多巴胺-黑色素纳米颗粒促进自噬清除氧自由基在骨关节炎中的机制研究论文

2020年3月9日20:16:31多巴胺-黑色素纳米颗粒促进自噬清除氧自由基在骨关节炎中的机制研究论文已关闭评论

多巴胺-黑色素纳米颗粒促进自噬清除氧自由基在骨关节炎中的机制研究论文

中文摘要

骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种非常常见的慢性退行性骨关节 病变,该病变主要累及承重的大关节,病程进展缓慢,呈进行性加重,晚 期0A病人日常活动明显受限,甚至可能丧失日常生活能力。学术界目前 普遍认为0A是由于机械负重和生物化学因素共同作用下,关节软骨基质、 关节软骨细胞和软骨下骨的新陈代谢发生失衡而导致的,病理进程涉及关 节机械力学、炎症因子、氧化应激(自由基)和先天遗传因素等多方面因 素的影响。大量文献报道表明,氧化应激(Oxidative Stress,OS)可以通过 调节细胞内信号通道的传导、胞外基质的合成和降解、生物膜的通透性、 细胞衰老和凋亡以及基因的转录和翻译等过程,对OA病情的发展的多个 阶段产生促进作用。而氧自由基(reactive oxygen species,ROS)是OS导 致OA软骨细胞损伤、衰老和凋亡的直接原因。因此,维持体内氧化与抗 氧化作用平衡,清除多余的ROS被认为是治疗OA的可行方案。多巴胺 (Dopamine)是一种常见的神经传导介质,在机体内主要作用为传递神经 冲动至细胞,调节细胞的生理活动。这种脑内分泌的激素能调节机体的情 绪和感觉,当多巴胺分泌增加能传递兴奋及开心的信息至下游的细胞。最 近研究表明多巴胺具有显著的抗氧化能力,同时多巴胺具有激活自噬清除 受损细胞器和有害物质的能力,而且多巴胺具有良好的生物相容性和微小 的细胞毒性,因此多巴胺是良好的治疗OA的潜在药物。然而在体内降解 很快,且体内环境对多巴胺理化性质影响很大,单纯的应用多巴胺难以起 到理想的疗效。本课题针对多巴胺的这些特性,用黑色素修饰多巴胺成功 制备了多巴胺-黑色素纳米颗粒(Dopamine-melanin nanoparticles,DM),DM

很好的弥补了多巴胺在体内半衰期短的不足,同时保存了多巴胺自噬的激 活效应、抗氧化清除ROS的优良性质。基于此,本课题首先测定了 DM体 外对白介素-IBata (IL-ip)介导的OA软骨细胞的治疗作用;其次检测DM 体外对IL-ip介导的OA软骨细胞自噬的影响;然后检测DM体外对IL-ip 介导的OA软骨细胞内ROS的影响;再进一步研究DM治疗OA与其激活 自噬、清除ROS的内在联系;最后通过内侧半月板切除的手术方式建立 OA动物模型,通过关节腔注射DM纳米颗粒和对照剂,系统评价了 DM纳 米颗粒对OA的治疗效果。本硕士学位论文取得的主要研究成果如下:

  1. DM的制备与表征

将盐酸多巴胺溶解于乙醇/水混合溶液中,加入氢氧化铵溶液中作为催 化剂。在空气中反应24小时后,通过离心收集产物。所合成的DM可以稳 定分散在水中,形成透明胶体溶液。扫描电子显微镜(SEM)和透射电子 显微镜(TEM)显示该产物纳米颗粒是均匀的球体,平均直径为112.5nm。 动态光散射(DLS)实验发现纳米颗粒的流体动力学尺寸为230nm。Zeta 电位分析表明,纳米颗粒表面呈负电荷(13.5 mV)。这归因于纳米颗粒表 面的多个儿茶酉分基团,并得到了傅立叶红外光谱(Fourier-transform infrared spectroscopy, Fr-IR)和核磁共振氢(1HNMR)分析的证实。

  1. DM纳米颗粒对OA软骨细胞的治疗作用评价

用2%二型胶原酶处理幼年SD大鼠膝关节软骨组织,并提取原代的关 节软骨细胞,并利用流式细胞学检测、阿利新蓝染色法和甲苯胺蓝染色进 行软骨细胞鉴定,第二代软骨细胞用于整个体外实验部分使用。使用用 CCK-8法评价DM纳米颗粒对软骨细胞的毒性,并做浓度筛选,结果显示 DM纳米颗粒溶液浓度不超过160 |ig/mL时,对关节软骨细胞的细胞活性不 会产生明显的抑制作用,在DM纳米颗粒的浓度为 10(ig/mL,30(ig/mL,60(ig/mL时软骨细胞的活性最强,因此这三个浓度被作为 最适浓度用于后面进一步研究。使用10 ng/mL的IL-ip孵育软骨细胞24小 时制造经典的体外OA模型,低、中、高浓度的DM纳米颗粒溶液干预OA 细胞24h,可显著上调OA细胞中自噬相关指标(Beclin-1,LC3,AGT7等) 的表达、降低自由基(ROS和RNS)的水平和抑制IL-ip介导的炎症因子 (IL-lp,IL-6,TNF-a,MMP-13等)的分泌(p<0.01)。通过共聚焦显微镜共定 位检测在DM干预下OA细胞内自噬流和ROS得变化,结果发现在DM作 用下自噬的激活先于清除ROS。使用自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤 (3-Methyladenine,3-MA)与DM共同孵育OA软骨细胞经,结果发现DM 清除ROS的效应和治疗OA的能力都被大大削弱。以上结果表明DM发挥 治疗OA的作用得益于DM自噬的激活效应,才能进一步清除ROS从而实 现对OA的治疗。

  1. DM对OA大鼠的药效评价

通过微创手术,行大鼠关节内前交叉韧带横断术和内侧半月板切除术, 建立经典的OA动物模型,并通过前抽屉试验验证造模成功。手术后4周 开始于关节腔注射低、中、高浓度的DM溶液,每周注射三次,每次0.2ml, 连续注射四周。大体观结果显示:骨关节炎模型组的大鼠的股骨髁及胫骨 平台软骨组织色泽灰暗,出现明显的软骨缺损,这一结果进一步说明造模 成功以及骨关节炎对关节的损害;低、中、高浓度DM纳米颗粒治疗组的 股骨和胫骨平台软骨色泽与骨关节炎模型组有明显差异,手术造成的关节 损伤被显著缓解,这一结果与组织染色的结果一致。说明DM纳米颗粒治 疗可以有效地保护骨关节炎造成的关节损伤和退化。此外,通过ELISA试 剂盒测定不同分组中SD大鼠关节液中TNF-a、IL-6和MMP-13的含量,该 结果表明不同浓度的DM纳米颗粒治疗组均出现炎症因子水平(IL-6、 MMP-13和TNF- a )显著降低(P<0.01),说明经关节腔注射DM纳米颗 粒可以有效降低大鼠关节液中IL-6、MMP-13和TNF-a的水平,减轻炎症 反应;抽取各组的关节液检测ROS的水平,结果显示OA组ROS水平相对 于正常组显著上升,DM纳米颗粒组大大降低了关节液中ROS的水平。通 过MDA和GSH试剂盒检测不同分组大鼠关节液中MDA和GSH的含量, 结果表明,DM纳米颗粒治疗组相对于OA模型组可以显著降低关节液中 MDA的含量,提高关节液中GSH的含量。说明经关节腔注射DM纳米颗 粒使关节组织氧化水平得到提升。

总之,DM纳米颗粒可以有效的对抗骨关节炎病理改变,保护软骨组织 正常功能和结构、激活关节组织自噬、降低氧化应激水平和降低炎症介质 表达,是一种具有潜在的具有临床意义的OA药物。

关键词骨关节炎,多巴胺-黑色素纳米颗粒,软骨细胞,自由基,自噬

MECHANISM OF DOPAMINE-MELANIN
NANOPARTICLES PROMOTING AUTOPHAGY AND
SCAVENGING OXYGEN FREE RADICALS IN
OSTEOARTHRITIS

ABSTRACT

Osteoarthritis (OA) is a very common chronic degenerative bone and joint disease. The lesion mainly involves the weight-bearing large joints. The course of the disease progresses slowly and progressively worsens. The daily activities of patients with advanced OA are obviously limited, even may lose the ability to daily life. It is generally believed in the academic community that OA is caused by the imbalance of metabolism of articular cartilage matrix, articular chondrocytes and subchondral bone due to mechanical load and biochemical factors. The pathological process involves joint mechanics, inflammatory factors, oxidative stress. (Free radicals) and congenital genetic factors and other factors. A large number of reports have shown that Oxidative Stress (OS) can regulate the conduction of intracellular signaling pathways, synthesis and degradation of extracellular matrix, biofilm permeability, cellular senescence and apoptosis, and transcription and translation of genes. The process of promoting the development of multiple stages of OA disease. Reactive oxygen species (ROS) are the direct cause of OS damage, senescence and apoptosis in OA chondrocytes. Therefore, maintaining a balance between oxidation and anti-oxidation in the body and eliminating excess ROS is considered a feasible solution for the treatment of OA. Dopamine is a neurotransmitter that helps cells transmit pulsed chemicals. This kind of brain secretion is related to human lust and feeling, and it conveys excitement and happy information. Recent studies have shown that dopamine has significant antioxidant capacity, while dopamine has the ability to activate autophagy to remove damaged organelles and harmful substances, and that dopamine has good biocompatibility and microcytotoxicity, so dopamine is a good treatment for OA. Potential drugs. However, the rapid degradation and the in vivo environment have a great influence on the physicochemical properties of dopamine. It is difficult to achieve ideal therapeutic effect by simply applying dopamine. In view of these characteristics of dopamine, dopamine melanin nanoparticles (DM) were successfully prepared by melanin-modified melatonin. DM well compensated for the short half-life of dopamine in vivo? and preserved dopamine autophagy. The activation effect, the excellent properties of antioxidant scavenging ROS. Based on this, the subject firstly measured the therapeutic effect of DM on interleukin-1 Bata (IL-ip)-mediated OA chondrocytes; secondly,the effect of DM on IL-ip-mediated autophagy of OA chondrocytes; To detect the effect of DM on IL-ip-mediated ROS in OA chondrocytes in vitro; further study the intrinsic relationship between DM and OA to activate autophagy and clear ROS; finally establish OA animal model and systematically evaluate the therapeutic effect of DM on OA . The main research results of this dissertation are as follows:

  1. Preparation and characterization of DM

Dopamine hydrochloride was dissolved in an ethanol/water mixed solution, and added to an ammonium hydroxide solution as a catalyst. After reacting for

24 hours in the air? the product was collected by centrifugation. The synthesized DM can be stably dispersed in water to form a transparent colloidal solution. Scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) showed that the product nanoparticles were uniform spheres with an average diameter of 112.5 nm. Dynamic light scattering (DLS) experiments found that the nanoparticle has a hydrodynamic size of 230 nm. Zeta potential analysis showed that the surface of the nanoparticles was negatively charged (13.5 mV). This was attributed to the multiple catechol groups on the surface of the nanoparticles and was confirmed by Fourier-transform infrared spectroscopy (Fr-IR) and nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR) analysis.

  1. Evaluation of the therapeutic effect of DM on OA chondrocytes

The rat knee articular cartilage was degraded with type II collagenase and primary chondrocytes were extracted and identified by toluidine blue and alexin blue staining. The whole in vitro cell experiments were partially treated with second generation chondrocytes. The toxicity of DM to chondrocytes was evaluated by CCK-8 method. The results showed that the DM dose did not exceed 100 |ig/mL? and had no significant effect on the cell viability of SD rat chondrocytes. Induction of classical in vitro OA cell model using IL-ip,low, medium and high doses of DM solution for incubated with OA cells for 24 h significantly up-regulated the expression of autophagy-related indicators, decreased ROS levels and inhibited IL-ip in OA cells. Mediated inflammatory factor secretion (p < 0.01). The rat knee articular cartilage was degraded with type II collagenase and primary chondrocytes were extracted and identified by toluidine blue and alexin blue staining. The whole in vitro cell experiments were partially treated with second generation chondrocytes. The toxicity of DM to chondrocytes was evaluated by CCK-8 method. The results showed that the DM dose did not exceed 100 |ig/mL? and had no significant effect on the cell viability of SD rat chondrocytes. Induction of classical in vitro OA cell model using IL-ip, low, medium and high doses of DM solution for incubated with OA cells for 24 h significantly up-regulated the expression of autophagy-related indicators, decreased ROS levels and inhibited IL-ip in OA cells. Mediated inflammatory factor secretion (p < 0.01).

