膀胱癌尿液外泌体IncRNA诊断模型的建立及对膀胱癌复发监测的临床意义论文

2020年2月28日19:01:33膀胱癌尿液外泌体IncRNA诊断模型的建立及对膀胱癌复发监测的临床意义论文已关闭评论

膀胱癌尿液外泌体IncRNA诊断模型的建立及对膀胱癌复发监测的临床意义论文

中文摘要

目的:

近年来有研究发现膀胱癌细胞可以分泌外泌体(exosomes)进入尿液中,并与癌

症的进儀有关。外泌体中含有致癌长链非编码RNA OncRNAs)分子,其表达水

平可反_肿瘤的动态变化。因此,尿液外泌体中差异表达的IncRNA分子可作为

膀胱癌修断和预后的新型非侵入性生物标志物。本研究的目的是提取并鉴定尿液

外泌体,分析其IncRNA分子表达谱;构建尿液外泌体IncRNA诊断模型用于膀

胱癌诊断,并探究尿液外泌体IncRNA分子与膀胱癌复发预测的关系。

方法:

  1. 分离并提取膀胱癌患者尿液外泌体,并通过透射电子显微镜、免疫印迹技术、 纳米粒径分析等多种方法鉴定外泌体。
  2. 通过检索文献获得在膀胱癌组织中异常表达且与膀胱癌的发生、发展密切相 关的 8 个 IncRNAs作为候选分子,如下:MALAT1, PCAT-l,SPRY4-IT1, UCA1, MEG3, H19, UBC1 和 TUGl
  3. 在训练阶段,提取104例膀胱癌患者和104例健康对照者尿液外泌体中的 RNA,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析上述8个IncRNAs的表达情 况,筛选出在膀胱癌尿液外泌体中异常表达的IncRNA分子。针对异常表达 的IncRNAs在训练阶段样本中的qRT-PCR检测结果,釆用多因素Logistic回 归模型构建膀胱癌分子诊断模型。
  4. 在验证阶段,差异表达的IncRNAs在另外80例膀胱癌患者和80例健康对照

者尿液外泌体中进一步验证,并采用受试者工作特征曲线(ROC)评估已建 立的尿液外泌体IncRNAs诊断模型对膀胱癌的诊断效能。此外,还对比了上 述诊断模型与尿液脱落细胞学的诊断效能。

  1. 为探讨尿液外泌体IncRNAs是否对膀胱癌复发具有预测价值,随访验证阶段 的膀胱癌患者共80例,并分为非浸润性膀胱癌患者组(50例)和浸润性膀 胱癌患者组(30例),中位随访时间为57个月(范围为‘76个月)。通过 Kaplan-Meier方法分析差异表达IncRNAs与上述两组膀胱癌患者五年无复发 生存率(RFS)的关系。将差异表达IncRNAs、年龄、性别、肿瘤病理分期、 肿瘤病理分级以及淋巴结转移情况纳入Cox比例风险回归模型,寻找能够用 于预测上述两组膀胱癌复发的独立危险因素。

结果:

  1. 在训练阶段,发现3个IncRNA分子(MALAThPCAT-1和SPRY4-IT1)在 膀胱癌和健康对照组之间存在显著的高表达(均P<0,001)。其受试者工作曲 线下面积(AUC)分别为0.844,0.832和0.760。基于多元Logistic回归分 析构建膀胱癌诊断模型为:Logit (P) = 0.6577 - 0.0695XMALAT1 -
  2. 0686xPCAT-l - 0.0015xSPRY4-ITl,其 AUC 为 0.854 (95%置信区间为
  3. 799-0.899,灵敏度=70.2%,特异度=85.6%)。
  4. 在验证阶段进一步证实MALAT1,PCAT-1和SPRY4-ITI在膀胱癌和健康对 照组之间存在显著的高表达(均P <0.001 ),其受试者工作曲线下面积(AUC) 分别为0.785, 810和0.799。上述尿液外泌体丨ncRNAs诊断模型的AUC为 0.813 (95%置信区间为0.744-0.870,灵敏度=62.5%,特异度=85.0%),明显 高于尿液脱落细胞学膀胱癌的诊断效能(AUC=0.619, 95% CI= 0.539-0.694, 灵敏度=25%,特异度=98.7%)。
  5. 在非浸润性膀胱癌患者组,Kaplan-Meier生存分析表明尿液外泌体IncRNA MALAT1和PCATM高表达组患者RFS明显低于相应的对照组=0.002 和尸<0.001)。经多因素Cox比例风险回归分析显示尿液外泌体IncRNA PCAT-1 (尸=0.018)和肿瘤TNM分期(P=0.036)是预测非浸润性膀胱癌患 者复发的独立指标。在浸润性膀胱癌患者组,Kaplan-Meier生存分析及Cox 比例风险回归分析均显示上述变量不能用于预测肿瘤复发。

