柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎IKK/IkB/NF-kB信号通路及相关因子的影响论文

2020年4月14日17:38:42柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎IKK/IkB/NF-kB信号通路及相关因子的影响论文已关闭评论

柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎IKK/IkB/NF-kB信号通路及相关因子的影响论文

摘 要

第一部分柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎患者相关炎 症因子的影响

目的:观察中药柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎患者相关炎症因
子的影响,为该药的临床应用和进一步机制研究提供依据。方法:从
医院消化内科2017年1月一2018年4月住院病人中,选择重症急性
胰腺炎且符合纳入及排除标准的患者30例,随机分成2组,分别为
试验组和对照组,每组15例患者,对照组予以基础治疗,试验组加
用柴黄清胰活血颗粒管喂(或口服)、灌肠。于入院时(0天)、第
3天、第7天采集患者血液标本。用全自动生化分析仪检测血清淀粉
酶;采用双抗夹心酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子“、白介素
■8、核因子kB含量。结果:(1)对照组、试验组患者入院时(0天)
血清中AMY、TNFf、IL・8、NF・kB均升高,组间差异无统计学意义(P〉0.05),提示两组患者的血清炎症因子水平具有可比性。(2) 两组患者第3天、第7天与入院时(0天)相比AMY、TNF-a> IL-8> NF+B均明显下降,有显著差异(F<0・05)。试验组第3天、第7天 AMY、TNF-a> IL-8> NF・kB与对照组相比均更低,组间差异具有统 计学意义(F<0・05) o结论:(1)在基础治疗上,加用柴黄清胰活 血颗粒可以明显降低重症急性胰腺炎患者的血清淀粉酶,结合前期临 床试验结果提示柴黄清胰活血颗粒可提咼疗效。(2)在基础治疗上, 加用柴黄清胰活血颗粒可以明显降低重症急性胰腺炎患者血清 NF-kB> TNF-a> IL-8含量,提示柴黄清胰活血颗粒可以降低重症急 性胰腺炎相关炎症因子水平,从而减轻炎症反应,进一步控制病情的 发展,其抗炎作用机制可能与NF・kB信号通路有关。

关键词:柴黄清胰活血颗粒;重症急性胰腺炎;炎症因子

第二部分柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎大鼠模型 IKK/IkB/NF-kB信号通路影响

目的:观察柴黄清胰活血颗粒对SAP模型大鼠胰腺组织IkB激酶、

NF-kB抑制蛋白a、磷酸化的NF-kB抑制蛋白(X、核因子kB表达水 平的影响,以探讨IKK/IkB/NF・kB信号通路中柴黄清胰活血颗粒的可 能作用机制。方法:(1)分组:48只大鼠随机分为3组,即SAP 模型组、假手术组、实验组。(2)造模:用3.5%牛磺胆酸钠,剂量 为lml/kg,经十二指肠乳头逆行胰胆管注射制备大鼠SAP模型;假 手术组大鼠开腹,翻动腹腔脏器后关腹。(3)配药:将柴黄清胰活 血颗粒配制成浓度为0.16g/m 1的药液。(4)给药:实验组予以配制 好的药液灌胃,10ml/kg/次,每4小时1次(0-6时不予以灌胃); 假手术组及SAP模型组用相同剂量的生理盐水灌胃。(5)取材:于 术后12h、24h共2个时间点,分别处死大鼠8只,进行大体解剖观 察,腹腔动脉采血,取出完整胰腺组织。(6)检测:用全自动生化 分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶;用实时定量PCR法检测胰腺组织 IKK卩、IkBolhiRNA的表达;用蛋白质免疫印迹法检测胰腺组织IKK卩、 IkBq> plKBa S白的表达;免疫组化法检测胰腺组织NF-kBP65的表 达。结果:(1)与假手术组相比,SAP模型组血清AMYLIP活性 均升高,差异具有显著性(p<0.05);实验组12h血清AMYLIP 活性与模型组比较均下降,24h活性更低,差异具有统计学意义

(p<0.05) o (2) SAP模型组胰腺组织IKK卩mRNA表达与比假手术 组高,差异具有统计学意义(p<0・05);与SAP模型组相比,实验组 胰腺组织各个时间点上IKKpmRNA表达减少,差异具有统计学意义

(p<0.05);与SAP模型组比较,实验组胰腺组织各个时间点上 iKBamRNA表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。(3) SAP 模型组IKK卩和plKBa蛋白表达量与假手术组比较均上升,差异具有 显著性(p<0.05);与SAP模型组比较,实验组胰腺组织IKK卩和 plKBa蛋白表达量均下降,差异具有显著性(p<0.05);与假手术组 比较,SAP模型组胰腺组织IkBq蛋白表达量较低,差异具有统计学 意义(p<0.05);与SAP模型组比较,实验组胰腺组织各个吋间点上 IkBu蛋白表达量升高,差异具有统计学意义(p<0.05) o (4) SAP 模型组和实验组胰腺组织NF-KBp65阳性表达及评分与假手术组比较 均升高,差异具有统计学意义(p<0.05);与SAP模型组比较,实验 组12h24h胰腺组织NF-kBP65阳性表达及评分均降低,24h较12h 表达更低,差异具有统计学意义(p<0.05) o结论:(1) SAP模型 组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶升高,结合前期研究基础结果提示造模成 功。(2) SAP模型组大鼠胰腺组织IKK卩、PIkBq> NF-kBP65表达 升高,IkBoi表达降低,提示重症急性胰腺炎时IKK/IkB/NF・kB信号 通路可能被激活,其激活与IKK卩活化和IkBq磷酸化有关系,进而 可能引起炎症介质释放聚集,加重炎症反应。(3)柴黄清胰活血颗 粒对胰腺组织IkBolhiRNA和IkBoi蛋白表达有上调作用,同时下调 IKK卩、PIkBq> NF-kBP65表达,提示重症急性胰腺炎时,柴黄清胰 活血颗粒可抑制IKK/IkB/NF・kB信号通路,减少炎症介质释放,可能 是其治疗SAP的机制之一。

关键词:重症急性胰腺炎;柴黄清胰活血颗粒;IKKP; IkBq; NF-kB

Effect of Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule on

IKK/IkB/NF-kB Signal Pathway and Related Factors in Severe
Acute Pancreatitis

ABSTRACT

First Part Effect of Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule on Serum Related Inflammatory Factors in Patients with Severe Acute Pancreatitis

Objective:To observe the effect of Chinese medicine Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule on inflammatory factors in patients with severe acute pancreatitis, and to provide evidence for clinical application and further study of this drug.Methods:From the inpatients of the Hospital of Gastroenterology from January 2017 to April 201& 30 patients with severe acute pancreatitis who met the inclusion and exclusion criteria were randomly divided into two groups, the experimental group and the control group. 15 patients in each group, the control group was given basic treatment, and the experimental group was fed with Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule tube (or oral) and enema.Blood samples were collected from patients at admission (0 days), 3 days, and 7 days. Serum amylase was detected by automatic biochemical analyzer. The levels of tumor necrosis factor-a? interleukin-8 and nuclear factor-KB were detected by double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Results: (1) In the control group and the experimental group, serum AMY,TNF-a? IL-8 and NF-kB were increased at admission (day 0),and there was no significant difference between the two groups (P>0.05). Serum inflammatory factor levels were comparable between the two groups. (2) AMY, TNF-a5 IL-8 and NF-kB were significantly decreased on the 3rd and 7th day of the two groups compared with the admission (0 days), the difference was statistically significant (P<0.05).. On the 3rd and 7th day of the experimental group, AMY, TNF-a? IL-8 and NF-kB were lower than the control group, and the difference between the groups was statistically significant (P<0.05).Conclusion: (1) In the basic treatment, the addition of Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule can significantly reduce serum amylase in patients with severe acute pancreatitis. Combined with the results of previous clinical trials, Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule can improve the curative effect. (2) In the basic treatment, the addition of Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule can significantly reduce the serum levels of NF-kB9 TNF-a and IL-8 in patients with severe acute pancreatitis, suggesting that Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule can reduce the inflammatory factors associated with severe acute pancreatitis. Levels, thereby reducing the inflammatory response, further control the development of the disease, and its anti-inflammatory mechanism may be related to the NF-kB signaling pathway.

Key words:Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule; Severe Acute Pancreatitis; Inflammatory Factors

The Second Part TWO Effect of Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule on IKK/IkB/NF-kB Signaling Pathway in Rat Model of Severe Acute Pancreatitis

Objective: To observe the effect of Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule on the expression of IkB kinase5 NF-kB inhibitory protein a? phosphorylated NF-kB inhibitory protein a and nuclear factor kB in pancreatic tissue of SAP model rats? in order to To explore the possible mechanism of action of Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule in IKK/IkB/NF-kB signaling pathway .Methods: (1) Grouping: 48 rats were randomly divided into 3 groups, namely SAP model group, sham operation group and experimental group . (2) Modeling: Rat model of SAP was prepared by retrograde injection of pancreaticobiliary tube with 3.5% sodium taurocholate at a dose of lml/kg. The rats in the sham operation group were opened, and the abdominal organs were turned over, belly. (3) Dispensing: The Chai Huang Qing Yi Huo Xue was formulated into a drug solution having a concentration of 0.16g/ml.                                 Administration: The experimental group was intragastrically administered with a solution of 10 ml/kg/time5 once every 4 hours (not administered by 0-6); the sham operation group and the SAP model group were orally administered with the same dose of normal saline. (5) Materials: 8 rats were sacrificed at 12h and 24h after operation, and 8 rats were sacrificed. Gross anatomy was observed, blood was taken from the celiac artery, and pancreatic tissue was completely removed. (6) Detection: serum amylase and lipase were detected by automatic biochemical analyzer; the expression of IKK and IkBoi mRNA in pancreatic tissue was detected by real-time quantitative PCR; the expression of IKKIkBoi and plKBa protein in pancreatic tissue was detected by Western blotting. The expression of NF-KBp65 in pancreatic tissue was detected by immunohistochemistry. Results: (1) Compared with the sham operation group, the serum AMY and LIP activities of the SAP model group were increased, the difference was significant (p<0.05); the serum AMY and LIP activities of the experimental group were decreased compared with the model group for 12h,24h. The activity was lower and the difference was statistically significant (p<0.05). (2) The expression of IKK mRNA in pancreatic tissue of SAP model group was higher than that in sham operation group (p<0.05). Compared with SAP model group, the expression of IKK mRNA was decreased at various time points in the experimental group. The significance of the study (p<0.05); compared with the SAP model group, the expression of IkBoi mRNA in the pancreatic tissue of the experimental group increased at each time point, the difference was statistically significant (p<0.05). (3) The expression levels of IKK and plKBa in the SAP model group were significantly higher than those in the sham-operated group (p<0.05). Compared with the SAP model group, the expression levels of IKK and plKBa in the pancreatic tissue of the experimental group decreased. There was significantness (p<0.05). Compared with the sham operation group, the expression of IkBoi protein in pancreatic tissue of SAP model group was lower, the difference was statistically significant (p<0.05). Compared with SAP model group, the pancreatic tissue of experimental group was used at different time. The expression of IkBoi protein was increased at the point, and the difference was statistically significant (p<0.05). (4) The positive expression and score of NF-KBp65 in pancreatic tissue of SAP model group and experimental group were significantly higher than those in sham operation group (p<0.05). Compared with SAP model group, the experimental group was 12h,24h pancreas. The positive expression and score of NF-KBp65 were decreased, and the expression was lower at 24h than at 12h,the difference was statistically significant (p<0.05). Conclusion: (1) The serum amylase and lipase of the SAP model group were elevated, and the results of the previous study combined showed that the model was successful. (2) The expression of IKKplKBa and NF-KBp65 in pancreatic tissue of rats in SAP model group was increased, and the expression of IkBoi was decreased, suggesting that IKK/IkB/NF-kB signaling pathway may be activated in severe acute pancreatitis, activation and activation of IKK.There is a relationshipbetween phosphorylation of IkBoi,which may cause the release of inflammatory mediators and aggravate the inflammatory response. (3) Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule has up-regulated the expression of iKBamRNA and IkBoi protein in pancreatic tissue, and down-regulated the expression of IKKplKBa and NF-KBp65? suggesting that Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule can inhibit IKK/IkB/NF-kB signaling pathway in severe acute pancreatitis. Reducing the release of inflammatory mediators may be one of the mechanisms for its treatment of SAP.