  1. Evaluation of the efficacy of DM on OArats

Through minimally invasive surgery, the rat anterior cruciate ligament transection and medial meniscus resection were performed to establish a classic animal model of OA? and the successful model was verified by the front drawer test. At 4 weeks after surgery,low, medium and high concentrations of DM solution were injected into the joint cavity,and injected twice a week,0.2 ml each time, for four weeks. The results of the general observation showed that the femoral condyle and tibial plateau cartilage tissue of the osteoarthritis model group were gray and dark, and obvious cartilage defects appeared. This result further indicated the successful modeling and the damage of the joints of osteoarthritis; low and medium The femoral and tibial plateau cartilage color of the high-concentration DM nanoparticle treatment group was significantly different from that of the osteoarthritis model group, and the joint damage caused by the surgery was significantly alleviated, which was consistent with the results of tissue staining. In addition, the threshold of mechanical contraction of hind limbs in the OA group was significantly reduced, and the threshold of mechanical contraction was gradually increased to normal level after three treatments in the DM group. The levels of IL-6? MMP-13 and TNF-a in rat joint
fluid were determined by ELISA kit. The results showed that inflammatory factor levels (IL-6? MMP-13 and TNF-a) were observed in different doses of DM treatment group. Significantly decreased (P<0.01)? indicating that injection of DM into the joint cavity can effectively reduce the levels of IL-6? MMP-13 and TNF-a in the joint fluid of rats? and reduce the inflammatory response; the level of ROS is detected by extracting the joint fluid of each group. The results showed that the ROS level in the OA group was significantly higher than that in the normal group, and the DM group significantly reduced the level of ROS in the synovial fluid. The MDA and GSH kits were used to detect the content of MDA and GSH in the synovial fluid of different groups of rats. The results showed that the DM nanoparticle treatment group can significantly reduce the content of MDA in synovial fluid and increase the content of GSH in synovial fluid compared with the OA model group. . It is indicated that the oxidized level of joint tissue is improved by intra-articular injection of DM nanoparticles.In conclusion, DM can protect chondrocytes more effectively, maintain the normal morphologyof articular cartilage, activate autophagy, increase the bodyfs antioxidant level and reduce the level of inflammatory factors, and it has higher biological activity and longer half-life in the joint cavity. Time is a potentially clinically significant OA drug.

 

第一章前言

骨关节炎(Osteoarthritis,0A),是一种进行性发展的退变性关节疾病, 主要病理特征为关节软骨退化变性、骨赘形成及关节间隙变窄,进而继发 骨膜、关节囊及关节周围肌肉韧带的改变,使关节面上生物应力失衡,反 过来加速关节软骨的退变,形成恶性循环,持续加重0A的疾病进程W。随 着社会人口老龄化的加重,发病率逐年上升,在60岁以上人群中发病率高 达78.5%,致残率高,是影响人们健康的最严重问题之一,给社会带来了巨 大的经济负担[2]。目前的0A治疗方式十分有限,在0A早期多选择保守治 疗,晚期只能进行关节置换治疗,价格昂贵给患者带来沉重负担,给医务 工作者尤其是骨科医护人员带来巨大挑战ra。由于人们对0A具体发病机制 尚未完全了解,给临床治疗带来了巨大阻碍。因此探索0A新的发病机制 和新的治疗策略成为目前关节外科领域亟待解决的研究难点和热点。

最近研究表明,自由基的大量集聚导致的氧化应激(0S)是0A发病 的重要病因W。当机体在受到的各种外来刺激超过一定程度时,体内具有高 氧化性的自由基如活性氧族(R0S)和活性氮族(RNS)等明显升局,超过了机 体自然的抗氧化能力,导致氧化和抗氧化系统的失衡,从而导致炎性细胞 浸润,蛋白酶分泌大量增加,产生大量伤害性的氧化中间产物,引起组织 细胞损伤[5]。过度的氧化应激可以对软骨细胞产生多方面的影响。对生物膜 的损伤:R0S作用于生物膜内的不饱和脂肪酸,使其转变成过氧化脂质, 使膜的流动性改变,导致软骨细胞变形能力下降、脆性增加,增加膜通透 性,甚至影响膜受体离子通道活性、功能对蛋白质的损伤:R0S对蛋 白质的氧化损伤可导致其三维结构和生物性能改变,影响细胞结构完整性, 损害细胞功能,促使其对蛋白降解酶的敏感性增加[7]。关节软骨由 (extracellular matrixc,ECM)和软骨细胞组成,ECM的主要成分为胶原蛋白 (collagen)、糖胺多糖(glycosaminoglycans,GAGs)ra。自由基作用于构成关 节软骨的胶原蛋白,改变胶原蛋白的一级结构和空间结构,使其发生变性 和疏水性增加,最终导致生物学功能改变,造成关节软骨细胞外基质流失, GAGs的耗尽是0A的主要特征[7]。GAGs是ECM的主要成分,是由少量蛋 白质和氨基已糖多糖结合成的大分子复合物。氨基已糖多糖的主要成分是 透明质酸(HA),而自由基可直接攻击HA分子中的化学键,使HA化学结 构上发生解聚和降解,造成氨基已糖多糖和GAGs的降解和流失,使ECM 水分丢失,为软骨组织进一步退化提供了有利条件[9]。自由基还可通过生物 膜的通透性、蛋白质、核酸的空间构象等导致软骨细胞生物学功能改变, 损伤了软骨细胞细胞外基质的合成能力,促使II型胶原为主要成分的透明 软骨发生纤维化转变为I型胶原,从而导致软骨的进行性进展的退变损伤[9]。 另外,自由基引起凋亡,造成细胞数量减少,引起缓冲机械压力的关节软 骨变薄,可能是0A的重要机制M]。因此清除过多的氧自由基、抑制氧化 应激是治疗0A的潜在方式和有效手段。

研究表明自噬过程与氧化应激具有显著的负性调节M。自噬是一个吞 噬自身细胞质中受损蛋白或细胞器并使其包被进入自噬囊泡,并与溶酶体 融合,形成自噬溶酶体,利用溶酶体内的水解酶降解其包裹的内容物的过 程,利用水解产物实现细胞本身的能量代谢、物质代谢和受损细胞器的更 新[12]。近来,细胞自噬在骨关节炎发生发展中的角色引起了广泛重视。在 0A微环境中自噬水平受到大大抑制,使得软骨细胞内损伤老化的蛋白或细 胞器等成分不能得到更新,受损物质在软骨细胞内堆积进一步影响细胞代 谢[1314]。另外,研究表明激活自噬能后抑制0S的水平,减少软骨细胞的氧 化损伤,因此激活自噬对抑制氧化应激和治疗骨关节炎具有重大意义[14]

黑色素(Melanin)是一种动植物中普遍存在的生物色素,是酪氨酸或3,4- 二轻苯丙氨经过一系列生化反应生成的。在人体内,Melanin广泛存在于皮 肤、视网膜、粘膜、胆囊、软脑膜及卵巢等部位。Melanin的异常积累多与 内分泌失调、日光照射有关[15]。色素是生物对抗紫外线产生的重要屏障,

Melanin是所有色素中对抗紫外线最强大的色素,而且非常高效。当在紫外 线照射皮肤时,皮肤下Melanin的化学链高度活跃而断裂,将绝大多数的有 害的紫外线转化为无害的热量。同时Melanin具有强大的免疫调节性能、清 除自由基和抗氧化能力,保护了生物体的生存有重要作用[16]。多巴胺 (Dopamine)是贻贝分泌的粘蛋白的主要成分,具有的粘附性、稳定性和生物 相容性,基于这些有益的生物学性质,多巴胺被广泛应用于生物、医药、 化学等领域[17]。此外,多巴胺化学结构中含有有利于化学修饰的的氨基和 酚羟基等活性基团,这一性能有利于它与各种化合物的结合。同时Dopamine 是一种神级系统分泌的儿茶酚胺类神经递质,有报道称Dopamine具有显著 的激活自噬的能力[18]

基于上述理由,本论文用Dopamine为骨架修饰以黑色素,合成一种具 有抗氧化和激活自噬能力的多巴胺-黑色素(Dopamine-Melanin, DM)纳米 颗粒,作用于IL-ip介导的软骨细胞,评估细胞内炎症、自由基(ROS和 RNS)和自噬水平变化,阐述DM纳米颗粒软骨细胞保护作用,并深入探 讨DM纳米颗粒保护软骨细胞的内在机制,以及激活自噬和清除自由基的 性能在其中所起到的作用。并进一步在动物水平上验证DM对OA的治疗 作用。为OA临床治疗提供一下新方向,为OA患者带来了福音。

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第二章多巴胺-黑色素纳米颗粒的构建及理化性质检测

  1. 1前言

多巴胺是一种贻贝足丝内提取的具有良好粘附性、生物相容性、和抗 氧化性的化合物,在多巴胺的侧链上含有大量氨基和酚羟基等活性基团, 为化学修饰提供了有利条件[u]。黑色素是一种普遍存在与动植物的生物色 素,在人体内主要分布于皮肤、粘膜和视网膜等[3]。黑色素通过激活络氨酸 酶对抗紫外线损伤w,具有强大的免疫调节能力和抗氧化性能该化学性 能满足了0A治疗的需要。黑色素化学结构中含有大量的羟基,而多巴胺 的化学结构上面包含一个羧基,这就为这两种物质的合成提供了化学结构 的基础。

本章节以黑色素为基础,与氢氧化铵与乙醇在30°C下充分混合,离心 提纯得到的产物。本章节通过一系列材料表征手段,如透射电镜(TEM)、 扫描电镜(SEM)、红外光谱分析仪(FTIR)、XPS分析、DSC分析、粒 度分析仪(DLS)以及孔径分析检测(BET)分析了合成的纳米颗粒以及纳 米颗粒的表征。

  1. 2材料

Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Fisher Chemical

硝基四唑蓝氯化物(NBT) 脱氧核糖 氯化铁 抗坏血酸

核黄素

乙二胺四乙酸(EDTA)

  1. 3.1 DM纳米颗粒的合成

将2毫升氢氧化铵(28-30% )加入到含有40 mL乙醇和90 mL去离子 水的混合溶液中。将溶液在30°C下磁力搅拌30分钟。在上述溶液中滴加 0.5g多巴胺盐酸盐的10mL去离子水溶液。溶液的颜色立即变为淡黄色并逐 渐变为深棕色。将溶液磁力搅拌另外24小时。离心收集产物并用去离子水 纯化三次。

  1. 2 DM纳米颗粒物理表征检测
  2. 2. 1扫描电子显微镜(SEM)分析

SEM制样简略步骤如下:取少量DM纳米颗粒样品放于1.5ml EP离心 管中,接着加入适量无水乙醇,通过超声振动仪充分混合样品至样品均匀 分散;取适量硅片于EP管中,通过超声清洗仪清洗样品并置于烘箱中烘干; 将均匀分散的样品滴一滴于硅片上,进行喷金处理,然后附上导电胶,进 行抽真空处理,待压强达到4x10^ Pa时开始进行检测,SEM加速电压为20 KV〇

  • 2透射电子显微镜(TEM)分析

TEM制样方法如下:现将DM纳米颗进行冷冻干燥处理,研磨处理好 的DM纳米颗粒样品,接着加入适量无水乙醇进行超声分散使其均匀分散 于乙醇中,DM纳米颗粒浓度不高于lmg/mL,再滴加在铜网上观察。加速 电压为200 KV。

  1. 2. 3傅里叶变换红外光谱(FTIR)

样品制备步骤如下:合成后的DM纳米颗粒样本,将提纯后的产物重 新分散于去离子水中,将密封好的样品放入冷冻干燥机12h。将冷冻干燥好 的DM纳米颗粒样品按质量分数为1: 100与溴化钾粉末混合,置于烘灯下 充分研磨。研磨好的样品置于压片模具上将其压成均匀的样品薄片,将样 品薄片置于红外光谱仪进行检测。检测时红外光谱分析仪的分辨率为: 0.5cm4,信噪比为! 40000:1,波数范围为:4000-400cm、

  1. 2. 4核磁氢谱(1H NMR)检测

称取15 mg待检测DM纳米颗粒样品充分溶解在氘代水中,以四甲基 硅烷(TMS)作为内标,分别检测FWSC和FGSC溶液的氢、氮和碳元素

的质量百分含量。

  1. 2. 5粒径分布和Zeta电位分析

实验步骤如下:取少量待检测DM纳米颗粒样品加入到适量的PBS缓 冲液中,超声震荡仪均匀分散30分钟后,将均匀DM纳米颗粒样品加入到 比色皿中,调节相关参数进行检测。

  1. 3. 3清除自由基检测 2. 3. 3. 1氢氧自由基检测

使用脱氧核糖试管法测量对羟基自由基的清除能力,并进行微小改变。 所有溶液均以新鲜制备的形式使用。这些包括200(iL的2.8 mM 2-脱氧-2- 核糖,5|iL 的 DM 纳米颗粒(3.125|ig/ ml-400|ig/ml),400|iL 的 200 mM FeCl3,1.04mMEDTA,200(iLH2〇2 (l.OmM)和 200(iL 抗坏血酸(l.OmM)。

将所得混合物在37°C下温育1小时。加入含有2.8%TCA的1.5mL水溶液, 首先将溶液保持在室温下。20分钟,然后在90°C下15分钟。然后冷却溶 液并测量并比较532nm处的吸光度。

  • 2超氧化物自由基检测

通过NBT还原检测由核黄素的光还原产生的超氧自由基。PBS (67mM,pH7.8)中的反应混合物含有 EDTA (0.1M),0.0015%NaCN, 核黄素(〇.12mM),NBT (1.5mM)和各种浓度的DM纳米颗粒(10-1000(ig/ mL)和总体积为3mL。将管均匀照射15分钟。在照射之前和之后测量 530nm处的光密度。

  1. 3. 3. 3 DPPH 检测

通过DPPH清除方法测量DM纳米颗粒的自由基清除能力。在96孔板 中使用含有0.004 (ig DPPH的总体积200(iL甲醇和一系列具有最终浓度的 样品等分试样进行测试。在1,0.5,0.25和0.125^ig/mL。测量一式三份进行。 将没有测试样品的相同浓度的DPPH溶液用作对照。每5分钟读取520nm 吸光度,持续30分钟。一式三份分析样品。

  1. 3. 3. 4 —氧化氮检测

将不同浓度的DM纳米颗粒与硝普钠(ImM) —起孵育,硝普钠用作 一氧化氮来源。一氧化氮与氧气反应生成亚硝酸盐。通过Griess测定法测 量亚硝酸盐的量,并监测和比较596nm处的吸光度。

  1. 3. 3. 5过氧亚硝基检测

通过伊文思蓝漂白试验测定过氧亚硝酸盐清除能力。混合50mM磷酸 盐缓冲液(pH7.4)、O.lmMDTPA、90mMNaCl、5mMKCl、12.5(iM 伊文

思蓝和各种浓度的DM纳米颗粒(10-400|ig/ml)和ImM过氧亚硝酸盐, 得到最终溶液的最终体积为lmL。30分钟后测量611nm处的吸光度。使用 没食子酸作为标准,通过将结果与空白样品进行比较来计算清除的过氧亚 硝基阴离子的百分比。

  1. 4结果
  • 1 DM纳米颗粒的合成

我们将多巴胺盐酸盐溶解在乙醇/水混合溶液中,并加入到溶液中作为 催化剂的氢氧化铵。在露天反应24小时后,通过离心收集产物。合成的 DM纳米颗粒可以分散在水中,形成透明的胶体溶液如图2-1所示。

aggregate and gel in the presence of 20 mM CaC12. Figure lb: Color of dopamine melanin nanoparticle

solution at different concentrations.

