PD-1受体高亲和力拮抗剂药物的设计及优化论文

2020年5月11日17:47:10PD-1受体高亲和力拮抗剂药物的设计及优化论文已关闭评论

PD-1受体高亲和力拮抗剂药物的设计及优化论文

Fc融合蛋白是以人抗体的Fc片段为支架、通过连接肽合理展示具有生物学活性的 多肽或功能性蛋白结构域所获得的新型融合蛋白。Fc融合蛋白的结构、功能、表达体系、 纯化工艺以及药理学研究等方面与抗体药物类似,也被认为是一种广义上的抗体类药 物。目前已有11种Fc融合蛋白类药物获得FDA批准上市,如依那西普、阿柏西普等。
天然PD-1/PD-L1分子间亲和力约为10 6M,亲和力较低,野生型PD・1或PD-L1不 能有效拮抗肿瘤微环境中PD-1/PD-L1的结合,逆转免疫抑制信号。如果对PD・1或PD-L1 分子进行特异性的突变改造从而提高其亲和力(例如10-9-10-10M),这些突变体就能够 发挥与抗体类似的阻断PD-1/PD-L1信号通路的效应。而且,改造后的高亲和受体/配体 结合表位与天然受体■配体的作用区域几乎完全重叠,理论上可以发挥比抗体更优的阻 断效应。本论文基于天然PD・1分子的结构特征,借助计算机辅助分子模拟技术进行 PD-1/PD-L1分子结构的模拟和对接,在保证PD・1分子识别PD-L1分子的表位不发生漂 移的前提下,综合考虑影响蛋白分子成药性的关键因素(如亲和力、稳定性等),合理 设计了多个PD・1突变位点,获得了包括各突变组合的虚拟库;进一步,借助哺乳动物 细胞库技术将设计的突变库展示于哺乳动物细胞表面,利用流式高通量分选技术筛选、 富集强阳性克隆,实现PD・1分子的体外亲和力成熟。同时,建立了 PD・1分子体内、外 评价模型,评价候选分子的生物学活性。
具体研究结果如下:
1.PD-1高亲和力突变库的设计和构建
借助PD-1. PD-L1晶体结构,利用计算机辅助分子模拟、对接技术合理搭建 PD-1/PD-L1相互作用复合物空间结构,通过计算机图形学、距离几何学以及分子间相 互作用模式(分子间氢键、Van der Waals作用等)从理论上分析PD-1/PD-L1相互识别 的关键氨基酸位点。据此设计丙氨酸替换PD-1分子突变体M1-M5,其中M3为对照突 变体,经实验确认,理论预测模型正确,Ml、M2、M4、M5为PD-1/PD-L1的主要识 别表位。在确认理论作用模型PD-1/PD-L1复合物结构合理的基础上,考虑分子极性、 分子间氢键、范德华力等因素进行氨基酸替换,对每一种可能的氨基酸替换进行自由能
in 计算,依照能量越低分子越稳定的原理,将自由能低于野生型PD・1分子的氨基酸纳入 虚拟库设计的候选突变位点中并构建点突变虚拟库。利用排列组合原理计算虚拟库理论 库容量,最终理论库容为2.98x106。
2.PD-1高亲和力突变体的筛选和初步鉴定
(1) 基于设计的点突变虚拟库设计兼并引物,合成PD・1突变体分子文库并克隆至 膜展示载体(PFRT-TM),随机挑取100个克隆进行测序分析,通过多序列比对分析对 测序结果进行质量控制,结果表明在71个测序正确的克隆中所有突变点均为理论设计 的突变点,且氨基酸出现频率呈均匀分布。同时71个克隆序列多样性丰富,没有重复 序列,即分子库的构建成功率为71%,符合实验需求并可用于后续的细胞库构建。
(2) 利用实验室已有的哺乳动物细胞展示系统(FRT定点整合),将PD・1突变体 库质粒稳定转染至CHO-Flp-In细胞,经过潮霉素B加压筛选获得稳定表达外源蛋白的 细胞群,即为哺乳动物细胞PD・1细胞库。
(3) 利用流式分选技术富集阳性高亲和细胞,经三轮筛选,通过逐步降低 PD-L1-biotin浓度的方法(lOyg/mL、5|iig/mL> 2)ng/mL)更好地富集强阳性的细胞群。 提取第三轮富集后细胞群的基因组,利用特异性引物进行PCR扩增获得目的基因。将 目的基因克隆入实验室已有载体PFRT-KIgGl/Fc,经过连接、转化,对阳性克隆进行测 序,获得候选分子的序列。
(4) 将候选分子序列与母本序列进行比对、聚类分析,初步选择9株代表序列, 通过CHO-S表达系统对目的蛋白进行大量表达,纯化,获得胞外段目的蛋白;通过结 合ELISA、竞争ELISA、亲和力测定实验最终获得一株亲和力提高约1000倍的高亲和 PD・1突变体蛋白,命名为463。
3.高亲和力PD-1突变体463的生物学活性评价
(1) 463融合蛋白体外有效结合PD-L1,发挥良好的竞争结合功能:结合ELISA 实验结果显示,463可特异性识别PD-1的配体PD-L1/PD-L2,与野生型PD・1相比,463 与PD-L1/PD-L2的结合活性明显提高;竞争ELISA实验结果显示,463可有效地竞争 阻断PD・1与PD-L1的结合,而野生型PD・1则不能有效阻断。463的阻断活性较野生型 PD-1提高约668倍。
(2) 463能够逆转PD-L1诱导的体外T细胞免疫抑制状态:抗CD3和CD28抗体
刺激后T细胞激活,IFN・Y表达上调。PD-L1能够抑制T细胞活化,抑制IFN-Y的分 泌。463和Opdivo均可以有效阻断PD-1/PD-L1信号通路,解除T细胞的抑制状态,恢 复IFN- Y的表达,且这一逆转效应具有一定的剂量依赖性。
(3)463抑制转基因荷瘤小鼠的肿瘤生长:与无关抗体组相比,10mg/kg463治疗 组肿瘤生长抑制率约为72%, 2mg/kg治疗组为43%,而阳性对照抗体Atezolizumab (10mg/kg)组为77%, 10mg/kg野生型PD-1组为14%,提示463的抑瘤效果明显优于 野生型PD・1蛋白,与上市抗体药物有着相似的抑瘤效果。
综上所述,PD・1突变体463具有良好的体内、外生物学活性,具有一定的开发潜 力和良好的应用前景。
关键词:Fc融合蛋白,计算机辅助分子设计,哺乳动物细胞抗体库,PD-1,肿瘤免疫治疗
ABSTRACT
The Fc fusion protein is a novel structural protein, which is fused by Fc fragment of human antibody as a scaffold and exhibits the structural domains of biologically active polypeptides or functional proteins through conjugated peptides. Its structure, function, expression system, purification process and pharmacological research are all similar to those of antibody drugs, therefore they are considered as broad-based antibody drugs. At present, 11 Fc fusion protein drugs have been approved by the FDA, e.g. Etanercept and Abecept, etc.
The native PD-1/PD-L1 has an intermolecular low affinity of about 10'6 M. Wild-type PD-1 or PD-L1 as an antagonist molecule cannot effectively compete to reverse the PD-1/PD-L1 inhibition signals in the tumor microenvironment. Similar to the antibody drugs, PD-1 or PD-L1 mutants can effectively block PD-1/PD-L1 signals if they are artificially modified with higher affinity (e.g. up to 10'9 -IO10 M). The engineered high-affinity receptor or ligand possesses overlapped epitope with that of the natural PD-1/PD-L1, so its blocking effect might be superior to that of antibodies theoretically. In this study, based on the structure of the wild-type PD-1 molecule, we used the computer-aided molecular analysis and design methods to simulate and dock the PD-1/PD-L1 structure, following the principle of keeping the epitope in PD-L1 recognized by PD-1. At the same time, the key pharmaceutical characters (e.g. affinity, stability, etc.) were considered to obtain the virtual library of PD-1 mutants. With the help of mammalian cell display technology, the mutanted PD-1 genes in the library were displayed on the mammalian cell surface. Then the high-throughput flow cytometry method was used to screen and enrich positive clones to improve the maturity and stability of PD-1 molecule in vitro. Furthermore, in vivo and in vitro models were established to evaluate the biological activity of the candidates.
The details of the research results are as follows:
1.Design and Construction of PD-1 High-affinity Mutant Library
(1)Based on the crystal structure of PD-1 and PD-L1, the spatial structure of PD-1/PD-L1 interaction complex was reasonably constructed by computer-aided molecular simulation and docking technology. The key amino acids in PD-1/PD-L1 complex were theoretically analyzed by computer graphics distance geometry and interaction modes (intermolecular hydrogen bonding, Van der Waals interaction, etc.), according to which five mutants, M1-M5, were designed using the alanine replacement, in which M3 is a control mutant (negative and invalid mutation). Experiments indicated that Ml, M2, M4, and M5 were indeed the key epitopes of PD-1 recognized by PD-L1, confirming the rationality of the theoretical model of PD-1/PD-L1 structure. Mutations were then designed by considering the mode of amino acid action and the physicochemical properties of amino acids, and the virtual library including all mutations was obtained.
(2)According to the library design, specific primers were synthesized, and the DNA sequences were subcloned to the membrane display vector (PFRT-TM) and then transferred to the cells to construct the library. We selected 100 clones randomly for sequencing using the multiple sequence alignment analysis, from which 71 correct clones were analyzed to have the mutation sites in agreement with the theoretical design. The frequency of amino acids appeared uniformly. At the same time, 71 sequences were available in diversity and didn't contain repetitive sequences, indicating that the effective ratio of the library is -71%, which meets the experimental requirement.
(3)The plasmids of the library were stably transfected into CHO-Flp-In cells (site-directed integration), and the stable expression cells of exogenous proteins were screened out by adding hygromycin B.
2.Screening of High-affinity PD-1 Mutants and Preliminary Identification of Candidates
The positive cells with high affinity were enriched by cell sorting. During three rounds of screening, the concentration of PD-L1-biotin was reduced from 10|ig/mL , 5|ig/mL to 2 |ig/mL in order to obtain the best clones. The genome of the final cells was extracted, and the target genes were amplified by PCR using specific primers. Then genes were subcloned into the existing vector PFRTKIgG 1 /Fc, and the positive clones were sequenced after ligation and transformation steps to know the candidate sequences.The candidate sequences were then compared with the maternal sequence, and 9 representative sequences were preliminarily selected by cluster analysis. The extracellular segment target proteins was prepared in CHO-S expression system, and purified to obtain the PD-1 mutants. Finally, 463 was chosen for further research by binding ELISA, competitive ELISA, and affinity assay, which had an affinity increase of about 1000-fold than the Wild-type PD-1.
3.The Bioactivity Evaluation of High A ffinity PD-1 Mutant 463
According to ELISA results, 463 could specifically recognize PD-1 ligand PD-L1/PD-L2. Compared with wild-type PD-1, the binding activity of 463 to PD-L1/PD-L2 was significantly increased. Competitive ELISA results showed that 463 could effectively compete to block the binding of PD-1 to PD-L1, while wild-type PD-1 could not. It concluded that the blocking activity of 463 was about 668-fold higher than that of the parent protein.
Experiments of in vitro PBMC activation experiments showed that 463 could reverse the inhibition of T cell activation. CD3 and CD28 stimulated T cell activation, and IFN-y expression was upregulated. However, T cell activation was inhibited by PD-1/PD-L1 pathway. At the same time, IFN-y secretion decreased. The candidate 463 and the positive antibody drug Opdivo could block the inhibitory PD-1/PD-L1 signaling pathway at the concentrations above 2.5pig/mL and re-activate the T cells to secrete IFN—y in a dose-dependent manner.
In exograft transgenic mice model, the satisfactory inhibition ratios of tumor growth were 72% in the lOmg/kg of 463 group, 43% in the 2mg/kg of 463 group, and 77% in the lOmg/kg of Atezolizumab (positive antibody) group, compared with 14% in the lOmg/kg of wild-type PD-1 group. The high-dose of 463 had a similar anti-tumor effect to the antibody drug Atezolizumab, which was much better than the wild-type PD-1 protein.
In conclusion, the candidate PD-1 mutant 463 had good biological activity both in vivo and in vitro, indicating certain values and potential for further exploitation and application.
KEY WORDS: Fc fusion protein, computer-aided molecular design, mammalian cell antibody
library,PD-1, tumor immunotherapy
癌症是危害人类健康的重大疾病之一,我国每年约150万人被癌症夺走生命,新确 诊的癌症病例也居高不下,癌症防治形势日趋严峻。传统癌症治疗策略主要包括手术、 放疗、化疗和靶向治疗,针对的主体是癌细胞本身。但是,肿瘤细胞具有高度的克隆选 择性和异质性,肿瘤快速增殖、转移和耐药是目前医学界的难题。近年来,肿瘤免疫治 疗取得了长足的进步,正在逐渐改变和挑战传统的癌症护理、治疗标准。肿瘤免疫治疗 旨在通过重新启动并维持肿瘤■免疫监视机制,恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应,从而 控制与清除肿瘤。根据作用机制不同,肿瘤免疫治疗方法主要包括非特异性免疫调节剂 治疗(如胸腺素、白细胞介素・2、干扰素)、肿瘤疫苗、过继免疫疗法(如LAK、DC-CIK、 CAR-T)、免疫检查点抑制剂疗法(如CTLA・4、PD-1. LAG-3)、溶瘤病毒疗法、针 对代谢通路靶标的免疫治疗、针对外泌体的免疫治疗和针对细胞离子通道的免疫治疗等 ⑴。
截至2017年9月⑵,全球已批准26种免疫疗法,涵盖17种癌症类型。1986年, Q干扰素被批准用于治疗毛细胞白血病,成为现代肿瘤免疫治疗第一个获批药物⑶。自 此,多种肿瘤免疫治疗的药物相继被批准。但肿瘤免疫治疗情况转变始于2011年,FDA 批准了 CTLA-4检查点抑制剂易普利姆玛(ipilimumab),用于晚期黑色素瘤的治疗⑷。 2013年,科学杂志将肿瘤免疫治疗列为十大科学突破之首⑸,掀起了近代肿瘤免疫治疗 的热潮。仅在过去的5年中炉刃,FDA就批准了五种新的靶向PD-1/PD-L1的检查点抑制 剂抗体:抗PD-1抗体纳武单抗(Nivolumab)、帕博丽珠单抗(Pembrolizumab)以及抗PD-L1 抗体阿特珠单抗(Atezolizumab)>巴文西亚单抗(Avelumab)和度伐单抗(Durvalumab)o 2018 年9月又批准了 Cemiplimab上市。此外,FDA还批准了两种靶向CD19的CAR-T细胞 免疫疗法和一种新的靶向CD3/CD19双特异性抗体。在大多数情况下,这些新型免疫疗 法旨在治疗对传统治疗没有反应的晚期,难治性或复发性癌症。
免疫检查点受体是调控免疫反应的关键分子。生理条件下,检查点信号能够抑制免 疫细胞尤其是T细胞的活化,以避免自身免疫和过度炎症反应。肿瘤微环境中,肿瘤利 用免疫检查点的抑制信号来逃避免疫系统的监视和杀伤,检查点阻滞疗法则利用单克隆 抗体解除受抑制的T细胞,使它们被激活并恢复抗肿瘤活性a】。近几年,随着靶向 CTLA・4、PD-1单抗药物的上市并在临床上取得了重大的突破,肿瘤微环境中免疫检查 点分子的研究和靶向拮抗剂药物开发迅速成为肿瘤免疫治疗的热点。其中,BMS与默 沙东开发的PD-1分子抑制剂Opdivo和Keytruda共同荣获2015年盖伦奖“最佳生物制 品”奖[UM。
PD-1分子是日本学者本庶佑于1992年利用消减法在凋亡的小鼠T细胞杂交瘤 2B4.11中分离得到的[⑶,因为它与细胞凋亡有关,因此被命名为程序性死亡受体・1 (Programmed death-1, PD-1) 。PD・1是一类重要的免疫负性调控分子,属于CD28超 家族成员。结构上,PD・1是由288个氨基酸组成的I型跨膜蛋白,分为Ig超家族结构 域、跨膜结构域、胞内结构域三部分。胞内区含有免疫受体酪氨酸抑制基序 (immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif^ ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序 (immunoreceptor tyrosine based switch motif^ ITSM) o ITIM 包括 SHP1 结构域,ITSM 则 包含SHP-1结构域和SHP-2结构域。研究认为,PD・1分子向胞内传递抑制信号主要通 过 SHP-2 分子[""I。PD-1 有两个配体,PD-L1 和 PD-L2o PD-L1 (又名 CD274 或 B7-H1) 和PD-L2 (又名CD273或B7-DC)。PD-L1是由290个氨基酸亚基组成的跨膜蛋白, 胞外段由两个免疫球蛋白恒定区(IgC)和IgV样结构域组成。PD-L1比PD-L2的分布 表达更广,主要表达于成熟的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、单核细胞等造血细 胞以及上皮细胞、基质细胞、肥大细胞等非造血细胞上,由促炎症细胞因子诱导表达。 多种肿瘤细胞均可以高表达PD-L1或PD・L2[i7,i8]。这两个配体与PD-1结合会导致ITSM 发生磷酸化,并招募酪氨酸磷酸酶SHP-2,引起下游蛋白激酶SyK、PI3K的去磷酸化, 抑制PI3K-AKT-mTOR通路,从而抑制T细胞的活性或使T细胞功能紊乱凹。生理条 件下,PD-L1分子在体内处于低表达状态,维持T细胞的免疫稳态;而在肿瘤微环境中, 肿瘤细胞高表达的PD-L1与浸润其中的T淋巴细胞表面的PD-1分子结合,使T细胞丧 失对肿瘤细胞的免疫杀伤活性,实现肿瘤细胞的免疫逃逸㈤]。因此,特异性阻断 PD-1/PD-L1信号通路,可以有效地激活免疫系统,增强免疫细胞的识别和杀伤功能, 从而彻底清除肿瘤0]。
近年来,FDA批准了 6款靶向PD-1/PD-L1通路的单抗药物。根据识别靶点这些药 物可以分为2类(见表1) o从适应症来看,靶向PD-1/PD-L1抗体类药物无论在血液 瘤还是实体瘤中均能发挥抗肿瘤效果,FDA甚至加速批准PD-1抗体Keytruda用于确定 有高度微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复基因缺陷(dMMR)的成人和儿童晚期或 转移性实体肿瘤患者,这是FDA首次批准不以肿瘤部位为参考,仅依靠生物标志物进 行治疗选择的药物。从临床疗效来看,目前PD-1/PD-L1抑制剂临床单药治疗效果有限
(约20%左右),但是大部分治疗有效的患者产生了持续性应答,有时甚至可以成功治 愈一些被“宣判死刑”的晚期癌症患者。为了解决单药的局限性,临床组合用药将会成 为下一个“肿瘤免疫治疗的风口”,从正在进行的临床试验看⑵,将抗PD-1/PD-L1药 物与其他IO疗法、靶向疗法、化学疗法、放射疗法或化学放射疗法相结合的组合试验 是临床开发的主要策略(图1)。
表1 FDA批准的PD-1/PD-L1抗体及应用
靶点 药品名 商品名 抗体类型 研发 公司 适应证
Nivolumab Opdivo 完全人IgG4 BMS 转移性非小细胞肺癌、肝细胞 癌、肾细胞癌、经典型霍奇金 淋巴瘤、头颈鳞癌、尿道癌或 错配修复缺陷的转移性结肠 直肠癌、不可切除的转移性黑 色素瘤或黑色素瘤辅助治疗
PD-1 Pembrolizum ab keytruda 人源化IgG4 默沙 东 头颈鳞状细胞癌、胃癌、黑色 素瘤、非小细胞肺癌、经典型 霍奇金淋巴瘤、尿道癌、高微 卫星不稳定的肿瘤
Cemiplimab Libtayo 人单克隆抗体 诺/M元 赛菲生 转移性或晚期皮肤鳞状细胞 癌
Atezolizumab Tecentriq Fc修饰人IgGl 罗氏 转移性非小细胞肺癌、 局部晚期或转移性尿道癌
PD-L1 Durvalumab Imfinzi 完全人IgGl 阿斯 利康 局部晚期或转移性尿道癌、转 移性Merkel癌
Avelumab Bavencio Fc修饰人IgGl 辉瑞/ 默克 青少年及成人性转移性默克 尔细胞癌、晚期尿道癌