Key words:Severe acute pancreatitis; Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule; [KK;IkBoi; NF-kB

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一种临床上 常见的急危重症,有复杂的病情变化,多样的病理生理改变以及病情 危重等特点。SAP发病后易引起并发症,包括全身性炎症反应综合征 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS)> 全身感染、多器官 功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)等,具 有较高的死亡率2〕。SAP从本质上来讲就是一种全身性炎症反应, 主要原因是较多的促炎因子和炎症介质释放到血液中,产生氧白由 基,炎性因子被激活,大量炎性因子汇聚从而产生级联反应,引起胰 腺损伤加重、病情恶化、多器官衰竭等情况,最严重者导致死亡。随 着对急性胰腺炎发病机制的不断研究探索,在急性胰腺炎发生发展过 程中,核因子 kappa B(nuclear factor kappa B, NF-kB)和炎症介质的 作用不断受到重视吐习,而NF・kB信号通路可直接参与肿瘤坏死因子 -a (tumor necrosis factor-a, TNF-a)等炎症介质的表达和调控,是控 制炎症反应的重要通路之一。

在SAP疾病发展过程中,NF+B是其炎症介质网络的中心桥梁; 在SAP炎症反应中有着重要作用⑹,故抑制核因子信号通路是改 善炎症反应的有效方法之一。有研究表明,用胆囊收缩素制作SAP 大鼠模型后发现其胰腺组织中NF-kB被激活⑺。说明NF・kB信号途 径与SAP之间有着重要的联系。NF-kB是Sen和Bahimoer在1986 年研究时提取出的一种蛋白因子,它能与免疫球蛋白轻链基因的增强 子kB序列特异结合⑻。静息状态下,NF+B与NF・kB抑制蛋白

(NF-kappa-B inhibitory protein, IkB)结合成复合物,以非活性形式 存在。在NF-kB信号通路中,IKK/IkB/NF-kB通路是其经典途径之一, 受特异性外界刺激时,IkB激酶(IkB kinase, IKK)活化,IkB磷酸 化,磷酸化后的IkB经相应酶识别后降解,NF・kB二聚体被释放出来, 与其DNA结合,从而诱导目标基因转录,生成相应的mRNA及蛋白 质⑼。NF+B抑制蛋白能抑制NF+B的活性MM。在IkBs家族成员 中,NF-kB 抑制蛋白 a (NF-kappa-B inhibitor alpha, IkBoi)主要介导 NF-kB的基础抑制,是抑制NF-kB活性的最重要成分。而磷酸化IkBq

(plKBa)的多少对于NF・kB信号通路的活化有重要意义。在NF+B 信号途径中,主要成员是IkB激酶家族(the Ikappa B kinases, IKKs), 能使IkB与NF-kB分离,激活NF-kB o IkB激酶主要组分为 IKKa(IKKl)、IKK卩(IKK2)、IKKy (NEMO)。研究表明在大多数经 典NF・kB信号通路中,IKK卩是磷酸化IkBoi所必需的;并且在导致 和促进炎性作用上,IKK卩作用比IKKoi作用更大。经研究,对NF・kB 蛋白而言,IKK卩可以直接将其磷酸化,特别是对P65亚基QI。NF-kB 活性的调控需要NF・kB发挥活性作用,首先要与IkB分离,IkB降解 后才能与NF+B分离,而IkB降解的前提是自身磷酸化,磷酸化的 前提是IKK发挥活性作用。IKK、IkB与NF-kB构成重要的信号转导 通路,NF-kB可诱导细胞因子TNF-a、白介素-8 (interleukin-8, IL-8) 等炎性靶基因的过度表达,促使中性粒细胞等炎性细胞大量浸润,导 致炎症反应。有研究表明,NF+B在急性胰腺炎发病、病情进展过程 中发挥着重要作用,NF・kB活化可促进炎细胞浸润、聚集,因此抑制 NF-kB能够减轻胰腺炎病情。所以,NF+B信号通路与胰腺炎发生发 展有密切联系。

柴黄清胰活血颗粒(Chai Huang Qing Yi Huo Xue Granule)是我院 治疗SAP的有效经验方柴黄清胰活血方加工而成。本课题组前期研 究证实柴黄清胰活血颗粒可明显改善胰腺炎症状,降低白细胞计数和 C・反应蛋白等炎症指标,保护肝肾功能等作用,但其作用机制尚未完 全清楚。而NF-kB与炎症反应密切相关,本研究拟观察柴黄清胰活 血颗粒作用于重症急性胰腺炎时IKK/IkB/NF・kB信号通路的变化, 以探讨其作用机制,为该药院内制剂的申报,以及新药的开发提供 依据。

第一部分柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎患者血清相关炎症 因子的影响

资料与方法

  • 临床资料

1.1研究对象

从2017年1月至2018年4月医院消化内科住院的重症急性胰 腺炎患者(SAP)中选择符合纳入以及排除标准的SAP患者30例。 按照随机数字表法,随机分为试验组(柴黄清胰活血颗粒组)和对照 组,每组15例患者。其中试验组男8例,女7例,年龄:19-74岁, 平均年龄:48.60±17.48岁。对照组男9例,女6例;年龄:28・73岁, 平均年龄:51.7±13・42岁。两组患者在性别,年龄上无统计学差异, 一般资料具有可比性。

1.2诊断标准

1.2.1西医诊断标准

急性胰腺炎临床诊断标准参照《急性胰腺炎诊治指南(2014)》[旧o 与以下标准中的两项相符合即诊断为AP:①急性发作且为持续性腹部 疼痛②血清淀粉酶(semm amylase, AMY)至少高于正常上限值3倍 ③腹部影像学检查和AP影像学变化相符合。重度急性胰腺炎:符合 AP诊断标准,伴有持续性(〉48h)器官功能障碍(单个或多个器官),改 良Marshall评分三2分。

1.2.2中医诊断标准

参照国家中医药管理局颁布的《中药新药治疗急性胰腺炎的临床 指导原则》。以湿热阻滞为主要证型的腹痛,主要临床表现为腹部剧 烈疼痛,胀满拒按,口干口渴,汗出身热,大便干结难解,小便黄, 舌质红,苔黄燥或黄腻,脉滑数。

1.3纳入标准

符合中医、西医诊断标准,在18・75岁年龄之间,同意并签署知 情同意书。

1.4排除标准

  • 发病到住院时长超过72h; (2)年龄在18岁以下,75岁以

上;(3)入院前已使用中药治疗;(4)入院时已有脑、肝、肾等脏 器功能不全;(5)对实验药物过敏。

1.5剔除标准

  • 不在纳入标准内却纳入;(2)受试者不愿配合,缺乏观察记 录;(3)使用对试验结果有干扰的药物者;(4)患者无理由白行要 求退出。

1.6终止实验标准

  • 有严重的不良反应者,马上停止试验,立即采取应对治疗;
  • 治疗中发现对试验药物不敏感或无反应者,应停止试验;(3) 受试者无原因要求终止退出的。

1.7病例脱落的处理

(1)当受试者不愿意继续参加试验,要求退出,研究人员应先 与受试者联系,咨询退出原因,条件允许情况下尽可能完成试验;(2) 对参加试验的患者,均整理、保存相关资料,无论中途是否退出试验;

(3)脱落率应<20%o

1.8伦理

该研究项目已取得医院伦理委员会的同意。

  • .研究方法

2.1给药方法

基础治疗:有西医常规治疗和中医常规治疗。西医常规治疗按照 《急性胰腺炎诊治指南(2014)》心。包括一般治疗(禁食、吸氧、心电 监护、胃肠减压)、液体补充、抑制胰腺外分泌、营养支持、预防感 染等。中医常规治疗:医院制剂室提供的白制中药胰痺帖(由大黄、 芒硝等中药组成)外敷上腹部+TDP照射,每天一次,每次20分钟。

试验组在基础治疗上加用柴黄清胰活血颗粒(来白医院制剂室, 由生大黄、桃仁等14味中药组成 规格:10g/袋)管胃(或口服)、灌 肠。具体用法:10g柴黄清胰活血颗粒+ 100ml温开水(34°C左右)混 合后管胃(或口服)、灌肠,早上6点到晚上12点,4小时一次(晚 间12点至清晨6点停止,以利于患者休息)。根据患者腹痛情况及 指标变化调整管胃(或口服)及灌肠次数。

对照组只予以上述西医和中医常规治疗。

2.2标本留取

两组患者分别于入院时(0天)、第3天、第7天进行采血收集 标本,收集血液后经5000rpm离心lOmin,离心后取上清液,储存在 ・80°C冰箱中。

2.3检测指标

采用双抗夹心酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测入院时(0 天)、第 3 天、第 7 天血清TNFf、IL・8、NF-kB,用全自动生化分析仪检测入院时(0 天)、第3天、第7天血清AMY,检测后比较AMY、TNF-a> IL-8>TNF-a具体检测步骤(参照试剂说明书)将TNF-a抗体预先包被于微孔板中,与样本和标准品中的TNF-a 相结合,然后加入生物素化的TNF-a抗体,结合成免疫复合物。加 入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素与之特异性结合,彻底洗涤 后加入显色底物。若反应中有TNF-a,无色显示剂在过氧化物酶的催 化下成蓝色。用酶标仪在450mn波长下测定吸光度(O.D.值),可 通过绘制的标准曲线求出样本中TNF-a的浓度。

  • 首先取出血清样本置于室温下。
  • 加样:在标准孔加lOOul标准品,空白孔加相同标准品稀释液, 其余孔中加血清样本各lOOuh酶标板覆膜,37°C孵育60mino
  • 弃去液体,用力甩尽孔内液体。
  • 每孔滴加提前准备好检测溶液A工作液lOOyL,酶标板覆膜, 37°C孵育1小时。
  • 弃去液体,每孔加入洗涤液350uh静置30s后甩尽液体,洗涤 过程中反应孔内残留的洗涤液应在吸水纸上拍干。洗板3次。
  • 每孔滴加提前准备好检测溶液B工作液lOOyL,酶标板覆膜, 37°C孵育1小时。
  • 手工洗板5次,方法同步骤5。
  • 每孔加入显色底物(TMB) 90uh 37°C下避光显色。
  • 每孔加入终止液50uh终止反应,混匀后立即用立即用酶标仪 在450nm波长测量各孔的光密度值(D.值)。
  • 以标准品的浓度作横坐标,OD值作纵坐标,绘制标准曲线。 通过每个人血清样本的OD值可在标准曲线中找到其浓度。TNF-a标 准曲线见图lo

<浓度/稀释度〉

图1 ELISA检测人血清中TNF-a水平标准曲线图

Fig. 1 Standard curve of ELISA for detecting TNF-a levels in human serum

  • IL・8、NF・kB检测原理、操作步骤同TNF-ao
  • 统计学方法

采用excel建立数据库,用SPSS20.0统计软件对数据进行统计分 析,计量资料服从正态分布以均数士标准差(丘土s )表示,组间比较 采用多次重复测量方差分析和独立样本/检验,组内两两比较采用 LSD-q法,以显著性水平P<0.05为有统计学意义。

两组患者血清淀粉酶比较

试验组和对照组患者入院时(0天)淀粉酶分别为

1486・36±466・29U/L, 1504.60±408.85U/L,入院时(0 天)淀粉酶比较 P=0.823,差异无统计学意义。两组患者第3天、第7天与入院时淀 粉酶比较均下降,差异具有统计学意义(F<0・05)。试验组第3天、 第7天淀粉酶与对照组比较更低,组间差异均具有统计学意义

(F<0・05) o 见表 1、图 2、3o

表1血清淀粉酶比较(U/L, X ±5 )

Table 1 Comparison of serum amylase (U/L, 兀土 S )

组别 例数 入院时(0天) 第3天 第7天      尸组间值 尸值
试验组 15 1486.36±466.29 220.52±19.74ab 84.73±22.66ac  
        1.755 0.196
对照组 15 1504.60±408.85 362.76±55.09 138.5U33.76  
/值   0.226 9.413 5.122  
尸值   0.823 <0.001 <0.001  
注: :a为与对照组比较P<0.05, b为与入院时 (0 天)比较 FV0.01, c为与第3

天比较尸<0.01。

图2两组患者不同时间点血清淀粉酶均数图

(#为与对照组比较P<0.01o )图3两组患者不同时间点血清淀粉酶柱状图

Fig.3 Comparison of histograms in serum amylase group at different time points
between the two groups

(# is P<0.001 compared with the control group.)

2.两组患者TNF-a比较

试验组患者入院时(0天)TNF-a为153.15±33.69pg/ml,对照组 入院时(0天)TNF-a为150.94±33.12pg/ml,两组患者入院时TNF-a 比较P=0.858,差异无统计学意义。两组患者第3天、第7天与入院 时(0天)比较TNF-a均降低,差异具有统计学意义(F<0・05)。试 验组第3天、第7天TNF-a与对照组比较显著降低,组间差异具有 统计学意义(FV0.05) o见表2、图4、5o

表 2 TNF-a 含量比较(pg/ml, X ±5 ) Table 2 Comparison of TNF-acontent (pg /ml,兀土 S )

组别 例数 入院时(0天) 第3天 第7天 尸组间值尸值
试验组 15 153.15±33.69 96.93±9.50ab 66.04±10.89ac 5.627        0.025
对照组 15 150.94±33.12 113.32±24.45 98.66±13.39  
/值   0.181 2.421 7.320  
尸值   0.858 0.022 <0.001  

注:a为与对照组相比P<0.05; b为与入院时(0天)比较P<0.01; c为与第3

天比较P<0.01o

Fig.4 Serum TNF-a mean at different time points in the two groups图4两组患者不同时间点血清TNF-a均数图

图5两组患者不同时间点血清TNF-a柱状图

Fig.5 Serum TNF-a histogram at different time points in the two groups
(#为与对照组比较p<0.01o )

(# is P<0.01 compared with control group.)

