阳离子脂质辅助的纳米颗粒递送肿瘤mRNA疫苗的研究论文

2020年5月9日18:01:18阳离子脂质辅助的纳米颗粒递送肿瘤mRNA疫苗的研究论文已关闭评论

阳离子脂质辅助的纳米颗粒递送肿瘤mRNA疫苗的研究论文

摘 要

肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗中的常见策略之一。递送肿瘤相关抗原进入抗原提 呈细胞,进而激活细胞免疫反应已经成为目前疫苗开发的主要目标。快速的适应 性免疫反应在此途径中至关重要,然而有效激活T细胞免疫反应通常需要一个 较长时间间隔的免疫接种。因此,缩短这一间隔时长是肿瘤疫苗发挥作用的关键 所在。抗原提呈细胞作为摄取、加工、提呈抗原进而致敏T细胞的始动者,是 肿瘤疫苗最主要的作用对象。

体外转录合成的表达特定蛋白质的信使核糖核酸(niRNA),生产周期短, 并且可以避免基于质粒或病毒整合到基因组的安全性问题,可以作为肿瘤免疫 治疗有效的激活剂,在肿瘤疫苗领域扮演着尤为重要的角色。然而,由于inRNA 极易被核酸酶降解并且难以直接进入细胞,递送mRNA疫苗至树突状细胞(DCs) 受到各种技术上的限制。利用纳米载体技术可以有效解决递送mRNA疫苗的难 题,由此发展了一系列递送mRNA疫苗的纳米载体。

本论文主要是基于阳离子脂质辅助的纳米颗粒(CLAN)递送mRNA疫苗用 于恶性肿瘤治疗的研究。研究结果显示CLAN包载的编码肿瘤模式抗原(TAA) mRNA在体内外均可以有效地刺激DCs的成熟,进而诱导抗原特异性的CTLs的 活化和增殖。尾静脉注射包载编码卵清蛋白(OVA) mRNA的CLAN至小鼠体 内,可以激活机体高强度的0%特异性肿瘤杀伤T细胞应答,并且在高转移的 E.G7-0VA淋巴瘤模型中有效减缓肿瘤生长。因此,基于CLAN的mRNA疫苗 递送平台可以有效地引起适应性免疫反应,后续研究还可以联合不同种类的免 疫佐剂,以更有效地发挥mRNA疫苗的免疫作用。

关键词,质辅助纳肿瘤免疫治疗mRNA疫苗抗原提呈细胞适应性免疫阳离子脂 米颗粒

ABSTRACT

Tumor vaccine, as a prophylactic approach, has a broad application prospects in tumor immunotherapy. It has been a main target that delivering tumor associated antigen (TAA) into antigen processing approach and activation of antigen-specific cytotoxic T cells. But activating T cells response effectively usually requires a relatively long interval of immunization. In this therapy pathway, initiating adaptive immune responses rapidly are critical, so it can be a critical step to shorten this interval. Antigen- presenting cells (APCs) are the initiators of ingesting, processing and presenting antigens, as the main target of messenger ribonucleic acids (mRNA) vaccines.

In vitro transcribed mRNA which express specific proteins is a more promising therapeutic and vaccine approach, not only with shorter production cycles, but also avoids many of the safety issues associated with viruses in DNA-based systems, such as integration into the genome. Based on the significant advantages of mRNA, mRNA vaccines have shown potential as activators of adaptive immunity. However, mRNA is so highly susceptible to nucleases and is difficult to enter cells directly, that delivering mRNA vaccines into dendritic cells (DCs) systematically is hampered by various technical challenges. Nanoparticle combine with mRNA can remedy these disadvantages. A series of nanocaniers that deliver mRNA have thus been developed.

Here, we investigate cationic lipid-assisted nmioparticles (CLAN) as a delivery vehicle for mRNA vaccines. We found that CLAN encapsulating mRNA encoding tumor-mode antigen (TAA) can effectively stimulate the maturation of DCs and promote the activation and proliferation of antigen-specific cytotoxic T cells, both in vitro and in vivo. Intravenous injection of CLAN encoding ovalbumin (OVA) mRNA in mice can activate OVA-specific T cell responses in vivo and effectively slow down tumor growth in the invasive E.G7-0VA lymphoma model. In general, CLAN is an excellent mRNA vaccine delivery platform that can induce a efficient adaptive immune response. For further optimization, including combination with various a<yuvants5 the efficacy of vaccine may be increased.

Key Words: tumor immunotherapy, mRNA vaccine, antigen presenting cells, adaptive immunity, cationic lipid-assisted nanoparticles

第1章绪论

1.1肿瘤免疫疗法

肿瘤免疫疗法通过激活或抑制免疫反应的方式来增强固有免疫和适应性免 疫反应,用以抗衡肿瘤细胞。免疫疗法是调控机体免疫反应来抑制肿瘤生长的有 效治疗策略,正在逐渐改变肿瘤治疗的格局⑴。在肿瘤免疫的初始阶段,免疫细 胞杀死肿瘤细胞,或者肿瘤细胞发生凋亡后肿瘤碎片或肿瘤相关抗原被释放到体 液中,抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs)通过模式识别受体等识别 肿瘤碎片或肿瘤相关抗原,然后通过巨胞饮或者受体介导的内吞作用摄取抗原⑵。 抗原在APCs的胞质内被加工后提呈于细胞表面,APCs逐渐成熟并且过表达特 定的受体,包括CD80 (B7.1) > CD86 (B7.2)和CD40。同时,APCs与周围组 织的粘附降低,趋化因子受体7 (CCR7)的分泌上调,致使APCs归巢到淋巴组 织,并提供共刺激信号给未成熟的T细胞,致敏细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTLs)活化⑶。至此,效应T细胞经血液循环后到达肿瘤部位,产 生抗肿瘤的免疫反应,抑制肿瘤生长已叫 如Figure 1.1 o

因此,要彻底根除肿瘤,应增强APCs和CTLs的生物学效应并且抑制免疫 负调节细胞(如调节性T细胞)的功能⑺。通过APCs向T细胞提供更多的肿瘤 相关抗原来重新激活机体免疫反应可以作为干预免疫系统的有效策略,随着这一 系列免疫反应的持续,机体可以获得抑制肿瘤生长甚至消灭肿瘤的免疫能力[叭 许多研究表明可以通过策略性调节一个或多个免疫反应阶段来抑制肿瘤生长【9〕, 其中代表性的肿瘤免疫疗法包括:肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体 细胞转输等[⑼。Lymph node associated macrophage kill tumor cells [6L

1.L1肿瘤疫苗

肿瘤疫苗通常是通过肿瘤细胞或从其中提取某些成分来制备。现有肿瘤疫苗 的研究表明其不仅可以预防特定高危人群肿瘤的产生,还可以抑制已形成肿瘤的 生长。最初肿瘤疫苗主要用于预防病毒感染所诱导的肿瘤,比如己上市的预防性 疫苗,如用于乙型肝炎病毒的Engerix・B以及用于人乳头瘤病毒的Gardasilt11*12^ 近年来,研究人员和制药公司更加注重开发用于治疗性肿瘤疫苗,如Provenge是 FDA批准的前列腺癌治疗性肿瘤疫苗[⑶。

如Figure 1.2所示,肿瘤疫苗主要以肿瘤细胞裂解物、蛋白质、肽或抗原致 敏DCs的形式使用【"I,其主要作用机制是在体内诱导抗原特异性的细胞免疫反 应,以达到清除肿瘤细胞的目的,这就表明肿瘤相关抗原可能是肿瘤疫苗的一个 突破点。因此,研究人员已经对各种肿瘤相关抗原,如肿瘤相关模式抗原(TAA) 和肿瘤特异性抗原(TSA)进行了深入研究,以评估它们作为肿瘤疫苗的潜力[⑸。 由于肿瘤的异质性,每个患者可能有不同类型的肿瘤细胞群,其中一部分细胞可 能无法表达足够的抗原。因此,一个标准化的肿瘤疫苗可能不适用于具有不同抗 原的异质性肿瘤,这就表明需要设计个性化的肿瘤疫苗[⑹。近年来研究报道,肿 瘤细胞突变衍生的新抗原被用来制备新型肿瘤疫苗,由于其肿瘤抗原特征超出传 统的TAA或TSA,这类肿瘤疫苗研究得到了广泛的关注I】儿总体而言,要设计 一种理想的预防性或治疗性肿瘤疫苗,有必要开发适当的肿瘤来源的新抗原和佐 剂,使其具有足够的免疫原性来调动机体的免疫系统。

1.1.2免疫检查点
免疫检查点是调控免疫反应的抑制性分子,防止免疫系统产生过激反应而导 致正常组织的损伤。然而在肿瘤生长过程中免疫检查点却成为肿瘤对机体产生免 疫耐受的主要缘由。近年来,用于调节免疫系统功能的免疫检查点抗体已被证明 对恶性肿瘤有优越的治疗效果[叭例如,PD・1和CTLA-4单抗阻断细胞间相互 作用,从而有效地杀伤肿瘤细胞这些免疫检查点抗体已在临床上被广泛用 于治疗各种癌症。免疫检查点抑制剂虽然具有广阔的治疗潜力,但仍然存在许多 问题。首先,免疫检查点抑制剂也会干预正常组织中T细胞的功能,造成免疫系 统紊乱。其次,免疫检查点抑制剂也会导致肺、肾脏、肝脏和胰腺中产生器官特 异性的副作用〔2%例如,约5%的患者会产生免疫相关性肝炎,肝脏表达高水平 丙氨酸氨基转移酶或天冬氨酸氨基转移酶。此外,肿瘤患者对免疫检查点抑制剂 的应答率较低,大多数类型肿瘤患者应答率低于30%。研究人员通过与传统治疗 方法联合治疗,或者通过抑制多种免疫检查点来克服这一局限性阻却。

1.1.3细胞过继转输(ACT)

由于癌症患者体内的效应T细胞数量减少或功能被抑制,其免疫系统难以 抑制肿瘤的生长进程,大规模回输T细胞来杀伤肿瘤细胞可作为一种有效的免 疫治疗策略。研究人员提取患者的肿瘤杀伤T细胞,在体外扩增T细胞的数量, 将获得的淋巴细胞重新注入患者的机体来增强抗肿瘤的细胞免疫反应宙打此外, 由于转输的T细胞来自于患者本身,因此可以将其视为个性化免疫治疗方法之 一a】。临床结果证明患者使用ACT的方式,如转输嵌合抗原受体T细胞(CAR- T)等对肿瘤的进展有显著的抑制效果,并且有较低的毒副作用发生率[刃。然而, 与其他免疫治疗策略相比,ACT过程复杂,耗时较长,治疗费用昂贵

1.2肿瘤核酸疫苗

121肿瘤疫苗发挥作用的机制

在过去的几十年中,由灭活病原体或亚单位疫苗组成的传统疫苗已成功用于 抵抗传染病,其中体液免疫被认为是机体的主要防御机制,机体产生的抗体能够 中和或杀死病毒以及细菌[2刃,但是控制慢性感染类疾病需要细胞免疫的参与,例 如CTLs能直接靶向病毒感染的细胞并根除病原体感染细胞,从而彻底消灭病原 体。细胞免疫的重要性也已在肿瘤免疫疗法领域得到广泛证实。治疗性肿瘤疫苗 的目标是增强细胞免疫反应,直接杀伤肿瘤细胞,并使机体产生免疫记忆从而防 止肿瘤复发卩叭为了有效诱导CTLs的应答,源自病原体的抗原蛋白需要递送到 APCs胞质中被蛋白酶体加工成抗原肽⑶],随后,在内质网形成MHCI-肽复合物 转运至细胞表面,用于被CD8+T淋巴细胞识别。另外,有部分抗原通过交叉提 呈的方式激活CD4+T细胞[初。因此,递送肿瘤相关抗原进入抗原加工途径,激 活MHC I类限制性CTLs反应已经成为目前疫苗开发的主要目标。研究证明核 酸疫苗能够在APCs的细胞质中高效表达其编码的蛋白质,因此核酸疫苗特别适 用于产生有效的CTLs应答。核酸疫苗的研究主要集中质粒DNA和病毒载体, 然而这些“经典”策略具有应用限制性,比如插入宿主基因组的不安全性等。因此, 研究人员对mRNA疫苗的关注与日俱增。Figure 1.3所示,mRNA作为肿瘤疫苗 在体内发挥作用的机制:mRNA在非淋巴组织中被APCs摄取,在胞质内翻译成 蛋白质,随后激活APCs并致敏T细胞。

  • Sequence optimizatn

'^2/ DC maturation and migration

  • Presence of dsRNA
  • Presence of unmodified nucleosides
  • Carrier sensing

Activation of Tfh celU and GC B cells

  • Kinetics
  • Expression in DCs
  • Cytokine milieu

Figure 1.3 Considerations for effectiveness of a directly injected mRNA vaccine〔3习.

