酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群的影响论文

2020年4月14日17:57:50酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群的影响论文已关闭评论

酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群的影响论文

Effect of Koumiss on the Gut Microbiota in Patientswith Chronic Atrophic Gastritis

慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis, CAG)是一种慢性消化系统疾 病,被认为是胃癌的癌前状态,是临床研究的热点。“酸马奶疗法”是蒙医学中治 疗慢性萎缩性胃炎的有效方法之一,具有控制病情发展、减少复发等效果,但有关 CAG治疗机理的报道较少。

本研究以10名慢性萎缩性胃炎患者为研究对象,采用“酸马奶疗法”对其进行 治疗。试验期间检测患者第0天和第60天的临床症状评分和血液生理生化指标,同 时采用PacBio SMRT测序技术分析三个时间点(第0天、30天和60天)的酸马奶 细菌多样性和四个时间点(第0天、30天、60天及停止饮用30天)的患者肠道菌 群,进而研究饮用酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群的影响。结果如下:

  1. 患者饮用的酸马奶中,优势菌属为乳杆菌属〈Lactobacillus',优势菌种 为瑞士乳杆菌 J Lactobacillus helveticus^) □
  2. 饮用酸马奶期间患者临床症状评分、血小板计数和总胆固醇含量显著降低 5 < 05) o
  3. 饮用酸马奶后,慢性萎缩性胃炎患者的肠道菌群结构发生变化。具有降解胆 固醇功能的单形拟杆菌Bacteroides uni form is产丁酸的罗斯氏菌属

{Roseburia}、直肠真杆菌 JEubacteriunirectale和普拉梭菌 QFaecalibacterium prausnitziD等有益菌的相对含量增加,副拟杆菌属IP&Fabacteroides、志贺 氏菌属QShigella等条件致病菌的相对含量减少,但停止饮用后部分菌群趋于恢 复到原始水平。

  1. 肠道菌群与血液生理生化指标的相关性分析结果发现12个菌属和13个菌种 与血液生理生化指标显著相关,其中拟杆菌属J Eacteroids、瘤胃球菌属Rumi nococcus'、多氏拟杆菌JB&cteroides dore£等与白细胞数、尿酸、红细 胞数、血红蛋白水平等血液指标呈正相关(门〈0.05),罗斯氏菌属、栖粪杆菌属 (Faecalibacteriuin、韦荣球菌属(Veillonella)、粪便普氏菌(Prevotella coprD 等与白细胞数、血红蛋白水平、血小板计数等血液指标呈负相关(p < 0.05),表 明患者的血液指标的变化与肠道菌群的改变有一定关系。

本研究结果表明饮用酸马奶可以影响慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群结构,提高 肠道中有益菌的相对含量,改善其临床症状。本研究以肠道菌群为基础,结合临床 症状评分和血液生理生化指标揭示了饮用酸马奶缓解慢性萎缩性胃炎患者症状的机 理,为今后临床上采用酸马奶治疗CAG奠定理论依据。

关键词:慢性萎缩性胃炎;酸马奶;肠道菌群;PacBio SMRT测序技术

Effect of Koumiss on the Gut Microbiota in Patients with Chronic
Atrophic Gastritis

Abstract

Chronic atrophic gastritis (CAG) is a chronic digestive system disease, which is considered as the precancerous state of gastric cancer and has become a hot research topic in clinical practice. The koumiss is one of the effective methods for treating CAG in Mongolian medical profession It has the effects of controlling the development of the disease and reducing recurrence, but there is few reports on the mechanism of koumiss in treating CAG

In this study, koumiss was used to treat 10 patients with CAG We detected the clinical symptom scores, blood physiological and biochemical indexes of the patients on day 0 (before drinking) and day 60 (during drinking). Meanwhile, PacBio SMRT sequencing technology was used to analyze the bacterial diversity of koumiss at three time points (day 05 day 30 and day 60) and the gut microbiota of the patients at four time points (day 0, day 30, day 60 and day 30 when drinking was stopped). This study revealed the influence of drinking koumiss on gut microbiota in patients with chronic atrophic gastritis. The results are as follows:

  1. The dominant genus and species in the koumiss are Lactobacillus and Lactobacillus helveticus
  2. The patients1 symptoms rating, platelet count and total cholesterol was significantly decreased after drinking koumiss (p <05).
  3. Drinking koumiss changed the gut microbioal structure of patients with CAG The relative abundance of some beneficial bacteria, Bacteroides uniformis with cholesterol degrading and produced-butyric acid such as Roseburia^ Eubacterium rectale^ Faecalibacterium prausnitzii increased during drinking koumiss. While the relative abudance of disease-related bacteria such as Parabacteroides and Shigella decreased in the gut microbiota・ While some bacteria will return to their original levels after stopping drinking.
  4. The correlation analysis results between gut microbiota and blood indexes showed that 12 bacteria genera and 13 bacteria species were significantly correlated with blood physiological and biochemical indexes. Bacteroides^ Ruminococcus^ Bacteroides dorei were positively correlated with blood indexes such as WBC, UA, RBC and HGB (p < 05). Roseburia. Veillonella, Prevotella copri were negative correlaed with blood indexes such as RBC, HGB and PLT (p < 0.05). It shows that the changes of blood indexes of CAG patients are related to the changes of gut microbiota.

In summary, these results showed that drinking koumiss affects the gut microbiota of patients, and increase the relative content of beneficial bacteria and relieving the patients1 symptoms and possibly improving CAG. Based on gut microbiota and combined with clinical indicators of patients, this study reveals the mechanism of drinking koumiss to alleviate the symptoms of patients with CAG, which is meaningful to treat CAG with koumiss in clinical practice.

Key Words: Chronic atrophic gastritis; Koumiss; Gut microbiota; PacBio SMRT sequencing technology

Di rected by: Prof. ZHANG Heping

App I i Cant for Master degree : Duo I ana      (Processing and Preservation Engineering of Agricultural

Products)

(College of Food Science and Engineering. Inner Mongolia Agricultural University. Hohhot 010018, China)

缩略语表

CAG (chronic at rophic gas trit is)

CAP (canonical analysis of principal coordinates)

Hp (力elicobacterpylori')

LEfSe (linear discriminant analysis effect size)

OTU (operational taxonomic units)

PCoA (principal coordinate analysis)

PERMANOVA (permutational multivariate analysis of variance)

SMRT (single molecule real time sequencing)

1引言

1.1慢性萎缩性胃炎

慢性萎缩性胃炎(Chronic atrophic gastritis, CAG)是胃黏膜上皮长期反复遭受 损伤导致的胃固有腺体萎缩、减少或变薄,幽门腺化生和/或肠腺化生等特征的一种 慢性消化系统疾病。1978年世界卫生组织确认CAG与胃癌的发生密切相关。目前 医学上认为,CAG的发生是在多种致病因素作用下的漫长疾病演变过程,CAG发 展情况可如下概括:正常胃黏膜―幽门螺杆菌感染-慢性非萎缩性胃炎-萎缩性胃 炎-肠上皮化生-上皮内瘤变-胃癌叫 因此该病被认为是胃癌的癌前状态,成为 临床上的研究热点。

1.1.1病因与发病机制

  • 幽门螺杆菌感染

幽门螺杆菌(Helicobdcterpylori, Hp)感染是CAG的主要病因,CAG的患病 率与Hp感染率呈正相关。Hp诱发患者发生CAG,由于持续的炎症反应,导致其 胃黏膜的正常结构被破坏。Hp感染者患CAG的几率明显高于未感染者。

  • 胆汁反流

胆汁酸反流进入胃中,破坏胃黏膜的屏障,引起炎症并出现腺体萎缩现象。陈 海金⑵对SD大鼠灌胃20 mmol/L的脱氧胆酸钠进行模拟胆汁反流实验,成功制备了 大鼠CAG的模型并证实了胆汁反流与CAG的关系。

  • 年龄

CAG的患病率与年龄呈正相关。随着年龄的增大,胃黏膜的保护因子变弱,使 免疫功能降低,从而导致CAG的患病率增高。CAG常见于老年人,0-50岁CAG 患病率为9%, 51-65岁患病率达到50%以上⑶。

  • 饮食因素

胃在消化系统中具有重要的地位,饮食与胃部的健康息息相关。不规律饮食, 食用过咸、过热的食物,频繁喝酒和长期吸烟等均会升髙发生CAG的几率。Lucy 等⑷发现人们食用杂粮、蔬菜和水果过少与CAG的患病率密切相关。

1- 1-2常用治疗方法

  • 一般治疗

CAG患者应饮食规律,避免摄入对胃黏膜有刺激性的食物,如过热、过咸食物 等。

  • 抗Hp治疗

胃萎缩期间根除Hp可以消除炎症,减慢或停止胃部萎缩的发展,并且可能使 部分萎缩得到逆转叭 目前主要用三联疗法和四联疗法进行Hp根除治疗。

(3)   对症治疗

可以根据患者的症状进行对症治疗。例如,如患者伴有胆汁反流,则可以使用 有结合胆汁酸作用的胃黏膜保护剂。消化不良患者则可以使用增强胃嫡动的消化酶 制剂。

(4)   中医治疗

临床实践中已证实屮医治疗可以有效的控制CAG的发展。中医治疗有针对性 强,副作用小的优点。但中医治疗还存在一些机制相关研允不系统,临床试验不严 谨等问题。

(5)   蒙氏治疗

蒙医学小通常运用“酸马奶疗法”治疗CAG。斯琴巴特尔等⑹观察蒙医结合酸 马奶疗法对CAG的临床疗效,对照组运用【垃阪治疗,观察组采用酸马奶疗法治疗。 结果发现观察组和对照组的临床总有效率分别为93.33%和76.66%,观察组优于对 照组(p>0.05) o酸马奶疗法治疗CAG的临床效果较好,且安全无副作用。

1.1.3慢性萎缩性胃炎与菌群的研究现状

最近研究已证实人体的各部位微生物群与人体的生理和病理有紧密联系。国内 外大部分关于CAG的研究均基于胃部和口腔菌群进行,如Ye等⑺比较分析了健康 志愿者和慢性胃炎患者的舌苔菌群,仅在慢性糜烂性胃炎患者黄色舌苔中发现芽抱 杆菌属(BaciC ,通过2个疗程的中医治疗后其相对含量显著减少。Cui等⑻分 析浅表性胃炎、萎缩性胃炎和肠上皮化生等不同阶段的胃炎患者的舌苔菌群变化发 现,与健康人相比较,胃炎患者的舌苔菌群中有21种微生物存在显著差异,并推测 其可作为长期观察胃炎的生物标志物。由于Hp感染是慢性胃炎的主要病因,因此 基于胃部菌群研究胃炎、肠上皮化生或胃癌的研究较多。慢性胃炎患者胃部菌群中 除匸耍的Hp外,还检测到嗜血杆菌属J Haemophilus)、沙雷氏菌属JSerratia)、 奈瑟氏菌属(Nelssefixi)和葡萄球菌属(Staphylococcus)切。相对而言,关于CAG 与肠道菌群的研究报道很少。

1-2酸马奶

  • 1概念

酸马奶是以生鲜马奶为原料,在乳酸菌和酵母菌等菌种的共同作用下自然发酵 产生的一种酸性、低酒精含量的特色乳饮品。蒙语称酸马奶为Airag、Arrag,音译 为艾日格,意为“发酵的马奶” o在中国、俄罗斯或英文文献里将酸马奶翻译成 Koumiss、Kumis或Kumys等。据记载,游牧民族骑马外出时,会在随身携带的皮 囊中装满马奶,马奶在骑马过程中的颠簸作用下充分混匀发酵形成酸马奶。后来通 过不断地尝试和改造,发明了 “桐制”技术,该技术迄今为止还广为使用何。

1.2.2传统制作工艺

传统酸马奶只能在马的产奶期(夏季的7・9月)内制作,传统酸马奶的制作需 要皮囊、陶瓷缸和木棒等用具。

皮囊用途因其容量的大小而有区别,例如发酵酸马奶、准备发酵引子和运输酸 马奶等。牧民将陶瓷缸底部埋入土中保持缸内发酵温度恒定(一般为20°C左右)。 通常需要两个缸,一个缸用来发酵,另一个用来存放已发酵好的酸马奶。将过滤好 的新鲜马奶倒入干净的陶瓷缸中,再加入准备好的“引子”进行混匀。每天用木棒 上下搅拌,混匀马奶促进其发酵,保证酸马奶的风味。每次在发酵缸中要留下少量 酸马奶当作下一次发酵的“引子”。待本年度的制作结束后,将少量的酸马奶留作 来年的发酵剂。

1-2.3微生物多样性研究进展

酸马奶是由多种微生物共同自然发酵而成的乳饮料,是一个复杂的微生态环境。 国内外关于酸马奶中的微生物多样性的研究报道很多,主要研究方法为纯培养方法 和非培养方法。

纯培养方法由于其培养条件的局限性,大部分微生物难以培养,无法完全揭示 样品中的微生物组成。但通过纯培养法能分离到单菌落的纯培养物,能获得丰富的 乳酸菌资源,为后续优良菌种的筛选提供资源。孟和毕力格等2从采集自蒙古国(5 份)和内蒙古锡林浩特市(16份)的21份酸马奶中共分离到80株乳杆菌 lactobacillus}.蒙古国和内蒙古酸马奶中的优势菌种分别为高温性的嗜酸乳杆菌 {Lactobacillus acidophilus^ 和中温性的干酪乳杆菌{Lactobacillus easel} ° 张明珠 等血从中国新疆乌鲁木齐采集到的自制酸马奶样品中分离到19株乳酸菌,包含乳酸 乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp. lactis )、德氏乳杆菌Lactobachis delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobcicillus pl antarum)、嗜热链球菌 Q Streptococcus thermophiles )、干酪乳杆菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis )和屎肠球菌 ^Enterococcusfaecium),其中优势菌种为乳酸乳球菌乳酸亚种。Wu等网从采集自 中国内蒙古的16份酸马奶样品中分离到48株乳杆菌,包括干酪乳杆菌、瑞丄乳杆 菌、植物乳杆菌以及少量的棒状乳杆菌棒状亚种{Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis)、弯曲乳杆菌 J Lactobacillus cwwtus)和坎德勒氏乳杆菌(WeisseHci kandleri) c Yu等冋从卡尔梅克和图瓦采集的5份酸马奶样品中分离到发酵乳杆菌

(Lactobacillus fermentium )、植物乳杆菌、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、植物乳杆菌等20株菌株。