  1. 4. 2多巴胺-黑色素纳米颗粒物理表征检测
    • 1扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)分析

DM纳米颗粒的直径、形貌在细胞应用方面尤为重要,因为要使得纳米 颗粒更好的发挥作用,首先纳米颗粒必须得顺利传递至目的细胞。而DM 纳米颗粒要进入细胞粒径是有一定要求的,研究表明,DM纳米颗粒尺寸介 于20-200nm之间。同时我们通过SEM初步观察DM纳米颗粒的基本形貌 特征。如图2-2所示,我们合成的DM纳米颗粒直径在100nm到200nm之 间,平均直径为112.5nm,具有完整的球形结构,形貌均匀稳定、尺寸均一。

  1. 4. 2. 1动态光散射、Zeta电位分析、傅里叶变换红外光谱核、磁氢谱

动态光散射(DLS)测量光强的波动随时间的变化。现在的动态光散射 仪器不仅可用运于测量粒径,还具有检测Zeta电位、大分子的分子量等的 功能。DLS技术已经成为纳米材料工程中比较常规的一种表征方法。被广 泛用于检测溶液或悬浮液中的粒径分布。Zeta电位是检测胶体溶液体系稳 定性的重要表征。Zeta电位的意义在于它与胶态分散稳定性呈正相关。因 此Zeta电位常用作颗粒之间相互排斥或吸引的强度的度量。分散粒子越小, Zeta电位的绝对值越高,整个体系就越稳定,即溶解或分散抵抗聚集能力 越强。傅立叶变换红外光谱是一种将傅立叶变换的数学处理,与计算机技 术和红外光谱相结合的分析、鉴定方法。当待测样品放在干涉仪的光路中, 由于吸收了特定频率的能量,因此所得的干涉图强度曲线发生相应的变化, 应用傅立叶变换技术,可以把干涉图上每个频率转变为对的光强,从而得 到整个红外光谱图像。通过对比光谱图的不同特征,可以检定待测样品的 功能团、化学结构、化学反应、异构体类型、物质的纯度等。核磁共振氢 谱(也称氢谱)是一种将分子中氢-1的核磁共振效应体现于核磁共振波谱法 中的应用。可用来确定分子结构。当样品中含有氢,特别是同位素氢-1的 时候,核磁共振氢谱可被用来确定分子的结构。

动态光散射(DLS)发现纳米颗粒的流体动力学尺寸为230nm(图2-3a)。 Zeta电位分析显示纳米颗粒的表面带负电(-13.5mV,图l-3b)。这归因于 纳米颗粒表面上的多个儿茶酚基团,并且通过FR-IR和1HNMR分析证实 (图 2-3c 和 2-3d)。

图2-3. a )多巴胺黑色素纳米颗粒的DLS。 b )多巴胺黑色素纳米颗粒的Zeta电位。c )多巴胺黑
色素纳米颗粒的FT-IR光谱。d )多巴胺黑色素纳米颗粒的1H NMR光谱。

Figure 2-3. a) DLS of dopamine melanin nanoparticles, b) Zeta potential of dopamine melanin
nanoparticles, c) FT-IR spectrum of dopamine melanin nanoparticles, d) 1H NMR spectrum of dopaminemelanin nanoparticles.

活性氧是机体内一类氧的单电子还原产物,是电子在呼吸链中未能传 递至末端氧化酶之前逸出呼吸链并消耗约2 %氧离子生成的,包括超氧阴离 子(02-)、过氧化氢(H202)、羟基自由基(.OH)及一氧化氮(NO)等。主要
包含一种激发态的氧分子,即单线态氧分子(02);三种含氧的自由基:即超 氧阴离子自由基、羟自由基和氢过氧自由基;两种过氧化物:即过氧化氢和 过氧化脂质以及一种含氮的化合物(NO)等。这些物质氧化活性强、存在寿 命短。本实验通过氯氧自由基检测、超氧化物检测、DPPT检测、一^氧化氮 检测和过氧亚硝基检测这五个方面评估巴胺-黑色素纳米粒子清除不同自由 基的能力。我们分析了多巴胺-黑色素纳米粒子清除不同自由基物种的能力(图 2-4)。通过DPPH测定评估自由基清除能力。我们观察到有效和浓度依赖 性DPPH抑制(图2-4a)。与PBS对照相比,80(ig/mL的黑色素纳米颗粒抑 制DPPH水平64%。对于过氧亚硝酸盐和超氧化物以及羟基自由基也观察 到显着的自由基抑制(图2-4b-d)。这些结果证实了黑色素纳米颗粒清除 多种R0S和RNS的能力。

图2-4.多巴胺黑色素纳米粒子作为自由基清除剂。a)多巴胺黑色素纳米颗粒的自由基抑制。b)
多巴胺黑色素纳米颗粒清除过氧亚硝酸根自由基的能力。c)多巴胺黑色素纳米颗粒对超氧化物的
抑制作用。d)多巴胺黑色素纳米颗粒清除羟基自由基的能力。

Figure 2-4. Dopamine melanin nanoparticles as free radical scavengers, a) Free radical inhibition of dopamine melanin nanoparticles, b) The ability of dopamine melanin nanoparticles to scavenge peroxynitrite free radicals, c) Inhibition of superoxide by dopamine melanin nanoparticles, d) The ability of dopamine melanin nanoparticles to scavenge hydroxyl radicals.

  1. 5讨论

本章以将巴胺盐酸盐溶解在乙醇/水混合溶液中,并加入到溶液中作为 催化剂的氢氧化铵。在露天反应24小时后,通过离心收集产物,得到多巴 胺-黑色素(DM)纳米颗粒,通过一系列材料表征检测,如TEM、SEM、 FTIR、1HNMR、Zata电位以及DLS实验表征了我们合成的DM纳米颗粒 特征。稳定的的结构是DM纳米颗粒应用的基础,同时只有纳米颗粒保持 在合适的粒径范围才有利于DM纳米颗粒通过细胞膜进入细胞。实验结果 显示,合成的DM纳米颗粒结构规则,大小均匀、分散性稳定性良好,电 位稳定,这些表征都有利于软骨细胞对其的摄取要求;傅里叶红外光谱、 Zeta电位以及核磁共振氢谱检测均说明该DM纳米颗粒已合成成功。动态 光散射(DLS)发现纳米颗粒的流体动力学尺寸为230nm (图3a)。纳米 颗粒在要细胞内或者机体内稳定存在,其所带电荷也起着重要的作用。Zeta 电位分析显示纳米颗粒的表面带负电为-13.5mV (图3b),表明该纳米颗粒 在溶液中能够稳定的存在;自由基,是指化合物在外界条件下共价键发生 断裂而形成的没有配对的单个裸露电子的原子或者基团因为其存在未配 对的电子,自由基性质非常的活跃,因此在许多生化反应中,自由基是以 中间体的形式存在,虽然它的浓度很低,存留时间很短,但在化学反应中 作用非常重要。在人体中,阳光辐射、吸烟、空气污染、农药等外部条件 的刺激都会使机体产生、积累更多活性自由基,使细胞膜通透性降低,蛋 白质三维构象改变和核酸突变,这是细胞衰老和失活的根源[7]。如心脏病、 帕金森病、老年痴呆症和肿瘤等众多疾病都与自由基异常有关。自由基也 是0A发展的重要原因[8]。自由基检测实验通过氢氧自由基检测、超氧化物 检测、DPPT检测、一氧化氮检测和过氧亚硝基检测这五个方面的自由基, 实验结果表明DM纳米颗粒具有显著的清除各种自由基的能力。为其进一

步在0A上的应用提供了基础和保证。

参考文献

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第三章多巴胺-黑色素纳米颗粒对IL-1 0介导的软骨细胞的抗炎作用

3.1 前g

0A是世界上中老年人中最常见的骨关节疾病,发生率约为3%,随着 人口老年化的加剧,发病率还在逐步攀升[1]。研究表明65岁以上的人群中 0A的发病率高于50%,随着年龄增长,这个数值还在升高。0A是由多种 因素包括遗传因素、生物化学因素、和机械力学等综合作用导致骨关节代 谢失衡,以及ECM合成及分解平衡被打破,进而引起软骨变性及退化,关 节软骨纤维增生,软骨下骨骨小梁的结构和骨密度的改变。在细胞生理学 上角度上,炎症的激活是OA的重要特征。由于软骨组织处于慢性炎症持 续损害的微环境中和关节组织结构和功能进行性改变,导致病理改变不断 恶化,晚期OA会累及滑膜组织,半月板及韧带。造成包括关节软骨损伤、 半月板磨损撕裂、韧带松弛、骨赘形成和软骨下骨骨质流失等多方面的损 伤,OA患者,持续的关节疼痛,失去日常生活能力和运动能力[2]。OA的 炎症的表达与年龄有很大相关性,高龄的OA患者炎症的水平显著高于低 龄患者,除年龄以外,OA患者中炎症因子的表达与肥胖、遗传和损伤等多 种因素有关[3],但是现在具体机制还不明确。

目前研究表明软骨退化在OA的发病中起重要作用。软骨的退化是OA 主要的标志之一[4],细胞外基质的遗失作为软骨退化的重要特种,目前被报 道与OA患者中炎症因子的表达显著升高有关。研究表明OA患者炎症水平 与关节软骨退化呈正相关;另外有报道称通过抗炎药物了抑制关节的慢性 炎症,关节软骨的退化也跟着降低,OA的临床评分也相应的降低了[3]

以前的研究在OA时,软骨下骨的病理改变和结构改变常常被认为是 次要的,但是最近研究发现,在OA患者中软骨下骨炎症因子的表达也是 上升的,抗炎药物控制住OA患者炎症以后软骨下骨病理性改变也得到了 抑制。另外膝关节软骨下骨的结构改变能触发0A炎症因子的分泌和加重 关节面软骨的损伤进一步研究发现软骨下骨的骨质改变是引起关节面的 硬化和关节内骨赘形成的重要原因[6]。因此,毫无疑问软骨下骨改变是0A 发病的又一重要原因,是0A治疗和预后评判重要考察指标。

目前0A研究中,钙离子对0A的病理进展起重要作用[7]。作为细胞信 使在软骨细胞传递外界刺激信号,钙信号传导机制已成为软骨细胞机械传 导研究的热点[8]。大量的文献表明钙通道的激活加剧有慢性炎症,0A炎症 水平与钙离子浓度呈正相关。这些新的研究都有助于帮助大家认识0A的 机制。

以前0A的治疗主要分为保守药物治疗和手术疗法。保守药物治疗包 括全身用药和关节腔局部用药。早期0A患者,可对症给予口服消炎镇痛 药或活血化瘀的保守治疗,以达到改善症状、提高生活质量的目的[9]

现在0A的治疗已经从以保守药物治疗和手术疗法为主转向预防0A 发病为主,以降低0A患病风险和降低患病率为目标。肥胖是0A发病最重 要的危险因素之一,因此减肥是最重要的预防0A患病风险的措施之一, 所以适当的运动和合理膳食是0A预防管理很重要方式。适当的运动量应 该是0A患者核心干涉措施之一,要加强0A患者日常生活约束和自我体重 管理。在目前的临床防治指南中适量的运动被普遍推荐,具体的实施则需 要根据每个0A患者的具体情况进行个体评估后给予个体化建议。

现在世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的0A防 治指南中非类固醇类抗炎药物(NSAIDs)作为一线治疗膝0A的药物。但 是由于NSAIDs能大幅度抑制前列腺素(PG)的生成,因此,同时也抑制了 Cox-l的生成进而限制了其对细胞的保护作用⑽11]。大量研究表明NSAIDs 对胃肠消化系统具有巨大的副作用,根据WHO报道,每年NSAIDs引起的 并发症的发生率为约为2% - 4%,其中所造成的胃肠道并发症包括胃肠道出 血、穿孔和其它胃肠道损伤是正常人群的3倍,尤其在老年人群中。氨基
葡萄糖也是临床0A治疗的常用药物,且具有很好的安全性和较少的副作 用[12]。但是0A的临床治疗的循证医学分析来看,氨基葡萄糖长期治疗效 果和预后并没有明显改善,其对0A的防治效果并没有得到循证医学结果 的肯定。有报道称深海鱼油以其良好的生物相容性和免疫调节性能是治疗 0A的理想用药。但是研究发现它也并不能缓解0A的进展。除了止痛,合 理的生活管理(包括适当运动和体重管理)对0A的治疗也尤为重要[13]

