G试验、GM试验对侵袭性肺部真菌感染诊断价值的探讨论文

2020年3月12日09:00:28G试验、GM试验对侵袭性肺部真菌感染诊断价值的探讨论文已关闭评论

G试验、GM试验对侵袭性肺部真菌感染诊断价值的探讨论文

摘要

研宄背景

随着现代医学的迅速发展,侵袭性肺部真菌感染(Invasive pulmonary fungal infection IPFI)的发生率也随之增加,且其死亡率较高,早期诊断仍然是临床医 生面临的巨大挑战。泛真囷细胞壁多糖(1-3 ) _P_D-甸聚糖((l-3)-P-D-glucan BG) 和曲霉菌特异性抗原半乳甘露聚糖(galactomannanGM)已被广泛研究并被纳入 国内外IPFI诊断的微生物学标准。然而,关于BG和GM诊断准确性的研究显 示了不同的结果。此外,BG和GM的临床应用部分受到假阳性和假阴性结果的 限制。已经有大量研究评估了 BG和GM对IPFI的诊断性能,但是,对于如何 在临床实践中应用这些标记物仍然没有达成共识。

目的

探讨G试验、GM试验对IPFI的诊断价值。

方法

  • 回顾性分析2015年1月至2018年12月因肺部感染收住郑州大学第二附 属医院呼吸内科病房的患者224例。收集全部患者的基本资料、临床诊断和辅助 检查结果。
  • 依据我国IPFI工作组制订的《IPFI的诊断标准与治疗原则》,将患者 分为IPFI组(3个诊断级别,确诊、临床诊断、拟诊,本研究IPFI组排除拟诊病 例)与NO-IPFI组。IPFI组依据病原学培养结果分为曲霉菌、其他真菌感染两个亚组。
  • 分别计算G试验在IPFI组及肺部曲霉菌感染亚组的灵敏度、特异度、 阳性预测值(positivepredictivevaluePPV)、阴性预测值(negativepredictivevalue NPV),并评价G试验对IPFI的诊断价值;分别计算血清、支气管肺泡灌洗液

(Bronchoalveolar lavage fluid BALF) GM试验在肺部曲霉菌感染亚组的灵敏度、 特异度、PPV、NPV,并比较G试验、GM试验对肺部曲霉菌感染的诊断价值, 同时比较血清、BALF GM试验对肺部曲霉菌感染的诊断价值。

  • 收集IPFI组112例患者所有标本的真菌培养结果,分析曲霉菌培养与G 试验、GM试验的一致率及曲霉菌培养对肺部曲霉菌感染的临床诊断价值。
  • 比较IPFI组与NO-IPFI组患者的性别、年龄、住院时间、合并的慢性基 础疾病等相关资料,评价IPFI的危险因素。

结果

  • 以BG检测值大于或等于100 pg/mL为G试验阳性,G试验在IPFI组 的灵敏度、特异度、PPV、NPV分别为 75.00%、78.57%、77.78%、75.86%; G 试验在肺部曲霉菌感染亚组的灵敏度、特异度、PPV、NPV分别为77.27%、 26.47%、40.48%、64.29%。以GM试验检测值大于或等于50 S/CO为GM试 验阳性,GM试验在肺部曲霉菌感染亚组的灵敏度、特异度、PPV、NPV分别为 63.64%、76.47%、63.64%、76.47%; BALFGM试验在肺部曲霉菌感染的灵敏 度、特异度、PPV、NPV分别为 72.73%、70.59%、61.54%、80.00%。在肺部曲 霉菌感染亚组患者中,G试验的灵敏度高于GM试验,G试验、GM试验的灵敏 度低于两者联合检测;BALFGM试验的灵敏度高于血清GM试验。
  • G 试验受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve ROC曲线)曲线下面积(Noarea under the curve AUC)大于GM试验

(0.862>0.610) ; BALF GM试验ROC曲线下面积大于血清GM试验

(0.850>0.735) 〇

  • 曲霉菌培养阳性中G试验阳性率为27%; G试验阳性的IPFI组患 者中,曲霉菌培养阳性率为40.48%。曲霉菌培养阳性中GM试验阳性率为 63.64%; GM试验阳性的IPFI组患者中,曲霉菌培养阳性率为77.27%。
  • 性别、年龄在IPFI组与NO-IPFI组患者对比分析中P> 0.05,无统计 学意义。而住院时间在两组对比分析中P< 05,有统计学意义,说明IPFI组患 者比NO-IPFI组患者住院时间更长。合并的慢性阻塞性肺疾病(Chronic

 

obstructive pulmonary disease COPD)、支气管扩张、脑梗塞、高血压、冠心病

等慢性基础疾病在两组对比分析中P> 0.05,无统计学意义;而肺结核、糖尿病、 恶性肿瘤、自身免疫性疾病、肾脏疾病、慢性肝脏疾病等慢性基础疾病在两组 对比分析中P< 0.05,有统计学意义,说明是IPFI的危险因素。

结论

  • 在诊断IPFI时,G试验的价值优于GM试验。
  • 对于IPFI,感染的病原菌以曲霉菌为主,G试验具有较高的敏感性, GM试验具有较高的特异性,两者联合检测,可以降低漏诊率及误诊率。
  • 在诊断肺部曲霉菌感染时,BALFGM试验的价值优于血清GM试验, 为防止漏诊及过度诊疗,可依据ROC曲线确定其最佳临界值。
  • IPFI组比NO-IPFI组住院时间更长,合并有肺结核、糖尿病、恶性肿 瘤、自身免疫性疾病、肾脏疾病、慢性肝脏疾病等慢性基础疾病的患者更易发 生IPFI,是IPFI的高危因素。

关键词

(1-3) -P-D-葡聚糖,半乳甘露聚糖,侵袭性肺部真菌感染,阳性预测值, 阴性预测值。

Discussion on the diagnostic value of G test and
GM test for Invasive pulmonary fungal infection

Postgraduate Heqing Wang
Supervisor Runxia Shao

Department of Respiratory and Critical Care Medicine
The Second Clinical College of Zhengzhou University
Henan Zhengzhou 450014

Abstract

Background

With the rapid development of modern medicine, the incidence of Invasive Pulmonary fungal infection (IPFI) is also increasing, and its mortality rate is high, early diagnosis is still a huge challenge for clinicians. The pancreatic fungal cell wall polysaccharide (1-3)- P -D-glucan (BG) and the Aspergillus-specific antigen galactomannan (GM) have been extensively studied and incorporated into the microorganisms diagnosed by invasive pulmonary fungal infections at home and abroad. However, studies on the diagnostic accuracy of BG and GM show different results. In addition, the clinical application of BG and GM is partially limited by false positive and false negative results. A number of studies have evaluated the diagnostic performance of BG and GM for invasive pulmonary fungal infections, but there is still no consensus on how to apply these markers in clinical practice.

Objective

To explore the diagnostic value of G test and GM test for IPFI.

Methods

  • A retrospective analysis of 224 patients admitted to the respiratory ward of the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University from January 2015 to

December 2018 due to pulmonary infection. Collect basic data,clinical diagnosis, and auxiliary examination results for all patients.

  • According to the "Diagnostic Criteria and Treatment Principles of IPFIn formulated by the Working Group on IPFI in China, the patients were divided into IPFI group (3 diagnostic grades, confirmed diagnosis, clinical diagnosis, suspicious diagnosis, IPFI group excluded the suspicious diagnosis) and NO-IPFI group. The IPFI group was divided into two subgroups of Aspergillus and other fungal infections based on the results of pathogenic culture.
  • The sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV) of the G test in the IPFI group and the lung subgroup of pulmonary Aspergillus infection were calculated, and evaluate the diagnostic value of the G test for IPFI. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of the serum and BALF GM test in the subgroup of Aspergillus pulmonary infection were calculated separately, and the diagnostic value of G test and GM test for pulmonary Aspergillus infection was compared. At the same time, the diagnostic value of serum and BALF GM test for pulmonary aspergillosis infection was compared.
  • Collecting fungal culture results of all specimens from 112 patients in the IPFI group, analyze the coincidence rate of Aspergillus culture with G test, GM test and the clinical diagnostic value of Aspergillus culture for pulmonary Aspergillus infection.
  • Compare the gender, age, hospitalization time, combined chronic basic diseases and other related data of patients in the IPFI group and the NO-PFI group, and evaluate the risk factors of IPFI.