结论:

  1. 本研究通过提取和分析尿液外泌体的lncRNAs,发现外泌体MALAT1,PCAT-1 和SPRY4-IT1在膀胱癌患者尿液中表达升高,可作为膀胱癌诊断的潜在肿瘤 标志物。
  2. 基于多元Logistic回归分析构建膀胱癌诊断模型Logit (P) = 0.6577 - 0.0695><MALAT1 -0.0686xPCAT-l -0.0015XSPRY4-IT1,其诊断效能 AUC 明

显高于尿液脱落细胞学。

  1. 尿液外泌体IncRNAPCAT-l可以作为非浸润性膀胱癌患者复发的独立预后指 标,为膀胱癌预后监测开辟了新的非侵袭性的检测途径。

关键词:膀胱癌,IncRNAs;尿液外泌体,诊断,复发预测

Expression signatures of exosomal long non-coding RNAs in
urine serve as novel non-invasive biomarkers for diagnosis and

recurrence prediction of bladder cancer

Post graduate: Zhan Yao
Tutor: Prof. Wang Chuanxin
Major: Clinical Laboratory and Diagnostics

ABSTRACT

Objective:

Exosomes released by tumor cells contain oncogenic long non-coding RNAs (IncRNAs), which can reflect the pathophysiology of tumors. Studies showed that bladder cancer (BC) cells can secrete exosomes into urine and facilitate tumor progression. Therefore, exosome-shuttled bioactive IncRNAs have aroused great interest of researchers to study whether it is possible to use exosomal IncRNAs as novel diagnostic and prognostic indicators for cancer. However, only few urinary exosome (UE)-derived IncRNAs are characterized as potential biomarkers in BC patients. In this research, we intend to establish a UE-derived IncRNA model for detection of BC by extracting and analyzing the expression signatures of UE-derived IncRNAs, and to explore the predictive value of differentially expressed exosomal IncRNAs in the recurrence of BC.

Methods:

  1. Exosomes were extracted from urine of BC patients and healthy controls and confirmed using transmission electron microscopy (TEM), Western blotting analysis, nanoparticle tracking analysis (NTA) and flow cytometry.
  2. Then, eight IncRNAs, including MALAT1, PCAT-1, SPRY4-IT1, UCA1, MEG3, HI9, UBC1 and TUG1, were selected as candidate moleculars according to their functional roles in tumorigenesis, development, and metastasis of BC.
  3. During the training phase, exosomal IncRNAs was extracted from the urine

samples of 104 patients with BC and 104 healthy controls. Then, qRT-PCR was used to analyze the expressions of the above 8 candidate IncRNAs,and IncRNAs that were abnormally expressed in the urinary exosomes of BC were screened out. Finally, the relative expressions     of the selected cxosomal IncRNAs were put into

multivariate logistic regression model to establish the diagnostic panel for BC. The diagnostic accuracy of the panel was evaluated by receiver-operating characteristic (ROC) curves.