伴随着分子生物学的发展,非培养方法广泛应用于研究样品的微生物组成中。 非培养方法可以同时获得多个样品的微生物结构信息,并且可以全面客观的分析样 品中的微生物多样性。Miyamoto[15J对采集自蒙古国的酸马奶进行了 PCR-DGGE分 析,检测到瑞士乳杆菌、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides) >乳酸乳球菌、 棉子糖乳球菌(Lactococcus厂劝饬o加fzk)、屎肠球菌、海氏肠球菌(Enterococcus hirae) 等乳酸菌,其中优势菌种为瑞士乳杆菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌。Oki等^从 蒙占国采集到22份酸马奶,采用454焦磷酸测序技术分析其微生物群落,结果发现 其优势菌属和优势菌种分别为乳杆菌属和瑞士乳杆菌,还鉴定到短波单胞菌 (Brevunclimonas subvibrioides)、产气荚膜梭菌(Clostridiim perfringens)、耐久 肠球菌Entemcoccus cluFcms)等菌种。其木格苏都""在酸马奶制作过程屮的不同时 间点采集样品,分析酸马奶在发酵过程屮的微牛.物动态变化。结果发现酸马奶样品 核心细菌菌群曲瑞I:乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、鸡乳杆菌(Lactobacillus gall in arum) 和巴氏醋杆菌(/他丹初於)4个菌种纟fl成。itl「各地区制作传统酸马 奶的方法、温度以及环境等因素不同,导致只所含的微丫物菌群也不同,其优势菌 种在要为瑞士乳杆菌、马乳酒样乳杆菌和干酪乳杆菌等。

1.2.4营养及医疗价值

酸马奶中富含有益于人体的有效成分,关于酸马奶中的化学成分和营养成分的 研究报道较多。孙天松等昭对新疆地区5个不同地点的28份传统酸马奶样品中的化 学成分进行分析,研究结果表明酸马奶中蛋白质、乳糖、脂肪、灰分、钙、磷的平 均质量浓度分别为 2.07±0.29 g/100 mL. 2.69±0.63 g/100 mL、1.87±0.33 g/100 mL> 0.28±0.05 g/100 mLs 72.25土 13.46 g/100 L、52.23±11.35 g/100 Lo 酸马奶中的酪蛋白 含量少于牛乳,与人乳相近。酸马奶中必需氨基酸和非蛋白氮的含量均较高,后者 占总蛋白质的10%,容易被消化"旳。酸马奶中富含VA、VC、VD、VE、VBi、 VB?和VB⑺其中VC的含量极高旳。表1中展现了 5种奶及发酵乳的主要成分⑵

表1    5种乳及发酵乳的主要成分

Table. 1 Main components of 5 kinds of milk and fermented milk

成分 人乳 鲜耳奶 酸马奶 鲜牛奶 酸T-奶
蛋门质(%) L20 2. 65 1.92 3. 19 3. 31
乳Wf(g/l00g) 0. 65 6.23 0. 31 4. 34 0. 65
脂肪代) 3. 30 0. 90 3. 30 3. 63 7.87
铁(nig/lOOg) 0. 10 0. 09 0. 28 0. 11 0. 06
锌(mg/100g) 0. 28 0. 41 0. 53 0. 38 0.42
钙(mg/lOOg) 30. 00 103.45 113. 55 L49. 74 148.35
VBi (mg/100g) 0.016 0. 013 0. 005 0.015 0. 005
VB, (nig/lOOg) 0.036 0. 020 0. 030 0. 073 0. 055

表1 (续)5种奶及发酵乳的主要成分

Table. 1 (Continue) Main components of 5 kinds of niilk and fermented milk

成分 人乳 鲜马奶 酸马奶 鲜牛奶 酸牛奶
VA (nig/100g) 190. 00 26. 05 19.21 50. 06 24. 39
VE (mg/100g) 0. 20 6. 85 5. 71 6. 12 6. 20

在蒙医学中,常用酸马奶治疗一些疾病。乌扎木苏等人总结蒙医学者们和自身 的医疗经验撰写了《酸马奶疗法》,书中主要记录着酸马奶对高血脂、贫血、结核 病、慢性消化道疾病、高血压和糖尿病等疾病均有明显的治疗作用。表2中列岀了 蒙医学中采用“酸马奶疗法”治疗疾病的临床研究报告。

表2酸马奶疗法临床治疗汇总

Table.2 Research summary of the therapy of koumiss therapy

研究对象 临床效果‘作用简述 年份 参考文献
髙血脂患者(50例) 血清胆固醇显著降低27. 04%,甘油二酯显著降低31. 21% 1994 [24]
黄褐斑患者(44例) 皮肤变得细嫩光滑而有弹性,对干性皮肤更为显著, 1998 [25]
总有效率95. 5%
肺结核患者(56例) 51例痊愈(91%) , 5例有效(9%) 1999 [26]
肺结核患者(31例) 36例痊愈(62%) , 20例好转(3丄5%) 2005 [27]
结核性胸膜炎(27例) 2例木愈(占3. 5%)
冠心病患者(62例) 15 例显效(48. 38%) , 10 例有效(32. 26%), 5 例无效(16. 13%), 2006 [28]
1例增髙(3. 23%),总有效率80. 64%
单纯性肥胖症(80例) 28 例治愈(35%) , 39 例显效(48. 75%) , 13 例有效(16. 25%), 2015 [29]
针刺结合酸马奶疗法 总有效率100%
咼血脂患者患者 对照组采用西页治疗,观察组采用酸马奶治疗,对照组和观察 2016 [30]
(300 例) 组的总何效率81.3%和86. 7%
过敏性鼻炎患者 31 人显效(70.4%) , 12 人有效〔27.3%) , 1 人无效(2.35), 2016 ⑶]
(44 例) 总有效率97. 7%
慢性胃炎患者(60例) 对照组采用四医治疗,观察组采舟酸马奶疗法治疗, 2017 [6]
观察组和对照组的有效率分别为93. 33%和76. 66%

1.3肠道菌群与人体健康的研究现状

1.3.1肠道菌群的概述

人体肠道内定植着数量巨大、种类繁多的复杂微生物群。众所周知,肠道菌群 在人体健康发挥着关键作用,如营养物质同化、免疫刺激、抑制潜在致病微生物、 增强抗病能力以及产生短链脂肪酸等功能⑫3310

1.3.2影响肠道菌群的因素

肠道菌群对宿主的健康有重要作用,从近些年的研究报道可以发现宿主自身和 外界因素会影响肠道菌群结构,例如宿主基因、年龄、饮食、生活方式以及疾病等。

近几年,关于双胞胎肠道菌群的研究为了解宿主基因型是否与肠道菌群结构相 关提供了基础。Zhou等⑭用shotgun宏基因组测序分析了 10对0・6岁的中国双胞胎 婴儿(5对同卵双牛:、5对异卵双牛:)的20份粪便样詁屮微半物构成,结果表明相 比「异卵,同卵双胞胎之间共享更多的菌群。不同地区、不同民族的健康人肠道菌 样结构也不同。Melanie等冋分析居住于阿姆斯特丹的6个族群受试者(摩洛哥人、 1:1 PX人、卄洲苏里南人、南亚苏里南人、荷兰人和加纳人)的肠道菌群,结果发 现摩洛哥人、上耳其人和加纳人以普氏菌属(PFewtella)为特征,非洲和南亚的苏 里南人以拟杆菌属CBacteroides为特征,荷兰人以梭菌目(Clostridiales)为特征, 表明种族显著影响个体肠道菌群的结构和组成。

肠道是人体重要的消化器官,大量的消化作用和消化产物的吸收都是在肠道内 进行的。饮食作为影响宿主肠道菌群结构的主要因素之一,可以使肠道菌群的结构 和功能快速改变3。Li等⑶利用PacBio SMRT测序技术研究用高碳水化合物饮食干 预蒙古人的高蛋白和高脂饮食3周对蒙古人肠道菌群的影响。研究发现随着饮食的 改变,肠道中细菌的丰度和多样性降低,拟杆菌属等菌属的相对丰度发生显著性变 化。益生菌制剂可能会通过调节肠道菌群的方式给宿主带来理想的健康效果昭。张 家超等研究Lactobacillus easel Zhang对健康人肠道菌群多样性的影响,研究中招集 24名志愿者,每位志愿者每天摄入Lactobacillus casei Zhang 4xIO10CFU,连续食用 2X X,并在0天,14天,28天,停止食用7天和停止食用14天采集志愿者的粪便 样品。研究发现,食用益生菌后,每个人的肠道菌群均发生了显著性变化,肠道中 双歧杆菌属^Bifidobacterium^等有益菌显著增加,沙雷氏菌属、志贺氏菌属等潜在 致病菌显著减少冋。

肠道菌群结构的改变可能影响宿主对疾病的易感性,肠道菌群失调与许多疾病 相关,已知患有各种疾病的个体的肠道微生物群组成不同于健康个体。如肥胖患者 体内的抗炎症Akkermansia muciniphila减少,而变形菌门、拟杆菌属、弯曲杆菌属 {Campylobacter}及志贺氏杆菌属(57?如〃°)增加⑷》Wang等⑷]对比分析了 11名 患有克罗恩病(CD)的儿童和16名健康儿童肠道菌群以期研究CD儿童的肠道菌 群特征,研究发现与健康对照相比,患有CD的儿童肠道菌群失调,菌群多样性降 低,肠球菌属等潜在致病菌较多,产生短链脂肪酸的菌属显著减少。Guo等比较 分析了痛风患者和健康人的肠道菌群,发现痛风患者肠道菌群在结构和功能上均与 健康人有显著差别,并提出了基于痛风患者肠道菌群建立的微生物基因目录,其鉴 定痛风的准确率达到了 88.9%O Ma等崗通过给无菌小鼠移植患有乳腺炎的奶牛粪便 菌群,发现该粪菌移植可以引起小鼠乳腺炎症状,以及其血清、脾脏和结肠也发生 了炎症,因此肠道微生物区系失调可能是引起乳房炎的原因之一。

总而言之,人体肠道菌群结构的形成和保持稳定状态是一个复杂的过程,其会 受到不同外界因素的影响。肠道菌群和宿主是一个互利共生的关系,肠道菌群结构 的平衡稳态对宿主的健康具有重大意义。

1.3.3三代测序技术在微生物多样性中的应用

微生物多样性的研究常常以16S rRNA为靶分子进行分析。伴随着分子生物学 的发展,变性梯度凝胶电泳、克隆文库分析法、454焦磷酸测序技术等技术广泛应 用于样品的微生物多样性检测。PacBio Bioscience公司的第三代测序技术单分子实 时测序(Single Molecule Real Time Sequencing, SMRT)结合了一代和二代测序的 优势,因其测序长读长、运行时间短、通量高、准确率高等特点,必然成为这一研 究领域首选的研究手段。三代测序可以准确的在种水平上对菌群进行分类,可以更 深入的探究样品的微生物多样性。2013年,Amir研究团队比较了 PacBio RS II和 Illumina平台对环境样品微生物多样性分析的分辨率,结果显示基于16S rRNA全长 序列,PacBio RS II平台可将样品中的微生物群落识别为23个OTU,而Illumina 技术并不能准确区分其近缘物种,表明了 PacBio RS II测序平台的分辨率高于 Illumina技术叫PacBio SMRT测序技术广泛应用于食品中微生物多样性⑷代 微生 物的全基因分析沏以及肠道菌群多样性阴呦等研究中。因此本研究也采用PacBio SMRT测序技术,在种水平上分析酸马奶对CAG患者肠道菌群的影响。

1-4立题背景及研究内容

1.4.1立题背景

慢性萎缩性胃炎被认为是胃癌的癌前状态,研究表明CAG与年龄、饮食、生 活习惯和胆汁酸反流有关叭目前常用西医学、中医学和蒙医学治疗CAGo药物治 疗存在疗程长、复发率高、不良反应大等问题,而微创治疗由于其有创伤和并发症 较多等使其在临床应用中具有较大的局限性。蒙医学中采用“酸马奶疗法”治疗CAG 取得了较好的疗效,且副作用小,可以控制病情发展和减少复发,但关于对CAG 治疗机理研究很少。酸马奶是食疗价值极高的功能性传统发酵乳制品,具有调节胃 肠道消化功能,激活胰腺功能,增强人体免疫功能等功效⑹。近些年来,大量研究 发现肠道菌群的稳态对宿主健康起到至关重要的作用,菌群失衡是影响各类疾病发 生的重要因素。因此,本研究从肠道菌群角度解析酸马奶对CAG患者的影响,为 今后临床上采用“酸马奶疗法”治疗CAG奠定理论依据。

1.4.2研究内容与技术路线图

  • 1研究内容

本研究以慢性萎缩性胃炎患者为研究对象,根据其健康状况以及临床诊断报告 情况,运用“酸马奶疗法”对其进行治疗,分析饮用酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者 肠道菌群的影响。具体试验内容为:

(1)采集三个时间点(0天,30天和60天)的酸马奶,分析其细菌多样性。

(2)通过检测第0天和第60天的患者血液成分、血脂成分和肾脏功能,分析 患者饮用酸马奶前后临床指标的变化。

(3) 采集四个时间点(第0天、30天、60天及停止饮用30天)的患者粪便样 品,釆用PacBio SMRT测序技术基于16SrRNA基因序列分析患者粪便微生物,研 究患者饮用酸马奶期间肠道菌群的变化情况。

1.4. 2. 2技术路线图

图1技术路线图

Fig.l Experimental flow chart

2材料与方法

  1. 1试验材料
  2. 1志愿者信息

本研究从锡林郭勒盟蒙医医院招募55名慢性萎缩性胃炎患者,志愿者的入选参 考《全国慢性胃炎研讨会共识意见》則中的诊断标准,患者自愿参加本试验,并签 署知情同意书。

  • 入选标准:①所有志愿者均符合慢性萎缩性胃炎患者的诊断标准并明确诊 断;②Hp检测呈阳性;③患者均进行胃镜检查,图像显示为慢性萎缩性胃炎。
  • 纳入标准:①符合诊断标准者;②无其他严重疾病;③在试验前3个月没 有服用抗生素类药物;④不吸烟、不饮酒。
  • 排除标准:①胃溃疡,怀疑恶性病变者;②没有按规定服用酸马奶,影响 功效性判断者;③试验期间服用抗生素类药物、其他药物或补品,影响试验结果者。

