 3008868
Frondoside A Cucumaria frondosa - PubChem:44448161
Fucoidan Brown algae - CAS:9072-19-9
Geodiamolide H Geodia - ChemSpider:4977358
  corticostylifera    
Heteronemin Heteronema erecta - CAS:62008-04-2
Latrunculin A; Latrunculin B Negombata Yes PubChem:445420;6436219
  magnifica    
Motuporamine C Xestospongia exigua Yes PubChem:9818652
Pachycladins A; Pachycladins D Clodiella Yes PubChem:46832819;
  pachyclados   46833117
Penicillivinacine; Terretrione A Penicillium vinaceum - None;CAS: 1558009-89-4
Penitrem A; Penitrem B; Penicillium commune Yes PubChem:44450809;
Penitrem D     3084087; 76308902
Phenylmethylene hydantoin Hemimycale arabica Yes CAS: 1134426-24-6
Phidianidine A Phidiana militaris Yes PubChem:59053149
Sarcophine Sarcophyton glaucum Yes PubChem:6436805
Sceptrin Agelas sceptrum Yes PubChem: 157394
Sinulariolide Sinularia flexibilis - PubChem:6440916
Sinuloduri A; Sinulodurin B Sinularia dura - PubChem:25016150;
      25016151
Sipholenol A; sipholenol E; Callyspongia - PubChem: 16757532;
Sipholenol A siphonella   ChemSpider: 10470228;
      PubChem:44423609

续表

Compound Source Total

synthesis

Compound identifier
Strongylophorine-26 Petrosia - PubChem: 11751458
  (strongylophora)    
  corticata    
Stylissamide X Stylissa species Yes PubChem:57335467
Subereamolline A Suberea mollis Yes PubChem:25016147
Sungsanpin Streptomyces species - PubChem:71713252
Waixenicin A Anthelia edmondsoni - PubChem:73755210

 

1.3海洋微生物来源活性物质研究进展

从古至今,高等植物一直都是文明社会发现药物的主要来源,尽管药物中的 化合物的性质尚不清楚。但自从青霉素发现后,人们便开始从陆地微生物寻找新 的药物,发现了很多新的抗生素。海洋微生物因海洋空间和营养物质的竞争,发 展出有别于陆地微生物更广泛的基因和生物化学多样性,使其产生珍贵的抗生素 和其他药物,是开发新颖高效药物的巨大宝库。

1.3.1海洋微生物资源及其药用活性物质

在海洋巨大的生态系统中,海洋微生物占据其生物量的90%,从温暖的上层 海水到黑暗寒冷缺氧的海底,从热带海洋区域到极寒海洋环境无处不在(Seymour, 2014)o相较于陆源微生物而言,在时间、空间上的特殊生活环境造就了海洋微 生物的物种多样性。近年来,通过PCR技术、16SrDNA序列同源性分析等现代 分子生物学技术对海洋来源微生物的生物多样性进行研究,并取得了较好的进展。 海洋微生物从单细胞生物到简单的多细胞生物,包含:细菌、古生菌和真菌,以 及其他具有生命的实体,如病毒和类病毒,它们共同形成了海洋的“微生物群”。 有研究报道称,通常一茶匙的海水中有超过5000万个病毒,500万个细菌,10 万个古菌以及5万的真核微生物(Seymour, 2014)。海洋微生物群落不仅在数量 上占据优势,而且具有大规模的生物医学资源发掘的巨大潜力。

海洋微生物的多样性和特异性,决定了其次生代谢产物的多样性。为人类提 供了种类繁多、结构新颖以及化学组成复杂的海洋天然产品,主要应用于医药、 食品、化妆品以及生物防治等领域(张长生 等,2018)o海洋微生物代谢物的开 发利用是集微生物学、天然产物化学和药理学等多学科交叉的一项工程。海洋微 生物产生的天然活性物质种类丰富,在抗肿瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒等方面均 发挥显著的作用,获得了较好的进展。

从海洋微生物中提取的天然产物被确定具有多种药理价值,包括抗癌细胞毒 性和抑制特定药物靶点(酶/蛋白质)、抗菌、抗炎和抗氧化特性,因此具有非常 大的有待挖掘的潜在价值。在1996年,Burkholder最早从海洋含漠假单胞菌中 分离得到硝毗咯菌素(pyrolnitrin),具有抗肿瘤抗菌作用。直到近年来,海洋微 生物活性物质的研究才逐渐增多起来。Tao等人(2010)从南海红树林真菌中筛 选岀87种海洋天然产物,并对其进行了抗癌活性筛选,发现14%的化合物在体 外均具有显著的癌细胞毒作用(Tao, 2010)。Yi-Wen等人(2015)从红树内生真 菌镰刀菌次生代谢产物中分离到一种已知的环肽,即白僵菌素。该环肽通过线粒 体途径诱导细胞凋亡(Yi-Wen et al., 2015)。Shindo等人(2014)从海洋细菌中 分离得到类胡萝卜素类化合物,具有显著的抗氧化活性(Shindo et al., 2014)。 Zhao等人(2016)从海洋细菌菌株JMUAZ5中提取分离得到一种粗酶,该酶具 有显著的抗氧化作用(Zhao et al., 2016)。

大量研究发现,海洋微生物与海洋动植物共生的关系非常普遍,比如海藻、 海鞘、海绵及海参等均有很多共生微生物,且这些微生物能够产生很多具有不同 生物学活性的天然产物。同时一部分科学家通过研究表明,许多以前认为是海洋 动植物产生的部分活性物质实际上是由与其共附生的海洋微生物产生的(Mudit et al., 2016; Persson et al., 2011; Jiang, 2005)o通常提出此观点的主要依据是:活 性物质产量低且产量易变;同样的产物可来源于不同的无脊椎动物;产生活性物 质的生物有微生物与其共存;产物的分子结构与以前报道由微生物产生的相像 (Jensen et al., 1994)O海洋微生物和宿主的关系如果不被外界因素干扰,可能会 永久保持。以热带海绵为研究对象,有令人信服的证据表明微生物参与了热带海 绵Dysidea habaceaTheonella来源活性产物的合成,参与活性化合物形成的是 一种蓝细菌,后者是另一种细菌(Anand et al., 2006)□另夕卜,Pandey等人(2014) 从887个海洋细菌中分离提取乙酰胆碱酯酶抑制剂,发现140种(15.8%)细菌 的次生代谢产物均能够抑制乙酰胆碱酯酶活性,这说明从海洋细菌中寻找乙酰胆 碱酯酶抑制剂是行之有效的途径,特别是在海洋无脊椎动物的伴生细菌中 (Pandey et al., 2014)。

尽管海洋微生物群落具有多样性且其所产生的生物活性化合物非常丰富,但 市场上的海洋微生物药物却非常少,仍需要大量的海洋微生物学家、医学工作者 和生物技术专家通过跨学科的研究和合作。在基因组分析的辅助下,应用代谢方 法学并结合生物医学和生物技术,为基于海洋的生物医学研究提供创新的研究方 法,挖掘大量具有成药性的海洋活性产物,对控制人类疾病和保护人类健康具有 重大意义。

1.3.2海洋微生物多糖类活性研究概况

多糖是由多个相同或者多种不同单糖分子(通常10个以上)经糖昔键缩聚 而成的高分子聚合物。研究表明,多糖作为生物有机体中普遍存在的生物大分子, 参与细胞的各种生命活动(Chen etal., 2017)。海洋微生物的生物多样性使其具 有产生新颖化学结构和独特生物学活性多糖的潜质o海洋微生物多糖具有抗氧化、 抗肿瘤、抗炎、抗菌及降血脂等药理作用,是开发海洋多糖类药物的新资源。

海洋微生物多糖主要是从海水、海泥等细菌中分离出来的多糖,可分为胞内 多糖、结构多糖和胞外多糖(Manivasagan et al., 2014),其中,研究报道的最多 的集中在胞外多糖。胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)是由微生物产生的并 分泌到胞外的可溶性多糖和多糖类复合物,在细胞间信息交换、细胞黏附等方面 发挥着重要的作用,对微生物本身具有保护作用,可以减轻外界环境对自身的伤 害。Yin等人(2012)从珊瑚来源真菌的发酵液中分离到胞外多糖AVP,其分子 量约为7kD,单糖组成为葡萄糖与甘露糖,其摩尔比为1.7: 1.0,具有很好的抗 氧化活性(Yinet al., 2012)。Yan等人(2016)从深海真菌培养基中提取了细胞 外多糖N1,具有较高的体外抗氧化活性(Yan et al., 2016)□ Sun等人(2011)从 海洋真菌的发酵液中分离得到ENP1和ENP2两种胞外多糖,具有显著的抗氧化 活性(Sun et al., 2011 )o Nahas等人(2011)报道了一种来自红海海绵中分离的 假交替单胞菌所产的胞外多糖,该多糖主要由葡萄糖组成,具有抗单纯性疱疹 (HSV-1)和溶解血浆凝块作用(Nahas, 2011)。Yan-Li等人(2015)从红树林 真菌中,提取分离得到一种细胞外多糖Fw-1,该多糖含半乳糖咲喃糖,与来自 其他海洋微生物的胞外多糖具有不同的结构特征,可能是一种潜在的抗氧化剂来 源(Yan-Li etal., 2015)o

海洋微生物来源多糖产量低仍然是需要克服的难题之一。传统条件下,主要 通过对微生物培养条件、多糖提取分离纯化工艺等方面进行优化来提高微生物多 糖产量。随着生物技术的快速发展,为从海洋微生物中提取多糖提供了更加强有 力的手段。通过分子生物学、合成生物学、基因组学及生物信息学等技术,挖掘 多糖合成基因簇,对相关基因进行改造获得多糖高产菌株。同时,生物技术的发 展使得体外生产高水平的多糖成为可能。但是,部分海洋来源微生物多糖的生物 活性不够显著和存在的毒副作用也是必须要考虑的问题。针对这些问题,一方面 需要对这些多糖进行结构改造,提高疗效降低毒性;另一方面还要充分利用好现 有的能够产生活性多糖的菌株外,仍需要挖掘更多来源于海洋微生物的活性多糖, 为海洋活性多糖库添砖加瓦。

1.3.3海洋微生物多糖抗肿瘤活性研究

近年来,癌症治疗中出现的严重副作用和多药耐药性。而海洋微生物多糖因 具有显著药理稳定性和低毒性等特点,成为抗肿瘤新药研发的热点,具有广阔的 应用前景。

抗肿瘤活性研究是海洋微生物多糖生物学活性中的重点。多糖结构的多样性, 导致了抗肿瘤的机理也不尽相同,包括直接杀死癌细胞或诱导癌细胞的凋亡,增 强机体的免疫以及抑制血管的生成等。Umezawa等人(1983)从海洋细菌中纯 化得到一种活性胞外多糖(marinactan),该多糖是一种新型杂多糖,由葡萄糖、 甘露糖和岩藻糖组成,摩尔比约为7: 2: 1。该多糖对实体肉瘤S-180小鼠的实 体瘤生长抑制可以达到70-90%,部分可以完全抑制其生长(Umezawa et al., 1983)O Li等人从海洋真菌中分离得到一种中性水溶性多糖(HPA),其单糖组成 分析表明,HPA主要由甘露糖组成并含少量半乳糖和葡萄糖。HPA对宫颈癌HeLa 细胞和乳腺癌MCF-7细胞均有明显的抑制作用。HPA可通过增加细胞内ROS 水平,诱导细胞凋亡,降低线粒体膜电位,提高caspase-3的表达(Li et al., 2018)。 Chen等人(2016)从海绵内生真菌中分离得到胞外多糖AS2-1,该多糖由甘露 糖、葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比为1.00: 0.67: 0.35,分子量为27.4 kD。体外 实验中,AS2-1对Hela、HL-60和K562细胞均有细胞毒作用(Chen et al., 2016)。