Results

  • The G test is positive if the BG test value is greater than or equal to 100 pg/mL, and the sensitivity, specificity, PPV and NPV of the G test in the IPFI group were00%, 78.57%, 77.78%, and 75.86%, respectively; the sensitivity, specificity, PPV and NPV of the G test in the subgroup of pulmonary Aspergillus infection were 77.27%, 26.47%, 40.48%, and 64.29%. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of the GM test in the subgroup of Aspergillus infection of the lung were 63.64%, 76.47%, 63.64%, and 76.47%, respectively, when the GM test value was greater than or equal to 0.50 S/CO. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of the BALF GM test in pulmonary Aspergillus infection were 72.73%, 70.59%, 61.54% and 80.00%, respectively. In the subgroup of patients with pulmonary aspergillosis infection, the sensitivity of the G test was higher than that of the GM test, and the sensitivity of the G test and the GM test was lower than the combined test; the sensitivity of the BALF GM test was higher than that of the serum GM test.
  • The area under the curve (AUC curve) of the receiver operating characteristic curve (ROC curve) of the serum G test was greater than the serum GM test (0.862>0.610); the area under the ROC curve of the BALF GM test was greater than the serum GM test (0.850>0.735).
  • The positive rate of G test in Aspergillus culture positive was27%. Among the patients with positive G test, the positive rate of Aspergillus culture was 40.48%. The positive rate of GM test in Aspergillus culture positive was 63.64%; in the IPFI group with positive GM test, the positive rate of Aspergillus culture was 77.27%.
  • Gender and age were P>0.05 in the IPFI group and NO-IPFI group, which was not statistically significant. The hospitalization time was P<0.05 in the comparative analysis of the two groups, which was statistically significant, indicating that patients in the IPFI group had longer hospital stay than those in the NO-IPFI group. The chronic underlying diseases such as Chronic obstructive pulmonary disease, bronchiectasis, cerebral infarction, hypertension and coronary heart disease were P>0.05 in the two groups, which was not statistically significant. The chronic underlying diseases such as tuberculosis, diabetes, malignant tumor, autoimmune diseases, kidney diseases and chronic liver disease were P<0.05 in the two groups, which was statistically significant, indicating that it is a risk factor for IPFI. Conclusion
  • In the diagnosis of IPFI, the value of the serum G test is superior to the serum GM test.
  • For IPFI, the pathogen of infection is mainly Aspergillus, the G test has high sensitivity, and the GM test has high specificity. Combined detection of the two can reduce the rate of missed diagnosis and misdiagnosis.
  • In the diagnosis of pulmonary Aspergillus infection, the value of BALF GM test is better than serum GM test. In order to prevent missed diagnosis and over-diagnosis, the optimal threshold value can be determined according to ROC curve.
  • The IPFI group was hospitalized longer than the NO-IPFI group. Patients with chronic underlying diseases such as tuberculosis, diabetes, autoimmune diseases, kidney diseases and chronic liver disease were more likely to develop IPFI, which was a high risk factor for IPFI.

Keywords

(l-3)-P-D-glucan, galactomannan, Invasive pulmonary fungal infection, Positive predictive value, Negative predictive value.

中英文缩略词对照表

现代医学发展速度日新月异,随着各种糖皮质激素、细胞毒类药物、免疫 抑制剂、广谱抗菌药物等的广泛应用,器官移植、造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplant HSCT)等的广泛开展,各种侵入性操作以及获得性免疫缺陷综 合征(Acquired immunodeficiency syndrome AIDS)患者的不断增多等因素,使侵袭 性肺部真菌感染(Invasive pulmonary fungal infection IPFI)的发病率逐年上升[12], 引起越来越多的临床医生尤其是呼吸内科医生的高度重视。国内有文献报道, IPFI占全身真菌感染发生率的60%以上同时国外文献报道,侵袭性真菌病 (Invasive fungal disease IFD)常发生于免疫力低下的患者,其病情进展迅速,死亡 率可高达50%[4,5]。早期诊断、及时有效抗真菌治疗可改善预后。由于IPFI的临 床特征缺乏特异性,早期诊断困难,易导致误诊,从而延误治疗,甚至最终导 致患者死亡,故临床急需解决IPFI的早期诊断问题。新的血清学检测方法如G 试验、GM试验等快速发展,且其具有早期、快速、方便、非侵入性等优点,已 成为目前诊断IPFI研究领域的焦点,已被国内外IPFI诊断和治疗指南列为临床 诊断IPFI的微生物学标准之一&11]

除接合菌(根霉/毛霉)、隐球菌之外的真菌细胞壁中广泛存在(1-3) -P-D- 葡聚糖((l-3H3-D-glucan BG),其占真菌细胞壁成分的50%以上,酵母菌细胞壁 中的含量最高,而其他微生物及组织细胞均不含BG。当发生IPFI时,真菌细胞 壁中的BG可以进入血液或其它体液中,而真菌表浅感染或局部定植时BG极少进 入血液或其他体液中,因此血清BG检测对筛查、诊断IPFI具有重要临床意义。 YoshidaM等[12]发现可能与内毒素在革兰氏阴性杆菌感染中的作用相似,BG可刺 激机体产生免疫反应并被迅速清除。目前推荐的诊断标准为BG检测值 2l00pg/mL为阳性,提示可能为真菌感染,血清BG水平下降提示临床抗真菌治 疗有效,连续检测可以判断病情变化和治疗反应。G试验诊断IPFI具有早期、快 速、方便、非侵袭性等优点,已被国内外IFD诊断列为微生物学标准[6_1G13]。值 得注意的是,在IPFI诊断和治疗专家共识M中强调了 G试验连续2次结果阳性在 IFD诊断中的重要性。但目前关于BG检测的敏感性和特异性在各种研究报道中 有较大差异,还需进一步研究其临床应用价值。

半乳甘露聚糖(galactomannan GM)抗原是曲霉菌细胞壁上的一种多糖抗原,

在曲霉菌菌丝向组织侵袭性生长时可以从薄弱的菌丝顶端进入血液,是最早释 放的抗原。GM抗原可以在血液中持续存在1-8周[14]。GM试验也被国内外IFD诊 断列为微生物学标准[6-1Q15]。和G试验一样,多个国内指南[7_9]均强调了GM试验 连续2次结果阳性在诊断IFD的重要意义。GM是第1个用于侵袭性曲霉菌病 (invasive aspergillosis IA)诊断的特异性抗原,也是最早释放的抗原,主要用于急 性侵袭性曲霉病的诊断其释放量与菌量呈正比,可以作为反映感染程度及 疗效评价的指标。血清、血衆、支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolarlavagefluid BALF)或脑脊液均可作为标本进行检测,灵敏度可达0.5〜l.Ong/mL%。肺部曲 霉菌感染患者的血清GM试验阳性可比临床表现和影像学改变早,对高危患者连 续动态监测(每周2次)具有早期诊断价值。GM检测与肺部CT检查相结合更有 助于早期诊断。有研究发现,血清GM在抗真菌治疗后升高者提示预后不良,血 清GM连续检测可以监测病情变化。

呼吸内科肺部感染患者由于大多合并有慢性基础疾病、应用广谱抗菌药物 等因素,成为IPFI的高危人群。本研究主要针对目前己广泛应用的传统病原学 检查、BG检测以及GM检测结果进行综合分析,探讨G试验、GM试验对IPFI 的临床诊断价值,并对传统的病原学检查对IPFI的临床诊断意义加深认识,提 高临床医生,尤其是非呼吸内科医生对IPFI的认识,指导临床早期诊断IPFI, 有效治疗,改善预后。对象与方法 1研究对象

1.1研究对象来源

2015年1月至2018年12月郑州大学第二附属医院呼吸内科因肺部感染住 院的患者224例。

1.2入选标准

  • 住院时间大于或等于3天;
  • 年龄大于或等于18周岁,男女不限;
  • 呼吸道症状及肺部体征给予抗细菌药物治疗3天后无好转或好转后上述 症状及体征再次加重;
  • 血清G试验、GM试验和BALFGM试验在住院期间给予抗真菌药物治 疗前至少各检测2次;
  • 资料齐全者。

1.3排除标准

  • 住院时间小于3天;
  • 年龄小于18周岁;
  • 拟诊IPFI患者;
  • 外院确诊或临床诊断IPFI并给予抗真菌药物治疗者;
  • 给予预防性抗真菌药物治疗者;
  • 资料不齐全者。

1.4分组标准

回顾性分析确诊及临床诊断的IPFI患者112例作为IPFI组(确诊20例、 临床诊断92例);同时收集同期呼吸内科因肺部感染住院但排除IPFI的患者 112例作为非IPFI组(NO-IPFI组);依据病原学培养结果将IPFI组分为肺部 曲霉菌感染及肺部其他真菌感染两个亚组。1.5 IPFI的诊断标准