3.两组患者IL・8比较

试验组与对照组患者入院时(0天)IL・8分别为:68.49±9.79pg/ml> 70.81±.85pg/ml,两组比较P=0.50L差异无统计学意义。试验组和对 照组第3天、第7天与入院时(0天)比较均降低(户<0・05),差异具 有统计学意义。试验组第3天、第7天与对照组相比更低,组间差异 均具有统计学意义(FO.05) o见表3、图6、7o

表3 IL-8含量比较(pg /ml,兀土 $ ) Table 3 Comparison of IL-8 content (pg /ml, 兀 ± ')

组别 例数 入院时(0天) 第3天 第7天 F组间值 尸值
试验组 15 6&49±9.79 33.71±9.22ab 10.89±3.64ac 28.751 <0.001
对照组 15 70.81±.85 48.31 土 10.15 31.7H9.22    
/值   0.682 4.121 9.232    
尸值   0.501 <0.001 <0.001    

注:a为与对照组比较P<0.05; b为与入院时(0天)比较P<0.01; c为与第3

图6两组患者不同时间点血清IL・8均数图

Fig.6 Serum IL-8 mean at different time points in the two groups

图7两组患者不同时间点血清IL-8柱状图
(#为与对照组比较p<0.01o )

Fig.7 Serum IL-8 histograms at different time points in the two groups

(# is P<0.01 compared with control group.)

4.两组患者NF・kB比较

试验组患者入院时(0天)、第3天、第7天NF+B分别为

59.16±7.79pg/ml、26.19±5.02pg/mk 13.87±3.69pg/mb 各个时间点 间差异均具有统计学意义(P<0.05)o对照组患者入院时(0天)、第3天、第 7 天 NF-kB 分别为 59・73±8.10pg /ml、36.60±4.02pg /ml、21.36±3.69pg/ml,各个时间点间差异均具有统计学意义(户<0・05)。试 验组第3天、第7天NF+B与对照组比较更低,差异均具有统计学 意义(P<0.05)o表明试验组NF・kB降低更明显。见表4、图8、9o

表4 NF-kB含量比较(pg/ml,兀土S)

Table 4 Comparison of NF- k B content (pg /ml,兀 ± ')

组别 例数 入院时(0天) 第3天 第7天 F组间值 尸值
试验组 15 59.16±7.79 26.19±5.02ab 13.87±3.69ac 10.721 0.003
对照组 15 59.73±8.10 36.60±4.02 21.36±3.69    
/值   0.195 5.021 5.134    
尸值   0.847 <0.001 <0.001    

注:a为与对照组比较P<0.05; b为与入院时(0天)比较P<0.01; c为与第3

天比较P<0.01o

图8两组患者不同时间点血清NF・kB均数图

豳对照组 固试验组
:■
SH5
SH5
SH5
时间(天)

Fig.8 Mean NF-kB in different groups of patients at different time points

图9两组患者不同时间点NF・kB柱状图(#为与对照组比较p<0.01o )

Fig.9 NF-kB histogram at different time points in the two groups

(# is P<0.01 compared with control group.)

.现代医学对SAP的认识及治疗方法

AP是我国常见的消化系统疾病,其中SAP并发症多,病死率高。

SAP发病机制复杂,目前并未完全阐明清楚。炎症介质与细胞因 子、胰酶自身消化、微循环障碍等多种学说是目前主要研究机 制。在治疗SAP上,现代医学多采用综合内科治疗方法,当病情 恶化时选择手术治疗网。内科治疗包括限制性液体复苏、脏器功能的 维持与替代、抗生素的合理使用、营养支持、血液净化、内镜治疗等 "-I®,采用西医方法治疗SAP,可使并发症发生率、病死率较前下降, 但住院时间仍长,治疗费用高。许多研究表明,治疗重症急性胰腺炎 时,合用中成药制剂比单独使用西医治疗的效果更显著,并有其独特 的治疗优势。

  1. 中医对SAP的认识及治疗方法

胰腺名称虽未在中医古典文献中被提及,但记载有胰腺解剖位 置、形态、功能。如《十四经发挥》载:“脾广三寸,长五寸,掩平 太仓,附着于脊之第十一椎” o目前中医将SAP归属于“胰痺”、

“胁痛”、“腹痛”、“脾心痛”等病证范畴。本病诱因多为外感湿 热时邪、饮食不节、喜食肥甘厚腻等,病机初为湿热内阻中焦、瘀血 阻滞,最终成热毒炽盛,瘀热内阻。目前西医对SAP发病机制的认 识、研究多倾向于“炎症介质和细胞因子学说”、“胰腺微循环障碍 学说” o而“炎症”对于中医来讲类似于“湿、毒、热”,“微循环 障碍”类似于“瘀”,在研究SAP病因病机上,传统中医和现代医 学的观点大致相同,即“湿毒蕴结,瘀热阻滞”。从SAP病因病机 出发,中医首要治疗原则多为清热解毒、祛湿通腑泄热、活血化瘀止 痛。孙海霞M将58例SAP患者分为对照组和观察组,观察组在常规 治疗上加用中药汤剂口服和灌肠,结果表明观察组可提高有效率,改 善患者腹痛等症状,降低血尿淀粉酶等,并且优于对照组。张昊天等 问将SAP患者分为两组,对照组42例、试验组45例,对照组治疗 采用单纯西医方法,试验组在对照组治疗上加中药大承气汤鼻饲或口 服,结果提示加用大承气汤可明显降低TNFf、白介素・6 (IL・6)、 IL・8等指标。治疗急性胰腺炎,若加用有清热解毒、通里攻下作用的 中药管胃,与单纯西医常规治疗相比较,更能促进胃肠道功能恢复, 改善临床症状,降低炎性因子,减轻炎症反应[⑼。

3 •柴黄清胰活血颗粒的组成及治疗作用

柴黄清胰活血颗粒是我院消化内科使用20余年的有效经验方 “柴黄清胰活血方”加工制成。方中有生大黄、厚朴、赤芍、黄苓 等14味中药。其组成中:生大黄通腑泄热、解毒利湿;柴胡疏肝 行气;梔子清肝胆热;厚朴行气导滞;赤芍理气止痛;丹参活血 祛瘀;甘草调和,诸药同用行通腑泄热、清热解毒、行气活血、化 瘀止痛之功。现代药理学研究显示,大黄主要成分可抑制NF・kB信 号通路激活,减少炎症介质TNF-a> IL-8等释放,从而减轻炎症反 应,改善微循环[20-23]o柴胡皂昔是柴胡有效成分,柴胡皂昔可抑 制NF・kB活化,减少IL・6、TNF-a等生成,从而起到抗炎作用 [24-25]。厚朴其主要药理活性成分厚朴酚可抑制炎性酶/细胞因子生 成,抑制NF-kB激活和白细胞的活化;下调人类NF-kB相关炎症基 因产物IL・8、TNF-a表达,起到抗炎作用臥旳。梔子昔是梔子主要 有效成分,研究发现具有抗炎作用,抑制NF・kB通路的活化是 其抗炎作用机制,它可以减少细胞炎症因子释放;对于胰淀粉 酶活性起到降低作用,有利胰、降胰酶活性的作用[28-29]o赤芍 有抗炎、抗氧化、抗内毒素等药理作用,芍药昔是其抗炎的主要成分; 芍药昔可抑制TNFf、白介素・1 (IL・1卩)、环氧合酶-2(COX-2)等炎 症介质的上调,从而抑制JNK、p38 MAPK的活化㈤]。丹参酮作为 丹参的主要有效成分,有抑制NF・kB信号通路的作用,能降低 TNF-a> IL-ip表达,有抗炎、抗氧化、保肝等作用[31-32]o

本课题组前期研究表明柴黄清胰活血颗粒具有改善肠粘 膜屏障的作用卩叫 能显著降低SAP患者白细胞计数,提高钙离子 水平,缩短住院时间等卩铁能减少SAP模型大鼠腹水量和白细胞计 数,改善胰腺组织病理评分,减少血清C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)含量,降低天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminolransferase, ALT)、尿素 氮(blood urea nitrogen, BUN),保护肝肾功能等作用[均。综上所 述,柴黄清胰活血颗粒治疗SAP可能有抗炎、改善微循环、 抗氧化等药理学作用,但具体作用机制尚未完全明确。

4•柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎患者血清AMY、

TNF-ax IL-8NF-kB 的影响

4.1柴黄清胰活血颗粒对血清AMY的影响

诊断急性胰腺炎,血清淀粉酶不仅是常用指标,也具有特异性。 胰腺是淀粉酶的主要来源,重症急性胰腺炎时,血清淀粉酶较早升高, 升高明显,起病6-12小吋开始升高。试验组、对照组患者入院吋淀 粉酶都升高,大于正常值3倍以上。两组患者第3天、第7天血清淀 粉酶与入院时比较均降低,差异具有统计学意义(FV0.05)。试验组 第3天、第7天淀粉酶与对照组相比均降低,差异具有统计学意义 (F<0・05) o说明柴黄清胰活血颗粒可以显著降低重症急性胰腺炎患 者血清淀粉酶水平,促进胰腺功能恢复,加快病情好转。

4.2柴黄清胰活血颗粒对血清TNF-a水平的影响

TNF-a作为一种细胞因子,它主要由激活的单核巨噬细胞分泌而 成。TNF-a在炎症反应时最先升高,也起到核心作用,可引起多种炎 性因子释放。急性胰腺炎时,TNF-a被大量激活,因炎性细胞浸润损 伤腺泡细胞,并引起胰腺进一步坏死;同时,TNF-a可刺激下游 IL・6、IL・8等炎性因子释放,反之,炎性因子反向刺激大量TNF-a合 成,细胞因子汇聚构成网络系统,导致炎症反应扩大,引起的瀑布效 应,造成全身炎症反应综合征和多器官功能障碍等严重后果;在急 性胰腺炎的发生发展过程,TNF-a起到关键作用,并与胰腺炎 严重程度有关,可选为评估急性胰腺炎严重程度的指标[36-38]o

在急性胰腺炎病情发展变化中,TNF-a有重要作用,它促进其他 炎症因子的产生,是NF-kB刺激剂,能活化NF+B,引起持续或放 大的炎症反应卩刃。控制TNF-a的产生,不仅可减轻急性胰腺炎症状, 使炎症介质释放减少,延缓病情恶化,也可有抑制NF・kB信号通路 活化的作用,控制炎症反应。本研究结果提示,治疗重症急性胰 腺炎时,柴黄清胰活血颗可使TNF-a浓度逐渐降低,与使用时 间成正比关系,提示重症急性胰腺炎吋柴黄清胰活血颗粒可减少 TNF-a释放,减轻炎症反应。

4.3柴黄清胰活血颗粒对血清IL-8水平的影响

IL・8是一种可趋化、激活中性粒细胞的因子,它可使溶酶体酶与 超氧化物(H2O2)释放到血液,参与炎症反应和机体免疫调节;IL-8 可促进淋巴细胞活化,启动体液、细胞免疫,IL・6等常经IL-8起产 生炎性反应放大作用[40-42]o急性胰腺炎时,IL・8水平迅速上升,上升 幅度较IL-6更明显,可作为反映胰腺损伤和病情严重程度的指标。 而急性胰腺炎病死率主要由炎症反应严重程度所影响,主要为促炎症 因子,如TNF-a> IL-6> 8等⑷]。

急性胰腺炎时,IL・8是重要炎症介质,有相关研究表示,TNF-a 和IL-8是SAP早期可靠指标【44]。il・8是NF-kB信号通路上的下游因 子。本研究结果显示,SAP患者在使用柴黄清胰活血颗粒后,其血清 中IL-8浓度随着药物使用时间逐渐降低,表明重症急性胰腺炎时柴 黄清胰活血颗粒可以减少其相关炎症因子IL-8的释放,控制病情进 一步发展。

4.4柴黄清胰活血颗粒对血清NF-kB水平的影响

NF+B是从B淋巴细胞核中提取,作用有:多向性转录调节功能、 调控机体炎性分子表达,参与多种生理病理过程W在经典炎性疾 病中,均可发现疾病发生发展与NF-kB过度激活有关,NF-kB复合 物移动到细胞核内,引起前炎症介质、炎症介质、免疫相关基因的转 录与表达[46】。