Xian等人(2013)从海洋真菌菌丝体中发现了一种均质多糖,名为YCP,通过 激活B细胞中的MAPK和NF-kB信号通路增强宿主免疫反应,在体内表现出很 强的抗肿瘤能力(Xian et al., 2013 >o

目前海洋微生物抗肿瘤多糖开发利用仍处于起步阶段,探究其抗肿瘤作用机 制,从细胞水平到基因水平的深入,明确多糖抗肿瘤的构效关系,对于海洋微生 物多糖的开发具有重要的意义。

1.4课题研究的目的和意义

癌症作为世界难题之一,严重危害人类生命健康,癌症转移是诱发大部分癌 症相关死亡的主要致死原因,亟需寻找高效低毒能够抑制肿瘤转移的药物。海洋 微生物因其特殊的生存环境以及其丰富的资源,能够产生很多具有新颖结构的活 性化合物,有很多化合物具有显著的抗肿瘤作用,而且部分已经进入临床。因此, 海洋微生物作为非常有潜力的抗肿瘤药物资源,开发应用前景非常广阔,未来成 药指日可待。EPS 11是本实验室前期筛选的一种海洋细菌胞外多糖,具有显著的 抗肿瘤活性。在前期研究中,EPS 11能够通过改变肺癌细胞A549中piII-Tubulin 相关的细胞信号通路来诱导癌细胞发生失巢凋亡(Cao et al., 2018)。在本研究中, 发现EPS 11对肝癌细胞Huh7.5具有同样显著的细胞增殖抑制作用,且具有潜在 的抗肿瘤转移效果。进而以肝癌细胞Huh7.5为模型,初步研究了 EPS11的抗肿 瘤转移分子机制,并进一步用黑色素瘤细胞小鼠体内高转移模型完成了 EPS 11 的体内抗癌细胞转移效果,为EPS 11作为临床前抗肿瘤转移药物提供了理论和 研究基础。

第二章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1生物材料

  • 实验菌株:芽抱杆菌Bacillusll分离自2016年三月份科学号在热带 西太平洋雅浦海山航次采集的沉积物(139°38025E, 11°44162^), -80°C甘油管 保存。
  • 实验细胞株:人肝癌细胞系5、HepG2和Bel-7402均购自美国菌 种保藏中心ATCC,黑色素瘤细胞系B16F-10由中国青岛海洋生物医药研究院馈 赠。
  • 实验动物:7周龄C57BL/6雄性实验小鼠购自北京维通利华实验动物 技术有限公司。

2.1.2实验试剂

2.1主要试剂列表

Table 2.1 Main regents list

实验试剂 生产厂家
蛋白腺 Oxoid,英国
酵母粉 Oxoid,英国
蔗糖 生工,中国
琼脂粉 索莱宝,中国
甘油 索莱宝,中国
Tris 索莱宝,中国
氯化钠 国药,中国
三氯甲烷 MP公司,法国
正丁醇 国药,中国
浓硫酸 国药,中国
续表:
实验试剂 生产厂家
RPMI-1640培养基 Gibico,中国
DMEM培养基 Gibico,美国
细胞培养皿 COSTAR,美国
细胞培养板 COSTAR,美国
Boyden Chamber Transwell COSTAR,美国
青霉素 Hyclone,美国
链霉素 Hyclone,美国
胎牛血清 Gibico,美国
胰蛋白酶 SIGMA ,美国
MTT SIGMA ,美国
PBS磷酸盐缓冲液干粉 索莱宝,中国
50%戊二醛 阿拉丁,中国
结晶紫 SIGMA,美国
冰醋酸 SIGMA,美国
十二烷基磺酸钠SDS 索莱宝,中国
乙二胺基四乙酸钠EDTA 国药,中国
异丁醇 国药,中国
甘氨酸 索莱宝,中国
盐酸 国药,中国
甲醇 国药,中国
乙醇 国药,中国
RIPA裂解液 SIGMA ,美国
BCA蛋白定量试剂盒 PIERCE-THERMO,美国
ECL化学发光试剂盒 Thermo,美国
P-actin 抗体 Proteintech,中国
CD99抗体 KleanAB,中国
HRP-山羊抗鼠抗体 Proteintech,中国
续表:
实验试剂 生产厂家
HRP-山羊抗兔抗体 Proteintech,中国
TRIzol Invitrogen, 美国
Sybr Green Premix Mdbio,美国
QuantStudio TM 6 Flex Thermo, 美国
反转录试剂盒 TaKaRa,中国
DNA Marker TaKaRa,日本
Kwi限制性核酸内切酶 TaKaRa,中国
X/zoI限制性核酸内切酶 TaKaRa,中国
pmax vector Amaxa, 美国
脂质体转染试剂 Bioino,中国
苯酚 国药,中国
2.1.3实验仪器  
2.2 主要仪器列表
Table 2.2 Main equipment list
实验仪器 生产厂家
分析天平 奥豪斯,美国
生物安全柜 力康集团,中国
高压灭菌锅 Zealway,美国
恒温振荡仪 精骐,美国
磁力搅拌器 海门其林贝尔,中国
水浴锅 常州智博瑞仪器,中国
冷冻干燥剂 SIM,美国
水平电泳仪 天能科技,中国
垂直电泳仪 Biorad,美国
半干式转移电泳仪 竞迈生物,中国
STS-2A脱色摇床 上海琪特分析仪器公司,中国
续表:
实验仪器 生产厂家
台式冷冻离心机 力康集团,中国
pH计 奥豪斯,美国
涡旋振荡器 Crystal,中国
冰箱 海尔集团,中国
层析柜 海尔集团,中国
多功能酶标仪 TECAN,瑞士
AKTA蛋白纯化系统 GE Healthcare,美国
冷冻干燥机 金西盟国际集团,美国
倒置生物显微镜 尼康,日本
显微照相系统 尼康,日本
S-3400N扫描电子显微镜 日立,日本
RT-PCR 仪 Life technologies, 美 国
移液器 Eppendorf,德国
PCR仪 博日科技,中国
Nanodrop微量分光光度计 Thermo,美国
CO2培养箱 力康集团,中国
凝胶成像仪 Biorad,美国
UNIQUE多功能超纯水系统 北京佰亿新创科技,中国
冷冻高速离心机 HITACHI,日本

2.1.4主要试剂的配置

(D2216E液体培养基:称取5 g蛋白月东,lg酵母粉,溶于1L陈海水中, 调节 pH7.4-7.6o

  • 2216E固体培养基:称取5 g蛋白月东,lg酵母粉,1%琼脂粉,溶于1 L陈海水中,调节4-7.6o
  • 多糖大规模发酵培养基:称取5 g蛋白月东,lg酵母粉,10g蔗糖,溶 于1L陈海水中,调节4-7.6o
  • LB液体培养基:称取10 g蛋白月东,5g酵母粉,lOgNaCl,溶于1 L 蒸憾水中,调节4-7.6o
  • LB固体培养基:称取10 g蛋白月东,5g酵母粉,lOgNaCl, 1%琼脂 粉,溶于1L蒸憎水中,调节4-7.6o
  • RPMI-1640 细胞培养基:RPMI-1640 培养基粉末,2 g/L NaHCO3,超 纯水配置,调节pH值为4,青霉素100 units/mL,链霉素100 |ig/mL,于提前 灭菌处理的生物安全柜中用灭菌处理过的0.22 pn滤膜过滤除菌,封口膜封口, 4。(2保存备用,用时按需要加入10%胎牛血清。
  • DMEM培养基:DMEM培养基粉末,7 g/L NaHCO3,超纯水配置, 调节pH值为7.4,青霉素100 units/mL,链霉素100 pig/mL,于提前灭菌处理的 生物安全柜中用灭菌处理过的0.22 pim滤膜过滤除菌,封口膜封口,4「C保存备 用,用时加入10%胎牛血清。
  • 10 mmol/L PBS磷酸盐缓冲液(pH 2-7.4):取PBS磷酸盐缓冲液干 粉,溶于对应体积的超纯水中。用灭菌处理过的0.22 pn滤膜过滤后分装,-20°C 保存。
  • 25%胰蛋白酶:称取20 mg EDTA溶于80 mL PBS磷酸盐缓冲溶液 中,加入0.25 g胰蛋白酶冻干粉,用PBS定容至100 mL,用灭菌处理过的0.22 pn滤膜过滤除菌,-2(TC保存备用。
  • 5 mg/mL的MTT溶液:称取5 g MTT溶解于1 L PBS磷酸盐缓冲液 中,用已灭菌处理的22(im滤膜过滤除菌,-2(TC避光保存备用。
  • 三联液:取10% SDS, 5%异丁醇,用950 mL蒸惚水溶解,加入12 mmol/L HC1,最终定容至1 L体积。
  • Sevage试剂:氯仿和正丁醇按照体积比5:1比例配置,现用现配。
  • 5x蛋白上样缓冲液:量取5 mL浓度为0.5 mol/L的Tris-HCl (pH 6.8),称取0.39 g二硫叔糖醇,0.5gSDS, 0.025 g漠酚蓝,力口入2.5 mL甘油。 混匀后分装,4°C保存。
  • 5XSDS-PAGE 电泳缓冲液:称取 1 g Tris, 94 g 甘氨酸,5gSDS, 加入800 mL去离子水搅拌溶解,定容至1 L, 4°C保存,用时稀释成1 x SDS-PAGE 电泳缓冲液使用。
  • 丽春红染色液:称取2 g丽春红,30 g三氯乙酸,30 g磺酸水杨酸, 用950 mL超纯水溶解并定容至1L,棕色瓶分装,4。(2保存。

(16) 转膜液: W 5.8 g Tris, 2.9 g 甘氨酸,0.37 gSDS,加入 800 mL 超 纯水搅拌溶解,定容至1L。4。(2保存,用时现加20%无水甲醇使用。

(17) TBST溶液:称取2.42 g Tris, 8 g NaCl,加入800 mL超纯水搅拌溶 解,调节pH为7.6并用超纯水定容至1 Lo 4°C保存,用时现加入1 mL吐温20□