IPFI组患者符合IPFI的诊断标准结合我国国情,参照欧美国家的相关 诊断及治疗指南,依据我国IPFI工作组制订的《IPFI的诊断标准与治疗原则》, 将可能的IPFI患者分为3个诊断级别,确诊、临床诊断、拟诊(见表2.1)。不 包括真菌寄生和过敏所致的支气管IPFI。

1.5.1宿主因素

  • 中性粒细胞计数持续减少,<0.5xl09/L,>10天;
  • T>38°C或<36°C,并伴有下列情况之一:前2月曾出现中性粒细胞持续减 少(>10天);前1月曾接受或正在接受免疫抑制剂治疗;有侵袭性真菌感染 (InvasivefungalinfectionIFI)病史;患有AIDS;有移植物抗宿主病(Graftversus hostdiseaseGVHD)的症状和体征;应用类固醇激素持续3周以上;有慢性基础 疾病,或创伤、术后长期住重症监护治疗病房(IntensivecareunitICU),长期 机械通气,留置导管,全胃肠外营养(ParenteralnutritionPN),长期使用广谱 抗生素等。

1.5.2临床特征

主要特征:1)侵袭性肺曲霉感染(Invasive Aspergillus infection IAI)的X线、 电子计算机断层扫描(Computed Tomography CT)影像学特征:胸膜下早期出

现密度增高结节实变影;病灶周围数天后出现晕轮征;肺实变区10-15天后液化、 坏死,出现空腔阴影、新月征;2)肺孢子菌肺炎CT影像学特征:两肺有毛玻 璃样肺间质病变征象,伴低氧血症。

次要特征:1)肺部感染的症状和体征;2)影像学有新的肺部浸润影;3) 发热持续4天,积极抗菌治疗无效。

1.5.3微生物学检查

  • 镜检合格痰液有菌丝,培养真菌阳性2次(包括曲霉属、接合菌、镰刀 菌属);
  • 镜检BALF有菌丝,培养真菌阳性;
  • 镜检或培养合格痰液或BALF新生隐球菌阳性;
  • 合格痰液或BALF有肺孢子菌包囊、囊内小体或滋养体;
  • 连续检测2次血液曲霉菌GM抗原(ELISA)阳性;
  • 连续检测2次血液真菌细胞壁成分BG阳性;
  • 血液、胸液隐球菌抗原阳性。

1.5.4 确诊 ipn

至少符合1项宿主因素;1项主要或2项次要肺部感染的临床特征;以及1 项下列微生物学或组织病理学依据:

霉菌:肺组织检出菌丝或球形体(丝状真菌,除外酵母菌),并有相应的 肺组织损害。肺组织、胸液或血液培养霉菌阳性,但曲霉属、青霉属(马尔尼 菲青霉菌除外)血液培养阳性时需结合临床,除外标本污染。

酵母菌:肺组织检出酵母菌细胞和(或)假丝菌。肺组织、胸液或血液镜 检有隐球菌,或培养酵母菌阳性。

肺孢子菌:肺组织染色、合格痰液或BALF有肺孢子菌包囊、囊内小体或滋养体。

1.5.5临床诊断IPFI

至少符合1项宿主因素;1项主要或2项次要肺部感染的临床特征;1项 微生物学检查依据。

1.5.6 拟诊 IPFI

至少符合1项宿主因素;1项主要或2项次要肺部感染的临床特征。

1.6观察指标

收集全部患者的基本资料、临床诊断和辅助检查结果。基本资料包括患者

的性别、年龄、住院时间。临床诊断包括住院的主要诊断,合并的慢性基础疾 病。辅助检查结果包括影像学、微生物学及组织病理学检查结果。收集可能引 起G试验假阳性或假阴性的影响因素:包括使用头孢西丁、甲氧苄啶及头孢类抗 菌药物如头孢唑林、头孢噻肟、头孢吡肟等,血液透析使用纤维素膜,静脉输 注凝血因子、免疫球蛋白、白蛋白等。

2研究方法

2.1 G试验的检验原理

使用北京金山川科技发展有限公司生产的真菌(1-3) -P-D-葡聚糖检测试剂 盒(光度法)。检验原理:反应主剂中的G因子、凝固酶原等能被真菌(1-3) -P-D-葡聚糖特异性激活,发生级联反应(凝固蛋白原转变)引起吸光度变化, 真菌(1-3) -P-D-葡聚糖浓度依据检测其溶液吸光度变化定量;两性电解质及表 面活性剂添加试剂中可抑制脂多糖对B、C因子的激活,并能特异性屏蔽革兰阴 性菌脂多糖。样本要求及检验方法严格按照说明书执行。

  1. 2 GM试验的检验原理

使用美国伯乐公司生产的曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒(ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay酶联免疫吸附试验)法)。检验原理:本 试剂盒采用ELISA夹心法,单克隆抗体EBA-2用于包被微板小孔并结合抗原、 检测结合到已激活微板(结合物试剂:过氧化物酶连接的单克隆抗体)上的抗 原;经过热处理的EDTA抗凝血清,可分离免疫复合物、沉淀血清蛋白质(可 能干扰实验的);加入微板小孔里,孵育;在半乳甘露聚糖抗原存在的条件下, 形成单克隆抗体-半乳甘露聚糖-单克隆抗体/过氧化物酶复合物;冲洗反应条的小 孔(微板上),除去没有结合的物质,加基质液呈蓝色,加酸溶液酶反应终止, 蓝色变黄色,测定(设置在450 nm和620/630 nm波长的分光光度计)样本和对 照的吸光度(光密度)。样本要求及检验方法严格按照说明书执行。

2.3统计学方法

数据分析采用spssl7.0统计软件。计数资料以百分比表示。正态分布或近似 正态分布的计量资料以均数±标准差(X±S)表示,偏态分布的计量资料以中位数表示。敏感度、特异度、阳性预测值(positive predictive value PPV)、阴性预 测值(negative predictive value NPV)、约登指数根据其定义计算,并绘制受试 者工作特征曲线(Receiver operating characteristic ROC曲线),确定其诊断价值

及最佳临界值。两组计量资料比较釆用独立样本t检验。计数资料多样本率比较 采用卡方检验或Fisher精确检验。双侧检验P小于或等于0.05有统计学意义。

结果

1辅助检查结果

1,1两组患者G试验、血清和BALF GM试验检测结果比较

IPFI组患者的G试验、血清和BALF GM试验结果高于NO-IPFI组(P < 0.01), 见表3.1。

1.2 G试验、GM试验检测结果

G试验采用BG检测值大于或等于100pg/mL为阳性。入选的224例患者中: IPFI组确诊的20例患者中G试验阳性16例,临床诊断的92例患者中G试验阳 性68例;IPFI组确诊曲霉菌亚组10例患者中G试验阳性8例,临床诊断曲霉 菌亚组34例患者中G试验阳性26例;NO-IPFI组112例患者中G试验阳性24 例。(详见表3.2)

 

注:合计百分率为G试验检测占该组患者百分比。

以GM试验检测值大于或等于0.50 S/CO为GM试验阳性。血清、BALF GM

试验在IPFI确诊、临床诊断曲霉菌及其他真菌感染的检测结果详见表3. 3。

表3.3血清、BALFGM试验检测结果

 

2 G试验、GM试验在诊断IPFI中的作用 2.1 G试验在诊断IPFI中的作用

G试验在IPFI组中的敏感度、特异度、PPV、NPV分别为75.00%、78.57%、 77.78%、75.86%; G试验在曲霉菌感染亚组中的敏感度、特异度、PPV、NPV 分别为 77.27%、26.47%、40.48%、64.29%。(详见表 3.5)

 

在NO-IPFI组患者中G试验阳性24例,其中使用头孢西丁、甲氧苄啶及头 孢类抗菌药物如头孢唑林、头孢噻肟、头孢吡肟等18例,血液透析使用纤维素 膜2例,静脉输注凝血因子、免疫球蛋白、白蛋白6例。

2.2 G试验、GM试验在诊断IPFI中的作用

在IPFI组肺部曲霉菌感染的44例患者中,血清及支气管肺泡灌洗液GM试 验结果,详见表3.3。血清GM试验在肺部曲霉菌感染的敏感度、特异度、PPV、 NPV 分别为 63.64%、76.47%、63.64%、76.47%; BALFGM 试验在肺部曲霉菌 感染的敏感度、特异度、PPV、NPV 分别为 72.73%、70.59%、61.54%、80.00%。 (详见表3.6)