近年来在对AP的发病机制研究上,主要研究的是NF+B的作用o 重症急性胰腺炎时,NF-kB高度活化,在SAP的发生及相关基因转 录上有重要作用;NF+B信号通路激活导致促炎症因子TNF-a> IL-6> 8等释放,加快炎症反应,进而引起SIRS和多器官功能衰竭(multiple organ failure5MOF),而NF+B在其中起着“信使”作用。本实验研 究结果提示,SAP患者入院时血清中NF-kB浓度升高,使用柴黄清 胰活血颗粒后NF・kB浓度开始降低,随着时间推移浓度更低。说明 治疗重症急性胰腺炎时,加用柴黄清胰活血颗粒可能可以抑制NF+B 活性,减少TNF-a> IL・8等相关炎症因子释放,产生抗炎作用。

1.柴黄清胰活血颗粒可明显降低SAP患者血清淀粉酶,且降低程 度高于单纯基础治疗患者,说明治疗重症急性胰腺炎时,在基础治疗 上加用柴黄清胰活血颗粒可提高治疗疗效。

2•柴黄清胰活血颗粒治疗重症急性胰腺炎,可能通过抑制NF-kB 活性,减少TNF-a> IL・8等相关炎症介质产生,起到抗炎作用,阻止 炎症反应扩大。

第二部分柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎大鼠模型

IKK/IkB/NF-kB信号通路影响

材料与方法

1实验材料与仪器

1.1实验动物

来自实验动物中心,健康雄性清洁级SD大鼠48只,体重在250 ±20g, 8 周龄。

1.2实验药物

医院制剂室研制供给的柴黄清胰活血颗粒,由生大黄,赤芍,黄 苓等组成。本课题组前期已经通过相关工艺将其提取制成深褐色流浸 膏,lg颗粒等同于流浸膏0.79go批号:20171102c

根据前期课题组研究0.16g/ml的药液浓度效果最优,故采用

0.16g/ml药物浓度。
1.3主要实验试剂  
免疫组化染色试剂盒 BIOYK
PlKBa(一抗,小鼠来源) CST
IkB(x(—抗,小鼠来源) CST
IKK卩(一抗,兔来源) CST
NF-kBP65(一抗,兔来源) CST
羊抗小鼠(二抗) CST
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) Beyotune
BCA蛋白浓度测定试剂盒 Solarbie

甲醇

甘氨酸

牛磺胆酸钠

戊巴比妥钠

RANsimple总RNA提取试剂盒

蛋白分子量Marker

1.4主要仪器

荧光定量PCR仪

离心机

GR60DR全白动咼压灭菌器

全自动酶标仪

全白动珊顿切片机

正置显微镜显微镜

台式电热鼓风干燥箱

雪科全白动雪花制冰机(FM40)

微量移液器

全自动珊顿脱水机

MX-F漩涡混匀器

凝胶成像系统

纯水制作机

珊顿石蜡组织包埋机

成都金山公司

Solarbie

sigma

江西涟水制药有限公司 天根

美国Fermenta公司

美国Roche

中国长沙湘智离心机仪器有限公司

美国 ZEALWAY

美国 Bio-Rad

美国 thermofisher Corporation 日本Nikon

上海一恒 DHG-9140A 北京常流科学仪器有限公司 Eppendorf Researchplus

美国 thermofisher Corporation 中国 DragonLab

美国Bio-Rad/伯乐

美国Ilipore公司

美国 thermofisher Corporation

1.5实验药物配制

结合临床用药,柴黄清胰活血颗粒按成人60kg的所需剂量,计 算出大鼠灌胃剂量,使用制剂室提供的柴黄清胰活血流浸膏,lg颗 粒二0. 79g流浸膏,结合前期实验柴黄清胰活血颗粒的最佳浓度为 0. 16g/mL按比例配置好药液灌胃,每次10ml/kg,每4小时1次。 假手术组和模型组用相同剂量的生理盐水灌胃,所有大鼠术后禁食, 白由饮水。

2实验方法

2.1试验动物的分组

取健康雄性清洁级SD大鼠48只,体重约250go用随机法将大 鼠分为3组:假手术组,SAP模型组,实验组,16只一组。分别于 术后12h、24h各组处死8只大鼠取材。

2.2大鼠模型的建立

用经十二指肠乳头逆行胰胆管注射牛黄胆酸钠(Sodium taurocholate, STC)的方法造模旳。大鼠称重,腹腔注射3%戊巴比 妥钠液(lml/kg)麻醉,将麻醉后的大鼠置于无菌操作台上,进行备 皮消毒,开腹,用:Lml无菌注射器,磨钝针头后消毒,避免划伤肠道 及胰胆管,从十二指肠乳头开口处缓慢进入胰胆管约0.5cm深处,用 动脉夹夹闭肝总管,为防止药物反流夹闭胰胆管,缓慢推注lml/kg 的3.5%牛黄胆酸钠溶液,注射完后发现胰腺组织肿胀、充血,去除 动脉夹、持针器后关腹。假手术组翻动腹腔脏器数次后关腹;术后禁 食,可饮水。术后大鼠背部皮下注射生理盐水4ml,补充术中失水。

2.3动物给药和观察

大鼠麻醉清醒后开始给药。实验组用配置好的实验药液,剂量按 大鼠体重,以10ml/kg灌胃,每4小时1次(0・6时停止灌胃),假 手术组和模型组用等量生理盐水灌胃。

2.4标本的采集

术后12h、24h点处死大鼠8只取材。麻醉后大鼠开腹,进行腹 腔动脉采血,采集胰腺组织并保存标本。

2.4.1血液标本的采集

用一次性静脉采血针进采集腹腔动脉血约5ml,抽取约lml血液 在离心机中以5OOOrpm离心lOmin,后取上层清液,用全自动血细胞 分析仪检测AMY、LIP,严格按照分析仪操作规程进行,其余血液 离心取上清液后保存于・80°C冰箱。

2.4.3胰腺组织的采集

取出完整胰腺组织,部分用生理盐水清洗干净后,液氮速冻后放 置于・80°C冰箱保存,部分用4%中性甲醛浸泡24h后做石蜡包被切片。 2.5采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)检测胰 腺组织中IKK卩、IkBoi的表达含量

根据分子克隆实验指南进行操作。由成都擎科有限公司合成引物。 具体引物如下:

IKKp-Fl: AGATCGCCTGTAGCAAA

IKKp-Rl: CTCCAGTCTAGGGTCGTG

IkBq-FI: CCCAAGTACCCGGATACAGC

IkBq-RI ; AGGGCAACTCATCTTCCGTG

GAPDH-F1; TGATGGGTGTGAACCACGAG

GAPDH-R1: TCATGAGCCCTTCCACGAT

2.5.1总RNA提取

  • 于・80°C冰箱中取出所需实验样品,约lOOmg胰腺组织,加入裂 解液RZ,在液氮中充分研磨;
  • 室温下静置5min,使得核酸蛋白复合物完全分离;
  • 12000rpm, 4°C,离心lOmin,取上清转移到新的离心管中;
  • 加入氯仿200uh盖好管盖,剧烈摇晃30s,在室温下静置3min;
  • 12000rpm, 4°C,离心15min,样品为三层:上层为无色的水相, 中间层,下层的黄色有机相;RNA主要在水相中,将水相移到新的 离心管中;
  • 加入无水乙醇并混匀;将沉淀转入吸附柱CR3中,12000rpm,

4°C,离心30s,弃废液;

  • 向 CR3 中加入 500ul 去蛋白液 RD, 12000rpm, 4°C,离心 30s, 弃废液,并将CR3置入收集管内;
  • 向 CR3 中加入 500ul 的漂洗液 RW,静置 3min, 12000rpm, 4°C, 离心30s,弃废液;
  • 重复8;
  • 将收集管中的吸附柱,12000rpm, 4°C,离心2min,弃残液, 室温放置晾干;加入100ulRNase-FreeddH20水,反复吹打,混匀, 充分溶解RNA,室温放置3min512000rpm, 4°C,离心2mino
  • 分装溶解的RNA液,于・70°C保存。
  • 使用酶标仪检测RNA的浓度,并根据公式(500ng/浓度)计 算出体积。

2.5.2逆转录cDNA

  • 将已提取的RNA置于65°C下进行热变性后,放于冰上冷却;
  • 根据以下公式配制反应液:
RNA样品 lpg-lug
5 X RT Master Mix 2ul
无RNA酶水  
总体系 10ul
混匀,轻轻搅拌均匀。  
(3)根据所需实验指标RNA浓度反应体系分别配制
(4)配制好反应液后, 按以下条件进行逆转录反应;
37°C 15min
50 °C 5min
98 °C 5minf逆转录失活
4 °C Hold

(5)进行逆转录后加入无酶水稀释(每个转录反应体系逆转录后分 别加入40ul)

2.5.3 qPCR

  • 取出检测指标引物,先用离心机在4000rpm下离心30-60s;
  • 按照使用说明书加入无酶水;
  • 稀释好引物;

(4)配制所需体系的反应液:

PCR Master Mix 5ul
cDNA lul
上游引物} 0.6ul
下游引物  
无酶水 3.4ul
总体系 lOul

混匀以上反应液;

(6)按以下条件进行PCR反应;

95 °C 60s
J  
95 °C 60s
60 °C 15s      — X40个循环
72 °C 45s
1  

用2-AACt法行数据分析

2.6用蛋白质免疫印迹法(Western Blot, WB )检测IKKp> IkBoi、 plKBa蛋白表达

2.6.1提取蛋白

  • 取出储存的胰腺组织置于冰上,称取适量胰腺组织约200mg, 剪碎后放入离心管中;
  • 加入裂解液约250ul (lmlRIPA+lOulPMSF比例,现配现用);
  • 用匀浆机充分研磨组织,并置于冰上裂解30min;
  • 将其置于离心机中,离心30min,取上清液,移至新的离心管 内;

262胰腺蛋白定量检测

  • 使用BCA蛋白浓度测定试剂盒,将试剂盒中的蛋白标准品置 于室温下解冻,按9:1的比例,使用PBS稀释BSA,配制好标准品 的稀释液;
  • 配制BCA工作液:每个孔需配置200U1BCA工作液,按BCA: Cu以50:1的比例配置,并充分混匀;
  • 在标准品中分别加0246&12,16,20ul配制好的稀释液,为保 证每个孔体积为20uh再加入20?18?16?14912?89450ul的PBS;
  • 待测样品用PBS稀释,加入酶标板中,加入20ul/每孔的待测 样品稀释液;
  • 每个孔中加入BCAX作液200uh震荡30s,充分混匀,37°C 孵育30min,后将其冷却至室温;
  • 在570nm附近下酶标仪下测定各孔的吸收值;
  • 以蛋白浓度为横坐标,吸收值为纵坐标,做标准曲线,在标 准曲线上计算待测样品的蛋白浓度;
  • 测定浓度后,取样品于离心管中,按4:1比例,加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液充分混匀,配制蛋白样品,100°C中水浴lOmin,于 ・20°C冰箱中储存。

2.6.3蛋白质的SDS・聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

  • SDS-PAGE凝胶配置:根据上样量的需要选择合适玻板,用白 来水清洗干净,并按照附件配方法制备分离胶和浓缩胶;

注意:A:玻板用白来水清洗时,一定要注意清洗磨砂边残留污渍, 清洗好后的玻板无需用RO水冲洗;

B:组装好的玻板需用RO水测漏;

C:常规电泳常使用10%、12%凝胶;

  • 上样电泳

A、 安装好电泳槽,往槽中倒入lXSDSnmningbuffer,轻轻拔掉梳子, 测漏后准备上样;

B、 用加样器取定量的样品同时加3ul蛋白marker;

C、 电泳,设置电压为80v,恒压电泳40-50min,至于浓缩胶与分离 胶交界处时,切换电压,120v,当漠酚蓝到达分离胶底部时停止电泳, 电泳完成后切胶。

  • 转模

提前剪取与实验所需大小相符的PVDF膜,置于甲醇液中30s , 后覆盖于含目的蛋白区域的胶上,并置于已制作好的“三明治”上(负 极面■海绵■滤纸■切取好的凝胶-PVDF模■滤纸■海绵)。准备转模装置, 将其移至转模槽中转模,恒电流100mA,约lh・2.5h转模。

  • 封闭

将转模后的PVDF模取出,放于5%脱脂牛奶的封闭液中,室温摇 晃60mino封闭结束后,予TBST漂洗2次,每次5 min,室温摇晃95 次/min。

  • 抗体孵育

根据抗体使用说明书,加入一抗稀释液,4°C缓慢孵育过夜;第 二天,回收一抗,并保存于4°C,用TBST再次洗2次,每次5min (如果结果背景要求高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数)。将 二抗稀释到5%的脱脂奶粉中,加二抗稀释液于10cm平板中孵育印 记膜,室温下孵育1小时;回收二抗,用TBST再次洗3次,每次 5min;