(18) 膜封闭液:称取5%脱脂奶粉或者BSA粉末溶于TBST溶液中,现用 现配。

2.2实验方法

221细胞培养

人肝癌细胞株Huh7.5以及小鼠黑色素瘤细胞株B16F-10所用培养基为含10% 胎牛血清的RPMI-1640培养基,人肝癌细胞株Bel-7402、HepG2所用培养基为 含10%胎牛血清的DMEM培养基。

将生物安全柜提前紫外灭菌20 min,处理结束后用75%酒精完全擦拭台面 备用。打开水浴锅至恒温37°C,从液氮罐中取出冻存的细胞,迅速放入37弋水 浴锅,1 min内完成融化,低速离心分离细胞和冻存液。用75%酒精擦拭冻存管 外壁,放入超净台,快速去除冻存液,将细胞用相应的培养基(含10%胎牛血清) 悬浮转移到培养皿中,放于含5% CO?的37。(2恒温培养箱中培养。待细胞生长 到对数生长期,进行传代培养。即倾倒掉多余的培养基,用0.25%胰蛋白酶洗两 次细胞后倒掉胰酶,在37弋恒温培养箱中放置合适时间,加入相应的新的细胞 培养基终止胰酶消化作用,用移液器轻柔吹打细胞得单细胞悬液,收集并离心除 去培养基,重新加入新的培养基混悬细胞并转移到细胞培养皿中于37°C恒温培 养箱中培养。

2.2.2 EPS 11的分离纯化

ESP11多糖的分离纯化参考本实验室前期已建立的方法并稍作修改(Cao et al., 2018)o将甘油管保藏的芽鞄杆菌Bacillus sp.ll,用平板划线法接种到 2216E固体培养基中活化培养,放置于28°C恒温培养箱中放置2天长出单菌落。 用枪头挑取单菌落接种到含有5 mL 2216E液体培养基的试管中,于28。(2摇床 150 rpm振荡培养24 h作为种子发酵液。将种子发酵液按照1: 1000的比例接种

到多糖发酵培养基中,于28弋摇床150rpm振荡培养48h、8000 rpm> 20°C离 心20 min收集发酵液上清。

于上清液中加入3倍上清液体积的95%乙醇并置于4°C层析柜中过夜得到 粗多糖沉淀。8000 rpm> 4。(2离心20 min收集粗多糖沉淀,用适量蒸惚水溶解粗 多糖沉淀得到粗多糖溶液。进一步用Sevage试剂对粗多糖溶液进行除蛋白操作, 加入1/5粗多糖溶液体积的Sevage试剂充分振荡混匀,于8000 rpm> 4°C离心 20 min,重复以上除蛋白步骤3次。将经Sevage试剂处理后溶液装入截留分子 量为8000-14000 Da的透析袋中,用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)透析液透析处 理24h (多次替换透析液)得透析后粗多糖。

透析后的粗多糖经0.22 pim滤膜除去直径0.22 pim以上的沉淀,挂载到经过 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)平衡过的 5 mL HiTrap™ Q HP 柱上,用含 2 mol/L NaCl的20 mmol/LTris-HCl (pH 8.0)溶液进行洗脱,收集5倍柱体积的洗脱液。 对洗脱液进行上述同样透析处理(透析液改为蒸馅水),透析后溶液冷冻干燥得 到冻干粉。

冻干粉用超纯水溶解并用0.22 |Lim滤膜过滤,上样于20 mmol/LTris-HCl(pH 8.0)平衡过的 HiTrapTM 16/600 Superdex™ 200 柱,用含 150 mmol/L NaCl 的 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)溶液进行洗脱,流速为1 mL/min, 4 mL每管收集洗 脱组分,收集一个柱体积。对收集馆分进行活性检测,合并活性馅分,蒸憎水透 析除盐并冻干。

2.2.3 EPS 11的含量测定及对肝癌细胞的细胞毒性检测

采用苯酚硫酸法测定EPS 11多糖含量。按洗脱顺序取0.5 mL各洗脱憾分置 于离心管中,加入0.5 mL的5%苯酚溶液混匀,接着加入2.5 mL的95.5%浓硫 酸反应充分,冷却至室温,用酶标仪在490 nm波长处检测吸光值,吸光值与多 糖相对含量成正相关。

采用MTT法检测各洗脱馅分对应Huh7.5细胞毒性检测。取对数生长期的 Huh7.5细胞,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,得到单细胞悬液,按5xl03 孔接 种于96孔细胞培养板,并设不含细胞的培养基作为空白对照,放于含5% CO2 的37°C恒温培养箱中培养24 ho将各洗脱馆分以及洗脱液用0.22 pim滤膜过滤 除菌,培养好的细胞每孔加入20 piL洗脱馆分作为实验组,每孔加入20piL洗脱 液作为实验对照组,每组设三个重复,放于含5% CO?的37。(2恒温培养箱中培 养24h。然后每孔加入30 |1L MTT溶液置于37。(2恒温培养箱中孵育,3 h后加 入100 yL三联液于37°C恒温培养箱中继续孵育过夜,用酶标仪在570 nm波长 处检测吸光值。计算细胞相对存活率,以确定多糖主要活性惚分及对应Huh7.5 细胞毒性。细胞相对存活率按以下公式计算:

相对存活率=(实验组OD —空白组OD) / (对照组OD —空白组OD)xl00% 收集并合并具有显著细胞毒性的馅分,蒸馅水透析除盐并冻干得EPS11纯 品。用超纯水配置合适浓度的EPS 11母液,0.22 pirn滤膜过滤除菌,分装置于-2(TC 储存。

EPS 11对肝癌细胞Huh7.5、Bel-7402及HepG2细胞增殖检测。取对数生长 期的Huh7.5、Bel-7402及HepG2细胞,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,得到单细 胞悬液,按5x10?个/孔接种于96孔细胞培养板,并设不含细胞的培养基作为空 白对照,放于含5%CO2的37。(2恒温培养箱中培养。24h加药处理,向Huh7.5、 Bel-7402及HepG2细胞加入EPS 11处理,使其终浓度为0、0.01、0.05、0.25、 0.50、2.00及4.00 mg/mLo加入同等体积超纯水作为实验对照组,每组设三个重 复,放于含5% CO?的37。(2恒温培养箱中分别培养24 h、48 h。然后每孔加入 30(1LMTT溶液37°C恒温培养箱中孵育,3 h后加入100(1L三联液37°C恒温培 养箱中继续孵育过夜,用酶标仪在570 nm波长处检测吸光值,计算细胞相对存 活率,实验重复三次。

2.2.4形态学观察

光学显微镜观察EPS 11对细胞形态学影响。取对数生长期的Huh7.5、 Bel-7402及HepG2细胞,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,得到单细胞悬液,按2xl05 个/孔接种于6孔细胞培养板,放于含5% CO2的37°C恒温培养箱中培养。过夜 培养后用新培养基替换旧培养基,并向Huh7.5、Bel-7402及HepG2细胞中加入 EPS 11 使其终浓度为 0、0.04、0.08、0.12、0.16 及 0.20 mg/mL, Bel-7402 及 HepG2 细胞加入EPS 11使其终浓度为0、0.20 mg/mL,放于含5% CO?的37。(2恒温培 养箱中分别培养,6 h后扫描电镜观察细胞表面结构变化。

扫描电镜观察EPS 11对细胞形态学影响。取对数生长期的Huh7.5、Bel-7402 及HepG2细胞,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,得到单细胞悬液,按2x"个/孔 接种于提前放置好细胞爬片(多聚赖氨酸包被)的6孔细胞培养板,放于含5% CO2的37°C恒温培养箱中培养。24 h后用新培养基替换旧培养基,并向Huh7.5、 Bel-7402及HepG2细胞中加入EPS 11使其终浓度为0、0.01、0.05、0.10及0.20 mg/mL, Bel-7402及HepG2细胞加入EPS 11使其终浓度为0、0.20 mg/mL,放 于含5%CO2的37。(2恒温培养箱中分别培养。6 h后处理细胞爬片,PBS清洗3 次后用5%戊二醛固定30 mine PBS洗去多余戊二醛,用30%、50%、70%、90% 和100%乙醇梯度脱水各10 mine对脱水爬片干燥处理,扫描电镜观察细胞表面 结构变化。

2.2.5细胞黏附实验

采用结晶紫法定量检测EPS 11对Huh7.5 .Bel-7402及HepG2细胞黏附作用。 取对数生长期的Huh7.5、Bel-7402及HepG2细胞,用0.25%胰蛋白酶消化细胞, 得到单细胞悬液,按5x10?个/孔接种于96孔细胞培养板,并设不含细胞的培养 基作为空白对照,放于含5% CO2的37°C恒温培养箱中培养。24 h后加药处理, 向 Huh7.5、Bel-7402 及 HepG2 细胞加入 EPS 11 使其终浓度为 0、0.01、0.02、0.04、 0.08、0.20及0.40 mg/mL,加入同等体积超纯水作为实验对照组,每组设三个重 复,放于含5% CO2的37°C恒温培养箱中分别培养12 h、24 h。去除培养基,PBS 洗去多余培养基及脱落细胞,用95%乙醇37。(2恒温培养箱固定30 mine去除多 余乙醇,0.1%结晶紫染色20 min, PBS清洗结晶紫,每孔加入100(1L冰醋酸溶 解结晶,用酶标仪在590 nm波长处检测吸光值,计算相对细胞黏附率,实验重 复三次。

相对细胞黏附率(%)二(实验组OD —对照组OD) /对照组ODxlOO%

2.2.6划痕实验

Huh7.5细胞在无血清培养基中过夜培养进行同步化处理,胰酶消化并接种 于12孔板(提前放置有Culture-Insert 2),待细胞生长到一定融合度时去除 Culture-Insert 2, PBS洗三次除去脱落的细胞,加入2%血清的新鲜培养基进行培 养同时EPS 11 (0、0.02、0.04 mg/mL)加药处理8 h。通过倒置显微镜拍照记录 EPS 11作用0 h和8 h的细胞形态,观察加药处理对Huh7.5细胞迁移能力的影响。

2.2.7 Transwell 实验

Huh7.5细胞在无血清培养基中过夜培养进行同步化处理,胰酶消化为单细 胞悬液。Transwell上室加入200(1L含5xl04个Huh7.5细胞的无血清培养基, EPS11 加药处理(0、0.10、0.20 mg/mL); Transwell 下室添加 600 pL 含 20%血 清的新鲜培养基。37°C恒温培养箱孵育8 h, PBS洗上室3次,95%乙醇固定10 min,后用棉签轻轻擦拭除去未迁移的细胞,用倒置显微镜观察并拍照,观察加 药处理对Huh7.5细胞迁移能力的影响。

2.2.8蛋白质组学分析

EPS 11对Huh7.5细胞的蛋白质组学分析由杭州景杰生物公司操作完成。样 品处理如下:用0、1及2 mg/mL的EPS11处理Huh7.5细胞24 h。收集细胞, 裂解细胞内蛋白,进一步分离、消化。通过液相色谱(LC)-电子喷雾电离(ESI) -串联质谱(MS/MS)对分子量较小的肽段进行分离鉴定。采用生物信息学技 术对EPS 11不同处理Huh7.5细胞后的蛋白进行注释、差异蛋白功能分类、差异 蛋白功能富集分析及聚类分析。

