PCB118 和 4-OH-CB107 对 GT1-7 细胞分泌GnRH的影响及机制研究论文

2020年5月11日17:56:24PCB118 和 4-OH-CB107 对 GT1-7 细胞分泌GnRH的影响及机制研究论文已关闭评论

PCB118 和 4-OH-CB107 对 GT1-7 细胞分泌GnRH的影响及机制研究论文

多氯联苯118 (2,3\4, 4\ 5-Pentachlorobiphenyl, PCB118)及其羟基代谢产物4-羟基-多氯联 苯 107 (4-Hydroxy-2, 3, 3\ 4\ 5-Pentachlorobiphenyl, 4-OH-CB107)均是典型的内分泌干扰物 (Endocrine Disrupting Chemicals, EDCs),对动物及人体具有内分泌干扰效应。针对PCBs (Polychlorinated Biphenyls, PCBs)和轻基多氯联苯(Hydroxylated Polychlorinated Biphenyls,
OH-PCBs)内分泌干扰效应的研究主要集中于对动物和人体的甲状腺素和雌激素干扰效应,对神 经内分泌干扰效应及相关机制研究相对较少。本研究以小鼠下丘脑永生促性腺激素释放激素 (Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH)神经元离体细胞系 GT1-7 细胞为模型,研究 PCB118 和4-OH-CB107对GT1-7细胞分泌GnRH的影响及相关机制。
不同浓度 PCB118 (0〜50000 nM)和 4-OH-CB107 (0-500 nM)分别处理 GT1-7 细胞 6 h、
12 h、24h和48h,采用CCK-8法检测细胞存活率、Annexin V-FITC/PI双染法定量检测细胞凋 亡和乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)释放试验检测LDH活性,初步探究PCB118和 4-OH-CB107分别对GT1-7细胞的毒性作用。选取不同浓度PCB118 (0、0.05、5、500、50000 nM) 和4-OH-CB107 (0、0.05、5、500 nM)分别处理GT1-7细胞6 h和24 h,应用ELISA试剂盒检 测细胞培养上清液中GnRH浓度,进而利用蛋白印迹和实时荧光定量PCR技术分别检测 Kisspeptin/GPR54信号通路中相关蛋白及其mRNA的表达情况。结果发现,PCB118 (0.05〜50000 nM)处理GT1-7细胞6h、12 h、24 h和48h后,细胞存活率呈剂量和时间依赖性显著降低,仅 高浓度PCB118 (50000 nM)显著促进LDH的释放和细胞的早期凋亡;PCB118处理GT1-7细胞 6 h, 5、500 和 50000 nM 组中 GnRH 分泌量显著降低,Kisspeptin/GPR54 信号通路上 GnRH、GPR54、 PLC和PKC等蛋白的表达水平显著下降,然而,5nM和500 nM PCB118显著下调PLC和PKC 基因mRNA的表达水平,对GnRH和GPR54基因mRNA的表达为显著影响;处理24 h, 500和 50000 nM PCB118显著抑制GT1-7细胞分泌GnRH, GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白和基因 mRNA的表达水平显著下降。4-OH-CB107 (0.05〜500 nM)处理GT1-7细胞48 h显著降低GT1-7 细胞存活率;0.05 nM 4-OH-CB107处理GT1-7细胞6 h显著促进GnRH分泌,GnRH、GPR54、 PLC和PKC等蛋白和基因mRNA表达水平显著增加;500 nM 4-OH-CB107处理GT1-7细胞24 h 显著促进GnRH分泌,GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白和基因mRNA的表达水平显著增加; 虽然5 nM 4-OH-CB107处理24 h未显著影响GnRH分泌量,但能促进GnRH、GPR54、PLC和 PKC等蛋白及其基因mRNA的表达。
综上所述,PCB118 (0.05〜50000 nM)和轻基多氯联苯4-OH-CB107 (0.05〜500 nM)均具有 抑制GT1-7细胞增殖的毒性作用,具有时间和剂量效应。PCB118仅在50000 nM时促进LDH释 放和细胞早期凋亡,具有显著细胞毒性;PCB118可通过显著下调Kisspeptin/GPR54信号通路 GPR54、PLC和PKC基因mRNA及蛋白表达水平抑制GnRH合成与分泌,其羟基代谢产物 4-OH-CB107可通过上调Kisspeptin/GPR54信号通路GPR54、PLC和PKC基因mRNA及蛋白表 达水平促进GnRH合成与分泌,但Kisspeptin/GPR54信号通路仅部分介导PCB118和4-OH-CB107 干扰GT1-7细胞分泌GnRHo
关键词:多氯联苯118, 4-轻基-多氯联苯107,促性腺激素释放激素,GT1-7细胞,信号机制
Abstract
PCB118 and its hydroxyl metabolite 4-OH-CB107 are both typical endocrine disrupting chemicals which have been found to have endocrine disrupting effects on animals and humans. In the past, Researches on endocrine disruption of PCBs and OH-PCBs pay much more attention to the disruption of thyroxine and estrogen. Studies on neuroendocrine system, however, is relatively few. As a consequence, this study was conducted to investigate the effects of PCB 118 and 4-OH-CB107 on GnRH secretion and the underlying mechanism in GT 1-7 cells, a model of mouse immortalized hypothalamus GnRH neuron in vitro.
GT 1-7 cells were exposed to different concentrations of PCB 118 (0-50000 nM) and 4-OH-CB107 (0-500 nM) at different time points. Cell viability, LDH activity and cell apoptosis were respectively performed by CCK-8 assay, LDH release assay and Annexin V-FITC/PI double staining methods. Then, GT 1-7 cells were treated with PCB118 in different concentrations of 0, 0.05, 5, 500 and 50000 nM, while 4-OH-CB107 in different concentrations of 0, 0.05, 5 and 500 nM. After 6 h and 24 h in culture, the concentration of GnRH in cell culture media was determined by mouse GnRH enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit. The expression of associated proteins of GnRH, GPR54, PLC and PKC in Kisspeptin/GPR54 signal pathway was detected by Western blot and further detected the related gene expression of GnRH, GPR54, PLC and PKC by Real-time quantitative PCR assay.
The results showed that PCB 118 (0.05〜50000 nM) significantly reduced cell viability of GT 1-7 cells in dose- and time-dependent manners after exposure to PCB 118 for 6 h, 12 h, 24 h and 48 h. Interestingly, increased release of lactate dehydrogenase (LDH) and the increase of early apoptotic cells was only observed under the treatment of 50000 nM PCB 118. Exposure to 5, 500 and 50000 nM PCB 118 for 6 h significantly decreased the concentration of GnRH in the culture media. The expressions of GnRH, GPR54, PLC and PKC proteins were significantly inhibited. And the expressions of PLC and PKC genes were down-regulated while the expressions of GnRH and GPR54 genes were not changed significantly; Similarly, GnRH expression levels were decreased significantly after exposure to 500 or 50000 nM PCB 118 for 24 h, the expressions of GnRH, GPR54, PLC and PKC proteins and genes were also significantly decreased. 4-OH-CB107 (0.05-500 nM) significantly reduced cell viability of GT 1-7 cells after exposure for 48 h. 0.05 nM 4-OH-CB107 could stimulate GnRH release after 6 h treatment with the increase of protein and gene expressions of GnRH, GPR54, PLC and PKC; Only 500 nM 4-OH-CB107 could stimulate GnRH release after 24 h treatment. And it could also increase the expressions of these proteins and genes. Although there is no significant difference on the secretion of GnRH after exposure to 5 nM 4-OH-CB107, the protein and gene expressions of GnRH, GPR54, PLC and PKC were increased.
Above all, PCB118 (0.05〜50000 nM) and 4-OH-CB107 (0.05〜500 nM) both have the cytotoxic effect of inhibiting cell proliferation in dose- and time-dependent manners. 50000 nM PCB 118, which has significant cytotoxicity, could increase the release of LDH and promote early apoptosis of GT 1-7 cells; PCB 118 could inhibit the synthesis and secretion of GnRH through down-regulating the expressions of GPR54, PLC and PKC proteins and genes in Kisspeptin/GPR54 signal pathway at the gene and protein level. And its main metabolite 4-OH-CB107 could stimulate the secretion of GnRH via promoting the expressions of GPR54, PLC and PKC proteins and genes. Kisspeptin/GPR54 signal pathway is partly involved in effects of PCB118 and 4-OH-CB107 on GnRH synthesis and secretion of GT1-7 cells.
Key words: PCB 11 & 4-OH-CB107, GnRH, GT 1-7 cells, signaling mechanism

英文缩略表
英文缩写 英文全称 中文名称
PCBs Polychlorinated Biphenyls 多氯联苯
OH-PCBs Hydroxylated Polychlorinated Biphenyls 轻基多氯联苯
MeSO2-PCBs Methylsulfonyl Polychlorinated Biphenyls 甲磺基多氯联苯
EDCs Endocrine Disrupting Chemicals 内分泌干扰物
POPs Persistent Organic Pollutants 持久性有机污染物
DL-PCBs Dioxin-Like Polychlorinated Biphenyls, 类二噁英多氯联苯
NDL-PCBs Non-Dioxin-Like Polychlorinated Biphenyls 非类二噁英多氯联苯
TCDD Tetrachlortetrachlorodibenzo-p-Dioxin 四氯二苯并二噁英
PCB118 2, 3', 4, 4', 5-Pentachlorobiphenyl 多氯联苯118
4-OH-CB107 4-Hydroxy-2, 3, 3\ 4\ 5-Pentachlorobiphenyl 4-轻基-多氯联苯107
SARs Structure-Activity Relationships 结构-活性相关性
PVC Polyvinyl Chloride 聚氯乙烯
GnRH Gonadotropin-Releasing Hormone 促性腺激素释放激素
GnRHR Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor 促性腺激素释放激素受体
HPG Hypothalamic-Pituitary-Gonadal 下丘脑-垂体-性腺轴
FSH Follicle-Stimulating Hormone 促卵泡素
LH Luteinizing Hormone 黄体生成素
GnIH Gonadotropin-Inhibitory Hormone 促性腺激素
ER Estrogen Receptor 雌激素受体
StAR Steroidogenic Acute Regulatory Protein 类固醇合成急性调节蛋白
SF-1 Orphan Nuclear Receptor Steroidogenic
Factor-1 孤核受体类固醇生成因子-1
P450scc Cytochrome P450 Cholesterol Side Chain
Cleavage Enzyme 碳链裂解酶
CYP17 17a-hydroxylase 17a-轻化酶
CYP19 Aromatase 芳香化酶
AhR Aryl Hydrocarbon Receptor 芳香炷受体
GPR54 G-protein-coupled Receptor 54 G-蛋白偶联受体54
PLC Phospholipase C 磷脂酶C

英文缩略表(续表)
英文缩写 英文全称 中文名称
PKC Protein Kinase C 蛋白激酶c
PIP2 4,5-Bisphosphate 磷脂酰肌醇二磷酸
IP3 Inositol Triphosphate 三磷酸肌醇
DAG Diacylglycerol 甘油二脂
RAF Receptor Accessory Factor 受体辅助因子
MEK Met-Enkephalin 甲硫氨酸脑啡肽
ERK Extracellular Signal-Regulated Kinase 细胞外信号调节激酶
SV40 Simian Vacuolating Virus 致癌猿猴空泡病毒40
PBS Phosphate Buffer Saline 磷酸缓冲盐溶液
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
Real-time qPCR Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 实时荧光定量聚合酶链式反应
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 酶联免疫吸附试验
LDH Lactate Dehydrogenase 乳酸脱氢酶
FITC Fluorescein Isothiocyanate 异硫氧酸荧光素
PI Propidium Lodide 碘化丙噪
PS Phosphatidylserine 磷脂酰丝氨酸
PMSF Phenylmethanesulfonyl Fluoride 苯甲基磺酰氟

第一章引言
本章综述了 PCBs的性质、应用、环境污染水平和毒性效应,OH-PCBs的生成和来源、环境 暴露水平和毒性效应以及分泌GnRH调控的机制,并阐述了研究内容和目的意义。
1.1PCBs的概述
1.1.1PCBs的性质和应用
PCBs是一类经高温氯化合成的氯代联苯同系物,分子结构十分稳定,如图1.1所示。根据氯 原子在联苯上取代数量和位置的不同,PCBs分为209种同系物,其化学结构的不同也导致各种 同系物的性质、环境行为和毒性差异较大,具有化合物结构一活性相关性(Structure-Activity Relationships, SARs)。PCBs的商业性生产起始于1929年,因其具有良好的化学惰性、耐热性、 高介电常数和低蒸气压等性能,成为润滑剂、绝缘介质和增塑剂等重要化工产品并在各国广泛生 产和应用。我国自1965年起开始生产PCBs,至1974年左右停产,总计生产量达到10000 t左右 (李娜,2012),其中三氯联苯的量约占90%,其余为五氯联苯,主要用作电力工业的绝缘油、 载热油以及油漆添加剂(Mai, 2005)o随着对PCBs的深入认识,发现其具有环境持久性、生物 蓄积性、远距离迁移性、高毒性等特点(Caoxiangzhong, 2008),极易通过生物链浓缩富集,对 生态环境和人类健康构成巨大的潜在威胁,是一类典型的持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)o因此,1976年左右PCBs逐渐被世界各国停止生产和使用,2004年生效的 《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》将其列入优先控制12类POPs名单(Cao xiangzhong, 2008)o
PCBs邻位上氯取代情况对其毒性有决定性的影响,并据此将209种PCBs单体分为类二噁 英 PCBs ( Dioxin-Like Polychlorinated Biphenyls, DL-PCBs)和非类二噁英 PCBs (Non-Dioxin- Like Polychlorinated Biphenyls, NDL-PCBs)两大类。DL-PCBs 在令M立(2, 2\ 6 和 6,)无氯取代 或者单氯取代,具有与四氯二苯并-p-二噁英(Tetrachlortetrachlorodibenzo-p-Dioxin, TCDD)相 似的共平面结构,也被称为共平面PCBs,表现出与芳香绘受体(Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR) 竞争性结合的特点,是毒性最强的一类PCBso NDL-PCBs的同边邻位被两个氯原子取代,在化 学键相互作用下导致两个苯环分子处于不同平面,称为非共面PCBs,该类化合物的毒性较前者 更弱(Buckley, 1982)。