  1. During the validation phase, the differentially expressed UE-derived IncRNAs were further validated in another 80 patients with BC and 80 healthy controls, and the diagnostic efficiency of the panel was measure by ROC analysis. In addition, we also compared the diagnostic performance between the panel and urine cytology for BC detection.
  2. To investigate the prognostic value of the differentially expressed IncRNAs for BC recwrrence, a total of 80 patients with BC were followed-up, which were divided into the nonmuscle-invasive bladder cancer (NMIBC) group (50 cases) and the muscle-invasive bladder cancer (MIBC) group (30 cases). The median follow-up time was 57 months. Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze the relationship between the differentially expressed IncRNAs and the recurrence-free survival (RFS) of BC patients in the two groups. Then,multiple variables including the selected exosomal IncRNAs, age of patients, gender of patients, tumor stage, tumor grade and lymph node metastasis were incorporated into the Cox proportional haz^ds regression model to find independent risk factors that could be used to predict recurrence of BC.

Results:

  1. In the training set, the expressions of eight candidate IncRNAs in 104 BC patients and 104 healthy controls were assessed by qRT-PCR. MALAT1, PCAT-1 and SPRY4-IT1 were significantly up-regulated in BC patients compared with the healthy controls (all at P <0.001), The diagnostic accuracy of MALAT1, PCAT-1 and SPRY4-IT1, measured by AUC, was844, 0.832 and 0.760, respectively. Athree-lncRNA panel based on this result was established for BC diagnosis: Logit (P)=
  1. 6577 — 0.0695xMALATl - 0.0686xPCAT-l - 0.0015xSPRY4-ITl,and the diagnostic performance of the established three-lncRNA panel was 0.854 (95% Cl -
  2. — 0.899, sensitivity = 70.2% and specificity =85.6 %).
  3. These three lncRNAs were further verified in an independent validation set, containing 80 BC patients and 80 healthy controls. Similarly, the dysregulated expression trend was consistent between the training set and the validation set, revealing no significant difference. The corresponding AUCs of the three lncRNAs (MALAT1, PCAT-1 and SPRY4-IT1) were 0.785, 0.810 and 0.799, respectively. The AUC of the three-lncRNA panel for BC detection was 0.813 (95% Cl = 0.744-0.870, sensitivity =62.5% and specificity = 85.0%), which was significantly higher than that of the urine cytology (AUC=0.619,95% Cl 二539-0.694,sensitivity 二 25% and specificity^ 98.7%, P < 0.001).
  4. In the NMIBC group, Kaplan-Meier survival analysis showed that patients with up-regulated MALAT1 and PCAT-1 had a significantly lower RFS compared with their corresponding counterparts (P =0.002 and P <0.001, respectively). Multivariate analysis revealed that exosomal IncRNA PCAT-1 and tumor stage were independent indicators for predicting recurrence of NMIBC (P =0.018 and P =036, respectively). However, none of the three dysregulated lncRNAs were correlated with the recurrence of MIBC patients (all at P > 0.05).

Conclusions:

  1. We successfully established a three-lncRNA panel for BC diagnosis through extracting and analyzing UE-derived lncRNAs.
  2. We identified that exosomal PCAT-1 could act as an independent risk factor for recurrence prediction of NMIBC.
  3. Our study provides a new strategy to explore effective and reliable urinary biomarkers for detection and recurrence prediction of BC.

Key words: Bladder cancer; LncRNAs; Urine exosomes; Diagnosis; Recurrence prediction

膀胱癌发生于膀胱黏膜上皮,恶性程度高,早期症状不明显,患者常以无痛 性血尿入院,在我国其发病率和死亡率常年居高不下,而在西方国家其发病率仅 次于前列腺癌,居第2位,严重危害人类健康[I]。全球癌症最新统计显示,2018 年世界范围内有约549,393例新发膀胱癌患者,约199,922例膀胱癌患者死亡, 是泌尿系统肿瘤死亡的首要原因[2]。美国最新调查数据显示,2018年美国新增 约81,190例膀胱癌患者,死亡例数约为17,240例[3]。虽然近年来膀胱癌的治疗 方法和技术己经取得长足的进步,但仍有约70%的患者经尿道电切术后复发,严 重影响患者的身心健康,而且膀胱癌的治疗与随访费用均相对较高,给整个家庭 带来巨大的精祌压力和经济压力。因此我们应该积极改进及研发膀胱癌诊疗技术 手段,在膀胱癌早期诊断、有效根治以及无创监测等方面取得突破性进展,从而 提高患者的生存质量。