双膦酸盐是目前常用的破骨细胞(Osteoclast,0C)的抑制剂,现在在 临床0A的治疗上也得到了相当的应用[14],它能够显著减少患者软骨下骨 骨量的丢失,但是临床疗效有待进一步循证医学的验证。随着0A的进一 步发展和恶化,临床各种保守治疗手段的疗效都得到了限制,手术干预成 为晚期0A的首选治疗方式,手术治疗方式包括是关节镜、关节置换术等。 但是手术方式只能暂时缓解症状,不能从根本上治愈0A。对于严重0A应 考虑行关节置换手,但是由于关节置换术彻底破坏自然关节结构,对整个 关节稳定性造成破坏,关节周围附件如(肌腱、韧带,肌肉等附件)均被 彻底破坏,另外关节置换术受到医务人员经验、手术方式、手术操作和患 者体质等多种因素的影响,而且具有感染的风险。这些因素大大限制了关 节置换术在临床上的应用。

因此目前0A的治疗缺乏真正安全可靠的方式,而随着社会老年化的 增加,0A的发病率越来越高,这就急切的需要有新的可靠治疗方案应对这 一严峻形势。今年来纳米材料发展迅速,本实验应用多巴胺与黑色素这一 体内存在的天然化合物,利用其优异的抗氧化应、生物相容性和安全性合 成DM纳米颗粒,将该纳米颗粒应用于0A的治疗上,为治疗0A提供了 一条新的思路。

  1. 2仪器和材料

上海舍岩仪器有限公司 Thermo Scientific 公司,美国酶标仪

微量分光光度计 低温高速离心机 超声波清洗机 蛋白电泳转膜仪 共聚焦显微镜 电热恒温水浴箱 电子天平 流式细胞仪 美国II型电泳仪 美国制胶板 实时定量荧光PCR仪 细胞培养瓶、培养板 离心管

细针头式滤器 移液器

移液器枪头枪头 PVDF 膜

全自动细胞计数仪TC 20 去离子水 胎牛血清

二甲基亚砜(DMSO) 青一链霉素 浓盐酸 三氯化铁 氯化钠(NaCl)

Molecular Devices,美国 Thermo Scientific 公司,美国 Frontier™ 5000Multi,德国 无锡鼎实电子科技有限公司 Bio-Rad Laboratories,美国 Molecular Devices 公司,美国 上海启前电子科技有限公司 Mettler Toledo 公司,瑞士 Thermo Scientific 公司 Bio-Rad Laboratories, Bio-Rad Laboratories,美国 Bio-Rad Laboratories,美国 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 Millipore公司,美国 Bio-Rad Laboratories,美国 S igma-Aldrich 公司,美国 S igma-Aldrich 公司,美国 Sigma-Aldrich 公司,美国 Invitrogen公司,美国 无锡新龙科技有限公司 成都锦泰化工有限公司 北京浩克科技有限公司

氯仿 异丙醇 戊巴比妥钠

Moloney MLV反转录试剂盒

TRIzol试剂

PCR引物

NO ELISA试剂盒

PGE2 ELISA试剂盒

实时定量荧光定量PCR试剂盒

总RNA提取试剂盒

人重组IL-lp

高糖DMEM培养基

舟山顺迎石油化工有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 S igma-Aldrich 公司,美国 Promega公司,美国 Invitrogen公司,美国 上海生工公司合成 R&D Systems公司,英国 R&D Systems公司,英国 Biotium公司,美国 杭州浩基生物科技有限公司

S igma-Aldrich 公司,美国 Invitrogen公司,美国

 

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐Sigma-Aldrich公司,美国 PBS                                        Sigma-Aldrich 公司,美国

II型胶原酶                                             Sigma-Aldrich公司,美国

0.25%胰蛋白酶(含 0.02%EDTA)         Sigma-Aldrich 公司,美国

  1. 3实验方法
  2. 3. 1 SD大鼠关节软骨细胞的提取和培养

该研究经广西医科大学动物实验中心动物伦理委员会的批准,3日龄大 的SD大鼠由广西医科大学动物实验中心获取。将SD大鼠整个置于75%酒 精中,两分钟后取出置于无菌手术铺巾,将大鼠膝关节部位充分碘伏消毒 后,用剪刀剪开关节附近皮肤,暴露膝关节,截取大鼠膝关节置于青链霉 素溶液中,然后移至超净台,用剪刀仔细分离关节周围肌肉、韧带组织, 得到较单一的膝关节软骨,小心剪下透明状的软骨部分,把关节组织置于 浓度为l〇〇U/mL青一链霉素溶液浸泡5分钟,接着用眼科剪将关节软骨剪 成尽可能小的软骨小块,将软骨小丁置于0.25%的胰蛋白酶消化30分钟后, 弃上清液,加入0.2%的二型胶原酶消化3小时,加入适量完全培养基中止 消化,置于离心机中以1000转/min的速率离心5分钟,弃去上清液,用完 全培养基充分重悬细胞团,将含有软骨细胞的上清液接种于直径10厘米培 养皿中,调整培养皿中完全培养基的量至12毫升左右,培养皿置于在5% 二氧化碳的37度恒温培养箱内培养。3天后更换培养基,5天以后进行细 胞传代。通过甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色、流式细胞学检测以及qRT-PCR 检测测定软骨细胞的特异性相关基因(比如Collagen II、SOX9和ACAN), 证明所获取的为软骨细胞。原代软骨细胞以后待软骨细胞铺满培养皿底部 约90%,用0.25%的胰蛋白酶消化细胞5分钟,按1:3比例进行细胞传代 培养,每个培养皿10毫升完全培养基。传到的第二代的软骨细胞用于进一 步的实验研究。

  1. 2 MTT筛选DM纳米颗粒对软骨细胞的最适浓度

在无菌条件下,取正常生长的二代SD大鼠软骨细胞均匀接种于96孔 板中,接种密度为每孔5000个细胞,37°C培养24小时后,加入10种不同 浓度的DM纳米颗粒(范围从0到180 (ig/mL)。24小时后向板的每个孔 中加入20微升5mg/mLMTT,并在黑暗中于37°C温育4小时。去除上清 液后,加入200|iL DMSO以溶解甲product产物。使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific,USA)在570nm测定溶液的吸光度。选择最有利于细胞生长的 ART的最佳剂量。平板振荡15分钟后,使用酶标仪在570nm测定溶液的 吸光度。处测吸光度的OD值。根据OD值软骨细胞的细胞活性。

  1. 3大鼠软骨细胞0A模型的建立及验证

将SD大鼠软骨细胞按密度为lxl〇5/孔接种在6孔细胞培养板中,待软 骨细胞长满板底约三分之一左右,吸出培养基。在三孔中分别加入浓度为 10ng/mL的IL-ip,另三孔加入普通的完全培养基,孵育24小时,然后收 集细胞及上清液,细胞用于提取RNA,做qRT-PCR检测软骨细胞内的

MMP-1,MMP-7, MMP-13基因表达,上清液用于ELISA检测,测量细胞 上清中 MMP-1,MMP-7,MMP-13 含量。

  1. 3. 4多巴胺-黑色素纳米颗粒处理SD大鼠软骨细胞

SD大鼠软骨细胞按密度1*105每孔接种到6孔细胞培养板中。待细胞 长满板底约三分之一左右,吸出所有培养基。三个孔(A,B,C)加入普通的 完全培养基;在一^个孔中分别加入浓度为10 |ig/niL的多巴胺-權黑素纳米颗 粒溶液(D);在一个孔中分别加入浓度为30 (ig/mL的多巴胺-褪黑素纳米颗 粒溶液(E);在一个孔中分别加入浓度为60 (ig/mL的多巴胺-褪黑素纳米颗 粒溶液(F)。在37°C培养两个小时后,吸出所有培养基,在A、B两孔中加入 普通的完全培养基,在C、D、E和F孔加入10ng/mL的IL-lp溶液,培养 板置于在37°C培养24个小时.然后收集软骨细胞,提取总RNA用于 qRT-PCR 检测,测量 IL-lp,IL-6, TNF-a,MMP-13, COX-2, iNOS 的基因表 达,提取总蛋白,用WB法检测细胞IL-ip,IL-6,TNF-a,MMP-13,COX-2, iNOS的蛋白表达。

  1. 3. 5活死细胞染色检测细胞活性

将lxl〇5个二代软骨细胞接种在24孔板中的载玻片上面,接受以上干 预后。吸出培养基,在用PBS洗涤三次后,将软骨细胞与l(iM钙黄绿素和 l(iM PI避光37°C孵育5 min。用PBS快速冲洗掉载玻片的残余染料后,通 过激光扫描共聚焦显微镜观测,获得活死细胞的图像。

3.3.6 GAG测定检测软骨细胞内的糖胺多糖

将lxl〇6个二代软骨细胞接种在六孔板中,并用IL-ip和/或DM纳米颗 粒处理24小时。用蛋白酶K收获用ART处理的软骨细胞用于消化。酶水 解产物用于随后的生化测定,如前所述。通过使用Hoechst 33258 (Sigma) 方法测定DNA含量,并使用荧光分光光度计在360 (激发)和460nm (发 射)下检测,以小牛胸腺DNA为标准。细胞内糖胺多糖(GAG)的分泌通 过1,9-二甲基亚甲基蓝(DMMB; Sigma)测定。用硫酸软骨素(Sigma)

作为标准,在525nm处检测每个样品中分泌的总细胞内GAG。最后,将 GAG的含量标准化为软骨细胞中的总DNA含量。

3.3. 7 qRT-PCR检测软骨细胞内炎症基因表达

将lxl〇6个二代软骨细胞接种在六孔板中,接受以上干预后。吸出培养 基,再用PBS洗去残余的培养基后,应用TRIzol方法,根据杭州浩基生物 科技有限公司总RNA提取试剂盒产品说明书操作步骤提取总RNA。具体 如下:1)用胰蛋白酶消化收集将六孔板中的软骨细胞悬液置于1.5ml离心管 中,加入lml TRIzol溶液充分振荡,再加入0.2ml氯仿。2)盖上离心管 盖子,充分振荡,在冰上孵育5分钟。室温下,12000 rmp离心十分钟。加 入0.2 ml氯仿,振荡15秒,静置2分钟,4 °C、12000 rmp尚心15分钟 弃去上清液。3)加入异丙醇0.5ml,将1.5ml离心管中液体用小心吹打混匀, 室温静置10分钟。再次4°C、12000rmp离心10分钟,弃掉上清液。4) 加入75%乙醇lml,小心洗涤沉淀。再次4°C、7500rmp离心5分钟,弃 掉上清液。5)晾干沉淀物,加入30ul的DEPC水溶解(65°C促溶15分 钟)其后用分光光度计检测样品的含量及纯度。

接下来进行DNA的逆转录。具体过程如下:使用Moloney MLV反转 录试剂盒,按照产品操作说明书进行逆转录。1)在200微升RNase-firee 的离心管中混合下列成分:600微克TotalRNA; 1微升Oilgo(dT)18; 1 微升dNTPs(lOmM);加入DEPC水至15微升,加热至70°C,五分钟变性 反应,迅速置于冰上。2)然后依次加入下列试剂:4微升First-strand Buffer; 2 微升 O.lmol/IDTT; 25 个单位RNase inhibitor; 250 个单位 Superscript TM RTase.混合上述成分,离心lmin,42°C孵育lh,负20°C长期保存。

接下来进行实时定量PCR操作:

实时定量荧光PCR操作:1)荧光定量PCR引物设计和合成,采用 Primer Premier 6.0软件进行引物的设计,然后由华大基因公司负责合成,引 物序列见表3-1。以GAPDH作为内参。GAPDH      5,- AGGGCCCTGAC AACTCTTTT-3,  5,- AGGGGTCTAC ATGGC AACTG-3,

 

Table 3-1, RNA primer sequences

qRT-PCR扩增体系和反应条件:反应体系(25微升):双真水10.5微 升;SYBR Premix TaqTM 10.5 微升;PCR-F( 10uM) 0.5 微升;PCR-R( 10uM) 0.5微升;模板cDNAl微升;反应条件:95°C,1分钟;45个循环:95°C, 10秒;62°C,25秒(收集荧光);熔点曲线分析55°C至95°C。

3.2. 6 WB检测软骨细胞内炎症蛋白的表达

将lxl〇6个二代软骨细胞接种在六孔板中,接受以上干预后。吸出培养 基,再用PBS洗去残余的培养基后,每孔中加入lOOulRIPA裂解液,lul PMSF,移液枪反复吹打使细胞充分裂解;将裂解液转移至1.5ulEP管中, 将EP管置于冰上孵育3小时后,12000rpm低温离心15min,弃沉淀收集上 清液,接着用BCA法测定所得蛋白浓度,每80ul添加20ul上样缓冲液, 水浴蛋白煮沸5min,煮好的蛋白置于液氮保存。