随着对PD-1/PD-L1相互作用模式的不断深入了解,靶向性的小分子/肽药物研发也 应运而生。Aurigene公司模拟人PD-1胞外段氨基酸序列设计出名为AUNP-12的肽衍生 物,通过动物实验验证了其抗PD-L1的作用和抑瘤效果;此外,可口服的PD・1小分子 抑制剂也有报道,代号为CA-170,通过使用间苯二酚和3■羟基苯硫酚作为母核与N, N■二甲基氨基甲酸酯和其它烷基取代的胺连接,得到13个胺附加的苯基二甲基氨基甲 酸酯(AAPD)可以与PD-1结合并能够抑制PD-1/PD-L1的相互作用㈤。天然PD-1/PD-L1 分子间亲和力约为1(?6M[24,25],野生型的PD-1或者PD-L1不能作为拮抗分子有效逆转 肿瘤微环境中PD-1/PD-L1的抑制信号。如果能够人为提高PD-1或PD-L1的亲和力(如 将亲和力提高至10-9-10-10M),则高亲和受体分子能够像抗体一样有效阻断PD-1/PD-L1 信号轴。而且,由于突变体与天然受体■配体作用表位的重叠面更大,理论上具有比抗 体更优的阻断效应。因此,本论文的研究宗旨是研发高亲和力PD・1受体拮抗剂。下面 将详述本论文的立题依据和技术路线。
PD-1分子体外亲和力成熟是发挥有效拮抗天然PD-1/PD-L1信号通路的必要条件。 传统的分子体外进化方法是借助分子互作的晶体结构信息,对关键位点进行随机突变, 并借助噬菌体抗体库进行体外筛选和进化。上述方法具有突变随机、库容量大、表位飘 移等缺点。随着结构生物学、计算生物学、生物信息学的发展,计算机辅助分子药物设 计应运而生[26-2讥 其基本思路在于:借助分子的结构信息,借助计算机搭建分子间相互 作用复合物结构,在合理判别分子间相互作用的模式基础上,针对蛋白分子识别关键位 点、利用丙氨酸突变方法设计突变体,并通过体外实验验证分子相互作用的“核心表位” 和“次级表位”。进一步,在确定分子相互作用复合物结构正确的基础上,考虑氨基酸 的理化性质、相互作用能等参数,有目的的设计计算机虚拟库。与传统的分子体外进化 相比,基于计算机辅助分子设计具有目的性强、库容量小、表位不飘移等优势,是实现 蛋白质分子(包括抗体)体外高效进化的强有力的工具。通常还需要将设计的具有多样 性的虚拟库分子与噬菌体PIII蛋白融合,实现目的蛋白的噬菌体表面展示,并经过几轮 筛选富集,获得高亲和力的候选蛋白。虽然噬菌体库是目前最常用的分子体外进化的展 示和筛选系统,但是在实际应用过程中,噬菌体库也存在一些不足:1.噬菌体使用原核 系统,缺乏精细的蛋白质折叠和翻译后修饰,不能完全代表天然蛋白分子的生物学活性;
2.原核系统和真核系统在进行抗体表达时存在密码子偏好性,从噬菌体筛选获得的候选 分子转换到真核系统进行表达时,存在一定的不确定性。相比较而言,哺乳动物细胞分 子库技术具有精密的蛋白质翻译和修饰系统,展示的蛋白分子最接近于天然分子的生物 学活性。但是,受制于转染效率、培养体系等因素,哺乳动物细胞分子库的库容量较小 (约10&),限制了其广泛应用【29-辺。考虑到计算机辅助分子设计对库容量要求小,弥 补了哺乳动物细胞库容量低这一缺陷,因此本论文拟联合计算机辅助分子设计和哺乳动 物细胞库技术,筛选高亲和PD・1受体拮抗剂。同时考虑到受体分子的稳定性和成药性 "34],将筛选的高亲和力PD-1候选分子构建至IgGl恒定区Fc的N端,获得稳定的高 亲和力PD-1-Fc融合蛋白。
技术路线

PD-1表位定向库的建立
J流戎分选

基于以上思路,本论文拟完成以下工作
1.基于PD-1/PD-L1结构信息,借助计算机建模搭建PD-1/PD-L1复合物结构。确 定PD・1识别PD-L1关键氨基酸位点,借助丙氨酸突变确定关键氨基酸的“核心表位” 和“次级表位”,在确定分子相互作用复合物结构正确的基础上,考虑氨基酸的理化性 质、相互作用能有目的的设计PD・1高亲和力虚拟库。
2.借助分子生物学、细胞生物学等方法构建PD・1高亲和力哺乳动物细胞分子库, 经过筛选、序列比对以及初步生物学活性评价确定具有优良生物学特性的候选分子。
3.建立体内、外评价方法,对候选分子进行系列的功能评价。
第一部分 基于PD-1与PD-L1相互作用模式设计PD-1高亲和力
点突变文库
借助计算机分子模拟、对接技术获得PD・1与PD-L1相互作用的复合物结构;在合 理判别PD-1与PD-L1相互作用的分子模式基础上,针对PD-1识别PD-L1关键位点进 行丙氨酸突变,设计突变体并通过分子生物学实验构建PD・1突变体表达载体,制备并 验证其结合活性。在确定PD・1与PD-L1相互作用复合物结构正确的基础上,考虑氨基 酸的理化性质、相互作用能计算设计PD・1高亲和力点突变文库。
1 •材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂
主要试剂 厂家名称
Nhe I酶、Xho I酶等内切酶和对应的酶切
Buffer Biolabs 公司
DMEM-F12培养基、DMEM培养基、澳洲 胎牛血清(FBS)、CHO-S表达系统、胰酶 Gibco公司
Jet prime转染试剂及buffer Polyplus transfection 公司
293 TGE, CF1116 百普赛斯生物科技有限公司
无内毒素质粒提取试剂盒 天根生物公司
羊抗人 IgG, GAH-IgG-HRP Biolegend 公司
DNA琼脂糖粉 sigma
TMB显色液 Invitrogen 公司
上海生工生物工程有限公司完成本课题的引物合成工作。

1.1.2计算机分析软件
IBM 服务器、Insightll (2000)、Homology 模块、Docking 模块、Discover 模块、
Discover_3 模块
1.2方法
1.2.1计算机辅助分子模拟
借助PD・1、PD-L1晶体结构(PDB注册号:3RRQ、4Z18),利用计算机辅助分子 模拟的方法搭建PD・1、PD-L1理论空间构象。选择CVFF、Gromos96力场,依次经最 陡下降(收敛判据0.005kJ/mol,收敛步长20000步)、共辘梯度(收敛判据0.001kJ/mol, 收敛步长50000步)对获得的PD-K PD-L1空间结构进行力学优化。通过结构叠合, 选择主链碳原子均方根位移(Root Mean Square Distance, RMSD)计算理论构象的趋向 性。
1.2.2分子对接
选择人PD・1与PD-L1相互作用的晶体结构(PDB注册号:4ZQK),利用确定的 PD-K PD-L1理论空间构象,通过刚性分子对接、分子叠合确定PD・1与PD-L1相互作 用的理论初始结构。选择CVFF、Gromos96力场,依次经最陡下降(收敛判据0.005kJ/mol, 收敛步长50000步)、共轨梯度(收敛判据0.001kJ/mol,收敛步长80000步)对获得的 PD-1与PD-L1相互作用复合物结构进行力学优化。
1.2.3PD-1突变体构建
根据1.2.2分子对接结果确定PD-1识别PD-L1关键氨基酸区域(见表1.2),将突 变位点进行丙氨酸替换,在突变体序列加上信号肽序列 (ATGGGGCTGGTCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGT CT)、kozak序列(GCCACC)以及Nhel、Xhol酶切位点。通过分子克隆的方法构建 至实验室已有的Fc融合蛋白表达载体(pFRT・KIgGl/Fc)和哺乳动物细胞膜表达载体 (pFRT-TM)中,通过酶切鉴定阳性克隆。
1.2.4计算机辅助PD・1高亲和力虚拟库设计
在确定PD-1识别关键区域后,利用计算机分子模拟软件针对PD-1进行虚拟突变, 将相互作用自由能作为主要考虑指标,同时考虑突变组合后的构象变化(结构叠合、骨 架走向、均方根位移),依照能量越低分子越稳定的原理,将自由能低于野生型PD・1 分子的氨基酸纳入虚拟库突变中。
2•纟吉果
2.1PD-1与PD-L1相互作用复合物理论空间构象
利用计算机辅助分子模拟技术、力学优化获得的人PD-1, PD-L1空间稳定构象如 图1所示,对比人PD-K PD-L1晶体结构,PD・1理论空间结构与晶体结构主链碳原子 结构叠合RMSD值为0.0026nm, PD-L1理论空间结构与其晶体结构主链碳原子结构叠 合RMSD值为0.0014nm,提示获得的理论构象结构可信,选择的力场参数及优化方法 是可行的。
A