图1.1 PCBs的分子结构图
Fig. 1.1 The structure of PCB s
1.1.2PCBs的污染和暴露水平
PCBs作为一类典型的POPs,迄今为止尚未发现其天然来源,环境中的PCBs是在生产和使 用过程中释放出来的。过去长达50多年的广泛生产、使用和排放,导致环境蓄积库仍能不断释 放PCBso PCBs处置焚毁厂和电子垃圾产品的不规范拆解是PCBs污染环境的重要来源,此外, PCBs作为副产物在一些含氯化合物如聚氯乙烯(Polyvinylchloride, PVC)和二氯苯(李素梅, 2009)高温合成中伴随生成,也是PCBs污染的来源之一。虽然PCBs己经在全球范围内停止生 产和使用,但PCBs具有化学稳定性和长距离迁移性,并且可经食物链富集传递。许多报道发现, PCBs仍然在大气、水源、飘尘、土壤等环境介质以及生物体内广泛的存在(WHO, 1993; Davis, 2007; Cetin, 2016)。并且,己经远距离扩散至人类活动稀少的地区,如喜马拉雅山脉和南北两 极地区(姚婷,2014)o PCBs还通过食物链迁移到动物和人体内,在水陆生动物及高等哺乳动物 包括人体脂肪组织、母乳、血清中均检测到PCBs (卢冰,2005; Fernandez-Gonzalez, 2015; Van den Berg, 2017)o
PCBs理论上有209种同系物,但在环境体系中,暴露水平较高的PCBs同系物大约有90多 种(Bacon, 1992),主要来源于商品化生产的PCBs产品。其中,以PCB28、PCB52、PCB10K PCB118、PCB138、PCB153和PCB180含量居高。因此,联合国在全球食品污染物监测规划 (Global Environment Monitoring System-Food Contamination Monitoring and Assessment Programme, GEMS/Food)中规定以这七种PCBs同系物作为评估PCBs污染状况的指示性单体进 行替代性监测。研究显示,随着PCBs的停产和限制使用,其环境暴露水平逐渐下降(Faroon, 2003)o卢双等(2016)调查了黄河中下游表层土壤中SPCBs变化范围为0.43〜39.83 ng/g dw,均 值为3.72 ng/g,与国内其他地区相比较,黄河中下游流域表层土壤中PCBs的暴露水平较低。 Bytingsvik等(2008)调查发现2018年极地地区北极熊母体内PCBs含量(2560+1500 ng/g脂肪 重)显著低于1997/1998年PCBs暴露水平(5710+3090 ng/g脂肪重),其幼崽体内PCBs的暴露 水平也同样呈现下降趋势(1997/1998: 14680+5350 ng/g脂肪重,2008: 6070+2590 ng/g脂肪重); 胡国成等(2012)对白洋淀8种鱼类体内PCBs监测发现,白洋淀鱼类体内PCBs以四氯联苯和 五氯联苯为主,平均含量范围是55.85〜1485.74 ng/g脂肪重。此外,还有研究发现,中等氯原子 取代的同系物较低氯、高氯原子取代的PCB同系物更易在生物体内富集,PCBs的富集程度与 氯原子个数呈现出抛物线关系(Wu, 2008)o WHO从2000年到2010年间在全球范围开展的3 次针对母乳中POPs含量的监测数据也反映了各国PCBs人体暴露水平持续下降的趋势(Van den Berg, 2017)o鲍彦等(2016)也发现北京市普通居民母乳中指示性PCBs暴露水平水平较低, 总含量范围为 1.10-17.59 ng/g fat,均值为 6.02 ng/g fate
1.1.3PCBs的内分泌干扰效应
一些外源性物质能够干扰生物体内源激素的合成、释放、转运、结合、作用或清除,从而影 响机体的内环境稳定、生殖、发育及行为,此类化合物被称为内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals, EDCs)(史熊杰,2009)o EDCs种类繁多,性质差异较大,主要包括PCBs、有机氯农 药、二噁英、多漠联苯醍、己烯雌酚等人工合成化合物或植物激素等天然化合物。
PCBs作为EDCs的典型代表,众多试验表明其具有内分泌干扰效应,能够通过各种途径影 响甲状腺素、性激素和神经激素等的水平或功能,从而对动物或人体的生殖和发育等功能产生不 良影响oEguchi等(2015)报道PCBs能够干扰女性体内促甲状腺素和甲状腺素的分泌;Soechitram 等(2017)还发现妊娠期暴露某些PCBs会影响脐带血中三碘甲状腺原氨酸(T3)的含量,T3 对机体的生长发育和代谢具有重要作用,表明母体暴露PCBs会通过脐带血间接影响胎儿的生长 发育。Zheng等(2017)通过多元线性回归模型来检测PCBs和OH-PCBs的暴露与机体内甲状腺 素水平和相关基因表达的关系,虽然未观察到PCBs和OH-PCBs的暴露与机体内甲状腺素水平有 显著相关性,但与调控TH的基因表达有显著关系。有报道表明甲状腺素在神经发育中发挥很重 要的作用(Park, 2009), PCBs对调控TH基因表达的影响可能帮助其发挥神经发育毒性和内分 泌干扰作用。
PCBs混合物(Aroclor 1254)在以较低浓度(0.1-1遽/ ml)暴露鸡胚卵巢细胞主要表现为雌 激素作用刺激生殖细胞增殖,而较高的暴露浓度(lOyg/ml)则产生严重的细胞毒性,表明PCBs 暴露可能会干扰卵巢生殖细胞增殖,并通过对鸡胚的雌激素作用引起生殖障碍(Xie, 2004);在 妊娠和哺乳期间低剂量暴露PCB153会破坏雌性山羊后代的激素产生和青春期发育(Lyche, 2004)o值得关注的是,一些PCBs单体通过干扰类固醇激素合成途径中关键基因的表达,从而影 响机体内类固醇激素的合成和释放(Xu Y, 2006),雌激素和睾酮等均属于类固醇激素,提示PCBs 能通过干扰类固醇激素的合成而发挥性激素内分泌干扰效应。PCBs不仅影响机体雌激素的水平 和功能,对雄性激素及其性腺功能也有影响,研究发现PCBs的暴露与法罗群岛男性血液中LH 和睾酮(T)的浓度有很大相关性,是导致男性精子形态畸变,精液质量下降的重要原因(Petersen, 2018)o
性腺激素对动物及人体的性别分化和生殖发育具有重要作用,其分泌水平和功能的发挥受到 下丘脑-垂体-性腺(Hypothalamic-Pituitary-Gonadal, HPG)轴的直接调控,其中,GnRH是HPG 轴的起始信号,其对生殖发育的影响也不容忽视。Chio等(2012)经体内外实验发现PCB118具 有抑制大脑微血管中紧密连接蛋白表达以及损伤血脑屏障完整性的作用,表明此类物质可能透过 血脑屏障,从而产生神经毒性作用。流行病学调查显示PCBs具有损伤儿童神经发育和认知的作 用(Brucker-Davis, 2015)。Gore 等(2002)发现 PCBs 混合物 Aroclor 1211 和 1254 能干扰 GT1-7 细胞分泌GnRH,造成严重的神经细胞毒性作用。目前,关于神经内分泌干扰效应的毒理学数据 还比较少,有待于进一步研究。
1.1.4PCB118 简介
PCB118由两个苯环上第2、3\ 4、4,和5等五个取代位上的氢原子被氯原子所取代产生, 分子结构如图1.2所示。PCB118不仅属于12种DL-PCBs之一,毒性较NDL-PCBs更高,也是 七种指示性PCBs之一。在我国长江三角洲地区受污染的水、土壤和水生生物中,PCB118是最 为常见的PCBs单体之一(Tarkowski, 1996)。有调查显示,在市售的猪肉、牛肉和羊肉等动物 性食品中,PCB118是暴露水平最高的一种PCBs单体(王春雷,2009)o Kerchich等(2018)报 道PCB118在垃圾焚烧后的灰分和烟雾中均有较高的暴露水平,占据DL-PCBs总量的67%;在 我国台州市电子垃圾拆解工人血清中,PCB118是检出率很高的PCBs单体之一(Ma, 2017)。 大量研究报道表明,PCB118是环境以及机体组织中对PCBs总含量贡献最大的化合物单体之一。 流行病学调查显示,PCB118暴露不仅造成机体代谢紊乱和生殖功能异常,同时具有一定的内分 泌干扰效应(Kuriyama, 2004; Gregoraszczuk, 2008;郭宏伟,2015; Lind, 2014)。Dickerson 等(2009)研究发现PCB118具有干扰GT1-7细胞分泌GnRH的作用;据报道,PCB118 (3 ^ig/mL) 即可显著促进体外猪卵巢内膜细胞和颗粒细胞共培养时雌激素的分泌(Gregoraszczuk, 2008); 郭宏伟等(2015)发现低浓度PCB118可抑制人甲状腺原代细胞Tg、T4的合成。PCB118具有广 泛的内分泌干扰效应。

图1.2 PCB118的分子结构图
Fig. 1.2 The structure of PCB118

1.2OH-PCBs 概述
1.2.1OH-PCBs的生成和来源
虽然PCBs能在环境中蓄积残留,但通过食物链进入生物体后,仍然可以缓慢转化成其它的 代谢产物。在不同生物体内,野外采集样品和室内代谢实验中均检测到PCBs的代谢物OH-PCBs 和甲磺基 PCBs(Methylsulfonyl Polychlorinated Biphenyls, MeSO2-PCBs)o 其中,OH-PCBs 是 PCBs 最主要的活性代谢产物。
OH-PCBs的形成主要依赖于细胞色素P450 (CYP450)酶系统,经PCB芳环上间、对位的 氧化作用,包括直接加轻基或者氯原子的NIH转换(芳环在轻基化的过程中分子内氢原子位置的 转换)形成(Letcher, 2000)。PCBs的代谢速率和程度取决于不同异构体氯取代的数量和位置。 通常情况下,氯原子取代数目多于6个或者是对位氯取代的PCBs单体较难轻基化,显示出较长 的半衰期,而低氯取代的PCBs或间、对位非氯取代的PCBs单体则代谢更快并易于形成轻基化 产物(Matthews, 1975)。具有4-OH-3, 5-2CI分子结构的OH-PCBs异构体能够与血浆中的蛋白 质可逆性结合,因而能够在血液中长期存在(Grimm, 2015)。此外,许多OH-PCBs还能够与葡 糖醛酸或者硫酸盐结合以持留于血液(Grimm, 2015)。PCBs的209种异构体可形成约837种构 型的OH-PCBs,其中约40种己经在人体和动物血液中检测到(Grimm, 2015)。人类和动物血液 中常见OH-PCBs及其母体化合物如表1所示。

表1.1人类和动物血液中常见的OH-PCBs及其母体化合物
Table 1.1 Several common OH-PCBs in human or animals blood and their suggested parent compound 母体PCBs
OH-PCBs 生物种类 参考文献
直接氧化加轻基 氯原子的NIH转化
4'-OH-CB97 PCB97 PCB99 人 (S oechitram, 2004)
4,-OH-CB101 PCB101 PCB99 人 (Hovander, 2002; Soechitram, 2004) (S oechitram, 2004 ; Mizukawa, 2015;
4-OH-CB107 PCB107 PCB118/PCB105 人、山羊、猪、海豹 Houde, 2006;
Weijs, 2009;
Berg, 2010)
4-OH-CB109 PCB109 PCB118/PCB105 湖红点鮭 (Campbell, 2003)
3-OH-CB118 PCB118 PCB107/PCB126 人 (S oechitram, 2004)
(S oechitram, 2004 ;
4-OH-CB146 PCB146 PCB153/PCB138 人、海豹、北极圈海鸟 Weijs, 2009;
Helgason, 2010)
3-OH-CB153 PCB153 PCB146/PCB167 人 (Berg, 2010)
(Jansson, 1975;
4-OH-CB162 PCB162 PCB157/PCB167 人、猪、海豹 Weijs, 2009;
Berg, 2010)
4J-OH-CB172 PCB172 PCB170/PCB180 人 (S oechitram, 2004 )
4-OH-CB187 PCB187 PCB183 人、猪 (S oechitram, 2004 ;
Mizukawa, 2015)
4'-OH-CE199 PCB199 PCB196/PCB204 人 (S oechitram, 2004 ;
Weijs, 2009)
4-OH-CB202 PCB202 PCB199 海豹 (Weijs, 2009)

1.2.2OH-PCBs的暴露水平
1975年,在波罗的海海豹和海鸟的排泄物中首次检测出OH-PCBs (Jansson, 1975)。随后, Bergman等(1994)在人类血浆中首次检出OH-PCBs,并发现此类化合物能持留于血液而不发生 进一步结合转化和排泄。后续研究发现,OH-PCBs在水、沉积物、动物及人体组织等环境介质广 泛分布(Tehrani, 2014)。其中,4-OH-CB187、4-OH-CB107、4-OH-CB146 等是动物及人体组织 或血液中OH-PCBs含量的主要贡献者。
很多研究显示,在海洋和陆地哺乳动物、鱼类、鸟类血液中可检出OH-PCBs,但由于不同种 属动物代谢能力不同,导致其检出水平及特征存在一定程度的差异,不同动物组织中轻基 OH-PCBs的暴露水平如表1.2所示。虽然一些OH-PCBs能被机体排出体外,但是具有对位或间 位轻基取代且有邻氯取代的OH-PCBs更易与蛋白质结合而滞留在血液中。此外,哺乳动物不仅 可以通过代谢蓄积OH-PCBs,也能直接经食物链蓄积OH-PCBs (Weijs, 2009),因此可能威胁
生物机体的健康和安全。PCBs及其代谢物暴露情况的研究早期主要集中在水生和极地动物,有 关畜禽类动物OH-PCBs暴露水平的研究较少。然而,食物是人类暴露PCBs及其代谢产物的主要 途径,家畜和家禽作为人类主要的动物性食品来源,其暴露水平也逐渐引发人们的关注oMizukawa 等(2015)研究发现垃圾排放点附近仔猪体内OH-PCBs的含量最高,其次是母猪和公猪;PCBs 在公猪体内的总含量高达3.1 ng/g,而仔猪和母猪分别只有0.140 ng/g和0.017 ng/g,由此推测母 猪比公猪对PCBs具有更强的代谢能力或更易富集OH-PCBs,且可能通过哺乳或者胎盘途径将 PCBs或OH-PCBs传递到仔猪体内。
表1.2不同动物组织中OH-PCBs的含量
Table 1.2 Concentrations of hydroxylated PCBs in different animals5 tissue
动物品种 含量(ng/g w/w) 主要 OH-PCBs 参考文献
东格陵兰岛北极熊 1 020 (血液)
60 (脂肪)
18 (脑)
355 (肝脏) 4-OH-CB187/4’-OH-CB199
4-OH-CB187/4-OH-CB146
4-OH-CB 187/4’-OH-CB199
4-OH-CB 187/4-OH-CB 107 (Gebbink, 2008)
贝加尔海豹 0.71-4.6 (血浆) 4-OH-CB 187/4-OH-CB 146 (Imaeda, 2014)
白腰鼠海豚 江豚 鼠海豚 0.058 (血浆)
0.020 (血浆)
0.0083 (血浆) 4-OH-CB97/4-OH-CB107 (Ochiai, 2013)
湖红点鮭鱼 0.010-0.173 (血浆) 4-OH-CB 187 (Campbell, 2003)
猪(垃圾站附近) 0.110 (公猪血浆)
0.190 (母猪血浆)
0.290 (仔猪血浆) 4-OH-CB 107 (Mizukawa, 2015)
注:w/w表示湿重