WB操作:1.配胶:准备干净的玻璃板,固定于灌胶架。10%分离胶 配制:2.3 毫升双蒸水,2ul30〇/〇Acr/Bis,1.56ml Tris-HCL (PH 值为 8.8), 60ull0%SDS,60ull0%APS,2.4ulTEMED;5%浓缩胶配制2.1ml双蒸 水,0.495 ml 30〇/Acr/Bis,0.375ml Tris-HCL (PH 值为 6.8),30ul 10〇/〇 SDS, 30ull0%APS,3ulTEMED;将上述方法配制的分离胶混匀后,缓慢贴壁注入 在两玻璃板间隙中,当液面距离玻璃板上缘约2 cm时停止注入,在液体表 面均勾加入lml双蒸水,室温放置约15min,分离胶完全凝固后倒掉上层的 双蒸水。将配置好的5%浓缩胶注入玻璃板之间,紧接着插入干净的梳子, 等待30min待浓缩胶凝固;2.电泳:根据前面提取的蛋白浓度,每个样品孔 上样50ug蛋白,两端加入2ul marker;浓缩胶在80 V恒压条件下电泳,直 到电泳条带至底部。3.转膜:电泳以后的凝胶根据目的蛋白的分子量大小进 行切胶、裁剪对应大小的PVDF膜,将凝胶和PVDF膜以合适的松紧度置 于卡夹中,对应电极颜色将卡夹插入转模槽,在低温150 mA恒流条件下转 膜150 min; 4.封闭:转膜结束后,小心取出PVDF膜,将蛋白面朝上置于 洗膜槽,以丁68丁充分冲洗3><5111丨11,封闭液室温封闭211,再以丁68丁充分 冲洗3x5 min; 5.杂交:将封闭后的PVDF膜置于事先准备好的合适浓度的 一抗中4 °C条件下孵育过夜;再以TBST充分冲洗3x5 min;将PVDF膜置 于二抗溶液室温孵育lh,再以TBST充分冲洗3x5 min; 6.显影反应:在避 光环境中,按等比例配置ECL试剂,室温放置3 min;吸干多余液体的PVDF 膜蛋白面朝上,均匀滴加ECL试剂,覆盖保鲜膜,避光室温反应5 min; 将感光胶片置于保鲜膜上,适当调整曝光条件;曝光完成后,将感光胶片 置于显影液中显影10s到30s,TBST冲洗后放入定影液中10 min,蒸馏水 冲洗,室温下阴干;7.扫描及条带分析:扫描仪扫描胶片,应用Image J软 件分析条带光密度,参照目的蛋白条带与内参(P-Actin)的光密度值,计 算各目的蛋白的相对含量。

将这个过程重复3次。之后,用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞,并 通过1.5毫升离心收集。通过使用10(iLAnnexin V-EGFP (增强型绿色荧光 蛋白)和5uL碘化丙啶(PI)在黑暗中孵育前面收集的悬浮的软骨细胞20 分钟。使用流式细胞仪测试制备的样品。

  1. 4结果
  2. 1 DM纳米颗粒对软骨细胞的最适浓度

为了探讨DM纳米颗粒对OA的影响,我们首先使用IL-ip作用于软骨 细胞,构建OA细胞模型,IL-ip是触发OA的关键炎性细胞因子。使用MTT 检测评估DM纳米颗粒的细胞毒性,并确定DM纳米颗粒多用于软骨细胞 的最佳浓度以更好地改善体外OA软骨细胞的生长增殖。用不同浓度的DM 纳米颗粒(0至180(ig/mL)处理IL-ip处理的OA软骨细胞。如图3-1所示, 与对照(仅IL-ip)相比,10|ig/ mL,30|ig/ mL和60|ig/ mL浓度的处理分别

显着增加细胞生长(p<0.05)。尤其是30(ig/mL的浓度,其显示出由IL-ip 介导的0A软骨细胞中最高的增殖活性。基于这些结果,将10(ig/mL,30(ig/ mL和60|ig/mL这三种浓度作为DM纳米颗粒最适浓度用于进一步研究。

  1. 2 DM纳米颗粒对软骨细胞的细胞活性的影响

为了确定DM纳米颗粒对0A软骨细胞活力的影响,用三种浓度的DM 纳米颗粒作用于IL-ip介导0A软骨细胞,并通过FDA/PI染色观察活/死细 胞。如图3-2所示,显示IL-ip作用的软骨细胞相对于正常的软骨细胞死细 胞显著增加,活细胞大量减少。然而,DM纳米颗粒处理可显著增加软骨细 胞活力,证据表明DM纳米颗粒组中存在的活细胞比IL-ip组的更多,特别 是30(ig/mL组的软骨细胞,具有更高的活细胞和更少的死细胞。该结果表 明DM纳米颗粒有效保护软骨细胞免受IL-ip侵蚀。

3.4.3 DM纳米颗粒软骨细胞凋亡的影响。为了研究DM纳米颗粒对0A中软骨细胞凋亡的影响,通过流式细胞 术评估凋亡细胞占整体细胞的比例。在正常的软骨细胞中凋亡率仅为 2.98%,IL-ip明显的提高软骨细胞凋亡率,当用IL-ip刺激软骨细胞时,凋 亡细胞的百分比增加至25.35%。然而,10.3(ig/ml,30(ig/ml和60(ig/ml 三种浓度的DM纳米颗粒处理显着减弱了这种增加,凋亡率分别从IL-ip组 的25.35%下降到8.99%,5.68%和10.56% (图3-3)。这些结果表明DM 纳米颗粒可能对IL-ip介导的软骨细胞凋亡具有保护能力。

图3-3: DM纳米颗粒抑制IL-1 P诱导的软骨细胞凋亡。U)流式细胞检测细胞凋亡(b)流失细胞

学检测凋亡的结果的量化分析。

Figure 3-3: DM nanoparticles inhibit IL-ip-induced chondrocyte apoptosis, (a) Flow cytometric detection
of apoptosis (b) Loss cytology A quantitative analysis of the results of apoptosis detection.

  1. 3 DM纳米颗粒对软骨细胞GAG含量的影响

在软骨发育过程中,GAG在软骨基质的完整性中起着必要的作用。已 经证明,软骨中GAG的丧失是早期0A发作的特征。为了评估DM纳米颗粒对由IL-lp引起的软骨细胞中GAG损失的影响,在用IL-ip或纳米颗粒处 理24小时后,通过DMMB测定法检测软骨细胞中GAG的合成和分泌。通 过GAG/DNA的比例表示GAG分泌水平,其中GAG含量通过DNA含量 标准化。如图3-4所示,IL-ip诱导软骨细胞中GAG的显着损失高达58.3%。 然而,与对照组(单独的IL-lp处理)相比,DM纳米颗粒处理组中GAG 分泌显著增加。在三个DM纳米颗粒处理组中,30ug/ml的DM纳米颗粒 的浓度显示出最高水平的GAG产生。数据显示DM纳米颗粒可抑制IL-ip 诱导的0A细胞内GAG丢失,促进GAG分泌。

  1. 5讨论

〇A以糖胺多糖进行性损耗做为病理特征。关节软骨主要由细胞外基 质(ECM)和软骨细胞组成,软骨细胞是软骨中唯一的细胞,软骨细胞合 成分泌ECM和胶原纤维,细胞外基质是软骨细胞增殖和代谢的场所,和细 胞生长因子一起构成软骨细胞的外环境[15]。软骨细胞分泌的细胞外的基质 主要分为3类:胶原蛋白、蛋白多糖和结构糖蛋白。关节软骨主要为透明
软骨,其中主要含有5种不同形态的胶原,而其基质中含量最多的是II型 月父原[16]。蛋白多糖主要由核心蛋白构成。核心蛋白被大量的GAG链围绕, GAG占蛋白聚糖含量的80%至90%之间,GAG的含量可以在一定程度 上反映蛋白聚糖的总体的代谢情况,糖胺多糖进行性遗失是软骨退变的重 要原因[17]。最近研究表明OA严重程度和细胞凋亡数量之间存在显著的相 关性[18]。正如图4b所示,OA组GAG的含量最低,仅为正常细胞的41.7%, DM纳米颗粒的治疗挽救了 IL-ip介导的GAG的遗失。GAG含量的减少导 致软骨细胞外环境的变化,加剧了软骨细胞的代谢异常,使GAG的分泌进 一步减少。同时软骨细胞的代谢异常和凋亡因子的分泌增加也是细胞内基 质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP )家族如 MMP-l,MMP-3 和 MMP-13的表达显著增加。在软骨细胞内MMPs是炎症因子(IL-ip,IL-6 和TNF-a等)重要的触发因素,导致炎症因子表达急剧上升。

OA中软骨细胞的凋亡与OA软骨退化过程和严重程度是相对应的。有 研究发现正常关节软骨也可发生细胞凋亡,但是它主要发生在软骨组织的 的表层,并且发生率不高炎症程度较低,而OA关节软骨的凋亡主要发生 于软骨表层和中层。也有研究表明,OA软骨的深层也可能有凋亡发生,这 是可能是由于OA软骨浅层出现纤维化,所以Fas在软骨深层表达的缘故。 如图3所示,DM纳米颗粒显著降低了细胞凋亡率。说明DM纳米颗粒对 OA软骨细胞具有极大保护作用。 参考文献

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第四章多巴胺-黑色素纳米颗粒对IL-1 0介导的软骨细胞
的氧自由基与自卩筮的影响,以及两者之间的关系

4.1前言

0A是一种常见的慢性退行性疾病,呈现进行性改变,后期导致关节功 能受损,呈显_度的年龄相关性。0S (氧化应激)是指机体受到有害刺激 时而产生过多的自由基(包括活性氧或活性氮),超过了机体自身的抗氧 化能力,机体防御功能对对自由基的清除能力不足,导致体内软骨组织内 大量ROS或RNS聚集,破坏了机体原有的氧化/抗氧化的平衡,0A中0S 则导致关节内局部病变和滑膜慢性炎症,影响关节软骨细胞合成代谢,使 软骨ECM减少,导致软骨进展性退化,最终导致了 0A的发病和病程进展。 氧化应激即自由基直接或间接破坏关节软骨细胞和软骨细胞ECM (主要成 分是二型胶原和蛋白聚糖),其中自由基对软骨细胞氨基酸的氧化修饰、 硝化、亚硝基化和氯化都可破坏蛋白质三维结构W,从而影响其生物功能, 甚至导致DNA变形解链直接导致细胞死亡,影响软骨细胞新陈代谢,导致 软骨细胞衰老或凋亡[2]

自噬细胞抵御外部伤害刺激,维持细胞稳态的重要过程。在0S条件下, 自噬能控制细胞稳态,减少氧化损伤。前期研究发现,自噬可能是通过降 低细胞内自由基水平间接减少细胞、细胞器和蛋白损伤从而起到抗氧化抗 凋亡的作用[3]。报道称,FOXO蛋白作为一种转录因子,能显著激活自噬相 关基因如LC3、Beclinl和ATG7基因以促进自噬[4]。Akasak等研究表明, 下调细胞内FOXO转录因子表达将会提高ROS水平促进0S,导致软骨细 胞衰老、调亡,研究表明这个过程可能与抗氧化相关酶(MDA,CAT和 GSH)和自噬相关蛋白(LC3、Beclinl和ATG7)减少有关[5]。同时有文献 报道,抗氧化细胞保护机制与一系列转录因子如核因子E2相关因子2(Nrf2)的上调有关,Nrf2调控细胞抗氧化物酶(MDA,CAT和GSH),使细胞抗 氧化能力增强,能清除更多的自由基[6,7]。此外有大量文献证实,自噬对慢 性炎症具有优异的抑制作用,这一抗炎效应也在0A大鼠上面得到了验证, 0A软骨细胞转染AGT7基因的慢病毒后,细胞内自噬会被激活,0A中的 炎症因子表达也出现了相对应的显著降低了[8]

鉴于0S在0A的病理进展中的关键作用和自噬激活对0S的抑制作用, 本论文采用具有激活自噬能力的多巴胺修饰到具有强烈抗氧化作用的黑色 素上面,构建了 DM纳米颗粒,进一步将其用于0A的治疗,探讨深入0S 和自噬在DM纳米颗粒治疗0A中的机制。

  1. 2仪器和材料

细针头式滤器 移液器

移液器枪头枪头 PVDF 膜 ROS试剂盒 RNS试剂盒

全自动细胞计数仪TC 20 去离子水 胎牛血清

二甲基亚砜(DMSO)

青一链霉素 浓盐酸 三氯化铁 氯化钠(NaCl)

二甲苯 氯仿 异丙醇 戊巴比妥钠

Moloney MLV反转录试剂盒 TRIzol试剂 PCR引物 NO ELISA试剂盒 PGE2 ELISA试剂盒 实时定量荧光定量PCR试剂盒 总RNA提取试剂盒 人重组IL-lp 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 Millipore公司,美国 R&D Systems公司,英国 R&D Systems公司,英国 Bio-Rad Laboratories,美国 S igma-Aldrich 公司,美国 S igma-Aldrich 公司,美国 S igma-Aldrich 公司,美国 Invitrogen公司,美国 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 S igma-Aldrich 公司,美国 Promega公司,美国 Invitrogen公司,美国 上海生工公司合成 R&D Systems公司,英国 R&D Systems公司,英国 Biotium公司,美国 杭州浩基生物科技有限公司 S igma-Aldrich 公司,美国

 

高糖DMEM培养基 四甲基偶氮唑蓝(MTT)

PBS

II型胶原酶

0.25%胰蛋白酶(含 0.02%EDTA)