临床上依据肿瘤有无肌层浸润,将膀胱癌分为非浸润性膀胱癌和浸润性膀胱 癌两种类型,其中新确诊的膀胱癌患者中非浸润性膀胱癌大约占70%[4]。非浸 润性膀胱癌(Ta、Tis、T1)又称表浅性膀胱癌。目前临床上针对的该类型膀胱 癌患者的治疗主要是经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of BC, TURBT),辅以膀胱内化疗或免疫治疗。这类肿瘤五年生存率较好,但仍有70% 患者会复发[5_6],因此该类型膀胱癌患者术后需要定期行膀胱镜检查。另一种类 型的膀胱癌是浸润性膀胱癌(pT2-pT4),约三分之一的患者属于该种类型,其恶 性程度极高,易扩散和远处转移,预后很差,临床上一经确诊立即釆取根治性膀 胱肿瘤切除术[7]。因此,进行准确的早期诊断、开展及时有效的早期治疗以及 研发新的无创性的复查手段是改善膀胱癌预后、降低膀胱癌复发率和死亡率的关 键。目前,膀胱镜病理活检是临床医生诊断膀胱癌最有力的证据,是公认的金标 准。但是膀胱镜检查过程中对患者尿道的损伤以及随之而来的疼痛感,给患者带 来极大的思想负担,致使需要长期复查的患者“谈镜色变”,依从性差,复诊率 低[8]。尿液脱落细胞检查作为目前临床最具特异性的无创检测手段,_常被用于BC的辅助诊断。然而,多项研究证实其在低级别膀胱肿瘤的鉴定中是相对无效 的。此外,良性疾病如膀胱内炎症,亦可引起细胞形态的变化,因此与膀胱癌细 胞很难区分,使假阳性率髙达12%[9]。影像学检査方法包括CT和超声检查,对 体积较大的占位性病变容易做出判断,但此时患者已处于中晚期,错过了最佳冶 疗时机。CT和超声检查对微小病变易漏诊,不利于肿瘤的早期发现和早期治疗 [10-11]。此外,随着人类对膀胱癌认知的深入以及液体活检的发展,许多尿液肿 瘤标志物相继出现,如核基质蛋白22 (NMP22)、纤维蛋白原降解产物(FDP) 和膀胱肿瘤抗原(BTA)。然而,这些新生肿瘤标志物均因特异度较低而无法对 膀胱癌做出准确判断[1243]。因此,寻找可靠的早期诊断和复发预测的膀胱癌标 志物,对于改善患者的预后和提高患者生存质量至关重要。

长链非编码RNA (longnoiM:odingRNA,lncRNA)是长度大于200个核苷 酸的非编码RNA,不具有蛋白编码能力[14]。LncRNA是通过与DNA、RNA或 者蛋白结合而发挥其生物学功能的,越来越多的研究成果发现一些IncRNA实际 上扮演着某些调控RNA (如microRNA或piRNA)前体的角色。但是IncRNA 的这种作用模式并不是单一的,它能够以多种不同的方式来调控基因表达和蛋白 合成[15-16]。目前已经被广大学者研究证实的调控方式有以下几个方面:IncRNA 参与调控表观遗传学水平的多种生物学过程,例如IncRNA HOTAIR通过DNA 甲基化抑制miR-122的表达,从而激活细胞周期蛋白G1,促进肝细胞癌的致瘤 性[17]。在转录水平调控中,IncRNA可以通过与转录相关蛋白形成复合体使其 作用于基因的顺式作用元件上或者直接作用于临近的顺式作用元件的方式,从而 调控靶基因的表达。在转录后水平调控中,互补的IncRNA与mRNA结合形成 双链结构,从而阻止反式作用因子与mRNA结合,最终影响mRNA的加工、剪 接、转运、翻译、降解卩8]。此外IncRNA还可以作为媒介参与生物学过程,例 如IncRNA分子可以充当分子支架,连接多个蛋白分子从而形成一个复合体进而 发挥特定的生物学功能,或者作为信号通路的调节剂,响应来自细胞内或细胞外 的信号[19]。