__________ 表3.6血清、BLAFGM试验的敏感度、特异度、PPV、NPV__________

曲霉菌感染亚组       血清GM试验(%)                         BLAFGM (%)

敏感度(%)          28/44 (63.64)          32/44                         (72.73)

在IPFI组肺部曲霉菌感染的44例患者中,G试验阳性34例,GM试验阳 性28例,敏感度分别为77.27% (34/44)、63.64% (28/44),G试验与GM试 验联合检测阳性42例,敏感度为95.45% (42/44);血清GM试验阳性28例, BALFGM 试验阳性 32 例,敏感度分别为 63.64% (28/44)、72.73% (32/44), 血清GM试验与BALF GM试验联合检测阳性40例,敏感度为90.91%(40/44)。 (详见表3.7)

G试验与G试验、GM试验联合检测卡方分析:卡方值6.175, P=0.013,有 统计学意义;GM试验与G试验、GM试验联合检测卡方分析:卡方值13.689, P<0.01,有统计学意义。血清GM试验与血清、BALF GM试验联合检测卡方 分析:卡方值9.318, P=0.002,有统计学意义;BALF GM试验与血清、BALF GM 试验联合检测卡方分析:卡方值4.889, P=0.027,有统计学意义。

  1. 3血清G试验、GM试验诊断IPFI的ROC曲线

IPFI组和NO-IPFI组患者血清G试验、GM试验结果的ROC曲线(见图1)。 血清 G 试验曲线下面积(Noarea under the curve AUC)为 0.862 (95%CI: 0.767 一0.916),约登指数最大时的血清BG最佳临界值为87.5 pg/mL。血清GM试 验AUC为0.610 (95%CI: 0.504 —0.715),约登指数最大时的血清GM最佳临 界值为0.375 S/CO。比较血清G试验、血清GM试验ROC曲线下面积(AUC) 可知:血清G试验对IPFI的诊断价值优于血清GM试验(0.862>0.610)。

图1血清G试验、GM试验结果的ROC曲线

2.4 IPFI组中G试验、GM试验阳性与曲霉菌培养阳性的对比

IPFI组112例患者中:G试验阳性84例,其中曲霉菌培养阳性34例,阳性 率为40.48%;曲霉菌培养阳性44例,其中G试验阳性34例,阳性率为77.27%。 血清GM试验阳性44例中,曲霉菌培养阳性34例,阳性率为77.27%;曲霉菌 培养阳性44例,其中GM试验阳性28例,阳性率为63.64%。BALF GM试验 阳性52例中,曲霉菌培养阳性32例,阳性率为61.54%;曲霉菌培养阳性44例, 其中GM试验阳性32例,阳性率为72.73%。

2.5血清、BALF GM试验诊断肺部曲霉菌感染的R0C曲线

血清、BALF GM实验结果的ROC曲线见图2。血清GM试验曲线下面积 (AUC)为0.735 (95%CI: 0.595-0.876),约登指数最大时的血清GM最佳临 界值为 0.29 S/CO。BALF GM 试验 AUC 为 0.850 (95%CI: 0.742-0.958),约登 指数最大时的BALF GM最佳临界值为1.0 S/CO。比较血清GM试验、BALF GM 试验ROC曲线下面积(AUC)可知:BALF GM试验对肺部曲霉菌感染的诊断 价值优于血清GM试验(0.850>0.735)。

1-特兄件

图2血清、BALF GM实验结果的ROC曲线

3IPFI的危险因素分析

IPn组(112例)患者与NO-IPFI组(112例)患者的基本资料对比分析详见表 3.8、表 3.9。

年龄、性别在IPFI组与NO-IPFI组对比分析中P>0.05,无统计学意义。而 住院时间在两组对比分析中P < 0.05,有统计学意义,说明IPFI患者比NO-IPFI 患者住院时间更长。

IPFI组与NO-IPFI组患者合并的慢性基础疾病对比分析:COPD (P=0.741 >0.05),支气管扩张(P= 0.098 >0.05),肺结核(P= 0.018 < 0.05),糖尿病 (P= 0.01 < 0.05),恶性肿瘤(P= 0.016 <0.05),自身免疫性疾病(P= 0.02 <0.05),肾脏疾病(P= 0.02 <0.05),肝脏疾病(P= 0.038 <0.05),脑梗塞 (P= 0.623>0.05),高血压(P= 0.237>0.05),冠心病(P= 0.127>0.05)。

(详见表3.9)

COPD、支气管扩张、脑梗塞、高血压、冠心病等慢性基础疾病在两组对比 分析中P> 0.05,无统计学意义。而肺结核、糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫性疾 病、肾脏疾病、肝脏疾病等慢性基础疾病在两组对比分析中P< 0.05,有统计学 意义,说明是IPFI的危险因素。

讨论

深部真菌大多为条件性或机会性致病菌,只有当宿主免疫力下降、菌群失 调或保护屏障功能障碍时才发病,免疫力正常个体很少被侵犯。而呼吸内科患 者大多合并有慢性基础疾病、长期应用糖皮质激素或广谱抗菌药物等危险因素, 成为IPFI的高危人群。而IPFI的预后和IPFI的早期诊断、及时有效抗真菌治疗 密切相关。组织病理学是目前诊断IPFI的金标准但本研究IPFI组112例患 者中,只有18例通过组织病理学确诊,其中10例CT引导下肺穿、6例支气管 镜下活检、2例术后病理,组织病理学确诊率仅为16.07%,而同时又排除了拟 诊IPFI例数,可能和常合并有慢性基础疾病、免疫力低下、病情危重等因素限 制病理检查有关。另一确诊方法是胸液、血液培养,但要求真菌浓度较高,且 阳性率较低,本研究中仅有2例血培养阳性确诊,培养确诊率仅为1.79%。痰涂 片、痰培养是目前最为常用的方法,但因长期应用糖皮质激素、免疫抑制剂的 影响,其假阳性率较高。由于临床疑诊IPFI患者常因病情危重,临床表现和特 征不典型,侵入性诊断操作难以实施,同时侵入性组织活检操作风险大、花费 高,患者及其家属难以接受。而真菌培养阳性率低,同时易受环境污染导致可 靠性不高,影像学典型表现出现较晚,导致IPFI早期临床诊断困难。同时,抗 真菌药物目前种类不多且价格昂贵,患者基础状况较差,造成IPFI整体疗效欠 佳,死亡率较高,如IPA达30%〜80%_,因此临床上急需一种快速、方便、有 效的检测方法,提高IPFI的早期诊断率。真菌血清学检测技术如G试验、GM 试验等是近年来才开展的,因其具有早期、快速、非侵入性等优点,同时具有 良好的敏感度、特异度,在IPFI的早期诊断中具有重要意义,己成为IPFI诊断 研究领域的热点。本研究结合传统病原学检查,评估G试验、GM试验对本院 IPFI患者的早期临床诊断价值,并对传统病原学检查在IPFI临床诊断中的意义 加深认识,同时为临床早期有效抗真菌治疗提供依据。

侵袭性曲霉菌病(invasive aspergillosis IA)仍然是免疫受损患者发病和死亡 的重要原因。可能是由于临床、影像学和微生物学诊断困难和诊断延误,尽管 不断有新的抗真菌药物应用于临床,但IA的死亡率仍然很高由于真菌培养 的诊断性能有限,因此越来越多地使用非真菌培养的方法。酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)检测半乳甘露聚糖已被广泛应用

[2122]。尽管PlateliaAspergillus曲霉菌试剂盒试验已成为诊断IA的重要手段,但已 报道了该试验的假阳性[23_25]和假阴性[22,26]结果。这种方法的一个主要缺点是,在 检测中出现假阳性和假阴性结果,因为可能导致对假阳性结果患者进行不合理 的侵入性检查或昂贵的抗真菌治疗,而在假阴性结果的情况下则出现漏诊或延 误诊断。GM试验已被欧洲癌症研究和治疗组织/真菌病研究小组(European Organization for Research and Treatment of Cancer / Mycoses Study Group EORTC / MSG)列入诊断标准P]。BG是大多数真菌细胞壁的组成部分。主要例外的是毛 霉菌和隐球菌,它们在人类血清中不会释放或很少发现BG[28]。BG水平的检测原 理是鲎试验[29]。BG激活因子G (—种鲎变形细胞裂解物的丝氨酸蛋白酶酶原, 其从马蹄蟹物种的阿米巴细胞中提取),这反过来激活凝血级联反应。可以使 用比色法或比浊法测量该反应的活性。然而,常规使用BG测试的主要限制是干 扰物质的假阳性反应[3G-36]。本研究中,IPFI组112例患者中,出现28例阴性,而 NO-IPFI组112例患者中,出现24例阳性,对IPFI的诊断及治疗造成了一定的干扰。 值得注意的是,在IPFI诊断和治疗专家共识W中强调了 G试验连续2次结果阳性在 IFD诊断中的重要性。