  • 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析
  • 5细胞总RNA的提取

Huh7.5细胞加药处理一段时间后,弃去培养基,细胞刮收集细胞于离心管 中,离心得细胞沉淀。PBS洗细胞2次,力n 1 mLTrizol,移液器吹打细胞使其充 分裂解,室温放置5 min,期间涡旋振荡。裂解充分后,条件下12000 rpm 离心10 min,吸取上清液,加入五分之一上清体积的氯仿,剧烈震荡15 s,室温 放置3 mine 4°C条件12000 rpm离心15 min,水层经移液管转移至新的离心管 中,添加同等体积异丙醇并混匀,室温放置10 mine 4。(2条件下12000 rpm离心 10 min,弃去异丙醇,加入预冷的75%乙醇洗涤,4。(2条件12000 rpm离心3 min, 弃去上清。置于室温3 min左右以挥发掉多余乙醇,加入一定量的无RNase的 DEPC水溶解RNA沉淀。Nanockop仪测定总RNA浓度,并参考A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm的数值评估RNA的质量;同时,将RNA进行琼脂糖凝 胶电泳,分析RNA降解情况。得到质量合格的RNA模板后用DEPC稀释至500 ng/|LiLo

  • RNA的变性:将上述得到的合格RNA样品在65°C条件下热变性5 min后,
    迅速置于冰上冷却备用。
  • 去除基因组DNA反应:在冰上配置如下反应体系(16(1L体系)。

2.3去除基因组DNA反应体系

Table 2.3 Removal of DNA reaction system

反应试剂 用量
4xDN Master Mix (已添 gDNA Remover) 4 |liL
RNA template 2)liL
Nuclease-free Water 10(iL
Total 16(iL

以上反应液用移液枪轻轻混匀,混匀后在37°C孵育5 mine

  • 逆转录反应:向上述反应液加入4(1L预冷5 xRT Master Mix II,按以下条 件(表4)在PCR仪进行反应。反映结束,-2(TC保存。qRT-PCR时可直接或 者稀释后使用。

2.4逆转录反应程序

Table 2.4 The reverse transcript reaction procedure

反应温度 反应时间
37°C 15 min
50°C 5 min
98°C 5 min
4°C hold
(5) qRT-PCR定量检测CD99的转录水平。
查阅数据设计CD99以及管家基因P-actin的特异性引物,由擎科生物科技
有限公司合成, 引物序列如表2.5所示:

2.5 qRT-PCR定量引物

Table 2.5 The specific primers for qRT-PCR

引物名称 序列(55- 35 )
CD99-F GCCACAGGAAAGAAGGGGAA
CD99-R CCCTTGTTCTGCATTTTCTTTGA
P-actin-F CACGATGGAGGGCCGGACTCATC
P-actin-R TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT

按照TaKaRa公司qRT-PCR定量试剂盒方法,cDNA模板ddH2O稀释20倍, 在提前预冷的金属96孔板上快速配置如表2.6所示反应体系,每个样品做4个 重复。

26 qRT-PCR反应组份表

Table 2.6 The reaction mixture for qRT-PCR

反应试剂 用量
2xSYBR Premix Ex Taq™ II 5 pL
Forward primer 0.2 pL
Reverse primer 0.2 |liL
cDNA template 4.6 pL
Total 10(iL

将制备好的反应体系,离心使液体离至管底。用Applied Biosystems 7500扩 增仪进行反应,扩增程序设置如表2.7所示:

2.7 qRT-PCR反应程序

Table 2.7 The reaction procedure of qRT-PCR

反应温度 反应时间  
95°C 1 min  
95°C

60°C

10 s n

30 s -J

40循环
 

确认反应的溶解曲线和扩增曲线,导出数据使用比较循环阈值法(2「"CT) 分析基因的表达差异量,计算方法如下:

AACt= (Ct目的基因—Ct管家基因)实验组—(Ct目的基因— Ct管家基因)对照组

式子中的Ct为PCR管中的荧光信号强度达到预先设定的阈值时所经历的循环数。

  • Western blotting 分析

(1)细胞总蛋白的提取及定量:

取对数生长期的Huh7.5细胞,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,得到单细胞悬 液,按2.5X105个/孔接种于6孔细胞培养板,放于含5% CO2的37°C恒温培养箱 中过夜培养。用含不同浓度 EPS 11 (0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL) 对Huh7.5细胞加药处理12 h;同时按此法用0.10 mg/mL EPS 11处理Huh7.5细 胞不同时间(0、6、12、24 h),后置于含5% CO2的37。(2恒温培养箱中分别培 养。

用细胞刮刮取贴壁细胞,收集细胞并离心得细胞沉淀,PBS洗细胞2次,用 加入PMSF的RIPA裂解液冰上裂解30 min,期间多次涡旋振荡,4°C条件下12000 rpm离心10 min后收集上清。通过BCA蛋白定量法对各处理组样品的总蛋白浓 度进行定量,并用裂解液使浓度调成一致,后加入5x蛋白上样缓冲液,使其稀 释为lx上样缓冲液。将混合好的样品置于金属浴100°C反应10 min, -20°C保存 备用。

  • Western blotting 检测:

根据目的蛋白的大小选择合适的聚丙烯酰胺凝胶,放置在凝胶电泳槽中,拔 出梳子,加入等体积提前处理好放于-20°C保存备用的蛋白样品(每孔蛋白上样 量保持在30-50 pig),对照组加入预染Marker,多余孔隙加入由裂解液稀释的lx 蛋白上样缓冲液补齐,防止相邻样品的扩散传播。首先将电压设置为80伏,当 蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时,调整电压为120伏,直至漠酚蓝条带跑到分 离胶底部,电泳结束。

电泳后,去除多余的浓缩胶和分离胶,按照三层滤纸、蛋白胶、PVDF膜和 三层滤纸的顺序依次放置(滤纸、PVDF膜提前放于转膜液中润湿处理),期间 注意除去各层之间的气泡。剪去多余边角,采用半干转180 mA转膜25 min。

转膜完毕后,把膜放置于丽春红染色液中染色5 mino通过膜上条带深浅初 步判断总蛋白含量是否一致,并根据Marker大小剪切得到目的蛋白和内参条带。 将剪好的条带放于含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭处理,室温置于摇床低速摇动 lho封闭结束用TBST洗涤4次,每次10 mine

选取对应抗体,用5%BSA溶液将抗体稀释到合适的浓度。首先将膜放入配 置好的一抗溶液中孵育,4°C过夜,后TBST洗涤4次,每次10 mine洗涤结束, 进行二抗的孵育,37°C孵育30 min,后常温再孵育30 min,后TBST洗涤4次, 每次10 mine抗体孵育结束,采用ECL化学发光法检测蛋白表达情况。将ECL 化学发光液A液和B液按照1: 1比例混合,混合液均匀覆盖PVDF膜的蛋白面 一侧,放入凝胶成像仪中曝光处理,拍照并分析条带。

  • CD99真核表达载体pmax-CD99的构建

(1)目的基因片段的克隆

按照上述方法获得Huh7.5细胞的cDNA,以Huh7.5细胞的cDNA为模板, 设计CD99基因扩增特异性引物,由擎科生物科技有限公司合成,引物序列如表 2.8所示:

2.8 CD99基因扩增特异性PCR引物

Table 2.8 The specific primers for CD99 gene amplification

引物名称 序列(5T)
CD99-F CGGGGTACCATGGCCCGCGGGGCTGC
CD99-R CCGCTCGAGCTATTTCTCTAAAAGAGTACG

用设计好的引物进行CD99基因扩增,PCR反应体系按如下(表2.9)反应 体系配置。

2.9 CD99基因扩增PCR反应各组份配置表

Table 2.9 The reaction mixture for CD99 gene ampliHcation PCR reaction

反应试剂 用量
2 x Taq Mix 20(iL
Forward primer 1 pL
Reverse primer 1 pL
cDNA template 1 pL
ddH2O 17(iL
Total 40(iL

PCR反应程序如表2.10所示:

2.10 CD99基因扩增PCR反应程序

Table 2.10 The PCR reaction procedure forCD99 gene amplification

(2)目的片段回收

将扩增好的CD99基因片段产物和合适的Marker,加入到1%琼脂糖凝胶中

(提前半小时配置并冷却备用),放置于凝胶电泳槽中,采用135伏,20 min电 泳条件进行跑胶处理。

跑胶完毕,凝胶成像仪下验证目的片段的大小是否正确,验证成功后收集含 目的片段的胶,并用DNA胶回收试剂盒回收目的片段(青岛英赛特生物科技有 限公司)。最后,将回收得到的DNA产物放置于-20°C的冰箱中保存,防止DNA 产物的降解。

(3)目的片段和质粒双酶切处理

纯化的CD99基因片段和pmax质粒均用Kpn\和X/zoI限制性内切酶进行双 酶切处理,按照以下反应体系:

2.11目的片段双酶切体系

Table 2.11 The double enzyme digestion system for Target fragment

反应试剂 用量
CD99模板 30 pL
Kpn\ 3 pL
Xhol 3 pL
Buffer 4(iL
Total 40(iL
质粒双酶切体系如表2.12所示:  
<2.12 质粒双酶切体系
Table 2.12 The double enzyme digestion system for plasmid
反应试剂 用量
Plamid 20(1L
Kpn\ 3 pL
Xhol 3 pL
Buffer 4(iL
ddH2O 10(iL
Total 40(1L
将以上体系置于37°C温育2 ho 温育后进行1%琼脂糖凝胶电泳分离。经切

胶回收获得酶切后的CD99和pmax基因线性片段,Nanodrop仪测定总DNA浓 度。

(4)双酶切片段连接

对胶回收获得的酶切后CD99和pmax基因线性片段进行连接,按以下反应

(表2.13)体系进行:

2.13 DNA连接反应体系

Table 2.13 The reaction system for DNA ligation

反应试剂 用量
CD99模板(酶切) 8 pL
pmax模板(酶切) 8 pL
T4 DNA连接酶 2 |liL
Buffer 2(iL
Total 20 pL

将以上体系置于16。(2条件下反应6h,以此反应体系为主,调整模板加入量 比例及连接时间来提高转化效率。

(5) 连接产物转化到E.coli DH5a感受态细胞

1) 将置于-8(TC储存的含有100(1L的E.coli DH5a感受态细胞的离心管在冰 上复融,吸取20 piL连接产物加入到感受态细胞中,用移液枪轻轻混匀,冰上放 置 30 mino

2) 将离心管置于42。(2水浴锅中热激45 s (严格控制时间),热激结束迅速 置于冰上,冷却1-2 mino

3) 加入ImL的LB培养基,轻轻混匀,37°C摇床振荡培养1 h。

4) 培养结束,5000 rpni离心30 s,去部分上清(留100(1L左右),吹打混 匀,用灭菌处理过的涂布器涂布到选择性培养基LB平板上(含卡那霉素抗性)