图1.1利用计算机分子模拟技术、力学优化获得的人PD-LK PD・1胞外区结构域三维结构的飘带构 象

A.人PD-L1胞外区结构域飘带结构B.人PD-1胞外区结构域飘带结构
2.2PD-1与PD-L1分子对接
进一步,通过分子对接获得了 PD・1与PD-L1相互作用复合物结构(图2)。从图 1.2B可以看出,PD-1与PD-L1相互作用较为紧密,主要通过疏水作用、分子间氢键、 静电作用实现二者的分子识别(表1.1)。利用距离几何学、计算机图形学方法从理论 上对PD-1与PD-L1相互作用的重要氨基酸进行了丙氨酸等位替换,利用相互作用能计 算判别氨基酸识别特点(表1.2) o

® 1.2 PD-1与PD-L1相互识别的分子模式
A.利用分子对接、力学优化获得的人PD・1与人PD-L1相互作用复合物飘带结构,绿色飘带代 表人PD・1胞外区结构,红色飘带代表人PD-L1胞外区结构;B通过距离几何学、计算机图形学技术 确定人PD-L1参与结合人PD・1识别的关键区域,绿色飘带代表人PD・1胞外区结构,红色飘带代表 人PD-L1胞外区结构,黄色球棍模型为PD-L1参与作用的关键氨基酸残基;C.通过距离几何学、计算 机图形学技术确定人PD-1参与结合人PD-L1识别的关键区域,绿色飘带代表人PD-1胞外区结构, 红色飘带代表人PD-L1胞外区结构,黄色球棍模型为PD■参与作用的关键氨基酸残基。
表1.1基于PD-1与PD-L1相互作用复合物确定二者相互识别的结构特点

2.3PD-1识别PD-L1核心表位确证
对PD-1参与识别PD-L1分子关键氨基酸位点进行丙氨酸替换,并利用分子生物学 方法构建相应的突变体(表2),其中,突变体M3为无关突变对照。为了更准确预测PD-1 识别表位信息,将关键表位突变体序列构建至pFRT-KIgGl/Fc> pFRT-TM载体中,实现 PD-1突变体Fc融合表达以及哺乳动物细胞膜表达。分别利用ELISA (图1.3A)和流式 细胞技术(图1.3B)检测PD・1核心表位突变体与PD-L1的结合活性。结果显示,PD-1 突变体Ml、M2、M4、M5与PD-L1结合明显降低,表明该区域为PD・1识别PD-L1的 核心位置。

表1.2 PDT关键位点丙氨酸替换相互作用能(kJ/mol)变化
PD-1突变
体 PD-1关键位点 突变前与PD-L1作
用能 丙氨酸替换后与PD-L1
作用能
PD-1 Ml Asn66Tyr68 -218.96 -108.29
PD-1 M2 Asn74Gln75Thr76Asp77Lys78 -218.96 -98.31
PD-1 M3 Thr45Glu46Asp48Asn49 -218.96 -215.38
PD-1 M4 Ile126Leu128Lys131Ile134Glu136 -218.96 -94.29
PD-1 M5 Glu84Asp85Arg86Ser87Gln88 -218.96 -106.83

Binding activity of PD-L1 to PD-1 Vari ants

图1.3 PD-1核心表位验证
A.ELISA验证PD-1突变体M1-M5与PD-L1结合活性
B.流式验证PD-1突变体M1-M5与PD-L1结合活性

2.4依据PD-1关键位置及识别模式设计虚拟突变库
在确定PD-1与PD-L1相互作用复合物构象合理的基础上,利用PD-1参与识别 PD-L1核心表位关键信息,进一步分析关键氨基酸的理化性质,考虑分子极性、分子间 氢键、范德华力等因素进行氨基酸替换,对每一种可能的氨基酸替换进行自由能计算, 野生型PD・1分子的自由能为119KJ,依照能量越低分子越稳定的原理,将自由能低于 野生型PD・1分子的氨基酸纳入虚拟库设计的候选突变位点中,见表1.3。利用排列组合 原理计算虚拟库理论库容量,将每一个突变位点的突变氨基酸个数相乘,最终获得理论 库容为2.98x106。为了将所有突变氨基酸成功引入特定的突变位点,建库过程中采用兼 并引物设计,具体每个点的兼并密码子见表1・3。

表1.3 PD-1分子虚拟库的设计
关键氨基酸 氨基酸替换码,理论上合成过程中每一种碱基出现的频率是均等的。
3 •讨论
近年来,随着结构生物学、生物信息学以及计算生物学的快速发展,衍生出基于计 算机结构模拟进行多肽、蛋白及抗体药物的设计。利用计算机模拟的方法来建立计算动 力学模型,并借助模型有目的地设计、改造多肽、蛋白及抗体药物的生物学特性(包括 亲和力、表达水平、热力学稳定性等)更亠]。利用计算机进行结构模拟和药物设计具有 目的性强、库容量低、成药性高等特点,这在一定程度弥补了哺乳动物细胞分子库库容 量低等缺陷。结合二者的优势,本实验室独创性地将计算机辅助设计与哺乳动物细胞抗 体库有机结合,首次提出了 “表位定向哺乳动物细胞抗体库技术”。通过计算机模拟技 术搭建PD-1与PD-L1相互作用复合物空间模拟模型,针对二者相互识别的分子模式进 行了分析,确认了 PD・1参与作用PD-L1的关键氨基酸位置。丙氨酸替换实验验证了理 论预测的准确性,从而保证可以基于正确的表位信息开展PD・1高亲和力突变体虚拟库 设计。总的来说,大分子蛋白体外进化是基于蛋白-蛋白相互作用信息来进行点突变设 计的,对于有明确晶体结构的蛋白质分子,计算机结构预测可以完全基于晶体结构,准 确性更高。本论文也正是基于已有的晶体结构开展PD-L1关键表位预测。而在抗体的体 外进化过程中,在抗体的晶体结构未知的情况下,通常采用同源建模的方式搭建抗体的 空间结构。例如利用NCEI中抗体多序列比对工具进行序列同源性比较,找出序列同源 性较高的且晶体结构已知的抗体作为模板来进行未知抗体的结构模拟。利用同源建模的 方法获得的理论构象虽然结构上有一些偏差,但是在完成抗原表位确证、明确抗体识别 关键表位信息后,可以对理论构象进行修正,在此基础上进行抗体库的设计,从而明显 提高抗体改造的成功率。可以说,计算机辅助平台是多肽药物、受体拮抗分子、蛋白药 物设计和优化的重要的研究工具,能够开展蛋白分子的体外进化,更有目的性地改造天 然分子的生物学活性。
4•小结
1.根据PD-1/PD-L1相互作用模型预测PD-1关键区域;
2.通过ELISA、流式细胞术等确证了 PD-1识别PD-L1的核心表位;
3.依据PD-1关键区域设计虚拟PD-1分子突变库。
第二部分PD・1高亲和力突变库的构建、筛选与候选分子的初步鉴

第一部分工作利用计算机辅助设计完成了 PD-1分子高亲和力突变虚拟库的设计工 作。本部分工作将构建PD・1分子哺乳动物细胞库,通过流式分选,富集与PD-L1结合 呈强阳性的克隆,并利用分子生物学方法从第3轮分选获得的细胞中钓取候选分子基因, 克隆至本实验室构建的Fc融合蛋白表达载体PFRT-KIgGl/Fco利用CHO-S瞬时表达系 统制备目的蛋白,并通过ELISA和Biacore方法初步鉴定候选分子的抗原结合、亲和力、 识别表位指标,挑选活性优良的候选分子。
1 •材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂
主要试剂 厂家名称
Nhel酶、Xho I酶等内切酶和对应的酶切 Biolabs 公司
Buffer
Optimum Growth 500 ml Flask THOMSON 公司
Expi CHO Expression Medium 培养基、 Gibco公司
DMEM-F12培养基、DMEM培养基、澳洲胎
牛血清(FBS)、CHO-S表达系统、胰酶
Jet prime转染试剂及buffer Polyplus transfection 公司
293 TGE, CF1116 百普赛斯生物科技有限公司
DNA 胶回收试剂盒,QIAmap DNA mini kit Qiagen公司
无内毒素质粒提取试剂盒 天根生物公司
潮霉素B 罗氏
羊抗人 IgG, GAH-IgG-HRP Biolegend 公司
DNA琼脂糖粉 Sigma公司
PD-Ll/Fc> PD-Ll-His> PD-L2-His 蛋白 义翘神州生物公司
TMB 显色液、zeocin Invitrogen 公司
Peroxidase-Labeled Streptavidin-APC KPL公司
PD-Ll-Biotin> PDl-Biotin由嘉暄智瑞生物科技有限公司进行生物素标记;上海生
工生物工程有限公司完成本课题的引物合成工作。2YT固体、液体培养基由本室配制高 压,注射用氨茉西林钠来自于华北制药。
1・1・2试剂配制方法
FACS 配制:98mL 1 X PBS+2mL(2%)胎牛血清。
双抗配置方法:100万单位注射用硫酸链霉素溶于10mL无菌水中,取8mL加入到 注射用青霉素钠(80万单位)中,混匀,分装,・20°C保存。
包被缓冲液:NazCOs 1.59g; NaHCOs 2.93g;加入800mL去离子水溶解,定容到 1000mL 加 0.02%NaN3, 0.22(im 膜过滤,4°C保存。
2N H2SO4终止液:5mL浓硫酸加入到85mL去离子水中,终浓度为lmol/L。
PBST: 100mL 20XPBS+1900mL 去离子水+4mL 吐温 20□
2YT液体培养基:16g胰蛋白B+10g酵母提取物+5gNaCl+900mL去离子水,定容 至IL, 15psi压力条件下高压蒸汽灭菌20mino
1.1.3常用载体、菌株、细胞
大肠杆菌TOP10感受态、293T细胞、CHO-FLP-IN细胞、CHO-S细胞、 PFRT-KIgGl/Fc载体由北京军事医学研究院免疫学研究室抗体组保存。
1.1.4主要仪器和设备
主要设备和仪器 厂家及产地
15mL离心管、50mL离心管、lOOmm?细胞培 Corning, 美国
养皿、150mm2细胞培养皿、6孔板、96孔板
二氧化碳培养箱,恒温二氧化碳细胞培养箱, Thermo, 美国
酶标仪
常温高速台式离心机Eppendorf5417D, PCR Eppendorf ,德国
扩增仪 EppendorfAG22331
流式细胞仪BD FACS Calibur BD,美国
DNA电泳仪 Bio-red,美国
涡旋振荡器,液氮罐 Thermo,德国
倒置显微镜 OLYMPUS 日本
蛋白纯化仪 AKTA prime plus, 美 国
Biacore T100 GE,美国
xz-i型真空泵 黄岩,中国
生物超净工作台 北京伟达,中国
垂直层流超净工作台,-80°C超低温冰箱 海尔,中国
1.2方法
1.2.1PD-1分子库构建及库质量分析
(1)PD-1分子库构建
根据论文第一部分计算机设计PD・1分子虚拟库突变位点信息,考虑每个突变位点 碱基序列的兼并性设计库引物,分子建库工作委托给金唯智生物技术股份有限公司。
(2)PD-1分子库建库质量分析
PCR成功构建PD・1分子突变库后,将目的片段连接T载体获得阳性克隆。挑取96 个克隆,利用T7通用引物进行测序,利用Expasy translate对获得的测序结果进行翻译 和序列统计。排除载体自连、PCR扩增引入的缺失、插入突变,对正确序列进行进一步 质量分析。首先利用EBI (The European Bioinformatics Institute)生物信息网站上多序列 分析模块(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对序列多样性进行分析,比较序列 与母本序列的同源性,分析序列的多样性。其次,利用http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi 网站对突变点每个氨基酸突变频率进行统计分析,明确突变位点每种氨基酸出现的理论 频率和实际频率。
1.2.2PD-1突变体细胞抗体库构建
(1)培养基配置
基础培养基:DMEM-F12 培养基+10%FBS+双抗 + 100(ig/mL zeocino
转染用培养基:DMEM-F12培养基+10%FBS+双抗。
筛选培养基:DMEM-F12培养基+10%FBS+lmg/mL潮霉素B。
(2)细胞复苏与传代培养
在细胞超净台中准备干烤的试管,加入8-10mL基础培养基;从液氮罐取岀冻存的 CHO-FLP-IN细胞,37°C水浴快速解冻,用ImL移液枪加入到试管中,1200rpm离心 4min,接种于100mm2细胞培养皿中,置于37°C, 5% CO2恒温细胞培养箱静止培养, 待细胞长至90%左右汇片率,弃掉上清培养基,用0.9%生理盐水洗细胞,并用0.25% 胰酶消化细胞,待细胞脱落用基础培养基终止,1200rpm离心4min,按照1 : 3传至培 养皿中,观察细胞状态和增殖情况。
(3)PD-1分子库转染
将处于对数生长期的细胞以1.0x107个/皿的细胞接种于150mm2的细胞培养皿中, 贴壁12h后弃去原培养基,换为新鲜培养基;配置如下转染体系:
A液:每皿30|Lig混合质粒(目的质粒:POG44=1 : 9)加入0.5mL Jet prime转染buffer 中,充分混匀;
B液:90|biLjet prime转染试剂加入0.5mL jet prime转染buffer中,充分混匀。
将A液与B液混匀室温条件静置lOmin,加入到150mm2细胞培养皿;转然后4-6h 撤去原培养基,换新鲜转染用培养基,48h后将基础培养基更换为筛选培养基进行加压 筛选。每隔72h换液1次,待细胞在显微镜下形成“花环状”克隆斑点即为阳性克隆,加 压筛选7・10天后,生理盐水洗细胞,并用胰酶将细胞消化下来用于抗原标记和流式分 选。
1.2.3流式分选
(1)抗原标记
胰酶消化PD-1细胞库,1200rpm离心4mim使用无菌FACS洗液洗涤细胞1次, 弹匀细胞,FACS洗液重悬细胞,用细胞计数板计数,FACS洗液调整细胞密度值IX 10& 个/mL,细胞使用PD-Ll-Biotin蛋白(三轮分选抗原浓度依次为10|ig/mL> 5|ig/mL> 2pig/mL)进行标记,4°C避光反应0.5h; 一抗反应结束后使用无菌FACS洗液洗涤细胞 1次,以1 : 4000稀释Streptavidin-APC二抗,标记细胞,4°C避光反应0.5h。二抗反应 结束后,使用无菌FACS洗液洗涤细胞2次,重悬细胞,取2X107个细胞重悬至2mL 的FACS洗液中,等待上机分选。
(2)流式分选
利用流式细胞分选仪进行分选,根据荧光标记的结果圈出阳性克隆细胞群进行分 选,每轮分选后1200rpm离心4min,用加压筛选培养基重悬分选阳性细胞,置于细胞 培养箱培养;待细胞融片率达80-90%,按照1.2.2方法进行传代,待细胞总数达到2-3xlO7 个,按照上述方法,进行第2轮、3轮分选。
1.2.4阳性克隆基因组提取
使用胰酶消化第3轮分选细胞,重悬计数,收获3x106个细胞,6000rpm离心弃去 上清;用 200|liL PBS 重悬细胞,加入 20)liL protease or proteinase 再加入 200pL 的 buffer AL, 涡旋15s混匀;56°C水浴lOmim瞬间离心,把受热凝集在盖上的液体富集到管底;加 入 200)llL 酒精,脉冲涡旋 15s;加入 minispin column, 8000rpm 离心 lmin;加入 500|nL AW1, 8000rpm离心lmin,弃去滤液;加入500yLAW2, 14000rpm离心3min,弃去滤 液;14000rpm 空离 1 min,晾干;加入 200)liL AE,室温放置 lmin; 8000rpm 离心 lmin, 离心管中即为第3轮分选后阳性细胞基因组。
1.2.5基因组PCR扩增
(1) PCR反应条件
以基因组为模板,进行PCR扩增,反应体系为50)liLo
模板 ]pL
引物Ku・F 1(1L
引物Ku・R 1(1L
水 22)iL
2xTaq PCR Mix 25(iL
反应条件:95 °C 5min预变性,95 °C 30s变性,62°C 30s退火,72°C 2min延伸,28个 循环,72°C10min, 4 °C holdo
(2) PCR特异性引物信息
Ku-F: TGTCTAGAGAATTGGGCTAGC
Ku-R: TGGTGCTAGCGCTGCTCACTGTCACC
1.2.6 PCR扩增目的片段并克隆入PFRT-KIgGl/Fc载体
(1)片段、载体酶切
PCR反应获得特异性目的片段,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,用Qiagen DNA 纯化试剂盒回收目的基因(操作步骤见试剂盒说明书),将回收目的片段与 PFRT-KIgGl/Fc载体均用Nhel和Xhol进行酶切,酶切体系如下表,置于37°C培养箱 酶切6ho
Nhe I 1|1L
Xho I 1(1L
Cutsmart Buffer 5pL
回收PCR片段 10(iL
水 33yL
Nhe I 1(1L
Xho I 1(1L
Cutsmart Buffer 5|liL
PFRT-KIgGl/Fc 载体 2pL
水 41pL
(2)片段、载体琼脂糖凝胶电泳和胶回收
详细描述参考《分子克隆试验指南》第四版
(3)片段载体连接
按照如下体系配置lOpiL连接反应体系,高速离心机瞬时离心并放置于室温条件连 接2-4ho以不加目的DNA片段的反应作为自连对照。
回收 PFRT-KIgGl/Fc 载体 0.5pL
回收目的基因 4)liL
2xT4 buffer 5pL
T4连接酶 0.5|liL