表1.3不同国家或地区人体血液中OH-PCBs的含量
Table 1.3 Concentrations of hydroxylated PCBs in the human blood from different countries or regions
不同地区人群/组织 含量(ng/g) 主要 OH-PCBs 参考文献
加拿大因纽特人/全血 0.117-11.6 w/w 4-OH-CB 109 (Sandau, 2000)
法罗群岛孕妇/血清 0.34-8.1 "w 4-OH-CB 187/4-OH-CB 146 (Fangstrom, 2002)
捷克斯洛伐克东部孕妇/血清 胎儿/脐带血血清 0.149-1.981 w/w
0.112-1.495 w/w 4-OH-CB 187/4-OH-CB 146 (Park, 2009)
北越电子废物回收站附近居民/血清 0.06-1.3 w/w 4-OH-CB 107/4-OH-CB146/4-OH -CB187 (Eguchi, 2015)
印度沿海地居民/血清
印度电子垃圾拆解工人/血清 0.013-0.11 w/w
0.012-0.14 w/w 4-OH-CB 107/4'-OH-CB 108 (Eguchi, 2012)
日本乳腺癌患者/血清 /乳腺脂肪组织 0.17-0.96 w/w
0.04 〜0.55 1/w 4-OH-CB 187/4-OH-CB 146/4-OH
-CB 107/4-OH-CB 101 (Nomiyama, 2010)
日本油症患者/血清 0.039-1.3 w/w 4-OH-CB 187/4-OH-CB 146 (Tobiishi, 2013)
中国东部电子垃圾拆解工人/血清 0.105-3.88 w/w 4-OH-CB 107 (Ma, 2017)
注:〃w表示鲜重,1/w表示脂重
不同性别、国家或地区的人群体内OH-PCBs的含量和种类均存在差异性,一方面可能由于 代谢能力存在差异,另一方面也源自不同环境中PCBs暴露水平和同系物的不同。OH-PCBs在血 清或血浆中检出浓度水平介于0-11.6 ng/g (湿重),大约占PCBs总含量的10%〜45%。不同国家 或地区人体血液中OH-PCBs的含量如表1.3所示。尽管OH-PCBs主要由PCBs生物转化形成, 依赖于个体代谢水平差异,但个体饮食习惯如喜食水产品等以及自然环境等外部因素也对身体 OH-PCBs负荷产生了重要影响。值得关注的是,通过摄入房屋内粉尘或电子废品产生的污染物也 会增加机体对OH-PCBs的富集程度,在我国台州市电子垃圾拆解工人体内具有较高的暴露水平 (Ma, 2017)。
1.2.3OH-PCBs的内分泌干扰效应
PCBs在生物体内可能通过多种形式表现出毒性作用,其中就包括在细胞色素氧化酶的作用 下,其代谢形成OH-PCBs和MeSCh-PCBs等代谢产物,造成比母体化合物本身更强的毒性作用 (刘李超,2013)。虽然PCBs被认为是内分泌干扰物,能作用于机体内分泌系统。但己经有报道 显示,其轻基代谢产物OH-PCBs也能发挥一定程度的内分泌干扰效应,甚至比其母体化合物的 作用更加显著(Park, 2009)o
研究发现,OH-PCBs能干扰动物如北极熊、海豹、鳄鱼等以及人体甚至婴儿体内甲状腺激素 水平。这与OH-PCBs的化学结构与甲状腺激素相似有关,其能与甲状腺激素竞争结合甲状腺转 运蛋白(Transthyretin, TTR),从而干扰甲状腺素的转运并诱导微粒体酶活性(Letcher, 2015)。 此外,OH-PCBs是磺基转移酶的基质或抑制剂,可能通过抑制磺基转移酶催化甲状腺素的硫酸化 过程,从而干扰甲状腺激素的合成和代谢(Grimm, 2015)。
大量研究报道,OH-PCBs能干扰机体雌激素的水平和功能。Ptak等(2005)发现PCB3及 其轻基化代谢产物4LOH-PCB3在暴露浓度为0.06ng/mL时就能促进猪卵巢卵泡细胞分泌E2,且 4,-OH-PCB3增加E2分泌的效力要高于PCB3。一些低氯取代的OH-PCBs在标准酵母雌激素测定 报告中显示出较微弱的类雌激素作用(Schultz, 2002), 4-OH-PCB 146、4-OH-PCB 107、 3-OH-CB180和4-OH-PCB 187等高氯取代的OH-PCBs与E2共处理荧光素酶报告基因转染的人 宫颈癌细胞后呈现出抗雌激素活性(Moore, 1997)。研究表明,OH-PCBs —方面通过直接影响 类固醇合成急性调节蛋白(Steroidogenic Acute Regulatory Protein, StAR)、孤核受体类固醇生成 因子-1 (Orphan Nuclear Receptor Steroidogenic Factor-1, SF-1)> 碳链裂解酶(Cytochrome P450 Cholesterol Side Chain Cleavage Enzyme, P450scc)、17a-轻化酶(17a-hydroxylase, CYP17 )和 芳香化酶(Aromatase, CYP19)等类固醇激素合成关键调控因子的活性(Gustavson, 2015; Mlynarczuk, 2015; Braathen, 2009; Ptak, 2006),进而干扰类固醇激素的生物合成。另一方面, OH-PCB能作为激动剂或者拮抗剂与ERa或ER卩受体反应,从而产生类雌激素或抗雌激素效应 (Connor, 1997; Takeuchi, 2011)。此外,有报道表明OH-PCBs也是一种有效的AhR激动剂 (Kamata, 2009),与共平面 PCBs —样能通过芳香桂受体(Aryl Hydrocarbon Receptor, AhR) 途径干扰性腺激素的代谢。同样地,OH-PCB也能通过抑制磺基转移酶的活性间接导致雌激素失 活(Grimm, 2015)。
目前,针对OH-PCBs神经内分泌干扰效应的研究比较少,但是有报道表明OH-PCBs能通过 结合TTR穿越血脑屏障,从而进入脑组织,在大脑发育过程中具有高度的敏感性(Grimni, 2015), 对神经发育具有不利影响。经体内外实验发现,某些非共面性PCBs与其代谢产物均能影响大鼠 神经元内C/+平衡(Kodavanti, 2003),通过影响神经细胞内钙离子的内稳态发挥神经毒性作用 (Londono, 2010)。某些牛OH-PCBs如4・OH-CB35、4-OH-CB39能刺激小脑颗粒细胞形成大量 的活性氧,4-OH-CB36显著诱导该细胞死亡和凋亡(Dreiem, 2009)。OH-PCBs对神经细胞的毒 性作用是否会进一步干扰神经内分泌系统,如影响GnRH的合成和分泌以及其功能的发挥,还有 待于研究。己经有报道表明,E2通过与ER结合可以参与调控HPG轴以及下丘脑内神经肽的表 达和神经递质的释放等,进而影响GnRH神经元生理功能的发挥。OH-PCBs因其化学结构与雌 激素相似具有一定的类雌激素或抗雌激素活性(Moore, 1997; Schultz, 2002), Dickerson等(2009) 发现ER抑制剂可以拮抗PCB118对GT1-7细胞分泌GnRH的抑制作用,提示PCBs的代谢可能 会进一步促进其代谢产物OH-PCBs介导ER途径来发挥神经内分泌干扰效应。
1.2.44-OH-CB107 简介
4-OH-CB107作为人体血液内主要的OH-PCBs之一,是PCB118或PCB105经NIH转换机制 产生(Sandau, 2002),分子结构如图1.3所示,其对动物和/或人体潜在的内分泌干扰及其它毒 性作用己经引起了越来越广泛的关注。在4-OH-CB107或者PCBs混合物Aroclorl254暴露产前大 鼠的实验中观察到,仔鼠的血浆和脑组织中T4总量降低(Meerts, 2002)o此外,Meerts (2004) 等观察到4-OH-CB107暴露Wistar大鼠能诱发神经发育毒性,包括改变行为如损伤雄性后代的习 性和增加雌性后代运动发生的延迟。Kester等(2000)报道OH-PCB能有效地抑制雌激素磺酰基 转移酶活性,该酶能促进硫酸盐化作用和雌激素钝化。同时,Purinton等(2000)也在羊胎儿的 脑部区域如下丘脑和脑干中检测到雌激素磺酰基转移酶,这表明4-OH-CB107可以作为一种抗雌 激素化学物质来影响神经发育。在一项人类试验中,脐带血中4-OH-CB107含量与儿童心理发育 指数呈现负相关性,这可能与其引发的内分泌干扰、神经递质功能紊乱或者中枢神经系统甲状腺 激素水平降低有关(Park, 2009)o因此,OH-PCBs的内分泌干扰作用和相关机制需要进一步研 究。

图1.3 4-OH-CB107的分子结构图
Fig. 1.3 The structure of4-OH-CB107
1.3GnRH分泌调控机制的研究
1.3.1GnRH 概述
GnRH是在下丘脑神经元中合成并以脉冲方式分泌的酰胺化十肽,经垂体门脉循环运输至垂 体前叶。作为哺乳动物性别分化和生殖功能的重要信号分子,GnRH通过促性腺激素释放激素受 体(Gonadotropin-Releasing Honnone Receptor, GnRHR)相结合起始下游信号通路从而调节垂体 中促性腺激素细胞分泌FSH和LH, FSH和LH进入外周血液循环并作用于性腺从而调节卵泡生 成、排卵、精子生成和类固醇合成等生殖功能(Stamatiades, 2018)。促性腺激素FSH和LH以 及性腺激素如雌激素(Estrogen)和睾酮(Testosterone)等也能反馈调节GnRH的合成分泌,从 而在下丘脑、垂体和性腺之间形成了一条复杂且严密的轴线系统,即HPG轴(Yeo, 2018),如 图1.4所示。由此看出,GnRH的脉冲式释放是调控动物生殖发育的关键,HPG轴在多个水平上 相互协调和制约的调控方式保证了动物神经和生殖内分泌系统的相对稳定。
Fig. 1.4 Hypothalamic-pituitary-gonadal axis of mammals
GnRH作为一种自分泌/旁分泌调节因子,直接参与调控GnRH神经元,进而使GnRH的脉 冲分泌保持最适的状态,以满足机体的生理需求(Leung, 1992)。然而,在不同生理条件或病 理条件下,GnRH的合成和脉冲分泌会受到许多内外因子和调节系统控制,其脉冲分泌模式均会 发生相应的改变(Tsutsumi, 2009)。在生理条件下,许多神经递质和神经肽参与了分泌GnRH 的调控,细胞内信号分子NO、瘦素Leptin、谷氨酸和Kisspeptin等对GnRH有正反馈调节作用, 而丫-氨基丁酸、阿片肽、神经肽Y和N-甲基天冬氨酸等对GnRH具有负反馈调控作用(陈志 龙,2017;张丽,2014) o研究表明许多化学污染物可能通过干扰神经递质如谷氨酸脱氢酶和酪 氨酸氢化酶等的合成进而间接发挥神经内分泌干扰效应(Martyniuk, 2009)。同时,分泌GnRH 还受到性腺类固醇激素如E2的负反馈调节,神经内分泌和生殖内分泌相互作用和制衡的密切关 系维持着机体正常的生理活动。随着EDCs问题日益凸显,越来越多的研究发现外源性内分泌干 扰物能通过内分泌、神经、免疫等系统的相互影响和相互制约来发挥其干扰作用,对动物及人类
的发育、生殖、行为等功能产生不良影响。
1.3.2Kisspeptin/GPR54信号通路对GnRH分泌的调控
GnRH的合成和分泌过程受到诸多因子和调节系统控制。其中,Kisspeptin/GPR54信号通路 是参与GnRH脉冲式分泌的关键信号机制。研究发现,Kisspeptin能直接或间接影响GnRH神经 元的活化,发挥整合和促进GnRH释放的中枢及外周信号的功能,进而激活HPG轴(d'Anglemont, 2010; Adams, 2018), Kisspeptin/GPR54被认为是青春发育启动的“分子阀门”,在生殖发育过程 中具有重要作用。
GnRH神经元受到其上游神经元(kiss-l)的直接调控,kiss-l神经元内含有kiss-l基因可以 编码的 Kisspeptin 多肽,是 G-蛋白偶联受体 54 (G-protein-coupled Receptor 54, GPR54)的内源 性配体(Ohtaki, 2001)。Kisspeptin与GPR54结合后,受体构象改变激活G“ii蛋白(调节磷脂 酶C活性的特异蛋白,是肌醇磷脂途径中膜受体和磷脂酶C的中介物),从而促进磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)的活化,磷脂酰肌醇二磷酸(4, 5-bisphosphate, PIP2)在 PLC 的作用 下分解为三磷酸肌醇(Inositol Triphosphate, IP3)和甘油二脂(Diacylglycerol, DAG),二者均 是胞内第二信使。IP3促使细胞内质网的“钙库”释放C/+,胞浆内C0浓度增加后激活蛋白激酶 C (Protein Kinase C, PKC)以及下游的受体辅助因子(Receptor Accessory Factor, RAF) 一甲硫 氨酸脑啡肽(Met-Enkephalin, MEK1/2) 一细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-Regulated Kinase, ERK1/2)等激酶磷酸化级联反应途径。同时,DAG活化细胞膜上的非选择性阳离子通 道并抑制K+的外向电流而达到GnRH神经元的去极化(Zamponi, 1997; Quaynor, 2007;刘羽 欣,2015)。GnRH神经元活化示意图如图1.5所示。此外,Kisspeptin还能通过与下丘脑中其它 表达GPR54的神经元作用从而间接调控GnRH神经元的活化(Herbison, 2010)。