依据入选标准和排除标准,最终共10名女性CAG患者完成90天的试验,具 体信息如表3所示。

表3    10名慢性萎缩性胃炎患者信息

Table.3 The information of the 10 chronic atrophic gastritis patients

患者编号 性别 民族 年龄 身高(cm) 体重(Kg) BM1 (Kg/nr)
1 汉族 65 157 52.5 2L30
2 汉族 74 167 65. 0 23. 31
3 满族 28 174 60.0 19.82
4 蒙古族 49 167 65. 0 23.31
5 汉族 58 162 62.0 23.62
6 蒙古族 41 170 60.0 20. 76
7 蒙古族 48 164 65.0 24. 17
8 汉族 54 176 90.0 29. 05
9 汉族 54 165 60. 0 22.04
10 汉族 49 167 60.0 21. 51

2.1.2酸马奶样品来源

本试验中所用的酸马奶采用分批发酵方式制作,由锡林郭勒盟蒙医医院提供给 患者。工作人员从锡林浩特市周边牧区收集鲜马奶,并进行过滤、去除杂质等工作 后预热至50〜60 °C0随后在95 °C条件下进行杀菌,时间为10 min,之后冷却至接 种温度后加入“引子”进行混匀,恒温发酵。发酵完成的酸马奶置于4 °C贮藏。

  1. 1.3临床症状评分

根据《中药新药临床研究指导原则(试行)》削中的相关评分标准,对CAG 患者主要症状以积分的形式量化评价,观察患者饮用酸马奶前后上腹痛、腹部胀满、 进食后恶化、打嗝、食欲不振、消瘦、恶心和呕吐、消化不良等13个临床症状的变 化,分别按正常、轻度、中等、严更、重度币[分别记0、1、2、3、4分,得分越高 表明患者相关症状严重,具体评分标准见表4。

表4慢性萎缩性胃炎临床症状评分表

Tablc.4 Clinical symptoms rating scale of chronic atrophic gastritis

程度

评估参数

匸常 轻度 屮等 严虫 匝•度
0 1 2 3 4
腹部胀满 0 1 2 3 4
进食后恶化 0 1 2 3 4
打嗝 0 1 2 3 4
食欲不振 0 1 2 3 4
、消瘦 0 1 2 3 4
恶心和呕吐 0 1 9 3 4
消化不良 0 1 2 3 4
口腔粘稠 0 1 2 3 4
口十舌燥 0 1 2 3 4
胃酸反'流 0 1 2 3 4
饭最减少 0 1 2 3 4
倦怠 0 1 2 3 4

2.1.4仪器和试剂

试验屮所使用的匸要仪器和试剂如农5, 6所示。

表5主要仪器

Table.5 The main equipment

主要仪器                                                                            仪器公旬

Applied biosystems PCR 仪
微量紫外分光光度计
仝自幼高压蒸汽灭菌器

表5 (续) 主要仪器
Table.5 (Continue) The main equipment
匸要仪器 仪器公司
协温水浴锅 上海讨口科技有限公司
凝胶成像分析系统 L'VP公司
LabchipGX 仪器 美国PerkinElmer公司
高速冷冻离心机 Eppendorf 公司
电泳仪 北京六•牛物科技有限公司
PacBio RS II 测序仪 美国 Pacific Biosciences 公司

表6主要试剂

Table.6 The main reagents

二要试剂 试剂公司
QtAGiuX         Stool Mini-Kit 试剂盒 徳国QIAGEN公司
OMEGA LO isolation kit 试剂盒 美国OMEGA公司
核酸染料 北京右泰克生物技术有限公司
DNA保护液 宅H医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa +国)
Ampurc Bead 磁珠 美国 Pacific Bioscienccs 公司
Sample 卩rolector for RNA/DNA 北京宝H页生物技术有限公司
DNA Extended Rtinge LabChip 芯片 羌国 Pcicific Biosciences 公司
Tris 人津市化学试剂一厂
DNA/Polynierase Bingding Kit P6 v2 试剂盒 美国 Pacific Biosciences 公司
硼酸 夭津市化学试剂一厂
S'IRT bell TM Template Prep Kit I. 0 试剂盒 美国卩acif ic Biosciences 公司
EDTA 夭津市化学试剂一厂
MagBeads 磁珠 艾国卩etcific Biosciences 公司
琼脂糖 法国BioWest.公司
DNA Sequencing Kit 4.0 v2 试剂盒 美国 Pacific Biosciences 公司
6xLoading Buffer 人连宝生物技术有限公司
SMRT Cell v38 Pac 美国 Pacific Biosciences 公司

2试验方法

  1. 2. 1试验设计

本研究中共10名患者完成试验,试验期间要求患者每天三餐前饮用250 mL酸 马奶,饮用60天。试验期间采集三个时间点(0天,30夭和60天)的酸马奶,分 析其细菌多样性。在患者自愿并知情的情况下,在饮用酸马奶前后的两个时间点(第 0天和第60天)采取血液样品检测血液成分、血脂成分和肾脏功能。同时在四个时 间和(笫0天,30天,60天及停止饮用30天)采集患者的粪便样品,测定患者肠 道菌群多样性。酸马奶样品和粪便样品采集后迅速冷冻,并尽快送到实验室冷冻保 藏于-80 C冰柜屮以备后续研究。血液样本由医院保存。

2.2.2样品采集及保存

用无歯采样勺采集10 g左右的新鲫粪便样歸装入尢酶无菌的50 mL的采样离心 管川,丿川入等休积的DNA保护液,充分混匀并标号。将样品低温保存,尽快带回 实验室・80 °C超低温冰柜中保存备用

将酸马奶在其发酵容器中充分搅拌后,取30mL酸马奶装入无菌离心管中,加 入等体积的DNA保护液,充分混匀并标号。将样品立即放入4 C便携式冰箱内, 尽快带回实验室转移至・80 °C冰柜中保存以备用。

血液样本由医院保存,用于患者各项临床指标的测定。

  1. 2. 3样品宏基因组DNA的提取

采用 QIAGEN DNA Stool Mini Kit 试剂盒和 OMEGA DNA isolation kit 试剂盒分 別提取粪便样品和酸马奶样品的宏基因组DNA。DNA提取按照试剂盒说明方法进 行。通过琼脂糖凝胶电泳和紫外可见分光光度计检测宏基因组DNA的质量。最终 DNA的浓度需高于100 ng/piL, OD260/280值在1.8〜2.0之间。将所有质量合格的 DNA保存于・20 °C以进行后续试验。

  1. 2. 4 细菌16S rRNA序列扩增及纯化

使川含有 Barcode 的正向引物 27F (5LAGAGTTTGATCMTGGCTCAG3)和反 向引物1492R (5LACCTTGTTACGACTT3) [S2],通过PCR扩增宏基因DNA中的 16S rRNA基因序列。PCR扩增反应体系见表7所示,PCR仪参数设置如下;预变 性(95 °C, 4 min):变性(95 °C, 30s);退火(58 °C, 30s);延伸(72 °C, 30 s) ; 30个循环;终端延伸(72 °C, 5 min)

表7聚合酶链式反应扩增条件

Table.7 PCR conditions

体系 添加量
1OxPCR Buffer 5 gL
表7 (续)       聚合酶链式反应扩增条件

Table.7 (Continue) PCR conditions

体系 添加量
dNTP MIX (2. 5mM each) 4 yL
正向引物(10 pmol/pL) 1. 5此
反向引物(10 pmol/gL) 1. 5 |iL
DNA模板 1.5 gL
TaKaRa Taq 酶(5 U/^L) 0. 5 gL
ddH20 补充至50吐

PCR产物需先经1%琼脂糖凝胶电泳检验,合格后进行PCR产物纯化。纯化过 程如下:在PCR产物中加入等体积的Ampure Bead磁珠震荡混匀10 min后,在磁 力架上静止至吸附完全,吸掉上清后用75 %的酒精清洗两次,随后用Elution Buffer 进行回溶。纯化后的DNA用Qubit® dsDNAAHS Assay Kit试剂盒测定其浓度,DNA 浓度需在20-100 ng/gLo

表8测序所用Barcode信息表

Table. 8 The barcode information

样品 Barcode ID Barcode 序列
上游引物 下游引物(5'r3‘)
Al 89 TCTCACTGATAGCGTG CACGCTATCAGTGAGA
A2 138 TAGCGTGAGAGTGTCG CGACACTCTCACGCTA
A3 168 CGCTAGAGATCTGCTA TAGCAGATCTCTAGCG
A4 226 TGTACGCTCTCTATAT ATATAGAGAGCGTACA
A5 379 TCTATGAGCACTCTCG CGAGAGTGCTCATAGA
A6 264 TATATATGTCTATAGA TCTATAGACATATATA
A7 295 GAGAGTAGCGTGTACA TGTACACGCTACTCTC
A8 339 CACATATCAGAGTGCG CGCACTCTGATATGTG
A9 352 GCzzGCGCGCACTCTCTG CAGAGAGTGCGCGCGC
A10 366 TCTGTATCTCTATGTG CACATAGAGATACAGA
Bl 89 TCTCACTGATAGCGTG CACGCTATCAGTGAGA
B2 138 TAGCGTGAGAGTGTCG CGACACTCTCACGCTA
B3 168 CGCTAGAGATCTGCTA TAGCAGATCTCTAGCG
B4 226 TGTACGCTCTCTATAT ATATAGAGAGCGTACA
表8 (续)       测序所用Barcode信息表

Table.8 (Continue)   The barcode information

样品 Barcode TD                                                       Barcode 序列
上游引物(5't3‘) 下游引物(5             )
B5 379 TCTATGAGCACTCTCC; CGAGAGTGCTCATAGA
B6 264 TA1'ATATGTCTATA(;A TCI'ATAGACATATATA
B7 295 ('.AdAGI'AGCGTGTACA TCITACACGCTACTCTC
B8 339 CACATATCA(;A(;T(;C(; CCJCACTCTGATAIXn'G
B9 352 <;CzzGC(;C(;CACTCTCT(; CA(;A(;AGTGCGC(;C(;C
BIO 366 TCT(;TAT(rr(:rAT(;TG ('A('ATAGAGATA('A(;A
Cl 89 TCT(g(TGATAGC(;TG CA('(;CTATCAGT(;A(;A
138 TAGCGTGAGAGTGTC'G CG.ACACTCTCAC(;CrA
C3 168 CGCT/AGAGATCTGCTA TAGCAGATCTCTAGCG
C4 226 TGTACGCTCTCTATAT ATATAGAGAGCGTACA
05 379 TCTATGAGCACTCTCG CGAGAGTGCTCATAGA
C6 264 TATATATGTCTATAGA TCTATAGACATATATA
C7 295 GAGAGTAGCGTGTACA TGTACACGCTACTCTC
C8 339 CACATATCAGAGTGCG CGCACTCTGATATGTG
C9 352 GCzzGCGCGCACiCTCTG CAGAGAGTGCGCGCGC
CIO 366 TCTGTATCTCTATGTG CACATAGAGATACAGA
DI 89 TCTCACTGATAGCGTG CACGCTATCAGTGAGA
D2 138 TAGCGTGAGAGTGTCG CGACACTCTCACGCTA
D3 168 CGCTAGAGATCTGCTA TAGCAGATCTCTAGCG
D4 226 TGTACGCTCTCTATAT ATATAGAGAGCC/rACA
1)5 379 TCTATGAGCACTCTCG CGAGAGTGCTCATAGA
1)6 264 TATATAT(;TCTATA(;A TC1ATAGACATATATA
1)7 295 GAGAGTA(;(Xn'GTA(:A TGTACACGCTA(:丁 (TC
D8 339 CACATATCAGAGTGCG CGCACTCTGATATGl'G
D9 352 GCzzGCGCGCACTCTCTC; CAGAGAGTGCGCGCGC
DIO 366 TCTGTATCTCTAT(;T(; CACATAGAGATACAGA

2.5 PacBio 测序

使用SMRTbellTM Template Prep Kit 1.0试剂盒纯化后的DNA,进行修复和末 端切齐,并再一次纯化及测量DNA浓度。对处理后的DNA进行灭活酶处理,并用LabchipGX仪器和Qubit荧光计测定文库的DNA浓度,并根据文库浓度及大小,使 用Calculater v2.3.3软件计算上机引物和聚合酶的添加量,对DNA文库加引物和酶 后,应用PacBio RS II测序仪上机测序。

  1. 2. 6高质量序列的提取

按照SMRT Portal (V2.7),使用RS_Reads Ofinsert」对原始序列进行质量控制, 控制参数如下:①最小通过率设定为5;②最小预测精确度为90;③最小插入序列 长度为1400 nt;④最大序列长度为1800 nt,符合以上标准的序列予以保留。

  1. 2.7生物信息学分析

通过235方法提取出高质量序列,并根据Barcode信息将其进行划分到每个样 品中后,去掉Barcode。使用QIIME (vl.7.0)分析平台嗣对处理好的序列进行生物 信息学分析。主要步骤如下:

  1. 利用PyNAST软件阿将序列对其,然后以100%的相似度进行UCLUST悶 划分序列,得到无重复单一的16S rRNA基因序列集。
  2. 建立分类操作单元(OpGmtional Taxonomic Units, OTU),在 100%相似度 进行划分的基础上,进-步在65%相似度下划分OTU。
  3. 应用ChimeraSlayer[56J去除含有嵌合体序列的OTU序列。
  4. 将去除含有嵌合体序列的OTU序列与RDP (Ribosomal Database Project) 和Greengenes (Version_3.8)数据库呦进行比对,并进行分类学鉴定。
  5. 使用FastTree软件阴绘制基于OTU代表序列的系统发育进化树。随后,计 算a和卩多样性。其中,a多样性包括香农指数(ShaimorTs diversity index)、测得 OTU数、Chao 1指数和辛普森指数(SimpsoHs diveisity index),以此进行样品菌 群结构多样性和丰度的评价。同时,采用稀疏曲线(Rarefaction curve)和香农曲线

(Shannon curve)评估测序序列多样性以及测序量是否能够代表样品的物种多样性。

  1. 在UniFrac距离的基础上进行加权(Weighted)和非加权(UnWeighted)的 主坐标分析(Principal coordinate analysis, PCoA),以评估不同样品的微生物群结 构。
  2. 2. 8统计学分析

统计学分析主要使用 R 语言(R Core Team, http: //www.r-project.org/)和 Matlab (Natick, MA, USA, v2011b)进行。应用 Mann-Whitney 和 Kruskal Wallis 分析评 估各时间点血液参数和患者肠道菌群的相对含量的差异性。使用主坐标典型分析 (Canonical analysis of principal coordinates, CAP ) t59]和 方差多变量方 差分析 (Pemiutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA)说来评估慢性萎缩 性胃炎患者肠道菌群结构是否在不同时间或不同患者屮存在显著差异。使用R语言 (http://cran.r-project.org/web/packages/ade4/index.html,V 1.7-6) E61],根据肠道分型网 的原始报告中描述的物种丰度谱进行肠型分析。根据Segata等丽人使用默认参数