肺部真囷感染易发生于如白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤及AIDS等机体免疫受 损患者[37_39]。严重的中性粒细胞减少是肺部曲霉菌感染及肺部念珠菌感染的主 要诱发因素[4Q-41],肺结核[42]、支气管扩张、肺脓肿等既往肺部基础疾病也易发 生肺部曲霉菌感染;糖尿病、系统性红斑狼疮等慢性基础疾病也是肺部隐球菌 感染的易感因素;器官移植、造血干细胞移植患者则更易发生肺部毛霉菌感染 [43];肺部组织胞浆菌感染在包括美国俄亥俄、密西西比河流域及亚洲、拉丁美 洲、非洲的部分地区呈地区性流行[44]。其中,发生率最高的是肺部曲霉菌感染, 约为39.74%[45]。本研究中,IPFI组确诊及临床诊断的肺曲霉菌感染44例,占IPFI 组112例的39.26%,与上述结果基本一致。

BG检测对IFD的诊断性能已经在几项荟萃分析[46_48]中进行了评估,如果将 其用于诊断,该检测被认为是一种有效的诊断手段。在免疫功能低下的患者中, 了解该试验的局限性[36]。对于侵袭性曲霉菌病的诊断,考虑到所报告的敏感性 和特异性在研究中的广泛分散,BG和GM测定似乎在相同的性能范围内。报告 的GM测定灵敏度可变范围为30%-100%,特异性范围为38%-98%[49,5Q]。报道BG 测定的灵敏度可变范围为80 %-90 %,特异性范围为36 %-92 % [5152]。本研究中BG 测定对肺部曲霉菌感染的敏感度、特异度分别为77.27%、26.47%,GM试验对肺 部曲霉菌感染的敏感度、特异度分别为63.64%、76.47%。本实验BG测定的敏感 度较低,可能和假阴性有关[53]:隐球菌或接合菌(根霉/毛霉)感染时,可 能由于其生长缓慢,形成厚壁胞膜,而出现假阴性;曲霉菌肺部感染时,出现 假阴性可能是因为厚壁空洞包绕。念珠菌定植不引起G试验升高。存在深部真菌 感染时G试验阳性,但G试验阳性不能提示感染的真菌类型也可能与研究对 象的分组方法、BG和GM的检测方法、抗真菌治疗的比例以及实验结果的阳性 标准不同有关。然而,很少有研究对诊断为IA的同一病人进行两项试验的直接 比较。一项研究倾向于BG检测[55],一项研究支持GM检测[56],一项研究发现两 种检测之间没有显着差异[57],两种检测之间存在中等一致性[58,59]。本研究中,IPFI 组确诊及临床诊断的44例肺部曲霉菌感染患者中,G试验阳性34例,GM试验阳 性28例,敏感性分别为77.27%、63.64%。但GM试验也可能出现假阳性,如[53]: 使用抗菌药物如哌拉西林-他唑巴坦等;使用免疫球蛋白、血液制品;使用大剂 量激素;透析;化疗所致的严重黏膜炎;儿童和新生儿。此外,GM水平下降可 能和使用抗真菌药物(如三唑类)有关,轻度的侵袭性曲霉病和低曲霉负荷量 GM试验阴性可能和预防性使用伊曲康唑有关[6Q]。Meta分析显示,GM试验对侵 袭性曲霉病的特异度和灵敏度为89%和71%〜87%,而GM试验在BALF中的灵敏 度可能要高于血清[61]。本研究中,血清GM试验、BALF GM试验ROC曲线分析 显示BALF GM试验对肺部曲霉菌感染的诊断价值优于血清GM试验,结果与上 述Meta分析一致。因此临床推荐同时检测BALF和血清的GM水平,以提高其灵 敏度,但需注意其交叉反应,可发生于以下菌种的感染如[53]:枝顶孢霉、马尔 尼菲篮状菌、拟青霉、链格孢霉、深红酵母、新生隐球菌、头地霉等。同时, 研究表明,为更有效诊断侵袭性曲霉病,可联合检测G试验和GM试验[62]

本研究中BG检测的阳性预测值并不高,可能与NO-IPFI组患者中G试验假阳 性率过高有关,已经确定了除IFI以外的原因而增加BG水平的几个因素[28],包括 血液透析使用纤维素膜[32],用去除白细胞的过滤器输注血小板[35,65],静脉输注 凝血因子、免疫球蛋白、白蛋白[66,67],使用头孢西丁、甲氧苄啶、阿莫西林-克 拉维酸盐、哌拉西林-他唑巴坦及头孢类抗菌药物如头孢唑林、头孢噻肟、头 孢吡肟等[33,55],存在严重的细菌感染[68],暴露于纱布或其他含有葡聚糖材料[69], 以及严重的粘膜炎[7G],溶血、脂血、黄疸;食物中的葡聚糖或定植的念珠菌通 过多糖类抗癌药物或放疗和化疗损伤的胃肠道黏膜进入血液等;另外,由于内 毒素与G试验原理相似,血液中的革兰阴性菌可以干扰G试验,从而出现假阳性 [53]。有研究发现,G试验在1例大肠埃希菌感染者结果为阳性,其值大于 120pg/ml;71l。据报道,在某些抗生素的制造过程中释放半乳甘露聚糖可能是GM 检测结果阳性的原因[72]。而BG可存在于制造期间使用的一些支持物中,例如纤 维素过滤器[35]。对于菌血症患者,G试验的假阳性率远高于GM试验(P <0.0001), 菌血症患者的G试验假阳性率为30%,但是对于革兰氏阳性菌血症和革兰氏阴性 菌血症患者,两者不存在显著差异。而一项前瞻性研究中并未发现菌血症期间 BG检测的假阳性结果[73]。本研究中NO-IPFI组G试验假阳性达24例,其中使用头 孢西丁、甲氧苄啶及头孢类抗菌药物如头孢唑林、头孢噻肟、头孢吡肟等16例, 血液透析使用纤维素膜2例,静脉输注凝血因子、免疫球蛋白、白蛋白6例。临 床工作中诊断IPFI需要结合宿主因素、临床特征、微生物学检查结果等综合考虑, 尽量减少过度诊断、过度治疗。本研究中,血清G试验、GM试验ROC曲线分析 显示G试验对IPFI的诊断价值优于GM试验。G检测比GM检测更敏感,但是这种 更高的敏感性与GM测试相比具有更低的特异性。

G试验作为一种新的检测手段也存在缺陷:第一,结合菌(根霉/毛霉)和 隐球菌细胞壁中BG含量极低,甚至不含BG,且由于隐球菌的荚膜较厚,BG不 易释放入血,故血清中BG检测值极低,甚至为零;第二,BG检测缺乏真菌种属 特异性,结果阳性只表示存在真菌感染,但不能区别感染真菌种类;第三,肺 部曲霉菌感染可能是因为厚壁空洞包绕,血清中BG检测值可正常。因此G试验 不适用于肺部结合菌(根霉/毛霉)、隐球菌感染染,对于肺部曲霉菌感染,G 试验阴性也不能排除诊断。

本研究中,对于肺部曲霉菌感染患者,以BG检测值2l00pg/mL为G试验阳性, 以GM检测值20.5S/CO为GM试验阳性,G试验的敏感度(77.27%)高于GM试验 的敏感度(63.64%)。BG检测值阳性34例,漏诊10例,GM检测值阳性28例, 漏诊16例,BG与GM联合检测阳性40例,漏诊4,与SophiakooM等关于G、GM

试验的研究结果相一*致,联合检测BG、GM可以提尚肺部曲霉囷感染患者的检 测敏感度,减少漏诊已有研究表明,将血清BG、GM检测与胸部CT检查相结合作为抢先治疗的 起点,不但降低了经验性抗真菌治疗的过度用药问题,而且提高了 IPFI诊断的准 确性,同时也降低了死亡率[63,6纪动态监测BG、GM水平可以评估抗真菌疗效和 患者预后,对抗真菌治疗方案的调整也有一定的指导意义。

本研究中,曲霉菌培养与GM试验一致性好,提示曲霉菌培养对临床诊断肺 部曲霉菌感染具有较大意义。但抗真菌治疗无效的危重症患者也可能与下列因 素有关:(1)选用抗真菌药种类不当;(2)抗真菌药物用量或疗程不足;(3) 真菌产生耐药性;(4)误诊,并非真菌感染。