图1.5 Kisspeptin/GPR54信号通路调控GnRH合成与分泌的分子途径(刘羽欣,2015)
Fig. 1.5 Molecular mechanisms of GnRH synthesis and secretion via Kisspeptin/GPR54 signaling pathway
1.4GT1-7细胞是研究GnRH神经元的理想模型
GnRH神经元是调控哺乳动物生殖系统的最终共同通路,主要在前脑嗅区、隔区和下丘脑等 区域呈弥散状分布,总量不足3000个(冯涛,2016)。下丘脑是由功能多样且不均一的神经核团 组成的复杂器官,参与调控机体的多种生理活动,是中枢神经系统的重要组成部分。因此,不论 是通过整体动物和组织切片等方式以进行GnRH神经元功能和特性的研究,还是通过体外原代培 养单个且数量足够的GnRH神经元细胞以开展细胞水平和分子机制的研究,都具有很大困难,对 GnRH神经元功能机制的深入研究也因此受到阻碍。
Mellon 等(1990)将致癌猿猴空泡病毒 40 (Simian Vacuolating Virus, SV40)抗原(Taq) 基因与GnRH神经元的调控基因杂合后,整合转移至小鼠受精卵原核中,进一步筛选克隆出具有 GnRH神经元活性和无限增殖双重特性的杂交瘤细胞,成功分离得到具有高度分化GnRH神经元 特性的GT1细胞株。GT1细胞株被进一步亚克隆得到GT1-1、GT1-3和GT1-7三个细胞系,已 经被广泛利用在GnRH神经元功能、分子和细胞生物学等研究领域。GT1-7细胞具有GnRH神经 元多种功能和特性,如多种信号通路参与调控细胞活性、表型形态包括神经元形态和突触传递、 超微结构、基因表达如GnRH、kiss-1、GPR54、ER、c-fos和nNOS mRNA等、激素储存和脉冲 分泌GnRH等均与GnRH神经元一致,同时也不表达下丘脑中分泌的其他激素和调控因子 (Fichna, 2011),是体外研究GnRH神经元的理想模型。
Son等(2016)利用GT1-7细胞模型研究发现促性腺激素(Gonadotropin-Inhibitory Hormone, GnIH)可通过cAPM/PKA信号通路参与对GT1-7细胞分泌GnRH的负反馈调节;Chason等(2015) 利用GT1-7细胞模型探究发现膜起始分泌GnRH与E2信号存在交互作用,ER受体参与调控GnRH 的合成。Sukhbaatar等(2013)发现细胞外信号调节激酶ERK和cAMP/PKA信号通路参与 Kisspeptin刺激GT1-7细胞中GnRH受体的表达;Ozcan等(2011)利用GT1-7细胞研究发现 kisspeptin/GPR54通过PKC信号通路调节下游细胞内钙离子通量从而影响GnRH的分泌; Dickerson等(2009)研究发现三种PCBs具有不同程度干扰GT1-7细胞分泌GnRH、细胞增殖、 细胞凋亡和坏死等内分泌干扰效应和神经毒性作用,并证明ER参与此类内分泌干扰物对分泌 GnRH的影响。目前,仅在Web of Science数据库检索就有730篇文献是有关GT1-7细胞的理论 或试验研究,其成功分离推动了神经内分泌和生殖内分泌调控领域的研究进程。
1.5研究内容和目的意义
1.5.1研究内容
本试验以小鼠下丘脑永生GnRH神经元离体细胞系GT1-7细胞为模型,从细胞存活率、细胞 凋亡、GnRH分泌水平和Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白及其mRNA表达等方面探究PCB118 和4-OH-CB107对GT1-7细胞分泌GnRH的影响和作用机制。研究工作主要从以下几个方面开展:
(1)检测PCB118和4-OH-CB107对GT1-7细胞存活率、LDH活性和细胞凋亡的影响,确 定两种受试物对细胞增殖和细胞凋亡的毒性作用,并为后续GnRH分泌干扰试验提供剂量选择依 据。
(2)根据细胞增殖毒性和细胞凋亡试验结果,选择一定浓度的PCB118和4-OH-CB107处理 GT1-7细胞,检测细胞培养上清液中GnRH分泌量的变化,观察两种受试物的神经内分泌干扰效 应。
(3)Kisspeptin/GPR54信号通路是调控GnRH分泌的关键信号机制,在上述试验的基础上 检测该信号通路中GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白及其基因mRNA表达水平的变化,以探 究Kisspeptin/GPR54信号通路是否介导两种受试物对GT1-7细胞分泌GnRH的影响,初步阐明两 种受试物干扰GT1-7细胞分泌GnRH的作用机制。
1.5.2研究目的和意义
PCB118是环境和动物及人体组织内检出率较高的单体之一,具有类二噁英的分子结构和毒 性作用,内分泌干扰效应突出。PCB118在动物体内能够发生轻基化代谢,其中4-OH-CB107是 其主要的代谢产物,同样发现其具有内分泌干扰效应。目前,己有的研究主要集中在PCB118和 4-OH-CB107对性激素和甲状腺激素的影响,对神经内分泌干扰效应和机制仍然缺乏全面和深入 系统的研究。
因此,本试验利用小鼠下丘脑永生GnRH神经元离体细胞系GT1-7细胞模型,通过分析 PCB118及其轻基代谢物4-OH-CB107对GT1-7细胞毒性和GnRH分泌的影响,探明GnRH分泌 信号传导通路中关键基因和蛋白表达差异变化,揭示PCB118和4-OH-CB107发挥神经内分泌干 扰效应的毒性机制。本试验的研究结果将为阐明PCBs类化合物内分泌干扰效应作用机制提供毒 理学数据支持,为科学评价PCBs及其轻基化代谢物毒性作用提供理论参考。
第二章 PCB118和4-OH-CB107对GT1-7细胞毒性及GnRH
分泌影响与机制研究
下丘脑GnRH神经元作为内外因子调控动物生殖发育的关键通路,其功能紊乱对生殖发育和 机体健康都具有不可忽视的作用。GnRH神经元作为HPG轴的关键靶标,既参与合成和分泌 GnRH,又是调控哺乳动物生殖系统的最终共同通路。因此,EDCs对神经内分泌的影响成为当前 该研究领域的热点之一。GnRH的合成和分泌过程受到诸多因子和调节系统控制,其中, Kisspeptin/GPR54信号通路是参与GnRH脉冲式分泌的关键信号机制。研究发现,Kisspeptin能 直接或间接影响GnRH神经元的活化,发挥整合和促进GnRH释放的中枢及外周信号的功能,进 而激活 HPG 轴(d'Anglemont, 2010; Adams, 2018)。研究表明 Aroclor 1254 和 PCB118 等 PCBs 混合物或单体能够在细胞水平干扰GnRH的合成和分泌(Dickerson, 2009; Gore, 2002), ER参 与PCB118对GnRH分泌的影响,但其它相关机制的研究还比较少。4-OH-CB107作为动物或人 体血液中残留量最高的OH-PCBs之一,目前仅有少数研究报道了 4-OH-CB107的神经发育毒性 和相关机制,但关于神经内分泌干扰效应和相关机制的毒理学数据尚未见报道。
本试验以GT1-7细胞为模型,开展PCB118和4-OH-CB107对GT1-7细胞GnRH分泌的影响 和相关机制的研究,分析两种受试物分别对GT1-7细胞的细胞存活率、LDH活性、细胞凋亡和 GnRH分泌量的影响,并基于Kisspeptin/GPR54信号通路对GnRH分泌的调控,测定该信号通路 中GnRH、GPR54、PLC和PKC等相关蛋白及其基因mRNA的表达水平,进而探讨PCB118和 4-OH-CB107干扰GT1-7细胞分泌GnRH的效应和作用机制。
2.1材料和方法
2.1.1细胞模型
选择小鼠下丘脑永生GnRH神经元离体细胞系GT1-7细胞为试验模型,该细胞系具有高度分 化的GnRH神经元细胞的特征,其表型形态、超微结构、基因表达以及激素储存和分泌的方式与 GnRH神经元保持一致,与原代培养的神经细胞相比,GT1-7能在体外分裂传代且增殖快速,易 于培养,有利于进行神经内分泌学的研究。GT1-7细胞系由军事医学科学院彭双清研究员馈赠。
2.1.2试剂材料
试验中使用的主要试剂与材料如表2.1所示。
2.1.3仪器设备
试验中使用的主要仪器与设备如表2.2所示。

表2.1试验中主要试剂材料
Table 2.1 Major reagents and materials in the research
试剂或材料 供应商
DMEM高糖培养基 中科迈晨,中国
胰蛋白酶液 中科迈晨,中国
青链霉素双抗 中科迈晨,中国
磷酸盐缓冲液PBS 中科迈晨,中国
胎牛血清 GIBCO, USA
二甲基亚砚 Sigma, USA
PCB118 DR, Germany
4-OH-CB107 Wellington, Canada
CCK8检测试剂盒 Dojindo,日本
Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒 BD,美国
乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒 上海碧云天,中国
小鼠促性腺激素释放激素酶联免疫检测试剂盒 BIM,美国
RIPA蛋白裂解液 中科迈晨,中国
BCA蛋白浓度测定试剂盒 CST,美国
PMSF 中科迈晨,中国
脱脂奶粉 BD,美国
G蛋白偶联受体54 (GPR54) 一抗 Abeam,美国
磷脂酶C (PLC) 一抗; Abeam,美国
蛋白激酶C (PKC) 一抗 Abeam,美国
促性腺激素释放激素(GnRH) —抗 lifespan, 美 国
p-actin 一抗 北京柏奥易杰,中国
HRP标记山羊抗兔二抗 北京博奥龙,中国
预染蛋白Marker 上海爱必信,中国
培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒 北京天根,中国
FastFire qPCR PreMix ( SYBR Green) 北京天根,中国
HotStart Taq MasterMix 北京天根,中国
FastKing RT Kit (With gDNase) 北京天根,中国
GeneGreen核酸染料 北京天根,中国
DNA Marker 北京天根,中国
DNase/RNase-Free 去离子水 北京天根,中国
PCR引物 上海生工,中国

表2.2试验中主要仪器和设备
Table 2.2 Major laboratory instruments and equipments in the research
仪器名称 规格型号 生产厂家
CO2 f旦温培养箱 Sill Thermo S cientific, 美 国
生物安全柜 1300 SERIES A2 Thermo Scientific, 美国
倒置相差显微镜 CKX41 Olympus,日本
数显恒温水浴锅 LUX-12 北京陆希,中国
自动细胞计数仪 Countstar Inno-Alliance Biotech, 美国
多功能酶标仪 Synergy HTX BioTek,美国
流式细胞仪 Guava easyCyte 6HT-2L Merck Millipore,德国
PCR仪 T-100 Bio-Rad,美国
荧光定量PCR仪 ABI 7500 ABI,美国
垂直电泳槽 Mini-PROTEAN 4 Bio-Rad,美国
转印槽 Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad,美国
电泳仪 PowerPac Bio-Rad,美国
全自动化学发光成像分析系统 Tanon 5200 上海天能,中国
凝胶成像及分析系统 Alphaimager EP ProteinSimple, 美国
超微量核酸蛋白测定仪 Nano Drop ND-2000 Thermo Scientific, 美国
台式高速冷冻离心机 Centrifuge 5418 R Eppendorf,德国
超低温冰箱 705 Thermo S cientific, 美 国
低温冰箱 HYC-360 海尔,中国
立式实验室灭菌器 3170ELV 55 升 Tuttnaueer
电子分析天平 BSA224S-CW Sartorius,德国
掌上离心机 D1008/D1008E SCILOGEX,美国
数显型磁力搅拌器 MS-H-Pro SCILOGEX,美国
脱色摇床 SK-O330-Pro SCILOGEX,美国