(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)进行线性判别分析效应大小(Linear discriminant analysis effect size, LEfSe)。使用 R 语言、Origiii8.6 和 Graphpad prism 软件绘图。

  1. 2.9测序数据登录号

3结果与分析

3.1酸马奶细菌多样性的分析

本研究从3份酸马奶样品中共获得9901条高质量完整的16S rRNA基因序列, 样品A, B, C分别测到1939, 3971和3991条高质量序列。根据序列的98.65%相 似度对高质量序列进行划分OTU后,共得到2105个OTUo

通过将OTUs序列与RDP和Greengenes数据库进行同源性比对,3份酸马奶样 品中鉴定出2个门,分别为厚壁菌门(Firmicutes, 89.33±6.43%)和变形菌门 (Proteobacteria, 10.53±6・42%)。剩余的序列为拟杆菌门(Bacteroidetes, 0.10土0.02%) 和放线菌门(Actinobacteria, 0.03±0.03%) □

在属水平上,3份酸马奶样品中共鉴定出32个菌属(图2左)。其中6个细菌 属的含量大于1%,分别为乳杆菌属Lactobacillus, 85.10±6.07% )、乳球菌属 (.Lactococcus, 2・19±1・82%)、醋酸杆菌属 CAcetobacter9 2.15±2.38)、链球菌属 (.Streptococcus, 1.59±2.53)、肠杆菌属(EntErobactg 1.09±1.17%)和克雷白氏 菌属1.04±0.33%)。从图2中可见,乳杆菌属是酸马奶样品中的优势 菌属。

在种水平上,3份酸马奶样品中共鉴定出57个菌种〔图2右)。酸马奶样品中 有5个平均相对含量大于1%的细菌种,分别为瑞士乳杆菌(.Lactobacillus helveticus, 53・01±11.34%)、马乳酒样乳杆菌 Lactobacillus kefiranofaciens, 26.38±0・78%)、 开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri9 2.19±3.58%)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis, L50±2.60%)和乳酸乳球菌{Lactococcus lactis, 1.29±1.11%)。由此 可见,本试验的酸马奶样品中优势菌种为瑞士乳杆菌。Fig.2 Relative abundance of major bacteria in koumiss at genus and species levels

注:左图为酸马奶在属水平上的主要细菌含量;右图为酸马奶在种水平上的主要细菌含量

  1. 2慢性萎缩性胃炎患者饮用酸马奶翦后的临床症状和血液生理生化指标评价
  2. 1临床症状评价

患者的症状评分可以直接反映疾病的严重程度。大多数CAG患者主要有上腹 部胀痛、食欲不振、反胃酸、恶心呕吐、暧气、口干口苦等临床症状,因此基于以 上普遍存在的临床症状制作分级量化表,对患者饮用酸马奶前后的症状变化进行量 化式评价。图3所示,饮用酸马奶60天后,患者的症状评分结果从10.6±2.9显著 降低至2.6±1.1 (尸0.006),降低了 7547%。朱微微等間应用中西医合用治疗CAG 患者期间,对患者的胃痛、胃胀、恶心和呕吐等症状进行评分,结果发现治疗后症 状评分显著下降,表明参罠健胃颗粒联合替普瑞酮可以改善患者的胃部不适症状。 因此本试验中症状评分的降低可以说明饮用酸马奶可以改善CAG患者的临床症状 并缓解病情。

Fig.3 Patients' symptoms rating on days 0 and 60 of koumiss consumption.图3饮用酸马奶0天和60天症状评分比较图

注:图注★水代表p <0.01

  1. 2血液生理生化指标评价

临床指标主要检测患者的血常规(白细胞、红细胞、血小板计数和血红蛋白), 血脂水平(甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇), 肾功能(尿素氮、肌酹和尿酸)和肝功能(丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移 酶)。从血常规和血脂水平比较图(图4)中可观察到,第0天的血小板计数和总 胆固醇含量分别为2.694xlOn/L和5.55 mmoL/L,饮用60天的酸马奶后,其含量分 别显著降低至2.456X10H/L和4.69mmoL/L (p<0.05)。其中,白细胞数在饮用酸 马奶期间有升高的趋势,相反甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平有降低的趋势。 研究报道,Hp阳性胃炎患者的总胆固醇、甘油三酯、血小板计数等指标的平均水平
显著高于Hp阴性旧巴通过根除Hp.治疗胃炎可改善Hp阳性患者的血小板计数呦, 因此可以推测血小板计数和总胆固醇的降低可能对患者具有有益作用。图5所示, 患者的肾脏和肝脏功能的五个指标在饮用60天的酸马奶期间没有显著变化,表明饮 用酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肾肝功能无显著影响。

图5饮用酸马奶0天和60天肾肝功能指标比较图

Fig.5 Renal and liver fimction on day 0 and day 60 of koumiss consumption.

3饮用酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群结构的影响

  1. 1测序质量评估及0TU划分

本研究在4个时间点(第0天,30天,60天,停止饮用30天)釆集CAG患 者的粪便样品。通过PacBioSMRT测序技术,从40个测序样品中获得255401条高 质量完整的DNA序列,平均每个样品有6385条高质量序列(SD=1557, Ran驴=3607〜9917)通过PyNAST比对和100%的相似度对序列划分OTU,得到 204822个OTU。在此基础上,再进一步按98.65%相似度划分OTU后,得到100735 个OTU,平均每个样品有2988个OTU (SD=719.1, Range-910^4237) □通过将获 得的OTU与RDP和Greengene数据库进行比对,确定每个OTU的分类学地位,然 后确定每个物种的相对丰度。比对结呆表明,仃18925个OTUs (7.41%)不能鉴定 到属水平,进一步进行种水平的划分后发现,仃52306个OTUs (20.48%)不能鉴 定到种水测序得到的序列未能划分到明呦的分类学地位,可能与测序平台测序 得到的用列址较人有关。

本研究通过Chaol指数、测得OTUs数、香农指数和辛普森指数等4种a多样 性指标对CAG患者粪便样品微生物多样性进行分析。本试验所研究的4个时间点 的粪便样品a多样性指数如表9所示。通常辛普森指数数值和香农指数数值越大, 说明样品中微生物多样性越高。本试验测序结果中辛普森指数的数值均趋于1.00, 香农指数的平均值为9.02,表明患者肠道微生物多样性较高。

表9样品的序列信息及a多样性指数

Table.9 Sequence abundance and a diversity index in the samples

样品 序列数 OTUs 数 辛普淼指数 香农指数 Chaol指数 测得OTUs数
Al 6222 2440 0.99 & 54 9585. 58 1307.84
A2 5523 3240 0. 99 9. 50 20797. 00 1862.02
A3 7328 3266 0. 98 8.93 13144. 00 1508.00
A4 5312 2972 0. 98 9. 13 20074. 80 1769. 06
A5 5601 3197 1. 00 9. 70 22710. 80 1818. 12
A6 6896 3200 0. 99 9. 21 13527.60 1549.36
A7 8014 2310 0,98 7. S5 5667. 61 1039.71
A8 5160 2329 0. 98 S. 16 11839. 40 1412. 31
A9 4843 2984 0. 99 9. 82 2691 1. 70 1927. 51
A10 8634 3852 0.99 8. 91 13860. 20 1517.18
Bl 6472 3042 0. 99 9. 33 14878. 40 1601.76
B2 6325 2565 0. 99 8.99 10866. 00 1459.82
B3 8443 4105 0. 99 9. 31 1667L 00 1660. 70
B4 8881 4237 0. 99 9. 16 13963.3 1630. 50
B5 7771 3285 0. 99 9. 11 11894.9 1482. 58

 

表9 (续)

Table.9 (Continue)

样品的序列和OTUs信息及a多样性指数

Sequence abundance and a diversity index in the samples

样品 序列数 OTUs 数 辛普森指数 香农指数 Chaol指数 测得OTUs数
B6 5345 2716 0. 99 9. 39 15391. 40 1641.00
B7 6439 3210 0. 99 9. 26 14493. 00 1652. 04
B8 3607 2214 1.00 10.11 23491.80 2009. 72
B9 5562 3623 1.00 10. 22 27942. 40 2088.90
B10 9917 4217 0. 99 8.91 12174. 60 1518.90
Cl 6748 2583 0.99 & 78 9045. 85 1357. 82
C2 5835 1641 0.97 7. 48 7814. 07 1026. 80
C3 7619 3332 0. 99 9.18 14992. 30 1626. 36
C4 7323 3769 0. 97 8. 69 21798. 70 1664. 58
C5 5518 2749 0.99 9. 35 19502. 40 1622. 22
C6 4928 2787 1.00 9. 74 22006. 20 1813. 40
C7 8017 3549 0.99 9. 29 11718.60 1532. 68
C8 3660 1823 1.00 9. 78 15316. 50 1789. 24
C9 6643 910 0.87 4. 82 3154.15 489.18
CIO 8694 4138 0. 98 & 98 14517. 30 1635. 72
DI 8772 2602 0. 98 7. 90 7321.51 1056. 66
D2 7140 2549 0.99 & 26 9684.22 1215.80
D3 6851 3732 0. 98 9. 15 20383. 90 1766. 06
D4 6223 2854 0. 97 8. 37 14002. 20 1487. 32
D5 5969 35i5 0” 98 9.19 30590. 70 1853. 32
D6 5610 3272 0.99 9. 70 17736. 80 1875. 74
D7 4593 3297 1.00 10.41 39576. 20 2219.46
D8 4101 2491 0. 99 9. 56 2U73. 10 1886.22
D9 4016 2465 0. 98 9. 42 26040. 00 1889.92
DIO 4846 2462 0. 98 & 72 17812. 30 1594.06

根据表9信息绘制稀疏曲线和香农曲线,用于分析和评价本研究所得到的测序 量是否符合后续生物学分析(图6)。如图6a中稀疏曲线所示,OTU的数量未达到 平衡状态,这表明随着测序量的增加,新的物种将被发现。而图6b显示的香农曲线 已经完全达到水平状态,这表明随着测序量的增加细菌多样性将不再改变,因此当 前测序量可以满足后续分析的需要。

Fig.6 Rarefaction (a) and Shannon diversity (b) curves
图6稀疏曲线(a)和香农曲线(b)

为研究酸马奶对CAG患者肠道菌群细菌丰度和多样性的影响,采用 Mann-Whitney检验对四个时间点肠道菌群的a多样性指数进行了比较分析。图7 所示,四个时间点的Chaol指数、测得OTUs数和香农指数之间无显著性差异。辛 普森指数数值越大,说明样品中微生物多样性越髙,饮用酸马奶第30天组的辛普森 指数显著高于停止饮用30天组(严0.02)。辛普森指数的降低表明停止饮用酸马奶 后肠道菌群多样性减少,由此可推测饮用酸马奶在一定程度上影响患者肠道菌群多 样性。

图7酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群a多样性的影响

Fig.7 Effect of koumiss on the a diversity of gut microbiota in patients with chronic atrophic gastritis

3,2聚类分析酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群的影响

为分析饮用酸马奶期间和停止饮用后CAG患者肠道菌群结构是否具有差异性, 本研究对四个时间点样品中的菌群结构进行了加权和非加权的UniFrac距离的主成 分分析(Weighted and Unweighted Uni&ac Principal Coordinate Analysis) o 基于非加 权UniFrac距离的主成分分析中第一主成分、第二主成分和第三主成分的贡献率分 别为5.62%、5.29%和4.37% (图8a),基于加权UniFrac距离的主成分分析中第一 主成分、第二主成分和第三主成分的贡献率分别为43.53%、12.26%和9.22%(图8b)° 从PCoA图可明显看出,图中四个时间点粪便样品间没有发生明显聚类现象,而同 一个体的样品间具有明显的聚类现象。综合以上聚类现象表明,酸马奶影响CAG 患者肠道菌群结构,但是菌群的变化是基于个体的小范围波动。

图8慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群的PCoA图

Fig.8 PCoA plot of chronic atrophic gastritis' intestinal microbiota

注:图a为基于非加权Uni frac距离的主坐标分析;图b为基于加权Unifrac距离的主坐标分析

为进一步验证以上结果,我们基于多变量方差分析(PERMANOVA)分析个体 差异和饮用酸马奶对患者肠道菌群差异的解释度(F值)和差异性(p值)。图% 和9c是基于非加权Unifrac距离的相似性研究个体和饮用酸马奶对患者肠道菌群的 差异,结果个体差异是显著影响患者肠道菌群的主要因素(pVXOOl)。同时,基于 加权Unifrac距离的相似性的分析也验证了以上结果。以上结果也表明了个体差异 对患者肠道菌群具有较大影响。

图9基于未加权和加权Uni Frac距离的酸马奶对肠道菌群结构的影响
Fig.9 Effects of koumiss consumption on the gut microbiota structure based on unweighted and weighted UniFrac
distances

基于CAP分析,利用未加权的UniFmc距离绘制的图10a揭示了早期(第0天 和第30天)与后期(第60天和停止饮用30天)的肠道菌群结构之间具有显著性差 异(严0.001)。此外,从加权的UniFrac距离生成的图10b显示第0天的肠道菌群 与其他三个时间点的肠道菌群具有显著差异(卩<0.01)。从以上结果可知,饮用酸 马奶期间,患者肠道菌群结构发生了一定程度的变化。

图10四个时间点肠道菌群结构的变化

Fig.l 0 Changes in gut microbiota structure at four time points

注:图10a为基于非加权Uni frac距离的主坐标前85%主成分的MANOVA分析,图10b基于加权Unifrac 距离的主坐标前85%主成分的主坐标典型相关分析;*: 0.01<p<0. 05;                                                              0. 001<p<0.01; ***: p<0. 001

  1. 3酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群相对含量的影响
  2. 3. 3. 1试验前患者肠道菌群相对含量

通过将筛选后的高质量OTUs序列与RDP和Greengenes数据库进行比对,得 到9个菌门、69个菌属和161个菌种。

在门水平上,患者肠道中主要菌门是拟杆菌门(Bacteroidetes, 57.65±7.48%)、 厚壁菌门(Firmicutes, 38.39±8.68%)、变形菌门(Proteobacteria, 1.62±2.69%)和 放线菌门(Actinobacteria, 1.20±2.52%)。