  1. 3方法
  2. 1流式细胞学检测软骨细细胞内R0S水平

SD大鼠软骨细胞按密度lx 1〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。待细胞 长满板底约三分之一左右,吸出所有培养基。三个孔(A,B,C)加入普通的 完全培养基;在一^个孔中分别加入浓度为10 |ig/niL的多巴胺-裡黑素纳米颗 粒溶液(D);在一个孔中分别加入浓度为30 (ig/mL的多巴胺-褪黑素纳米颗 粒溶液(E);在一个孔中分别加入浓度为60 (ig/mL的多巴胺-褪黑素纳米颗 粒溶液(F)。在37°C培养两个小时后,吸出所有培养基,在A、B两孔中加入 普通的完全培养基,在C、D、E和F孔加入10ng/mL的IL-lp溶液,培养 板置于在37°C培养24个小时之后,去掉培养基加入10uM的荧光探针 DCFH-DA,(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate)避光孵育 30 分钟, 去掉培养基后PBS清洗三遍,用无EDTA的胰酶消化细胞,离心PBS重悬 后用流式细胞仪检测。激发波长是500nm,接收波长是525nm。

  1. 2氧自由基试剂盒检测软骨细细胞内R0S水平

重复上述步骤,得到转载了荧光探针DCFH-DA的软骨细胞,将离心 PBS重悬后加入24孔板,用分光光度计检测荧光强度。激发波长是500nm, 接收波长是525nm。所有操作被重复3次。

  • 3 MDACATGSH试剂盒检测软骨细细胞内抗氧化酶

SD大鼠软骨细胞按密度lx 1〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。按上述 分组干预,24小时后分别收集软骨细胞和培养液,按照南京建成生物工程 研究所有限公司MDA、CAT和GSH试剂盒说明书进行操作处理,最后用分光光度计检测光密度(0D值),每个样品重复三次。

  1. 4 qRT-PCR检测软骨细胞内自噬基因表达

SD大鼠软骨细胞按密度lx 1〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。按上述 分组干预,24小时后分别收集软骨细胞,提取总RNA、逆转录、实时定量 PCR操作和条件如3.3.5描述。以GAPDH作为内参。所有操作被重复三遍。 引物表如表4-1所示:

Gene name  Forward primer               Reverse primer

GAPDH     5,- AGGGCCCTG AC A ACTCTTTT-3,          5,- AGGGGTCTAC ATGGC AACTG-3,

LC3        5 ’-GACGTCACCGGGCGAGTTA-3,             5 ’-GCTGTACCTCCTTACAGCGG-3 ’

Beclin-1     5,-TCCGGGCTCCCGAGG-3 ’                  5,-GGGGGATGAATCTGCGAGAG-3,

ATG7       5,-TGGTTACAAGCTTGGCTGCT-3,             5,-TCAAGAACCTGGTGAGGCAC-3,

表4-1: RNA引物序列
Table 4-1: RNA primer sequences

  • 5 WB检测软骨细胞内自噬相关蛋白表达

SD大鼠软骨细胞按密度lxl〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。按上述 分组干预,24小时后分别收集软骨细胞,提取蛋白、电泳、电转、封闭、显 影如3.3.6所描述。以GAPDH作为内参。所有操作被重复三遍。

  1. 6透射电镜观测自噬小体的形成

SD大鼠软骨细胞按密度lxl〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。按上述 分组干预,24小时后分别收集软骨细胞。将细胞离心收集,取上清液,得 到的集聚在管底的细胞用2.5%体积分数的戊二醛固定24小时,吸出上清 液,PBS清洗三次,用1% (v/v)四氧化锇固定2小时,以稳定细胞的细 胞器和磷脂膜。接着用浓度梯度的酒精(30%,50%,75%,90%,99%, 100%)将细胞分别脱水15分钟,再用PBS洗涤三次后包埋在树脂中。从 包埋于树脂的软骨细胞切成薄片,并在2°C下用2%乙酸双氧铀水溶液在黑 暗中染色1小时。得到的切片于TEM下观测拍摄。

  1. 6 RT-PCR检测自噬抑制剂干预的软骨细胞炎症基因表达

SD大鼠软骨细胞按密度lxl〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。待细胞 长满板底约三分之一左右,吸出所有培养基。两个孔加入普通的完全培养 基;在两个孔中分别加入浓度为30 (ig/mL的DM纳米颗粒溶液;在两个孔 中分别加入浓度为30(ig/mLDM纳米颗粒与5nM氯喹混合液。在37°C培 养两个小时后,吸出所有培养基,加入10ng/mL的IL-ip溶液,培养板置于 在37°C培养24个小时之后,提取总RNA、逆转录、实时定量PCR操作和 条件如3.3.5描述。以GAPDH作为内参,检测IL-lp, IL-6和TNF-a的基因 表达。所有操作被重复三遍。

  1. 7自臨与氧自由基特异焚光染色检测不同时间点软骨细胞的自嗤与氧 化应激水平。

SD大鼠软骨细胞按密度lxl〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。待细胞 长满板底约三分之一左右,吸出培养基,加入30 (ig/mL的DM纳米颗粒溶 液分别孵育〇小时,3小时,6小时,9小时,12小时,24小时。到时间后 吸出培养基,加入 5(iM 的 MitoSox Red,、5(iM 的 Cyto-ID Green Dye 和 5pg/ml的Hoechst 33342的混合液。避光孵育20分钟。共聚焦显微镜下观 测拍摄照片。

  1. 2. 6共聚焦显微镜检测DM纳米颗粒干预后软骨细胞内自噬和氧化应激的 变化

SD大鼠软骨细胞按密度lxl〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。待细胞 长满板底约三分之一左右,吸出所有培养基。两个孔加入普通的完全培养 基;在两个孔中分别加入浓度为30 (ig/mL的DM纳米颗粒溶液;在两个孔 中分别加入浓度为30(ig/mLDM纳米颗粒与5nM氯喹混合液。在37°C培 养两个小时后,吸出所有培养基,一个孔加入完全培养基,另外5个孔加入 10 ng/mL的IL-ip溶液,培养板置于在37°C培养箱24个小时之后,加入5pM 的 MitoSox Red,、5|iM 的 Cyto-ID Green Dye 和 5|ig/ml 的 Hoechst 33342 混合液。避光孵育20分钟。共聚焦显微镜下观测拍摄照片。

SD大鼠软骨细胞按密度lxl〇6每孔接种到6孔细胞培养板中。待细胞 长满板底约三分之一左右,吸出所有培养基。两个孔加入10ng/mL的IL-ip 溶液;在两个孔中分别加入浓度为30 (ig/mL的DM纳米颗粒与10 ng/mL 的IL-lp混合溶液;在两个孔中分别加入浓度为30(ig/mLDM纳米颗粒、10 ng/mL的IL-ip与5nM氯喹混合液。培养板置于在37°C培养箱,分别孵育 0小时,3小时,6小时,9小时,12小时,24小时。到时间后吸出培养基, 去掉培养基,PBS清洗三次,加入10uM的荧光探针DCFH-DA避光孵育 30分钟,去掉培养基后PBS清洗三遍,到转载了荧光探针DCFH-DA的软 骨细胞,将离心PBS重悬后加入24孔板,用分光光度计检测荧光强度。激 发波长是500nm,接收波长是525nm。所有操作被重复3次。

  1. 3结果
  2. 3. 1 DM纳米颗粒软骨细细胞内ROS水平的影响

通过流式细胞术研究DM纳米颗粒对IL-ip介导的软骨细胞内ROS产 生的影响。如图4-la,b所示,在IL-ip组中的软骨细胞中产生的ROS随着 处理时间的增加显著增加。然而,在DM+IL-lp组中,DM纳米颗粒的治疗 显着降低了 ROS产生(相对于IL-ip组)。特别是在24小时,ROS水平大 大减少,甚至接近正常细胞的水平。值得注意的是,当软骨细胞接受DM 纳米颗粒处理从0小时到3小时,ROS产生快速增加;从3小时到6小时 之后,细胞内的ROS水平相对缓慢的上升;6小时以后软骨细胞内ROS水 平呈现出下降趋势。这些结果表明DM纳米颗粒具有强大的清除细胞内 ROS的能力。

3. 2 DM纳米颗粒软骨细细胞内MDA、CAT和GSH的影响

我们检测到细胞内抗氧化酶CAT和GSH-Px。如图4-2所示,在IL-ip 组中,软骨细胞内CAT和GSH-Px表达水平被显著下调,而DM纳米颗粒 处理逆转细胞内CAT和GSH-Px的下调。特别是在30(ig/mL的DM纳米颗 粒处理组中软骨细胞内CAT和GSH-Px表达水平上调最为明显。MDA其是 在脂质过氧化过程中产生的化合物之一。如图5d所示,与正常细胞相比, IL-lp组中的MDA活性被显着激活(相对于正常组升高了 3.68倍),但在 DM纳米颗粒处理后被软骨细胞内MDA的表达被抑制。特别是在IL-1P+ 30组中,MDA水平被降低的最为明显,接近达到正常细胞的水平。这些 结果表明DM纳米颗粒作为有效的ROS清除剂通过减少细胞内过多的ROS, 降低氧化应激来保护软骨细胞免受氧化损伤。

^3 Normal

  • IL-1p
  • IL-1P+DM10 H IL-1P+DM30 口IL-1P+DM60

图4-2:分光光度计测定软骨细胞内CAT, GSH-Px, MDA的含量。

Figure 4-2: Spectrophotometer to determine the content of CAT, GSH-Px, MDA in

chondrocytes.

  1. 3. 3 DM纳米颗粒软骨细细胞内自噬基因表达的影响

自口筮作为0A发病机制中的保护过程已被证实,也表明增强的自B筮可 以减少细胞内ROS含量,从而保护软骨细胞。实时定量荧光PCR(qRT-PCR) 分析显示。与正常软骨细胞相比,IL-lp导致特异性自噬标记物包括LC3-II, ATG7和Beclin-1轻度增加。相比之下,DM纳米颗粒极大地提高了 IL-ip 预处理的软骨细胞中这些自噬标志物

在的表达(图4-3 )。当DM纳米颗粒浓度为30(ig/ml时,软骨细胞内LC3-II, ATG7和Bedin-1显示出最高的表达水平。Western印迹分析也证实了这一 点,发现在DM纳米颗粒处理后LC3, ATG7和Beclin-1蛋白水平显着增力口 (图4-4)。LC3- I向LC3-II的转化是自噬的一个起始步骤。值得注意的 是,DM纳米粒子促进了 0A软骨细胞中LC3-II的产生,表明自噬激活。

图4-3: QRT-PCR用于分析软骨细胞内LC3, ATG7和Beclin-1的基因表达。

  1. 3. 4 DM纳米颗粒软骨细细胞内自噬蛋白表达的影响

Western blot (WB)检测用于分析软骨细胞内蛋白表达,结果与qRT-PCR 相似,结果表达在DM纳米颗粒处理后LC3, ATG7和Beclin-1蛋白水平显 着增加(图4-4),同时30(ig/ml的DM纳米颗粒同样显示出最好的自噬提 升能力。LC3-I向LC3-II的转化是自噬的一个起始步骤。值得注意的是, DM纳米粒子促进了 0A软骨细胞中LC3-II的产生,LC3-II/ I的比例上升, 表明自噬激活。

图4-4. (a) WB用于分析LC3, ATG7和Beclin-1的蛋白质表达。⑹WB条带灰度值被检测
Figure 4-4. (a) Western Blot was used to analyze protein expression of LC3, ATG7 and Beclin-1. (b) WB

strip gray value is detected Image

  1. 3. 5 DM纳米颗粒软骨细细胞内自噬小体形成的影响

自噬小体的形成被认为是自噬被激活的首要特征。如图4-5所示:在正 常软骨细胞中,自_体很少被观察;在IL-ip处理组自噬体同样少见;但是 在30(ig/ml的DM纳米颗粒处理的软骨细胞中出现了量的自噬小体(红色 箭头标记),以上结果表明30|ig/ml的DM纳米颗粒能现在激活自噻。

  1. 3. 6自噬抑制剂3-MADM纳米颗粒介导的抗炎作用的影响

氯喹是选择性PI3K抑制剂,能抑制自噬体的形成从而抑制细胞自噬。 如图4-6所示:IL-ip介导的软骨细胞接受DM纳米颗粒干预后,炎症因子 (IL-6,MMP-13和TNF-a)的基因表达相对于IL-lp组显著下降,分别下 降了 77.78%,92.31%,54.55%。然而,氯喹的干预逆转了 DM纳米颗粒的 抗炎作用,在IL1P+DM+氯喹组中炎症因子相对于IL-ip+DM组显著上升。 以上结果表明DM纳米颗粒发挥的治疗作用与自噬有关。

图4-6: qRT-PCR检测氯喹对DM纳米颗粒抗炎作用的影响。

Figure 4-6: qRT-PCR assay for the effect of chloroquine on the anti-inflammatory effects of DM

nanoparticles.