(4)连接产物转化
转化实验操作参照《分子克隆实验指南》第四版。取lOOpiLTOPlO感受态加入到 10(iL连接产物中,冰浴30 min后,42 °C热击90s,将混合液迅速置于冰上3-5 min,加 入750(iL无抗性2YT培养基,将混合后菌液放置于37°C恒温摇床振荡培养45-60 min 后,将菌液以5000rpm离心lmim并将沉淀涂布于含AMP抗性的2YT固体培养基上, 37°C孵箱倒置培养过夜。阴性对照实验步骤同上,第二天观察菌板上菌落状态,若阴性 对照有少量菌落或无菌落生长则将连接产物菌板送测序。
(5)测序鉴定及序列分析
挑取120个克隆进行测序,序列分析同1.2.1中PD-1分子库建库质量控制,初步按 照序列同源性对序列进行归类分析,并从中挑选出具有代表性的序列进行功能验证。
1.2.7突变体克隆瞬时转染
(1)培养基配制
基础培养基:DMEM培养基+10%FBSo
表达培养基:293GTE与CF1116按9: 1比例混合。
(2) PD-1突变体细胞转染
将处于对数生长期的293T细胞以5x105个/孔接种于6孔板中培养,贴壁12h后, 用生理盐水洗细胞,换新鲜基础培养基;细胞融片率70%即可进行转染,转染体系为:
A液:2|Lig质粒加入lOOpiL转染buffer涡旋混匀。
B液:4(iLJet prime转染试剂加入100(iL转染buffer,涡旋混匀。
将A、B液混匀后室温条件放置10 min后,一一对应地加入到6孔板中,转染6h 换回基础培养基;贴壁培养12h后,观察细胞,待细胞融片率95%以上,弃去原培养基, 换为表达培养基。72h后观察细胞状态,收集上清用于下一步实验。
1.2.8双夹心ELISA法检测瞬时表达上清表达量
包被液稀释GAH-IgG抗体至2(ig/mL,按照每孔100(iL加入对应的酶联板中,将酶 联板放入湿盒置于4°C冰箱过夜。洗板机清洗酶联板3次,1.5%酪蛋白封闭,每孔200piL, 酶联板置于37°C封闭lho用PBS稀释标准品至0.5pig/mL,在此基础上进行2倍稀释获 得个浓度梯度,同时用PBS稀释样品至5倍、125倍。将标准品与样品按照lOOpiL/每孔 加入对应的酶联板中,37°C反应lh, PBST清洗酶联板3次,加入羊抗人酶标二抗室温 反应45min, PBST清洗酶联板4次,加入lOOpiLTMB底物显色,室温反应3min并用 100(iL2N H2SO4终止反应,酶标仪450nm读数。以标准品浓度LN值为横坐标,相应的 OD值为纵坐标,绘制一条标准曲线并添加线性回归曲线及其相关系数R? (R2>0.95), 并用y=kx+b直线方程计算样品中抗体浓度。
1.2.9 ELISA法检测表达上清结合活性
使用包被液分别稀释PD-L1 His, PD-L2 His至终浓度l|ig/mL, 100(iL每孔加入酶 联板中,放置于湿盒中4°C过夜;使用PBST清洗酶联板3次,1.5%酪蛋白封闭,每孔 200(iL,放置于湿盒37°C温箱lh。PBST清洗酶联板3次,尽量在吸水纸上拍干孔内残 留液滴;将转染后收集的6孔板上清按每孔lOOpiL分别加入到上述两个酶联板中,每个 样本设两个复孔,放置于湿盒37°C温箱反应lh;反应结束后PBST清洗酶联板3次, 尽量拍净酶联板中残留液滴,每孔加入预先稀释好(1:3000)的羊抗人(GAH-HRP)酶 标二抗100yL,室温反应30 min反应结束后使用PBST清洗酶联板4次并加入100(iL/ 孔TMB底物显色,反应3 min,用100此/孔2N H2SO4终止反应,酶联免疫检测仪OD 450nm读数;以PD-1突变体克隆号为横坐标,相对应的OD450nm值为纵坐标,做柱状
图分析。
1.2.10表位竞争ELISA实验
(1)PD-1突变体竞争PD-1/Fc与PD-Ll-biotin相互作用
使用包被液稀释PD-1/Fc至终浓度l|ig/mL, 100(iL每孔加入酶联板中,放置于湿盒 4°C孵育过夜;使用PBST清洗3次,清洗完尽量在吸水纸上拍干孔内残留液滴;每孔 加入1.5%酪蛋白200(iL,放置于37°C温箱,封闭lh。使用PBST清洗3次,清洗完尽 量在吸水纸上拍干孔内残留液滴;
在对应的上清样品中加入PD-Ll-biotin至1.87昭/mL,,每孔100|iL,放置于湿盒 37°C温箱反应lh;用PBST清洗3次,清洗完尽量在吸水纸上拍干孔内残留液滴;二抗 使用 Peroxidase-Labeled Streptavidin (1:4000 稀释使用),每孔加入 100pL, 37°C温箱反 应30 min; PBST清洗3次,清洗完尽量在吸水纸上拍干孔内残留液滴;加入TMB 100(iL/ 孔,室温避光显色2-5 min。待颜色变化适度时,加入2NH2SO4 100(iL/孔终止反应。用 酶标仪检测各孔OD450nm值。
(2)PD-1突变体竞争PD-L/Fc与PD-1-biotin相互作用
使用包被液稀释PD-Ll/Fc至终浓度1 pig/mL, 100(iL每孔加入酶联板中,放置于湿 盒4°C孵育过夜;使用PBST清洗3次,清洗完尽量在吸水纸上拍干孔内残留液滴;每 孔加入1.5%酪蛋白200(iL,放置于37°C温箱,封闭lh。使用PBST清洗3次,清洗完 尽量在吸水纸上拍干孔内残留液滴;在对应的上清样品中加入PD-Ll-biotin至7.5yg/mL, 每孔lOOpiL,放置于湿盒37°C温箱反应lh;用PBST清洗3次,清洗完尽量在吸水纸上 拍干孔内残留液滴;二抗使用Peroxidase-Labeled Streptavidin (1:4000稀释使用),每 孔加入lOOpiL, 37°C温箱反应30 min; PBST清洗3次,清洗完尽量在吸水纸上拍干孔 内残留液滴;加入TMB 100(117孔,室温避光显色2-5 mino待颜色变化适度时,加入2N H2SO4 lOOpiL/孔终止反应。酶标仪检测各孔OD450nm值。
1.2.11PD-1突变体质粒转化和大提
(1)候选PD・1突变体转化与细菌扩大培养
转化方法同127,取干烤过的螺旋管加入5mL含有氨茉抗性(1:1000)的2YT液 体培养基,用灭菌透明枪尖挑取2YT固体培养基上的单个菌落,接种到培养基中。将 接种过的螺旋管置于3代、220rpm的恒温摇床上培养6-8h,使菌液浊度大于0.5麦氏 单位;然后按照1:1000的比例将菌浊液接入到200H1L2YT液体氨节抗性培养基摇床同 样条件培养12-16h, 8000rpm离心lOmin,收集菌液沉淀。准备大提质粒。
(2)候选PD・1突变体大提质粒
加入8mLPl (加入RNase A)到菌液沉淀中,居U烈涡旋振荡2min,充分悬浮沉淀; 加入8mlLP2,轻柔地翻转6・8次,充分裂解菌体,室温条件静置5mim力口入8mLP4, 轻柔地翻转6・8次,溶液中出现白色分散絮状沉淀,室温静置10-15min, 8000rpm离心 20min,将液体用CS1过滤柱过滤收集;向滤液里加入7mL异丙醇,温和上下颠倒混匀; 向吸附柱CP6加入2.5mL平衡液BL,放入收集管,8000rpm离心2min,弃去废液,加 入滤液,8000rpm离心2min,直至滤液全部滤过;加入10mL的漂洗液PW漂洗吸附柱 CP6, 8000rpm离心2min,弃去废液。重复漂洗2次;加入3mL无水乙醇到吸附柱CP6 放入收集管,8000rpm离心2min,弃去废液;吸附柱CP6放入收集管,8000rpm离心5min, 去除残留液体;将吸附柱CP6置于新的收集管中晾干,向吸附膜中央加入lmL洗脱缓 冲液TB,静置5min, 8000rpm离心2min,收集管底的洗脱液到高压灭菌的1.5mL EP 管中,上机测定质粒浓度,・20°C保存。
1.2.12PD-1突变体Fc融合蛋白表达
(1)CHO-S细胞复苏与传代
37°C水浴锅中快速复苏CHO-S细胞,1200rpm离心4min,按照5xl05个/mL密度 重悬于SFM培养基中,按照重悬体积接种至合适的细胞摇瓶中(一般细胞终体积为摇 瓶体积的1/4-1/5左右),置于37°C、5%CO2> 125rpm细胞摇床上扩培。待细胞密度达 到3x106个/mL-6xlO6个/mL,进行传代培养。待细胞转态稳定且细胞总数达到预期转染 数量时,调整细胞密度为3xl06个/mL接种于100 mLExpi CHO Expression Medium培养 基中,放置于37°C、5%CO2> 125rpm细胞摇床上培养。次日细胞计数,待细胞密度达 到6"()6个/ mL时进行转染。
(2)瞬时转染
A液:200昭 质粒中加入7.4mLSFM培养基总体积约8 mL
B液:640(iL转染试剂中加入7.4 mL SFM培养基总体积约8 mL
将A液与B液混合,涡旋振荡,室温放置3-5 min后加入至培养瓶内;转染后18-22h, 向培养瓶内加入48 mL Feed以及1.2mL Enhancer; 7天后对细胞进行计数,直到细胞活 率降至60%以下,8000 rpm离心30 min回收上清;使用0.45ym滤膜过滤收集上清至高 压灭菌瓶中等待纯化,取出200|iL上清做双夹心ELISA测定浓度,方法见127,计算 可纯化突变体Fc融合蛋白总量。
1.2.13PD-1突变体Fc融合蛋白纯化及定量
打开AKTAprime plus蛋白纯化仪,连接蛋白纯化软件;使用灭菌注射用水冲洗机 器管路20-30min;使用Wash2缓冲液(pH=7.7、0.5mol/L磷酸盐溶液)冲洗15min;安 装HiTrap MabSelect SuRe蛋白亲和柱O.lmol NaOH冲洗5min,去除杂质 Wash2缓冲液 冲洗30min, UV值回到基线,将收集的CHO-S细胞表达上清上样;上样结束后,用 Wash2缓冲液平衡UV值到基线,流穿液中检测不到其他的杂蛋白时,准备洗脱;用 O.lmol乙酸洗脱目的蛋白,待UV值开始升高时,收集流穿液到离心管中,将收集的流 穿液用lmol/LTris-HCl (PH=9.0)快速调节pH值到6.5・7.5,待UV值重新回到基线位 置,停止收集;加入lxPBS补齐15mL体积,用30kDa超滤管超滤,4°C低温7900rpm 离心30mino弃去废液,再次加入lxPBS补齐15mL体积置换,同条件下再次离心2・3 次,充分置换,以保证蛋白活性;将超滤管收集到的蛋白用0.22pim滤膜除菌过滤,使 用BCA法蛋白定量,计算蛋白浓度后,分装到EP管中,・70°C保存。
1.2.14ELISA法测定PD-1突变体Fc融合蛋白与PD-LK PD-L2结合 活性
使用包被液稀释PD-L1 His, PD-L2 His至1憾/mL, 100(iL每孔加入酶联板中,放 置于湿盒中4°C过夜;洗板机清洗酶联板3次,清洗完尽量在吸水纸上拍干孔内残留液 滴。用1.5%酪蛋白封闭酶联板,每孔加入200(iL,放置于湿盒37°C温箱封闭lh。洗板 机清洗酶联板3次;将突变体蛋白用lxPBS稀释到15pig/mL,并按3倍倍比稀释获得8 个浓度点,分别为 15yg/mL、5|big/mL> 1.67yg/mL、0.55yg/mL、0.18|big/mL> 0.06|Lig/mL> 0.02(ig/mL> 0.007pig/mLo将其分别加入到上述两个酶联板中,每孔100(iL,每个浓度 点设两个复孔,37°C培养箱反应lh;反应结束后清洗酶联板3次,清洗完尽量在吸水纸 上拍干孔内残留液滴,每孔加入预先稀释的(1:3000)羊抗人酶标二抗lOOpiL, 37°C温 箱反应30 min反应结束后清洗酶联板4次并加入100|iL/孔TMB底物显色,反应1-3 min, 加入lOOpiL/孔2NH2SO4终止反应,酶联免疫检测仪OD450nm读数;利用Prism5分析 软件以样品浓度LN值为横坐标,相应的OD值为纵坐标,模拟四参数方程拟合曲线, 方程为y=(A-D)/(l+(X/C)AB)+D,其中B代表斜率,C代表EC50,计算EC50值。
1.2.15PD-1突变体Fc融合蛋白亲和力测定
打开电脑和BiacoreTlOO的开关,30-60min温度稳定后,系统指示灯停止闪烁;打 开Biacore控制软件,连接操作系统。量取450mL去离子水加入50mL10xHPS-EP缓冲 液混匀加入到缓冲液瓶中,放置于左侧托架上,右侧托架缓冲液瓶加入去离子水,清洗 进样针,连接好废液瓶;选择Tools-Prime命令,开始使用缓冲液以高流速清洗仪器, 5・8min后关闭。将PD-1/Fc突变体偶联到CM5芯片上,信将PD-LI His、PD-L2 His梯 度稀释至浓度为3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100nM,以单循环模式开始测试,测试后 用3M Regeneration solution再生芯片,配体与受体接触时间为180s,解离时间600s,再 生时间30s;将原始数据导入分析软件,扣除参比通道以消除容积效应,用动力学方法分 析,得到结合常数kon和解离常数Koff并绘制动力学曲线。
2 •实验结果
2.1PD-1突变体分子库的构建和聚类分析
经过overlap PCR成功构建PD・1突变体分子库,从DNA琼脂糖电泳图(图2.1A) 可以直观看到,分子库大小约为615bp,与理论大小一致;为了进一步验证分子库的质 量,挑取96个克隆进行测序,对测序结果进行分析,其中有22个克隆发生了移码突变, 2个克隆产生终止密码,3个克隆发生缺失突变,最终71个克隆测序正确,即分子库构 建成功率为71%o利用多序列比对对序列的多样性和每个突变位点氨基酸出现频率进行 可视化分析,结果显示,71个克隆在进化树上序列具有一定同源性,但是不存在相同序 列的克隆(如图2.1B),表明PD・1分子库具有丰富的多样性。同时所有的突变均发生 在理论位点,且突变的氨基酸均为理论设计的氨基酸,每一种氨基酸实际出现的频率与 理论频率大致一样(如图2.10提示PD・1突变体分子库构建基本成功。