  • 曝光信号检测

对每张印记膜,使用曝光液,用lOOulA液加lOOulB液充分混匀, 将印记膜正面朝上置于混匀的AB液中,约lmin,后在BioRad GelDoc XR仪器上进行曝光信号的检测;

  • 数据收集与分析

保存好扫描图片,用Image!分析软件计算分析所保存图片上的 每个特异性条带灰度值。

2.7采用免疫组化法检测NF・KBp65的阳性表达

2.7.1胰腺组织固定、脱水、包埋

  • 固定,把胰腺组织放到4%的固定液(中性甲醛溶液)中,浸泡 24小时;
  • 取适当大小组织放入包埋盒中脱水,加入70%乙醇、80%乙醇 各30min, 95%乙醇、100%乙醇各2次,每次10-15min,纯二甲苯2 次,每次lh;
  • 将脱水后的组织连同包埋盒依次放入机器组织槽中,进行石蜡

浸泡,浸泡lh后进行包埋;

2.7.2切片、制片

打开切片机,调整刀片和蜡块的距离,调整切片厚度为5um,对准 已包埋好的石蜡块进行切片;然后将切片放入50°C的烘箱中烤制3h; 2.7.3组织免疫组化检测

  • 室温脫蜡、水化:二甲苯脫蜡2次,每次lOmin,将切片放入 100%的乙醇中5min后,再分别依次加入95%酒精、90%酒精、80% 酒精中,每次各2min,并用流动水冲洗5次左右;
  • 热抗原修复:先配制好抗原修复液,经高温预热lOmin,后加 入切片再微波修复lOmin,修复完后室温自然冷却;
  • 配制PBS,切片用PBS冲洗,3次,每次3min,冲洗完后取出, 甩干水分并置于湿盒中,滴加3%过氧化氢于组织上,避光孵育15min, 并用PBS冲洗3次,一次3min,将组织切片取出,甩干组织周围液 体,用石蜡在组织周围画圈,并平放于湿盒中;
  • 加血清圭寸闭液,放入湿盒内,室温lOmin;
  • 一抗按使用说明书稀释后滴加于组织上,37°C孵育2h,孵育结 束后,用PBS冲洗3次,每次3min,将组织切片取出,甩干组织周 围的液体(组织勿干燥),平放于湿盒中;
  • 滴加SP法抗鼠免疫组化检测试剂盒中的黄色液体在组织上, 37°C孵育45min,孵育后,用PBS冲洗3次,每次3min,将组织切 片取出,甩干组织周围的液体(组织勿干燥),平放于湿盒中;
  • 滴加SP法抗鼠免疫组化检测试剂盒中的橘红色液体在组织上, 室温中孵育,约lOmin后结束,用PBS冲洗3次,每次3min,取出 组织切片,甩干组织周围的液体(组织勿干燥),平放于湿盒中;
  • 预备好显色剂DAB工作液,组织上滴加lOOuh于显微镜下观 察,显色结束后,用蒸惚水冲洗以终止显色;
  • 苏木素复染,先100%乙醇脫水2次,每次l-2min,自然晾干; 二甲苯透明2次,每次5min,晾干,中性树胶圭寸片,电脑拍片; 7.4免疫组化结果等级评分

每张切片随机选择5个视野(x400),细胞浆及细胞核内出现黄 色或棕黄色免疫染色物质为阳性表达,染色程度和阳性染色范围两项 积分的总和作半定量分析:

  • 染色程度评分。

0分:无着色;

1分:细胞浆及细胞核内可见淡黄色染色颗粒;

2分:较多黄色或棕黄色染色颗粒;

3分:大量棕黄色颗粒。

  • 阳性染色范围积分。

0分:阳性染色范围<5%;

1分:阳性染色范围占5%〜25%;

2分:阳性染色范围占25%〜45%;

3分:阳性染色范围大于50%。

  • 根据两者的总积分分为四个等级

0 分:;I〜2 分:“ + ” ; 3・4 分:“++J 大于 4 分:“+++” o

3统计学方法

用excel建立数据库,数据统计分析采用SPSS20.0统计软件,计 量资料服从正态分布以(元土s)表示,多个样本均数之间比较采用 单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-q法,组内治疗前后比较 采用配对样本/检验,计数资料(等级资料)采用率或构成比表示, 组间比较釆用非参数秩和检验(多样本:Kruskal-Wallis H两样本 Mann-Whitney U),检验水准 a=0.05/3=0.017o

1.血清淀粉酶活性

组间比较:SAP组淀粉酶活性均最高,其次为实验组,均高于假 手术组,差异具有统计学意义(pV0・05);实验组淀粉酶活性与模 型组比较均低,差异具有统计学意义(pV0・05) o

不同时间点组内比较,实验组、假手术组组内的淀粉酶活性与时 间增加成反比关系,差异均具有统计学意义(pVO.Ol)。详见表5、 图 10、 llo

表5 3个组别2个时间点血清淀粉酶活性比较(U/L,元土 S)

Table 5 Comparison of serum amylase activity at 2 time points in 3 groups (U/L, 元土 S )

组别 例数 12h 24h /值 尸值
假手术组 8 1079.75 土 27.30 961.13 土 17.38° 11.57 <0.001
模型组 8 8682.38 ±162.73* 8489.00±205.01ac 3.83 0.006
实验组 8 6535.38 ±177.18abc 4298.75 土 157.49航 32.45 <0.001
尸值   6289.56 5086.42    
尸值   <0.001 <0.001    

注:&为与假手术组比较P<0. 05, b为与模型组比较P<0. 05, C为与12h比较

PVO.Ol。

12h:三个组间差异具有统计学意义(启6289. 56, P<0. 001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(^130. 32,啟0. 001);假手术组与实验组比较(旷86. 07, P<0. 001);模型组与实验组比较(旷25. 24, P<0. 001)。

24h:三个组间差异具有统计学意义(启5086. 42, PV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(旷103. 49,P<0. 001);假手术组与实验组比较(旷59. 58, P<0. 001);模型组与实验组比较(旷45. 85, P<0. 001)。

治疗时间

图10 3个组别2个时间点血清淀粉酶活性均数图

Fig.10 Mean number of serum amylase activity at 2 time points in 3 groups

2.血清脂肪酶活性比较m假手术组 m模型组 目实验组

图11各组2个时间点血清淀粉酶活性柱状图

(#为与 12h 比较FV0.01。)

Fig.ll Histogram of serum amylase activity at 2 time points in each group

(# is P<0.01 compared tol2h.)

组间比较,假手术组的脂肪酶活性均较模型组、实验组低,差异 均具有统计学意义(p<0.05);两个时间点上,实验组的脂肪酶活性 与模型组比较均降低,差异有统计学意义(p<0.05)。

不同时间点间组内比较,实验组、假手术组、模型组的脂肪酶均 与时间延长呈反比关系,差异均有统计学意义(p<0・05)。详见表6、 图 12、 13o

表6 3个组别2个时间点血清脂肪酶活性比较(U/L,元土 $ )

Table 6 Comparison of serum lipase activity at 2 time points in 3 groups (U/L, 元土 S )

组别 例数 12h 24h /值 尸值
假手术组 8 8.67 土 0.28 7.10 土 0.27° 10.51 <0.001
模型组 8 312.6 0± 24.30』 288.00±8.02ac 3.13 0.017
实验组 8 150.82 土 12&24航 72.91 ±1.56abc 78.30 <0.001
尸值   943.11 7754.93    
尸值   <0.001 <0.001    

注:a为与假手术组比较FV0.05, b为与模型组比较FV0.05, c为与12h比较

P<0.01o12h:三个组间差异具有统计学意义("943.11, PV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(厂35.38, PV0.001);假手术组与实验组比较(厂161.93, FV0.001);模型组与实验组比较(厂21.04, FV0.001)。

24h:三个组间差异具有统计学意义(戶7754.93, FV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(q=219.99, FV0.001);假手术组与实验组比较0=117.50, FV0.001);模型组与实验组比较(厂74.48, FV0.001)。

图12 3个组别2个时间点血清脂肪酶活性均数图

Fig.12 Mean number of serum lipase activity at 2 time points in 3 groups

图13各组2个时间点血清脂肪酶活性柱状图

Fig.13 Comparison of histograms in serum lipase activity groups at 2 time points in
(*为与12h比较FV0.05, #为与12h比较P<0.01o )

each group

(*is P<0.05 compared to 12h;# is P<0.01 compared to 12h.)

  1. IKK卩mRNA的表达

SAP模型组12h、24h胰腺组织IKK卩mRNA表达量与假手术 组相比较均较高,差异具有统计学意义(pV0・05) o模型组12h、24 胰腺组织IKK卩mRNA表达量分别为2.72土0.40、302土034,实验组 12h、24h 胰腺组织 IKK卩mRNA 表达量分别为 1.96 土 0.23 >1.75 土 0.26, 均低于模型组表达量,差异均具有统计学意义(pV0・05) o详见表7、 图 14、 15o

表7 3个组别2个时间点IKKB mRNA比较(兀土 $ )

Table 7 Comparison of IKK B mRNA in two groups at three time points (兀 ± * )

组别 例数 12h 24h /值 尸值
假手术组 8 0.98 土 0.15 1.00 土 0.08 0.371 0.721
模型组 8 2.72 土 0.40a 3.02 土 0.3¥ 8.068 <0.001
实验组 8 1.96±0.23ab 1.75±0.26ab 2.315 0.054
尸值   79.276 128.919    
尸值   <0.001 <0.001    

注:a为与假手术组比较p<0.05, b为与SAP组比较p<0.05o

12h:三个组间差异具有统计学意义(F=79.276, P<0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(q=12.559, P<0.001);假手术组与实验组比较(q=7.058, P<0.001);模型组与实验组比较(q=5.501, P<0.001)。

24h:三个组间差异具有统计学意义(F=128.919, P<0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(q=15.880, p<0.001);假手术组与实验组比较(q=5.883, P<0.001);模型组与实验组比较(q=9.998, P<0.001)

图14 3个组别2个时间点IKKpmRNA表达量均数图

图15   3个组别2个时间点IKKpmRNA表达量柱状图

(#为与 12h 比较 P<0.01o )

Fig.15 Histogram of IKK卩 mRNA expression in two groups at three time points
(# is P<0.01 compared to 12h.)

  1. iKBamRNA 的表达

组间比较:SAP模型组胰腺组织12h、24hlKBamRNA表达量均 高于假手术组(p<O.O5);实验组胰腺组织12hlKBamRNA表达量高 于SAP模型组12hlKBamRNA表达量(p<O.O5);与模型组24h比较, 实验组胰腺组织24hlKBamRNA表达量更高(pVO・O5),模型组和 实验组各个时间点间差异具有统计学意义(p<O.O5) o

不同时间点组内比较:假手术组12h与24h比较,无明显变化; 与实验组12h比较,24h胰腺组织IkBolhiRNA表达量升高,差异有 统计学意义(p<O.O5) o详见表8、图16、17o

表8 3个组别2个时间点I k B ci mRNA表达量比较(元土 $ )

Table 8 Comparison of I k B a mRNA expression levels in two groups at three time

points (兀土 S)

组别 例数 12h 24h /值 尸值
假手术组 8 0.97 土 0.097 0.99 ±0.047 1.026 0.339
模型组 8 1.49 土 0.18a 1.87 土 0,30ac 4.590 0.003
实验组 8 2.17 土 0.29恥 2.86 ±0,70abc 2.889 0.023
尸值   66.999 35.626    
尸值   <0.001 <0.001    

注:a为与假手术组比较p<0.05, b为与模型组比较p<0.05, c与12h比较p<0.05o 12h:三个组间差异具有统计学意义("37.546, PV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(g=5.001,FV0.001);假手术组与实验组比较(^11.542, FV0.001);模型组与实验组比较(旷6.535, FV0.001)。

24h:三个组间差异具有统计学意义(C128.919, FV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(g=15.880, “V0.001);假手术组与实验组比较(g=5.883, P<0.001);模型组与实验组比较(旷9.998, FV0.001)。

治疗时间12h                            24h

图16 3个组别2个时间点的IKBamRNA表达量均数图

Fig.16 Mean number of IkBoi mRNA expression at two time points in three groups

图17 3个组别2个时间点的iKBamRNA表达量柱状图
m
假手术组 o模型组 目实验组

(*为与12h比较FV0.05; #为与12h比较FV0.01。)

Fig.17 Histogram of IkBoi mRNA expression at two time points in three groups
(*is P<0.05 compared to 12h;# is P<0.01 compared to 12h.)