  1. 3. 7自噬与ROS特异荧光染色检测DM纳米颗粒软骨细胞的自噬与ROS水 平的影响

IL-ip介导的软骨细胞在接受DM纳米颗粒干预不同时间点,自噬和 ROS水平被评估通过荧光共聚焦显微镜。如图4-7a,b所示;软骨细胞接受 DM纳米颗粒处理0-24小时内自噬的变化趋势是:0-6小时自噬强度缓慢上 升,从6小时开始软骨细胞内的自噬水平迅速地加速升高,而第6小时是 自噬水平加速升高的一个时间点。软骨细胞接受DM纳米颗粒处理0-24小 时内ROS水平的变化趋势是:0-3小时软骨细胞内ROS水平急速上升,3-6 小时ROS水平上升变得很平缓,从第6小时开始软骨细胞内ROS的水平呈 现加速下降趋势。因此从第3小时开始是软骨细胞内ROS水平变化的第一 个拐点,第6小时是ROS水平变化的第二个拐点。以上结果表明,软骨细 胞内ROS水平变化先于自噬水平的变化。图4-7c中通过分光光度计检测不 同干预的软骨细胞内ROS水平。在IL-ip组软骨细胞ROS水平呈一直加速 上升的趋势;在IL-lp+DM组ROS水平在0-3小时加速上升,3-6小时软骨 细胞ROS水平缓慢上升,6小时以后ROS水平加速下降;在IL-1P+DM+ 氯喹组ROS水平在0-3小时加速上升,3-6小时软骨细胞ROS水平缓慢上 升,6小时以后ROS水平平稳的上升。对比IL-lp+DM组与IL-lp+DM+氯喹组,在6小时之前软骨细胞内ROS水平没有显著差异,6小时以后这两 组的差异逐渐增大。

图4-7:(&)用〇!^纳米颗粒(3〇]1^/1111)和11-10(1〇1^/1111)共同干预软骨细胞〇11,311,611, 9h, 12h和24h后,用0乂1:〇-10 0代611(自噬,绿色)染料和1^1:〇3(^1166(1108,红色)染料同时染色 的细胞样品通过共聚焦进行分析。显微镜。(b)通过Image J.分析软骨细胞的荧光强度。(c).软骨 细胞分别接受不同干预Oh, 3h, 6h, 9h, 12h和24h后,被装载DCFH-DA。分光光度计检测荧光强

Figure 4-7: (a) Intervention of chondrocytes with DM nanoparticles (30 |ig/mL) and IL-ip (10 ng / mL) for 0 h, 3 h, 6 h, 9 h, 12 h and 24 h, using Cyto-ID Green (autophagy, Cell samples of the green) dye and the MitoSox Red (ROS, red) dye simultaneously stained were analyzed by confocal. microscope, (b) Analysis of the fluorescence intensity of chondrocytes by Image J. (c). Chondrocytes were loaded with DCFH-DA after different interventions for Oh, 3h, 6h, 9h, 12h and 24h. The spectrophotometer detects the fluorescence intensity.

  1. 4讨论

氧化应激(OS)指的是机体在受到各种有害刺激时所聚集过多活性氧

自由基(ROS)、活性氮自由基(RNS)等,当机体自身对自由基的清除能力不 足时,使体内自由基增多,破坏原有的氧化平衡状态,目前医学界大多数 学者都认为0S对软骨细胞的损伤与0A发生存在密切关系[9]。另有报道显 示,ROS极有可能直接或者间接导致滑膜组织和软骨细胞本身的慢性持续 炎症[1()]。以上种种迹象表明自由基在0A病情进展中发挥着关键的作用。 进一步深入分析软骨细胞衰老和ROS的关系后发现,ROS、RNS和NO等 自由基可诱使软骨细胞DNA出现不稳定现象,常见DNA损伤类型包括端 粒不稳定、复制老化和功能失调[n]。综上所述,随着对OA发病机制的研 究深入,OS和OA发病的相关性越来越收到了人们的重视,但是目前的抗 氧化治疗任然没有取得突破性进展。

自噬是细胞新陈代谢的一种方式,通过细胞内溶酶体的水解酶来降解 细胞内的受损细胞器、蛋白质等物质,产生氨基酸或其他小分子以及能量 用于实现细胞合成循环,正常细胞自噬水平一般比较低,当机体内环境受 到外来刺激时,细胞内自噬水平会发生变化,自噬小体数量会增加或降低。 对于OA患者来说,当软骨细胞出现损伤时,细胞内氧化应激增加导致细 胞凋亡,进而导致关节软骨的进行性退变,然而自噬可以抑制关节软骨细 胞的氧化损伤,抑制细胞凋亡,从而减缓OA的进展[12]。常俊等进行了一 个研究,釆用免疫组化染色分析三组(青年组、老年组和OA组)老鼠中 SIR-1基因的表达情况,分析结果显示:老年组和OA炎组SIR-1表达均低 于青年组中SIR-1的表达,通过釆用的SIR-1激动剂和SIR-1抑制剂改变细 胞内源性SIR-1的活性,再通过乙酰基试剂盒检测自噬表达时发现在SIR-1 表达被抑制时,青年组软骨细胞自噬能力出现显著减弱,SIR-1表达被上调 时,青年组的细胞自噬能力显著增强。OA组中,当SIR-1表达增强时细胞 自噬能力出现了明显减弱,但在老年组中细胞的自噬能力却反而显著增强。 自噬在软骨细胞中并不只是发挥保护作用,它在不同是时期发挥两种相反 的作用,在OA前期可软骨细胞通过自噬作用使氧化损伤的软骨细胞被修 复,自噬起到一种保护行作用。随着0A进一步发展,自噬也随之减弱, 软骨细胞的修复能力也随之下降。在0A晚期,软骨细胞内可能启动了程 序性性死亡机制,高度激活自噬的导致软骨细胞死亡。在这两种情况中自 噬均全程参与了软骨细胞修复或凋亡过程,在0A早期时通过激活自噬能 够修复软骨损伤延缓细胞老化;而在0A晚期则通过抑制自噬水平减少软 骨细胞自噬性死亡,起到阻止软骨细胞大面积死亡,防止关节软骨进一步 退化的作用。

本论文运用DM纳米颗粒保护软骨细胞缓解0A,上述图9-10结果显示, DM纳米颗粒具有ROS的清除效应;图11-13结果显示,DM纳米颗粒具 有激活自噬的能力,谁是主导,谁先谁后呢,其内在机制如何,本部分做 了较深入的探讨,图13(a-b)结果显示:DM纳米颗粒作用于OA软骨细胞时, 清除ROS的作用先于激活自噬,激活了激活自噬以后反过来增幅了 DM纳 米颗粒的ROS清除作用。

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章多巴胺_黑色素纳米颗粒骨关节炎大鼠的治疗作用 5. 1前言

在0A病程初期,被半月板覆盖的软骨组织区域的容易发生退化,导 致该区域的软骨水分和细胞外基质丢失,结构和功能出现异常,同时关节 的滑膜组织受到影响,导致滑膜组织炎症细胞聚集,分泌炎症介质IL-lp、 MMPs等软骨组织W。0A进展期,病灶部位的软骨细胞严重受累,软骨细 胞出现功能改变,细胞外基质的合成能力减弱,胶原结构遭到了破坏,软 骨的弹性逐渐减退,软骨细胞分泌炎症介质(IL-ip、MMPs等)显著增多, 进一步加速了软骨基质的降解[2]。0A晚期,病灶由软骨向软骨下骨进展, 并最终形成了髓腔样结构,软骨面进一步变薄,关节软骨发生血管化,软 骨下骨结构改变,细胞外基质降解严重[3]。炎症在0A的病情进展中其重要作用。从上述介绍可以看出,炎症不 是0A的发病因素,但炎症因子可以加剧关节损害,加速0A进展。0A病 理过程中,炎症介质的表达于软骨损伤和细胞外基质的退化具有高度的相 关性,上调的炎症因子通过第二信使介导细胞核的改变,从而影响到转录 和翻译,导致细胞凋亡进一步增加,正反馈了软骨损伤[4]。在炎症介质的作 用下,细胞外基质水解酶的表达回显著升高(包括MMPs家族和各种类型 的整合素),都会影响关节软骨细胞外基质分泌和降解的的动态平衡,加 剧退化,从而加速0A的病情[5]

软骨细胞是关节软骨组织中唯一的细胞,它对维持软骨组织的正常结 构和生物学功能起至关重要的作用。在0A的微环境中,炎症因子会通过 细胞膜上的受体将各种信号转导入细胞,并通过各种信号通路传入细胞核, 介导相关基因和蛋白的表达,使关节软骨由透明软骨细胞表型转变成纤维 细胞表型,周围组织纤维化,从而介导软骨细胞的功能改变。

正常软骨的细胞外基质主要由二型胶原和蛋白多糖组成,它们对维持
关节软骨缓冲关节压力起着重要作用。二型胶原主要承担组织拉伸支持作 用,而蛋白多糖则主要承担为支撑软骨细胞,维持其营养供应的作用。在 0A病程中,蛋白多糖的含量下降,并且二型胶原蛋白减少一型胶原蛋白增 加。同时在0A微环境下会介导10余种基质金属蛋白酶(MMPs)大量分 泌,它们的分泌可降解软骨组织[6],例如可降解胶原的MMP-1,MMP-8, MMP-13,可降解基质的MMP-3, MMP-7, MMP-10, MMP-11和可降解明 胶的MMP-2, MMP-9。在正常情况下,软骨细胞中含有的MMPs的抑制物 组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)能调节MMPs的活性,从而维持软骨细 胞正常的生物学功能[7,8]。而IL-lp、IL-6, TNF-a等炎性因子可以通过MAPK 和NF-kB等途径来抑制TIMPs的分泌和促进MMPs的分泌等,从而对软骨 细胞多种功能照成破坏[9]

  1. 2仪器和材料

超净工作台 细胞培养箱 酶标仪

微量分光光度计 低温高速离心机 超声波清洗机 蛋白电泳转膜仪 共聚焦显微镜 电热恒温水浴箱 电子天平 流式细胞仪 II型电泳仪 制胶板

实时定量荧光PCR仪

细胞培养瓶、培养板

离心管

细针头式滤器 移液器

移液器枪头枪头 PVDF 膜

全自动细胞计数仪TC 20 去离子水 胎牛血清

二甲基亚砜(DMSO)

青一链霉素 浓盐酸 三氯化铁 氯化钠(NaCl)

二甲苯 氯仿 异丙醇 戊巴比妥钠

Moloney MLV反转录试剂盒 TRIzol试剂 PCR引物

实时定量荧光定量PCR试剂盒 总RNA提取试剂盒 人重组IL-lp 高糖DMEM培养基 四甲基偶氮唑蓝(MTT)

上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 上海晶安生物有限公司 Millipore公司,美国 Bio-Rad Laboratories,美国 Sigma-Aldrich 公司,美国 Sigma-Aldrich 公司,美国 S igma-Aldrich 公司,美国 Invitrogen公司,美国 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 杭州永星五交化有限公司 Sigma-Aldrich 公司,美国 Promega公司,美国 Invitrogen公司,美国 上海华大基因公司 Biotium公司,美国 杭州浩基生物科技有限公司 S igma-Aldrich 公司,美国 Invitrogen公司,美国 S igma-Aldrich 公司,美国

PBS                                Sigma-Aldrich 公司,美国

II型胶原酶                      Sigma-Aldrich公司,美国

0.25%胰蛋白酶(含 0.02%EDTA) Sigma-Aldrich 公司,美国

  1. 3方法
    • 1大鼠骨关节炎模型的建立

使用30只雌性7周龄SD大鼠完成体内实验。用2.5%体积分数的戊巴 比妥钠麻醉动物后,对SD大鼠的右下肢进行备皮、消毒、铺巾,从膝关节 内测纵行切开皮肤,小心进入关节腔剪断前十字韧带切断术(ACLT),缝 合关节腔、肌肉和皮肤,在对侧的左膝并用相同的皮肤切口作为对照。将 大鼠随机分为5组:正常组,OA组和三个治疗组。在正常组中,大鼠未进 行手术治疗,并且每周三次向关节腔内注射〇.2ml生理盐水。在OA组中, 在ACLT手术后4周,大鼠每周三次关节内注射0.2mL生理盐水,持续注 射4周。治疗组分为3个亚组:在ACLT手术4周后,一组关节内注射1 Oug/ml DM纳米颗粒,一组关节内注射30ug/ml DM纳米颗粒和一组关节内注射 60ug/ml DM纳米颗粒,每周三次持续注射4周。

4周后,通过过量的戊巴比妥钠麻醉处死大鼠,并分离其关节组织收集 关节液用于进一步研究。观察关节面,根据软骨结构变化的整数评分评估 0A病变的严重程度(评分范围0-6,0=正常软骨结构,5=软骨向软骨下骨侵 蚀),细胞变化(评分范围0-3),H&E和Safranin-0快速绿色染色(评 分范围0-4)和潮标完整性(评分范围0-1)。

  1. 2大鼠的形态学染色

将膝关节组织在4%多聚甲醛中固定48小时,并在摇床上在10% (w/ v) Tris-EDTA中脱钙4周。脱水后将样品包埋在石蜡中。将样品包埋在石 蜡中,然后将前切片5pm。关节嵌入石蜡和5pm正面切片。脱蜡切片用曙 红苏木精(H&E),番红-0快速绿染色和MMP-13免疫组织化学染色染色。 通过倒置显微镜(Olympus,Japan)以盲法观察软骨和软骨下骨的细胞结 构和形态。如前所述,通过使用国际骨关节炎研究协会(OARSI)对胫骨 平台内侧和股骨内侧髁的评分系统来评估关节损伤的程度。

  1. 3大鼠的OARSI评分

SD大鼠被连续干预4周后,过度麻醉初试大鼠,小心分离关节组织, 将关节分离为胫骨平台和股骨髁两面,注意不要损伤关节面,根据上述方 法做切片,做形态学染色后,根据关节组织的组织学表现,严格按照国际 骨关节炎研究协会(OARSI)骨关节炎评分标准进行OA评分。

  1. 4免疫组化检测大鼠關P-13

使用中山金桥免疫组化试剂盒SP9000做SD大鼠的免疫组织化学染色。 简言之,将脱蜡后的载玻片用3%过氧化氢淬灭15分钟,然后用胰蛋白酶 抗原淬灭15分钟。然后将切片用10%正常山羊阻断血清在室温下覆盖15 分钟,并将MMP-13的抗体孵育过夜4°C。然后将细胞与山羊抗兔IgG抗 体在室温下孵育1小时。显色剂孵育5分钟后,通过荧光成像显微镜 (Olympus BX53,Japan)获取图像。

  1. 5自由基试剂盒检测大鼠组织匀浆中的R0S.