在属水平上,14个属的相对丰度超过1%,占总微生物群总数的87.29%,包括 拟杆菌属 JBactedes, 36.16±22.53%)、普氏菌属(PrewUella, 14.02±22.64%)、 栖粪杆菌属(Fawca肪ac妙加加,6.54±4*89%)、真细菌属(Eubacterium, 5.00±5.54%)、 小类杆菌属(Dlalister, 5.00±6.26%)、别样杆菌属 JAlistipes, 3.99±7.09%)、梭 菌属(CloEdium, 3.89±2.46%)、瘤胃球菌属(Ruminococcus, 2.63±2.48%)、罗 斯氏菌属 CRoseburia, 2.37±3.89%)、多尔氏菌属(Dorea, 2.00±1.38%) > 副拟杆 菌属(Parabacteroides, 1.98± 1.75% )、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium , 1.89±2.97%)、巴恩斯氏菌属(加力劭沏彷,1.71 土3.10%)和柯林斯菌属(Collinsella, 1.10±2.50%) o

在种水平上,17个种的相对丰度超过1%,占微生物群总数的68.75%o包括多 氏拟杆菌(Bactemides dorei, 15.57±12.95 % )、粪便普氏菌(Prevotella copri, 13.96±22.56%)、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii, 6.52±4.89%)、单形拟 杆菌 JBacteiroldes uniformis, 6・48±6.64%)、直肠真杆菌(EubacteFiiim rectale, 3.58±5.50%)、卵形拟杆菌(Bacteroides o+atus, 4・42±5.58%)、Alistipesputredinis (2・89±6.10 % )、Dialister invisus ( 2.50±4.47 % )和 Dialister succinatiphilus (2.47±5.72%) o

由图11可看出,慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群在门水平上无明显的差异,而在 属和种水平上具有明显差异,表现出个体差异对患者肠道菌群的影响。

  • BacieroiJes nnZHmP、
  • PluzHur Uobarterj am Jatxium
  • Diali wr \wdn^tiphUus
  • Dialler i料打◎戡

Mlputretlinis

  • Ba^eruitles 础如務 您邂 Eubaefcri utn reaule
  • Boi hruides UHifarm v

MV Fa^Wi burferiiufipruttsftit^i

MB Pre^Ht^hi coprl

  • BactiTtHtles

图门10名慢性萎缩性胃炎患者主要肠道菌群结构

Fig. 11 The gut microbiota structure of 10 chronic atrophic gastritis

  1. 3. 2酸马奶对不同分类学地位的肠道菌群相对含量的影响
  • 基于门水平分析酸马奶对肠道菌群相对含量的影响

通过与数据库比对,饮用酸马奶后,三个时间点样品中分别鉴定出9个、7个 和8个菌门。如表10所示,对四个时间点样品中菌门含量进行比较发现,饮用酸马 奶后患者肠道中拟杆菌门和厚壁菌门具有显著改变,其余菌门含量无显著变化。以 上结果表明,酸马奶可以在菌门水平上影响患者的肠道菌群。

图12门水平上主要肠道菌群组成

Fig.l 2 The major gut microbiota composition at phylum level

表10主要菌门含量表

Table. 10 The relative abundance of major bacterial phylum

0天 30天 60天 90天
Bacteroidctes 57. 65±7. 48 44. 70±15. 80 35.15±16. 54 42. 54±13. 56 0. 003
Eirmicutes 3& 39±8. 68 50. 95±13. 58 60. 39±15. 60 52. 52±9. 82 0. 005
Proteobacteria L 62±2. 69 2. 34±4. 53 3. 65±3. 88 3. 97±7. 59 0. 238
Actinobacteria 1. 20±2. 52 0. 18±0. 21 0. 40±0. 52 0. 14±0. 22 0. 147
Verrucomicrobia 0. 68±1. 42 1. 38±4. 22 0. 24±0. 63 0. 01 土0. 01 0. 505
Tenericutes 0. 33±1. 01 0. 29±0. 59 0. 07±0. 22 0. 66±2. 07 0. 766

注:采用Kruskal-Wallis检测计算p值

(2)基于属水平分析酸马奶对肠道菌群相对含量的影响

属水平上,三个时间点(饮用酸马奶第30天、第60天和停止饮用30天)患者 肠道菌群中分别鉴定出73个、79个、73个菌属(图13)。由主要菌属的柱形图可 以发现,CAG患者个体肠道菌群的差异性较明显,但整体上肠道菌群中的主要菌属 为拟杆菌属、普氏菌属和栖粪杆菌属。比较分析四个时间点的菌属相对含量发现, Curvibacter代尔夫特菌属(Dea、肠球菌属(Enterococcus )、芽殖菌属 (Gemmiger)、乳球菌属〈Lactococcus)和罕见小球菌属Subdoligranidum等 6 个菌属的相对含量显著变化(表11) O其中乳球菌属是酸马奶的主要菌属,在饮用 酸马奶之后,患者肠道菌群中乳球菌属的相对含量有不同程度的增加,但其在停止 饮用后未在肠道中检测到。

图33属水平上主要肠道菌群组成

Fig.l 3 The major gut microbiota composition at genus level

表门差异菌属的相对含量

Table. 11 The relative abundance of bacterial genus

菌属名称                                                           菌属含量(%)                                                         卫值

0天 30天 60天 90天
Curvibacter 0. 006 0. 036 0. 013 0. 049 0. 022
Delftia 0. 007 0. 000 0. 000 0. 000 0. 004
Enterococcus 0.000 0. 002 0. OH 0. 000 0. 005
Gemini ger 0. 168 0. 149 0.104 0. 030 0. 040
Lactococcus 0. 000 0.012 0. 029 0. 00 0. 003
Subdoligranulum 0.514 0. 265 0. 582 0. 071 0. 028

注:采用Kruskal-Wallis检测计算p

通过Mann-Whitney检验比较分析四个时间点(第0天、第30天、第60天和 停止饮用30天)的差异菌属发现,20个菌属具有显著性差异(图14),其中粪球 菌属(Copmcoccus)的相对含量较0天均有增加(p=0.005),其在饮用期间和停 止饮用30天的相对含量较第0天分别增加了 2*92倍、1.10倍和1.35倍。双歧杆菌 属(.Bifidobacterium}、韦荣球菌属(畑〃。血〃a)、真细菌属、粪球菌属等有益菌 的相对含量在饮用期间均显著增加,其中双歧杆菌和韦荣球菌属在停止饮用后有下 降的现象。试验期间芽殖菌属、霍尔德曼氏菌属(Holdemania)志贺氏菌属(.Shigella) 和副拟杆菌属的相对含量有所降低。其中副拟杆菌属和志贺氏菌属分别与糖尿病和 炎症等疾病的发生呈正相关关系

  • 基于种水平分析酸马奶对肠道菌群相对含量的影响

种水平上,三个时间点样品中分别鉴定到169个、182个和170个菌种。从图 15a的柱形图可以看出,CAG患者肠道菌群中主要的菌种是多氏拟杆菌和粪便普氏 菌。通过Kruskal-Wallis检验对四个时间点的菌种含量进行比较分析发现,甲酸芽 殖菌(Gemmiger fi)rmicilis)、卷曲乳杆菌(Lactobacilhts crispatus)、约氏乳杆菌 (.Lactobacillusjohnsonii)、乳酸乳球菌〈Lactococcus lactis)Blautia faecis> Delftia lacustris^ Roseburta inulinivoransSubdoligranulum variabile 等 8 个菌种的相对含 量产生显著性变化(表12)。患者肠道中卷曲乳杆菌、约氏乳杆菌和乳酸乳球菌等 有益菌的相对含量增加。

 

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表12差异菌种的相对含量

Table. 12 The relative abundance of bacterial species

菌种名称 菌种含量(%) 戸值*
0天 30天 60天 90天
Blautia faccis 0. 04±0. 10 0. 01±0. 02 0. 00±0. 00 0. 03±0. 05 0. 030
Dclftia lacustris 0. 01±0. 01 0. 00±0. 00 0. 00±0. 00 0. 00±0. 00 0. 023
Genuni ger formic ills 0. 17±0. 15 0. 15±0. 19 0. 10±0. 13 0. 03±0. 06 0. 040
Lactobacillus crispatus 0. 00±0. 00 0. 00±0. 00 L 82±5. 65 0. 00±0. 00 0. 023
Lactobacillus Johnsonii 0. 00±0. 00 0. 00±0. 01 0. 46±1. 20 0. 00±0. 00 0. 023
Lactococcus lactis 0. 00±0. 00 0. 01±0. 01 0. 02±0. 04 0. 00±0. 00 0. 023
Roseburiinulinivorans 1. 07±l. 50 0. 15±0. 20 0. 05±0. 07 0. 55±0. 63 0.019
Subdol igranulum variabile 0. 51±0. 57 0. 27±0. 32 0. 58±L 25 0. 07±0. 08 0. 028

通过Mann-Whitney检验比较分析四个时间点的差异菌种发现,25个菌种具有 显著性差异(p<0.05)。与第0天相比较,饮用酸马奶第60天产粪笛醇真细菌 {Eubacterium coprostanoligenes)、多形拟杆菌 (.Bacteroides thetaiotaomicron)、 卵形拟杆菌(Bacteroides owtus)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfrxigilis)等14个有益 菌种的相对含量均有增加,而一些菌种如脆弱拟杆菌、多形拟杆菌等6个菌种在停 止饮用后有减少的现象。其中多形拟杆菌和卵形拟杆菌可以消化利用食物中的低聚 糖,向宿主和宿主肠道中的其他细菌提供营养。温永平等刚研究健康志愿者在连续 饮用酸马奶60天前后肠道菌群的变化,结果发现志愿者肠道中益生菌如柔嫩梭菌、 多形拟杆菌的相对含量均增加。在饮用酸马奶第60天甲酸芽殖菌、单形拟杆菌、 Blautiafaecis^共生拟杆菌(Clostridium symbiosum)等菌种的相对含量减少,其中
一些菌种如甲酸芽殖菌、共生拟杆菌等7个菌种在停止饮用后有增多的现象。从以 上结果可看出,饮用酸马奶期间肠道中的有益菌增加、条件致病菌减少,而停止饮 用后部分菌种相对含量趋向于试验前的水平,因此酸马奶对患者肠道菌群的影响是 暂时性的。

表13四个时间点差异显著菌种相对含量

Table. 13 Significant differences in the relative abundance of bacterial genus at four time points

0天 30天 60天 90天
Alistipos indistinctus 0. ll±0. 32 ” 0. 17±0. 24 " 0. 22±0. 43'1' 0. 3l±0. 711
Bactoroides caccae 0. 01±0. 02!, 0. 49±0. 98」 0. 10±0. 19' 0. 22±0. 51'
Bactoroidos doroi 0. 17±0. 15杭 7. 90±6. 53叭 10. 20±8. 47" 12. L6±1L 47'
Bactoroidos fragi1 is 0. 52±0. 87f, 1. 26±3. 231 1. 90±5. 62 "' 0. 89±2, 15(,
Bactoroides ovatus 0. 07i0. 22" 3. 02±5. 38'1 0. 73±1. 6針 1. 34±2. 58'1!,
Bac toi'oidos thotaiotaomicron 0. 39±0. 48" 0. 61±0. 581 0. 58士0. 76" 0. 37±0. 40h
Bac toroides uniforms 6. 48±6. 64" 4. 16±4. 061' 1.38±2. 19c 2. 84±2. 96'
Blautia face is 0. 04±0. 10 ' 0.01±0. 02 " 0* 00±0. 00l: 0. 03±0. 05"b
Cl os tri di urn symbiosum 0. 01±0.01i!, 0. 03±0. 0511 0. 00±0. 0111 0. 04±0. 03 L
Coprococcus comes 0. 26±0. 21b 0. 56±0. 76" 0. 96±1. 78" 1. 28±2. 37“
Esch er i chi a/ Sh ige 1 hi dysen t.eriae 0. 89±2. 03朋 1. 64±3. 64 11 2. 28±2. 76, 0. 50±0. 60卜
Eubuc t erium con tor turn 0. 01±0. 02b 0. 03±0. 04a 0. 01±0. 02"b 0. 02±0. 03 !,
Eubac terium co pros t ano ligenes 0. 35±0. 54”“ 0. 83±0. 91! 0. 43±0. 66" 0. 06±0. 14"
Eubuc teriuni ramulus 0. 10 土 0. 16"' 0. 04±0. 06" 0. 07士0. 09「 0. 04±0. 05 b
Eubacterium rec tale 3. 58±5. 50、 5. 60±7. 60" 5. 01 ±8. 22J' 9. 56±9. 01
Ge/nm iger formic ills 0. 17±0. 15 心 0. 15±0. 19' 0. 10±0. 13 d 0. 03±0. 06"
Ha emophilus para infl uenzae 0. ll±0. 221!, 0. 01±0. 03 0. 16±0. 47 '" 2. 17±6. 74'
Ho 1 deman in fil i form is 0. 0L±0. 01' 0. 01±0. 01! 0.01±0. 0111 0. 00±0. 00卜
Odoribacter splanchnicus 0. 03±0. 04" 0. 06±0. 10' 0. 01±0. 02' 0. 06±0. 12"
Oscillibac ter iralericigenes 0. 52±0. 87 ” 0. 74土0. 84" 0. 46±0. 80h 0. 48±0. 70r
Phascolai 'c tobac terium faeciuni L 89±2. 97" 2. 19±3. 631 0. 86±2. 00 0. 19±0. 47"
Rosebui 'ia inulin i i rorans 1. 07±l. 50'" 0. 15±0. 20s 0. 05±0. 07" 0. 55±0. 63"
Rumi nococcus lac tar is 0. 16±0. 41' 0. 19±0. 36' 0. 15±0. 16' 0. 17±0. 59c!
Subdoligi'anulum i^ariabi 1 e 0. 51±0. 57" 0. 27±0. 32 ' 0. 58土 1.25" 0. 07±0. 0$
Vei Lionel hi dispar 0. 07±0. 22" 0. 01±0. 02 ' 0. 46土 1. 09" 0. 52±. 61"