LncRNA被证明是肿瘤发生、发展生物学过程中的重要介质。Wang Z等通 过系统分析TCGA中6475个肿瘤样品的DNA甲基化水平和基因表达数据,全 面解析了癌症中受DNA甲基化调控的IncRNA,进而发现IncRNAEPICl可以通过与MYC蛋白相互作用调控MYC靶基因的转录,从而促进肿瘤细胞的周期进 程与癌症的发生[20]。近期另有研究发现CASC15和NBAT1编码位于神经母细 胞瘤风险相关的6p22.3位点的一对正义/反义IncRNA (6p221ncRNAs)是肿瘤抑 制因子,并且在高危神经母细胞瘤中表现出低表达的特征,通过 USP36-CHD7-SOX9调节轴决定神经母细胞瘤的易感性。6p22IncRNA与USP36 之间的相互调控作用不仅对IncRNA介导的转录和转录后基因调节提供了蜇要的 机制认识,而且还提供了用于治疗高风险神经母细胞瘤患者的替代治疗选择[21]。 LncRNAs已成为结直肠癌细胞增殖,凋亡和迁移的关键分子,在整个结直肠癌 发生与进展过程中发挥的作用不容忽视。近期就有研究团队利用芯片技术研究了 两个结直肠癌患者的原发性肿瘤组织和相应的正常粘膜中IncRNAs的转录图谱, 并利用实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)在结肠癌组织中进一步验证差异 IncRNAs的表达水平,发现LinC〇0659在结肠癌组织中表达明显上调,并且其表 达水平升高与结直肠癌患者的预后不良显著相关。发现LinC〇0659是一种新发现 的能够通过调节细胞周期参与结肠癌细胞的生长的促癌IncRNA分子[22]。这一 项研究结果深入解析了 IncRNA调控机制并为结肠癌治疗提供了应用策略。

LncRNA在膀胱癌中也扮演了重要角色。Peter等[23]釆用IncRNAs生物芯片 分析膀胱癌及癌旁正常粘膜组织,发现了一种新型IncRNA-AB074278,进一步 研究表明AB074278通过与EMP1相互作用从而促进肿瘤细胞的增殖,是预测膀 胱癌预后的一项较好指标。Ying[24]等发现IncRNAMALAT-1可通过调控上皮间 质转化促进膀胱癌细胞的迁移。Zhu[25]等建立了基于PCR技术的IncRNAs检测 平台,分析了 IncRNA ncRAN在膀胱癌不同分期中的表达模式,发现IncRNA ncRAN在浸润性膀胱癌表达明显升高,提示其可能在膀胱癌的肌层浸润中发挥 着重要作用。近年来关于IncRNAs的研究进展迅猛,大量膀胱癌相关IncRNAs 被发现,然而目前大部分研究主要集中在组织,如何利用无创性的检测手段对 IncRNAs进行分析,已成为肿瘤领域研究的热点。最近,人们发现IncRNAs稳 定地存在于外泌体中,并能反映肿瘤患者的病理状态,引起了研究人员的极大兴 趣,这使得外泌体IncRNAs作为新的诊断和预后生物标志物成为可能。

近年来随着分子技术的飞速发展以及生物学界对外泌体(Exosonies)探索的 R趋深入,外泌体检测成为液体活检技术中的重要组成部分,是目前继ctDNA(circulating tumor DNA,循环肿瘤 DNA)和 CTC (circulating tumor cell,循环肿瘤细胞)之后,另一蓬勃兴起的研究领域。外泌体是指由细胞分泌释放到细胞 外的一种脂质双层囊泡,直径约为30- 150mn,广泛存在于人体的各种体液中,