2.1.4GT1-7细胞的培养
本研究使用的细胞为GT1-7细胞。获取该细胞后传代扩大培养,冻存足够数量的细胞以满足 整个试验的开展。细胞复苏后,根据其生长状态和生长密度进行传代,传1〜2代以恢复细胞的活 性和功能。取处于生长期的细胞用于正式实验,此时细胞融合至80%左右。
2.1.4.1细胞的复苏
(1)配制完全培养基,高糖培养液中加入10%胎牛血清和1%青链霉素双抗,彻底混匀后分 装,做好标记包括日期、配制者姓名和相关试剂的比例及名称,置于4七冰箱备用。
(2) 迅速取出冻存管,检查管壁上的标签,确定是否为所需细胞。在37 £恒温水浴锅解冻 1〜2 min,酒精消毒管壁后置于生物安全柜中,将解冻的细胞悬液转移至15 mL离心管,吸取5 mL 完全培养基缓慢稀释细胞和细胞保护剂。
(3) 1000 rpm离心4 min,仔细吸取上清,用5 mL的完全培养基重新悬浮细胞,轻轻吹打 并均匀接种于细胞培养瓶中,静置5 min再转移至细胞培养箱中,控制培养条件为37七、5%CO2 以及饱和湿度,间隔24 h进行培养基的更换。
2.1.4.2细胞的传代
培养过程中注意观察细胞的生长状态,当细胞贴壁生长汇合至80-90%时对细胞进行传代, 即选择处于生长期的细胞进行传代。具体步骤如下:
(1) 将细胞从培养箱中取出后置于生物安全柜操作台面上,真空抽液泵吸出旧培养液,磷 酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline, PBS)洗涤 2 遍,5 mL/次。
(2) 加入1 mL0.25%胰酶(含EDTA),使试剂完全覆盖细胞层,吸取部分胰酶,只留下一 薄层。置于细胞培养箱消化lmin,待细胞解离程度大于等于90%时,加入5 mL完全培养基终止 消化,使用移液枪反复吹打成单个细胞,将细胞悬液转移至15 mL离心管,封口膜封口。
(3) 1000 rpm离心4 min,仔细吸掉上清。用新鲜完全培养基重新悬浮细胞,吹打均匀后, 将细胞悬液与台盼蓝染料按照1:1进行混合,随后立即使用Count Star细胞计数仪检测细胞悬液 的密度和细胞活性。
(4) 根据步骤(3)中检测结果,按照一定的比例稀释细胞悬液,分别接种于T25细胞培养 瓶中,静置5 min后转移至细胞培养箱中继续培养。
2.1.4.3细胞的冻存
为了获取足够量的细胞以满足实验的需求,同时降低细胞受到污染以及长期传代导致遗传突 变等不良情况的发生,一般采用液氮超低温保存的方式来冻存大批量的细胞。操作步骤如下:
(1) 配制细胞冻存液:将二甲基亚砚DMSO与胎牛血清FBS以1: 9的比例配制所需体积 的混合液,反复颠倒;标记冻存管,注明冻存细胞种类、冻存时间、冻存细胞代数、操作人等信 息,以免与其他细胞系混淆污染。
(2) 利用传代时所用方法将处于对数生长期的GT1-7细胞制备成细胞悬液,台盼蓝染色计 数。
(3) 根据细胞密度,用现配的细胞冻存液重悬细胞并吹打均匀,控制细胞浓度为1〜3x106 个/mL。
(4) 当细胞活力较高时可以选择冻存lmL/管,若细胞活力较弱能选择冻存1.2〜1.5 mL/管。 注意要拧紧管盖,同时使用橡皮膏封住管口,并做好标记包括细胞的名称、冻存日期、冻存细胞 代数和操作人。
(5) 将细胞冻存管转移至异丙醇冻存盒中,检查盒中异丙醇是否充足,将冻存盒置于-80 £ 超低温冰箱,过夜后转移至液氮管储存。
2.1.5PCB118 和 4-OH-CB107 溶液的配制
PCB118纯度为99.5%。取10 mg粉状试剂溶解于612.68 |1L的DMSO溶液得到50 mM PCB118 母液,振荡10 min,彻底混匀后转移至棕色样品瓶,常温储存。配制PCB118I作液时,控制每 个浓度组中DMSO溶液的含量为l%o,以避免DMSO对细胞的损害。
4-OH-CB107纯度〉98%,浓度为50 |ig/mLo取400 piL标准品经氮吹后加58.4piLDMSO溶 液,振荡10 min,彻底复溶得到1 mM 4-OH-CB107母液,转移至棕色样品瓶,常温储存。配制 4-OH-CB107 I作液时,控制每个浓度组中DMSO溶液的含量为1%。,以避免DMSO对细胞的损 害。
2.1.6CCK-8法细胞存活率测定
采用CCK-8法检测两种化合物对GT1-7细胞的增殖毒性作用,具体的实验方法和染毒剂量 如下所示:
(1)设置 PCB118 染毒剂量分别为:0 (1%oDMSO 对照组)、0.05、0.5、5、50、500、5000、 50000 nM,共计8个染毒剂量;设置4-OH-CB107染毒剂量分别为:0( 1%oDMSO对照组)、0.0005、 0.005、0.05、0.5、5、50、500 nM,共计 8 个染毒剂量组。
(2)传代细胞生长汇合至80%左右时,按照之前的操作步骤制备浓度为5x104个/mL的细胞 悬液,吹打混匀之后,均匀接种到96孔板,每孔100 jiL,即每孔接种5x103个细胞。将细胞培 养板放置于细胞培养箱中预培养24 h,根据上述实验方案对细胞进行染毒,染毒6h、12 h、24 h、 48 h后检测细胞的相对存活率。
(3)CCK-8法检测细胞相对存活率:CCK-8法是用以测定细胞增殖毒性试验中活细胞数目 的一种比色检测方法,具有高灵敏和无放射性等优点。CCK-8试剂中的WST®-8物质能被活细胞 线粒体中的脱氢酶氧化还原形成具有高度水溶性的橙黄色甲瞳染料,甲瞳量与活细胞数量成正 比。细胞染毒结束后,每孔加入10 ^iL CCK-8试剂,再放入细胞培养箱中孵育1 h,在酶标仪上 450 nm处测定吸光度,同时设置650 nm作为参考波长以消除培养液浑浊造成的干扰。
(4)计算细胞相对存活率,染毒组吸光度值和对照组吸光度值分别扣除背景对照组的吸光 度值,两者的比值即为细胞相对存活率。
2.1.7LDH释放法细胞毒性检测
正常状态下,LDH稳定地存在于细胞质中,当细胞膜结构受损时会导致胞浆内的LDH释放 进入细胞培养液中。因此,LDH释放是评价细胞膜完整性的重要指标,常用于细胞毒性检测。根 据细胞培养液中LDH活性,可以定量分析外源化学物质对细胞的毒性作用。具体操作流程如下:
(1)取生长良好的处于对数期的GT1-7细胞,以5000个/孔的密度接种于96孔板中,每组 设置6个重复,置于细胞培养箱预培养24 h后进行染毒处理。
(2)试验分组包括背景空白对照组(无细胞和染毒液)、样品对照组(含细胞和1%oDMSO, 无目标染毒液)、样品最大酶活性对照组(含细胞,无染毒液,用于后续细胞裂解测定最大酶活) 和染毒处理组。设置PCB118染毒剂量为0、0.05、5、500、5000、50000 nM;设置4-OH-CB107 染毒剂量为 0、0.05、0.5、5、50、500 nM0
(3) 染毒后置于细胞培养箱继续培养24 h,在相应的检测时间点前lh,样品最大酶活对照 组中加入LDH释放剂,20 jiL/孔。置于细胞培养箱中孵育1 h后400 g离心5 min,每孔取出120 |1L上清液至新的96孔板中。
(4) 现配LDH检测工作液,每孔加入60 jiL工作液,室温避光孵育30 min后测定490 nm 波长处吸光度值(A490值)。
(5) 计算每组中吸光度值的平均值,并扣除背景空白对照组中吸光度值,按照以下公式计 算LDH活力(%), LDH活力(%)二(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活 性的吸光度-样品对照孔吸光度)o
2.1.8Annexin V-FITC/PI双染法定量检测细胞凋亡
在细胞早期凋亡过程中,位于正常细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)会翻 至膜外侧。膜联蛋白(AmiexinV)是一种与PS有高度亲和力的C/+依赖性磷脂结合蛋白,能结 合在早期凋亡细胞的细胞膜外侧,通过标记特定的荧光染料可以检测细胞早期凋亡率。碘化丙喘 (Propidium Lodide, PI)是一种核酸染料,虽然不能穿透过完整的细胞膜,但能进入凋亡中晚期 细胞或死细胞,从而将细胞核染成红色。将两种染料联合使用,以区分处于不同凋亡时期的细胞, 最后使用流式细胞仪的的FITC和PE通道进行凋亡检测,利用散点图分析凋亡结果。
取对数生长期细胞,接种于6孔板,预培养24 h后饥饿处理细胞12 h,设置PCB118染毒剂 量为:0、0.05、5、500、5000、50000 nM, 4-OH-CB107 染毒剂量为:0、0.05、0.5、5、50 和 500 nM,染毒24 h后严格按照试剂盒说明书进行检测,具体实验步骤如下:
(1) 吸出细胞培养基至Ep管中,使用0.25%胰酶(不含EDTA)消化GT1-7细胞3〜5 min, 加入吸出备用的细胞培养基终止消化;4 °C, 1000 rpm离心5 min后弃去上清,注意不要吸到管 底的细胞,以避免细胞的损失。
(2) 用己经置于4 £预冷的PBS缓冲液洗涤细胞两次,注意避免吸除细胞。
(3) 使用结合缓冲液(lx)重悬细胞,立即进行细胞计数,从而调整细胞浓度为1x106个/mL; 混合均匀并吸取100 piL细胞悬液(约1x105个细胞)至上样管中。
(4) 设置Annexin V-FITC单染管(仅加Annexin V-FITC染料)、PI单染管(仅加PI染料)、 空白对照管(不加Annexin V-FITC染料和PI染料,用于进行荧光补偿调节和十字门位置的设定) 以及试验组,试验组加入5 jiL Annexin V-FITC染料和5 jiLPI染料,轻轻混匀后室温避光反应15 min。
(5) 反应结束后加入400 yL结合缓冲液(lx)至上样管中。立即上机检测,调节检测的激 发波长为488 nm,发射波长为530 nm。注意控制检测时间在1 h内。
2.1.9GnRH分泌量的测定
2.1.9.1细胞接板和染毒
(1)传代细胞生长汇合至70%〜80%时,按照之前的操作步骤制备浓度为1x105个/mL的细 胞悬液,吹打混匀之后,均匀接种到6孔板,每孔2mL,即每孔接种2x105个细胞。将6孔板放 置于培养箱中继续培养24 ho
(2)更换不含有血清的DMEM继续培养GT1-7细胞12 h,饥饿处理从而使细胞达到同步化。
(3)不同浓度PCB118或4-OH-CB107处理GT1-7细胞6 h和24 h, PCB118染毒剂量为0、 0.05、5、500 和 50000 nM , 4-OH-CB107 染毒剂量为 0、0.05、5 和 500 nM。
(4)在预设的时间点收集细胞培养上清液于Ep管中,3500 rpm离心20 min后吸取上清用 于GnRH的测定。若不能及时测定,可分装保存于-20 £待检,避免反复冻融。
(5)每个处理进行3个重复,每组试验重复3次。
2.1.9.2 ELISA 测定 GnRH 浓度
本试验使用小鼠GnRH酶联免疫标记检测试剂盒检测GT1-7细胞GnRH的分泌。利用酶标 仪读取样品450 nm的OD值,根据标准品绘制的GnRH标准曲线计算样品GnRH浓度。试剂盒 检测 范围:2.5 mIU/mL〜80 mIU /mL。
2.1.10细胞总蛋白的提取
2.1.10.1细胞接板和染毒
按照2.2.9.1进行操作。
2.1.10.2总蛋白的提取
吸取上清后,在6孔板中加入1 mL冰浴的PBS洗涤2遍;加入300 jiLRIPA细胞裂解液(使 用前加入1%的PMSF),置于4 °C冰箱裂解60 min;转移裂解产物至Ep管中,12000 rpm, 4 °C 离心15 min;吸取上清到新的Ep管中,立即检测蛋白浓度或分装保存于-80七待检。
2.1.11 BCA法测定蛋白浓度
该方法是基于双缩月尿反应的原理,当蛋白溶液体系处于碱性条件下时,蛋白质可以与Cu2+ 发生络合反应,从而将二价铜离子(C/+)还原成一价铜离子(Cu+)并形成稳定的蓝紫色复合 物。检测562 nm波长处的吸光度值,并根据所测样品的吸光度值和标准曲线计算蛋白浓度。该 方法具有复合物颜色稳定性强、操作简单、灵敏度高、不受去垢剂影响等优点。具体步骤如下:
(1)工作液的配制:根据所测样品的数量计算工作液的总体积,将BCA试剂A与试剂B (Cu+)按照50:1的比例混合均匀,获得嫩绿色的工作液,可置于常温保存2h, 4 °C保存一天,
但建议现配现用。
(2)标准蛋白溶液的配制:取20 piL 10 mg/mL蛋白标准品BSA加入80 piL超纯水,得到 2000 |ig/mLBSA溶液,从中取50此进行倍比稀释,依次得到BSA标准溶液2000、1000、500、 250、125、62.5 yg/mL,各 50 pL。
(3)采用微孔酶标仪法进行测定。将20 piL标准蛋白溶液和待测样品分别加到板孔中,每 孔再加入200 yL工作液,轻轻混匀后置于37 £恒温箱孵育30 min。
(4)使用酶标仪检测562 nm波长处光吸收值并绘制标准曲线,结合样品OD值计算样品的 蛋白浓度。
2.1.12 蛋白质印迹(Westemblot)
2.1.12.1蛋白变性样品的准备
吸取等质量的总蛋白30昭,加入适量的上样缓冲液(6xSDS),99 °C变性10 min,保存于-20 °C 备用。
2.1.12.2 Western blot 操作步骤
(1) 电泳:取出预制胶放入电泳槽,加入适量MOPs电泳液,点样并进行电泳,140 V电泳 至漠酚蓝染料到达凝胶底部为止。
(2) 转膜:将湿转塑料模具黑色板面朝下,依次放入海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、 海绵垫,夹紧后放入电泳槽中,以100 V恒压中转移60 min,低温条件下转膜(放入冰袋)。
(3) 封闭:用TBST洗涤膜3~5 min;再用预先配制的封闭液(5%脱脂奶粉)室温封闭2h。
(4) 一抗反应:封闭后根据目的蛋白分子量剪下相应的PVDF膜条带,转移至塑料袋中, 加入1 mL适度稀释的目的蛋白一抗,塑封后置于摇床室温摇动30 min,转移至4 £孵育12〜18 h。
(5) 二抗反应:孵育结束后用TBST洗涤膜3次,5 min/次;再将洗涤后的膜转移至抗体孵 育盒中,加入2mL5000倍稀释的二抗,于室温孵育1 h。
(6) 显色:孵育结束后用TBST洗涤膜3次,5 min/次;于暗室用膜发光液(1:1配制)浸 泡1〜5 min,将膜置于蛋白化学发光凝胶成像系统中扫描。
(7) 用Image J软件分析条带的灰度值,并与内参总蛋白相比较,计算目的蛋白的相对表 达量。
2.1.13细胞总RNA的提取
2.1.13.1细胞铺板和染毒
取处于生长期的细胞,按照2x105个/孔的密度接种于6孔板,预培养24 h后,更换无血清培 养基继续培养12 h,使细胞饥饿达到同步化。0、5、500和50000 nM PCB118处理GT1-7细胞6 h, 0、500 和 50000 nM PCB118 处理 GT1-7 细胞 24h; 0、0.05、5、500 nM 4-OH-CB107 分别处 理GT1-7细胞6h和24h。每个处理设置3个重复,每组试验重复3次。
2.1.13.2总RNA的提取
使用离心柱型的RNA提取试剂盒提取GT1-7细胞中总RNA,根据说明书进行操作,具体步 骤如下:
(1) 试验前准备:①用RNase-Free ddH20配制70%乙醇;②试剂盒中细胞裂解液RL加入 卩-毓基乙醇至终浓度为1%,现配现用,或置于4 £保存1个月;③试剂盒中漂洗液RW加入一 定量的无水乙醇,加入量参见瓶上标签;④枪头、EP管用DEPC水浸泡过夜,高压灭菌后烘干 备用。
(2) 吸除细胞培养基后加入裂解液RL, 350卩17孔,转移细胞裂解液至离心管,涡旋振荡 30 s,转移溶液至过滤柱CS中,12000 rpm离心2 min后收集滤液。
(3)向滤液中加入1倍体积70%乙醇,混匀后将所有溶液包转移至吸附柱CR3中,12000 转速下离心1 min后倒掉废液,将吸附柱依次放回收集管中。
(4)加入去蛋白液RW1至吸附柱中,350卩17管,12000转速下离心1 min后倒掉废液,将 吸附柱依次放回收集管中。
(5)DNase II作液的配制:将DNase I储存液与RDD溶液以1:7比例配制,轻轻混匀。
(6)加DNase I工作液至吸附柱的中央,80卩17管,室温放置15 mino
(7)加入去蛋白液RW1至吸附柱中,350(117管,12000转速下离心1 min,倒掉废液,将 吸附柱依次放回收集管中。
(8)加入漂洗液RW至吸附柱中,500 piL/管,室温静置2 min, 12000转速下离心1 min, 倒掉废液,将吸附柱依次放回收集管中。
(9)重复步骤(8)
(10)12000转速下离心2 min,倒掉废液后室温静置约10 min,以晾干吸附柱,充分去除 残留的漂洗液。
(11)将吸附柱转入一个新的RNase-Free离心管中,加入50 piL RNase-Free ddH2O,室温放 置2 min, 12000转速下离心2 min,从而得到RNA溶液。
(12)所得RNA溶液立即进行浓度和纯度检测并进行反转录试验或置于-80 £超低温保存, 因RAN易降解,保存时间不宜过长,应尽快进行反转录试验。
2.1.14RNA浓度和纯度检测
利用紫外吸收法检测RNA浓度和纯度。具体操作步骤如下:
(1)滴加2 |1L RNase-Free ddf^O至检测基座的表面进行调零,使用擦镜纸擦去上下基座表 面的液体。
(2)滴加2yLRNA样品溶液至检测基座的表面,重复测定2次,一个样品检测结束后用擦 镜纸擦去上下基座表面的样本液,以防干扰下一个样品的测定。
(3)测定结果
A260代表溶液中核酸的吸光值,其读值为1表示RNA的浓度为40 ng/jiLo因此,样品RNA 浓度的计算公式为:A260x40 ng/|iLo
A280代表溶液中蛋白质或氨基酸的吸光值,RNA溶液A260/A280的比值用于判断提取RNA 的纯度,比值范围在1.8〜2.1之间表示RNA提取成功。
2.1.15RNA完整性检测
利用琼脂糖凝胶电泳对提取获得的RNA进行完整性检测。具体操作如下:
(1)将5xTBE缓冲液与超纯水按照1:4比例配制lxTBE缓冲液,称取1.2 g琼脂糖,加入 lOOmLTBE缓冲液(lx)后混合均匀,微波炉加热至琼脂糖全部溶解并呈现透明状,以获得1.2% 的琼脂糖凝胶。
(2)室温冷却至60。(2左右时加入lOpiL GeneGreen核酸染料(浓度为1%。),混合均匀后立 即倒入电泳槽中并插入梳板,控制凝胶厚度为5 mm左右,凝胶时间约为15-30 min,据室温而 定。
(3) 选择120 V恒压进行电泳,时间为35〜45 min。
(4) 凝胶成像仪观察RNA条带并拍照。
2.1.16逆转录合成cDNA
本试验使用“TIANGEN FastKing cDNA第一链合成试剂盒”进行反转录试验,按照试剂盒说 明书及样品RNA浓度计算体系中各成分的添加体积,体系如表2.3和2.4所示。
按体系成分在冰上配制反应溶液,为保证反应溶液配制的准确性,按反应数+2的量配制Mix, 然后分装到各反应管中,最后加入RNA样品。将反转录反应中的Mix,加到gDNA去除步骤的 反应液中,充分混匀,42。(3孵育15 min, 95 £孵育3 min之后置于冰上,得到的cDNA产物可 用于后续实验或者置于-20七保存备用。
表2.3 gDNA去除反应体系
Table 2.3 The reaction system of removing gDNA
组成成分 使用量
5xgDNABuffer 2吐
Total RNA 1聘
RNase-Free ddH2O 补足到10 |1L
表2.4反转录反应体系
Table 2.4 The reaction system of reverse transcription
试剂 使用量/|1L
lOxKing RT Buffer 2
FastKing RT Enzyme Mix 1
FQ-RT Primer Mix 2
RNase-Free ddfhO 补足到10