注:字母不同表赤具有显著性差异,P 0.05, .Vann-IVhimey检测汁算显著性差异

3. 3. 3差异分析

LEfSe 分析(LDA Effect Size)采用线性判别分析(Linear Discriminant Analysis, LDA)比较多个分组样品,进而分析不同时间点之间具有显著差异的菌群。本研究 利用该分析(LDA=3・0)筛选出13个特征性菌群(图16a) □第0天的特征性菌群 为拟杆菌门、拟杆菌纲(Bacteroidia)、代尔夫特菌属、拟杆菌目(Bacteroideles) 和Delftia lacustris ;饮用酸马奶第60天的特征性菌群为厚壁菌门、梭菌纲 (Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、肠球菌科(Enterococcaceae) > 肠球菌属 和卷曲乳杆菌;停止饮用后30天的特征性菌群为卩■变形菌纲(Betaproteobacteria) 和伯克氏菌目(Burkholderiales) □进化分枝树图(图16b)中展示了各层次水平上 具有显著差异的菌群结构。图中的红色节点即拟杆菌纲、拟杆菌目等是第0天组中 起到重要作用的菌群,绿色节点代表着第60天组中起到重要作用的菌群,黄色节点 代表无显著差异的菌群。图中拟杆菌纲(Bacteroidia)和梭菌纲(Clostridia)分别 在第0天和第60天的样品中具有显著差异。为进一步观察两个物种在饮用酸马奶期 间的变化,在门、目水平上绘制菌群相对丰度直方图(图17),图中实线和虚线分 别是物种相对丰度平均值和中值。从图中可看出,饮用酸马奶期间4个分类群的相 对丰度发生显著变化,厚壁菌门的相对丰度在每个个体中均增加,而拟杆菌门的相 对丰度具有相反的趋势(图17a, b)-梭菌目和拟杆菌目分别为厚壁菌门和拟杆菌 门的代表性菌目。虽然在目水平上每个个体的变化趋势并不是很明显,但可明显看 出与第0天相比较,在第60天梭菌目显著增多,拟杆菌目显著降低。而以上趋势在 患者停止饮用30天时发生改变。此外,伯克氏菌目的相对丰度在整个饮用酸马奶期 间几乎没有变化,但其在停止饮用后显著增加。以上结果进一步确定了酸马奶对肠 道菌群的影响是暂时性的推断,需要持续饮用一段时间,以达到患者肠道的健康化。

图16四个时间点CAG患者肠道细菌LEfSe分析图

Fig. 16 Analysis of intestinal bacteria in CAG patients at four time points by LEfSe at four time points

图17差异显著物种的相对含量

Fig.l 7 Relative abundances of differential abundant taxa

  1. 3.4肠型分析

人体肠道微生物根据其特点可分为不同类型,即“肠型”,本研究采用Arumugam 等悶人所描述的方法进行分析,结果如图18』所示,我们发现10名慢性萎缩性胃炎 患者的肠道菌群可分成两种不同的肠型,分别是BB-肠型(优势菌种为多氏拟杆菌 和单形拟杆菌)和P・肠型(优势菌种为粪便普氏菌),其中BB-肠型患者肠道微生 物群中仅存在低丰度的粪便普氏菌。饮用60天酸马奶后,所有患者的肠型保持不变 (图 18b)。

对于EB-肠型组,饮用60天的酸马奶后患者肠道菌群的优势菌种是多氏拟杆 菌,其次是普拉梭菌。然而,在第60天发现单形拟杆菌含量从9.16%降低至1.86%O 对于P■肠型组,饮用前后的肠道菌群的优势菌种均为粪便普氏菌。饮用期间,直肠 真杆菌含量从2.03%增加至13.85%,普拉梭菌含量从6.52%增加至&68%,而相反 Dialistersuccinatiphilus的含量从7.20%下降至3.26%。从以上结果可得知,不同肠 型患者饮用酸马奶后其肠型不变,但是肠道中个别优势菌种的含量产生不同程度的 变化。

图18基于K均值聚类的肠道菌群PGoA图(0天和60天)

Fig. 18 K-means clustering via PCoA of the gut microbiota (Days 0 and 60)

3.4患者肠道菌群与临床指标的相关性分析

为了分析慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群与血液生理生化指标间的关联性,通过 Spearman相关性分析探究其相关性。

图19表示的为基于属水平的肠道菌群与血常规、血脂水平和肾脏功能等血液生 理生化指标间的相关性。结果显示血小板计数与栖粪杆菌属、考拉杆菌属和巴恩斯 氏菌属呈负相关,其中栖粪杆菌属还与血小板计数、白细胞数、总肝固醇水平、尿 酸、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇呈负相关关系。考拉杆菌属还与红细胞、高密 度脂蛋白胆固醇显著正相关(p<0・05),与血小板计数、甘油三酯和尿酸显著负相 关(p<0.05) o基于属水平的肠道菌群间相关性分析中,拟杆菌属与普氏菌属负相 关,与瘤胃球菌属、巨型球菌属(Megasphawm)和副拟杆菌属正相关(p<0.05)。 罗斯氏菌属、别样杆菌属与埃希氏杆菌属/志贺氏菌属Eschwrichia/Shigwlla显著 负相关(p<0”05),与副拟杆菌属、巴恩斯氏菌属和栖粪杆菌属呈正相关关系 (pv0.05) o

图19 CAG患者肠道中细菌属与血液指标相关性分析

Fig」9 The correlation between gut microbiota at genus level and blood index in CAG patients

注:*: 0.01<p <0.05, **: OOOKp <0.01,                                       <0.001; WBC—口细胞;RBC—红细胞;HGB—血

红蛋白;PLT—血小板数;TG—甘油三酯;TC一总胆固醇;HDL-C-高密度脂蛋口胆固醇;LDL-C-低密度脂蛋口

胆固醇;ALT—丙氨酸氨基转移酶;AST—天冬氨酸氨基转移酶;BUM—尿素氮;CREA—肌酹;UA—尿酸

图20表示的为基于种水平的肠道菌群与血常规、血脂水平和肾脏功能间的相关 性。结果显示普拉梭菌与白细胞、甘油三酯、总胆固醇水平、低密度脂蛋白胆固醇

和尿酸呈显著负相关(p<0・05)。总胆固醇水平与有益菌直肠真杆菌、普拉梭菌和 多氏拟杆菌显著负相关(p<0』5)。甘油三酯与痢疾志贺氏菌呈正相关。小韦荣氏 球菌(VIsiHonellaparvula)与低密度脂蛋白胆固醇呈正相关,JGraessler等呦研究胃 旁路术治疗对患有II型糖尿病的病态肥胖症患者肠道菌群的影响,结果发现低密度 脂蛋白胆固醇与小韦荣氏球菌、螺状梭菌(Clostridium spirqfdnne)等10个菌种具 有相关性,并推测患者的血液生理生化指标的变化与肠道菌群的改变有一定关系。 基于种水平的患者肠道菌群间相关性中,粪便普氏菌与Dialistersuccinatiphilus呈正 相关,与多氏拟杆菌、单形拟杆菌、卵形假杆菌(Bactervides ovatus)呈负相关关 系(p<0.05) 0活泼瘤胃球菌(Rumiitococcus gnavus)与痢疾志贺氏菌、Dorea longicatena正相关,与Barnesiella intestinihominis>普拉梭菌负相关。血小板数与 Dialister invisus、活泼瘤胃球菌两个菌种呈显著正相关,与普拉梭菌、 Phascolarctobacterium faecium^ Barnesiella intestinihominis 呈负相关关系。

Fig.20 The correlation between gut microbiota at species level and blood index in CAG patients图20 CAG患者肠道中细菌种与血液指标相关性分析

注:*: 0.01<p <0.05, **: 00013 <0.01,                                         <0.001; WBC—白细胞;RBC—红细胞;HGB—血

红蛋白;PLT—血小板数;TG—甘油三酯;TC—总胆固醇;HDL-C—高密度脂蛋白胆固醇;LDL-C—低密度脂蛋白

胆固醇;ALT—丙氨酸氨基转移酶;AST—天冬氨酸氨基转移酶;BUN—尿素氮;CREA—肌酹;UA—尿酸

4讨论

慢性萎缩性胃炎是一种常见的慢性消化系统疾病,它会引起严重的并发症,如 胃出血,贫血,消化性溃疡,甚至会发展成肠上皮化生、胃癌。随着现代医学的发 展,临床上治疗CAG的方法越来越多,总体来说可以分成西医治疗和民族医药治 疗。西医治疗主要是缓解患者的临床症状,改善胃部黏膜组织,存在着长期使用会 容易出现不良反应,疗效不确切的现象。民族医学治疗有中医治疗、藏医治疗和蒙 医治疗等等,其中蒙医学中常用“酸马奶疗法”治疗CAG,酸马奶是一种缓解各种 临床症状包括胃肠道疾病,肺结核和其他慢性疾病的民间药物。最近研究发现人体 肠道菌群通过参与食物的代谢过程和代谢交换等方式与宿主具有紧密相连的关系。 肠道菌群的稳态对宿主的健康起到至关重要的作用,现已认为其失衡是彫响齐类疾 病发卞的币要因素,其与炎症性肠病、腹泻、肥胖等疾病密切相关。因此通过调节 肠道菌样來促进健康,预防疾病,改善症状已成为-种趋势。为了研究酸马奶对CAG 患者的影响,在本研究中招募了 55例患者,其中只有10名年龄在41-55岁的女性 患者完成试验。在60天的试验期间,每位患者每天服用3份酸马奶(每份250mL)。 根据患者的临床症状评价,我们可得知饮用酸马奶可以有效改善CAG患者的症状 并缓解病情。

为了观察酸马奶中的细菌菌群对患者肠道菌群结构的影响,本研究对其进行了 细菌多样性分析。三个时间点的酸马奶测序结果表明,其细菌群主要由厚壁菌门和 变形菌门两个菌门组成,乳杆菌属是酸马奶的优势菌属。其中,低丰度属如乳球菌 属、醋杆菌属、链球菌属和肠杆菌属之间存在显著差异。在种水平上,酸马奶中检 测到瑞士乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、开菲尔乳杆菌、副乳房链球菌等菌种,其中瑞 士乳杆菌为其优势菌种。Watanabe[70]等研究中所采集的蒙古国酸马奶中的优势菌种 为瑞士乳杆菌、马乳酒样乳杆菌和马克斯克鲁维酵母。Gesudu等旳人所研究的酸马 奶样本中乳酸乳球菌的相对含量为21%,而该研究中乳酸乳球菌的相对含量仅为 1.29%,从以L两个研究结果的差异可发现酸马奶中的微生物组成间具有较大差异, 町能吋其采集地点、季节和家庭生产条件所导致。

血液生理生化指标可快速反映患者的血液成分,血脂水平和肾肝脏功能,进而 反映其临床意义。如甘油三酯水平在患有甲状腺机能减退、糖尿病、肾病综合征等 的患者血液中增高,而在重症肝病、消化不艮等患者血液中降低。饮用60天的酸马 奶后CAG患者的血小板计数和总胆固醇水平显著降低,而其他血液指标均无显著 变化。Clemente等网研究报道肝脏,肾脏,肠道菌群和胃肠道功能可能密切相关, 因此试验中还检测了患者的肾肝脏功能。然而,肾肝脏功能的五个指标在饮用酸马 奶前后均无显著变化,表明饮用酸马奶对肾脏功能没有显著影响。血小板计数在急 性灸症和癌症疾病中起着至关重要的作用同,它们通过产生促炎因子,趋化因子和 生氏因子来促进发生炎症的过程。高血小板计数通常与胃癌、肺癌和肾癌的转移风 险的升高相关沏。Wang等泗研究表明,摄入含乳酸菌的乳制品可以降低血清胆固醇 浓度。益生菌在生长期间利用胆固醇作为营养源,并将胆固醇掺入细胞膜中,与细 胞表面结合,从而降低宿主的胆固醇水平。该研究中观察到的总肝固醇的降低可能 与酸马奶中大量的乳酸菌有关。饮用酸马奶期间显著增加的产粪當醇真细菌能将胆 固醇分解为不能被吸收的粪當醇,随着粪便排出体外,降低人对胆固醇的吸收。由 此可推断饮用酸马奶60天后血小板计数和总胆固醇水平的减少现象可能对患者有 益。

本研究从锡林郭勒盟蒙医医院招募的CAG患者肠道中,拟杆菌门是优势菌门, 其次是厚壁菌门、变形菌门和放线菌门。王佼等皿研究锡林郭勒盟的人畜肠道菌群 和土壤微生物以期探究同一环境中不同生境的微生物多样性差异,其中人肠道菌群 的优势菌门为厚壁菌门,其次是变形菌门和柔壁菌门。比较同一地区的健康人和 CAG患者肠道中的优势菌群发现其优势菌门不同,虽有个体因素和年龄的影响,但 疾病对人体肠道菌群的影响较大旳,因此推测CAG患者肠道中优势菌门可能是拟 杆菌门。Hp诱发患者发生CAG, Hp感染者患CAG的几率显著高于未感染者。Gao 等册招募47名受试者研究肠道菌群与Hp阳性胃损伤的关联性,研究发现与Hp阴 性受试者相比较,呈现Hp感染者或胃炎患者的微生物丰度和多样性略有增加,并 且Hp感染者的肠道中主要菌门为拟杆菌门(54.99%),厚壁菌门(31.37%)和变 形菌门(12.91%),其中优势菌门为拟杆菌门。这与本研究结果相一致,进一步证 明了拟杆菌门在CAG患者肠道中富集的推测。短期饮食的改变可以快速引起肠道 菌群的变化,如David等网对志愿者进行5天的饮食变换引起志愿者肠道菌群的快 速改变。本研究以第0天的样品作为对照组进行纵向分析,发现患者饮用60天的酸 马奶也使患者的肠道菌群结构发生了显著变化。然而,相较于饮用酸马奶,个体差 异对肠道菌群结构的影响更大,这与Li等關采用PacBio SMRT测序技术研究主食 变换对蒙古国志愿者肠道菌群影响的结果相一致。肠道菌群结构不仅与饮食、药物 等外界因素紧密相关,还与年龄、宿主遗传等个人因素相关(呵。早期的研究表明, 肠道菌群结构具有显著的个体差异,本研究结果也支持了此观点。此外,我们还发 现通过饮用短时间的酸马奶可以影响受试者个体的肠道菌群结构,其中某些菌群发 生显著变化。酸马奶中含有高丰度的乳酸菌,我们在患者肠道菌群中也发现乳杆菌 属、链球菌属等乳酸菌,其相对含量在试验期间降低,但差异不显著。饮用酸马奶 60天后患者肠道菌群中检测到低丰度的乳球菌属、肠球菌属等乳酸菌,而停止饮用 后未被检测到。其中乳球菌属发生显著性变化,其作为过路菌,可能对患者肠道菌 群的变化有「定程度的影响。