5) 于37弋培养箱中倒置培养12-16 ho单菌落长出后,挑取单菌落,接种 到含抗生素的LB液体培养基的试管中,37°C摇床中180 rpm振荡过夜培养,进 行后续质粒提取。

(6) 质粒提取

采用天根公司的无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒,提取步骤如下:

1)柱平衡:将吸附柱CP6放入50 mL收集管中,加入2.5 mL平衡溶液BL, 8000 rpm离心2 min,然后倒掉收集管中的废液,重新把吸附柱CA6放到收集管 里。

2)取100 mL过夜培液,加入干净的离心管中,8000 rpm离心3 min,去除 上清液并保留菌体。

3) 然后将8mLPl (提前加入RNaseA的溶液)添加到含菌体的离心管中, 接着用移液枪悬浮菌体沉淀,使之充分混匀。

4) 将8mL溶液P2加入到离心管中,温和颠倒8次以充分裂解菌体。

5) 将8mL溶液P3加入到离心管中,温和颠倒8次。离心管中会出现大量 白色絮状沉淀物,8000 rpm离心15 min,将离心后上清液加到过滤器CS1中, 轻轻推动推柄完成过滤,收集滤液于50 niL离心管中。

6) 向上步得到的滤液中加入0.3倍体积的异丙醇,上下颠倒混匀后转移到 CP6中(CP6吸附柱置于50 mL离心管中)。室温8000 rpm离心2 min,弃废液, CP6重新放回离心管中。

7) 再往吸附柱CP6中加入10 mLPW (提前加入无水乙醇),8000 rpm离心 2 min,弃废液,CP6重新放回离心管中。

8) 将3 mL无水乙醇加入到CP6中,8000 rpm离心2 min,弃废液,CP6 重新放回离心管中。8000 rpm离心5 min,再次除去残留漂洗液。

9) 将吸附柱CP6置于新的干净的离心管中后,将2 mL无菌水滴加入吸附 柱中心,室温放置5 min, 8000 rpm离心2 min以获得质粒溶液。

10) 质粒溶液分装小管,保存在-20°C的冷冻冰箱中。

对提取得到的质粒进行测序验证是否转化成功,进行后续实验。

2.2.12脂质体法转染Huh7.5肝癌细胞

脂质体转染按以下方法展开:首先,将Huh7.5细胞均匀接种于6孔板中, 待细胞生长到50%汇合度的时候,弃去旧的培养基,加入2mL新鲜的无血清培 养基,进行脂质体转染。将转染所需试剂放置室温平衡合适时间。取1.5 mL无 菌离心管2个,各离心管加入200 yL无血清RPMI-1640培养基,分别取3憾的 pmax和pmax-CD99质粒加入离心管中,按照9憾/此的比例加入脂质体转染试 剂,立即涡旋震荡混匀,室温放置15 mino将上述所得转染复合物逐滴加入到新 鲜的无血清培养基中,将转染后的细胞继续置于5% CO?的37。(2培养箱中培养 48 ho按照2.2.10方法提取获得各处理组总蛋白,用Western blotting检测CD99 蛋白的过表达情况。

2.2.13过表达CD99对肝癌细胞Huh7.5增殖、黏附及迁移的影响

按照223、225、226、2.2.7实验方法,结合2.2.12实验方法进行过表达 CD99对Huh7.5细胞的增殖、黏附和迁移影响的实验。

2.2.14动物实验

  • B16F-10细胞传代培养至小鼠体内试验所需数量,胰蛋白酶消化对数生 长期的B16F-10细胞,无血清RPMI-1640培养基吹打细胞收集,离心得细胞沉 淀,无血清RPMI-1640培养基重悬细胞,血球板计数法进行计数,调整细胞浓 度为2xl06个/mL。
  • 取7周龄的C57BL/6雄性小鼠20只,每只小鼠均通过尾静脉注射2 mL B16F-10细胞悬液。随机将注射过B16F-10细胞的小鼠分为两组(生理盐水组, 加药处理组)。生理盐水组腹腔注射0.2 mL的生理盐水,加药处理组按照200 mg/Kg腹腔注射EPSllo隔一天腹腔注射一次,连续处理9次。第18天对小鼠 实施脱颈处死,取肺,拍照观察肺部转移瘤灶数。

2.2.15统计学分析

本实验所得实验结果使用GraphPad Prism软件,对各实验组数据完成单因素 方差分析(one-way AN0VA检验)和多重比较(Tukey检验)。P<0.05被认为具有 统计学意义(*<0.05, **<0.01, ***V0.001)

第三章结果与讨论

  • EPS 11多糖的制备

本实验室前期筛选到一株海洋芽鞄杆菌Bacillus sp.ll (BS11),所产胞外粗 多糖能显著抑制肿瘤细胞的生长增殖。其中活性成分EPS 11多糖对肺癌细胞 A549和肝癌细胞Huh7.5均具有显著的细胞毒作用。己初步完成EPS 11理化性质 测定及抑制肺癌细胞A549生长增殖的机制研究(Cao et al., 2018)。因EPS11对 肝癌细胞Huh7.5同样具有显著细胞毒作用,因此开展EPS 11抗肝癌机制研究, 以期为新颖的抗肝癌药物的研发提供候选药物。

BS11胞外产物经醇沉水提、除蛋白、透析得粗多糖,依次通过HiTmpTM Q HP 和HiTrap™ 16/600 Superdex™ 200柱进行分离纯化,分子筛分离纯化色谱图如 下(图3.1)o

3.1多糖粗提物经HiTrap™ 16/600 Superdex™ 200柱分离纯化图

Figure 3.1 Polysaccharide crude extract from EPS 11 after HiTrap™ 16/600

Superdex™ 200 column

利用苯酚硫酸法和MTT法同时检测了分子筛各憾分的多糖含量(各憾分多 糖含量与吸光度值成正比)及对应的肝癌细胞Huh7.5的细胞毒作用。结果表明, 多糖含量与Huh7.5细胞毒性成正比,我们收集具有显著抑制Huh7.5细胞生长增 殖的馅分透析浓缩后得到EPS 11多糖,用于后续实验。EPS 11浓缩后用超纯水配 置母液,无菌滤膜过滤后于-20°C冰箱保存备用。

收集分子筛多糖馆分,利用苯酚硫酸法在490 nm处测定多糖含量,MTT法在570 nm 处测定细胞活性。Rev代表相对细胞活性,OD490代表该检测波长下的多糖含量。
3.2多糖粗提物各憾分多糖含量及对应Huh7.5肝癌细胞毒性

Figure 3.2 The content of polysaccharide crude extract from EPS 11 and cytotoxic
effects on hepatocellular carcinoma cells Huh7.5

The profiles of the fractions in the gel filtration, which were collected and monitored for the cell proliferation determined at OD570 nm after MTT assay and polysaccharide content determined at OD490 nm after the phenol-sulfuric acid assay. "Rev" stands for relative cell viability. OD490 stands for polysaccharide content.

  • EPS 11对肝癌细胞生长增殖的影响

利用MTT法检测EPS 11对肝癌细胞Huh7.5的生长增殖抑制作用,结果如 图3.3所示。当EPS 11给药浓度大于0.05 mg/mL时,EPS 11能够浓度和时间依 赖性地抑制Huh7.5细胞的生长增殖。当EPS 11浓度达到4.00 mg/mL时,处理 Huh7.5细胞48 h,肝癌细胞Huh7.5的存活率几乎为零(低达2%)。

3.3 EPS11不同条件下对肝癌细胞Huh7.5的细胞毒性

不同浓度EPS 11作用于Huh7.5肝癌细胞24小时和48小时,采用MTT法检测相对细

胞活性,数据重复三次取平均值。*P<0.05, ***Pv 0.001。

Figure 3.3 Cytotoxic effects of EPS 11 on hepatocellular carcinoma cells Huh7.5

Hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 were treated with different concentrations of EPS 11 for 24 h and 48 h, respectively. The relative cell viability was analyzed by MTT assay. Data were presented as means + SD of three independent experiments (n = 3). * P < 0.05, ***Pv 0.001.

为了检测EPS11是否对其他肝癌细胞同样具有生长抑制作用,我们进一步 检测了 EPS 11对Bel-7402和HepG2的细胞毒作用。图3.4显示,EPS 11同样能 够浓度和时间依赖性地抑制Bel-7402和HepG2两种肝癌细胞生长增殖,从而在 一定程度上表明EPS 11具有广谱抗肝癌细胞生长增殖作用。当EPS 11以4.00 mg/mL的浓度处理Bel-7402和HepG2细胞48 h时,细胞存活率分别为40%、 10%o同等作用时间,当EPS 11浓度为4.00 mg/mL时,对比EPS 11对三种肝癌 细胞的细胞毒作用发现,EPS11对肝癌细胞Huh7.5的细胞毒作用最为显著。

不同浓度EPS 11作用于Bel-7402和HcpG2肝癌细胞24小时和48小时,采用MTT法 检测相对细胞活性,数据重复三次取平均值。*Pv0.05, ***Pv 0.001。
34 EPS11对肝癌细胞Bel-7402 (A)HepG2 (B)肝癌细胞毒性

Figure 3.4 Cytotoxic effects of EPS 11 on hepatocellular carcinoma cells Bel-7402 (A)
and HepG2 (B)

Hepatocellular carcinoma cells Bel-7402 and HepG2 were treated with different concentrations of EPS 11 for 24 h and 48 h, respectively. The relative cell viability was analyzed by MTT assay. Data were presented as means + SD of three independent experiments (n = 3). * P < 0.05, *** p v 0.001.