DS™ 5000 kuldeiv
l 城剛州 13R-8«ZCM 0.01772
D¥1®1-AAU6fl-lb4< 13R.E_EO7 D 01222
PD-1_WT_ 0.01533
DY 1995-AA1360-lib-M13R-88.A08 0.01461
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图2.1 PD-1分子库构建和质量控制
A. PD・1分子库DNA片段电泳B测序正确克隆多序列比对
C.测序正确克隆突变位点氨基酸出现频率分析
2.2哺乳动物细胞抗体库的构建与分选
按照1. 2. 2方法构建PD-1突变体细胞库,利用流式分选仪对细胞库进行三轮分选, 筛选过程中采用依次降低PD-L1浓度的策略,使得强阳性克隆得到更好的富集,每轮筛 选圈定10%-25%比例的阳性克隆细胞群作为分选目标细胞群,如图2. 2所示,第一轮分 选时PD-1突变体细胞库阳性率仅为14. 3%,而在第二轮和第三轮分选时可以明显看到, 细胞结合PD-L1的能力明显增强,表现为细胞团明显向右偏移,表明每轮筛选中强阳性 克隆得到很好富集。
PD-Ll/Biotin 汁 Strep t a vidin-APC

图2.2 PD-1突变体细胞库三轮分选
2.3PD-1突变体Fc融合蛋白表达载体构建及测序分析
按照1.2.6方法将第三轮分选的目的基因构建至PFRT-KIgGl/Fc载体,挑取120个 克隆进行测序分析,多序列比对分析结果显示,有33套完全不一样的序列,进一步依 照序列同源性挑选出16套具有代表性的候选序列,并对序列突变位点进行可视化分析, 可见大部分突变位点在体外进化过程中产生了一定的偏向性(图2.3),提示PD-1分子在
体外亲和力成熟过程中有一定的偏好性和选择性。

2.4PD-1候选突变体瞬时表达上清表达量测足
瞬时表达16套候选序列并进行表达量测定,结果显示,候选分子均能够分泌到表 达上清中,表达量约为1 pig/mL-50pig/mL (图2.4),表明所有PD・1突变体均能够实现 Fc融合表达。
PD-1突变体上清表达量检测
图2.4 PD-1突变体瞬时表达上清表达量测定
2.5PD-1候选突变体上清与PD-L1/PD-L2结合活性
按照129方法评价PD-1突变体细胞表达上清与PD-LK PD-L2结合活性,结果女口 图2.5所示,与野生型PD・1分子相比,大部分候选分子与PD-LK PD-L2结合活性明 显增强,其中9个突变体蛋白的上清(克隆410、446、407、463、408、431、411、576、 506)与PD-LK PD-L2均有较强的结合能力,OD450nm值均大于2; 549、432、465、 491突变体与PD-L1> PD-L2结合能力一般,OD450nm值在1・2之间;406、507、573 突变体 OD450nm 值在 0.5 以下,最终选择 410、446、407、463、408、431、411、576、 506共9个克隆进行进一步评价。

2.6PD-1突变体融合蛋白的表位确证
为了进一步对PD・1突变体蛋白的表位进行确证,按照1.2.10描述的竞争ELISA方 法评价410、446等9个突变体能否有效竞争野生型PD-l/PD-LK PD-1/PD-L2的相互作 用。图2.6A显示了 PD・1突变体竞争PD-1-Biotin与PD・L 1的结合,463, 506, 408稀 释125倍后仍然具有较高的抑制率,463为56.7%, 506为59.5%, 408为57.6%。图2.6B 显示PD-1突变体竞争PD-1-Biotin与PD-L2的相互作用,显示上述9个突变体均具有良 好的抑制功能。
A
PD-Ll/PD-l-BIOTIN (5ng/mL)

PD-L2/PD-1-Biotin (5pg/mL)

■上清原倍 ■上清5倍稀释 ■上清25倍稀释 ■上清丄25倍稀释
图2.6 PD-1突变体瞬时表达上清竞争野生型PD-1与PD-L1、PD-L2的结合
A PD-1突变体竞争野生型PD-1与PD-L1的结合;
B PD-1突变体竞争野生型PD-1与PD-L2的结合

2.7PD-1突变体融合蛋白的规模化表达与纯化
为了进一步评价PD・1突变体融合蛋白活性,按照1211、1.2.12> 1.2.13方法表达 制备PD・1突变体融合蛋白,利用Protein A纯化柱进行蛋白的亲和纯化,纯化的蛋白用 BCA法测定蛋白浓度。图2.7A是某特定突变体蛋白纯化流穿峰和洗脱峰,经过洗脱下 来的蛋白通过超滤将洗脱液置换成PBS溶液,并利用BCA测定蛋白浓度,图2.7B是根 据标准品浓度和吸光值拟合的线性方程,将未超标线的待测样品吸光值代入公式,计算 出X值,同时乘以稀释倍数即为蛋白的真实浓度。经过计算纯化蛋白的浓度见表2.1。
A

图2.7APD-1突变体蛋白纯化流穿和洗脱峰 B蛋白浓度定量
表2.1 PD-1突变体纯化蛋白浓度统计
蛋白编号 408 431 407 410 446 411 463 506 576
蛋白浓度(mg/mL) 1.3 2.5 3.3 1.3 1.9 2.6 3.4 4.4 5
体积(mL) 6 4 6 5 6 4 2.8 3 2
蛋白总量(mg) 7.8 10 19.8 6.5 11.4 10.4 9.52 13.2 10

2.8PD-1突变体融合蛋白的结合能力测定
禾U用间接ELISA的方法测定9种PD-1突变体Fc融合蛋白与固相载体上PD・L1/His、 PD・L2/His蛋白的结合能力(方法见1.2.14)。其中,上市抗PD・L1抗体atezolizumab 作为本实验中的阳性对照。结果显示,所有PD・1突变体均能够特异性识别PD-Ll/His 以及PD-L2/His,且结合活性明显高于野生型PD・1分子。图2.8A为与PD-Ll/His结合 结果,463与阳性对照抗体PD-Ll-Ab的半数结合剂量分别为0.013(ig/mL> 0.137(ig/mL, 证明突变体463具有较好的结合能力。图2.8 B中,463与PD-L2依然有较好的结合活 性,EC50值为0.068ug/mLo可以看出463分子具有良好的PD-LK PD-L2结合活性。
A

图2.8 PD-1突变体结合活性检测
A PD-1突变体与PD-L1的结合活性测定 B PD-1突变体与PD-L2的结合活性测定
2.9突变体融合蛋白亲和力测定结果
为了确定PD・1突变体蛋白与PD・1配体的亲和力,利用BiacoreTlOO仪器进行检测。 表2.9为突变体与PD-L1及PD-L2相互作用的结合与解离曲线,根据拟合曲线计算结合 常数ka (1/Ms)和解离常数kd (1/s),并通过解离常数与结合常数的比值获得亲和力常数 KDo所有PD・1突变体的亲和力大小见表2.2。从结果可以看出,只有463分子活性最 好,与PD-L1及PD-L2结合的亲和力均达到10'9Mo其次是506,同样也具有较高的亲 和力;大部分突变体的亲和力超过了 10-8M。但是大部分突变体解离速率也较快,只有 463分子与PD-L1分子作用的解离速率在合理的范围内。

图2.9 PD-1突变体结合PD-L1、PD-L2的亲和力测定
A PD-1突变体结合PD-L1亲和力测定拟合曲线;
B PD-1突变体结合PD-L2亲和力测定拟合曲线

表2.2 突变体畝和力测定结果
待测样品编号 抗原 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
408 PDLl-his 9.84E+07 5.72E-01 5.81E-09
410 PDLl-his 1.08E+05 1.37E-01 1.28E-06
446 PDLl-his 5.05E+06 1.78E-01 3.53E-08
463 PDLl-his 9.99E+05 2.06E-03 2.06E-09
506 PDLl-his 4.25E+09 2.36E+01 5.54E-09
408 PDL2-his 3.40E+06 9.07E-02 2.67E-08
410 PDL2-his 3.47E+10 4.24E+02 1.22E-08
446 PDL2-his 2.31E+06 2.07E-02 8.96E-09
463 PDL2-his 2.80E+06 1.95E-02 6.95E-09
506 PDL2-his 7.70E+06 1.28E-01 1.66E-08

3 •讨论
本部分工作基于论文第一部分所设计的PD-1虚拟库蛋白序列,构建PD-1分子库和 细胞库,并利用流式细胞术进行分选,富集强阳性克隆,最终获得一系列高亲和力的 PD・1突变体。初步结果显示,系列突变体与PD-L1及PD-L2结合能力均有明显提高, 且突变体识别表位与野生型PD-1/PD-L1作用区域高度重叠,突变体上清在不同浓度下 均能够很好的竞争野生型PD-1/PD-Llo为了进一步评价蛋白的活性,通过CHOS瞬时 表达系统规模化制备一批PD・1突变体蛋白,利用Protein A亲和纯化柱小量制备了蛋白。 结合活性和亲和力检测结果显示大部分突变体均具有增强的结合活性。其中463分子与 PD-L1, PD-L2亲和力较母本分子均提高了三个数量级,且能够有效竞争PD・1与其配 体的相互作用,具有一定的开发价值。因此论文第三部分将会围绕463候选分子开展体 内、外生物学活性评价。计算机设计虚拟库将可能的突变位点和可替换的氨基酸进行有 目的地分析和优化,为了实现计算机模拟设计的虚拟库,本论文通过设计突变位点的兼 并引物,有目的性的囊括所有理论设计的可能性,并通过overlap PCR方法将序列进行 拼接,最终获得全长PD・1分子库序列。在实际操作过程中可能会存在以下几种问题:
1.PCR扩增和重叠PCR过程中会引入或者缺失部分碱基序列,导致最终翻译的蛋白出现 移码突变、缺失突变,或者翻译提前终止;2.兼并引物设计过程中会人为引入非理论氨 基酸序列,或者引物终止密码子,在引物设计过程中尽量避开终止密码的出现,同时尽 可能少的出现非理论氨基酸,以免造成对库质量的影响。因此,在构建分子库的过程中 分子库的质控显得尤为重要,决定着后续产品的优劣。本论文在成功构建分子库后,随 机挑取了 96个克隆进行测序,对测序结果进行了详细的分析,在24个错误序列中,有 超过22个序列发生了移码突变,因此在PCR过程中基因的复制和扩增也存在一定的错 误率,如果控制不好很容易造成错误序列过多导致后续操作问题;另一个影响分子库较 为重要的因素是库容量问题。在本论文的分子库构建过程中,利用生物信息学的方法对 测序正确的71个克隆序列进行序列多样性分析,结果表明,71个序列具有71种序列多 样性,虽然没有进行大规模的克隆测序,但是随机取样的测序结果显示,分子库中的多 样性丰富,能够满足下一步的实验需求。同理,在PCR扩增过程中,每个突变位点氨 基酸出现的频率应该大致随机分布,从理论频率来计算,每种氨基酸出现的频率应该就 是兼并密码中某氨基酸出现的频率,从分子库中每个突变位点的氨基酸出现频率来看基 本属于平均分布,没有明显偏向性。而进行三轮分选之后,候选序列的突变位点上氨基 酸出现频率发生了比较大的变化,某些氨基酸在某些位点出现的频率开始变大,表明某 些氨基酸在体外进化过程中具有一定的选择性。
本论文另一个亮点就是利用实验室已有的哺乳动物细胞定点表达系统来进行细胞 库的构建和后续筛选。该系统利用“定点整合''的原理实现单个细胞只表达单个PD・1突 变分子,方便后续的的筛选和功能验证。先前实验室曾利用哺乳动物细胞抗体库进行抗 体的体外进化和功能改造,为了拓展哺乳动物细胞库的应用范围,本论文提出利用哺乳 动物细胞库进行蛋白大分子的体外进化,从而获得生物学功能增强的Fc融合蛋白。
4•小结
1.成功构建了表位定向突变的PD-1突变体分子库。
2.成功利用流式细胞术对PD-1哺乳动物细胞库进行3轮分也 筛选出16组代表序 列。
3.通过序列比对,ELISA实验和亲和力测定,最终筛选出一株候选分子463。
第三部分PD-1高亲和力突变体463生物学活性评价
初步的体外活性实验提示463为功能优良的候选分子o本部分工作拟评价463体内、 外生物学活性,即通过间接ELISA评价结合活性,利用竞争ELISA,流式竞争实验验 证表位信息,利用淋巴细胞活化实验和PD-1转基因小鼠荷瘤模型分别验证463的体外 细胞学功能和体内疗效。实验过程中设置上市的PD-L1抗体Atezolizumab作为阳性对 照药物,天然PD・1分子作为母本对照。
1 •材料与方法
1.1材料
主要试剂 厂家名称
Nhel酶、Xho I酶等内切酶和对应的酶切
Buffer Biolabs 公司
Optimum Growth 500 ml Flask THOMSON 公司
Expi CHO Expression Medium 培 养基、 DMEM-F12培养基、DMEM培养基、澳洲胎 牛血清(FBS)、CHO-S表达系统、RPMI1640 培养基、胰酶 Gibco公司
Jet prime转染试剂及buffer Polyplus transfection 公司
293 TGE, CF1116 百普赛斯生物科技有限公司
DNA 胶回收试剂盒,QIAmap DNA mini kit Qiagen公司
无内毒素质粒提取试剂盒 天根生物公司
潮霉素B 罗氏
羊抗人 IgG, GAH-IgG-HRP Biolegend 公司
DNA琼脂糖粉 Sigma公司
Mouse-PD-Ll> PD-Ll-His> PD-L2-His 蛋白 义翘神州生物公司
TMB 显色液、zeocin Invitrogen 公司
Peroxidase-Labeled Streptavidin-APC KPL公司
人淋巴细胞分离液 天津市潭洋生物制品公司
Opdivo、Atezolizumab 百克灵生物公司
CD3和CD28抗体 天厂实生物技术公司
Human inferferon-gamma(IFN-y ) Elisa Maxtm Delute Set 达科为生物公司
羊抗人(FabO 2抗体 Abacm公司
BCA蛋白定量试剂盒 Thermo公司
8%多聚甲醛组织固定液 solarbio 公司
主要设备和仪器:

主要设备和仪器 厂家及产地
15mL离心管、50mL离心管、lOOmm?细胞培 养皿、150mm2细胞培养皿 Corning,美国
二氧化碳培养箱,恒温二氧化碳细胞培养箱, 酶标仪 Thermo, 美国
常温高速台式离心机Eppendorf5417D, PCR 扩增仪 EppendorfAG22331 Eppendorf ,德国
流式细胞仪BD FACS Calibur BD,美国
DNA电泳仪 Bio-red,美国
涡旋振荡器,液氮罐 Thermo,德国
恒温水浴锅 长风,中国
蛋白纯化仪 AKTA prime plus, 美 国
XZ-1型真空泵 黄岩,中国
生物超净工作台 北京伟达,中国
游标卡尺 宁波智琳,中国
常用细胞:CHO-K1-PD-L1由北京军事医学研究院免疫学研究室抗体组保存,MC38 (mPD-Ll knock out;hPD-Ll knock in)购买于南方模式生物公司。
实验动物:周龄人PD・1转基因小鼠30只,C57BL/6j,SPF级,购买于上海南方 模式生物公司,许可证号SCXK (沪)2014-0002o
1.2方法
1.2.1蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
用自来水和清洗剂将配胶玻璃板清洗干净,使用双蒸水清洗两遍,置于试管架上自 然晾干。将玻璃板水平对齐安装在专用的玻璃夹中,注意下缘整齐平整,防止漏胶。按 照实验室的SDS-PAGE配方表进行配胶,加入双蒸水、30%丙烯酰胺、10%SDS、pH=8.8 1.5M Tris・HCl,最后加入AP和TMEDM,边加边快速混匀。将分离胶溶液小心加入到玻璃 板的缝隙中,液面高度距离顶部2cm处,停止加液,用lmL异丙醇缓慢加入液封,保 持分离胶上层平整。室温条件静置30min后,待分离胶与异丙醇之间有明显的界限,开 始配置浓缩胶,在试管中依次加入双蒸水、30%丙烯酰胺、10%SDS、pH=6.8 lMTris-HCk AP、TMEDM,边加边快速混匀。倒掉异丙醇并用吸水纸吸取残留,将浓缩胶液体沿着 玻璃板边缘快速加入(过程中要避免气泡的产生),将洁净的10孔1.5mm梳子小心插 到浓缩胶中,室温条件静置30mim凝固后取出,固定于电泳槽中,小心取下梳子,准 备上样。用1 XPBS稀释抗体至50|Lig/mL9加入适量的SDS上样buffer,在非还原样品中 不加B ■毓基乙醇和任何还原剂,还原样品中加入含B蹴基乙醇的5Xloading buffer,用 来还原链间二硫键ol00°C水浴加热3min,使蛋白变性。在电泳槽中加入10(iL样品,15mA 恒流电泳。蛋白在凝胶电泳分离后用考马斯亮蓝染液进行染色,室温30min-lh,并在脱 色液中旋转脱色30-60min,条带清晰后进行凝胶扫描。
1.2.2间接ELISA法检测463结合活性
使用包被液稀释h-PD-Ll至终浓度l|ig/mL, lOOpiL每孔加入酶联板中,放置于4°C 湿盒过夜。PBST清洗酶联板3次,尽量甩干孔内残留液体,使用1.5%酪蛋白封闭,每 孔加入200(iL, 37°C温箱反应lh。使用PBS稀释463、PD-lwt> Atezolizumab至起始浓 度均为15pig/mL,3倍倍比稀释12个浓度梯度作为一抗,设置2个复孔,每孔加入100(iL, 37°C温箱反应lhoPBST清洗3次,甩干孔内残留液体。每孔加入lOOpiL预先稀释(1:3000) 的GAH-HRP酶标二抗,37°C为温箱反应30minoPBST清洗酶联板3次,每孔加入lOOpiL TMB显色液,反应l-3min,加入2N H2SO4 100(iL/孔终止反应,酶联免疫检测仪450nm 读取OD值。
包被液稀释h-PD-L2至终浓度lyg/mL, PBS稀释463, PD-lwt至15(ig/mL作为起 始浓度,3倍倍比稀释12个浓度梯度作为一抗,其他实验条件同上。
包被液稀释m-PD-Ll至终浓度l|ig/mL, PBS稀释463, PD-lwt至15(ig/mL作为起 始浓度,3倍倍比稀释12个浓度梯度作为一抗,其他实验条件同上。
1.2.3流式检测463结合膜表面PD-L1活性
CHO-K1-PD-L1细胞是本室采用稳定转染的方法将PD-L1转染到CHO-K1细胞构 建的稳定株,培养用基础培养基为:DMEM-F12培养基加10%FBS加0.2(ig/mL MSXo 复苏该细胞,传代扩增,观察细胞状态。胰酶消化细胞,用细胞计数板计数,以3X105 个/管,设置裸细胞和二抗对照,共准备17个样本。FACS洗液洗涤细胞1次,7200rpm 离心lmin,弃去洗液,弹匀底部细胞。使用PBS稀释463、Atezolizumab> PD-lwt至 40^g/mL,并4倍倍比稀释5个浓度梯度,100(iL/管加入相对应的样本中,裸细胞和二 抗分别加入1 OOpiLPBS,全部样本4°C避光反应0.5ho反应结束后,FACS洗液洗涤细
胞2次,弃去洗液,弹匀底部细胞。裸细胞加入1 OOpiLPBS,其他样本每管加入20(iL anti-human PD-1 PE二抗,全部样本4°C避光反应0.5h。使用FACS洗液洗涤细胞2次, 弃去洗液,弹匀细胞,每管加入300(iLl%多聚甲醛固定,待上机检测。
1.2.4 竞争 ELISA 检测 463 阻断 PD-1/PD-L1 xPD-1 /PD-L2 xPD-L1 /CD80 抑制信号轴
1.2.4.1463 阻断 PD-1/PD-L1
包被液稀释PD-1/his至1 pig/mL,每孔lOOfiL加入酶联反应板中,放置于湿盒4°C过夜。 PBST清洗3次,每孔加入200(iL1.5%酪蛋白,放置于湿盒37°C封闭lh。使用PBS稀 释PD-L1-biotin至1.25|iig/mL,以此溶液为母液分别稀释463、Opdivo、PD-lwt,起始 浓度均为150|Lig/mL?2倍倍比稀释共获得12个浓度梯度作为一抗,每孔lOOpiL加入到酶 联反应板中,放置于湿盒37°C反应lho PBST清洗3遍,稀释Peroxidase-Labeled Streptavidin (1:4000),每孔加入100pL,放置于湿盒37°C反应0.5h。清洗3次酶联板 并加入TMB显色液显色,反应3min后用2N H2SO4终止反应,450nm读数,以OD值 为纵坐标,抗体浓度为横坐标绘制曲线,计算每个抗体的半数抑制效率。
1.2.4.2463 阻断 PD-1/PD-L2
同样条件包被PD-L2/his,使用PBS稀释PD-1-biotin至1.25(ig/mL作为母液稀释463、 Opdivo、PD-lwt,方法和条件同上。
1.2.4.3463 阻断 CD80/PD-L1
同样条件包被CD80,使用PBS稀释PD-L1-biotin至5(ig/mL作为母液稀释463、410、
411、PD-lwt,方法和条件同 1.2.4.1o
1.2.5流式检测463阻断PD-1与膜表达PD-L1结合活性
复苏CHO・K1・PD・L1细胞,传代扩增后,胰酶消化细胞,计数,以3X105个/管, 准备22个样本。使用FACS洗液洗涤细胞1次,7200rpm离心lmin,弃去洗液,弹匀 底部细胞。将 463、PD-1/Fc> Atezolizumab> Opdivo 用 PD・l・biotin (5yg/mL)稀释至 160pig/mL,4倍倍比稀释获得5个浓度点,分别为160|ig/mL> 40|ig/mL> 10|ig/mL、 2.5pg/mL、0.625昭/mL,以每管100(iL加入到相对应的样本中;做裸细胞和二抗对照, 每个加入1 OOfiLPBSo全部样本4°C避光反应0.5ho反应结束后,FACS洗液洗涤2遍, 7200rpm离心lmin,真空泵吸去洗液,弹匀细胞;除裸细胞(加lOOpiLPBS)夕卜,每管 加入5(iL Antihuman-PD-1 APC,吸打混匀,4°C避光反应0.5h。FACS洗液清洗2遍, 7200rpm离心lmin,弃去洗液,弹匀管底细胞,每管加入300(iLl%多聚甲醛,用ImL 加样枪吸打吹匀细胞,加入到流式管中,避光保存于4°C冰箱,待上机检测。
1.2.6人外周单个核细胞的活性实验
1.2.6.1PBMC 的分离:
抽取1名健康志愿者10-15mL新鲜血液,加入等体积的生理盐水稀释。在15mL离 心管中加入5mL人外周血淋巴细胞分离液垂直静置lmin,然后缓慢地沿管壁加入已稀 释的血液,使血液和分离液形成两层,2000rpm 22°C离心20min,升降速均按最小值设 定。离心后液体分为四层,从上而下依次为血浆层、白膜层、透明分离液层、红细胞层。 用移液管吸取血浆层,用200piL加样枪轻轻吸取白膜层细胞。准备15mL离心管加入 10mL生理盐水,将吸出的细胞加入到生理盐水中,1500rpm离心lOmin,重复2次。 用RPMI 1640培养基重悬细胞,计数,以lx"个接种到100mm细胞培养皿中,每2 天半换液一次,培养1周。收集细胞以每孔1x105个接种于96孔板,每孔加50(iL培养 基,将终浓度为0.8(ig/mL的CD3和CD28混合液以每孔25piL加入到对应的孔中, RPMI1640 培养基稀释抗体获得 40(ig/mL> 10(ig/mL> 2.5卩g/mL、0.625(ig/mL 加入对应 的体系,培养72h,收取上清并用人IFN-yELISA检测盒检测IFN-y的表达情况。
1.2.6.2IFN・y的 ELISA 检测:
将Cytokine standard稀释后按lOOyL/孔加入到标准品孑L。样品按每孔100此加入到样 品孔,空白孔加入Dilution buffer□每孔50yL加入Biotinylated antibody工作液,混匀后 密圭寸室温孵育2小时。扣去孔内的液体,每孔加300)liL1xwashing buffer,充分洗涤lmin 后弃去洗液,尽量在吸水纸上拍干孔内残留液滴,重复洗涤3次。每孔加入 100(iLStreptavidin-HRP,密封室温孵育20mino扣去孔内的液体,每孔加3 00(iL lx washing buffer,充分洗涤lmin后弃去洗液,尽量在吸水纸上拍干孔内残留液滴,重复洗涤3次。 每孔加入1 OOpiLTMB,室温条件下显色10-20min,根据孔内颜色的深浅判定终止,每 孔lOOyL加入Stop solution终止反应。酶标仪450nm读取OD值。
1.2.7PD-1转基因小鼠荷瘤模型的建立与治疗
复苏 MC38 (mPD-Ll knock out;hPD-Ll knock in)细胞,使用 DMEM (加 10%FBS、 双抗、0.2%卩票吟霉素)培养基培养扩增。购买30只6・8周龄人PD・1转基因雌性小鼠 C57BL/6j,SPF级,放置于动物房饲养观察一周,每笼5只。观察小鼠精神状态,有无脱 毛等情况,记录体重。胰酶消化MC38-hPD-Ll细胞,DMEM培养基吸打吹下细胞, 1200rpm离心4min,弃去培养基,生理盐水洗涤2遍,1200rpm离心4min后使用10mL 生理盐水重悬细胞,计数,显微镜下加入台盼蓝,观察MC38细胞活率大于99%,调整 细胞密度为IX IO?个/niL,每只小鼠200piL接种在小鼠的腹股沟部位。注射时,上下颠 倒混匀细胞,皮下注射要求不托针、不补针。当日记为第0天。连续观察8・10天,观 察肿瘤生长情况和小鼠体重变化。用脱毛膏脱去肿瘤皮肤处的鼠毛,使用游标卡尺测量 肿瘤的长径、短径;电子天平称量并记录小鼠体重变化。瘤体积公式为:瘤体积(mmJ =瘤长径(mm) X瘤短径2 (mm2) X0.52;待肿瘤体积大约80-100mm3时,为小鼠打 耳号。拇指和食指抓起小鼠头颈部皮肤,小拇指压住小鼠尾巴,使用专用的耳号钳将耳 号打在小鼠的右耳根部,使其不易脱落。
将成瘤的小鼠按耳号随机分组,共分5组,每组5只。其中突变体463设置高低2 个剂量组:463 2mg/kg 组、463 10mg/kg 组。Atezolizumab 10mg/kg 组为阳性对照组、 PD-1 10mg/kg组为母本对照组、MIL50 10mg/kg组为无关对照组,小鼠平均体重约20g, 计算平均给药剂量,使用PBS稀释药物到分组浓度。每周治疗2次,每只小鼠腹腔注射 给药200(iL,每周测量肿瘤的长短径,小鼠体重2次。治疗7次后,停药。观察肿瘤生 长速率,待无关对照组小鼠肿瘤体积到2000-3000mm3时,拖颈处死小鼠,剥取肿瘤, 测量其长短径,称取肿瘤重量,放置于4%多聚甲醛固定。将测量数据整理,以测量时 间点为横坐标,以肿瘤的体积为纵坐标,做肿瘤生长折线图,计算每组小鼠肿瘤的平均 体积和方差。利用统计学方法对终末阶段小鼠肿瘤大小和剥离后肿瘤重量进行统计分 析。