通过Mann-Whitney检验比较分析四个时间点的差异菌群,结果发现,双歧杆 菌属、韦荣球菌属、真细菌属等有益菌属的相对含量显著增加,与糖尿病和其他炎 症等疾病相关的条件致病菌显著减少,在种水平上,也有类似的变化现象。本研究 利用LEfSe分析进一步鉴定各时间点间在丰度上具有显著差异的菌群,结果发现厚 壁菌门和附属于厚壁菌门的梭菌目显著增加,而拟杆菌目显著降低。梭菌目被认为 是防御共生体,与拟杆菌目产生相互拮抗或相互抑制作用悶。梭菌目包括许多分解 多糖的细菌,其功能是在宿主肠道中产生短链脂肪酸⑻打在停止饮用酸马奶后,具 有显著差异的厚壁菌门,拟杆菌门,拟杆菌目和梭菌目的相对含量趋于恢复到原始 水平。从以上结果可推测酸马奶对肠道菌群的影响是暂时性的,需要持续饮用一段 时间,以达到持久的治疗效果。免疫因素是CAG发病机制之一,口身免疫稳态被 破坏从而降低宿主的致癌抗性昭。目前肠道菌群被认为是影响宿主的能量代谢以及 其免疫和中枢神经系统的重要因素,因此通过调节患者肠道菌群起到缓解CAG症 状的解释是合乎逻辑的。

[tl「个体间肠道菌群的差异,基于整体研究菌群变化不能完全揭示酸马奶对患 者肠道菌群结构的影响。研究者提出了 “肠型”的概念,即基于人体肠道菌群结构 对H进行分类,并且肠型与年龄、性别及地理无关。近几年基于肠型分析肠道菌群 的研究越来越多,Nakayama等悶在菌科的水平上分析了亚洲学龄儿童的肠道细菌群 落,并发现亚洲儿童的肠道菌群可分为P型(优势菌科为普雷沃氏菌科)和BB型 (优毎菌科为双歧杆菌科和拟杆菌科)。本研究首次发现CAG患者的肠道菌群在 种水平上具有两种截然不同的肠型。在一定程度上,我们对CAG患者的肠型分类 结果与Nakayama等人的结果相匹配,其中BB型的优势菌种为多氏拟杆菌和单形 拟杆菌,P型的优势菌种为粪便普氏菌。为研究饮用酸马奶是否会诱导任何肠型产 生特异性变化,分别分析第0天和60天两个时间点的患者肠道菌群组成。我们观察 到BB肠型的代表菌种单形拟杆菌显著减少(p=0.016)。Renouf和Hendrich昭发现, 单形拟杆菌可以降解人体肠道中的异黄酮。异黄酮主要存在于人类饮食中的大豆食 品屮。它们的化学结构类似于雌激素,它们可以降低患乳腺癌和动脉粥样硬化的风 险,并降低仓鼠的血浆胆固醇水平[6" 861 o饮用酸马奶后,单形拟杆菌相对丰度的降 低可能有利地降低异黄酮分解的速率,从而能吸收更多的异黄酮。对于P肠型的 CAG患者,饮川酸马奶之后检测到直肠真杆菌和普拉梭菌的相对含量增加,其中直 肠真杆菌有显苦变化。直肠真杆菌和普拉梭菌都是产丁酸盐的细菌,这些细菌在代 谢过程中产生丁酸,丁酸是一种重要的分子,为结肠上皮细胞提供能量,减少炎症, 抑制癌细胞生氏,并起到其他重要的主理功能沖。此外,研究发现普拉梭菌可诱导 上皮细胞中相对低含量的IL-12和大量IL-10,起到抑制炎症的作用丽,其缺乏可能 引起并增强炎症陶。饮用酸马奶第60天在P肠型的患者个体中检测到低丰度的 Dialister succinatiphilus,然而目前对这个物种的作用知之甚少,因此,这种下降的 重要性有待进一步研究。综上,可以认为饮用酸马奶对P肠型的患者更有益。

本研究利用Spearman相关性分析分析CAG患者肠道菌群与血液生理生化指标 的关系,结果发现12个菌属和13个菌种与血液生理生化指标显著相关,其中显著 减少的血小板计数与3个菌属(栖粪杆菌属、考拉杆菌属和巴恩斯氏菌属)、5个 菌种(活泼瘤胃球菌、普拉梭菌、Dialister invisus> Phascolarctobacterium faecium> Barnesiella intestinihominis显著相关,总胆固醇与1个菌属(栖粪杆菌属)和3个 菌种(直肠真杆菌、普拉梭菌和多氏拟杆菌)显著相关。Tang等丽研究发现瘤胃球 菌属与甘油三酯,胆固醇,低密度脂蛋白胆固醇显著相关(pVLOOl),与木研究结 果相一致。考拉杆菌属还与红细胞、血小板数、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和 尿酸显著相关。Li等附在研究中也发现考拉杆菌属与血清甘油三酯,总胆固醇、低 密度脂蛋白胆固醇水平和高密度脂蛋白胆固醇水平具有相关性。罗斯氏菌属、别样 杆菌属与埃希氏杆菌属/志贺氏菌属显著正相关(“<0.()5),罗斯氏菌属参与肠道代 谢产生短链脂肪酸,特别是丁酸具有刺激结肠运动、抗炎症和维持机体免疫系统的 作用剛,同时也与肠易激综合征、肥胖、II型糖尿病、神经系统病症和过敏等多种 疾病相关,是肠道健康的重要生物标志物昭。

对比饮用酸马奶前后的临床指标,发现患者血小板计数和总胆固醇降低。通过 分析试验前后肠道菌群变化,结果表明饮用酸马奶会影响患者肠道菌群结构,肠道 中的产短链脂肪酸、分解胆固醇的有益菌含量增加,条件致病菌减少。本研究的结 果表明酸马奶可以缓解患者临床症状,调节其肠道菌群结构进而对患者起到有益作用。

5结论

本研究以慢性萎缩性胃炎患者为探究对象,检测饮用酸马奶期间患者血液生理 生化指标和患者肠道菌群的变化,全面探究酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群 的影响。具体结论如下:

  • 患者饮用的酸马奶中,优势菌属为乳杆菌属,优势菌种为瑞士乳杆菌。
  • 饮用酸马奶后患者的临床症状评分显著降低,酸马奶可以改善CAG患者 的临床症状。
  • 饮用酸马奶后CAG患者肠道屮有益菌群增加,条件致病菌减少,停止饮 用后趋于恢复到原始水平。饮用酸马奶在一定程度上影响患者肠道菌群结构,而此 影响作用是暂时性的。
  • 部分肠道菌群与血液生理生化指标存在显著相关性,如栖粪杆菌属、考拉 杆菌屈等有益菌与血小板计数显著负相关,有益菌直肠真杆菌、普拉梭菌和多氏拟 杆菌与总胆固醇水平显著负相关。

致 谢

又是一年毕业季,我的三年研究生生活也接近尾声。回首三年的学习生涯,感慨万分。有 作出見美的一张图的满足,有文章收录时的欢喜,当然也有实验不顺利时的仿徨,种种万千, 历历在目。在离别之际,向给予我指导、帮助和鼓励的所有人真挚的说声:谢谢!

首先我要衷心感谢我的导师张和平教授,感谢导师在我的实验和学习中给予的指导。您精 湛的学术水平、严谨的科学态度和一丝不苟的学术精神,让我受益匪浅,是我终身学习的榜样、 追求的目标。万分感谢您不辞辛苦的谆谆教导,在此再次向老师致以崇高的敬意和衷心的感谢。

在这儿遇到乳品生物技术与工程教育部重点实验室的各位老师,我感到很幸运。感谢这个 大家庭,特别感谢孙志宏老师和刘文俊老师,感谢两位老师给予我的发展空间,感谢老师们对 我的信任和鼓励。还要感谢孙天松老师、孟和毕力格老师、陈永福老师、钟智老师、王记成老 师、包秋华老师、张文羿老师、陈霞老师、丹彤老师、葛芳老师和马俊老师,谢谢你们在学习 上的指导和实验上的帮助,在此对你们表示衷心的感谢,愿你们工作顺利,健康幸福!

感谢李晶师姐,小伙伴任敏小仙女和孙雅如在学习和生活上给予的无微不至的照顾与关心。 感谢宋宇琴师姐、徐海燕师姐、席晓霞师姐、姚国强师兄、赵洁师姐、侯强川师兄、李常坤师 兄、白晓晔师姐、余中节师兄、乌日拉嘎师姐、边燕飞师姐、马慧敏师姐、王彦杰师姐等师兄 师姐的指导与教诲。感谢赵飞燕、刘亚华、莫蓝馨、张悦、王瑞雪和李伟程等同届伙伴们对我 的鼓励和支持。感谢李敏、王佼、郑慧娟、王帅、高旭、安晓娜、姚彩青、菌种资源与生物多 样性组的任冬艳、郭艳荣、陈美埴等师弟师妹对我的支持和帮助。谢谢你们一路以来的陪伴, 愿你们每天都有小确幸!

最后,感谢我的阿爸额吉,你们对生活的态度是我人生的启明灯。谢谢你们一直以来的支 持、鼓励和包容,你们是我坚强的后盾,我爱你们。

酸马奶对慢性萎缩性胃炎患者肠道菌群的影响

参考文献

李海文.胃萎清治疗慢性萎缩性胃炎的临床疗效及作用机制研究[D].广州:广州中医药大学,2017.

陈海金,王惠吉.萎缩性胃炎丸鼠P16,BCL-2,PCNA的表达及叶酸的预防作用[J].中国老年学 杂志,2011, 31 (17) :3324-3327.

陈佳,李守英,徐红.幔性萎缩性胃炎的研究进展[J1.中国老年学杂志,2013, 33(14) : 3540-3542.

Ltol S, Oba-Shi njo S M, Marie S K N, et a I. Lifestyle factors associated with atrophic gastr i t i s among Helicobacter pylor/ -seropos i t i ve Japanese一Braz i I ians i n SAo Pau Io[J].

I nternat ionaI Journa丨 of Cl intcal Oncology, 2003, 8(6):362-368.
刘文忠,谢勇,成虹等.

51 (10) : 832-837.

第四决全国幽门螺杆菌感染处理共识报告[J].中华内科杂志,2012,
斯琴巴特尔,白阿茹娜, 敖奇等.蒙药联合酸马奶疗法治疗慢性胃炎的临床疗效观察[J].中
国民族医药杂志,2017, 23 ⑶:9-10.
Ye J, Ca i X, Yang J, et a I. Bac iI I us as a potent i a I diagnostic marker for ye I Iow tongue

coat i ng[J]. Scientific Reports, 2016, 6:32496.

Cu i J, Cui H, Yang M, et a I. Tongue coat i ng microb i ome as a potent i a I b i omarker for

gastritis including precancerous cascade [J]. Protein & Cell, 2018, 12:1-14.

Li T H, Qin Y, Sham P C, et a I. Alterations in gastric microb iota after H. Pylori

erad i catio门 and i n di ffererrt h i stological stages of gastr ic carcinogenesis[J].
Scientific Reports, 2017, 7:44935.
哈斯苏荣,阿木古楞, 芒来.酸马奶及其医学价值[J].中国中药杂志,2003, 28(1) :11-14.
孟和毕力格,乌日如人 王立平等.不同地区酸马奶中乳杆菌的分离及其生物学特性的研究[J].
中国乳品工业,2004, 32(11)

张明珠.靳疆酸马奶中乳酸茵的多态性分析及发酵性能研究[J].食品与发酵科技,2015,

51 ⑶:44-48.

Wu R N, Wang L P, Wang J C, et a I. I so I at i on and pre I i min ary prob i ot i c se I ec tion of lactobaci I I i from koumiss i n Inner Mongo I i a [J]. JournaI of Basic Microbiology, 2010, 49(3) : 318-326.

Yu J, Wang H M, Zha MS, et a I. Mo I ecu I ar i den tif icm tion and quant ifica tion of I ac tic acid bacteria in traditions I fermented dai ry foods of Russia[J]. Journal of Dai ry Science, 2015, 98(8) :5143-5154

Miyamoto M, Seto Y, Naka j ima H, et a I. Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of lactic acid bacter ia and yeasts in trad i t i onaI mongo I ian fermented milk[J]. Food

Science and Technology Research, 2010, 16(4):319-326.

Oki K, Dugersuren J, Demberel S, et al. Pyrosequencing analysis of the microbial diversity of airag, khoormog and tarag, traditional fermerrted dairy products of Mongo I i a [ J]. Bioscience & Microflora, 2014, 33(2):53-64.

其木格苏都.自然发酵酸马奶细菌多样性及其基因动态变化研究[D].呼和浩持:内蒙古农业 大学,2017.

孙天松.中国新疆地区传统发酵酸马奶的化学组成及乳酸菌生物多样性研究[D].呼和浩特: 内蒙古农业犬学,2006.

Malacarne M, Martuzzi F, Summer A, et al. Protein and fat composition of mare's mi Ik: some nutritions I remarks with reference to human a nd cow's mi Ik [J]. International Dairy Journal, 2002, 12(11) : 869-877.

包艳青.不同发酵时期酸马奶中乳清蛋白的分离及差异蛋白的初步研究[D].呼和浩特:内蒙 古农业大学,2014.

徐少泽.马奶、酸马奶的食疗和医用价值[J].中国民族医药杂志,2012, 18(2):21-22.

顾浩峰,张富新,梁蕾等.山羊奶与牛奶和人奶营养成分的比较[J].食品工业科技,2012, 33 (8):369-373.

王建光,孙玉江,芒来.马奶与几种奶营养成份的比较分析[J].食品研究与开发,2006, 27(8):146-149.

扎木苏,刘月英.酸马奶降脂及抗凝作用50例临床观察[J].内蒙古中医药,1994, 13(4):16-16.

包德必理格,吴江媛,马凤珍等.策格(酸马奶)霜倒模面膜治疗黄褐斑44例疗效观察[J].中 国皮肤性病学杂志,1998, 12(2):110-110.

查哈达.酸马奶治疗肺结核56例临床观察[J].中国民族民间医药,1999, 36(1):13-14.

苏雅拉吉日嘎,胡毕斯哈拉图.用酸马奶治疗肺结核及结核性胸膜炎58例临床疗效观察[J]. 中国民族民间医药,2005, 74(3):142-142.

原琪,赵淑萍,乌云高娃等.酸马奶治疗冠心病62例临床观察[J].慢性病学杂志,2006, 2(12):111-112.

刘金英,晓荣,王建等.针刺配合策格治疗单纯性肥胖症80例临床疗效观察[J].中国民族医 药杂志,2015, 21 (9):13-16.

斯琴巴特尔,布仁毕力格,乌萨其拉等.酸马奶治疗高脂血症临床研究[J].世界最新医学信 息文摘,2016, 16(25):192-193.

韩班布拉,斯琴巴特尔,白朝鲁等.蒙医酸马奶治疗过敏性鼻炎44例临床观察[J].中国民族 医药杂志,2017, 23 (3):5-6.