  • EPS11对肝癌细胞形态学影响

3.3.1光学显微镜观察EPS 11对肝癌细胞表面形态的作用

利用倒置相差显微镜观察EPS11对肝癌细胞形态的影响,我们发现给药6 h 时,随着浓度的升高,EPS11能够明显改变细胞形态,并显著引起细胞聚集成团 和脱黏附。通过光学显微镜拍照记录EPS 11对肝癌细胞Huh7.5的特殊作用方式 (图 3.5)o

3.5光学显微镜观察EPS11Huh75肝癌细胞形态学改变

Figure 3.5 Observation of the morphological changes in hepatocellular carcinoma cells

Huh7.5 after the treatment of different concentrations of EPS 11 via light microscope

进一步检测EPS 11对肝癌细胞Bel-7402和HepG2的形态学影响,发现均能 够引起肝癌细胞聚集成团、脱黏附,如图3.6所示。结果提示EPS 11作用于肝癌 细胞的方式有一定的共性。

0.00 mg/mL 0*20 mg/mL

Figure 3.6 Observation of the morphological changes in hepatocellular carcinoma cells
3.6光学显微镜观察EPS11Bel7402 (A)HepG2 (B)肝癌细胞形态学改变

Bel-7402 (A) and HepG2 (B) after the treatment of different concentrations of EPS 11
via light microscope

3.3.2扫描电镜观察EPS 11对肝癌细胞表面形态的作用

采用扫描电镜进一步观察EPS 11给药后对肝癌细胞表面结构的影响,并对 EPS11给药或未给药处理的肝癌细胞表面拍照记录。结果如图3.7所示,当肝癌 细胞Huh7.5未经EPS 11处理时,细胞表面有大量膜状突起形成的丝状结构,细 胞间联系紧密。当用不同浓度EPS 11处理6h后,细胞表面膜状突起结构逐渐减 少,细胞间连接疏松,且呈现浓度依赖性的减少。当EPS 11浓度达到0.20 mg/mL 时,细胞变圆且细胞表面的突起状结构几乎完全消失。

用EPS 11处理肝癌细胞Bel-7402和HepG2时,具有同样的效果,如图3.8 所示。这与我们在光学显微镜下观察的现象以及与EPS 11对Huh7.5细胞的作用 方式相一致,再次证明了 EPS 11作用于肝癌细胞的方式具有共性,且与细胞表 面结构的破坏以及黏附能力的下降密切相关,因此我们以此作为提示,进行后续 实验。
Figure 3.7 Observation of the filiform structures in hepatocellular carcinoma cells

Huh7.5 after the treatment of EPS 11 via scanning electron microscopy (SEM)

38扫描电镜观察EPS11Bel7402 (A)HepG2 (B)肝癌细胞形态学改变

Figure 3.8 Observation of the filiform structures in hepatocellular carcinoma cells

Bel-7402 (A) and HepG2 (B) after the treatment of EPS 11 via scanning electron
microscopy (SEM)

  • EPS11对细胞黏附和迁移的影响

3.4.1结晶紫染色法定量检测EPS 11对肝癌细胞Huh7.5黏附能力的影响

在光学显微镜下观察发现,肝癌细胞随着EPS 11给药浓度的提高和作用时 间的延长,细胞聚集成团和脱黏附现象越来越显著。为了进一步定量评估EPS11 对肝癌细胞的黏附能力的影响,我们通过结晶紫染色法检测EPS11作用后对肝 癌细胞黏附率的影响。结晶紫为一种碱性染料,可以和细胞核中的DNA结合, 把细胞核染成蓝色。本实验中脱黏附的细胞会被洗去,留下贴壁细胞染色定量。 实验结果如图3.9所示,当EPS 11给药浓度大于等于0.04 mg/mL时,作用24 h 后的细胞黏附率明显低于12 h,表明EPS 11能够时间依赖性的抑制Huh7.5细胞 黏附。当EPS 11浓度大于0.08 mg/mL时处理Huh7.5细胞24 h时,细胞的黏附 率仅为20%

3.9定量检测EPS11Huh75肝癌细胞黏附率的影响

不同浓度EPS11作用Huh7.5肝癌细胞12小时和24小时后,采用结晶紫法检测细胞黏 附率。数据重复三次,取平均值。*Pv0.05, **Fv0.01, ***Pv0.001。

Figure 3.9 Quantification assay of cell adhesion in hepatocellular carcinoma cells

Huh7.5 after treatment EPS 11

Hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 were treated with different concentrations of EPS 11 for 12 h and 24 h, respectively. The data were presented as means + SD by three independent experiments. *Pv0.05, **Pv0.01, ***Pv0.001.

我们还同时检测了 EPS 11对肝癌细胞Bel-7402和HepG2黏附率的影响,结 果如图3.10所示,EPS 11同样具有显著的抑制肝癌细胞黏附的作用。当给药浓 度小于等于0.04 mg/mL时,EPS 11作用Bel-7402和HepG2细胞无论24 h还是 12 h,两种肝癌细胞几乎不脱离96孔细胞培养板底部;当给药浓度大于或等于 0.08 mg/mL时,均有超过50%的细胞脱离96孔细胞培养板底部。EPS 11作用24 h的条件下,当浓度达到0.40 mg/mL时,肝癌细胞Bel-7402和HepG2黏附率分 别为7%、10%。同等作用时间下,对比EPS 11对三种肝癌细胞黏附能力的影响 发现:当浓度低于等于0.04 mg/mL时,EPS 11对Huh7.5细胞的黏附能力抑制更 为明显;当浓度大于等于0.08 mg/mL时,EPS 11对Bel-7402和HepG2细胞的黏 附能力抑制更为明显。

不同浓度EPS 11作用Bel-7402和HepG2肝癌细胞12小时和24小时后,采用结晶紫法 检测细胞黏附率。数据重复三次,取平均值。*Pv0.05, **Pv0.01, ***Fv0.001。
310定量检测EPS11Bel7402 (A)HepG2 (B)肝癌细胞黏附率的影响

Figure 3.10 Quantification assay of cell adhesion in hepatocellular carcinoma cells

Bel-7402 (A) and HepG2 (B) after treatment EPS 11

Hepatocellular carcinoma cells Bel-7402 and HepG2 were treated with different concentrations of EPS 11 for 12 h and 24 h, respectively. The data were presented as means + SD by three independent experiments. *Pv0.05, **Pv0.01, ***Fv0.001.

3.4.2 EPS 11抑制肝癌细胞Huh7.5迁移能力

细胞伪足状结构对于细胞的迁移至关重要,细胞迁移需要在迁移方向形成伪 足状结构(潘志兵 等,2014), EPS 11能够有效减少肝癌细胞Huh7.5伪足状结 构的数量并降低其黏附能力。EPS 11是否可以通过破坏伪足状结构进一步抑制 Huh7.5细胞的迁移,我们通过划痕实验(图3.11 A)和Transwell (图3.11 B) 实验进行验证。划痕实验结果显示,EPS 11作用8 h时,随着EPS 11作用浓度的 增加,肝癌细胞Huh7.5划痕愈合能力呈现剂量依赖性的减少。Transwell实验结 果显示,相比于EPS 11未给药处理的的细胞,Huh7.5细胞经EPS 11处理后迁移 数量明显减少。划痕实验和Transwell实验结果均显示,EPS 11能够显著降低肝 癌细胞Huh7.5的迁移能力。

Figure 3.11 EPS 11 inhibited hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 migration ability
311 EPS11抑制肝癌细胞Huh7.5迁移能力A)划痕实验检测B) Transwell
验检测

(A) Quantitative evaluation of hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 migration through

wound healing assay (B) Quantitative evaluation of hepatocellular carcinoma cells

Huh7.5 migration through Transwell assay

  • EPS11作用5细胞后的蛋白质组学分析

EPS 11能够显著引起肝癌细胞聚集成团和脱黏附,并通过破坏细胞伪足状结 构显著降低肝癌细胞黏附、迁移能力。为进一步揭示EPS 11引起这种现象的分 子机制,我们进行蛋白质组学分析。蛋白质组学结果显示,EPS11能够显著改变 细胞黏附分子相关通路,绿色代表下调(图3.12)。细胞黏附分子作为黏附受体 参与细胞黏附、迁移等生物学进程,这与我们前面有关EPS 11引起Huh7.5细胞 脱黏附现象高度一致,并为我们下一步分析提供有效的指导意义。

且可以作为一些癌症的诊断分子,成为我们重点研究的对象。
根据蛋白质组学数据,结合蛋白定量精确数据和细胞黏附分子通路中相关下 调分子,并查阅大量与细胞黏附、迁移相关文献,筛选出以下显著降低的蛋白, 结果如图3.13所示。其中,Claudin-1> Claudin-6以及Occludin是主要的紧密连 接复合体,与肿瘤的发生发展有关(Thorsten et al., 2004); Junctional adhesion molecule A和CD166是免疫球蛋白超家族成员,前者调控细胞紧密连接与淋巴 细胞转移有关,后者与肿瘤发展预后密切相关(Kahlert et al., 2009; Mandell et al., 2004) ; Vitronectin> Cadherin 2> Laminin 和 Fibronectin 是细胞外基质蛋白,与 细胞黏附和转移密切相关(Liming et al., 2013; Felding-Habermann et al., 1993; Chakrabarty et al., 1987); Nidogen-1 和 Nidogen-2 是基质膜的重要组成成分 (Sharada et al., 2008); Matrix metalloproteinase-14 (MMP14)和 Intercellular cell adhesion molecule 1 (ICAM-1)是跨膜蛋白,前者促进肿瘤生长和转移,后者参 与细胞间联系、细胞极性、组织稳定性及相关信号通路等(Kotteas et al., 2014; Devy et al., 2009)o这些细胞黏附分子直接或间接的影响黏附、迁移等进程。CD99 作为降低最多的细胞黏附分子,引起我们的注意,相关报道均表明CD99与细胞 增殖、分化、黏附、转移及死亡等进程显著相关,同时介导一系列细胞信号通路,

Claudin-6 Claudin-l Villin-1 Vitronectin Laminin subunit beta-1 Junctional adhesion molecule A Occludin Catenin beta-1 Laminin subunit gamma-1 Cadhcrin-2 Epithelial cell adhesion molecule

Nidogen-1 Catenin delta-2

Nidogen-2

Laminin subunit alpha-5 Matrix metalloproteinase-14 Intercellular adhesion molecule 1 Fibronectin Basal cell adhesion molecule Methionine aminopeptidase 1 CD166 antigen CD99 antigen

3.13热图分析EPS11Huh75肝癌细胞黏附相关蛋白差异化表达

Figure 3.13 Proteomic clustering and heatmap analyses of differentially expressed
adhesion-related proteins in hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 after EPS 11
treatment

  • EPS 11显著降低CD99的表达

3.6.1 EPS 11在mRNA水平上显著降低CD99编码基因的转录

采用qRT-PCR法检测CD99 mRNA水平的表达。结果表明,EPS 11作用 Huh7.5肝癌细胞12 h后,EPS 11能够浓度依赖性地抑制CD99的mRNA转录水 平。

3.14 EPS11显著降低CD99mRNA水平的表达

EPS 11作用Huh7.5肝癌细胞12小时,通过qRT-PCR检测CD99分子在转录水平上的 表达。P-actin 作为内参,*Pv0.05, **P <0.01, ***P<0.001

Figure 3.14 EPS 11 downregulated the CD99 mRNA expression level

Huh7.5 cells were incubated with different concentrations of EPS 11 for 12 h, and the mRNA expression of CD99 was measured by qRT-PCR.卩-actin was used as the loading control. *Fv0.05, **P <0.01, ***Pv0.007.