2.1.17PCR 扩增
本试验选择/3-actin基因为管家基因,对相关基因G欣H、GPR54、和PKC进行PCR扩 增,电泳检测PCR的扩增产物,从而评价产物的特异性并确定是否进行后续荧光定量程序。
2.1.17.1引物设计
本试验中的所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列如表2.5所示。

2.1.17.2反应体系和程序
PCR反应体系如表2.6所示。
表2.6 PCR反应体系
Table 2.6 Reaction system of PCR
组成成分 使用量/piL
cDNA 2
Primer F (10 |1M) 1
Primer R (10|iM) 1
2xTaq PCR MasterMix 10
RNase-Free ddHzO 6

PCR反应程序:
94 °C, 3 min
94 °C, 30 s —|
55 °C, 30 s 30 个循环
72 °C, 1 min 一
72 °C, 5 min
2.1.18PCR产物凝胶电泳鉴定
通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。具体操作如下:
(1) 电泳缓冲液制备:将5xTBE缓冲液与超纯水按照1:4比例配制lxTBE缓冲液,倒入电泳槽。
(2) 1.5%琼脂糖凝胶配制:称取1.5 g琼脂糖,加入100 mLTBE缓冲液(lx) >波炉加热至沸 腾溶解,加入10 |1L GeneGreen染料,混合均匀后倒入胶槽中,插上梳子,室温放置30-40 min, 待凝固后拔去梳子,将凝胶转移至电泳槽中。
(3) 力口 10 jiLPCR产物或DNAMarker至胶孔中,120 V恒压电泳35 min左右。
(4)凝胶成像系统观察PCR产物电泳结果并拍照。
2.1.19Real-time qPCR
本试验选择P-actin为内参基因,根据试剂盒说明书于冰上配制Real-time qPCR反应液,反 应体系见表2.7。采用两步法PCR反应程序进行反应,具体过程见表2.8。
表2.7荧光定量PCR反应体系
Table 2.7 Reaction system of Real-Time PCR
组成成分 使用量/|1L
2xFastFire qPCR PreMix 10
Primer F (lOyM) 0.6
Primer R (10|iM) 0.6
cDNA模板 2
RNase-Free ddfhO 6.8

表2.8 Real-Time PCR反应程序
Table 2.8 Reaction procedure of Real-Time PCR
阶段 循环数/次 温度/°C 时间/sec
预变性 1 95 60
变性 40 95 15
退火/延伸 60 Al 15A2
熔解曲线分析(Melting/Dis sociation Curve Stage )

2.1.20基因表达定量分析方法
采用Livak法即2-AACt法计算目的基因的表达差异。设定目的基因的相对表达量2-AACt=b 当试验组2-△△ct值大于1时表示促进目的基因的表达,反之表示抑制目的基因的表达。计算公式: F=2-{[A-BHC-D]}。
A:表示处理组目的基因平均Ct值;
B:表示处理组管家基因平均Ct值;
C:表示对照组目的基因平均Ct值;
D:表示对照组管家基因平均Ct值。
2.1.21统计学分析
实验数据以平均值土标准差(xiS)表示,采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,方差齐 时组间均数比较采用LSD法,方差不齐时组间均数比较采用Dunnetfs法,设定检验水准a=0.05, PV0.05为差异显著。使用GraphPadPrism6.0软件做图。
2.2结果与分析
2.2.1 GT1-7细胞形态学观察
如图2.1所示,GT1-7细胞株(Passage3, P3)传代后,呈圆点状散在分布于细胞培养液中 (图A); 6 h左右基本完成贴壁过程,可见部分呈纺锤形或不规则形状的贴壁细胞呈现集落样生 长,仅有少量未贴壁细胞漂浮于培养液中(图B); 24 h左右细胞开始增多,由集落样生长逐渐 扩散并伸出长突触,呈现纺锤体形或星形,交织呈网状分布,融合达50%左右,形态较为均一(图 C);此后,细胞迅速增殖,继续生长至36 h左右即融合达80-90% (图D)。
图2.1GT1-7细胞传代Oh、6h、24h和36h的形态学特征(100x)
Fig.2.1 The morphological features of GT 1-7 cells cultured for 0 h、6 h\ 24 h and 36 h (lOOx)

2.2.2PCB118和4-OH-CB107对GT 1-7细胞增殖的影响
2.2.2.1PCB118对GT1-7细胞增殖的影响
不同浓度PCB118作用GT1-7细胞6h、12 h、24 h和48 h后,细胞存活率的变化结果如图 2.2所示。从剂量效应上看,处理6h, PCB118对GT1-7细胞的存活率无显著影响;处理12 h和 48 h,随PCB118作用浓度增加(0.05〜50000 nM),各浓度组与对照组相比均能显著或极显著降 低细胞存活率 40.05或尸V0.01);处理24h,随PCB118作用浓度增加(0.5〜50000 nM),各 浓度组均能显著或极显著降低细胞存活率(PV0.05或PV0.01)。从时间效应上看,处理12h〜48 h, 0.05〜50000 nM剂量组中细胞存活率显著(Pv0.05)或极显著(PvO.Ol)低于6 h处理组。结 果表明,随作用时间延长,PCB118以剂量依赖性方式显著降低GT1-7细胞存活率,呈现一定的 剂量效应和时间效应,具有抑制细胞增殖的毒性作用。

llOn
Concentration of PCB118(nM)
图2.2 PCB118对GT1-7细胞存活率的影响
Fig.2.2 Effects ofPCB118 on cell viability ofGTl-7 cells
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差(n=6),与对照组相比,* P<0.05, ** P<0.01 ;与染毒6h组相比,A P<0.05,小P<0.01。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group; A P<0.05, AA P<0.01, compared to the 6 h group.
2.222 4-OH-CB107对GT 1-7细胞增殖的影响
不同浓度4-OH-CB107处理GT1-7细胞6 h、12 h、24 h和48 h,检测细胞存活率,结果女口 下图2.3所示。从剂量效应上看,处理6h, 4-OH-CB107对细胞存活率无显著影响;处理12 h和 24 h,仅50 nM和500 nM 4-OH-CB107显著(Pv0.05)或极显著(P<0.01)降低细胞存活率;处 理48h, 0.05-500 nM 4-OH-CB107极显著(PvO.Ol)降低细胞存活率,呈现一定的剂量效应。从 时间效应上看,0.05〜500 nM剂量组作用GT1-7细胞48 h与6 h相对比细胞存活率极显著(FvO.Ol) 降低。4-OH-CB107在一定程度上以剂量和时间依赖性方式显著降低GT1-7细胞存活率,具有抑 制细胞增殖的毒性作用。

图2.3 4-OH-CB107对GT1-7细胞存活率的影响
Fig.2.3 Effects of4-OH-CB107 on cell viability ofGTl-7 cells
26
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差(a=6),与对照组相比,* P<0.05, ** P<0.01 ;与染毒6h组相比,人P<0.05,小P<0.01。
Note: Data were expressed as mean+SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group; A P<0.05, AA P<0.01, compared to the 6 h group.
2.2.3PCB118 和 4-OH-CB107 对 GT 1-7 细胞 LDH 释放的影响
2.23.1PCB118对GT1-7细胞LDH释放的影响
PCB118 (0.05、5、500、5000和50000 nM)处理GT1-7细胞24 h后,各浓度组培养基上清 中 LDH 活力分别为最大酶活对照组的 3.93±1.36%、4.09+0.74%> 4.34+0.95%> 4.02+0.76%> 15.64±1.76%。0.05、5、500和5000nMPCB118未造成细胞培养基上清液中的LDH释放量增力口, 50000 nM PCB118能够显著促进LDH的释放(FvO.Ol),结果如图2.4所示。说明只有高浓度 PCB118才会引起细胞膜通透性的增加,具有明显的细胞毒性作用。

图2.4 PCB118染毒24 h对GT1-7细胞LDH释放的影响
Fig.2.4 Effects on the release of lactate dehydrogenase from GT 1-7 cells treated with PCB118 for 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=6),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01;。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.
2.23.24-OH-CB107对GT1-7细胞LDH释放的影响
4-OH-CB107 (0.05、0.5、5、50和500 nM)处理GT 1-7细胞24 h,各浓度组细胞培养上清
液中LDH活力未见显著变化,表明该浓度范围暴露GT1-7细胞不会影响细胞膜通透性。

Concentration of 4-0H-CB107(iiM)
图2.5 4-OH-CB107染毒24 h对GT1-7细胞LDH释放的影响
Fig.2.5 Effects on the release of lactate dehydrogenase from GT 1-7 cells treated with 4-OH-CB107 for 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=6),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean+SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.
2.2.4PCB118和4-OH-CB107对GT 1-7细胞凋亡的影响
2.2.4.1PCB118对GT 1-7细胞凋亡的影响
不同浓度PCB118作用GT1-7细胞24 h, PCB118 (0.05-5000 nM)未显著影响GT1-7细胞
凋亡和坏死(P>0.05),仅50000 nM PCB118极显著促进细胞的早期凋亡(P<0.01),活细胞数目
极显著降低(PV0.01),结果如图2-6所示。

图2.6 PCB118染毒24 h对GT1-7细胞凋亡率的影响
Fig.2.6 Effects on apoptosis in GT 1-7 cells treated with PCB118 for 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.