Kamada N, Chen G Y, Inohara N, et al. Control of pathogens and pathobionts by the gut microb iota (Review) [J]. Nature Immunology, 2013, 14 (7) : 685-690.

Round J L, Mazman ian S K. The gut microb iota shapes i ntest inal immune responses dur ing hea I th and d i sease [J]. Nature Rev i ews I mmuno I ogy, 2009, 9(5):313-323.

Zhou S, Xu R, He F, et a I. Di vers i ty of gut microb i ota metabo I i c pathways in 10 pa i rs of chi nese infant twins [J]. Pios One, 2016, 11 (9) : e0161627.

Me lanie D, E B K, Andrei P, et a I. Dep i ct i ng the compos it i on of gut microbiota i n a popul at ion with var i ed ethn i c origins but shared geography [J]. Nature medic ine, 2018, 24(10) : 1526-1531.

AguirreM, Eck A, Koe nen M E, et a I. Diet drives quick changes in the metabo I ic activ ity and composition of human gut mi Grobiota i n a vaIi dated invitro gut model[J]. Research in Microbiology, 2016, 167(2) : 114-125.

李晶.主食变换对蒙古国志愿者肠道菌群结构及功能影响研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大 学,2017.

Kwok L Y, Wang L, Zhang J, et al. A pilot study on the effect of Lactobacillus casei Zhang on intestinal microbiota parameters in Chinese subjects of differerrt age[J]. Benef ici a I Microbes, 2014, 5(3):295-304.

Zhang J, Wang L, Guo Z, et a 1. 454 pyrosequenc i ng revea I s changes i n the faeca I microbiota of adu I ts consumi ng Lactobacillus case i Zhang [J]. Fems Microbiology Ego I ogy, 2014, 88(3) : 612-622.

G e rard P. Gut microbi ot a and obesi ty[J]・ Cellular a nd Mo 丨 ecu I ar L i fe Sc i ences, 2016, 73(1) : 147-162.

Wang Y, Gao X, GhozIane A, et a I. Character i st i cs of fecal microb i ota in ped i atrie crohn's d i sease and the\r dynamic changes dur i ng infliximab therapy[J]. JournaI of Crohns & Colitis, 2017, 12 (3) : 337-346.

Guo Z, Zhang Jt Wang Z, et a I. I ntest i naI microbiota d i stinguish gout pat i ents from heaI thy humans[J]. Scientific Reports, 2016, 6:20602-20612.

Ma C, Sun Z, Zeng B, et a I. Cow一to一mouse fecaI transpI antations suggest intestinal micro biome as one cause of mas t i t i s [J]. M i cro bio me, 2018, 6(1) : 200-217.

Amnon A, Amit ZT Or Z, et a I. Hi gh-resoIution microbia I community reconstruction by i nt egrat i ng short reads from mu It i p I e 16S rRNA regions [J]. Nuc I e i c Ac i ds Research, 2013, 41 (22) : e205-e205.

Cao J, Yang J, Hou Q, et a I. Assessment of bacter i a I profiles in aged, home-made Sichuan paoca i br ine with vary ing t itratable acidity by PacBi o SMRT sequenc i ng techno I ogy [J]. Food Control, 2017, 78:14-23.

Hou Q, Xu H, Zheng Y, et al. Evalua tion of bacter i a I cont am in at ion in raw mi I k, ultra-high temperature milk and i nfant formuI a us i ng single mol ecule, reaI-time
sequenc i ng techno Iogy[J]. JournaI of Dairy Science, 2015, 98(12) :8464-8472.

Zhang W, Sun Z, Menghe B, et al. Shor t communication: Single mol ecu I e, rea I -t ime sequencing techno logy revealed spec i es- and strain-specific methyI at ion pmtterns of 2 Lactobacillus stra i ns [J]. Journal of Dai ry Science, 2015, 98(5):3020-3024.

Li J, Xu H, Sun Z, et a I. Effect of d i e tary i ntervent i ons on the intest inal micro bi ota of Mongo Ii an hosts[J]. Sc i ence Bui let in, 2016, 61 (20) :1605-1614.

Leonard M T, Davi s-Richardson A G, Ard i ssone A N, et a I. The methyIome of the gut microb iome: d i sparate dam methy I at ion patterns in intest i na I Bacteroides dorei\_S\. Frontiers in Microbiology, 2014, 5(361):361-368.

房静远,刘文忠,李兆申等.中国慢性胃炎共识意见[J].胃肠病学,2013, 18(01) : 24-36. 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则试行[M].北京:中国医药科技出版社,2002:120-139.

Mosher J J, Bernberg E L, Shevchenko 0, et al. Efficacy of a 3rd generation h i gh-throughpu t seque ncing p I atform for ana I yses of 16S rRNA genes from env i ronmen tai samp Ies[J]. JournaI of Microb i oIogicaI Methods, 2013, 95(2):175-181.

Caporaso J G, Kuczynsk i J, Stombaugh J, et a I. QI I ME a I I ows ana I ys i s of h i gh-throughput community sequenci ng data[J]. Nature methods, 2010, 5:335-336.

J Gregory C, Ky I e B, Bushman F D, et a I. PyNAST: a flexible too I for a I ign ing sequences to a temp I ate a Iignment[J]. Bioinformat ics, 2010, 26(2):266-267.

Edgar R C. Search and cIuster i ng orders of magn i tude faster than BLAST [J]. Bioinformat ics, 2010, 26(19) : 2460-2461.

Edgar R C, Haas B J, CI emen te J C, et a I. UCHIME improves sensitivity a nd speed of ch imera detect i on [J]. Bioi nformat i cs, 2011, 27 (16^ : 2194-2200.

Desantis T Z, HugenhoItz P, Larsen N, et a I. Greengenes: Chimera-checked 1&S rRNA gene data base and workbertGhcompa ti b I e in ARB [J]. App I i ed & En v i ronmen tai Microbiology, 2006, 72:5069-5072.

Price M N, Deha I P S, Arkin A P. FastTree: compu ting large minimum evo 丨 utiont rees with profiIes instead of a d i stance matr ix[J]. Molecular Biology & Evolution, 2009, 26(7) : 1641-1650.

Ratkowsky D A. Choos i ng the number of principal coord i nates when us i ng CAP, the canon i caI ana lysis of principal coord i nates[J]. AustraI EcoIogy, 2016, 41 (7) :842-851. McardIe B H, Anderson M J. Fitt ing multivar iate models to community data: A comment on distance-based redundancy ana Iys i s[J]. Ecology, 2001, 82(1):290-297.

Dray S, Dufour A~B. The ade4 package: imp I ement i ng the dua I i ty d i agram for eco I ogi sts [J]. Journa I of Stat i st ica I Software, 2007, 22 (4):1 -20.

Arumugam M, Raes J, Pelletier E, et a I. Enterotypes of the human gut mi crob i ome [J].

Nature, 2011, 473 (7346) : 174-180.

Sega ta N, I zard J, Wa I dron L, et a I. Metage nom ic biomarker discovery and exp la natio 门[J]. Genome Biology, 2011, 12(6):R60.

朱微微,姚憬,池美华等.中西医结合治疗在脾胃虚寒型慢性萎缩性胃炎患者中的应用效果观 察[J].世界华人消化杂志,2018, 26(36) :2120-2126.

Zeren S, Bayhan Z, Kocak F, et a I. Diagnostic vaIue of pI ate Iet/lymphocyte rat i o and neutrophiI/1ymphocyte ratio in investigations for he Iicobacter pylori gastrit is[J]. InternationaI JournaI of Cl inicaI and Exper imentaI Medicine, 2016, 9(2):5102-5106.

Ansar i M H K, Omrani Sayyah B,巳t al. Effect of Helicobacter Pylori Infeetion on

the lipid, Ii poprote i ns, apo I i poprote i n~A1, Ii poprote i n (a) and apo I ipoprotein-B i n pat i ents with gastr itis[J]. African Journal of Microbiology Research, 2010, 4(2) : 84-87.

Kodama M, Kitadai Y, Ito M, et al. Immune response to GagA protein is associated with improved platelet count after He/icobacter pylori eradication in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. He Iicobacter, 2010, 12(1):36-42.

温永平,侯强川,张和平.自然发酵酸马奶对人体肠道菌群的影响一基于PacBio SMRT测序 技术[J].中国乳品工业,2017, 45 (2):4-7.

Metage no mi c sequenc i ng of the human gut microbiome

i n obese pat ients with type 2 d i a bet es: cor re I at i on

parameters[J]. Pharmacogenomics Journa1,                             2013,

13 ⑹:514-522.

et a I. Diversity of I ac tic ac i d bacter i a and yeas ts

in A i rag and Tarag, t rad i ti ona 丨 ferme nt ed milk produc ts of Mongo I i a [J]. Wor I d Journa I

of Microbiology & Biotechnology, 2008, 24(8):1313-1325.

Gesudu Q, Y i Z, Xi X, et a I. I nvest i gat i ng bacter i a I population s tructu re and dynamics

in trad i t ionaI koumi ss from Inner Mongo I i a using single mo I ecu Ie real-time sequenc i ng [J]. Journa I of Dairy Science, 2016, 99 (10) : 7852-7863.

Cl emente J C, Urse I I L K, Laura Wegener P, et a I. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view[J]. Cell, 2012, 148(6):1258-1270.

Melania D, Sara A, Pa Ioma G L, et a I. Role of pI ate Iets i n infIammat i on and cancer: nove I therapeutic strategies [J]. Basic Clin Pharmacol Tox i co 1, 2014, 114(1) :118~127. Matow i cka K J, Kamock i Z, PoIi n ska B, et a I. PI atelets and infIammatory markers in patients with gastrie cancer[J]. Cl i n i caI & DeveIopmentaI Immuno Iogy, 2013, 2013(9214) :401623.

Wang J, Zhang H, Chen X, et al. SeIection of potential probiotic Iactobacilli for

choIesteroI-1ower ing propert ies and thei r effect on choIesteroI metaboI ism in rats fed a high-1 ipid diet[J]. JournaI of Dai ry Science, 2012, 95(4):1645-1654.

王佼,王彦杰,侯强川等.锡林郭勒牧场人畜肠道微生物及土壤微生物多样性的比较分析[J]. 科学通报,2019, 64(03) : 337-347.

Liu H N, Wu H, Chen Y Z, et a I. AI tered mo I ecu I ar s i g nat ure of intesti na I microbiota i n i rr itab Ie boweI syndrome pat i ents compared with heaI thy controls: a systematie rev i ew and meta-ana I ys i s [J]. D i ges tive and Liver D i sease, 2017, 49(4):331-337.

Gao J, Zhang Y, Gerhard M, et a I. Assoc i at i on between gut mi Grob iota and he!icobacter py/or/-related gastr i c les ions in a high-risk popuI at ion of gastrie cancer[J]. Frontiers i n Cel IuI ar and Infect i on Microbiology, 201& 8:202-214.

David L A, Maurice C F, Carmody R N, et a I. Diet rapid I y and reproduc i bly a I ters the human gut microbiome[J]. Nature, 2014, 505(7484):559-563.

Ramanan D, Tang M S, Bowcutt R, et a I. Bacterial sensor nod2 prevents i nfIammat i on of the small intest i ne by restrieting the expans i on of the commensaI bacteroides vu I gatus [J]. Immunity, 2014, 41 (2) : 311-324.

Da i suke C, Sh i geyuk i N, Sh i nsaku F, et a I. The fermentation of different dietary fibers

i s associated with fecaI clostridia levels i n men[J]. Journal of Nutr it ion, 2004, 134(8) : 1881-1886.

Ii zasa H, Ishihara S, Richardo T, et a I. Dysbi otic i nfection in the stomach [J]. WorId JournaI of GastroenteroIogy, 2015, 21(40):11450-11457.

Nakayama J, Watanabe K, J iang J, et a I. Di vers ity in gut bacterial community of schooI-age chiIdren i n As i a [J]. Scientific Reports, 2015, 5:8397-8409.

Mat h i eu R, Suzanne H. Bac tero i des un i form i s is a putative bacterial spec i es assoc i a ted w i th the degradat i on of the i sof I avone gen i ste in in human feces [J]. Jour na I of Nutr it ion, 2011, 141 (6) : 1120-1126.

Messina M, Mccaski I l-S七£“2 W, Lampe J W. Addressing the soy and breast cancer re I at i onsh i p: rev i ew, conrnentary, and workshop proceed i ngs [J]. Journa I oft he Na ti ona 丨 Cancer Institute, 2006, 98(18) : 1275-1284.

Xing-Gang Z, Me I by M K, Shaw W. Soy i sofIavone i ntake Iowers serum LDL choIesteroI: a meta-anaIys i s of 8 randomized controlIed trials i n humans[J]. Journa I of Nutr it ion, 2004, 134(9):2395-2400.

Ben jam i n J L, Hed i n C R, Koutsoumpas A, et a I. Smokers with act i ve Crohn's d i sease have a cl inicalIy re Ievant dysbiosis of the gastrointestinaI microb iota [J]. InfIammatory Bowe I D i seases, 2012, 18 (6) : 1092-1100.

Cao Y, Shen J, Ran Z H. Association between faecal ibacterium prausnitzi i reduct i on and
i nf 丨 ammatory bowe I d i sease: a meta-ana lysis and systemat i c rev i ew of the I i terature [J]. GastroenteroIogy Research and Pract ice, 2014(1):872725.

  • Tang W, Yao X, X i a F, et a I. Modu I at ion of the gut m i crob i ota i n rats by hugan q i ngzh i tab Iedur i ng the treatment of h i gh-fat~d i et-induced nona I coho Ii c fatty I i ver d i sease[J]. Ox i dat i ve med i c i ne and cel IuI ar longevity, 201& 2018:7261619.
  • Li T T, Liu Y Y, Wan X Z, et a I. Regu I a tory eff i cacy of the po I yunsatura ted fatty ac i ds from microa Igae sp i ru I ina p I atens i s on lipid metabo I i sm and gut microbi ota i n high-fat diet rats [J]. Internat i onaI JournaI of Molecular Sciences, 2018, 19(10) :3075-3085.
  • Duncan S H, Be Ienguer A, Holtrop G, et a I. Reduced d i etary intake of carbohydrates by obese sub jects resu Its in decreased concentra tions of but yrate and but yra te - product ng bacter ia in feces[J]. Appl ied and Environmental Microbiology, 2007, 73(4):1073-1078.
  • Tamana i-Shacoor i Z, Smi da I, Bousargh inL, et a I. Rosebur i a spp. : a marker of hea I th [J]. Future Microbiology, 2017, 12 (2) : 157-170.