1.2.2核酸疫苗的应用前景

质粒DNA (plasmidDNA, pDNA)广泛应用于非病毒基因的递送。但是其 长期表达细菌未甲基化的CpG基序会通过激活Toll样受体9 (TLR9)引起强烈 的免疫反应从而产生致病性抗DNA抗体,以及序列易整合到宿主基因组的风险, 限制了 pDNA疫苗的临床应用[X35]O而信使RNA (messengerRNA, mRNA)不 需要质粒骨架或病毒包装蛋白质的支持,本身不具有免疫原性,引发的免疫反应 只针对编码的抗原,具有更好的安全性。此外,mRNA不需要越过细胞核屏障来 翻译蛋白质,因此能够更有效转染不分裂的体细胞或缓慢分裂细胞,如树突状细 胞(DCs)opDNA通过电穿孔、阳离子聚合物或阳离子脂质的方式仅转染1-10% 的DCSo而电转mRNA的转染效率可达到95 %以上[叭 最后,mRNA是由质粒 DNA作为模板通过噬菌体RNA聚合酶(T7, T3或S6)在体外转录合成的,生 产和纯化简易且成本相对较低mJ由此可知,将编码多功能抗原的mRNA递送 到DCs来诱导癌症患者产生抗肿瘤免疫反应是一种极具前景的肿瘤治疗策略[网。

研究表明将mRNA转染到肿瘤患者的离体DCs中,然后转输回病人体内有 效增强抗原特异性CTLs细胞免疫应答。临床试验也己显示该方法的安全性和可 行性,然而DCs的离体操作以及个性化的mRNA合成使得疫苗接种程序异常复 杂,这严重阻碍了 DCs-mRNA疫苗的广泛应用[⑼。因此,亟需发展能够直接在 体内激活APCs的新疫苗。mRNA疫苗是否能直接在体内激活细胞免疫面临以下 挑战[他:首先,编码抗原的mRNA应在被核糖核酸酶(RNase)降解前靶向APCs, 被APCs内吞,然后mRNA必须从酸性溶酶体中逃逸出来进入细胞质⑷];进入 胞质后,mRNA的结构应该足够稳定并有效地招募翻译起始元件。其次,效应T 细胞应答还需要APCs在合适的成熟状态提呈抗原。除此之外,mRNA翻译的抗 原不仅需要刺激CD8+T细胞活化,还应该诱导CD4+T细胞反应,为维持抗原 特异性CD8+ T细胞功能提供足够的辅助㈤]。解决这些问题能够使mRNA在APCs 内更高效的翻译成抗原并引起更强烈的T细胞反应。虽然mRNA疫苗可以通过 触发几种模式识别受体(PRR)来活化DCs,但DCs的活化程度充其量是适中的 ⑷〕。因此在不干扰mRNA摄取和翻译的情况下优化DCs活化程度是体内mRNA 疫苗的第二个主要障碍[创。在以下部分中,我们将对阻碍基于mRNA的疫苗广 泛应用瓶颈进行详细阐述,并讨论近几年已经取得的技术进步和仍待解决的挑战, 为开发更好的mRNA疫苗奠定基础。

1.3 mRNA肿瘤疫苗

131 mRNA体外转录技术的发展

真核细胞中的成熟mRNA由五个重要部分组成:帽结构(m7Gp3N, N代表 任意核昔酸)5,端非编码区(5PTR)、开放阅读框(ORF)、3,端非编码区 (3PTR)和尾部100-250个腺昔残基(poly(A)尾)[44]O体外转录的mRNA以 含有噬菌体启动子(例如T7, SP6或T3)的质粒DNA为模板获得,通常使用 商业化的试剂盒可获得足够量的功能性mRNAW 研究结果显示与正常加帽相 比,体外ARCA加帽的转录产物(ARCA-mRNA)具备出更高的翻译效率与稳定 性[购。Poly(A)尾与大量的多聚腺昔结合蛋白质(PABP)结合后,PABP与真核 转录起始因子4G(eIF4G)的N末端相互作用,导致真核转录起始因子4E(eIF4E) 对帽结构的亲和力增加。mRNA的亍和3,端之间的物理相互作用导致Cap-poly(A) 相互作用旳。一旦poly(A)尾部被移除或缩短至少于12个残基,mRNA将由于5? 端帽结构的裂解,被核酸外切酶从亍至歹端或3,至亍端降解。由此表明,poly(A) 尾在保持稳定性和mRNA翻译过程中起重要作用【伺。到目前为止,体外转录 mRNA技术的灵活性、稳定性等方面的细化得到了显著改善【创。

1.3.2核酸疫苗治疗肿瘤面临的障碍

mRNA作为肿瘤疫苗在体内发挥激活免疫系统的作用需要以下三个阶段: 在第一阶段,mRNA需要克服细胞外屏障(达到抗原呈现细胞),内吞障碍(进 入细胞),随后通过细胞内屏障(将mRNA释放到细胞质中);在第二阶段, mRNA翻译的蛋白质被加工提呈在APCs表面[刈;在第三阶段,抗原提呈细胞提 供必要的共刺激信号和细胞因子,以确保启动适应性免疫,诱导抗原特异性CTLs 的活化和增殖。这三个阶段构成了一个启动适应性免疫的网络t5b53]o研究人员通 过提高mRNA疫苗的稳定性和翻译效率克服mRNA肿瘤疫苗的体内屏障〔河。

如Figure 1.4所示,为了实现mRNA疫苗的提呈并激活T细胞应答,mRNA 稳定性和有效的胞内摄取可能是其面临的最大挑战3〕。研究表明可以通过体外转 录具有完整结构的mRNA来增强其自身稳定性。由于核酸是亲水的负电性生物 大分子,它们不能轻易穿过细胞的疏水性脂质膜3】,并且病原体相关的核酸导致 了机体先天防御机制,包括在核酸酶的作用下降解核酸和通过模式识别机制激活 先天免疫系统清除核酸。因此,有效的核酸递送通常包括两种方式:一是载体递 送系统,可以保护核酸不被降解并协助核酸进入细胞;二是通过直接将核酸注射 至淋巴结中,在APCs富集区被细胞内吞进而释放在细胞质中,发挥其功能[粘°〕。

Figure 1.4 Strategies to increase presentation of the mRNA-encoded antigen 卜勿.

1.3.3 mRNA肿瘤疫苗的应用现状与前景

免疫疗法中肿瘤疫苗有望成为治疗恶性肿瘤的重要策略。肿瘤疫苗通过引入 肿瘤相关的抗原物质以诱导下游免疫系统活化的方式来发挥作用,近几年来基于 mRNA的肿瘤疫苗被广泛应用于临床前与临床研究中⑹]。肿瘤细胞高表达的肿 瘤相关抗原或者肿瘤特有抗原被开发为mRNA疫苗〔I® 6丐 其目的是诱导细胞介 导的免疫反应,如来自CTLs的反应,以达到清除或减轻肿瘤负担的目的mJ二 十多年前第一个mRNA肿瘤疫苗的研究不仅提出的mRNA肿瘤疫苗的概念,也 验证了 mRNA肿瘤疫苗这种方法的可行性。随后,也有很多研究证明了 mRNA 肿瘤疫苗对治疗肿瘤的可行性以及有效性,目前以用于临床研究的包括皮内注射 mRNA用于非小细胞肺癌(NCT00923312) [64],静脉注射脂质体mRNA复合物 用于黑色素瘤(NCT02410733)和乳腺癌(NCT02316457)等昭。

1・4核酸纳米递送系统

1.4.1核酸纳米药物递送的优势

纳米递送载体通过吸附或者包埋的方式荷载核酸药物,不仅可以保护核酸不 被降解,也可以延长释放时间从而持续增强免疫反应[呦,例如凝胶状或聚合物纳 米颗粒可以作为mRNA贮存库,在很长一段时间里缓慢释放核酸[67】。如Table 1 所示,纳米载体的合理设计和构建以及合适的给药方式,能更好的将核酸递送至 免疫细胞和免疫器官中,激活机体的抗肿瘤免疫反应岡】。一方面,调控纳米载体 的特性可以优化靶细胞对于核酸药物的摄取。比如,通过调控颗粒的尺寸大小, 使得纳米颗粒疫苗给药后更容易进入淋巴系统进而有效传递到淋巴结中,转染高 密度的免疫细胞群a】;通过将颗粒外层改性可以进一步改善纳米颗粒靶向配体特 异性免疫细胞的表面受体[7叭还可以设计纳米颗粒以最大化生物活性的有效载荷 方式促进细胞更多的摄取。另一方面,选择不同给药方式可以提高核酸疫苗效率。 例如,Hoen•等人证明使用脂质体保护mRNA免受核酸酶介导的降解,通过体内 静脉注射的途径显著增强CTLs响应,但是未能通过肌肉注射和腹腔注射的方式 诱导该响应。他们还表明,虽然少量鱼精蛋白可以保护裸mRNA免受核酸酶降 解,单独使用鱼精蛋白-mRNA (不含脂质体)皮下免疫小鼠不能增强CTLs活化 [7氏总的来说,选择合适的纳米载体,包载方式和给药方式都可以提高核酸疫苗 的治疗效果。

Table 1 mRNA vaccine conq)lexing strategies for in vivo use

Delivery system type Route of

delivery

Species Target
Commercial transfecti on

reagent

i,n. Mouse   OVA【72]
Protamine i.d. Mouse, ferret, pig and human melanoma[71], non-smaD-cell lung cancer[73], prostate cancer[38], OVA and Lewis lung cancer"】
Protamine liposome Lv. Mouse   Lung cancel751
Cationic polymer liposome i.v. Mouse   Melanoma®,761, pancreatic cancert771
Cationic lipid nanoparticle i.d.

i.v.

Mouse   HIV-1 and
Cationic lipid, cholesterol nanoparticle iu, s.c.t

is.

Mouse   Melanoma, OVA, colon cancer^]
Cationic lipid, cholesterol id, i,m.t Mouse, cotton melanomat80]

s.c. rat

Influenza virus, Ebola virus, and Zika Dendrimer nanoparticle i, m. Mouse

virM

OVA, ovalbumin-expressing cancer models; sc, subcutaneous; i・d., intradermal; i.v., intravenous; in., intranasal; Ls., intrasplenic; im, intramuscular;

最后,近年研究也报道了可以通过多种技术将核酸和佐剂包载到同一个纳米 载体中,同时也证明了该体系不仅可以增加抗原特异性免疫反应并且是提高有效 载荷的药代动力学的方式回】。

142核酸纳米药物递送系统的分类

核酸的递送载体是由多种天然或合成材料(脂类、聚合物、多肽、抗体、小 分子或金属等)制成的具有不同几何结构(纳米颗粒、微粒、共轨物、固体器件 或水凝胶等)的纳米颗粒。纳米递送载体材料的选择对实现有效且高效的核酸递 送至关重要。早期转染细胞的研究证明带正电荷的分子(通常富含质子化胺等基 团)更容易与带负电荷的核酸形成静电复合物,并且进一步形成纳米复合物转染 细胞并促进蛋白质表达。从最初的使用天然存在的高分子材料,如鱼精蛋白和聚 (L•赖氨酸),延伸到近期专为基因递送设计的高分子材料,如聚(卜氨基酯)或 (2,3■二油酰基■丙基卜三甲胺(DOTAP)脂质,这些阳离子纳米颗粒被证明在 mRNA递送的应用中是有效的【跖。

研究表明编码卵清蛋白(OVA)的mRNA与阳离子脂质体DOTAP在预防 和治疗表达OVA的肿瘤模型中表现优良国]。掺入DOTAP脂质的二油酰磷脂酰 乙醇胺(DOPE)脂质体进一步提高了 CTLs反应的强度。Mockey等人使用脂质 复合物递送mRNA的策略进行疫苗接种,证明静脉注射包载编码黑色素瘤相关 抗原(MARTI) mRNA的富含组氨酸阳离子脂质体可以有效遏制黑色素瘤的进 展【加。