2 •实验结果
2.1突变体463的SDS-PAGE电泳分析
将纯化后的突变体463以及野生型PD-1/Fc融合蛋白进行还原和非还原处理并进行 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(图3.1),结果显示纯化后蛋白纯度达到95%O在非还原的 条件下,150KDa处有特异性主条带,分子量大小与IgG —致。150KDa以上出现两条 较细的条带,推测是蛋白多聚体形式。在还原条件下,二硫键打开,463被还原为两个 接近60KDa的条带。由于463氨基酸一级序列理论预测分子量为78KDa,明显小于实 测分子量,推测PD・1分子自身存在较为复杂的翻译后修饰类型。
非还原 还原
1: PD-1毗非还原 2: 463非还原 3:PD-1 wt非还原 4: 463非还原
图3.1 463 SDS凝胶电泳图
2.2PD-1 463的结合功能鉴定
2.2.1PD-1 463 特异性识别 h PD-Ll/h PD-L2
按照122方法评价463与人PD-LK PD-L2结合活性。与PD-L1结合实验中,设 置Atezolizumab为阳性对照,PD・1天然分子为母本对照,通过四参数方程拟合曲线计 算半数结合剂量(EC50), Atezolizumab的半数结合剂量为0.063pg/mL,463为0.031|big/mL, 野生型PD-1分子为2.571(ig/mL,表明463结合活性与上市抗体具有一定可比性(图3.2 A),比野生型PD-1结合明显增强;同时,463与PD-L2的结合如图3.2 B所示,ECso
值为0.63(ig/mL,而野生型PD・1的ECso为76.60(ig/mL,显示与野生型PD-1分子相比, 463的结合活性明显提高。
值得一提的是,人PD・1基因和小鼠的PD・1基因在氨基酸序列上具有60%的相似性, 原则上人PD・1与鼠PD-L1结合较弱,因此考虑鉴定463与鼠PD-L1的结合是否明显增 强。通过包被鼠PD-L1分子进行ELISA检测,验证463的结合活性,结果如图3.2 C所 示,与野生型PD・1分子相比(EC5o>15昭/mL) , 463与鼠PD-L1结合的EC50值为 0.491(ig/mL,二者差距明显。
A

463 Binding with Mouse PD-L1

图3. 2 PD-1 463的结合功能鉴定
A.PD-1突变体463与人PD-L1 ELISA活性实验;B. PD-1突变体463与人PD-L2 ELISA活性实验;
C.PD-1突变体463与鼠PD-L1结合活性实验。
2.2.2463特异性识别细胞膜PD-L1分子
利用实验室构建的PD-L1高表达稳定株(CHO-K1-PD-L1),按照124方法检测 463与膜表达PD-L1分子的结合。实验结果如图3.3显示,463分子能够特异性识别膜 表面PD-L1分子,且在较低剂量下结合仍然较强,与阳性对照atezolizumab类似,结合 活性较野生型PD・1明显提高。

图3.3流式检测PD-1突变体463、atezolizumab以及PD-1 wt分子与CHO-K1-PD-L1结合活性
2.2.3463 特异性阻断 PD-1/PD-L1、PD・1/PD・L2、PD-L1/CD80 抑制信 号轴
上市抗PD-1抗体主要是通过阻断PD-l/PD-LK PD-1/PD-L2发挥功能,而抗PD-L1 抗体主要阻断PD-l/PD-LK PD-L1/CD80从而发挥功能。因此研究463对上述蛋白分子 相互作用阻断效应具有较大的意义。按照124方法进行相应的竞争ELISA实验,结果 显示,与已经上市的抗PD・1或者抗PD-L1抗体不同,463能够同时有效阻断上述三个 信号通路。尤其是在竞争PD-1/PD-L1方面(图3.4A),与阳性抗体药物opdivo相比, 463的半数有效抑制浓度(IC50)值为0.45pig/mL,阳性抗体药物Opdivo的IC50值为 0.907(ig/mL,而野生型PD・1分子IC50值大于100(ig/mL,显示463的阻断活性较母本有 明显提高。
A B C

图3.4突变体PD-1 463 Opdivo与PD-L1 biotin竞争结果
A.PD-1突变体463阻断PD-1/PD-L1的结合;B. PD-1突变体463阻断PD-L2/PD-1的结合;C.PD-1
突变体463阻断CD80/PD-L1的结合
2.2.4 463特异性阻断PD-1-biotin与细胞膜PD-L1结合活性
为了进一步验证463特异性阻断PD-1/PD-L1结合功能活性,实验室前期构建了细 胞表面高表达PD-L1的稳定细胞株CHO-K1-PD-L1,并利用细胞表面竞争结合的方法验 证高亲和突变体的竞争结合活性。前期实验结果证实PD-1-biotin浓度为5pig/mL时可以 饱和结合CHO-K1-PD-L1细胞表面的PD-L1,选择5(ig/mL PD-1-biotin进行试验。梯度 稀释 463、Atezolizumab、Opdivo 或 PD-1 wt 蛋白(浓度为 160yg/mL、40yg/mL、lOyg/mL、 2.5pg/mL、0.625pig/mL),与细胞孵育,绘制4种蛋白与PD-1-biotin竞争结合细胞表面 PD-L1的反应曲线。结果如图3.5所示,蛋白浓度大于2.5pig/mL时,463和抗PD-L1阳 性抗体Atezolizumab可明显阻断细胞表面PD-L1和PD-1的结合,阻断率约为98.44%、
97.00%[阻断率公式为(1 ■样本gate值/阳性对照gate值)X 100%]。野生型PD-1的阻断率 约为1.26%,抗PD-1抗体Opdivo的阻断率约为5.95%O当蛋白浓度小于2.5憾/mL时, 463和Atezolizumab的阻断率为89.32%、7&84%,而PD・1野生型和Opdivo几乎不显
示阻断活性。

图3.5 PD-1突变体463特异性阻断PD-1-biotin与细胞膜PD-L1结合活性
2.3PD-1突变体463体外激活PBMC活性
研究发现,T细胞活化需要接受两个信号,TCR-CD3复合物识别APC表面抗原肽 -MHC复合物传递第一信号;T细胞表面的CD28分子与APC表面的B7分子结合传递 第二信号。本实验利用CD3和CD28抗体共刺激活化T细胞,活化的T细胞上调PD-1 分子表达水平,与PD-L1相互作用,激活负调节作用,避免过度免疫反应。抗CD3和 抗CD28共刺激T细胞,T细胞激活,活化的T细胞上调PD・1分子表达水平,IFN・y表 达上调,而加入PD-L1后抑制T细胞活化,IFN・y分泌量下降。图3.6结果显示,存在

PD-L1情况下,加入梯度463分子能够有效逆转免疫抑制状态,且具有良好的剂量依赖 性,与上市抗体opdivo相比具有相近效果。而野生型PD・1分子不能有效逆转免疫抑制 活性。提示改造后的463分子具有良好的细胞活性。
CD3/28
CD3/28+PD-L1
CD3/28+PD-L1+opdivo
CD3/28+PD-L1+PD-1 463
CD3/28+PD-L1+PD-1
图3. 6 PD-1突变体463体外激活PBMC活性
2.4463在转基因小鼠中抑瘤活性
由于人、鼠PD-1/PD-L1不存在交叉,因此本研究利用人PD・1转基因小鼠构建 MC38(hPD-Ll)皮下荷瘤模型,具体方法参见127。与无关抗体组相比,463 10mg/kg 治疗组抑瘤率约为72%, 2mg/kg治疗组抑瘤率为43%,阳性对照Atezolizumab 10mg/kg 组抑瘤率为77%,野生型PD-1 10mg/kg组抑瘤率为14% (图3.7A),表明与野生型 PD・1蛋白相比,463抑瘤效果明显增强,尤其是在2mg/kg低剂量情况下抑瘤效果要优 于10mg/kg高剂量野生型PD-1,而在高剂量情况下,463与阳性对照抗体Atezolizumab 具有相近的抑瘤活性。在整个治疗过程中,通过对小鼠体重进行监测,图3.7B显示荷 瘤小鼠在整个治疗过程中体重的变化,可以看出在整个治疗过程中小鼠体重基本保持不 变,表明药物不具备明显的安全性问题。为了进一步分析候选分子463的治疗效果。将 小鼠肿瘤进行离体剥离并对其肿瘤重量进行测量,图3.7C显示各组小鼠肿瘤的平均体 重分布,利用Student t统计分析比对463高、低剂量组分别与别的组进行统计分析, 结果显示463高剂量组(10mg/kg)与野生型PD・1高剂量组(10mg/kg)比较,P=0.045 (PV0.05),具有明显的统计学差异;463高剂量组(10mg/kg)与无关抗体MIL50组 (10mg/kg)比较,P=0.039 (PV0.05),具有明显的统计学差异;表明463分子具有明 显的抑瘤效果,且明显强于野生型PD・1分子。图3.7D是对各组剥离的肿瘤进行拍照,
从拍照的结果也能看出候选分子463具有明显的抑瘤效果。
A
0 5 10 15 20
Days post administration
〔9 ALImae4>诵 now