本研究存在的不足之处:(1)本研究为回顾性对照研究,存在一些难以控 制的影响因素;(2)收集例数较少,代表性欠佳;(3)本院为省级三甲医院, 患者住院前可能已在基层医院应用影响G试验检测结果的治疗,如静脉应用头孢 西丁、甲氧苄啶及头孢类抗菌药物如头孢唑林、头孢噻肟、头孢吡肟等,血液 透析使用纤维素膜,静脉输注凝血因子、免疫球蛋白、白蛋白等;(4)部分住 院患者可能住院时病情已经很严重;(5)不同的入选标准和分组标准可能会影 响研究结果。

结论

  • 在诊断IPFI时,血清G试验的价值优于血清GM试验。
  • 对于IPFI,感染的病原菌以曲霉菌为主,G试验具有较高的敏感性,GM试 验具有较高的特异性,两者联合检测,可以降低漏诊率及误诊率。
  • 在诊断肺部曲霉菌感染时,支气管肺泡灌洗液GM试验的价值优于血清GM 试验,为防止漏诊及过度诊疗,可依据ROC曲线确定其最佳临界值。
  • IPFI组比NO-IPFI组住院时间更长,合并有肺结核、糖尿病、恶性肿瘤、自 身免疫性疾病、肾脏疾病、肝脏疾病等慢性基础疾病的患者更易发生IPFI, 是IPFI的高危因素。

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综述

血清学检查在诊断霉菌感染中的作用

王和庆综述 邵润霞审校

1.背景

虽然球孢子菌病,组织胞浆菌病和副球菌病是区域性的,但曲霉菌病是全 球性的。每年估计有373000例新的CPA (chronic pulmonary aspergillosis慢性肺

曲霉病)病例在完成抗结核治疗后12个月内使治疗后的肺结核复杂化;5年期 患病率为1174000 (介于397000-2088000) [1]。这一广泛的范围来自几个因素, 特别是根据英国544例肺空洞患者的有限数据集推断CPA诊断M,肺结核治疗 后公布的空洞发生频率存在显著差异,在没有空洞的患者中,缺乏CPA患病率 的估计,以及对并发HIV感染的影响缺乏了解。CPA的发病率和患病率尚不清 楚,但可能被低估,部分原因是CPA发生在活动性肺结核患者中,或作为既往 肺结核的后遗症[3],或作为其他肺部疾病的并发症,症状与肺结核病类似,并被 误诊和误治为肺结核[4]。CPA的英语和日语诊断指南,强调了先进的曲霉菌成像 和血清学检测的核心作用[5 -7]

G试验、GM试验和隐球菌抗原检测均被国内外的诊断标准列入微生物学标 准[8]。念珠菌甘露聚糖抗原、抗体检测在2012年欧洲临床微生物与感染性疾病学 ^ (European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases ESCMID) 念珠菌病诊断和治疗指南中[9]已被推荐作为念珠菌血症和慢性播散性念珠菌病 的诊断方法(Levelll)。曲霉抗体检测在侵袭性曲霉病尤其是慢性曲霉病诊断中 的作用越来越被科研人员重视[1()]。曲霉IgG、IgM和IgE抗体检测在CPA诊断中的 重要作用在2015年出版的欧洲慢性肺曲霉病诊断和治疗的临床指南中[11]已被特 别强调。曲霉IgG抗体检测是慢性空洞性肺曲霉病诊断中最灵敏的微生物学方法 在 2016 年更新的美国感染病学会(Infectious Diseases Society of America IDS A ) 曲霉病诊断与处置指南中更是已被强调[12]

迅速、准确分析造成真菌感染的病原体仍然是现代卫生保健的一个重大挑 战。即使在过去的几十年里,抗原的检测,如酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)和侧流装置已经被开发和应用,传统的真菌培养和 血清学检查仍然是必不可少的。经典的和最近发展起来的血清学技术包括:免 疫扩散,补体固定和ELISA。血清学仍然是检测真菌诊断的基石。

2013年,MarkLindsay写道:“真菌血清学的未来可期。虽然未来的分子学 技术可能取代血清学方法,但直接从患者标本中提取的分子学方法仍需要标准 化,包括时间、技术和成本方面的改进。目前真菌血清学检测的复杂性使大多 数抗体检测和一些抗原检测仅限于较大的临床医院和实验室。为使真菌血清学 继续发展,必须发展足够敏感和特异、快速和简单的方法,且可在本地实验室 进行,以提高诊断效率和及早开始对症治疗[13]。”

血清学抗体检测自20世纪50年代以来一直对非基于培养的真菌感染诊断 有很大价值。可用的技术包括免疫扩散(Immunodiffusion ID)、补体固定 (Complement fixation CF)和酶免疫分析(Enzyme immunoassay EIA)。针对特 定抗体的侧向流动装置正在开发和验证中。

  1. 血清学诊断侵袭性霉菌感染的优缺点

利用血清学诊断侵袭性霉菌感染有许多优点。首先,当培养结果为阴性或 样本难以获得时,结果可能是阳性。在曼彻斯特真菌学研究中心,大约50%的 慢性曲菌病患者痰样本培养呈阴性。其次,如果是阳性,血清学结果可能降低 对培养的需求。最后,血清学样本的获取是微创的,它降低了检测的难度。但 是,敏感性和特异性较低是血清学公认的缺点。血清学检查结果阴性不应排除 真菌感染的存在。一些检测,特别是补体固定,耗时且技术要求较高。免疫受 损患者的抗体反应可能降低,这大大降低了血清学检查的价值[14]。对血清学结 果的解释,可能因血清学检测特定的免疫球蛋白无法区分目前或既往的感染而 混淆。一些测试可能出现假阳性。最后,敏感性取决于疾病的类型和与疾病过 程相关的检测时机,例如,感染的早期与晚期相比。

血清学对于一些侵袭性真菌病诊断价值很大,特别是与镜检和培养结合时。 血清分析包括血液中抗体的定性和定量测定。根据使用的方法,半定量和定量 的血清学分析可能具有潜在的预测价值,尽管它们在特异性和(或)敏感性方面会有一些差异[15-17]。在常用的方法中,免疫扩散的敏感性较差,但如果参考 感染特异性抗原和抗体,它的特异性较高。

  1. 曲菌病

少数曲霉菌,最常见的烟曲霉菌,可能导致各种过敏状态以及慢性疾病, 但很少有危及生命的侵袭性曲菌病。这主要发生在严重免疫缺陷患者,并在最 近几年急剧增加。检测曲菌病特异性抗体是过敏性支气管曲菌病(Allergic bronchopulmonary aspergillosis ABPA)和 CPA 诊断的重要组成部分[1516]。这些感 染在全球范围内很可能成为一个重大的公共卫生问题,因为20-35%的结核病患 者在治疗后会产生曲霉特异性抗体,其中63%的患者在3年内会发展为肺曲霉 菌病[15]。据估计,全球5年期结核病继发流行率在80万至137万例之间。由于 烟曲霉是主要的致病菌,因此从气道中分离出的曲霉对诊断和鉴定抗药性至关 重要,但是,与当前标准培养技术相比,痰的分离率相对较低[17]

  1. 慢性肺曲霉菌病

血清学在真菌感染中对CPA的诊断价值最大。CPA在全球范围内对人的影 响比其他任何真菌感染都严重的多,是最常见的肺结核并发症,尽管其他慢性 肺部疾病如肺气肿和结节病也可以由CPA复杂化。

血清抗原检测,如半乳聚糖是诊断急性侵袭性曲菌病的关键,但只有大约 25%的CPA患者血清抗原检测结果阳性[1819],而90%以上的患者抗体检测结果 阳性@1。这两者是相关的,因为半乳甘露聚糖是形成IgG抗体的免疫抗原之一。 最近研发的一种商业抗半乳聚糖IgG检测方法(Dynamiker, China)在CPA病例 中的敏感度为77%[21]。如抗半乳甘露聚糖抗体一样,似乎有相似数量的患者血 清半乳甘露聚糖检测阴性,尽管这些数据来自不同的临床研究,但这表明这可 能与血清中的半乳甘露聚糖抗原结合并使半乳甘露聚糖抗原检测对慢性疾病不 敏感有关。在亚急性肺曲霉菌病中,尚不清楚抗原或抗体检测是否敏感,可能 这两种方法都可用。