1.4.3核酸纳米药物递送系统未来发展方向

在过去的几十年中,基于DNA或病毒载体疫苗的开发受到严重的安全性问 题的阻碍。因此疫苗研究的重点是寻找有效诱导抗原特异性CTLs反应的替代策 略。基于mRNA的基因递送可能是用于治疗先天性和后天性疾病的新策略〔列。 其优点在于:mRNA没有插入基因组DNA的风险、可调控的表达方式、以及转 染效率与靶细胞的细胞周期无关。虽然mRNA自身的一些限制阻止了其在免疫 调控中更广泛的应用,但临床前研究已经证明了通过构建具有稳定结构的mRNA、 优化mRNA递送系统,可以降低其免疫原性,提高其应答效率。因此,基于mRNA 的疫苗在预防和治疗抗肿瘤方面更具应用前景。最近的一项研究也首次表明 mRNA疫苗可以诱导防止小鼠和猪的病毒感染。然而,治疗性mRNA肿瘤疫苗 的临床结果表明mRNA疫苗技术仍然不是最理想的。降低因mRNA的免疫原性 导致的固有免疫反应,同时保持mRNA诱导的免疫激活特性,仍然是阻碍mRNA 疫苗开发的一个主要的问题。综上所述,需要更好地了解mRNA疫苗触发的免 疫机制来合理地设计疫苗和治疗方案,以达到提高mRNA疫苗的临床疗效的目 的阿。

1.5选题依据以及主要研究内容

对于恶性肿瘤,抗原特异性的细胞毒性T细胞在适应性免疫应答中起关键 作用[旳。T细胞功能依赖于抗原呈递细胞提呈抗原决定簇和共刺激信号。为了调 控细胞免疫对肿瘤的抑制功能,可能的策略是通过免疫接种来引发APC的活化 阿。临床前研究中已经设计了多种方法将mRNA递送至APCs中㈤卫汎 用编 码抗原的mRNA转染自体DC已在进行了大量实验并具有相当大的前景留型〕; 然而,复杂的操作过程限制了它们广泛的临床应用[叫因此,在体内直接将mRNA 递送给DCs是mRNA疫苗接种是必需的,目前这一策略正在面临一些挑战〔旳。 首先,未修饰的mRNA易受无处不在的核酸酶的降解[冏。其次,与任何其他核 酸一样,mRNA的负电荷使细胞摄取相对低效。最后,将mRNA分子暴露于非 APC存在引发体内不良反应的风险。有研究显示局部注射裸mRNA可引起抗原 特异性T细胞应答a〕。然而,由于裸mRNA分子立即被组织核酸酶降解,无法 诱导高水平的T细胞的活化。一种改进的方法是将mRNA分子包载到纳米输送 系统中,这一策略在解决基因疫苗接种的上述挑战中持有独特的优势。近年来, 少数研究已经研究了基于mRNA的纳米颗粒疫苗的治疗效果。例如,静脉内注 射mRNA-LPX (脂质体和编码新抗原mRNA的复合物)能够在多种肿瘤模型中 诱导强烈的新抗原特异性T细胞反应3-99]。目前在临床上没有基于纳米颗粒的 mRNA疫苗,从而迫切需要有效和可临床转化的mRNA疫苗输送系统来进行癌 症免疫治疗。

我们课题组发展了一种阳离子脂质辅助的纳米颗粒系统(CLAN)来递送核 酸药物,该系统是由嵌段共聚物聚(乙二醇)■嵌段■聚(乳酸■乙醇酸)(mPEG・ 6-PLGA),聚乳酸■共■乙醇酸(PLGAuk)和阳离子脂质NN二羟乙基甲基. N-2-(胆固醇氧按基氨基)乙基漠化鞍(BHEM-Chol)组成,这些材料均具有生 物相容性和生物可降解性。我们己经在多个疾病模型中证明CLAN是高效的核 酸药物递送载体(包括小干扰RNA,microRNA和CDISPR/Cas9质粒等)[im05]o 在本项工作中,我们进一步探究了 CLAN作为肿瘤mRNA疫苗递送载体的潜能。 我们证明了 CLAN可有效荷载mRNA并可提高细胞内化mRNA的能力并促进 树突状细胞中mRNA的翻译。此外,我们发现CLAN包载编码肿瘤模式抗原卵 清蛋白(OVA)的mRNA可以高效诱导淋巴组织中CDllc+ DC的成熟和CD8+ T细胞的活化和增殖,还评估了包载mOVA的CLAN (CLANmovA)在转移E.G7- OVA淋巴瘤模型中的抗肿瘤效果(Figure 1.5) □综上可知,CLAN是一种具有 广阔应用前景的mRNA疫苗递送平台。

第2章CLAN递送mRNA用于肿瘤疫苗的研究

2.1实验材料

2.1.1主要材料

嵌段共聚物聚乙二醇■聚乳酸■乙醇酸(mPEG5K-fe-PLGAnK)由实验室王立师 兄合成提供,聚乳酸■共■乙醇酸(PLGAhk)由实验室曹志婷师姐合成提供,阳离 子脂质N, N二梵乙基・N■甲基-N2 (胆固醇氧拨基氨基)乙基漠化鞍(BHEM- Chol)由实验室张厚兵师兄合成提供,以上材料均根据先前报道的方法合成[血〕。

2.1.2细胞株

  • 鼠源T淋巴瘤细胞系G7-0VA:来自美国典型培养物保藏中心(ATCC ), 使用添加10%热灭活胎牛血清和1%抗生素的RPMI-1640培养基进行培养;
  • 鼠源树突状细胞系4:来自北京索莱宝科技有限公司,使用添加 10%热灭活胎牛血清和1%抗生素的DMEM培养基进行培养;

所有细胞系均培养在37 °C条件下,含5% CO2的培养箱中。每三个月检测 细胞的支原体。

2.1.3实验小鼠

C57BL/6J小鼠(4-6周龄)购自南京大学模型动物研究中心(MARC), C57BU6J 背景的 OVA 特异性 TCR转基因小鼠(C57Bl/6-Tg(TcraTcrb) 11 OOMjb/J) /6 (简称OTJ鼠)是来自廉哲雄教授实验室的惠赠。在所有实验中使用6・10周 龄的SPF级小鼠。实验小鼠由中国科学技术大学实验动物中心负责饲养和管理

(SPF级,22°C,湿度55%, 12h白天/黑夜),符合实验动物护理和使用指南中 概述的要求。开展的所有动物实验遵照中国科学技术大学实验动物管理条例。

2.1.4主要试剂

  • pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458, pCas9-GFP): Addgene 公司,美 国;
  • pUC57・OVA257・264质粒:安徽通用生物有限公司,中国;
  • PCR引物序列:安徽通用生物有限公司,中国;
  1. a) EGFP引物序列:

正向引物:5—TAATACGACTCACTATAGGGATG-3,

反向引物:5»TTACTTGTACAGCTCGTCCA・3,

  1. b) Ovalbumin引物序列:

正向引物:5—TAATACGACTCACTATAGGGATG-3,

反向引物:5,・TTAAGGGGAAACACATCTGC・3,

  • HiScribe™ T7 ARCA Quick High Yield RNA Synthesis kit (mRNA 体外 转录试剂盒):New England Biolabs公司,美国;
  • 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog:New England Biolabs公司,美国;
  • coliPoly(A) Polymerase: New England Biolabs 公司,美国;
  • RNase Inhibitor:New England Biolabs 公司,美国;
  • Quant-iT™ RiboGreen RNA kits (RNA 定量试剂盒):Invitrogen 公 司,美国;
  • Anti-mouse Ovalbumin (3G2E1D9)抗体:Santa Cruz Biotechnology 公 司,美国;
  • ECL显色系统Western Blot底物试剂盒:Pierce公司,美国;
  • Alexa Fluor 568 Phalloidin:Invitrogen 公司,美国;
  • Animal-Free Murine Dendritic Cell Cytokine Package:PeproTech 公 司,美国;
  • CellTrace™ CFSE 细胞增殖试剂盒:Thermo Fisher Scientific 公司, 美国;
  • APC-H-2Kb/OVA257-264 四聚体:Emory University Vaccine Center, NIH Tetramer,美国;
  • 流式抗体 FITC-anti-CD8a, CDllc;PE-anti-CD62L, IFN-y, I-A/I- E, CDllc; Percp-Cy5.5-anti-CD44, CD19, TNF-a, CD80; APC-anti- CD3, CD86, F4/80; PE-Cy7-anti-CD69, CD45, B220; APC-Cy7-anti- CD4, CDllb, BV510-anti-CD45, I-A/I-E: BioLegend 司,美国;
  • Fixation/Permeabilization Diluent (固定/穿膜液):eBioscience 公 司,美国;
  • Cell Activation Cocktail (with Brefeldin A):BioLegend 公司,美国。

22实验方法

2.2.1 mRNA的模板构建和体外转录

编码EGFP(增强绿色荧光蛋白)和OVA(卵清蛋白)的mRNA分别用mEGFP 和mOVA表示,mEGFP和mOVA的体外转录分别是以pUC57和PX458载体上 的对应基因片段作为DNA模板。在pUC57质粒的EcoRV酶切位点插入编码 OVA (H-2K位限制抗原表位肽段00257.264)片段的DNA序列,并且在该段 DNA序列5,段添加T7启动子序列,该质粒由安徽通用生物有限公司构建。 pSpCas9 (BB) -2A-GFP (pX458)是 Addgene 公司的质粒#4813& 该质粒含有 EGFP报告基因。按照附录D所示的方法进行对质粒进行扩增和提取。然后通过 聚合酶链式反应(PCR)分别对质粒中O%和EGFP序列进行扩增。

(1)设定的PCR反应体系如下:

试剂 便用量 终浓度
Plasmid DNA 100 ng  
Forw^d Primer (10 jiM ) 5gL 0.5 pM
Reverse Primer (10 p,M) 5 piL 0.5 gM
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix 50 gL lx
Nuclease-free ddH20 X|iL  
Total 100 [xL  
(2) PCR仪设置程序如下:
反应步骤 反应温度 反应时间
①预变性 95 °C 30 s
②变形 98 °C 10 s
③退火 60 °C 30 s
④延伸 72 °C 30 s
②至④,30个循环    
⑤最终延伸 72 °C 5 min
4 °C Hold

 

  • PCR产物长度通过凝胶电泳鉴定,然后使用PCR产物纯化试剂盒进行 目的条带的纯化,详细方法见附录D;
  • 以纯化后的PCR产物为模板,体外转录合成5,端加帽的mRNA,转录 反应体系如下:

IYTmENAT(加亍Cap结构浜似物厂 一一 確用量—

T7-DNAtemplate X|liL (1 gg)

NTP buffer mix 8(1L (8 mM each NTP final)

Cap Analog (40 mM) 5 gL (8 mM final)

Nuclease-free water Y pL

T7 RNA polymerase Mix 2 pL

Total 25 pL

  • 充分混匀后,离心到PCR管底部,37七孵育过夜;
  • 加入2jxLDNaseI,充分混匀,37弋孵育15 min,除去产物中的DNA;
  • 通过LiCl沉淀法对mRNA进行纯化:
  1. 在上述体系中,加入25 hLDEPC水至50 yL体系;
  2. 加入25 jiLLiCl溶液,混匀;
  3. 放入-20 «箱孵育30 mm;
  4. 4 £离心13000 g, 15min;
  5. 去除上清,在mRNA沉淀中加入500肛70%冰乙醇,稍微润洗管壁;
  6. 4 °C离心13000 g, 5 min,去除上清;
  7. mRNA用适量DEPC水重悬,使用Nanodrop 2000对mRNA进行定 量。
  • mRNA的3,端加Poly(A)尾,反应体系如下:

For mRNA (加 3Poly(A)尾巴) 体积

mRNA 120 gg/60 gL

10x E.coli Polymerase Reaction buffer 10 piL

ATP(lOmM) 16 gL

E.coli Poly(A) Polymerase 4 piL

Total ]00 吐

  • 充分混匀,离心到底部,37 °C孵育2h;
  • 再次加入50 jaLLiCl进行沉淀法纯化,添加RNase inhibitor后分装到 合适体积,・80弋冰箱保存产物;
  • 通过RNA变性电泳鉴定IVTmRNA的长度:
  1. 制备1%变性胶,1 g琼脂糖加入72 mLNuclease-free water置于三角 烧瓶中,微波炉融化琼脂糖,冷却到60 °C;
  2. 再加入10 mL 10 x MOPS buffer、18 mL新配制的37%甲醛溶液

(DEPC 水配制,12.3 M)和 10 gL Gel-red 混匀,倒胶;

C)取 1 yg RNA 样品加入等体积 RNAloading Dye (2 x, NEB);