2.2.4.24-OH-CB107对GT1-7细胞凋亡的影响
不同浓度4-OH-CB107 (0.05〜500 nM)作用GT1-7细胞24 h,各浓度组中细胞早期和晚期凋

图2.7 4-OH-CB107对GT1-7细胞凋亡率的影响
Fig.2.7 Effects on apoptosis in GT 1-7 cells treated with 4-OH-CB107 for 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean+SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.
2.2.5PCB118 和 4-OH-CB107 对 GT 1-7 细胞分泌 GnRH 的影响
2.2.5.1PCB118对GT 1-7细胞分泌GnRH的影响
参考PCB118的环境暴露水平和对GT1-7细胞毒性的试验结果,设置PCB118的暴露浓度分 别为0、0.05、5、500和50000 nM,对GT1-7细胞分别染毒6 h和24 h, ELISA法检测细胞培养 液内GnRH浓度,并用细胞内总蛋白含量进行标化,结果如图2.8所示。PCB118染毒6 h后,5 和500 nM两个浓度组细胞培养液中GnRH的含量显著低于对照组(Pv0.05), 50000 nM浓度组 细胞培养液中GnRH的含量极显著低于对照组(PvO.Ol); PCB118染毒24h后,0.05和5 nM浓 度组GnRH的变化无明显统计学差异,500和50000 nM浓度组细胞培养液中GnRH的含量显著 低于对照组(PV0.05)。结果表明,一定浓度的PCB118具有抑制GT1-7细胞分泌GnRH的作用。

Concentration of PCB118(nM) Concentration of PCB118(nM)
图2.8 PCB118染毒6 h和24 h对GT1-7细胞分泌GnRH的影响
Fig.2.8 Effects on GnRH secretion in GT 1-7 cells treated with PCB 118 for 6 h and 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the control
group.
2.2.5.24-OH-CB 107 对 GT1-7 细胞分泌 GnRH 的影响
参考4-OH-CB107的环境暴露水平及其对GT1-7细胞毒性的试验结果,选择4-OH-CB107的 暴露浓度为:0、0.05、5和500 nM,对GT1-7细胞分别染毒6 h和24 h, ELISA法检测细胞培 养液内GnRH浓度,并用细胞内总蛋白含量进行标化,结果如图2.9所示。染毒6 h,只有0.05 nM PCB118显著促进GT1-7细胞分泌GnRH (PV0.05), 5和500 nM浓度组均未见显著变化;染毒 24 h, 0.05和5nM PCB118对GnRH分泌量无显著影响,而500 nM浓度组中GnRH分泌量显著 增加(P<0.05)o提示一定浓度的4-OH-CB107具有促进GT1-7细胞分泌GnRH的效应。

图2.9 4-OH-CB 107对GT1-7细胞分泌GnRH的影响
Fig.2.9 Effects on GnRH secretion in GT 1-7 cells treated with 4-OH-CB 107 for 6 h and 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean+SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.
2.2.6PCB118和4-OH-CB 107对Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白表达的影响
2.2.6.1PCB118对Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白表达的影响

PCB 118分别对GT1-7细胞染毒6 h和24 h,提取胞内总蛋白并足量,Western blot分析 Kisspeptin/GPR54信号通路上关键蛋白的表达情况,应用Image J软件对结果进行定量分析。结 果如图 2.10和图2.11 所示,PCB118染毒GT1-7细胞6h后,0.05 nMPCB118对蛋白 GnRH、GPR54、 PLC和PKC的表达无显著影响;5、500和50000 nMPCB118均能显著或极显著降低蛋白GnRH、 GPR54、PLC 和 PKC 表达水平(P<0.01 或 Pv0.05)。染毒 24 h 后,500 和 50000 nM PCB 118 能显著或极显著降低蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC表达水平(PvO.Ol或Pv0.05)。

图2.10PCB118染毒6h和24h后Kisspeptin/GPR54信号通路蛋白的表达情况
Fig.2.10 The expression of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT 1-7 cells treated
with PCB118 for 6 h and 24 h

图2.11 PCB118染毒6 h和24h后Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白的定量分析
Fig.2.11 Quantitative analysis of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT1-7 cells
treated with PCB 118 for 6 h and 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。

Note: Data were expressed as mean+SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.
2.2.6.24-OH-CB107对Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白表达的影响
4-OH-CB107暴露GT1-7细胞6 h和24 h,提取胞内总蛋白并定量,Western blot分析 Kisspeptin/GPR54信号通路上关键蛋白的表达情况,应用Image J软件对结果进行定量分析,结 果如图2.12和图2.13所示。染毒6 h, 0.05 nM 4-OH-CB107显著上调GnRH、GPR54、PLC和 PKC等蛋白的表达水平(P<0.05) ; 5nM浓度组中GnRH、GPR54和PLC等蛋白表达水平无显 著变化,而PKC蛋白水平显著上调(PV0.05) ; 500 nM 4-OH-CB107能显著抑制GnRH的表达 (PvO.05),但对GPR54、PLC和PKC等蛋白的表达无显著影响。染毒24 h, 0.05 nM浓度组中 各蛋白表达水平均未显著变化;5 nM 4-OH-CB107能显著上调GnRH、GPR54和PLC蛋白的表 达水平(PV0.05),但对PKC的表达无显著影响;500 nM 4-OH-CB107均能显著促进GnRH、 GPR54、PLC 和 PKC 的表达(Pv0.05)。
图2.13 4-OH-CB 107染毒6 h和24 h后Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白的定量分析
Fig.2.13 Quantitative analysis of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT 1-7 cells treated with
4-OH-CB 107 for 6 h and 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.
2.2.7PCR产物电泳鉴定
以GT1-7细胞cDNA作为模板,并根据GnRH. GPR54、PLC和PKC和管家基因p-actin的 引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,产物大小依次是247 bp、204 bp、217 bp>

图2.14 GT1-7细胞PCR产物鉴定电泳图
Fig.2.14 Electrophoresis results of PCR products
2.2.8实时荧光定量扩增曲线和熔解曲线
实时荧光定量的扩增曲线可用于确定Ct值,同时反映体系的优化程度,熔解曲线主要反映 目的基因产物的特异性。内参基因Q/3-actin^和目的基因(GnRH、GPR54、PLC和PKC)的扩 增曲线和熔解曲线如图2.15〜图2.19所示。结果显示扩增产物比较均一,熔解曲线均呈现单峰, 无非特异性扩增或引物二聚体,表明引物特异性好。

2.2.9PCB118 和 4-OH-CB107 对 Kisspeptin/GPR54 信号通路相关基因 mRNA 表达的 影响
2.2.9.1 PCB118对Kisspeptin/GPR54信号通路相关基因mRNA表达的影响
不同浓度PCB118处理GT1-7细胞6 h和24 h,对Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白GnRH、 GPR54、PLC和PKC基因mRNA表达的影响如图2.20和2.21所示。染毒6 h,与对照组相比, GnRH和GPR54基因mRNA的表达水平呈现先上升后下降的趋势,5 nM和500 nM PCB118上 调了 G肤H和GPR54基因mRNA的表达水平,但无统计学差异(P>0.05) ; 50000 nM PCB 118 极显著或显著抑制GnRH和GPR54基因mRNA的表达(PvO.Ol或Pv0.05)。随处理浓度增加, PCB118极显著或显著抑制PLC和PKC基因mRNA的表达(P<0.01或Pv0.05),呈现一定的剂 量效应。染毒24h, PCB118以剂量依赖性方式显著或极显著抑制GPR54、和PKC 基因 mRNA 的表达(PvO.Ol 或 Pv0.05)。
6h

图2.20 PCB118染毒6 h对Kisspeptin/GPR54信号通路相关基因mRNA表达的影响
Fig.2.20 Effects on relative mRNA expression of genes on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT 1-7 cells
treated with PCB118 for 6 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the

图2.21 PCB118染毒24 h对Kisspeptin/GPR54信号通路相关基因mRNA表达的影响
Fig.2.21 Effects on relative mRNA expression of genes on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway m GT 1-7 cells treated
with PCB118 for 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.
2.2.9.2 4-OH-CB107对Kisspeptin/GPR54信号通路相关基因mRNA表达的影响
不同浓度4-OH-CB107处理GT1-7细胞6 h和24 h,对Kisspeptin/GPR54信号通路GnRH、 GPR54、PLC和PKC基因mRNA表达的影响,如图2.22和2.23所示。染毒6 h,与对照组相比, GnRH. GPR54、PLC和PKC基因mRNA的表达水平随4-OH-CB107作用浓度的增加均表现出 先增加后降低的趋势,GnRH、GPR54、PLC和PKC基因mRNA的表达水平在0.05 nM浓度组中 均显著上调(PV0.05),而G胰H基因mRNA在500 nM浓度组中显著下调(Pv0.05) , GPR54、 PLC和PKC基因mRNA的表达水平在5 nM和500 nM浓度组中均未呈现统计学差异(P>0.05)。 染毒24 h,与对照组相比,GnRH和GPR54基因mRNA的表达水平随4-OH-CB107浓度增加呈 现上升的趋势,5 nM和500 nM 4-OH-CB107均显著上调GnRH和GPR54基因mRNA的表达水 平。和PKC基因mRNA在各浓度组均极显(FvO.Ol)或显著(P<0.05)。
6h

Concentration of4-OH-CB107 (nM)
图2.22 4-OH-CB107染毒6 h对Kisspeptin/GPR54信号通路相关基因mRNA表达的影响
Fig.2.22 Effects on relative mRNA expression of genes on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT 1-7 cells treated
with4-OH-CB107for6h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.