包括血液、尿液、脑脊液、胸腹水等[26-28]。外泌体中携带了来源细胞的各种生 物活性物质,总体可以分为蛋白质、核酸及脂类。研究发现外泌体可以携带上述 生物活性分子在细胞和组织之间自由穿梭,从而参与细胞间的通讯网络。当外泌 体与受体细胞接触以后,通过与细胞表面受体相互作用发挥信号转导作用或者直 接与细胞融合将其所携带的生物活性分子释放进入细胞中,最终调控受体细胞的 生物学活动。有研究发现肿瘤细胞释放的外泌体通过细胞间通讯促使肿瘤微环境 形成,进而引发恶性肿瘤远处转移以及对化疗药物产生耐药[29-30]。由于外泌体 具有来源细胞的代表性,即携带来源细胞(包括肿瘤细胞)内的特定蛋白质、核 酸及脂类物质,且取样创伤性小、可以动态监测,因此外泌体有成为新的肿瘤诊 断标志物的潜力[31-32]。Huang等[33]利用高通量测序分析发现体液外泌体中存 在丰富的RNA,并且外泌体的膜性囊泡结构可以对这些RNA产生保护作用,因 此与体液总体RNA相比,外泌体中的RNA更加稳定,并且更能代表肿瘤的恶 性生物学功能变化。以外泌体为检测载体对肿瘤进行液体活检,可摆脱对原发肿 瘤组织的依赖,为肿瘤的无创性检测研究提供新的思路。Goto T等[34]研究发现 胰腺癌患者血清外泌体中miR-191,miR-D21,miR-451a的表达水平明显升高, 可为胰腺癌的恶性程度及进展趋势预判提供帮助。Sugimachi等[35]以血清外泌 伸:为检测载体对miRNAs差异表达谱进行研究,显示血清外泌体中的miR-718 是一项预测肝癌侵袭转移的良好标志物。另有研究发现外泌体lncRNAZFASl在 胃癌患者血清中的表达水平明显升高,且能够通过细胞间通讯促进胃癌的进展, 可作为胃癌诊断和预后的潜在生物标志物[36]。目前肿瘤外泌体己经被发现可用 于多种肿瘤的诊断和病程及预后的监测,在前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵 巢癌和黑色素瘤等肿瘤诊治中显示出其应用前景。

自2004年Pisitkun T等人第一次用超速离心法在尿液中获得外泌体,并在外 泌体中鉴定到了疾病相关的蛋白之后[37],有关尿液外泌体的研究开始全速起航, 越来越多的学者发现尿液外泌体中的肿瘤相关物质在肿瘤患者与健康人之间存 在着显著差异,这表明尿液外泌体在疾病诊断领域将发挥重要的作用[38]。尿液是除血液之外的另一种潜在的液体活检样本来源。相较于血样,获取尿液样本是 完全无创的,操作和保存也更为简单方便。且尿液中同样可检测到外泌体,其携 带的细胞特异性组分如蛋白、脂类和核酸等均可提供多样化信息,在疾病诊疗等 临床领域意义重大D此外尿液外泌体的HNA相较于尿液总RAN而言,具有更 高的稳定性,因为外泌体的膜结构可以减少RNA酶的降解作用。Neeb等[39]探 讨了尿液上清外泌体中的mRNA对前列腺癌的诊断价值,发现AGR2 SV-G和 AGR2 SV-H均显示出对前列腺癌和健康对照者良好的鉴别诊断能力,并且显著 优于传统肿瘤标志物血清PSABeckham CJ等[40]研究发现从膀胱癌患者尿液中 提取的外泌体中含有EDIL-3等生物活性分子,识别这些成分及其相关的致癌信 号通路可为膀胱癌的治疗提供新靶点和策略。本课题组前期研究发现,膀胱癌尿 液上清外泌体中也含有丰富的IncRNAs,其对外界具有良好的耐受性。因此,分 析尿液外泌体IncRNAs表达谱将为膀胱癌的诊断和预后提供有价值的线索。