3.6.2 EPS 11在蛋白水平上显著降低CD99表达

采用Western blotting检测CD99的蛋白表达水平。用不同浓度EPS 11作用 Huh7.5肝癌细胞12h后,以p-actin作为内参蛋白,检测CD99蛋白的表达。如 图3.15所示,相比于对照组,EPS11给药组的CD99蛋白表达显著降低。当EPS 11 给药浓度大于0.08 mg/mL时,CD99蛋白表达己经低至检测不到的水平。同时, 我们还检测了 EPS 11在0.10 mg/mL浓度下作用不同时间后CD99蛋白表达水平, 结果表明6 h后CD99在蛋白水平上已经低至检测不到的水平。说明EPS 11作用 Huh7.5肝癌细胞时,在较低浓度和短时间内即可显著降低CD99的蛋白表达水平, 提示CD99可以作为EPS 11抗肝癌的一个重要分子靶标。

3.15 EPS11显著降低CD99在蛋白水平的表达

(A)不同浓度EPS 11作用Huh7.5肝癌细胞12小时的CD99蛋白水平,p-actin作为内 参。(B) 0.10 mg/mL EPS 11作用Huh7.5肝癌细胞不同时间的CD99蛋白水平,卩-actin 作为内参。

Figure 3.15 EPS 11 downregulated the CD99 protein expression level

(A) Huh7.5 cells were incubated with different concentrations of EPS 11 for 12 h. P-actin was used as the loading control. (B)The protein expression level of CD99 in Huh7.5 cells was detected after treatment with 0.10 mg/mL EPS 11 for different time. The protein expression levels of CD99 were measured by Western blotting, and 卩-actin was used as the loading control.

3.7过表达CD99逆转EPS 11对Huh7.5肝癌细胞的生长增殖抑制作用

EPS 11给药Huh7.5肝癌细胞后显著降低CD99的表达,与蛋白质组学数据 相一致。为了验证CD99在EPS 11抗肝癌机制中的作用,我们构建了 pmax-CD99 真核表达载体,通过转染到Huh7.5肝癌细胞中,检测过表达CD99后EPS 11对 Huh7.5肝癌细胞的相关作用是否受到影响。将pmax-CD99质粒转染Huh7.5肝 癌细胞不同时lW, Western blotting检测CD99的蛋白水平表达,如[图3.16 A所示, CD99过表达载体构建成功,从而进行后续实验。在这样的基础上,采用脂质体 转染法在Huh7.5细胞中转入CD99真核表达载体以及对照质粒。选择最佳转染 时间24 h, EPS 11处理24 h后采用MTT法检测CD99过表达对细胞存活率的影 响。结果表明,CD99过表达能够显著降低EPS 11引起的肝癌细胞Huh7.5的细 胞毒作用(图3.16 B)。

3.16过表达CD99逆转EPS11引起的Huh7.5肝癌细胞的生长增殖抑制
Concentration (mg/mL)

(A)肝癌细胞 Huh7.5 转染过 pmax 和 pmax-CD99 质粒 12 h、24 h, Western blotting

检测CD99过表达成功(B)过表达CD99能够减弱EPS 11引起的Huh7.5肝癌细胞的死亡。

Figure 3.16 The over-expression of CD99 in the hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 rescued the EPS 11-induced inhibition of cell viability

(A) The protein expression levels of CD99 were detected by Western blotting after hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 cells transfected with pmax or pmax-CD99 for 12 h and 24 h (B) The overexpression of CD99 in the Huh7.5 cells reduced the EPS 11 -induced suppression of the cell viability.

3.8过表达CD99逆转EPS 11对Huh7.5肝癌细胞的黏附和侵袭能力降低

3.8.1过表达CD99逆转EPS 11对Huh7.5肝癌细胞的黏附能力降低

在Huh7.5肝癌细胞转染pmax和pmax-CD99质粒24 h, EPS 11不同浓度作 用12 ho利用结晶紫染色法定量检测在EPS11给药处理后细胞黏附率的变化, 如图所示(图3.17)。结果表明,过表达CD99确实可以一定程度上减轻EPS11 引起的Huh7.5细胞黏附率的下降。

3.17过表达CD99逆转EPS11引起的Huh7.5肝癌细胞的黏附率的降低

Figure 3.17 The overexpression of CD99 in hepatocellular carcinoma cells Huh7.5

rescued the EPS 11 induced decrease in cell adhesion

3.8.2过表达CD99逆转EPS 11对Huh7.5肝癌细胞的迁移能力降低

在Huh7.5肝癌细胞转染pmax和pmax-CD99质粒24 h, EPS 11不同浓度作 用 12 ho

划痕实验,Huh7.5肝癌细胞转入pmax-CD99和pmax质粒24 h后,EPS 11 处理不同浓度12 h。结果如图所示,过表达CD99组迁移距离大于对照组迁移距 离,表明过表达CD99 —定程度上可以减轻EPS 11引起的细胞迁移能力的下降, 揭示了 CD99在Huh7.5肝癌细胞迁移进程中发挥促进作用。

Transwell 实验,Huh7.5 肝癌细胞转入 pmax-CD99 和 pmax 质粒 24 h 后,EPS 11 处理不同浓度12 ho结果如图所示,过表达CD99后Huh7.5肝癌细胞迁移数量 大于对照组迁移细胞数量,表明过表达CD99 一定程度上可以减轻EPS 11引起的 细胞迁移能力的下降,进一步揭示了 CD99在Huh7.5肝癌细胞迁移进程中发挥 促进作用。

A 0.00 mg/mL 0.10 mg/mL 0.50 mg/mL

    j:舅卸宰::食2嗨/曲建x-? 乡 f:鷄爐礬嚥童魏
     
    潸阳七密;;虫八  
       
* 工    

3.18过表达CD99减轻EPS11引起的Huh7.5肝癌细胞迁移能力的降低

在Huh7.5肝癌细胞中过表达CD99,通过划痕实验(A) Transwell小室实验(B)检测

得到,CD99过表达可以减少EPS 11引起的Huh7.5肝癌细胞的迁移

Figure 3.18 The overexpression of CD99 in hepatocellular carcinoma cells Huh7.5
reduced the EPS 11 induced decrease in cell migration

The overexpression of CD99 in the hepatocellular carcinoma cells Huh7.5 rescued the EPS 11 induced decrease in cell migration by wound healing assay (A) Transwell assay (B)

3.9 EPS11抑制小鼠体内黑色素瘤细胞的转移

通过构建黑色素瘤细胞小鼠体内转移瘤模型,对EPS 11抑制肿瘤细胞体内 转移能力作用进行评估。黑色素瘤细胞具有高度的转移特性,并且黑色素瘤细胞 体内转移瘤模型已经非常成熟操作简单,成本较低,成为我们首选模型。实验结 果表明,EPS 11加药组相比于生理盐水组,肺转移灶明显降低,表明EPS 11可明 显抑制黑色素瘤细胞体内转移。加药期间,对小鼠体重影响不大,小鼠状态良好, 为下一步开发成抗肿瘤转移药物奠定基础。

3.19 EPS11抑制黑色素瘤细胞肺转移灶的降低

(A) EPS 11抑制黑色素瘤细胞在C57BL/6小鼠体内向肺部转移模型。构建C57BL/6 小鼠黑色素瘤细胞体内转移瘤模型,随机分为两组,药物处理组为小鼠腹腔注射200 mg/kg剂量的EPS11,对照组为腹腔注射同等体积生理盐水。每两天加药和对照处理一 次,18天后脱颈处理,取肺部组织拍照,观察肺部黑色素瘤结节数量。(B) EPS 11处 理后不影响小鼠的体重。每次加药或对照处理前测量一次体重,并取体重平均值作为参 考。

Figure 3.19 Inhibitory effect of EPS 11 on melanoma tumor lung colonization

(A) Inhibition of C57BL/6 mouse mammary tumor cell metastasis to the lung by EPS 11 in a spontaneous metastasis model. Representative images of the tumor nodule formation in the lung were observed. Mice were simultaneously administrated intraperitoneal EPS 11 at a dose of 200 mg/kg and injected equivoluminal normal saline as control every two days. Drug treatment lasted for 18 days (B) EPS 11 had no effect on the body weights of treated mice. Body weight was measured every two days with a balance for average value.

3.10小结与讨论

癌症转移作为癌症患者的主要致死原因,是多因素调控的生物学进程。转移 的限速步骤虽然至今不可知,但不可否认黏附是至关重要的其中一步。黏附这个 过程不仅受细胞黏附受体和配体调控,而且受膜状结构空间分布的影响(划分不 同的黏附分子到特定的基质膜区域和支撑黏附分子与其特异性受体的相互作用)。 而我们的研究对象EPS11,在本研究中正是发挥着这样的作用,既破坏了细胞的 表面膜结构又影响了大量细胞黏附分子的表达,并抑制了癌细胞的生长增殖,表 明EPS 11具有作为新型的抗肿瘤转移药物深入挖掘的潜力。

本研究通过体内体外实验研究了海洋微生物多糖EPS 11抗肿瘤转移机制, 主要包括以下几个方面:(1)能够抑制肝癌细胞Huh7.5、Bel-7402和HepG2的 生长增殖。(2)显著破坏肝癌细胞Huh7.5、Bel-7402和HepG2的表面结构,抑 制细胞黏附,引起细胞聚集成团。(3)抑制肝癌细胞Huh7.5的迁移能力。(4) 蛋白质组学结合文献分析,EPS11作用肝癌细胞Huh7.5后,大量的细胞黏附分 子的表达显著下调,其中黏附分子CD99下调最为显著且与肿瘤转移关系非常密 切,从而成为我们的重点关注对象。进一步的研究结果表明,EPS 11抑制肝癌细 胞Huh7.5的生长增殖、黏附和迁移的部分原因是通过下调黏附分子CD99来完 成的。(5) EPS 11显著抑制黑色素瘤细胞B16F-10在小鼠体内的转移。

细胞迁移的过程中,细胞的肌动蛋白骨架必须通过形成肌动蛋白束和聚合体 重组来动态的改变细胞形状,肌动蛋白束提供刚力有利于细胞对付来自于基质膜 的综合外力(Mogilner et al., 2005)。伪足作为主要的膜状结构之一,在基质膜下 面形成,类似一个感应器官一样感应着周围微环境并完成相应的生物学进程 (Huang et al„2015)o转移特性的癌细胞具有丰富的伪足结构,这些伪足与其转 移和侵袭密切相关(Weigang et al., 2002; Coopman et al., 1998)。而且,有研究报 道伪足状结构在肿瘤细胞定殖到第二器官的过程中也是至关重要的(Tsukasa et al., 2012)o EPS11能够显著破坏伪足状结构,减少伪足状结构的数量,使癌细胞 变圆,这与癌细胞的迁移能力的降低实验结果相一致,表明EPS11 一定程度是 通过破坏伪足状结构的方式来降低癌细胞的迁移能力的。在蛋白质组学分析中, EPS11作用后大量的细胞黏附分子显著下降。其中,黏附分子CD99的下调最为 显著。研究表明,CD99在肿瘤转移,侵袭等生理进程中发挥着重要的作用(Pasello et al., 2018)o CD99在尤文肉瘤、恶性胶质瘤等多种肿瘤中均高表达,与肿瘤的 发生发展均密切相关,在这些肿瘤的临床治疗和诊断中已经作为诊断分子。本研 究发现EPS 11能够显著改变CD99的表达;同时,过表达研究也表明CD99能够 逆转由EPS 11所引起的Huh7.5细胞的增殖抑制、黏附和迁移能力的降低。因此, 我们认为EPS 11部分通过降低CD99的表达起到发挥抗肿瘤生长转移的作用。同 时,我们认为CD99可作为肝癌治疗中的有效诊断靶标分子。