  1. 65 °C・70 £热处理加有loading dye的RNA样品或者RNAmarker 5 -10 min;
  2. 点样后电泳(电泳液为lx的MOPS buffer), 80 V恒压电泳30 min ,凝胶成像仪拍照,验证RNA的大小和完整性。

222包载mRNA的CLAN的制备及其表征

(1)将・80七冰箱保存的聚合物PEG5K&PLGA11K, PLGAuk和BHEM-Chol取出,平衡到室温后在干燥环境下开封,分别以62.5 mg/mL, 37.5 mg/mL和20.0 mg/mL的浓度溶于色谱级三氯甲烷溶液中;

  • 将・80七冰箱保存的mRNA溶液在冰上融化,使用无核酸酶水(DEPC 水)调整其浓度为4mg/mL。在50mL无菌离心管中,依次加入25 rL mRNA (0.1 mg), 100gLBHEM-Chol (2mg), 350 ^lLPEGsk^-PLGAuk

(21.875 mg)和 50rLPLGAiik (1.925 mg);

  • 将该离心管置于冰水中,把Vibra-Cell™VCX130的超声探头用DEPC 水冲洗后放入离心管的溶液中,在80 W功率和冰水浴条件下,以超声 5 s停2 s的方式超声乳化溶液60s,得到油相■水相的初乳液。随后, 将SmLDEPC水沿管壁加入到初乳液中,并在同样条件下,以超声10 s停2 s的方式再次乳化60s,形成水相-油相■水相的复乳液;
  • 将复乳液转移到DEPC处理并高压过的无菌无核酸酶100 mL圆底烧 瓶中,使用RotavaporR-3旋转蒸发仪,在低温条件下,缓慢地减压旋 蒸以除去乳液中的三氯甲烷,并浓缩其水溶液体积到lmL左右,制备 好的CLANmRNA转移到5 mL EP管中保存于4 £冰箱中待用。包载 水、mEGFP 和 mOVA 的 CLAN 分别用 CLANbiank、CLANhiegfp和 CLANmOVA 表不;
  • 使用 Malvern Zetasizer Nano ZS90 动态光散射仪(DLS)在 25。(3条件 下检测纳米颗粒的大小(diameter)>表面电势(zeta potential)及多分 散性(PDI);
  • 使用Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒测定CLAN对mRNA的包 载效率,具体方法见试剂说明书,其中,CLAN的处理方法为:
  • 使用超高速离心机将CLANmRNA在4。0 20,000 g条件下离心2 h, 收集上清液并用移液器定量其体积,记为V上清,Quant-iT RiboGreen RNAAssay Kit测量上清中的mRNA的浓度,记为C上清;
  • 沉淀溶于ImL的DMSO,从中取100 yL,加入200 pL肝素钠溶液 (6.667mg/mL),混匀,室温静置2h后,记录置换的体积V置换及测定

的mRNA的浓度,记为C 沉淀;

3 )其中CLANmRNA的包载效率、回收率和实际得到的有效 mRNA/mRNA的投料量分别为:

  1. 包载效率(100%) - (1- (C 上清X V上清 )/ (C 上清x V上清 + C 沉淀XV 沉淀))X 100%;
  2. CLANmRNA 回收率(100%) = (C 上清x V上清 + C 沉淀xV沉淀 )/C 投料x V 投料 x 100%;

c)实际得到的有效mRNA/mRNA的投料量=包载效率x回收率。

2.2.3检测细胞转染CLANmRNA后蛋白质的表达情况

  • CLANmEGFP 转染 4 细胞

调整DC2.4细胞为8 x 105个/mL,接种在12孔板中,DMEM培养基培养细 胞使其数量达到培养板面积的70%左右。随后,用含CLANmEGFP的新鲜培养基 对细胞进行不同时间的转染,共设置6个实验组,分别是PBS组、12h组、24h 组、36 h 组、48 h 组和 72 h 组。先用 CLANmEGFP(5.0 gg/mL mEGFP)处理 6 h 后换液,再进一步孵育相对应实验组的时间后,收集细胞,流式细胞术检测EGFP 阳性细胞的百分比和平均荧光强度。

根据上述实验结果选取转染细胞后EGFP表达最高的时间点,按照同样的方 式,将细胞在含有CLANmEGFP的新鲜DMEM培养基中进行转染,共设置6个实 验组,分别是 PBS 组、CLANblank组、CLANmEGFP (l・25pg/mL)组、CLANmEGFP (2・5yg/mL)组、CLANmEGFP (3.75 yg/mL)组和 CLANwegfp (5.0 gg/mL)组, 用不同浓度CLAN^gfp处理6 h后换液。在进一步卿育相对应实验组的时间后, 获取细胞悬液,通过流式细胞术检测EGFP阳性细胞的百分比和平均荧光强度。

另外,将DC2.4细胞以6xlt)5个/mL接种在6孔板中,培养24h后,更换 培养基,用CLANmEGFP对细胞进行转染,共设置2个实验组,分别是PBS组和 CLANmEGFP组,用 PBS 或 CLANmEGFP (5.0 gg/mLmEGFP)处理 6h 后换液。再 进一步培养40h后,消化后,将细胞以每孔1x104个细胞的数量种在含圆形超 薄盖玻片的24孔板中培养过夜,按照附录D的荧光免疫染色方法制备样品,使 用激光共聚焦显微镜检测细胞中的EGFP荧光信号。

  • CLANmovA转染 4 细胞

DC2.4细胞以6 x 105^/mL的浓度接种在6孔板中,培养24 h后,更换为 含有CLANxbova的新鲜DMEM培养基中转染细胞,共设置5个实验组,分别是 PBS 组、CLANmO治(1.25gg/mL)组、CLAN^ova (2.5gg/mL)组、CLANmO% (3.75 ng/inL)组和 CLANmo% (5.0gg/mL)组,用 PBS 或不同浓度 CLANmovA 转染细胞6 h后换液,再进一步培养40 h,使用1 xPBS洗涤细胞3次,通过细 胞裂解缓冲液裂解DC2.4细胞从而得到胞质总蛋白质,裂解缓冲液中含有蛋白 酶抑制剂混合物PMSFo根据附录C的配方配制浓度为10%的SDS-PAGE胶, 按照附录D的方法将裂解出的总蛋白(50yg/孔)进行电泳,通过蛋白印迹实验 分析细胞在转染CLANmovA后OVA蛋白在细胞中的表达情况。以GAPDH作为 内参蛋白,山羊抗小鼠或山羊抗■兔HRP缀合的抗体作为二抗。使用Image QuantTMLAS 4000 显影条带。

2.2.4体外诱导培养小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)

将OT-I转基因小鼠(C57Bl/6-Tg(TcraTcrb) 11 OOMjb/J))按照附录D的方法 取出骨髓细胞,分离并培养于24孔板中,每隔两天换液并补充细胞因子。在第 6天,吹打培养液来收集悬浮和疏松贴壁生长的细胞,重新铺板于六孔板中并加 入等量细胞因子继续培养2天,然后收获半粘附状态的树突状细胞用于实验。

225检测CLANmRNA诱导DCs的成熟和T细胞的增殖

从OT・I转基因小鼠中获得的骨髓细胞在体外诱导分化成BMDCs,方法如上 所述。分别用等体积PBS、LPS (Ing/mL)和CLANmOvA (5.0pg/mL)转染未成 熟的BMDCs,其中PBS组和LPS组分别作为阴性对照组和阳性对照组a叭 培 养48 h后,收集细胞,PBS重悬细胞后加入TruStain FcX™ (抗小鼠CD16/32) 冰上孵育20 min,再标记流式抗体CDllc、I・A/I・E、CD80和CD86;通过BD FACS Verse™流式细胞仪检测BMDCs中CD80和CD86阳性细胞的百分比。

使用MACS技术从OT・I小鼠分离OVA特异性CD8+ T细胞,用5-(和・6) ■竣基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记,具体方法见附录D。将CFSE标记好 的CD8+T细胞1 x山个/孔加到96孔板中,同时加入100 U/mL的IL-2,再分 别与上述三个实验组的BMDCs以1: 1的比例共培养72h,然后通过BD FACS Verse™流式细胞仪检测T细胞中CFSE的荧光强度变化,从而分析T细胞的增 殖情况。

2.2.6检测CLAN包载的mEGFP在小鼠体内DCs中翻译成EGFP

尾静脉注射CLANmEGFP (40^gmRNA)到C57BL/6鼠体内,两天后,牺牲 小鼠,摘取脾脏和引流淋巴结。使用5niL注射器柄和200目滤网研磨脾脏,使 用两个糙面载玻片的粗糙面研磨淋巴结,获得细胞悬浮液,然后将悬液以1500 r/min, 4弋条件下离心5 min,弃去上清;淋巴结细胞用含0.2% BSA的PBS重 悬,通过200目筛网过滤,计数后调整浓度为1 xio7^/mL;脾脏细胞裂红后用 含0.2% BSA的lxPBS重新悬浮沉淀,并通过200目筛网过滤,调整浓度为1 x 107个/mL。然后,以每管100 yL细胞悬浮液的体积将细胞分配到流式管中, 在免疫染色之前用TruStain FcXtm (抗小鼠CD 16/32)在冰上孵育20 min,用抗 小鼠CD 11c, I-A/I-E抗体标记细胞悬浮液。最后,将细胞重悬于200 [1LFACS缓 冲液,在流式检测前加入lOgLDAPI (4\ 6■二眯基2苯基卩引喙,二乳酸盐)到 细胞悬液中以排除死细胞。用BD FACS Verse™流式细胞仪检测脾脏和引流淋巴 结中的CDllc+树突状细胞里EGFP的表达情况。

2.2.7检测体内CLANhirna诱导DCs的成熟和T细胞的增殖

尾静脉注射CLANoova (40 gg mRNA)到C57BL/6鼠体内。三天后,摘取 脾脏和引流淋巴结,按照上述的方法分离细胞并标记流式抗体CD45、CDllc、 I-A/I-E> CD80和CD86。在流式细胞术检测向细胞悬液中加入lOpLDAPI用以 排除死细胞。通过BD FACS Verse™流式细胞仪检测和分析脾脏和引流淋巴结中 CD80+和CD86+的DC比例和CD3+CD8+CD69+ T细胞的百分比。

228检测体内CLAN^a诱导功能性T细胞的增殖

磁珠分选出OT・I小鼠脾脏中的CD8十T细胞,并用CFSE标记。用CFSE阳 性的OVA抗原特异性CD8+ T细胞以2.0 x 107个/只的数量转输到C57BL/6小鼠 体内;转输细胞18h后,将CLANmEGFP (40憾mRNA)以尾静脉注射的方式免 疫C57BL/6小鼠,注射PBS或CLANbiant作为阴性对照。免疫后第3,从脾脏 和引流淋巴结中分离免疫细胞,并如上述方法进行抗体染色(抗■小鼠CD45、CD3、 CD4和CD8)O在流式细胞术检测向细胞悬液中加入10吐DAPI用以排除死细 胞。通过流式细胞术对不同组织中CFSE阳性T细胞进行分析。

  • CLANmRNA疫苗针对G7-OVA肿瘤小鼠模型的治疗

1) CLANmRNA疫苗免疫C57BL/6小鼠:分别在第0天,第3天和第8天用 CLANmovA(40 ^gmRNA)通过尾静脉注射的方式给C57BL/6小鼠接种疫苗,同 时,接种等体积PBS溶液和CLANblank的小鼠设定为对照组。

2) 建立鼠源淋巴瘤细胞E.G7-OVA皮下肿瘤模型:扩增培养E.G7-OVA细 胞系,在小鼠最后一次接种CLANmrna疫苗5天后,将小鼠侧腹部脱毛;收集培 养的肿瘤细胞,将4.0 x 105个E.G7-OVA肿瘤细胞皮下注射到小鼠的侧腹部。

3) 监测小鼠肿瘤生长情况:每隔三天测量肿瘤垂直直径。使用下述公式计 算小鼠的肿瘤体积:V(mm3) = xxy2/2,其中V代表肿瘤体积,x表示肿瘤长径, y表示肿瘤短径,单位为nun;同时用天平记录小鼠体重的变化。

  • CLANthrna疫苗接种后荷瘤小鼠免疫细胞亚群的变化

当荷瘤小鼠的健康受到危害或肿瘤的直径超过15 mm时,对小鼠进行安乐 死处理,收集小鼠的脾脏,引流淋巴结和血液,脾脏和淋巴结按照上述方法分离 出细胞,血液裂红后用含0.2% BSA的1 x PBS重新悬浮沉淀并通过200目筛网 过滤,计数后调整浓度为1 x IO?个细胞/mL。以每管100 yL细胞悬浮液的体积 将细胞分配到流式管中,用TruStain FcX™ (抗小鼠CD 16/32)在冰上孵育20 min,然后标记流式抗体CD45, CD3, CD4, CD8和OVA-MHC-I类四聚体在冰 上孵育20min,用PBS洗一遍后用200gLFACS缓冲液重悬细胞,通过BDFACS Verse™流式细胞仪检测细胞比例。