使用上海贝博的ROS试剂盒检测SD软骨组织中ROS的含量。将来自 膝关节的50mg新鲜软骨组织与lmL缓冲液一起制成勻楽,在这些勻衆混 合物中,取200(iL软骨组织匀浆,并在4°C下离心10分钟。收集1上清液, 并与10 (iLBBcellProbeTMROS探针在96孔板中于37°C避光温育30分钟。 通过荧光酶标仪定量光密度(OD值)水平。所有样品重复三次。

  1. 4结果
  2. 1 DM纳米颗粒对骨关节炎大鼠的大体观的影响

为了评估DM纳米颗粒对OA病理表现的影响,我们通过在股骨下端 和膝关节胫骨上端进行前交叉韧带交换(ACLT)手术建立了大鼠OA模型, 注射具有三种不同剂量(10,30和60^lg/mL,0.1mL)的DM纳米颗粒或者 生理盐水。通过肉眼观察评估软骨退化。如图5-1所示,在ACLT手术组(OA 组)的股骨課和胫骨平台中观察到0A的特征,例如糜烂和骨赘形成,而 正常组中的正常软骨呈现闪亮,光滑的表面,没有任何缺陷和骨赘形成(假 手术组)。然而,实验组中,DM纳米颗粒连续干预4周后,软骨损伤明显 减少,骨赘和关节面粗糙程度也都显著下降。在所有实验组中,30|ig/mL DM 纳米颗粒表现出最佳性能,闪亮的软骨表面类似于正常软骨。

5.4.2 DM纳米颗粒对骨关节炎大鼠形态学改变的影响

对SD大鼠的形态学评估通过HE染色和番红固绿染色,如图5-2通过 HE和番红固绿染色的组织病理学检查显示:OA组中的严重病理学变化, 如裂隙和纤维性颤动,关节面变薄,软骨细胞遗失,软骨浅表区和骨赘增 多,关节软骨下骨结构紊乱(图5-2)。相反,DM纳米颗粒减缓软骨退化, 表现为组织病变严重程度显着降低和GAG含量增加,关节面相对完整,软 骨层变厚,尤其在DM浓度为30ug/ml时相对于OA组的修复最是明显。

  • 3 DM纳米颗粒对骨关节炎大鼠的OARSI评分的影响

根据形态学染色,严格按照OARSI评分标准对SD大鼠进行组织学评分, 结果如图5-3所示:0A组的评分相对于正常组显著升高,已达到正常组的 10倍,DM纳米颗粒的干预显著降低了 SD大鼠的OARSI评分,尤其是DM 纳米颗粒浓度为30ug/ml时其对应的评分仅为OA组的50%,以上结果表明 DM纳米颗粒具有显著改善SD大鼠关节软骨组织学损伤的作用。

OARSI scores

图5-3:根据SD大鼠组织学表现的OARSI评分
Figure 5-3: OARSI score based on histological performance of SD rats

  • DM纳米颗粒对骨关节炎大鼠炎症因子的影响

通过免疫组化染色评估MMP-13表达,MMP-13作为骨关节炎特异性 炎症相关指标,在骨关节炎的评估炎症评估中应用广泛。如图5-4所示:0A 组的阳性表达相对于正常组的软骨组织显著升高,软骨面表层出现大量的 纤维化,在DM纳米颗粒干预的实验组MMP-13的阳性表达显著减小,软 骨细胞的形态和数量也相对于0A组增加。以上结果表明:DM纳米颗粒能 够显著降低炎症因子的表达。Normal        OA           DM 10         DM 30              DM 60

  • 5 DM纳米颗粒对骨关节炎大鼠自由基水平的影响

为了证实DM纳米颗粒对OA介导的ROS分泌的影响,招募了 BBcellProbeTMROS探针。如图5-5所示,OA组ROS水平显着升高,是 正常组的24.35倍。然而,DM纳米粒子逆转OA介导的ROS增加,并且 在数值上,DM组中浓度为30ug / ml的ROS水平仅为OA组的20.22%。

图5-5: SD大鼠关节软骨组织匀浆中ROS的含量
Figure 5-5: ROS content in articular cartilage tissue homogenate of SD rats

  1. 5讨论

0A的关节软骨炎症反应与软骨退变有密切的关系,炎症细胞和炎症因 子如白细胞介素-IP (IL-ip)、IL-6和肿瘤坏死因子-a( TNF-a)等广泛参与0A 病理变化过程。IL-lp是0A病理进展中最核心的因素,IL-1主要由活化的 巨噬细胞分泌,在转换酶作用下变成活性更高的IL-ip,IL-lp是一种可引起 局部疼痛和炎症反应的致炎因子^1。炎症反应会给细胞的结构和功能带来 破坏,细胞外基质的分泌与代谢失衡,导致关节软骨的功能受损。TNF-a 与IL-lp具有一定的同源性,二者虽然受体不同,但其生物效应相似,另外 TNF-a可刺激滑膜组织产生前列腺素,促进软骨吸收,破坏二型胶原,在软 骨退变过程中起重要作用[n]。IL-6是发动炎症反应的始动因素之一,在早 中期0A患者关节液中的含量很高。IL-6与IL-ip,TNF-a等炎症因子具有 协同作用,对0A的早中期有一定的诊断意义。在本次实验中,多巴胺-黑 色素纳米颗粒可使IL-lp介导的软骨细胞的炎症因子表达显著下降,减轻局 部炎症反应。

另外,IL-ip也能够促进MMPs合成。而MMPs家族有多种在骨关节炎 有表达有意义的成员,如MMP-1、MMP-9、MMP-13,它们能够降解软骨 细胞外基质,引起关节软骨退化,加速0A的病程恶化[12]

环氧化酶(COX)在正常细胞内活性极低,炎症刺激能诱导其大量产生。 临床研究明C0X2在0A关节软骨组织中表达显著增加[13]。另外实验证明, iNOS抑制剂能够促进关节软骨修复、明显增加而二型胶原表达和增加软骨 厚度。因此,抑制iNOS表达对维持软骨表达有积极意义[1415]。在本次实验 中,多巴胺-黑色素纳米颗粒可使IL-ip介导的软骨细胞的MMP-13、COX-2 和iNOS表达显著下降,减轻局部软骨蜕变损伤。

综上所述,多巴胺-黑色素纳米颗粒能缓解骨关节炎中炎症因子的分泌, 对软骨细胞具有良好的保护作用。

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第六章综述

膝骨关节炎生物治疗研究进展

骨关节炎(0A)是最常见的关节慢性疾病,发病率随年龄的增长而明 显增加。据统计,在美国60岁以上人群中0A的发病率约65%,75岁以 上的人群发病率约为80%,其中约80%的OA患者表现行动受限,25%最 终发展为残疾[1]。OA的发病机制复杂,现已明确的风险因素有年龄、肥胖、 创伤、环境、性别和遗传因素等,关节软骨的退行性变是其主要的病理学 改变,特征改变是关节软骨退化、边缘和软骨下骨增生,软骨基质减少[2,3]。 软骨细胞是软骨组织中唯一细胞,占软骨总体积的1%〜5%,可分泌细胞 外基质(II型胶原蛋白、蛋白多糖和透明质酸等重要组分),并维持细胞 外基质的代谢平衡。研究已经证实Wnt/p- catenin、TGF-p/Smad、Indian hedgehog 和 Wnt/p_ catenin 信号通路及一些炎症因子(IL-lp、TNF-a、IL-6 和MMPs)均可刺激软骨细胞退化导致OA的发生;而且上述通路影响软 骨细胞代谢平衡的一系列粑基因的表达,例如Runx2、MMP-13和Adamts5 等;炎症抑制和免疫细胞可促发软骨组织的病理改变m。然而由于关节软骨 组织内没有血管、淋巴管和神经存在,导致关节损伤后自身修复能力非常 差。目前对OA的治疗上面,对于轻中度OA患者主要采用非手术治疗,采 用抗炎、止痛、服用硫酸软骨素,关节注射透明质酸钠、理疗等,上述这 些措施都是对症治疗,只能缓解OA的临床症状,不能阻止病情进展,更 是难以完全修复受损的软骨;而对于重度OA患者,则只能外科手段行手 术干预,50岁以内的年轻患者疗效稍好,对于高龄患者只能采用全关节置 换术,经济费用高昂,且承受着手术带来的损伤。因此,目前针对OA的 治疗还缺乏一种满意的方案。

随着人们对OA发病机制认识的深入我们对OA的治疗有了新的灵感, 随着组织工程的迅猛发展,以及生长因子、干细胞和软骨细胞移植和基因 治疗等领域的不断进步,对0A新的治疗策略的不断尝试取得了突破性的 进展。

  • 生长因子(growth factor,GF)

GF是维持软骨和软骨下骨内环境稳态以及修复再生的重要因素,可促 进软骨细胞对软骨细胞外基质合成分泌,转化生长因子超家族,特别是骨 形态发生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2,BMP _ 2)、成纤维细胞生 长因子(Fibroblast growth factor, bFGF)、胰岛素样生长因子-1 (Insulin-like growth factor-1,IGF-1)等对0A中的软骨和软骨下骨损伤修复效果十分显著 [5_7]。它们不但可以直接作用于受损的软骨和软骨下骨,还通过调节免疫细 胞、成纤维化细胞和滑膜细胞通过一系列信号通路传导调节,间接影响膝 软骨细胞的合成和分解代谢,从而发挥0A的治疗作用[8]

  • 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)

近年来,MSCs在OA应用中显示了优异的促进软骨组织再生、促进细 胞外基质分泌的性能,MSCs可通过细胞间相互作用或者分泌生物活性因因 子,维持软骨细胞局部微环境稳定,发挥营养、免疫调节等多种生物学能 力[9]。局部应用MSCs后,MSCs会分泌众多的生物活性物质包括miRNA、 GF、免疫调节因子等,促进软骨再生体外扩增的骨髓来源的MSCs (BMSCs)或体内富集的骨髓来源MSCs在治疗0A均能达到满意效果。 深入探讨MSCs作用机制发现,MSCs对0A的治疗作用可能因为其调节 TGF- p/Smad,Wnt/p_ catenin等通路,作为骨关节炎的重要分子机制,它 们的抑制可能下调下游靶基因如MMPs、ADAMTS和Runnx等的表达,从 而使软骨细胞合成细胞外基质增多,BMSCs对IL- 1、TNF- a等炎性因子 有明显的抑制作用,对进一步软骨损伤起到了重要的抑制作用W,12]。在进 来的一项临床试验中,通过关节镜在关节面钻孔造就一种微骨折状态,使 骨髓腔的BMSCs迁移到关节腔修复软骨损伤和关节内注射自体体外培养 的BMSCs结合透明质酸治疗全层软骨损伤,取得了可喜的疗效[13]

  • 外泌体(exosomes)

外泌体也具有优异的OA治疗作用。外泌体是细胞分泌的活动在细胞 内或细胞间的一种高效运输载体,主要传递生物活性物质包括(mRNA, microRNA蛋白质和脂质)[1415]。BMSCs分泌的外泌体对胶原酶诱导的OA 治疗效果相当可观[16]。外泌体的作用与microRNA的调节作用具有很大的 相关性,microRNA与其对靶基因转录的mRNA发生特异性结合,调节其 靶基因的表达,或也可形成一个复杂的相互作用网络。目前研究重点主要 集中在microRNA在OA中的作用机制以及对OA相关的基因或者通路的调 控[17],而关于更深入的外泌体分泌调控型miRNA机制还不清楚。

4基因治疗

随着基因工程技术的发展,基因治疗在OA的应用也收到了不错的效 果。将一些重要的软骨基因转入软骨细胞内,进而促进软骨再生,或者转 导一些抗炎基因,减轻炎症因子分泌,发挥持续的治疗作用,现在已经成 为一种颇有应用前景的方案。应用基因工程技术作用于同种异体软骨细胞 使其产生TGF- pi,将这种软骨细胞植入OA的关节内治疗严重的晚期OA, 已经被证明可以显著改善关节功能和临床症状[18]。一项随机双盲III期临床 实验随访1年后发现,单次给予通过基因工程转导TGF-卩1软骨细胞后, OA相关症状得到持久、不同程度的改善[19];以上结果表明:基因治疗在 OA应用具有非常良好的前景。

5展望

尽管近来新兴的治疗方法在缓解OA症状和软骨再生方面展现出不错

的效果,但由于0A的发病机制任然不明缺,修复再生软骨质量和长期稳

定疗效还缺乏长期的循证医学的考量。多种生物治疗方法的联合应用,可

能更为有效的缓解0A,因此笔者认为在未来0A的治疗中这会变成主要的

研究方向。

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