5.IKK卩蛋白表达

Western Blot结果显示:假手术组胰腺组织IKK卩蛋白呈低表达, 与假手术组比较,12hSAP模型组IKK卩蛋白表达升高,24h更高,差 异均具有统计学意义(pV0・05);与模型组比较,在12h、24h两个 时间点上,实验组IKK卩蛋白表达降低,实验组与模型组比较差异均

具有统计学意义(pV0・05) o详见表9、图18、19、20o

图18 Western Blot检测各组胰腺组织中IKK卩蛋白的变化

Fig.18 Western Blot detection of changes in IKK[3 protein in pancreatic tissue of each

注:A为假手术组12h; B假手术组24h; C为模型组12h; D模型组24h;

E实验组12h; F实验组24h

表9 3个组2个时间点胰腺组织IKKB蛋白表达量比较(丘土 $)

Table 9 Comparison of IKK B protein expression in pancreatic tissue between 3

groups at 2 time points (兀 ± ')

组别 例数 12h 24h /值 尸值
假手术组 8 0.43 土 0.071 0.41 土 0.041 0.894 0.401
模型组 8 0.95 土 0.20a 1.12 土 0.1 严 3.334 0.013
实验组 8 0.70 土 0,054ab 0.55 土 0.036abc 7.437 <0.001
尸值   33.549 228.616    
尸值   <0.001 <0.001    

注:a为与假手术组比较p<0.05, b为与模型组比较p<0.05, c与12h比较p<0.05。 12h:三个组间差异具有统计学意义("33.549, PV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(g=8.188, FV0.001);假手术组与实验组比较(旷4.276, FV0.001);模型组与实验组比较(旷3.911, H0.001) o

24h:三个组间差异具有统计学意义(C228.616, FV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(旷17.303, “V0.001);假手术组与实验组比较(旷7.722, PV0.001);模型组与实验组比较(旷13.914, PV0.001)。

治疗时间

图19 3个组2个时间点胰腺组织IKKP蛋白表达量均数图

Fig.19 Mean graph of IKK|3 protein expression in pancreatic tissue of 3 groups at 2time points

(*为与12h比较PV0.05, #为与12h比较FV0.01。)图20 3个组2个时间点胰腺组织IKK卩蛋白表达量柱状图

Fig.20 Histogram of IKK卩 protein expression in pancreatic tissue in 3 groups at 2
time points

(*is P<0.05 compared to 12h;# is P<0.01 compared to 12h.)

6.IkBq蛋白表达

Western Blot结果显示:与假手术组比较,模型组胰腺组织IkBoi 蛋白表达在12h、24h均低于假手术组,差异具有统计学意义(p< 0.05);与模型组比较,实验组12h、24hlKBa蛋白表达逐渐升高, 说明实验组IkBoi蛋白表量达与时间增加成正比关系,各个时间点上, 实验组与模型组相比较差异均具有统计学意义(pV0・05)。详见表 10、图 21、22、23 o

图21 Western Blot检测各组胰腺组织中IkBoi蛋白的变化

Fig.21 Western Blot detection of changes in IicBa protein in pancreatic tissue of each group 注:A为假手术组12h; B假手术组24h; C为模型组12h; D模型组24h; E实验组12h; F实验组24h

表10 3个组2个时间点胰腺组织IkBoi蛋白表达量比较(元土 S)

Table 10 Comparison of IkBoi protein expression in pancreatic tissue between 3 groups at 2 time points (兀 ± S )

组别 例数 12h 24h /值 尸值
假手术组 8 0.61 土 0.052 0.67 土 0.045 2.290 0.056
模型组 8 0.43 土 0,093a 0.46±0.031a 1.284 0.240
实验组 8 0.91±0.096ab 1.37 土 0.33abc 4.669 0.002
尸值   70.647 47.824    
尸值   <0.001 <0.001    

注:a为与假手术组比较p<0.05, b为与模型组比较p<0.05, c与12h比较pvO.Ol。 12h:三个组间差异具有统计学意义("70.647, PV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(g=4.365, FV0.001);假手术组与实验组比较(g=7.392, FV0.001);模型组与实验组比较(旷11.757, PV0.001)。

24h:三个组间差异具有统计学意义("47.824, PV0.001),组间两两比较:
假手术组与模型组比较(g=10.572, “V0.001);假手术组与实验组比较(g=5.907,

PV0.001);模型组与实验组比较(旷7.689, FV0.001)。

治疗时间

图22 3个组2个时间点胰腺组织IkBoi蛋白表达量均数图

Fig.22 Mean number of IkBoi protein expression in pancreatic tissue of 3 groups at 2

time points

图23 3个组2个时间点胰腺组织IkBol蛋白表达量柱状图
(#为与 12h 比较 P<0.01o )

Fig.23 Histogram of IicBa protein expression in pancreatic tissue of 3
groups at 2 time points

(# is P<0.01 compared to 12h.)

  1. plKBa蛋白表达

Western Blot结果显示:假手术组胰腺组织仅有少量PIkBq蛋白 表达,与假手术组比较,SAP模型组12hplKBa蛋白表达升高,24h 表达更高,差异均具有统计学意义(p<0.05);与模型组比较,实 验组12hplKBa蛋白表达降低,24h更低,说明实验组胰腺组织plKBa 蛋白表达量与药物使用时间成反比,在12h、24h两个时间点上,实验 组与模型组相比较有显著差异(p<0.05)。详见表11、图24、25、26o

图24 Western Blot检测各组胰腺组织中plKBa蛋白的变化

Fig.24 Western Blot detection of changes in plKBa protein in pancreatic tissue of each group

注:A为假手术组12h; B假手术组24h; C为模型组12h; D模型组24h; E实验组12h; F实验组24h

表11    3个组2个时间点胰腺组织plKBa蛋白表达量比较(丘土 S )

Table 11 Comparison of plKBa protein expression in pancreatic tissue of 3 groups at 2

time points (兀 ± S )

组别 例数 12h 24h /值 F值
假手术组 8 0.21 ±0.021 0.19 土 0.054 0.840 0.428
模型组 8 0.78 ±0,071a 1.17 土 0.062ac 36.095 <0.001
实验组 8 0.48 土 0,035ab 0.36 ±0,015abc 13.998 <0.001
尸值   291.098 926.001    
尸值   <0.001 <0.001    

注:a为与假手术组比较p<0.05, b为与模型组比较p<0.05, c与12h比较p<0.01。 12h:三个组间差异具有统计学意义(八291.098, FV0.001),组间两两比较: 假手术组与模型组比较(g=21.828,FV0.001);假手术组与实验组比较(g=l&833, PV0.001);模型组与实验组比较(旷10.614, PV0.001) o

24h:三个组间差异具有统计学意义(戶926.001, FV0.001),组间两两比较:

假手术组与模型组比较(厂33.347, “V0.001);假手术组与实验组比较(厂8.198, PV0.001);模型组与实验组比较(9=35.823, FV0.001)。

治疗时间

图25 3个组2个时间点胰腺组织plKBa蛋白表达量均数图

Fig.25 Mean number of plKBa protein expression in pancreatic tissue at 3 time points

in 3 groups

图26 3个组2个时间点胰腺组织plKBa蛋白表达量柱状图
(#为与 12h 比较 FV0.01。)

Fig.26Histogram of pIicBa protein expression in pancreatic tissue of 3 groups at 2
time points

(# is P<0.01 compared to 12h.)

5.大鼠胰腺组织中NF-kB p65含量

胰腺组织免疫组化染色显示假手术组12、24hp65不表达或弱阳 性表达(见图27 A与B) o模型组12h胰腺组织可见p65免疫阳性 细胞,阳性物呈棕黄色(见图27 0 ;模型组24hp65免疫表达呈强 阳性,且与12h比较明显增强,胞质和胞核中均可见,染色加深,呈 片状分布(见图27 D) o与模型组12h相比,实验组12h胰腺组织 p65免疫阳性细胞减少,染色减弱,呈淡黄色(见图27 E);与模型 组24h相比,实验组24h胰腺组织p65免疫阳性细胞明显减少(见图 27F),详见表 12、13、14、图 27。

表12三个组NF-kB p65阳性表达量表达量组内比较

Table 12 Comparison of the expression levels of NF-kB p65 positive expression

in three groups

组别 胰腺组织中NF-kB p65阳性表达量 Z值 尸值
- + ++ +++
假手术组12h 8 0 0 0 0.000 1.000
假手术组24h 8 0 0 0    
模型组12h 0 1 4 3 2.000 0.046
模型组24h 0 0 2 6    
实验组12h 3 1 4 0 2.000 0.046
实验组24h 3 5 0 0    

表13三个组治疗12hNF-KB p65阳性表达量表达量组间比较

Table 13 Comparison of the expression levels of 12hNF-KB p65 positive expression in
the three groups

组别胰腺组织中NF-kB p65阳性表达量

  - + ++ +++ H值 尸值
假手术组 8 0 0 0 15.470 <0.001
模型组 0 1 4 3    
实验组b 3 1 4 0    

注:三个组间NF-kB p65阳性表达量差异具有统计学意义(炉15.470, FV0.001), 组间两两比较:a为假手术组与模型组比较(Z=3.633, FV0.001) ; b为假手术 组与实验组比较(Z=2.582,P=0.010);c为模型组与实验组比较(Z=2.534,P=0.012)

  - + ++ +++ H值 尸值
假手术组 8 0 0 0 19.727 <0.001
模型组ac 0 0 2 6    
实验组b 3 5 0 0    

组别胰腺组织中NF-kB p65阳性表达量

注:三个组间NF-kB p65阳性表达量差异具有统计学意义(昭19.727, FV0.001), 组间两两比较:a为假手术组与模型组比较(Z=3.703, FV0.001) ; b为假手术组与 实验组比较(Z=3.520, FV0.001) ; c为模型组与实验组比较(Z=3.330, P=0.001)

图27各组胰腺组织中NF-kB p65的表达和定位(免疫组化SABC法x400)
Fig.27 Expression and localization of NF-kB p65 in pancreatic tissue of each group
(immunohistochemistry SABC method x400)

注:A为假手术组12h; B:假手术组24h; C: SAP组12h; D: SAP组24h; E:

实验组12h; F:实验组24h

1.现代研究对NF・kB的认识

NF・kB是一种广泛存在的转录因子,参与细胞的生长、分化、炎 症反应、免疫应答等生命活动中。对于NF・kB来说,有两种存在方 式,第一种由两个亚基P65和P50而组成,是具有活性的二聚体形式, 以P65/P50表示;第二种是具有无活性的三聚体形式,以P65/P50/IkB 表示。在静息状态下,NF+B的P65亚基与其抑制物IkB蛋白结合, 以无活性的复合物存在。外界因素刺激时,IkB磷酸化、泛素化后降 解,从而释放NF-kB,进而引起一系列反应。

NF-kB是Rel蛋白家族的成员组成的,组成形式为同源或异源二 聚体,其家族成员主要有 RelA(p65> NF-kB3)、Rel(c-Rel)> RelB> N F-kB1(P50)和NF-kB2(P52),并且它们的N端都具有一个保守的300 个氨基酸区域的Rel同源区,该区域含有二聚体化区,DNA结合区 和核定位信号区,分别负责NF+B与DNA结合,二聚化,与IkB相 互作用,从而使活化的NF+B行使作用。IkB作为NF・kB的抑制物, 主要有以下组成,IkBoi、IkB卩、IkBe> Bcl-3 及 NF-KBl(plO5)和 NF-k B2(plOO,为p52的前体)、IKB,"。其中IkBoi发现最早,且作为NF -kB的反应基因。但是IkB降解,需要先磷酸化,而IkB的磷酸化需 要IkB激酶先激活,即IKK。IKK在1995年被发现,目前证实只要 由 IKKa、IKK卩、IKKy IKAP(IKK-complex-associated-protein)组成。 在NF・kB激活过程中,IKK活化是其限速因素,假如IKK激酶活性 受到减弱,IkB降解过程就会受到明显抑制,NF-kB激活将受到影响。

通过基因敲除实验表明,IKK卩和IKKy是炎症因子激活NF-kB的必 需物,而IKKP是炎症细胞因子诱导的NF-kB活化不可缺失的蛋白激 酶。

  1. NF・kB与胰腺炎的关系

目前对AP的发病机制来说,在胰腺炎发病中,起到重要作用的 是炎症因子和胰蛋白酶原的激活,且得到大多数的认同。有相关研究 证实,在急性胰腺炎炎症反应过程中,NF+B有着重要作用,可加重 炎症反应。闫长孟⑷]等通过动物实验发现,未予治疗的胰腺炎模型大 鼠血清血清淀粉酶(AMY) > IL-6水平升高,胰腺组织中NF・kB蛋 白表达高;当予以卩■胡萝卜素(卩・C)后胰腺炎大鼠中的AMY、IL・6、 NF-kB水平明显降低。在急性胰腺炎发展过程中,NF-kB参与调控与 炎症、免疫相关的基因表达。研究表明,NF+B通路的激活直接加重 了胰腺炎的严重程度,激活期若超过3个月即可导致慢性胰腺炎卩叭 Chen X等El通过直接向大鼠胆管内注射能表达NF-KB的Rel/P65腺 病毒载体后发现,随着胰腺NF-KB表达,随着时间的增加,组织出 现了损伤;而当Rel/P65腺病毒载体共转染IKBa时,NF-KB水平下 降,胰腺炎症程度减轻。通过制作大鼠模型进行观察实验,发现在重 症急性胰腺炎早期,胰腺NF-KB明显活化,随后炎症细胞因子、黏 附因子等表达增加,因子相互作用,导致胰腺炎症进一步加重o Weber 等少]把两种胰腺类型进行比较,即SAP模型与水肿型胰腺炎,结果 提示SAP和水肿型胰腺炎分别以胰腺细胞坏死和胰腺细胞凋亡为主, 而SAP以剧烈的局部、全身炎症反应为主要表现;NF+B信号通路 的激活与胰腺炎炎症反应有着密切的关系。