为了检测T细胞内细胞因子的分泌情况,另以每管200吐细胞悬浮液的体 积将细胞分配到流式管中,用细胞激活混合刺激剂(含布雷菲德菌素A)在培养 箱中刺激细胞6 h,然后用抗■小鼠CD45、CD3、CD4和CD8的抗体标记T细 胞。根据附录D的方法对染色后的细胞进行固定和穿孔,再标记抗细胞因子染 色的抗体(抗•小鼠IFN-丫和TNF-a)o使用BD FACS Verse™流式细胞仪检测T 细胞中OVA抗原特异性T细胞的比例和T细胞中细胞因子的分泌情况。以上流 式数据均使用FlowJoVIO软件进行分析。

2.2.11统计分析

组平均值之间的显著差异水平由参数数据集的学生t检验确定。使用 GraphPad Prism 7.0进行所有统计学分析。0.05的p值在所有的分析被认为是有 显著性(95%置信水平)。

2.3结果与讨论

23.1体外转录可翻译成肿瘤模式抗原的信使RNA

为研究阳离子脂质辅助纳米颗粒是否能够有效的将mRNA疫苗递送到抗原 提成细胞中,我们首先在体外转录可翻译成抗原的的信使RNA,在本项工作中, 我们选取卵清蛋白(ovalbumin, OVA)作为肿瘤模式抗原进行研究。为了在体外 高效转录具有功能性的mRNA,我们设计了插入了编码OVA基因的pUC57质 粒,并在亍端添加T7启动子序列以提高mRNA的体外转录效率,如Figure2.1 A 所示。通过PCR扩增pUC57-OVA质粒上的OVA基因片段,该DNA片段即为 mOVA的线性化的转录模板。如Figure 2.1B所示,凝胶电泳检测目的条带长度 约为1200 bp,初步判断OVA基因片段大小是正确的。在mRNA的5,端添加 m7Gp3N帽结构,有利于提高体外转录RNA分子的翻译效率,在歹端加入poly(A) 可以则有效减缓mRNA的降解速度。我们按照试剂盒的标准方法在体外转录出 具有5,端帽结构和3,端poly(A)尾的mOVA (一般poly(A)的长度超过100 bp)。

如Figure 2.1C所示,体外转录获得的mOVA通过变性琼脂糖凝胶电泳鉴定,长 度大约是1300 bpo这表明我们成功转录出具有预测长度的编码OVA蛋白的 mRNA片段。

mRNA在体内递送过程中面临诸多难题,如易被核酸降解、负电性导致的进 入抗原提呈细胞的能力差等,严重限制了 mRNA疫苗等药物的应用【】°叽我们实 验室之前的研究表明,阳离子脂质辅助纳米颗粒(CLAN)是具有良好应用前景 的核酸递送载体,其有望解决上述难题。我们尝试证明CLAN能荷载mRNA并 保护其在递送过程中不被核酸酶降解,并且增强抗原提呈细胞对mRNA的摄取 进而翻译成功能性蛋白质。我们以嵌段共聚物聚乙二醇■聚(乳酸-乙醇酸) (mPEG5K“・PLGAiiK)、聚(乳酸■乙醇酸)(PLGAiik)和阳离子脂质N, M二疑 乙基・N■甲基(胆固醇氧拨基氨基)乙基漠化鞍(BHEM-Chol)作为辅料, 通过双乳化的方法制备阳离子辅助的包载mRNA的纳米颗粒(表示为 CLANthrna),负电性的mRNA在阳离子脂质额协助下包载在纳米颗粒的内水相, 有望高效递送mRNA的目的。我们按照mRNA: PEG5K-6-PLGAhk: PLGAuk: BHEM-Chol是0・1:2340・9:2的投料比进行CLANjurna的制备,并对制备的获得 CLANmRNA的特性进行表征。首先通过变形凝胶迁移实验对CLAN包载mRNA 的效率进行检测,如Figure 2.2A所示,大多mRNA被阻滞在上样孔中,表明 CLANwrna具有良好的包封效率。Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒测定 CLAN对mRNA的包载效率为91.5%,回收率为42.1%,实际得到的有效 mRNA/mRNA的投料量为38.5%0动态光散射DLS结果显示CLANmRNA的平均 粒径在llOnm左右,具有较小的多分散指数(PDI)值(如Figure2.2B),纳米 颗粒的匚电位约为25 mV (如Figure 2.2C)O使用相同浓度RNase A处理游离
2.3.2 包载mRNA的CLAN的制备和表征

mRNA和CLANmRNA, CLAN可以保护mRNA避免核酸酶的降解,如Figure 2.2D 所示。因此我们推测mRNA在CLAN的保护下可以不被快速降解,从而更有机

会被抗原提呈细胞摄取。

Figure 2.2 Preparation and characterization of CLANmrna. (A) Encapsulating efficacy of CLANmovA examined by gel electrophoresis; CLANmovA consist of PEG-PLGA, PLGA, BHEM-cholesterol, and mRNA via double-emulsification method. (B) Size distribution and (C) zeta potential of CLANmRjg. (D) The integrity of mRNA encapsulated in CLAN after treatment with nuclease.

2.3.3 CLANxhrna在细胞水平的转染与mRNA的翻译

mRNA疫苗接种的成功与否取决于以下三点:mRNA被APC内化、翻译成 蛋白质并被APC加工呈递抗原肽到细胞表面〔IB。在这项研究中,我们首先验证 APC是否能将包载mRNA的CLAN摄取并表达出相应的蛋白。我们将鼠源树突 状细胞系DC2.4与荷载增强的绿色荧光蛋白的mRNA的纳米颗粒CLANmEGFP (mEGFP浓度为2.5pg/niL)共孵育不同时间段后(从12h至72h),我们通过 流式细胞术检测DC2.4细胞中EGFP蛋白的表达情况。如Figure 2.3A所示,在 12到48h之间,随着孵育时间的延长,EGFP阳性细胞的比例响应增加(共孵育 48h后EGFP阳性细胞的比例约为60%)o同时我们也观察到,EGFP表达水平 在共孵育72 h后显著下降,这可能是由于mRNA翻译成的EGFP蛋白质发生了

降解。同时,我们将不同剂量的CLANffiEGFP(mEGFP浓度范围为l・25-5・0Mg/mL) 与DC2.4细胞共孵育来探究量效关系。如Figure 2.3B所示,随着mEGFP剂量 的增加,细胞内EGFP的表达量升高。细胞与5.0 tig/inLCLANmEGFP共孵育40 h 后,有80%以上的细胞中表达EGFPo此后,我们通过共聚焦激光扫描显微镜来 观察转染后的DC2.4中EGFP的表达情况,与阴性对照(加入等体积PBS)相 比,CLANmEGFP转染40 h后的DC2.4细胞中检测到较强的EGFP荧光(Figure 2.3C)o最后,我们通过蛋白免疫印迹检测了不同剂量CLANmovA (mEGFP浓度 范围从1.25到5.0 gg/mL)转染后的DC2.4细胞中OVA的表达情况。如Figure 2.3D所示,随着CLANmovA剂量的增加,细胞中OVA蛋白的蛋白水平也相应的 提高,与流式细胞术检测结果相一致。上述结果表明,CLAN可以有效地包载 mRNA,树突状细胞能有效摄取CLANmRNA并将mRNA翻译成蛋白质,这一结 果支持利用CLAN递送mRNA作为肿瘤疫苗的假设。

intensity and the percentages ofEGFP positive cells in DC2.4 cells after treatment with different doses of CLNAxdegfp for 48 h analyzed by flow cytometry. (C) EGFP expression (green) in DC2.4 cells treated with CLAN-encapsulated mRNA analyzed by LSCM. The cell nuclei were stained with DAPI (blue) and Alexa Fluor® 568 phalloidin (red) was used to visualize cell skeleton. Scale bar; 50 gm. (D) Egression of ovalbumin in DC2.4 cells transfected with CLANmovA examined by western blotting. Data are

2.3.4细胞水平验证CLANmovA诱导BMDC成熟和CD8+T细胞增殖
shown as mean 士 SD, n = 3.

为进一步验证CLAN是否可以有效地将mRNA递送到DCs中并启动抗原特 异性的细胞免疫,我们检测了 CLANeova诱导BMDC成熟和CD8+ T细胞增殖 情况,这是是判断疫苗接种效果的两个重要参数。在细胞水平,我们将小鼠骨髓 来源的树突状细胞(BMDCs)分别CLANwova (5.0yg/mL)共孵育48 h后检测 细胞表面CD80和CD86 (成熟DC的标志物)表达水平。如Figure 2.4A所示, 阴性对照PBS组中BMDCs的CD80+和CD86+细胞比例分别为35.1%和50.3%, 阳性对照LPS组的CD80+和CD86+的细胞比例分别为48.7%和75.2%,而 CLANmo%组中CD80+和CD86+细胞的比例显著增高,相较于阴性对照组分别有 约2倍和1.5倍的增长,且活化效果好于LPS组。从这些结果,我们可以判断, CLANmovA被BMDCs摄取后,mRNA释放到胞质中翻译成蛋白质,进而被加工 成抗原肽提呈到细胞表面,诱导DCs的成熟I】。%

此外,我们探究了 CLANmovA是否能诱导抗原特异性的细胞毒性T细胞的 增殖。CLANmovA诱导BMDCs成熟并提呈OVA抗原肽到细胞表面后,MHC分 子■抗原肽复合物与T细胞表面的TCR相互识别,由此激活抗原特异性T细胞的 增殖。因此我们将CLANmOvA诱导活化的BMDC与CFSE染色的OVA抗原特异 性的T细胞共培养三天后,通过流式细胞术检测到CLANmovA组中的T细胞出 现较强细胞增殖峰(Figure2.4B),表明BMDCs成功将OVA抗原肽提呈给OVA 特异性T细胞,促进其活化增殖。综上所述,CLANmovA可以成功将mRNA递 送到BMDCs中,翻译成具有功能性的蛋白质进而被DCs加工提呈给T细胞, 激活适应性免疫。

2.3.5 CLANmEGFP在体内DCs中的蛋白表达
Figure 2.4
Maturation of DCs and expansion of functional antigen-specific T cells induced by CLANmRNA in vitro and in vivo. (A) Percentages of CD80+ and CD86+ cells in BMDCs after transfection with CLANmova (5.0 pg/mL) for two days. (B) Priming of nonactivated OVA-CD8+ T cells ex vivo. CLANmovA transfected BMDCs were coincubated with CFSE-labelled OVA-TCR transgenic CD8+ T cells. Three days later, proliferation profiles were analyzed by flow cytometry. Relative percentage of proliferated CD8+ T cells after co-culture with CLANnovA-treated BMDCs. Data are shown as mean 土 SD, n = 3; *P< 0.05, **P < 0.01.

在小鼠体内,DCs加工提呈抗原后逐渐成熟,其粘附能力逐渐下降而迁移能 力增强,从非淋巴组织归巢到次级淋巴组织中,主要是脾脏和引流淋巴结【约。为 了进一步检测CLAN能否将mRNA递送到小鼠体内的DCs中,并成功翻译成具 有功能性的蛋白质,我们通过尾静脉注射CLANmEGFP (mEGFP剂量为2mg/kg) 到C57BL/6小鼠体内,48h后牺牲小鼠,收集小鼠的脾脏和引流淋巴结细胞,流 式检测DCs中EGFP的表达情况。在脾脏和腹股沟淋巴中的CDllc+细胞中EGFP 的表达率分别为7.41% (如Figure 2.5A)和4.14% (如Figure 2.5B)o对比阴性 对照组脾脏和引流淋巴结内DCs中EGFP阳性的细胞比例具有显著性上调,说 明包载mRNA的CLAN注射到小鼠体内,可以被DCs捕获并吞噬,进而在DCs 的胞质中释放mRNA并翻译成具有功能性的蛋白质o

Figure 2.5 In vivo transfection of CLANmEGFP in DCs. (A) Fluorescence signal intensity and percentages of EGFP positive cells in CDllc+ cells in the spleen of mice treated with CLANihegfp i.v. (40 gg mEGFP per mouse). (B) Fluorescence signal intensity and percentages of EGFP positive cells in CD llc+ cells in lymph nodes of mice treated with CLANmEGFP (40 |ig mEGFP per mouse). Data are shown as mean  SD, n = 3; *P< 0.05, **P<0.01.