已经应用了 70多年的沉淀技术[15],可以检测到多种类型的免疫球蛋白,除IgG外还包括IgM。它们通常与从真菌培养中提取的内部抗原一起使用。在技能29熟练的人中,这个检测是可能用的,但该技术费时,实验室之间的标准化和重 现性极具挑战性。在英国,这种技术的灵敏度不到60%,而且很大程度上已经 被ELISA取代然而,在法国,沉淀技术通常被用作大多数中心的“确认” 检测[

在过去的十年中,已经开发了几种商业化的曲霉特异性IgGELISA,并且己 经广泛用于CPA的诊断。但是这些试验之间存在差异。其中许多是基于与传统 的沉淀物中使用的抗原相似的培养提取的抗原,例如,Immulite (Siemens, Germany) , ImmunoCAP (ThermoFisher Scientific) , Serion (Germany) fP Genesis (UK)。一种方法使用未指定的重组抗原(Bio-Rad,USA)的组合。另一种方 法是将传统培养提取抗原与重组糜蛋白酶和mitogillin (Bordier,Switzerland)的 组合。ImmunoCAP和Immulite检测只能在自动化系统上进行,而其他品牌可在 传统的96孔ELISA板上使用,可以手动或借助自动洗板机进行。

最近有研究描述了这些检测的可重现性。在一项研究中,Bordier检测变异 系数为 20%[24],而在另一研究中,Immulite 为 3.6%,Genesis 为 8.2%,Serion 为23-44 % [21]。第三项研究描述ImmunoCAP (CAP免疫测试)的变异系数为5%, Bio-Rad (生物芯片)的变异系数为33%[22]。只描述了 ImmunoCAP的实验室间 变异(7.3-18.1%),这说明了批次之间的差异,因为在不同地点使用了不同生产批 次的检测包[25]。由于许多分析是基于培养物提取的抗原,因此建立批次间重现 性至关重要,但到目前为止还没有其他相关的分析。

大多数检验报告的结果是任意单位,而Immulite和ImmunoCAP报告的结 果单位为mg / L。同时,通过ImmunoCAP试验,曲霉菌水平一直是Immulite 的两倍[2125]。因此,实验室说明避免混淆而使用的检测方法是至关重要的。

商业化验之间的诊断性能存在差异。在一项研究中,ImmunoCAP和Bio-Rad 检测对CPA的敏感性分别为86%和85%[22]。另一项研究比较了 Bordier, Bio-Rad和Serion,发现检测性能差异有统计学意义,敏感性分别为97%,92% 和86%[24]。与慢性肺疾病患者相关的特异性为90.3%,91.3%和81.5%,Bordier 和Bio-Rad均表现出统计学上显着优于Serion的表现。第三项研究发现 ImmunoCAP和Immulite在性能方面具有统计学上显著优于Serion的性能,后者 本身明显优于Genesis和Dynamiker检测[21]。CPA的敏感性分别为96%,96%, 90%,75%和77%。在最佳cut-offs下,与健康对照相关的特异性为98%,98%, 98%,99%和99%。本研究中超过99%的患者对至少一项检测结果阳性,这表

明如果第一次检测结果为阴性且临床怀疑程度较高时,则应进行第二次检测。

最佳cut-offs的鉴定对于曲霉属ELISA检测是至关重要的。在大多数感染中, 暴露于致病微生物是一种罕见的事件,并且任何抗体反应的存在是代表目前或 既往感染的证据。然而,人类在整个生命过程中都会接触曲霉菌,如果具有正 常结构的肺和完整的先天免疫系统,则很少患病。健康人的抗体水平在整个儿 童时期都会增加[26],大多数健康成年人都有一定程度的抗体反应。因此,确 定区分抗体病理性上升的cut-offs至关重要。

大多数检测制造商建议使用诊断cut-offs。这些cut-offs通常根据具有各种形 式的曲霉病的小混合群体来计算。由于慢性疾病中的抗体水平可能远高于过敏 性或急性侵袭性疾病,因此这些cut-offs可能无法针对CPA进行优化。最近的一 项研究通过进行ROC曲线分析比较241 CPA病例确定了 Bio-Rad测定的最佳 cut-offs 为 1.5 AU / ml, Immulite 为 25 mg / L,ImmunoCAP 为 50 mg / L,Serion 为 50 U/ml。对于 Immilite,ImmunoCAP 和 Serion,这些与制造商推荐的 cut-offs 类似,但对于Bio-Rad,这与推荐的中间值为10 AU/ml和阳性为15 AU/ml的 cut-offs显著不同。

CPA几乎全部发现于患有潜在慢性肺病的患者。最近的一项研究表明,与 健康对照组和治疗结核病对照组相比,Immulite检测的cut-offs相似[27]。另一项 研究将已证实CPA患者的ImmunoCAP水平与具有相似临床和放射学表现但具 有正常炎症标志物的患者进行比较,并确定与其他地方相关的健康对照相同的 cut-offs (50 mg/L) [28]。对于其他潜在的肺部疾病可能不是这种情况。健康对 照组的中位曲霉菌特异性IgG水平为6 mg / L,而无支气管扩张的慢性阻塞性肺 疾病(Chronic obstructive pulmonary disease COPD)为 17.4 mg/L,支气管扩张 的COPD为35.4 mg/L^。目前为止,没有研究评估过结核病以外的其他条件 下曲霉菌特异性IgG的最佳cut-offs,后者仅占欧洲CPA病例的15%[3()]。如果 要对CPA诊断使用这些检测方法,这些研究是必不可少的。

估计全球大多数CPA都继发于肺结核因此很可能发生在资源匮乏的地 区。目前,在这些地区中获得曲霉菌血清学的机会非常有限[32]。由于需要维护, 复杂的自动化系统(如ImmunoCAP和Immulite)不适合资源匮乏的地区。Bio-Rad 和Bordier等板材ELISAs可在实验室提供,但不适用于提供结核病护理的当地 诊所,因为难以获得如自来水和电力等基本设施。侧流装置即时检验已经改变 了这些地区中疟疾和艾滋病等其他疾病的诊断。正在开发针对曲霉属IgG的类

似测定,包括 IMMY (Norman,OK,USA)和 LDBio (Lyon, France)的测定,

但迄今为止尚未公布关于临床准确性的数据且尚未将检测商业化.

除诊断外,曲霉属IgG可能在监测CPA中的治疗反应中起作用。在英国使 用6个月的泊沙康唑治疗的10名患者中,有7名患者的曲霉菌IgG水平下降, 而在中国接受治疗的患者中有2名然而,另一项研究发现,在英国接受6 个月唑类治疗的25名患者中,不到10%的抗体水平显著下降[22]。目前尚不清楚 抗体水平的降低是否与临床治疗和放射学反应相关。在将曲霉-IgG视为治疗反 应的可靠检测之前,需要在该领域进行更多的临床试验验证工作。

鉴于培养提取物中存在大量抗原,必须确定曲霉特异性IgG检测与其他真 菌之间是否发生交叉反应。在过敏性曲霉菌病中,已显示出曲霉属抗原与青霉 菌(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、枝孢菌(Cladosporium)和马拉色 霉菌属(Malassezia)的IgE发生交叉反应[35]。这些真菌中没有一种会引起类似 CPA的疾病,但由于气道定植或指甲感染,它们可能会产生IgG反应,从而导 致曲霉菌特异性IgG假阳性结果。尚不清楚Bio-Rad或Bordier检测中使用的重 组抗原是否与其他物种发生交叉反应。尚不清楚曲霉菌特异性IgG检测与可导 致类似临床表现的其他真菌交叉反应的程度,例如组织胞浆菌,球孢子菌和副 球孢子菌。在使用曲霉菌特异性IgG之前,需要在该领域开展更多工作,特别 是在其他真菌性肺病流行的地区。

欧洲的大部分CPA都是由烟曲霉引起的[27],但在韩国,20%的病例是由黑 曲霉引起的[19]。CPA的物种多样性尚未在其他地方得到很好的调查。基于烟曲 霉(A.fumigatus)的沉淀试验仅在黄曲霉(A.flavus)或黑曲霉(A.niger)引起 的曲霉病病例中约有一半阳性[36]。尚未确定现代商业ELISA测定与由其他物种 引起的CPA的交叉反应性。在曲霉菌血清学在全球范围内使用之前,需要解决 这些问题。

  1. 结核病和艾滋病病毒感染的曲霉国病

最近在乌干达的研究表明,慢性肺曲菌病和曲霉菌致敏可能是导致乌干达 肺结核病人死亡的主要原因[22]。对101例合并HIV感染的患者在结核病治疗开 始和第24周的配对血清进行了测试[37]。用免疫学分析方法ImmimoCAP测定了 曲霉特异性免疫球蛋白G (IgG)和免疫球蛋白E (IgE);用免疫学分析方法