3•柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎淀粉酶、脂肪酶的影响

淀粉酶主要来源是胰腺和唾液腺,可消化食物中的多糖化合物。 急性胰腺炎时,胰淀粉酶异常分泌释放血液中,导致血清淀粉 酶的升高,一般在发病后6-8h升高,12・24h为高峰期。脂肪 酶(lipase, LIP),来白于胰腺,能水解甘油三酯。急性胰腺 炎时,胰腺功能紊乱导致脂肪酶入血,造成脂肪酶升高。脂肪 酶于AP发病后12-24h升高,高峰值在24・48h,可持续7・14 天。

检测血清淀粉酶、脂肪酶活性情况,对诊断急性胰腺炎有 重要价值,但有文献提及当胰腺广泛坏死时淀粉酶可能不升 高。本研究结果提示,各个时间点上,假手术组大鼠淀粉酶、 脂肪酶与模型组比较均低;造模12h后,大鼠血清淀粉酶、脂 肪酶明显升高,且达到高峰值,24h后开始下降,符合急性胰 腺炎酶学特点。与模型组比较,实验组大鼠血清淀粉酶、脂肪 酶活性降低,提示柴黄清胰活血颗粒能有效降低SAP大鼠血清脂 肪酶、淀粉酶含量,促进胰腺白我修复。

4•柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎大鼠IKK/IKB/NF-KB信号通 路中 IKK卩、IKBou piKBax NF-KBp65 的影响

4.1对IKK卩的影响

在NF・kB信号通路中,激活NF-kB需要IkBoi降解,IkBoi降解 的前提是其本身磷酸化。而促使IkBq磷酸化的前提是需要IkB激酶 即IKK。IKK卩是IKK的组成成分之一,IKK卩有激酶结构域,有磷 酸化作用,在调节NF-kB活性方面占主导地位,在炎症和肿瘤等疾病 方面可作为治疗的相关靶点[河。通过对IKKa和IKK卩研究显示,由 TNF, IL-1等炎性细胞因子诱导的IKK激酶复合体的酶活性主要集 中在IKK卩活性,而NF-kB的激活大多由IKK卩起作用W55]。研究表 明,在肝细胞中高表达的IKK卩/NF・kB,可增加炎性因子产生,使 肝脏和肌肉的葡萄糖利用障碍;当去掉肝细胞的IKKp基因后可逆转 胰岛素抵抗〔旳。重症胰腺炎时,IKK卩活性升高,促使IkBoi磷酸化, 磷酸化后IkBoi进一步降解,激活NF+B信号通路,释放炎症因子, 进而发生一系列炎症反应。有文献曾说明,若IKK激酶活性受到一 点抑制,会明显抑制IkBoi的降解和对NF-kB的激活作用。

本研究结果提示,SAP模型组大鼠胰腺组织IKK卩mRNA和 蛋白表达量较假手术组高,实验组IKK卩mRNA和蛋白表达量表 达量与模型组比较降低,且各个时间点均较模型组更低。表明 重症急性胰腺炎时柴黄清胰活血颗粒可能通过抑制IKKP活性,阻 止IkBoi磷酸化,间接抑制NF-kB信号通路激活。

4.2 对 IkBoi、plKBa 的影响

IkBq是NF-kB抑制物IkB中最先被克隆、也是最为重要的分子; IkB经过一系列过程后降解,进而与NF+B分离,NF+B被激活,引 起一系列特异性前炎性因子基因转录和表达[57-58]o SatohM用钙离子 抑制剂进行实验,结果提示钙离子抑制剂可抑制雨蛙肽诱导重症急性 胰腺炎大鼠的IkBq降解和NF-kB活化。所以NF-kB活化的关键步骤 是IkBoi的降解和低表达。急性胰腺炎时,NF+B信号通路被激活, 扩大炎症反应,而胰腺炎本质是一种炎症反应,在IKK/IkB/NF・kB信 号通路中,IkBoi的磷酸化是NF・kB活化的必然经过,所以plKBa含 量的多少对是否活化NF+B有着重要的作用,故实验观察IkBoi基因 和蛋白表达及plKBa蛋白表达有着必要的意义,可更深层次的解释药 物作用机理。重症胰腺炎时,IKK卩激酶活性被活化后,想要进一步 抑制NF+B被激活,则抑制IkBq的磷酸化是必需的,因为IkBoi的 磷酸化是NF-kB活化的重要过程。

本实验研究结果提示,SAP模型组胰腺组织iKBoimRNA和蛋白 相对表达量较假手术组低,实验组iKBamRNA和蛋白相对表达量较 SAP模型组明显升高。SAP模型组胰腺组织plKBa蛋白相对表达量 高于假手术组,模型组24hplKBa蛋白相对表达量较其12h更高,各 个时间点均高于实验组。实验组各个时间点plKBa蛋白相对表达量与 SAP模型组相比均降低,且随时间延迟表达量更低。说明柴黄清胰活 血颗粒治疗重症急性胰腺炎时,IkBoi与plKBa表达呈负相关,提示 柴黄清胰活血颗粒可抑制IkBoi磷酸化,进而抑制NF-kB活化。

4.3对NF-KBp65的影响

NF・kB是一种免疫球蛋白,不仅可控制基因转录,调控炎症因子 水平,同时可作为评估重症急性胰腺炎患者病情严重程度的指标[创。 颜琼⑹]等通过研究证明,急性胰腺炎时,核因子kB调控炎症递质的 转录,炎症因子释放,引起胰腺及其胰外器官损伤,而P65是NF+B 调控炎症反应的核心蛋白。马丹阿等建立重症急性胰腺炎模型大鼠, 检测出模型大鼠p_p65、p-lKBa蛋白表达明显升高,说明重症急性胰 腺炎时NF・kB信号通路被激活;而对SAP模型大鼠使用丹参注射液 后发现,大鼠p-p65、p-lKBa蛋白表达明显低于用药前,说明丹参注 射液可能抑制NF+B信号通路活化,减轻炎症反应。NF+B对于炎 症调节起着重要作用,若通过药物延缓或阻滞NF-kB信号通路激活, 可减轻炎症反应扩散,抑制炎症因子释放,延缓病情恶化;而P65 起着关键性作用,所以控制P65显得至关重要。

本实验通过研究,结果表明,与假手术组比较,SAP模型组12h 胰腺组织NF-kBP65表达升高,且24h升高更明显;与SAP模型组相 比,实验组胰腺组织NF-kBP65表达在各个时间点均明显低于模型组o 提示柴黄清胰活血颗粒可降低重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺组织p65 蛋白表达,可抑制NF+B信号通路活化,减少炎症介质释放,减轻 炎症反应,控制病情进一步发展。

  1. 柴黄清胰活血颗粒对IKK/IKB/NF-KB信号通路的影响

本研究临床试验提示柴黄清胰活血颗粒治疗重症急性胰腺炎时, 可减少相关炎症因子如TNF-a. IL-8的释放,提示柴黄清胰活血颗 粒具有抗炎作用,但具体抗炎作用机制尚不明确,需进一步研究其作 用机制;而NF・kB是常见的炎症信号通路,在重症急性胰腺炎的发 生发展过程中具有重要作用,IKK/IkB/NF・kB是其经典通路之一,故 本实验选择此信号通路进行研究。实验结果显示:柴黄清胰活血颗粒 可下调IKK/IkB/NF-kB信号通路上相关蛋白如IKK卩、plKBa、 NF-kBP65的表达,同时对抑制蛋白IkB的表达有上调作用,提示柴 黄清胰活血颗粒对IKK/IkB/NF・kB信号通路的激活有抑制作用,可能 是其治疗SAP的机制之一。

1.SAP模型组大鼠胰腺组织IKK卩、PIkBq> NF-kBP65表达上调,IkBoi 表达下调,提示重症急性胰腺炎时IKK/IkB/NF-kB信号通路被激活, 可导致炎症介质释放及过度表达,引起炎症反应;

2•实验组大鼠胰腺组织IkBoi表达上调,且高于模型组,IKK卩、piKBa、 NF-kBP65表达下调,IkBoi与IKK卩、plKBa表达呈负相关,提示治疗 重症急性胰腺炎时,柴黄清胰活血颗粒可抑制IKK卩活性,阻止IkBol 磷酸化,从而抑制IKK/IkB/NF・kB信号通路激活。

综上;结合临床研究及动物实验结果提示治疗重症急性胰腺炎 吋,柴黄清胰活血颗粒可抑制IKK卩活性,阻止IkBoi磷酸化,从而 抑制IKK/IkB/NF-kB信号通路激活,减少炎症介质NF-kB> TNF-a> IL・8的释放,可能是其治疗SAP的机制之一。

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缩略词对照表

AP acute pancreatitis 急性胰腺炎
AMY serum amylase 血清淀粉酶
AST aspartate aminotransferase 天门冬氨酸氨基转移酶
ALT alanine aminotransferase 丙氨酸氨基转移酶
BUN blood urea nitrogen 尿素氮
CRP C-reactive protein 血清C■反应蛋白
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附测定
IL-8 interleukin-8 白介素
IL-6 interleukin-6 白介素・6
IL・1卩 interleukin-1 白介素・1
IKK IkB kinase IkB激酶
iKBa NF-kappa-B inhibitor alpha NF-kB抑制蛋白a
LIP lipase 血清脂肪酶
MODS multiple organ dysfunction syndrome |多器官功能障碍综合征
MOF multiple organ failure !多器官功能衰竭
NF-kB nuclear factor kappa B 核因子kB
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
SIRS systemic inflammatory response

syndrome

全身性炎症反应综合征
SAP severe acute pancreatitis 重症急性胰腺炎
STC Sodium taurocholate 牛黄胆酸钠
TNF-a tumor necrosis factor-a 肿瘤坏死因子-a
WB Western Blot 蛋白质免疫印迹

致谢

衷心感谢我的导师李志教授,在我三年研究生学习和工作中谆谆 教诲惑,我收获颇多;在我的研究课题和毕业论文书写过程中,倾注 了极大的精力和心血;在我的生活、成长方面给予的关怀和教导!

衷心感谢脾胃科肖国辉主任及科室各位老师在临床学习中给予 的悉心指导和帮助!感谢师兄、师姐、师妹们在学习生活中予以的支 持和鼓励!

衷心感谢父母在学习生活中给予的关心和支持!

衷心感谢百忙之中参加论文评审和答辩的各位专家领导!

综 述

摘要:重症急性胰腺炎本质是一种全身炎症反应,中医药治疗对 其炎症介质释放有作用。目前中医药治疗主要有中药口服(管胃、鼻 饲)、灌肠、外敷等,针灸针刺,穴位贴敷、按摩等。现将中医药治 疗SAP对其炎症介质影响的研究进展综述如下。

关键词:重症急性胰腺炎;中医药;炎症介质

Research progress of traditional Chinese medicine on inflammatory
mediators of severe acute pancreatitis

Abstract: Severe acute pancreatitis is a systemic inflammatory response, and Chinese medicine treatment has an effect on the release of inflammatory mediators. At present, traditional Chinese medicine treatment mainly includes oral administration of Chinese medicine (tube stomach, nasal feeding), enema? external application, acupuncture acupuncture^ acupoint application, massage and so on. The research progress of the treatment of SAP on its inflammatory mediators by Chinese medicine is summarized as follows.