2.3.6 CLANmovA刺激体内DCs成熟并诱导CD8+T细胞增殖

接下来,我们检测CLANmovA在动物水平是否可以刺激DCs成熟。通过尾 静脉注射CLANmovA (mOVA剂量为2mg/kg)到C57BL/6小鼠体内,72h后收 集脾脏和引流淋巴结细胞,流式检测淋巴组织中DCs表明共刺激因子的表达情 况。如Figure 2.6A所示,脾脏DCs中CD80的表达增加约2,CD86的表达增 加约1.7倍。但是,引流淋巴结中表达CD80和CD86的CDllc+细胞百分比没有 显著增加(Figure 2.6B)C同时我们检测脾脏和淋巴结中总T细胞中CD8+CD69+ T细胞的百分比,女口 Figure 2.6C所示,在两种脏器里活化的杀伤性T细胞比例 分别为由3.19%增加至10.78%和5.69%至&42%。

为了进一步检测在体内抗原特异性T细胞的增殖情况,我们将CFSE染色的 OVA特异性的CD8+T细胞转输给C57BL/6小鼠,18h后将CLANmovA (mOVA 剂量为2 mg/kg)到注射小鼠体内,72 h后流式检测CFSE阳性T细胞的增殖情 况。如Figure 2.7A所示,未处理组和CLANbiank组T细胞增殖的百分比分别为 3.42%和 5.09%,而 CLANmovA组 T 细胞增殖的百分比为 15.6% (Figure 2.7B)O 基于这些结果,我们确定了系统注射的CLANmovA可以在体内通过抗原提呈细胞 有效内化,提呈功能性抗原肽并诱导OVA特异性CD8+ T细胞的有效活化和增 殖。Figure 2.6 CLANwova stimulates the maturation of DCs in vivo. Percentage of CD80 and CD86 positive cells in CDllc+ DCs in spleen (A) and inguinal lymph node (B) from C57BL/6 mice treated i.v. with CLANmovA. (C) Fraction of activated T cells (CD8+CD69+) in spleen and inguinal lymph nodes. Data are shown as mean 士 SD, n = 3; *P< 0.05, **P <0.01.

Figure 2.7 CLANmovA induces expansion of functional antigen-specific CD8+ T cells in vivo. (A)

Gating strategy and analysis of CFSE+CD8+ T cells C57BL/6 after adoptive transfer of OVA-specific TCR-transgenic CD8+ T cells and subsequent immunization with CLANmovA or control (CLANbiank). (B) Percentage of proliferative T cells in spleen. Data are shown as mean 土 SD, n = 3; *P< 0.05, **P < 0.01.

2.3.7 CLANmRNA预防小鼠肿瘤生长情况

接着,我们进一步评估了 CLANmow在激活适应性免疫后对肿瘤进展的影响, 以确认CLANmOVA作为肿瘤核酸疫苗在对抗恶性肿瘤方面的应用前景。在第0天, 第3天和第8天通过尾静脉注射PBS溶液,CLANmank或CLANmovA给C57BL/6 小鼠,该步骤作为肿瘤疫苗的接种过程。距离最后一次接种五天后,在小鼠体内 构建E G7-OVA淋巴瘤细胞皮下肿瘤模型(Figure 2.8A)°隔天监测肿瘤大小, 对肿瘤的生长情况进行统计学分析。如Figure2.8B所示,用PBS溶液和CLANbiank 处理的小鼠的肿瘤生长迅速,后期伴随着肿瘤的全身转移,相反,用CLAN^ova 免疫过的小鼠肿瘤生长相对缓慢,肿瘤生长抑制率为55.7%,肿瘤平均体积是空 颗粒组的31.2%,并且没有出现转移的现象。此外,治疗没有显着影响小鼠的体 重(Figure 2.8C)O

 

Day 0 3 8

1 i I

14 22

I I

  30

1

1 1 T

t t t

Injection of CLANmOvA

i.v.

I I

f i

  l
T

Incubation of E.G7- OW cells s.c.

Monitoring of tumor growth T

Analysis of immune cell populations

Figure 2.8 Antitumor efficacy of CLAN vaccines in the aggressive lymphoma model. (A) Schematic illustrating anti-tumor activity of CLANmovA in a murine lymphoma model.

(B) Tumor growth and (C) body weight of mice bearing E-G7-OVA tumors during treatment. Data are shown as mean 士 SD, n = 6; **P < 0.01.

23.8 CLANmRNA治疗后荷瘤小鼠免疫细胞亚群及其细胞因子分泌

为进一步判断实验组小鼠产生的抗肿瘤作用是否由于CLAN.OVA诱导激活 的抗原特异性T细胞反应,待阴性对照组小鼠肿瘤大小达到1500 mm3,牺牲小 鼠,分离脾脏、弓I流淋巴结和外周血的细胞,通过流式细胞术检测OVA特异性 T细胞比例和细胞因子的分泌情况。首先,我们使用四聚体H-2Kb/SIINFEKL (0%257一264 tetramer)检测 0% 特异性 CD8+ T 细胞的比例。如I Figure 2.9A - C 所示,与PBS组小鼠相比,CLANmOvA组小鼠的脾脏,弓I流淋巴结和外周血中

CD8+Tetramer+ T细胞的比例均有所增加(5.05%比1.91%, 8.70%比1.08%和 2.71%比0.76%)。其次,IFN-丫和TNF-a是评估CD4+T细胞是否产生强烈免疫 反应的关键指标,我们通过内标细胞因子的方法检测T细胞的细胞因子分泌,如 Figure 2.9D-F所示,在脾脏、引流淋巴结和外周血中的CD4+T细胞中,CLANm0VA 组IFN-y和TNF-a的分泌量与阴性对照组有显著性差异。综上所述,证明CLAN 是有效的mRNA疫苗递送体系。2.4本章总结

我们利用CLAN递送编码TAA的mRNA到抗原提呈细胞,TAA抗原肽的 提呈激活抗原特异性的适应性免疫反应,用于对侵袭性肿瘤的预防。我们在体外 和体内水平证实包载mRNA的CLAN能有效刺激DCs的成熟并促进抗原特异性 T细胞的增殖和活化。更重要的是,CLANxbova在侵袭性E.G7-OVA淋巴瘤模型 中表现出良好的肿瘤预防效果。总而言之,我们的研究表明CLAN是适合作为 体内mRNA疫苗递送的平台,具有广阔的临床转化前景。未来我们需要更全面 的研究,例如证明纳米颗粒表面特性如何影响其在免疫细胞群体中的生物分布, 以优化和开发用于增强mRNA疫苗递送的下一代莫CLANS

附录A主要仪器设备

附录A主要仪器设备

1) 普通PCR仪:德国Biometra公司,型号TPersonal;

2) 水平电泳槽:上海天能科技有限公司,型号VE-186;

3) 垂直电泳槽:上海天能科技有限公司,型号VE-180;

4) 电泳仪:上海天能科技有限公司,型号TanonEPS300;

5) 凝胶成像系统(Gel imaging system): _h海天能科技有限公司,型号Tanonl600;

6) NanoDrop 2000 微量分光光度计:美国 Thermo Scientific 公司,ND-ONE-W;

7) 超声细胞破碎仪:美国Sonics Materials公司,型号VCX130;

8) 旋转蒸发仪(Rotavapor):瑞士 BUCHI公司,型号R・3;

9) 真空泵(Vacuum Pump):瑞士 BUCHI 公司,型号 V-700;

10) 动态光散射仪(Dynamic light scatterings DLS):英国 Malvern 公司,型号 Zeta sizer Nano ZS90;

11) 二氧化碳细胞培养箱:美国Thermo Scientific公司,型号3111;

12) 生物安全柜:美国Thermo Scientific公司,型号1300-A2;

13) 超净工作台:上海智诚分析仪器制造有限公司,型号:ZHJH-C1209B;

14) 流式细胞检测仪:美国BD Bioscience公司,型号FACS Calibur, FACS Verse;

⑸ 多功能微孔检测系统(酶标仪):美国Biotek公司,型号Cytation5;

16) 化学发光成像仪:美国GE Healthcare Life Sciences公司,型号Image Quant LAS 4000 mini;

17) 涡旋振荡器:德国IKA公司,型号Genius3;

18) 小型高速离心机:德国Eppendorf公司,型号5424R;

19) 倒置显微镜:日本光学工业株式会社,型号NikonTSlOO;

20) 激光共聚焦扫描显微镜:德国Carl Zeiss公司,型号LSM710;

21) 分析天平:岛津有限公司,型号:AUY120;

22) pH 计:Mettler-Toledo 公司,型号:Delta320;

23) 游标卡尺:大阳量具有限公司,型号:1131451;

24) 高压灭菌锅:HIRAYAMA公司,美国,型号HVE-50;

附录B常规试剂

  • DMEM (DulbecccTs Modified Eagle Medium) : Invitrogen 公司,美国;
  • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) -1640:Invitrogeii 公司,美国;
  • 胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS) : Hyclone 公司,美国;
  • 青霉素■链霉素混合溶液(双抗):美国Thermo Fisher Scientific公司
  • 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA):上海生工生物工程有限公司;
  • 胰蛋白酶(Trypsin-EDTA, 25%) : Invitrogen 公司,美国;
  • AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit (基因组 DNA 提取试剂盒): Coming Life Sciences 公司,美国;
  • AxyPrep PCR Cleanup Kit (PCR 纯化试剂盒):Coming Life Sciences 公司, 美国;
  • 氯仿(CHCh)、二甲亚枫(DMSO):上海国药集团化学试剂有限公司;
  • 琼脂糖:上海生工生物工程有限公司;
  • RIPA细胞裂解液:上海碧云天生物技术有限公司;
  • 乙酸乙酯:上海国药集团化学试剂有限公司;
  • Gelred:上海生工生物工程有限公司;
  • DEPC水:上海生工生物工程有限公司;
  • N, 亚甲基双丙烯酰胺:上海生工生物工程有限公司;
  • Tris:Sigma-Aldrich 公司,美国;
  • 浓盐酸:国药集团化学试剂有限公学司;
  • 甘氨酸(Glycine):上海生工生物工程有限公司;

1 刃过硫酸钱(Ammonium persulfate, APS ) : Sigma-Aldrich 公司,美国;

  • 丙烯酰胺:上海生工生物工程有限公司;
  • 甘油:上海生工生物工程有限公司;
  • 漠酚蓝(Bromo phenol blue, BPB):上海生工生物工程有限公司;
  • 无水乙醇:上海国药集团化学试剂有限公司;
  • Tween-20:Sigma-Aldrich 公司,美国
  • TEMED (Tetramethylethylenediamine) : Sigma-Aldrich 公司,美国;
  • 叶藐基乙醇:Sigma-Aldrich公司,美国;
  • Goat anti-mouse-IgG-HRP 二抗:Santa Cruz Biotechnology 公司,美国;
  • Pierce BCA Protein Assay Kit:Thermo Fisher Scientific 公司,美国;
  • PVDF (Poly vinylidene fluoride)膜:Merck Millipore 公司,美国;
  • Fast Start Universal SYBR Green Master ( ROX) : Roche 公司,美国;
  • 4%多聚甲醛溶液:上海生工生物工程有限公司;
  • 蛋白酶抑制剂:美国Roche公司;
  • 胰蛋白腺(Tryptone) : Thermal Scientific 公司,美国;
  • 酵母提取物(Yeast extract) : Thermal Scientific 公司,美国;
  • NaCl:Sigma-Aldrich 公司,美国;
  • 柠檬酸:上海阿拉丁试剂有限公司;
  • KC1:上海国药集团化学试剂有限公司;
  • Na2HPO4:上海国药集团化学试剂有限公司;
  • KH2PO4:上海国药集团化学试剂有限公司;
  • Na2EDTA>2H2O:上海国药集团化学试剂有限公司;
  • 硼酸:Sigma-Aldrich 公司,美国;
  • 甲醇:上海国药集团化学试剂有限公司;
  • TritonX-100:上海生工生物工程有限公司;
  • 红细胞裂解液:碧云天生物技术有限公司
  • DAPI (4\6-diamidino-2-phenylindole) : Thermo Fisher Scientific 司,美国;
  • PBS缓冲液,北京中杉金桥生物技术有限公司;
  • Fluoromount-G 荧光封片剂:Invitrogen 公司,美国;