1 ・辛.
•壬・
3 2 1
(6) Jll^wuolunl

(A.小鼠肿瘤生长曲线;B.小鼠体重随时间变化情况;C.治疗终末剥离肿瘤体重;D.治疗终末
剥离肿瘤拍照

3 •讨论
PD・1分子是重要的免疫负性调控分子,它是CD28超家族成员,通常表达在活化的 CD4+T、CD8+T、NK和B以及单核巨噬细胞表面。PD・1分子与其配体PD-L1> PD-L2 相互作用可以下调细胞活性,维持细胞免疫稳态。在肿瘤微环境中,肿瘤细胞高表达 PD-L1,与浸润其中的T细胞表面的PD・1分子结合,激活PIK3-AKT-mTOR通路使T 细胞丧失对肿瘤细胞的免疫杀伤活性,实现肿瘤细胞的免疫逃逸。上市抗体欧狄沃 (opdivo)、可瑞达(keytruda)均是通过特异性阻断PD-1/PD-L1信号轴进而增强免疫细 胞识别和杀伤的功能。本实验室基于计算机辅助分子设计和哺乳动物细胞抗体库技术筛 选获得了一株具有潜在利用价值的高亲和力PD-1 Fc融合蛋白463o
在本部分工作中,我们对筛选得到的463融合蛋白进行了体内外的生物学活性评价, 结果显示463能够特异性结合PD-L1/PD-L2,结合活性较野生型PD・1分子提高了约1000 倍。竞争ELISA结果显示其阻断活性较母本提高了约668倍;体外PBMC活性实验中, PBMC细胞中的T淋巴细胞在CD3和CD28双信号刺激下被激活,加入PD-L1蛋白后 T淋巴细胞的活性被抑制,而加入463可以有效逆转PD-L1对T淋巴细胞的抑制效应, 并具有良好的剂量依赖性;转基因小鼠荷瘤治疗中为明确463的体内药效活性,我们引 入了上市抗体Atezolizumab作为阳性对照。实验表明,463高剂量组和阳性抗体药物组 与其他组小鼠在肿瘤体积和质量方面具有明显的统计学差异,与上市药物Atezolizumab 相比,463具有相似的抑瘤活性,能够有效阻断PD-1/PD-L1信号轴,恢复T淋巴细胞 功能,发挥良好的肿瘤杀伤效应,463保持了较为一致的体内外生物学活性,以上结果 证明了 463具有良好的应用前景,从目前的数据能够看出高亲和力PD-1 Fc融合蛋白具 有良好的生物学活性,有望成为下一代PD-1/PD-L1拮抗剂。
4•小结
1.通过CHO-S表达系统得到PD-1突变体463Fc融合蛋白纯品,体外实验显示,463 可以特异性识别人PD-Ll/PD-L2o
2.463可以阻断PD-1与其配体PD-L1> PD-L2之间的相互作用。
3.463具有良好的激活T淋巴细胞活性的功能,促进IFN-Y表达上调。
4.463在转基因荷瘤小鼠体内治疗实验中,与阳性抗体药物Atezolizumab有 相似的抑瘤活性。
全文总结
本研究基于已建立的表位定向哺乳动物细胞抗体库技术平台,结合计算机辅助分子 设计技术,以PD・1分子为靶点,利用分子生物学和细胞生物学方法构建了 PD・1分子突 变体库,通过流式高通量筛选和功能确证得到高亲和力候选分子463,并将其克隆入 PFRT-KIgGl/Fc载体,探索了具有开发潜能的Fc融合蛋白药物的优化策略,建立了能 够快速、高效筛选获得拮抗型Fc融合蛋白药物的细胞库技术,并对463・Fc融合蛋白进 行了体内、外生物学评价。
1.PD-1高亲和突变体库的设计和构建
利用计算机辅助设计平台,对PD-1/PD-L1进行空间结构模拟,确定相互作用关键 区域,借助表位信息进行计算机辅助下的PD・1分子库设计,设计兼并引物并合成突变 体分子库,将分子突变体库克隆到膜展示载体,随机挑选96个克隆测序分析,结果显 示分子库成功率为71%,符合质量控制要求,可以用于后续细胞库的构建。将PD・1突 变体库质粒稳定转染至CHO-FLP-IN细胞,加压筛选获得哺乳动物细胞PD-1细胞库。
2.PD-1高亲和突变分子的筛选和候选分子的初步鉴定
使用流式分选技术富集阳性高亲和力蛋白的表达细胞,三轮筛选获得强阳性细胞 群,提取基因组,设计特异性引物,PCR扩增获得目的基因。将目的基因克隆至实验室 已有载体PFRT-KIgGl/Fc,进过连接,转化,对阳性克隆测序,获得9株候选分子序列。 通过CHO-S表达获得目的融合蛋白,通过ELISA、亲和力测定筛选出最优候选分子463 o
3.高亲和PD-1突变体463的生物学活性评价
通过结合ELISA和竞争ELISA测定463的结合能力,其较野生型PD-1分子的结合 活性提高了约1000倍,阻断活性提高了约668倍。463分子能够有效逆转免疫抑制状态, 且具有良好的剂量依赖性。转基因小鼠荷瘤治疗实验中,463高剂量组与阳性抗体药物 Atezolizumab有相似的抑瘤效果,低剂量组优于野生型PD-1高剂量组。
受体亲和力低是阻碍受体作为拮抗剂成药的关键因素之一,因此受体体外进化显得 尤为重要。从氨基酸序列预测,高亲和力PD・1分子仅有14KDa,能够更好的浸润到肿 瘤局部,但是如果单纯做成单一的分子药物会存在半衰期短,体内代谢快等缺点,因此 本论文是对候选分子进行Fc融合,一方面保持候选分子高效的生物学活性,同时保留 Fc 的 ADCC、CDC、FcRn 等功能。
结合到临床应用,目前CAR-T在实体瘤有效性低,一方面的原因是CAR-T进入到 肿瘤微环境会面临着很对免疫抑制因子的调节,从而让具有抗癌活性的CAR-T细胞失 能。为了更好地解决这个问题,如果能够在CAR-T载体上设计T2A的连接多肽,将 CAR-T原件和高亲和PD-1 463分子进行串联,一方面能够将T细胞带到肿瘤部位,同 时通过分泌高亲和力463分子从而解除肿瘤微环境中的PD-1/PD-L1抑制信号通路,实 现一石二鸟的效果。而且,相比较抗体而言,463分子量小能够更好地渗透到肿瘤内部, 更好地发挥抗癌效果。
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综述
重组Fc融合蛋白药物研究现状
摘要:重组Fc融合蛋白是指利用基因工程技术,将具有生物学活性的多肽或功能 性蛋白结构域与抗体Fc片段融合而产生的新型结构蛋白。其不仅保留了天然蛋白分子 的生物学活性,还具有抗体的一些特性。如通过Fc结构域与新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor;FcRn)结合延长药物在人体的半衰期,或者增强或减弱抗体依赖细胞介导细胞 毒效应(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity;ADCC )、补体依赖细胞毒效应 (complement dependent cytotoxicity;CDC )。重组Fc融合蛋白的上述特性决定了其具 有广阔的应用前景。本文将对重组Fc融合蛋白独特的结构特征、临床应用价值和研发 现状进行综述。
关键词:Fc融合蛋白,单克隆抗体,FcRn, ADCC, CDC
自上世纪60年代起,针对各种疾病的抗体药物研发引起了科学工作者们的广泛关 注。从最初的免疫动物获得多克隆血清,到后来兴起的杂交瘤单克隆抗体技术,抗体技 术研发获得了巨大的进步;然而,到20世纪末期抗体研发才真正取得了跨越式的进步, 基因工程技术的兴起及成熟对抗体的研发及抗体工程的推进提供了便利的条件,通过抗 体工程合成的抗体药物已经广泛的应用到基因诊断、免疫防御及治疗和科学研究中。进 入21世纪在基因工程及抗体工程技术的帮助下,一大批治疗性单克隆抗体及重组性融 合蛋白生物制药成果已广泛应用于相关疾病的治疗,并且这些工程抗体及融合蛋白成果 对于未来诸如肿瘤、流行性疾病等的预防及治疗发挥举足轻重的作用2】。
当今社会,生物医药产业是全球新一轮科技产业变革中创新、创业最为密集、投资 最为活跃的领域。其中,单克隆抗体及抗体类融合蛋白药物由于具有靶向性强、特异性 高和副作用低等特点,己经成为药物研发的重点。2018年全球药品销售排行榜前10位, 抗体类药物占据了 8个品种(包括2个Fc融合蛋白药物),具有绝对的统领地位。治 疗性抗体药物应用领域主要涵盖了:肿瘤、自身免疫病、感染性疾病、心血管疾病、抗 移植排斥、骨质疏松、眼科用药、生物安全防控等。近年来,我国抗体/抗体融合蛋白产 业蓬勃发展,进步迅速,但无论是靶点的原创性、新抗体发现和功能优化还是下游的规 模化生产与国外相比有一定的差距,目前仍然以仿制药为主。抗体/抗体融合蛋白如何创 新是我们面临的巨大挑战⑷。同时,国外上市并用于临床治疗的抗体类药物多数未进入 国内市场;然而,即使抗体类药物进入国内市场,因为价格昂贵,医保覆盖率低,使得 大部分中国患者不能得到及时有效的治疗,给国人的生命健康带来了极大的威胁。因此, 安全性稳定及价格合理的国产治疗性单克隆抗体、抗体类融合蛋白药物的研发,已经成 为当下我国亟待解决的问题。
1.Fc融合蛋白的结构与功能特点
Fc融合蛋白是指利用基因工程技术,将天然的具有生物学活性的多肽或功能性蛋白 结构域与抗体Fc片段融合表达而生成的新型结构蛋白。结构上,Fc融合蛋白是将功能 性蛋白(如受体、细胞因子、酶、模拟多肽等活性物质)融合到IgG的N端,替换掉抗 体轻、重链可变区、CHI、CL结构,形成功能性蛋白■柔性较链区-CH2-CH3同源二价 分子®6】;功能上,Fc融合蛋白中功能蛋白可以特异性结合靶抗原,激活或者阻断下游 的生物学效应。Fc结构具有FcyRs及补体Clq结合位点,保留了抗体药物ADCC、ADCP、 CDC等免疫杀伤活性,同时稳定的二聚体结构以及FcRn位点可以有效延长药物半衰期 并提高药物稳定性,从而提高功能性蛋白的成药性祸。由于Fc融合蛋白在结构、功能、 表达体系、纯化工艺和药理学与抗体药物类似,因此也被称做抗体类药物[9]。
2.Fc融合蛋白的市场前景及临床研发现状
Fc融合蛋白作为全新的生物大分子药物具有广阔的应用前景。截至到2017年3月, 全球已有12个Fc融合蛋白获得FDA批准上市,主要用于治疗肿瘤及自身免疫性疾病 ZU]。2018年全球药品销售排行榜中有两个Fc融合蛋白药物跻身前十名,分别为依那 西普(Etanercept ,第7名,71.26亿美兀)和阿柏西普(Abatacept,第10名,58.39亿美 元)。从已上市的融合蛋白靶点来看,大部分Fc融合蛋白中功能性蛋白分子来源于内 源性受体(配体)(表1)。如以天然受体作为拮抗性分子(TNFR2-IgGl Fc,VEGFRl/2-IgGl Fc,CTLA-4-IgGl Fc,LFA3・IgGl Fc ) [12,13,14,15,23,24]或某些激动型分子(GLP亠IgG4 Fc,EPO-IgGl Fc?rFactorVIII-IgGl Fc,rFactor IV-IgGl Fc) MSl。目前,3 个 Fc 融合蛋 白药物处于III期临床研究,23个Fc融合蛋白药物处于早期临床研究阶段问。

表1 Fc融合蛋白上市药物概览表
商品名称 药物名称 靶点/活性分子 适应症
Amevive Alefacept (阿法赛特) CD2 , LFA-3 Psoriasis (银屑病)
Orencia Abatacept (阿巴西普) CD80/CD86, CTLA-4
刺激物,CD28抑制剂 RA (类风湿性关节
炎)
Nulojix Belatacept (贝拉西普) CD80/CD86 Transplant rejection
(移植排斥反应)
Arcalyst Rilonacept (利纳西
普) IL-1 R CAPS cryopyrin (相关
周期综合征)
Enbrel Etanercept (依那西
普) TNF- a RA(类风湿性关节炎)
Nplate Romiplostim (罗米司
亭) 促血小板生成药物二 代 C-MPLCTP O 受体)
激动剂 TCP(血小板减少症),
UC(溃疡性结肠炎);
Eylea Afliberceprt 邙可波西
普) VEGF-A配体抑制 剂,胎盘生长因子抑 制剂 wAMD新生血管性
(湿性)年龄相关性
黄斑变性
Blincyto Binatumomab CD3激动剂 淋巴细胞瘤
Trulicity DulaglutideC 杜拉鲁肽) GLP-1激动剂 2型糖尿病
Alprolix Eftrenonacog alfa 凝血因子IX-Fc融合
蛋白 B型血友病
Eloctate Efmoroctocog alfa 凝血因子VIII-Fc融
合蛋白 A型血友病
Strensiq Asfotase alfa TNSALP-Fc融合的
蛋白 低磷酸酶血症
3.Fc融合蛋白与抗体的比较
尽管Fc融合蛋白药物在研发投入和获批品种方面不及单抗药物,但是其在结构设
计上的多样化以及在生物学机制上的差异性,有望成为单抗药物的有力补充。相比于单 抗药物,Fc融合蛋白具有以下四点优势:1.功能性分子通常是完全人源的天然结构,与 人免疫球蛋白Fc进行融合后具有较弱的免疫原性,而通过鼠源杂交瘤获得治疗性抗体 具有较强的免疫原性,即使经过抗体人源化在人体内仍然可能产生一定程度的免疫原 性。2.在作用机制上,大部分阻断型抗体药物通常以空间位阻的结合方式阻断受体■配体 的功能,抗体功能强弱与其识别表位产生空间位阻的能力及亲和力大小密切相关。而融 合蛋白是天然的受体■配体相互竞争,结构完全重叠理论上具有更强的阻断效应。而且, 对于一些结构复杂、免疫原性弱、亲和力高的受体■配体分子,抗体药物开发难度大, 功能性的受体拮抗分子则成为治疗疾病的首选分子。3.融合蛋白中功能性蛋白来源范围 广,作用机制多样,通常一个受体(配体)分子对应一个或多个配体(受体)分子。如 上市融合蛋白药物依那西普,其功能性蛋白TNFR2/p75能够同时靶向TNF・a,TNF■卩两 个配体。与TNF-a相同的是,TNF-P同样介导免疫反应,所以阻断TNF■卩通路也有缓解 炎症的作用a》。]。4.融合蛋白将多个功能性蛋白分子串联,达到双功能或多功能靶向的 优势。如上市融合蛋白阿柏西普核心功能区域由VEGFR1中免疫球蛋白样区域2和 VEGFR2中免疫球蛋白样区域3组成,能够有效阻断VEGF-A9VEGF-B,PIGFo上市后药 物在有效性和安全性均头对头打败同类竞品雷珠单抗(靶向VEGF-A的Fab抗体片段) 0],而且由于阿柏西普较雷珠单抗在亲和力及作用机制的差别,药物的使用剂量更少, 频次更低。
4.讨论
虽然融合蛋白在以上方面较抗体药物具有差异化优势,但是不可否认融合蛋白药物 开发同样也存在一些瓶颈。目前,Fc融合蛋白药物研发的重点是基于受体设计拮抗型药 物用以阻断天然受体■配体相互作用。通常,受体的生物学活性、理化性质的优化是Fc 融合蛋白研发中的关键环节,如亲和力、稳定性、溶解度、结构异质性、药代动力学性 质等。其中,受体■配体的亲和力直接决定着药物的生物学活性,是受体分子成药性的 关键因素。而一些具有良好成药性的天然受体■配体亲和力较低,限制了其作为拮抗分 子成药性的可能。因此,针对这类受体的改造是今后Fc融合蛋白重要的研究方向。 治疗性抗体及抗体类药物的相关研究表明,以体内蛋白(如细胞因子、受体)为靶点药 物开发通常可以有多种研发思路。如单克隆抗体、多肽以及受体Fc融合蛋白等。随着 生物信息学、结构生物学、计算生物学的发展,基于受体■配体的作用模式和特殊的生 物学机制能够更好的实现受体(配体)Fc融合蛋白药物的设计。其一方面保留或者增强 了功能性蛋白的活性,同时也具有抗体Fc的多重特性,并通过调整Fc的活性满足临床 实际需求Ma]。FC融合蛋白作为抗体的衍生物,凭借其独特的结构基础和作用机制在临 床上具有广阔的应用前景。
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致谢
时光荏苒,岁月如梭,三年的研究生学习生涯即将接近尾声,回首这三年的时光, 我深有感触,受益良多。在这段人生最宝贵的学习时光中,我有幸遇到帮助我不断成长 的师长,鼓励我进步的同门。在实验室的大家庭中,我感受到家的温暖,也体味了科研 生活的美好,在毕业即将来临之际,我谨以我最真诚的谢意,感谢三年来一直关心、支 持和帮助我的所有人,谢谢你们的一路陪伴!
首先感谢我的导师,马远方教授。感谢您提供了到军事医学研究院毒物药物研究所 学习的宝贵机会。感谢您在这几年在学习和生活方面给予的建议和帮助。您严谨认真的 科研态度;求真务实,精益求精的工作作风,深刻地影响了我,您是我一直要努力学习 的榜样!
衷心地感谢我的联合导师,冯健男研究员。感谢您在课题设计和论文撰写等方面给 予的指导。在北京学习期间,您在学习和生活方面都给予了莫大的支持和帮助,感谢您 对我的教诲和鞭策!由衷地感谢我的指导老师,罗龙龙老师。自从来到实验室,罗老师 手把手地教,耐心地指导,使我学习到了很多宝贵的知识。感谢您在课题设计、实验指 导和论文撰写等方面给予我的帮助和指导,使我能够顺利地完成硕士研究生的学习。您 严谨的学术态度,开拓进取的创新精神,勤奋踏实的工作风格,对我以后的人生产生重 大影响,使我受益终生!
感谢孙英勋老师、于鸣老师、乔春霞老师、李新颖老师、王晶老师在实验方面的指 导和言传身教。感谢段艳婷师姐、刁德坤师兄、王师师兄、汪海涛师兄、吕忠霖师兄、 窦帅杰师兄、刘伟江硕士的关心与帮助,激励我不断前进。感谢王志宏师妹、胡乃静师 妹、卢星师妹、李国贤师弟在学习和生活中的无私关怀和支持。感谢我的好友,张昆鹏、 张兴昆、胡自超、贾浩、冯登峰、张宸瑜在校期间给予生活上的帮助,几年的相处,让 我们结下兄弟般的友谊。
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