图2.23 4-OH-CB107染毒24 h对Kisspeptin/GPR54信号通路相关基因mRNA表达的影响
Fig.2.23 Effects on relative mRNA expression of genes on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT 1-7 cells treated
with 4-OH-CB107 for 24 h
注:结果表示为三次独立试验的平均值土标准差5=3),与对照组相比,*P<0.05, **P<0.01。
Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the
control group.
2.3讨论
长期以来,下丘脑神经内分泌调节的研究主要集中于通过动物模型结合组织切片等方法,而 由于神经元具有位置分散、数量较少、功能各异、表型丰富等特点导致其较难区别和定位,从而 为基于细胞水平的分子机制研究带来诸多不便。Mellon等(1990)从小鼠下丘脑培养获得的GT1 细胞系具有与内源性GnRH神经元相似的特性,目前广泛用于体外GnRH神经元功能、分子和细 胞生物学等领域的研究。本试验采用小鼠永生化下丘脑GnRH神经元细胞模型GT1-7细胞系,探 究PCB118及其轻基代谢物4-OH-CB107对GT1-7细胞分泌GnRH的影响和相关机制。
2.3.1 PCB118和4-OH-CB107对GT1-7细胞增殖和凋亡的影响
Dickerso n等(2009)研究发现,PCB118 (0.1-100 jiM)体外暴露GT1-7细胞24h以内能够 抑制细胞增殖;Hashmi等(2018)也发现PCB118 (1〜20 ptg/mL)作用人胚肺成纤维细胞12〜48 h 后,具有显著抑制细胞增殖的作用。本试验重点研究较低浓度PCB118对GT1-7细胞增殖和细胞 凋亡作用。结果表明,低浓度PCB118具有抑制GT1-7细胞增殖的毒性作用,随PCB118暴露浓 度(0.05〜50000 nM)的增加和作用时间(6h〜48h)的延长,细胞存活率逐渐降低,呈现一定的 剂量-时间效应关系。正常状态下,LDH稳定地存在于细胞质中,当细胞膜结构受损时会导致胞 浆内的LDH释放进入细胞培养液中。试验结果发现,低浓度PCB118 (0.05〜5000 nM)对LDH 的释放无显著影响,仅在50000 nM浓度作用下显著促进LDH的释放,损伤细胞膜的通透性。诱 发或抑制细胞凋亡是外源化学物发挥毒性作用的形式之一,同样,在细胞凋亡试验中,仅高浓度 组(50000 nM) GT1-7细胞早期凋亡率与对照组相比显著增加。Dickerson等(2009)研究发现, 100 piM PCB118具有促进GT1-7细胞坏死的作用,Guo等(2015)也发现25000 nM PCB118能
中国农业科学院硕士学位论文 第二章PCB118和4-OH-CB107对GT1-7细胞毒性及GnRH分泌影响与机制研究 促进人甲状腺上皮细胞(HTECs)的凋亡。上述结果表明,低中浓度的PCB118 (0.05-5000 nM) 仅具有一定的细胞增殖毒性,而高浓度PCB118 (50000 nM)对细胞增殖、LDH活性和细胞凋亡 均有显著影响,具有明显的细胞毒性。
虽然有报道表明10〜50 jiM 4-OH-CB36能以剂量依赖性方式促进大鼠小脑颗粒细胞LDH释 放并诱导细胞凋亡或坏死(Dwiem, 2009),但针对OH-CPBs暴露的毒理学数据还比较少。 4-OH-CB107作为PCB118最主要的活性代谢产物,研究结果显示,在0.05〜500 nM浓度范围内, 4-OH-CB107仅具有抑制细胞增殖的毒性作用,对LDH水平和细胞凋亡均无显著影响。相较于其 母体化合物PCB118, 4-OH-CB107的增殖毒性更低,但其长期暴露所造成的细胞毒性作用仍值得 关注。两种受试物在低中浓度作用下均对GT1-7细胞的LDH活性、细胞凋亡和坏死无显著影响, 细胞毒性作用较弱。
2.3.2PCB118 和 4-OH-CB107 对 GT1-7 细胞分泌 GnRH 的影响
GnRH由下丘脑神经元合成并分泌,经垂体门脉系统调节腺垂体的促性腺激素分泌,进而调 控性腺激素水平和生殖功能(Stamatiades, 2008)。目前,已经有研究表明PCBs可以干扰神经内 分泌系统,影响大鼠脑组织中GnRH表达,进而影响机体性别分化,造成生殖功能紊乱(Dickerson, 2010); Khan等(2001)也发现PCBs混合物Aroclor 1254 (主要成分是PCB118)能损伤鱼类下 丘脑前部中GnRH的合成和释放。本研究结果表明,不同浓度PCB118 (0.05〜50000 nM)处理 GT1-7细胞不同时间(6 h和24 h)对GnRH分泌具有一定的抑制作用。处理6 h, 5、500和50000 nM PCB118能显著抑制GT1-7细胞分泌GnRH,这与Dickerson等(2009)发现PCB118 (0.1〜10 piM)作用GT1-7细胞4 h促进分泌GnRH的结果不一致,可能与实验中细胞状态、药物干预浓 度和GnRH脉冲分泌时间有关。处理24h,高浓度PCB118 (500 nM和50000 nM)能显著抑制 GT1-7 细胞分泌 GnRH,这与 Dickerson 等(2009)发现 PCB118 (1-100 piM)作用 GT1-7 细胞 24 h显著抑制GnRH分泌的结果一致。细胞培养上清液中GnRH由具有活性的GT1-7细胞分泌, PCB118对GT1-7细胞增殖的抑制作用可能是造成GnRH分泌量降低的原因之一。但作用6 h, PCB118并未显著抑制细胞增殖,因此短时间内GnRH分泌量的改变并不是由细胞增殖引起,可 能是通过影响GnRH合成和脉冲式分泌模式发挥作用。研究表明,GnRH神经元主要位于下丘脑 等部位,内源性或外源性刺激到达时,GnRH与其受体结合可调节多条信号通路,经级联放大反 应诱导GnRH分泌。其中,Kisspeptin/GPR54信号通路可以直接调控GnRH的脉冲分泌过程。此 外,GnRH自身可作为信号分子通过脉冲分泌频率调控FSH等HPG轴激素水平并接受其负反馈 调节(王新,2011)。因此,根据本研究结果,可以推测GnRH分泌量的改变主要受其合成和分 泌模式改变的影响,PCB118的细胞增殖毒性作用对GnRH分泌量的影响较小。
已经有报道表明,某些OH-PCBs具有一定的神经毒性作用。Kimura-Kuroda等(2007)发现 某些OH-PCBs通过干扰甲状腺素的作用从而抑制小鼠小脑中浦肯野细胞树突状结构的形成,最 终影响小鼠的神经发育系统。在一项人类试验中,脐带血中4-OH-CB107含量与儿童心理发育指 数呈现负相关性,这可能与其引发的内分泌干扰、神经递质功能紊乱或者中枢神经系统甲状腺激 素水平降低有关(Park, 2009)o研究结果发现,较低浓度(0.05 nM) 4-OH-CB107作用6 h促进 GT1-7细胞分泌GnRH,较高浓度4-OH-CB107 (500 nM)作用24 h同样具有促进GnRH分泌的
作用。值得关注的是,虽然低浓度PCB118 (0.05 nM)在较短时间内不影响GnRH的分泌,但其 代谢产物4-OH-CB107会促进GT1-7细胞分泌GnRH,提示PCB118的代谢在短时间内可能并不 具有解毒作用,反而有助于发挥内分泌干扰效应。此外,PCB118主要表现出抑制分泌GnRH的 作用,但4-OH-CB107在一定作用浓度和时间下呈现促进GnRH分泌的作用,提示PCB118发挥 干扰GnRH分泌的效应可能被其轻基化代谢所拮抗或逆转,但最终效应还有待研究。目前关于 OH-PCBs对神经内分泌干扰效应的毒理学数据比较少,相关的作用机制有待于进一步研究。
2.3.3 PCB118和4-OH-CB107对Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白及其基因表达 的影响
大量研究发现,GnRH的分泌受到许多调节系统的控制,而最终反应是兴奋性和抑制性双重 因素协同作用的结果(张丽,2014) o随着KzksJ基因和GPR54基因的发现和克隆(Lee, 1996; Lee, 1999),陆续的报道揭示了 Kisspeptin/GPR54信号通路在调控分泌GnRH和生殖发育系统 中的重要作用。GnRH神经元受到其上游神经元(kiss-1)的直接调控,kiss-1神经元内的HvsJ 基因可以编码Kisspeptin多肽,Kisspeptin通过与其受体GPR54 (Ohtaki, 2001)结合激活PLC 反应途径,从而激活下游激酶如PKC等磷酸化级联反应途径并活化细胞膜上非选择性阳离子通 道以及抑制K+的外向电流而达到GnRH神经元的去极化,参与调控GnRH的合成和分泌 (Zamponi, 1997; Quaynor, 2007; Adams, 2018)。GPR54、PLC 和 PKC 等均是 Kisspeptin/GPR54 信号通路中的关键调控蛋白。已有研究表明,在GT1-7细胞中,Kisspeptin/GPR54可通过PKC 信号通路调节下游细胞内钙离子通量从而影响GnRH的分泌(Ozcan, 2011)。本试验初步分析 了 PCB118 及其轻基代谢物 4-OH-CB107 对 Kisspeptin/GPR54 信号通路中 GnRH、GPR54、PLC 和PKC等蛋白及其基因表达的影响。
己经有研究发现,低浓度PCBs短时间暴露GT1-7细胞会促进GnRH mRHA的表达,进而促 进GnRH的分泌;而高浓度PCBs长时间暴露则会抑制G欣H基因的表达,从而抑制GnRH的分 泌(Gore, 2002; Dickerson , 2009)。体外实验证明PCB118能显著降低雌性羔羊下丘脑组织 中kiss-1和GPR54基因的表达水平从而影响雌性动物的生殖神经内分泌(Bellingham, 2008)。 本试验结果发现,一定浓度PCB118 (5〜50000 nM)分别暴露GT1-7细胞6 h和24 h后,具有抑 制GT1-7细胞分泌GnRH的作用。同时,Kisspeptin/GPR54信号通路上关键蛋白及其基因mRNA 表达水平的变化趋势与PCB118影响GT1-7细胞分泌GnRH的变化趋势基本一致,表达水平显著 下调。其中,类环境剂量组中0.05 nM PCB118对GnRH分泌量和GnRH、GPR54、PLC和PKC 等蛋白的表达均无显著影响,但5 nM PCB118作用6 h,在不影响细胞增殖的情况下即可抑制 GT1-7细胞分泌GnRH,显著抑制Kisspeptin/GPR54信号通路上GPR54、PLC和PKC等蛋白的 表达,并显著下调PLC和PKC基因mRNA的表达水平;值得注意的是,5 nM作用24h时, PCB118对GT1-7细胞的GnRH分泌和相关蛋白的表达差异并不显著,推测可能存在其他调控机 制。500 nM的暴露浓度稍高于正常的环境水平,在长期生活于受PCBs污染的地区或接触电子 垃圾的动物或人体内属于较正常水平,其所带来的危害不容忽视。研究结果发现,500 nM PCB118作用6h,显著降低GnRH分泌量并显著下调GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白水平 和PLC与PKC基因mRNA表达水平,但GnRH和GPR54基因的表达水平增加,与蛋白表达量 和GnRH分泌量的变化呈现相反趋势,考虑分泌GnRH受到兴奋性和抑制性双重因素的影响,推 测PCB118可能激活了其它兴奋性信号通路。50000 nM PCB118远高于环境介质中的水平,在 设定的时间范围内,能稳定地抑制GnRH分泌并下调Kisspeptin/GPR54信号通路中相关蛋白和基 因mRNA的表达水平。研究结果初步表明,环境剂量暴露下PCB118仍然具有一定的神经内分泌 干扰效应,Kisspeptin/GPR54信号通路部分介导PCB118从基因水平和蛋白水平干扰GT1-7细胞 分泌GnRH,具体机制和其它潜在信号机制有待进一步研究;而在高浓度剂量下,PCB118主要 通过干扰Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白和基因的表达而影响GT1-7分泌GnRH。
虽然己有报道表明,4-OH-CB107具有甲状腺素和雌激素干扰效应,但目前针对OH-PCBs 神经内分泌干扰效应及作用机制的研究相对较少。本试验选择较低浓度4-OH-CB107处理GT1-7 细胞6 h和24 h,结果表明,0.05 nM和500 nM 4-OH-CB107作用GT1-7细胞6 h和24 h,具有 促进其分泌GnRH的作用。类环境剂量水平的4-OH-CB107 (0.05 nM)暴露6 h后上调GnRH、 GPR54、PLC和PKC蛋白及其基因mRNA的表达水平。当较高浓度4-OH-CB107 (500 nM)暴 露24 h后,也显著促进了 GT1-7细胞GnRH、GPR54、PLC和PKC蛋白及其基因mRNA的表达, 与4-OH-CB107对GT1-7细胞分泌GnRH的影响基本保持一致,表明Kisspeptin/GPR54信号通路 介导4-OH-CB107干扰GT1-7分泌GnRH的过程。此外,500 nM 4-OH-CB107作用6 h后能显著 下调GnRH蛋白及其基因mRNA的表达水平,但对GPR54、PLC和PKC蛋白和基因mRNA的 表达以及GnRH分泌量无显著影响;0.05 nM和5 nM 4-OH-CB107作用24 h后,也能促进GnRH、 GPR54、PLC和PKC等蛋白及其基因mRNA的表达,但GnRH分泌量未出现显著变化,推测 4-OH-CB107可能同时刺激某些兴奋性和抑制性的信号分子来介导其影响GnRH的脉冲式分泌过 程,具体机制有待进一步探究。
第三章全文结论
3.1论文总结
(1)PCB118 (0.05〜50000 nM)和轻基多氯联苯 4-OH-CB107 (0.05〜500 nM)均具有抑制 GT1-7细胞增殖的毒性作用,具有时间和剂量效应。PCB118仅在50000 nM时促进LDH释放 和细胞早期凋亡,具有显著细胞毒性;
(2)PCB118可通过显著下调Kisspeptin/GPR54信号通路GPR54、PLC和PKC基因mRNA 及蛋白表达水平抑制GnRH合成与分泌,其轻基代谢产物4-OH-CB107可通过上调 Kisspeptin/GPR54信号通路GPR54、PLC和PKC基因mRNA及蛋白表达水平促进GnRH合成与 分泌,但Kisspeptin/GPR54信号通路仅部分介导PCB118和4-OH-CB107干扰GT1-7细胞分泌 GnRHo
3.2研究创新点
(1)针对PCBs和OH-PCBs神经内分泌干扰效应和相关机制研究较少的问题,本论文分析 比较了 PCB118及其轻基代谢物4-OH-CB107对GT1-7细胞分泌GnRH的影响,并探究相关的信 号机制,为进一步探究PCBs的代谢对其发挥内分泌干扰效应的作用提供理论依据。
(2)针对以往研究主要采用高环境暴露剂量PCB118开展体外毒性试验的研究现状,本试 验同时选择类环境剂量PCB118和4-OH-CB107分别暴露GT1-7细胞,评价其对GT1-7细胞分泌 GnRH的影响,更贴近真实的环境污染状况,所得毒理学数据更能说明实际问题,可为PCBs风 险评估提供科学依据。
3.3研究展望
本课题的研究工作虽然取得了一定的进展和成果,但仍然存在不足之处,可以在以后的工 作中进一步开展以下几方面的内容:
(1)现阶段针对神经内分泌干扰效应作用机制的研究还不够完善和深入,需要进一步对受影响 的蛋白进行阻断剂验证,同时进一步探究下游信号通路中关键调控因子如RAF、MEK1/2和 ERK1/2等蛋白及其基因的表达情况并进彳丁验证。
(2)已经有报道表明外源性Kisspeptin-10 (Kp-10)能够促进GnRH的分泌。因此,可以添加 Kp-10至细胞培养液中以活化GT1-7细胞,构建GT1-7细胞的敏感模型,再进行内分泌干扰物的 干预试验,能更加准确地模拟GnRH神经元处于青春期时机体内的生理环境。
(3)将PCB118及其轻基代谢物4-OH-CB107进行联合暴露,探究联合暴露对GT1-7细胞分泌 GnRH的影响,并与单独暴露两种受试物的结果进行比较,进一步阐明PCB118的代谢过程对其 发挥神经内分泌干扰效应的影响。
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致谢
时光荏苒,3年的硕士研究生学习生涯即将落下帷幕,回忆了这段难忘岁月里的点点滴滴, 发现自己的成长和进步离不开太多人的帮助和关怀,值此论文完成之际,我想对他们表示真心地 感谢。
本课题及论文的撰写是在导师苏晓鸥研究员的悉心指导和大力支持下完成的。苏老师在本论 文的选题、试验设计和完成以及论文撰写的整个过程都倾注了很多心血,在此,我要向苏老师致 以衷心的感谢!感谢苏老师对我学业上的指导和教诲;对我生活上的关怀和帮助;感谢这3年来 老师对我的言传身教,指引我学习的方向,更教会我如何为人处事,使我受益终身。他严谨的治 学态度、敏锐的思维方式、渊博的专业知识和严格且勤恳的工作作风是激励我不断进步的动力和 终生学习的榜样。一日为师,终身为父,对苏老师的感激溢于言表,虽然这3年的学习即将告一 段落,但师生情长存,再次对我的导师苏晓鸥研究员致以最诚挚的感谢和祝福。
本试验得到了二噁英室王培龙、程初、肖志明、李晓敏、张苏、董淑君、王嬪和李桐等老师 的关心、帮助和支持,向各位老师致以最衷心的感谢!特别感谢我的师兄王瑞国博士在试验的选 题和设计过程中对我的悉心指导,他无私的帮助和不断地鼓励支持着我奋斗前进。特别感谢张维 老师、齐香荣老师以及林刚师兄在实验开展过程中以及论文撰写和发表中给予我的切实帮助。特 别感谢己经出站的博士后张志岐师姐对我实验技能和论文撰写的悉心指导,试验的开展和论文的 发表少不了与师姐的一次次交流,在此向师姐表示感谢!