附录C常用试剂的准备

  • 10% (w/v) SDS:称取lOgSDS置于200mL烧杯中,加入80mL的去离子 水,68 OC加热溶解,滴加浓盐酸调节pH至2,加入去离子水定容至100 mL,保存于室温;
  • 50xTAE 缓冲液(pH8・5):称取 242 g Tris、2 g Na2EDTA-2H2O 置于 1 L烧杯中,加入800mL的去离子水,充分搅拌溶解,加入57.1 mL的醋酸, 充分搅拌,加入去离子水定容至1 L,保存于室温;
  • 10 x MOPS buffer:称取8 g MOPS置于1L烧杯中,加入700 mL的去离 子水,充分搅拌溶解,加入2 N NaOH调节pH至7.0,再加入20 mL 1 M NaOAc和20mL0・5 MEDTA,加入DEPC水定容至1 L,避光保存于室温;
  • LB/Amp 培养基:称取 10 g Tryptone、5 g Yeast extract> 10 g NaCl 置于 1 L 烧杯中,加入800 mL的去离子水,充分搅拌溶解,加入NaOH调节pH至 0,加入去离子水定容至1 L,高温高压灭菌,冷却至室温,加入1 mL Ampicillin (100 mg/mL)后混匀,4 °C 保存;
  • 10xHank,s 液:称取 KH2PO46g, NaCl 80 g, NaHCOs 3.5 g, KC14g,葡 萄糖lOg, Na2HPO4H2O0.6g,加入去离子水定容至1 L;注:Hankt液不 可以高压灭菌,4七下保存;
  • FACS缓冲液:取10 x Hank's液100 mL,称取叠氮化钠(NaNs) 1 g,牛血 清白蛋白(BSA) lg,加入去离子水定容至1L;
  • 30% (w/v)丙烯酰胺溶液:称取29g丙烯酰胺、IgN, 亚甲基双丙烯酰

胺于200 mL烧杯中,加入60 mL去离子水,充分搅拌溶解,加入去离子水 定容至100 mL,避光,4。(2保存;

  • 10% (w/v)过硫酸鞍:称取1 g 硫酸鞍置于1.5mLEP管中,加入1 mL 去离子水溶解,4「C保存,注意有效期为2周以内;
  • Western 膜转移液:称取 9 g Glycine、5.8 g Tris、0.37 g SDS 置于 1 L 烧杯 中,加入600mL的去离子水,充分搅拌溶解,加入去离子水定容至800mL 后,加入200mL甲醇,室温保存;
  • Western 膜清洗液(TBST):称取 &8 g NaCl、20mLlM Tris-HCl 置于 1 L 烧杯中,加入800 mL的去离子水,充分搅拌溶解,加入5 mL Tween-20, 充分混匀,加入去离子水定容至1L,室温保存;
  • Western封闭液:称取4 g BSA置于200 mL烧杯中,加入60 mL的Western 膜清洗液,充分搅拌溶解,加入Western膜清洗液定容至10mL;

⑵ Western抗体稀释液:称取0.5 g BSA置于100 mL烧杯中,加入30 mL的 Western膜清洗液,充分搅拌溶解,加入Western膜清洗液定容至50 mL;

13)常用的SDS-PAGE浓缩胶和分离胶的配方:

浓缩胶配方(2mL):

试剂 使用量®L)
30%丙烯酰胺溶液 325
1 M Tris-HCl (pH6.8) 250
ddH2O 1375
10%SDS 20
10%APS 20
TEMED 2

 

10%分离胶配方(10mL):

试剂 使用量(mL)
30%丙烯酰胺溶液 3.3
lMTris-HCl (pH6.8) 2.5
ddH20 4.0
10%SDS 0.1
10%APS 0.1
TEMED 0.04

 

附录D常规实验方法

1.中抽质粒

1) 摇菌:将500 pL含有目的质粒的菌液加到500 mL灭菌放凉后的LB培 养基中,37汇、200r/min摇菌约13h。如需冻存菌液,则在生物安全柜 中,吸取700 zL菌液到无菌冻存管中,而后再加入500 yL80%甘油,混 匀,放于・80 C保存。

2) 收菌:取摇菌扩增后的菌液,8000 g, 4 °C离心10mine

3) 重悬:离心后弃上清,每500mL的菌液离心下来的细菌加入8-lOmL添 加了 RNaseA的RES-EF重悬,缓慢吹开,不要残留小块。

4) 裂解:加入8-lOmLBufferLYS-EF裂解细菌,先剧烈振摇30s,然后室 温静置3-5mine裂解液最好提前放到37 °C环境中加热以优化裂解效果。

5) 中和:加入8-10 mL Buffer Neu-EF中和裂解反应,先剧烈振摇30 s,然 后冰上静置3-5 min,待形成稳定分层,上层为杂质碎片,下层为液体。

6) 平衡:在中和的过程中,装好Nucleo Bond Xtra Column,沿内层过滤膜 的顶端加入15 mL的EQU-EF,使柱子完全湿润、平衡。

7) 过滤:吸取中和反应后的下层液体加入到柱子的内层过滤膜中,依靠重 力作用过滤,过滤时要避免上层的细菌碎片杂质堵住滤膜。

8) 洗涤过滤膜及过滤柱:沿滤膜外沿四周加5 mL的FIL-EF,洗涤第一次, 而后丢弃过滤膜。

9) 洗涤过滤柱2:每管加入35mL的ENDO-EF,以去除内毒素,重力作用 下洗涤第二次。

10) 洗涤过滤柱3:每管加入15 mL的WASH-EF,洗涤第三次。

11) 洗脱:每管加入5mL的ELU-EF,用一个新的管子收集洗脱液。第二章 材料和方法

12) 沉淀质粒:在洗脱液中加入3・5mL异丙醇,混匀,15000 g、4七离心30 mine离心完成后,可以看到离心管底部有质粒沉淀。

13) 洗涤质粒:弃去离心后的上清液,用2mL70%乙醇洗涤质粒,16000g、 室温离心10 min收集质粒。

14) 于超净工作台内,弃去离心后的上清液,放置5 min左右,待乙醇完全 挥发。

15) 每管加入1 mL的TE Buffer溶解质粒。

16)分光光度计检测质粒浓度,而后0.8%琼脂糖凝胶电泳确认质粒大小,并 将剩余质粒按需要分装后置于・80七冰箱保存、待用。

  1. 体外诱导培养小鼠骨髓来源的树突状细胞

1) 小鼠(6・10周龄)颈椎脱臼法处死,手术取出所有股骨和胫骨,并剪刀和 银子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净;

2) 将骨移至超净台内,并用盛有70%酒精的无菌培养皿浸泡2-5min,以消 毒灭菌,然后用无菌的PBS洗2次;

3) 将骨移入另一个盛有PBS的新培养皿中,用剪刀剪去骨两端,再用注射 器抽取PBS,针头分别从骨两端插入骨髓腔,反复冲洗出骨髓至培养皿 中,直至骨完全变白;

4) 收集骨髓悬液,用200目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织;

5) 滤过液1200 r/min离心5 min,弃上清;

6) 加入2 mL红细胞裂解液,重悬细胞,室温孵育3-5 min,最长10 min;

7) 加入10 mL PBS中和裂解液的作用,然后1200 r/min离心5 min,弃上 清;

8) PBS洗1次,然后用含10%FBS的RPMI1640培养液重悬细胞,至此已 获得小鼠骨髓细胞;

刃 将获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS的RPMI 1640完全培养液 调整细胞浓度为1 x 106个/mL;

10) 铺至24孔培养板内,每孔1 mL细胞,同时加入重组小鼠GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10ng/mL), 37 °C, 5% CO2培养箱培养,此为培养的第0 天;

11) 每2天轻轻摇晃培养板,然后3/4体积更换新鲜培养液,并补足细胞因 子。以去除悬浮的粒细胞和淋巴细胞;

12) 在培养的第4天,可以看到聚团生长的DC贴附于板底,第6天则可观 察到很多DC成集落生长;

13) 在第6天之间,轻柔吹打培养液,收集悬浮细胞及藐松贴壁生长的细胞;

14) 此时的细胞已经是BMDC,但成熟度不高,所以需要后续的再铺板步骤 使其更成熟;

15) 吸出培养液(含DC细胞)的24孔培养板需补充新鲜的含重组小鼠GM・ CSF(20 ng/mL)和 IL-4(10 ng/mL)的 RPMI1640 完全培养液,继续培养, 以便后面能够再次收集BMDCo 1200 r/min离心5 min,弃上清;

16) 用含10%FBS的RPMI1640完全培养液重悬细胞并计数,然后调整细胞 浓度至1 x 106个/mL,并加入重组小鼠GM-CSF(20 ng/mL)和IL-4(10 ng/mL);

17) 细胞铺板至100 mm培养皿(每皿最多10 mL)或6孔培养板(2 m/孔)。 37 °C, 5%CO2培养箱继续培养2天;

18) 收集悬浮细胞,即为较成熟的BMDC;

19) 再铺板后的3h内可见许多棘状贴壁细胞从DC簇中迁移出来,而培养1 天后会发现这些贴壁细胞从培养板底脱离,而且可以看见在培养液中漂 浮着许多典型的DC。

  1. 免疫荧光染色

1) 将玻片置于无水乙醇中,使用小蹑子小心从乙醇中夹起盖玻片的边缘, 在空中静止几秒,使大部分的乙醇滴下,仅在盖玻片上保留少量乙醇并 均匀润湿玻片,将玻片快速从酒精灯上通过,使玻片上的乙醇燃烧,从 而使玻片无菌,并小心放置在24孔板中;

2) 将消化成单细胞悬液的细胞计数,用相应培养液配制成所需要的细胞密 度溶液(通常密度为10%nL),取500 pL该溶液,加入到上述含有玻片 的孔内,在培养箱内,通过“顺时针旋转■前■后•左■右”摇晃细胞培养板的 方式将细胞均匀铺在盖玻片上;

3) 置于二氧化碳细胞培养箱内培养24 h,然后加入药品处理;

4) 在药品处理细胞指定时间后,除去培养液,加入500yLlxPBS,清洗细 胞两次;

5) 加入500 yL 4%多聚甲醛溶液,盖上盖子,避光室温放置10 min;用于 固定细胞骨架;

6) 除去多聚甲醛溶液,加入500 gLlxPBS,清洗细胞两次;

7) 加入200^L0.1%TritonX-100,避光室温放置5min;除去该溶液,加入 500 gL lxPBS,清洗细胞两次;

8) 加入200pLl%BSA溶液,室温避光放置20 min;

9) 除去上述溶液,无需清洗,直接加入200 pL 165 nM的Alexa Fluor 568 Phalloidin染液,室温避光放置20mm;除去该溶液,加入500 yL lxPBS, 清洗细胞,两次;

10) 加入200 pL DAPI染液,室温避光放置3 min;加入500 pL lxPBS,清 洗细胞两次,并将玻片浸泡在PBS溶液中;

11) 用10 yL移液器将10 piL抗荧光淬灭封片液小心滴在载玻片上,勿产生 气泡;

12) 在铁制品上将5 mL注射器针头针尖部位压平,左手使用该针头小心将 孔内玻片勾起,右手拿小弯银子夹起玻片边缘,在滤纸上控去大部分溶 液,小心使盖玻片的含细胞面的一端边缘先接触载玻片上的封片液,再 缓慢放下盖玻片,勿使产生气泡;

13) 将制备好的样品盖玻片朝上水平放置在切片盒中,避光放置在4・C冰箱, 使封片液自动晾干后,可进行后续激光共聚焦观察。

  1. 免疫印迹法(Western Blot)

1) 蛋白样品的提取:使用上海碧云天公司的RIPA细胞裂解液对细胞中的 蛋白进行提取,每5x105个细胞中加入100 gL的RIPA细胞裂解液,用 移液器吹打均匀后,于冰上裂解30 min,每隔10 min涡旋振荡1次, 14000 g, 4七离心15 min,小心吸取上清;