Immulite测定了曲霉特异性免疫球蛋白IgG和总血清IgE。在结核病治疗结束时, 10%的患者的曲霉特异IgG (表明曲霉致敏性)和9%的患者的曲霉特异IgG抗 体升高。在基线和24周之间,曲霉特异性IgG滴度显著下降。CD4T细胞计数 <100/以的患者和在基线上没有接受抗逆转录病毒治疗的患者,其曲霉特异性IgG 抗体升高(p=〇.〇l,p=〇.〇3)。第24周时,ImmunoCAP曲霉菌特异性IgG抗体 滴度高于基线,24周时阳性更多。肺部浸润是最常见的X射线异常,只有5% 的患者在24周的胸部X射线有肺空洞。曲霉感染可能使HIV阳性患者的活性 肺结核复杂化,他们的研究结果提供了血清学可能有助于测量肺曲霉菌病合并 肺结核的流行率。

6.ABPA

过敏性支气管肺曲霉菌病(ABPA)的特征是曲霉菌气道定植的过敏性炎症 反应[38],偶尔见于其他真菌。据估计,ABPA使大约7-14%的哮喘病例复杂化[38]。 在每一例不受控制的哮喘病例中都应排除ABPA。ABPA的诊断标准包括支气管 哮喘的存在,即时皮肤试验对烟曲霉的反应性,烟曲霉特异性IgE滴度的升高, 肺浸润(短暂或固定),中央支气管扩张和外周血嗜酸性粒细胞增多[37]

许多研究通过分析慢性肺曲霉菌病和由曲霉菌引起的过敏性疾病的血清来 比较不同的血清学技术。Baxter及其同事对两种商用EIA的性能与交叉免疫电 泳(counterimmunoelectrophoresisCIE)进行了比较[22]。在一项针对 175 例患有 慢性或过敏性肺曲菌病的成人队列研究中,使用CIE,PhadialmmunoCap Aspergillus IgG 和 Bio-Rad Platelia Aspergillus IgG 检测曲霉 IgG 抗体。确定了中 间测定的可重复性,在6个月的间隔时间内对25名患者分析了两份血清样本。 与CIE相比,ImmunoCap和Platelia Aspergillus IgG对检测曲霉IgG抗体具有良 好的灵敏度。两个EIA之间的阳性结果一致性水平良好,但抗体浓度在测试之 间或与CIE滴度无关。92 %患者的ImmunoCap IgG水平和72 %患者的Platelia IgG 水平反映了 6个月CIE滴度变化的方向。结果表明,与CIE相比,ImmunoCap 和Platelia Aspergillus IgG EIA都是曲霉菌IgG抗体的敏感指标,但是, ImmunoCap似乎具有更好的重复性,可能更适合患者疾病的监测。

Dumollard及其同事最近报道了一种新的商业酶免疫测定法对Aspergillus IgG (Bordier Affinity Products)的性能与 Platelia Aspergillus IgG (Bio-Rad

Laboratories, France)和 Virion / Serion Aspergillus fumigatus IgG 测定法相比的

结果[24]。该检测使用两种重组抗原,其与烟曲霉的传统体细胞和代谢抗原有共 有特征。该研究表明,在单一 EIA中使用重组,体细胞和代谢抗原改善了灵敏 度和特异性之间的平衡,从而使该测定非常适合用于诊断慢性和过敏性曲霉菌 病。尽管新的血清学试验有了很好的发展,但过敏性和慢性肺曲霉菌病的诊断 目前仍然依赖于建立的曲霉IgG和IgE测定,同时结合临床。

7.ABPM

过敏性支气管肺真菌病(Allergic Bronchopulmonary Mycosis ABPM)是一

种与各种环境真菌的免疫敏感性有关的临床综合症,在全球范围内,定植于哮 喘患者的上呼吸道。一个大型案例系列已经过审查[39]。截至2014年,已报告143 例由曲霉菌以外的真菌引起的ABPM病例。印度次大陆占ABPM报告病例的约 47%,主要是白色念珠菌,其次是日本(16%),其中S. commune占主导地位, 其余三分之一来自美国,澳大利亚和欧洲。最常见的病原体是白色念珠菌,占 病例报告的60%,其次是双极霉属(Bipolaris species) (13%),裂褶菌 (Schizophyllum commune) (11%),弯孢霉属(Curvulariaspecies) (8%), 假霉样真菌属复合物(Pseudallescheriaboydii species complex) (3%),以及很 少的链格孢属(Alternariaalternata)、镰刀菌属(Fusariumvasinfectum)、青霉 菌属(Penicillium species)、分枝孢子菌属(Cladosporiumcladosporioides)、葡 柄霉属(Stemphyliumlanguinosum)、稻根霉菌(Rhizopusoryzae)、酵母菌属 (Saccharomyces cerevisiae)和白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)。有趣的 是,支气管哮喘仅存在于32%的ABPM病例中,而其与ABPA发展的关联更为 常见。回顾的病例显示,中位IgE值比ABPA高3倍,这表明ABPM的病原体 引起的免疫反应强于ABPA中的曲霉菌@1。ABPM目前尚未被诊断,需要进行 全面的基础和临床研究,以了解其流行病学和开展有效的治疗方法.ImmunoCap 可以监测一些与ABPM相关的霉菌的血清学反应[39]

对环境模型特异性的IgE和/或IgG抗体是ABPM诊断的重要要求@1。尽管 不是ABPM中所有的致病真菌,但可获得市售的ELISA抗原试剂盒。有许多临 床和免疫学标准用于诊断过敏性支气管肺曲霉菌病,包括特异性IgE;在简单的 霉菌敏化的情况下也可以发现相同的情况,因此,并没有指出ABPM的诊断[39]。 然而,特异性IgE升高至真菌致敏患者混合血清的两倍,表明ABPM[39]

  1. ABPA与ABPM的血清学分化

Fukutomi及其同事己经解决了这样的问题:由于不同真菌来源的天然提取 物(天然抗原混合物)之间的交叉反应性,烟曲霉特异性IgE的存在并不总是表 明对烟曲霉的真正致敏%L研究发现,通过测量IgE至Aspfl和f2,并对检测 真正的烟曲霉过敏的特异性过敏原成分进行表征,可以大大提高测试的特异性。 还认识到天然真菌提取物之间的交叉反应性问题对于鉴定ABPM患者中的真正 致病真菌也是如此。一些由曲霉菌以外的真菌诱导的ABPM患者可能与ABPA 诊断标准一致,因为目前的标准取决于IgE / IgG对天然提取物的反应性。考虑 到临床表现,抗真菌治疗策略和疾病预后可能受到不同病原菌的影响,准确鉴 定ABPM的真正致病真菌具有重要的临床意义。通过对真菌特异性过敏原组分 IgE的测定,确认真菌的敏感性,以及从气道中对真菌进行反复微生物分离,可 以有效地验证致病真菌的诊断。

  1. 展望

检测升高的抗曲霉菌抗体可用作免疫活性或非中性粒细胞减少患者的非侵 袭性疾病的诊断标记。然而,这些检测对免疫抑制患者的临床作用有限,对于 这些患者,需要额外的实验室证据(例如,真菌培养,放射照相标志)。值得 注意的是,在重症监护患者中用于区分曲霉菌定植与侵袭性疾病的方法中没有 该分析物的检测。

床边检测(Point-of-caretestingPOC)是一项令人兴奋的发展,特别是对实

验室资源有限的发展中国家。与集中式实验室相比,POC可在更短的时间内提 供及时的结果。基于侧向流动检测(Lateral flow assay LFA)的POC装置是用于 定性和定量分析的非常快速增长的策略之一。其出色的功能和多功能性使其成 为即时应用的理想选择。侧向流动检测基本上结合了许多变体,例如形式,生 物识别分子,标记,检测系统和应用。

毫无疑问,LFA条带在临床真菌学中具有广泛的应用。大多数LFA给出可 以用肉眼观察到的定性或半定量结果。传统的LFA通常是定性的,给出答案是 或否。良好的LFA生物传感器应具有许多属性,如生物相容性,高特异性,高 灵敏度,分析速度快,结果的再现性/精确度,分析工作范围广,分析准确,高 通量,紧凑,成本低,操作简单,便携性,配置灵活性,小型化的可能性,以 及大规模生产和现场检测的潜力。我们等待开发用于检测真菌抗体的这些装置 的进一步进展。

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