综上所述,EPS11在体内体外均具有显著地抑制肿瘤细胞转移的能力,且同 时可以显著抑制肿瘤细胞的生长增殖。EPS 11是一个潜在抗肿瘤候选药物前体, 值得进一步深入开发。

第四章结论与展望

4.1结论

本文以海洋芽鞄杆菌胞外多糖EPS 11为研究对象,以癌细胞作为靶标开展 体内体外药理实验,初步探讨了多糖EPS 11的抗肿瘤转移作用机理。得到以下 结论:

  • MTT实验结果显示EPS 11能够浓度和时间依赖性的抑制肝癌细胞 5、Bel-7402和HepG2的生长增殖,表明EPS 11具有广谱的抗肝癌细胞活 性。
  • 形态学观察及相关迁移实验表明EPS 11抑制肝癌细胞的生长增殖和迁 移可能与细胞表面伪足状结构破坏密切相关。
  • 蛋白质组学结果显示EPS11显著下调肝癌细胞5中黏附分子等 相关通路,其中细胞黏附分子CD99在该通路中下调最为显著。进一步在Huh7.5 肝癌细胞中过表达CD99,结果表明EPS 11抑制Huh7.5肝癌细胞的生长增殖及 转移作用与CD99的显著下调密切相关。
  • 通过构建黑色素瘤细胞小鼠体内高转移模型,表明EPS 11可以显著降 低高转移性黑色素瘤细胞株B16F-10向肺部转移的病灶数量,且对小鼠的生长状 态没有影响。

综上所述,本研究通过对海洋细菌胞外多糖EPS 11的药理学研究,初步探 讨了 EPS11抑制肿瘤细胞生长、迁移的作用机制,并通过体内实验验证其具有 抑制肿瘤细胞体内转移效果,为其未来开发为一种抗肿瘤转移药物提供了 一定的 理论和研究基础。

4.2不足和展望

本研究尚存在以下不足:

  • 海洋来源芽抱杆菌所产多糖EPS 11含量仍有限,不足以实现工业化应用;
  • 利用本实验的分离纯化方法得到的EPS 11多糖,仍然存在一定的杂质,

且对于EPS 11多糖的抗肿瘤活性核心仍然未知;

  • 本研究初步检测了 CD99在EPS 11抑制肝癌细胞5的作用,但与 CD99相关的信号通路仍需要进一步深入挖掘;
  • 本研究定性检测了 EPS 11体内抑制肿瘤细胞转移作用,但并未深入探究 EPS 11体内抑制肿瘤转移的分子机制。

针对研究中在的不足之处有以下解决方案:

  • 通过对海洋芽抱杆菌BS11进行全基因组测序,结合基因组数据分析BS11 所产胞外多糖EPS11的相关基因簇,对野生菌株进行多糖合成关键基因的改造 获得高产菌株或利用合成生物学技术体外表达多糖合成基因簇,实现EPS11多 糖的高产;
  • 进一步优化EPS 11分离纯化方案,得到纯度较高的多糖。采用不同多糖 降解酶和细胞实验追踪其抗肿瘤活性核心;
  • 根据已报道的黏附分子CD99相关的信号通路,进一步挖掘及验证新的 CD99信号通路对癌细胞迁移的影响;
  • 针对EPS 11体内抑制肿瘤细胞转移机制,进一步通过免疫组化法检测黏 附相关蛋白和通路的变化情况,明晰体内抑制癌细胞转移分子机制。

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致谢

时光啊你慢点走,我还没有数完汇泉广场上空五彩的风筝,还没有透过窗外 欣赏够远处海面上缓缓移动的大船,还没喂够那广阔海天盘旋飞翔的海鸥、、、随 着致谢二字的敲下,才发现我的硕士生涯也渐渐走向了尾声。蓦然回首,往事历 历在目,一千多个日日夜夜带走了时间的痕迹,却留下了丝丝缕缕的回忆和牵绊。

我与青岛的邂逅始于四年前,独自一人拉着行李箱从秋雨绵绵的南方来到了 阳光明媚的海滨城市青岛,找公交站的时候一对超级好的爷孙主动给我带路,还 一路给我讲各种好吃好玩的,这就是这座城市给我的第一印象:现代化的海滨城 市、热情友好的市民。当来到海洋所的时候,第一次见到了孙老师,他学识渊博、 充满活力、平易近人;第一次见到了 129B实验室和最初的实验室成员,129B实 验室在我心目中的初印象就是麻雀虽小,五脏俱全;作为一个本科偏向于医药化 学的学生,我对一切新的仪器和实验都抱着好奇的心情。还记得当时遇到的一个 个熟悉的满是笑容的脸庞给我细致的讲解实验室的方向,他们是温柔大方的刘格 师姐、热情开朗的张林林师兄还有不善言谈却认真做实验的修鹏远师兄,这些名 字也是真正进入实验室之后才知道,这个实验室就这样给了我一种归属感,我希 望自己会是其中的一员。推免面试结果也如我所期望,我有幸成为了 129B实验 室的一员,拉开了研究生生涯的序幕。在这三年中,我有很多很多要感谢的人, 有你们陪伴,有你们并肩作战真好。

首先,最要感谢的是我的导师孙超岷老师。在科研上,孙老师有着极强的责 任心、敏锐的洞察力和攻坚克难的决心。孙老师总是早来晚归,几乎所有的时间 都花在实验室的建设发展上。对于每一个人的课题,孙老师都很清楚,他总是会 把最新的研究进展分享给每个人,而且经常会和我们探讨实验进展并提出建设性 的意见解决难题。我的课题从最开始的选题到后期的实验设计以及文章的撰写, 孙老师都给予了我耐心指导与细心关怀。实验处于摸索阶段的时候,孙老师会帮 我一起查阅资料,寻找思路;仪器出问题的时候,孙老师会主动帮我借仪器;实 验处于瓶颈期的时候,孙老师会鼓励我,给我勇气去突破;论文撰写的过程中, 孙老师认真细致负责的给予指导和修改。孙老师不仅仅在学业上给我以精心指导, 在生活中,孙老师也给我树立了非常好的榜样,他总是充满了正能量,传递着一 种积极向上的人生态度,鼓舞我不断攻坚克难,勇往直前。我始终记得孙老师说 的那句“做而不思则罔,思而不做则殆”,无论什么时候都要有这样的觉悟和态 度,遇到孙老师是我的幸运,在此向孙老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意,我衷 心祝福孙老师和您的家人吴老师、天天和昊昊身体健康、一切顺利、开开心心。

我还要特别感谢我的师姐刘格对我的帮助。师姐从最开始的养细胞开始到我 可以系统的了解细胞生物学并掌握相应的实验技能和思维给了我很大的帮助。她 认真耐心的教我基础实验操作,提醒我该注意哪些细节以及如何解决实验中出现 的相应问题等。在最开始开展实验的过程中,我的实验总是各种问题频出,进展 缓慢,师姐无论在实验问题的解决上还是在我心情非常失落的时候都给予了极大 的关心,给我依然不放弃不抛弃坚定地去解决问题的勇气。在实验处于瓶颈期时, 师姐会扮演着一个push者的角色,push我往更好的方向前进,一起陪伴我前进, 在这样的激励下,我不断的突破自我,提升自我。在生活中,师姐一定程度上分 担着姐姐的角色,知心的替你分析,替你出谋划策,希望我可以做得更好,我很 感谢师姐,在这里我希望师姐所有的努力都能结果,希望师姐永远幸福快乐。

感谢张林林师兄、曹若冰师姐和匡珊师姐在我刚进实验室给予的帮助,你们 虽然毕业或者出站了,但我真的非常感谢你们在我科研生活伊始中的启蒙和指导。 从你们身上学到了特别多,匡珊师姐和曹若冰师姐严谨细致的思维、张林林师兄 豁达中透露的细致。感谢匡珊师姐教会我进实验室来的第一个实验,感谢曹若冰 师姐不怕麻烦的帮我修仪器给我指导,特别感谢张林林师兄在我刚进实验室时细 心无私的教会我微生物和分子生物学方面的实验。

感谢刘瑞老师、马宁师姐、张晶师姐和郑日宽师兄在分子生物学和相关软件 使用等方面提供的帮助,使我学到更多非常实用的实验和技术,非常感谢你们。 感谢刘老师随时可以开小讲堂似的对我的小问题给予科普,感谢马宁师姐带我一 起做分子生物学实验并教会使用很多软件,感谢张晶师姐随时提供分子实验学技 术和物资支持,感谢郑日宽师兄细心讲解实验原理并提供很多帮助,我才可以顺 利快速的开展实验。

感谢我的同级高蓉蓉和博后师兄刘卫翔一直以来的陪伴,时常给予我学习和 生活上的鼓励和支持;感谢我的师弟单业奇,他乐于助人,无私的奉献着自己的 光和热;感谢师妹蔡瑞宁、吴作栋、周胜男和谭颖琪的陪伴,你们勤快踏实、真 诚的对待每个人,为我的科研生活带来了很多快乐,希望你们在未来的科研道路 上都能够一切顺利。

感谢中国海洋大学马伟平、陆仲夏师兄在动物实验的帮助,在动物实验中再 次感谢刘瑞老师、刘格师姐、郑日宽师兄和张林林师兄的帮忙,特别是郑日宽师 兄,一向对动物有着慈悲之心的他,为了科学研究,为了我顺利开展实验,从头 到尾都在帮忙,非常感谢。

感谢公共实验平台邓涪老师、侯战辉老师和电镜室刘老师和孙圆圆师姐在仪 器和技术方面给予的支持和指导。感谢研究生处老师和公寓大叔的热心服务,让 我有一个舒适、安全的学习和生活条件。感谢中科院海洋所的各位老师和我的同 级同学们,谢谢你们给予我的指导和帮助。

感谢北京集中教学期间遇到的那些优秀的老师,你们对我的科研思维和科研 理论基础奠定了良好的基础;感谢我遇到的那些优秀的朋友,你们让我看到了指 点江山的豪情和严谨认真的求知探索态度。

感谢我的好朋友郭翠和张芯闻一直以来的陪伴,无论在哪里,都有你们的陪 伴。感谢我研究生以来最好的朋友李汶睿,因为有你在身边的鼓励,我能够及时 的调整姿态向前进。感谢我的舍友解兴伟、陈晓彤,有你们的朝夕陪伴使我的生 活丰富多彩。

感谢我的家人作为我最坚强的后盾,给予我支持、理解和鼓励,因为你们我 会更努力的走向更远的未来。

感谢我的男朋友李凯乐,感谢你一直以来的陪伴和支持,即使在最艰辛的时 候,有你在,便也不觉得辛苦。

最后,感谢为本研究顺利进行提供的项目资助,包括:中国大洋协会深海生 物资源计划(DY135-B2-14)、科技部重点研发计划(2018YFC0310800)、山东 省杰岀青年基金(JQ201607)、山东省泰山学者青年专家(tsqn20161051)>青岛 海洋科学与技术国家实验室鳌山人才优秀青年学者(2015ASTP)及中科院百人 计划。