2) 蛋白浓度的检测:使用BCA蛋白定量分析试剂盒对收集的蛋白样品进行 检测,具体步骤如下:

a) 梯度稀释BSA标准品:将BSA标准品(2mg/mL)分别使用稀释液 稀释至 BSA 的终浓度为 1.5 mg/mL、1.0 mg/mL、0.75 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL> 0.125 mg/mL> 0.025 mg/mL;

b) BCA工作液:将试剂盒中的试剂A与试剂B按照50:1的比例混合, 制备得到工作液;

c) 取各稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各25 yL,加入至96 孔板中;

d) 每个孔中加入200 ixL工作液,震荡器上震动混匀30 s; 37 °C孵育 30 min;

e) 将96孔板取出,冷却至室温后,使用酶标仪检测样品在540 nm的 吸光值;

f) 将各个标准品和待测蛋白质的吸光值减去空白标准品的吸光值;

g) 绘制BSA标准品的标准曲线,使用四参数二次方程进行曲线拟合, 根据待测蛋白质的样品的吸光值计算其对应的蛋白浓度。

3) 蛋白样品的制备:取出含有50 gg的蛋白裂解液,加入蛋白裂解液调整 体积至10此,加入2此的5 x SDS-PAGE上样缓冲液,混匀后,95 °C 加热15 min,然后放在冰上待用;

4) 按照附录C中的方法配制浓度为10%的分离胶,5%的浓缩胶,胶的厚度 均为1.5 mm;

5) 蛋白样品的上样及电泳:SDS-PAGE胶做好后连同玻璃板一起安装到电 泳槽上,加入SDS-PAGE电泳缓冲液后开始准备上样。用10 pL移液器 吸取蛋白样品,注意不要吸进气泡。将10 yL枪头插至加样孔中缓慢加 入样品,在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。将电泳缓冲液加满 整个电泳槽,按照电极顺序连接好电泳槽及电泳仪,选择为恒压模式, 电压设为90 V,电泳15 min,至样品已被浓缩与分离胶和分离胶的交界 处,将电压增大至120V,电泳lOOmin左右,至漠酚兰刚跑出即可终止 电泳,进行转膜;

6) 转膜:电泳结束后,将玻璃板取下,置于装有转膜液的槽中将玻璃板撬 开才可剥胶,撬的时候动作要轻,除去小玻璃板后,将上层的浓缩胶刮 去。在加有转膜液的培养皿里放入裁好的胶、浸过乙醇的PVDF膜、滤 纸和海绵,平衡5 min;平放转膜夹,黑色面在下,透明面在上,依次叠 放海绵、4张浸泡过转膜液的滤纸、完成电泳的凝胶、PVDF膜、4张泡 过缓冲液的滤纸和海绵。使用移液管在叠层的滤纸上滚动,除去气泡。 注意每叠一层就要用移液管赶去气泡,将转膜夹安装于转膜架中,置于 电泳槽中,加入预冷的转膜液,同时在电泳槽的空隙处放置合适大小的 冰盒,连接好电泳槽及电泳仪,进行电泳;选择恒流模式,300mA,根 据转膜的蛋白的分子量决定转膜时间,一般多少kD的蛋白就转多少分 钟,再根据结果调整时间。之后断开电源,取出PVDF膜,注意通过在 左上角剪角的方式标记膜上接触蛋白的正面;

7) 封闭:将PVDF膜移至含有封闭液的平皿中,正面向上,室温下脱色摇 床上摇动封闭2 h;

8) 封闭结束后,按照蛋白marker及目的条带的位置,将PVDF膜剪开;

9) 按照抗体说明书推荐的稀释比例,使用稀释液稀释一抗,分别孵育含有 目的蛋白或内参蛋白的PVDF膜于一抗稀释液中,4。(3孵育过夜;

10) 二抗孵育:一抗封闭结束后,使用PBST洗涤膜3次,每次5 min,按照 1:5000的比例稀释对应的二抗,然后将PVDF膜转移至二抗孵育液中, 脱色摇床上室温孵育45 min;

11) 化学发光显色:二抗孵育结束后,使用PBST洗涤膜3次,每次5 min, 使用ECL显色试剂盒进行化学发光显色,使用GE Healthcare公司的 Image Quant LAS4000化学发光成像系统进行曝光显影。

  1. T细胞磁珠分选

1) 无菌分离淋巴细胞,尽量保持细胞状态良好;

2) 小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉使放血充分,摘取脾脏。用注射器柄将脾 脏一点一点磨碎(尼龙网辅助),将研磨液通过200目尼龙网过滤至15 mL离心管中,450g离心5min收集细胞。2mL红细胞裂解液裂解脾脏 红细胞,冰上lOmino (视细胞数量和裂解液品牌而定)加满1 xPBS终 止,450 g x 5 min,离心收集细胞。lOmLlxPBS重悬细胞后,再次通 过200目尼龙网过滤至新的15 mL离心管中;

3) 根据实验需要获取待纯化的细胞到15 mL离心管中,300g离心lOmin, 弃上清,收集细胞;

4) 微珠标记(此处以CD8a为例),每1 x IO?细胞用95 gL MACS buffer 重悬。每1 x IO?细胞加入5 pL anti-CD8a微珠,4弋标记15 min,或冰 上 20 min;

5) 加满MACS buffer清洗,去除未标记上的微珠,300 g离心lOmin,弃上 清,收集细胞;

6) MACS buffer重悬细胞,以1x10*细胞/500吐体积进行。如果不足1 x 10*细胞也按照500 pL体积进行,如果多于1 x 10*细胞则倍比增加;

7) 磁珠分离,根据细胞数选择合适的分选柱,将分选柱放在分选器上,将 2层200目尼龙网置于分选柱上,用MACS buffer对柱体进行润洗(将 MACS buffer从尼龙网中间加,注意不要挂到柱体壁上),分选柱下面用 新的15 mL离心管收集。润洗体积:MS为500 gL, LS为3 mL;

8) 待MACS buffer不再流岀时,将重悬好的细胞通过2层200目尼龙网加 入分选柱中,收集留下来的未被标记的细胞;

9) 合适体积的MACS buffer对分选柱中的细胞进行清洗,MS为500 yL, LS为3mL,重复3次。同样收集未被标记的细胞;

10) 向分选柱中加入合适体积的MACS buffer, MS为1 mL, LS为5mL,然 后将分选柱从分选器上取下,放在15 mL离心管上,利用配套的推柄将 分选柱中的液体迅速推出到15 mL离心管中;

11) 离心收集细胞计数,进行之后的实验。分选后流式检测细胞纯度。

  1. CFSE染色

1) lxPBS重悬分选出的淋巴细胞,标记浓度范围能够从lxl06/mL (体外 培养)至5 x 107/mL (转输);

2) 对于低浓度的细胞(不足5 x 107/mL),在标记溶液中加入低浓度的蛋 白质(0.5% FBS)有助于减少CFSE的细胞毒性。这种毒性虽然不会诱 导细胞死亡,但是会抑制正常的细胞分裂;

3) 培养基中存在的游离氨基酸同样会导致第一代的CFSE荧光不足,进而 导致能够区分的细胞增殖代数减少。高浓度的细胞需要直接用1 x PBS 重悬进行标记;不要使用含有5%以上的血清的缓冲液重悬细胞,用于 CFSE标记,这样会导致标记效果极差,不要忘记了 CFSE的标记原理;

4) 用1 x PBS稀释DMSO溶解的CFDA-SE成为2 x即用型缓冲液,每管 500 gLo细胞少于5 x 106,建议使用1或2 yM的标记终浓度,那么预 先配置2或4 yM的工作液。细胞大于5 x 107,建议使用5问的标记终 浓度,那么预先配置10 yM的工作液;

5) 在Ep管中收集细胞沉淀,用500pL的"PBS充分重悬细胞,加入500 pL的2x即用型CFDA-SE染色缓冲液,轻柔而快速地充分混匀,一定 浓度的荧光染料迅速同细胞的接触,才能保证初代细胞(G0)荧光值的 均一;

6) 将细胞在37 £细胞培养箱中避光标记10 min;

7) 用含有10%FBS的PBS洗细胞,3000 g离心2 min,洗2遍;

8) 将细胞重悬在1 mL含有10%FBS的T细胞培养液中,37七孵育5 mino 细胞计数,准备加样;

9) 调整培养细胞浓度和实验准备:以BMDC (效应细胞)对CD8+T细胞

(靶细胞)的活化作用实验为例,对加样策略给予建议;

10) 阳性对照:a-CD3和a・CD28活化T细胞;

11) 提前约15 h进行anti-CD3包板:用PBS将anti-CD3稀释至5 pg/ mL, 吸取60吐到圆底96孔板中,4七孵育;

12) 细胞培养前,吸去anti-CD3抗体,并用PBS洗板三次;

13) 将纯化得到的CD8+T细胞1 x 106/孔加到包被了 anti-CD3的96孔板中, 并往培养基中加入 1 pg/mL 的 anti-CD28> 100U/mL 的 IL・2, 37。(3、5% CO2条件下培养72 h;

14) 实验组:BMDC与T细胞共培养

15) BMDC与肿瘤抗原共培养48 h后观察形态或流式检测其活化程度

16) 调整效应细胞浓度为1x10* mL。调整标记CFSE之后的靶细胞浓度为1 x 106/mL;

17) 96孔板加样培养细胞,并做好记录,每孔加入什么细胞,什么刺激剂, 需要事先设计好;

  • 在培养板周围加入一圈1 x PBS防止边缘位置的孔液体过度蒸发,影响 孔间平行性。培养72 h之后收集细胞进行检测。
  1. 流式细胞术检测细胞因子

1)取分离得到的细胞或培养的细胞,调节细胞浓度至1 OOgLlxPBS中约1

X 106 个,用 1 mL DMEM 培养基重悬,并加入 Cell Activation Cocktail

(withBrefeldinA) , 37°C> 5%CO2条件下于培养板中刺激培养细胞6

  • 加入10 pL大鼠血清到细胞悬液中,混匀,4£环境下孵育30mine
  • 加入相应的外标流式抗体,混匀,4 £环境下避光孵育30 mine
  • lxPBS洗细胞一次,4000r/min离心5 min,弃去上清,细胞沉淀用100 “L固定液重悬,4环境下避光固定30 min。
  • lx穿膜液洗细胞一次,6000r/min离心5 min,弃去上清,细胞沉淀用100 yL穿膜液重悬,并加入10吐大鼠血清,混匀,4 £环境下避光孵育30 min。
  • 加入相应的内标流式抗体,混匀,4七环境下避光过夜孵育。
  • 1 xPBS洗细胞一次,8000r/min离心3 min,弃去上清,细胞沉淀用200 吐1 "BS重悬,用200目尼龙网过滤转到流式管中,流式细胞仪检测。

 

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致谢

时光如逝,转眼间三年的研究生生涯即将落下帷幕,这是一段成功与喜悦、 失败与迷茫交替生长的旅程。幸得师长指引、父母支持、朋友陪伴,让我有勇气 面对一切挫折和挑战。这几年的点点滴滴都将成为我人生中宝贵的经历与财富。 在此我要真诚的感谢每一位给与我关怀与帮助的人。

首先感谢我的导师王均教授,感谢他在学习及生活中给与我的指引与帮助。 我非常敬佩王老师严谨务实的研究精神与诲人不倦的优良美德。在这三年的时间 里,王老师教会我的不仅是做学问的态度,更重要的是他以身立行的做人风格使 我明白了如何待人接物、为人处事,更让我懂得该如何规划自己的人生,这将深 刻影响我今后的工作和生活。我将在接下来的学习和生活中,继续努力,不断锤 炼自己、超越自己,让自己变得更加优秀。王老师深厚的学术功底,敏锐的科学 洞察力,独到的见解使我受益良多,论文从开题、初稿到定稿,王老师都给予了 细心的指导,在实验结果的讨论、论文的结构、撰写和修改等方面都提出了宝贵 的意见和建议。在此,向他致以最诚挚的感谢!

其次非常感谢沈松博士和李敏博士悉心指导我的课题,提出了很多中肯的建 议了,帮我解决了很多问题。

感谢王育才教授、都小姣副教授、李洪军师兄、许从飞师兄、曹志婷师姐、 王继龙师兄、柳岸师姐、罗英丽师姐、刘晶师姐、蒋为师姐、王立师兄、赵阳阳 师兄、李舒雅师姐、陈凯歌师兄、张厚兵师兄、陈之尧师兄、张垢、甘蕴久、赵 贵等同学的在实验和生活中对我的帮助和包容,他们教会了我很多知识,让我获 益匪浅。

感谢朱艳华老师和陈雨老师在实验室日常生活和管理中为我提供的帮助。

感谢中国科学技术大学三年的培养,我会永远为自己是“红专并进,理实交 融汀的科大人而引以为傲。

感谢NIH中心提供的Tetramero

感谢廉哲雄教授实验室的慷慨惠赠的小鼠。

感谢科技部、教育部、中国科学院和和国家自然科学基金委员会的资助。

感谢我的家人,你们始终给我温暖,在我低落彷徨时激励我勇敢向前。感谢 你们,你们始终是