Key words: severe acute pancreatitis; Chinese medicine; inflammatory medium

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是急性胰腺炎的一 种特殊类型,发病率在急性胰腺炎中占5%〜10%,病死率高达 30%〜50%,病情变化复杂,并发症多,若治疗不及时后期容易导致 不可预知的后果,严重影响患者的生存质量⑴現 而炎症介质在SAP 起病和发展过程有重要作用;炎症介质过多释放,不仅加重炎症反应, 而且会加快病情的恶化。炎症介质主要由白细胞介素(interleukin, IL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、核因子 kappa B

(nuclear factor-kappa B , NF-kB )、血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)、前列腺素(prostaglandin, PG)、一氧化氮

(nitric oxide, NO)、内皮素(endothelins, ET)、氧自由基(oxygen free radicals, OFR)等成员组成。以往对于重症急性胰腺炎,临床上 大多采用常规西药对该病患者进行治疗,但效果不佳,患者症状恢复 时间长,比较容易引起并发症卩⑷。近年来中医药治疗SAP的研究越 来越多,受到广大关注和重视,其中不少研究发现中医药治疗对改善 SAP炎症反应,减少炎症介质释放方面有影响。本文就目前中医药治 疗对炎症介质影响的研究情况进行总结。

1、临床试验研究

1.1单味中药

单味中药研究比较多是大黄和芒硝等中药。王海涛⑸回顾性分析 发现,30例SAP患者在基础治疗上加用大黄鼻饲和灌肠,患者血清 中白细胞介素・18 (IL-18) >血清淀粉酶(AMY)水平与治疗前相 比明显降低(P<0.05),提示大黄可能减少炎症介质释放。李青回将50 例SAP患者随机分为两组,即试验组和对照组,每组25例,试验组 在对照组常规治疗上加用大黄粉冲服,后检测患者血清中相关指标, 结果提示试验组血清中C反应蛋白(CRP)和细胞间黏附分子1 (ICAM-1)水平较对照组明显降低(P<0・05),且胃肠功能恢复较快, 说明大黄可减少相关炎症因子释放,减轻局部炎症反应。冯妞妞⑺等 将66例重症急性胰腺炎患者分为两组,分别为观察组和对照组,观 察组在基础治疗上加用生大黄煎水保留灌肠,发现观察组患者血中 CPR、白介素・8 (IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-a)等炎症因子较对 照组明显下降(P<0・05)。张旭罔用单纯西医医治SAP患者49例, 相同条件下加用芒硝鼻饲及腹部外敷医治SAP患者52例,5天后发 现芒硝组患者血尿淀粉酶和白介素・6 (IL-6)水平较对照组低。原皓 等⑷用红花注射液静脉滴注治疗SAP患者,7天后发现患者血清 TNF-a> IL-6和IL・8浓度较治疗前明显下降(P<0.05),且比对照组 更低,降低程度高。

1.2复方中药

樊宏伟何等医治SAP患者48例,随机分为两组,每组28例,治 疗组在使用生长抑素等药物上予以元胡柴芍承气汤(元胡、柴胡、白 芍、黄苓、积实、厚朴、玄明粉、生大黄)管胃,与单纯治疗组相比, 治疗组患者血浆内毒素,血清TNF-a>白介素-1卩(IL-1B )水平显著 降低,提示元胡柴芍承气汤治疗重症急性胰腺炎可能与抑制其炎症介 质有关系。郑指挥Z等通过临床观察40例重症急性胰腺炎患者,予 以口服通腑消胰汤(酒大黄、黄苓、枳实、厚朴、牡丹皮、芒硝、清 半夏、白芍),患者血清淀粉酶、TNF-a和IL・6等指标较入院时下 降。黄尧达[12]在清胰汤的基础上加减,并对44例SAP患者进行治疗, 发现SAP患者在使用加减清胰汤(大黄、川苇、芒硝、马鞭草、黄 苓、郁金、鸡血藤、刘寄奴、枳壳、厚朴、川楝子、柴胡)鼻饲后, 其血清中降钙素原(PCT)、白细胞介素-1 (IL-1)和IL・8水平比单纯 用药患者低,且CD4+、CD4+/CD8+水平升高,说明加减清胰汤可减 轻炎症反应,提高患者免疫力,保护肠道功能。陈爱华2采用清胰 通腑汤(大黄、枳实、厚朴、芒硝、黄苓、黄连、木香、白芍、延 胡索、炙甘草、炒山药)灌肠治疗SAP患者,7天后治疗组患者WBC、 TNF-a和IL・6炎症指标比对照组更低(P<0・05)。许文捷等冋采取 锦红汤鼻饲(大黄,蒲公英,红藤)加肠内营养治疗SAP患者20例, 治疗3天和8天后,与其他两组患者相比,血中IL・6、TNFf、降钙 素原、C・反应蛋白等指标均明显降低(P<0.05) o李强问在常规治疗 基础上加用大柴胡汤治疗SAP患者50例,7天后大柴胡汤组IL・6、 白介素・10 (IL-10)和hs-CRP等指标的含量较对照组明显降低 (P<0.05)o

1・3针灸治疗

针灸治疗重症急性胰腺炎在近几年研究比较热门,临床上对针灸 合用中药的研究比较多,单纯使用针灸辅助治疗SAP的临床研究目 前比较少。崔东等[⑹通过观察用针刺联合参附注射液治疗SAP患者 57例后得出结论,SAP患者经针灸治疗后其改良Marshall、Balthazar CT及APACHE- II评分均明显低于对照组患者,且其血清中AMY、 CRP> IL-6及TNFf等含量均明显减少(P<0.01)?说明针灸辅助治疗重症急性胰腺炎,能在改善患者肠胃功能,减轻临床症状,抑制炎 症反应等方面起到作用。冯勇等[⑺医治SAP患者72例,实验组36 例,对照组36例,实验组在对照组基础上辅以清胰汤口服和针灸治 疗,发现实验组患者血清淀粉酶和肝肾功能指标较对照组降低,且实 验组患者血清中TNFf、IL・6、IL・8水平显著降低,说明清胰汤和针 灸可以辅助治疗SAP ,减少炎症因子的释放,减轻炎症反应。赵莉 等问用针灸针刺大肠俞、上巨虚穴治疗SAP患者60例,第3、8、14 天,针刺组血清淀粉酶、TNFf、IL・6和APACHE II评分均较治疗前 明显降低(P<0.05)o

2、动物实验研究

2.1中药单体

高美花等[19]以腹腔注射大黄素治疗SAP模型大鼠,并于术后4, 8, 12h三个时间点收集肺泡灌洗液,经检测肺泡灌洗液中的IL・1卩、IL-6 水平在术后4h较模型组低,可以推测大黄素可减轻SAP相关肺组织 的早期损伤。李慧艳等㈤]以黄苓貳经股静脉首次推注0.2 ml/100 g, 后用微泵持续泵入,以0.2 ml • 100 g1 -h-1速度,于给药后3、6、12 h时间点,胰腺组织TNFf、IL-6> 10水平与模型组比较降低,说明 黄苓貳可能通过抑制炎症介质的释放,进而控制级联反应。王艳蕾等 0]用梔子提取液治疗SAP大鼠,以lmL/100g剂量灌胃,术后24h 发现治疗组大鼠血中ET、NO、过氧化脂质(LPO)以及胰腺组织LPO 改善情况均比模型组大鼠好。刘明东等〔22]通过腹腔注射20mg/kg剂量 的丹参酮IIA,并于给药后3、6、12、24四个时间点观察,肺组织 中细胞因子TNF-a> IL・1卩、ICAM-1与模型组相比明显降低(P<0.05), 提示丹参酮可以改变肺组织中的炎症因子水平,从而减轻其损伤程 度。赵永福等㈤将90只大鼠随机分为SAP组、雷公藤内脂醇治疗组、 假手术组,治疗组予以腹腔注射雷公藤内脂醇(0・05g/L),每只大 鼠注射剂量为0.2mg/kg,于术后2、6、12h三个时间点,治疗组大鼠 血中ALT、TNF-a> IL・6比SAP组低,且肝组织中NF・kB活性明显 降低,说明雷公藤内脂醇可能抑制NF+B激活,从而调控炎症介质 的释放。

2.2单味中药

王艳蕾等[24]用单味中药梔子煎水,煮成50%煎剂,以lml/100g 灌胃SAP大鼠,24h后检测血清中淀粉酶、内毒素、一氧化氮、过 氧化脂质含量明显下降。陈博用刺五加经股静脉注射10ml/kg,并 于术后3、6、12三个时间点,收集肺泡巨噬细胞,发现NF・kB活性 受到抑制(P<0・05),胰腺腺泡炎性细胞浸润减少,渗出明显减轻。邙 钢等[26]将72只大鼠随机分为三组,治疗组给予丹参注射液静脉滴注, 剂量为3.6mg/100g,于给药后6、12、24h采集大鼠血液及胰腺组织, 结果显示血中IL-1> IL・6、和TNF-a水平较SAP模型大鼠明显降低, 且胰腺病理评分也降低。张莹等旳将45只大鼠分为模型组、药物组、 对照组,药物组每天以丹参注射液2 ml/kg肌肉注射,6h/次,24h后 发现药物组血中ET-1含量降低,肾脏ET-1 mRNA的表达受到抑制 (P<0.01) o朱正明等[绚将70只大鼠随机分为7组,每组10只,分 别采取外周静脉注射和腹腔动脉灌注红花注射液治疗SAP大鼠,剂 量均为0.5ml/kg,结果显示,早期予以动脉灌注红花注射液,对降低 血清TNF-a和血浆TXB2、胰腺组织和肺组织的MPO效果较好。 2.3复方中药

吕冠华等[2刃将72只SD大鼠分为三组,每组24只,即假手术组、 模型组和中药组,中药组予以清下活血方(大黄、黄苓、赤芍、厚朴、 枳实、桃仁、红花、莪术、甘草)灌胃,剂量为lml/100g,其余两 组予以相同生理盐水灌胃,于24, 4& 72 h三个时间点收集大鼠小肠 组织,中药组肠粘膜组织IL-6mRNA水平与模型组比较明显减低 (PVO.O5), IL-10mRNA水平与模型组比较明显升高(P<0. 05),结果提 示清下活血方可平衡和调控炎症介质的释放,包括促炎因子和抗炎因 子。路小光等网发现,大黄附子汤(附子、大黄、细辛)经大鼠空肠 造痿管灌注,8h/次,可降低SAP大鼠血清中淀粉酶、TNF-a> IL・1卩 和IL-18的含量,且模型组含量更低(P<0・0 1),提示大黄附子汤 可减少促炎因子的释放。金岩柏等卩1]以茵陈承气汤(茵陈、梔子、厚 朴、枳实、大黄、芒硝)治疗SAP大鼠,3h、6h、12h三个时间点取 样,与模型组相比,治疗组大鼠胰腺、肺及空肠组织中NF・kB活性 减弱,血清中TNF-a> IL-10表达水平降低,提示茵陈承气汤可能抑 制NF-kB活性。党琳等[辺用去氧胆酸钠胰胆管逆行注射建立SAP模 型大鼠,并应用柴苓承气汤(柴胡、黄苓、厚朴、枳实、川苇、丹参、 梔子、生大黄、芒硝)治疗SAP大鼠,在治疗lh、5h、10h后, 大鼠血清AMS、ALT、AST、IL・6含量和胰腺、肝脏组织单核细胞 趋化蛋白・1 (MCP-1)、IL-6 mRNA表达水平在同一时间点上较治疗 前显著下降(P<0.05) o肖青川等⑴]用清胰II号颗粒剂灌胃治疗SAP 大鼠以10ml/kg的剂量,6h/l次,24h后大鼠胰腺组织Hmgbl mRNA 相对表达量较对照组明显降低(P<0・01) , ET-K NO浓度明显降低 (PV0.01)。韦运达等网将12只大鼠随机分为对照组、模型组、阳性对 照组(IL-10组)和安胰颗粒组,予以安胰颗粒(生大黄、玄明粉、 柴胡、枳实、厚朴、木香、金银花、蒲公英、黄苓、红藤、莪术等) 灌胃3h后大鼠胰腺组织NF-kBP65表达开始降低,且12h降低更为 显著。

2.4针灸

实验研究针灸治疗SAP目前较少。蒋莉娅等卩习将40只雄性大鼠 随机分为4组,用3.5%牛黄胆酸钠逆行注射胰胆管建立SAP模型, 造模后予以针刺治疗(肺、大肠、脾经穴位及其背月俞穴),治疗6h 后发现针刺可降低SAP大鼠血清中TNFf、NO、血清巨噬细胞炎症 -2 (macrophage inflammatory protein-2? MIP-2)含量、肺与大肠组织 MIP-2mRNA表达水平,说明早期针刺可减少炎症细胞释放,减轻肺 损伤。

3、总结

在全身炎症反应过程中,炎症介质具有关键和重要的作用,目前 关于重症急性胰腺炎发病机制主要偏向于“炎症介质与细胞因子学 说” o治疗SAP时单纯西医治疗方法所取得的疗效具有明显局限性, 故中医药治疗SAP成为研究热点。根据SAP发病机制,中医药治疗 对炎症介质的影响受到更多关注和重视。从以上相关临床和实验研究 证实,中医药治疗,包括中药、针灸等方式能调控炎症介质,减轻

SAP的炎症反应;但目前中医药治疗对炎症介质影响的具体机制研 究,未明确得到系统的证实,大多主要是研究如何影响炎症介质的水 平,仍需要更加深入研究。

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