本研究首先通过检索文献获得在膀胱癌组织中异常表达且与膀胱癌的发生 密切相关的8个IncRNA分子作为候选分子,如下MALAT1, PCAT-1, SPRY4-IT1,UCA1,MEG3, H19, UBC1 和 TUG1。然后在训练阶段,通过 qRT-PCR 分析了上述8个候选lncRNAs在104例膀胱癌患者和104例健康对照者尿液外 泌体中的表达情况,筛选出在膀胱癌尿液外泌体中差异表达的IncRNA分子。针 对异常表达的IncRNAs在训练阶段样本中的qRT-PCR检测结果,采用多因素 Logistic回归模型构建膀胱癌分子诊断模型。进而在验证阶段,差异表达的 IncRNAs在另外80例膀胱癌患者和80例健康对照者尿液外泌体中进一步验证。 采用受试者工作特征曲线(ROC)评估已建立的尿液外泌体IncRNAs诊断模型 的对膀胱癌的诊断准确性,并与尿液脱落细胞学进行对比分析。为探讨尿液外泌 体IncRNA是否对膀胱癌复发有预后价值,我们随访了验证阶段的膀胱癌患者, 分析差异表达的尿液外泌体IncRNAs与膀胱癌复发的关系,寻找膀胱癌复发的 独立预后因素。

材料和方法

  1. 实验材料

本课题进行过程中使用的所有尿液样本均是在2012年至2017年期间于山东 大学齐鲁医院检验科收集。本课题己获得山东大学齐鲁医院伦理委员会批准,所 有患者均已签署知情同意书。

1.1标本临床资料及标本采集和处理

本课题共纳入184例膀胱癌患者和184例健康对照者,其中表1详细介绍了 研究大群的年龄、性别、以及膀胱癌的临床病理学特征。膀胱癌分期依据国际抗 癌联遞的TNM分期系统(2009版)及世界卫生组织膀胱癌分级系统(2004版 训练阶段和验证阶段所有研究人群的年龄、性别均无统计学差异。

标本釆集必须符合以下标准:①膀胱癌患者尿液标本采集于手术、化疗、放 疗等抗肿瘤治疗前,且患者除膀胱癌之外并无其他类型肿瘤存在;②健康对照者 的尿液样本取自于齐鲁医院体检未发现疾病的健康人;③所有受试人群的年龄均 在46岁到88岁之间。尿液釆集后均在两小时内进行预处理,分别以3500转/ 分离心5min, 10000转/分离心5min,将上清分装入1.5mL的去酶EP管中冻存 于-8(TC待提取外泌体,离心沉淀物送往齐鲁医院病理科做细胞脱落学检查。

1.2主要试剂

  • PrimeScript™ RT reagent Kit: TAKARA 生物科技有限公司;
  • SYBR Premix Ex TaqTAKARA生物科技有限公司
  • Slurry B1:加拿大 Norgen Biotek 公司;
  • Binding Buffer A:加拿大 Norgen Biotek 公司;
  • Lysis Buffer A:加拿大 Norgen Biotek 公司;
  • Wash Solution A:加拿大 Norgen Biotek 公司;
  • 无水乙醇:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;

(DMALATK PCAT-1、SPRY4-IT1、UCA1、MEG3、H19、UBC1、TUG1 和 GAPDH的PCR引物:博尚生物技术有限公司;

  • 2%醋酸双氧铀水溶液:和元生物技术股份有限公司;
  • Glycine:索莱宝科技有限公司;

 

@TRIS:索莱宝科技有限公司;

®甲醇:分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;

⑬Tween-20:索莱宝科技有限公司;

@Albumin Bovine V:索莱宝科技有限公司;

⑮异丙醇:分析纯,天津市富宇精细化工有限公司;

@Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate:美国 Millipore 公司;

4主要仪器设备

  • 高速縢冻离心机:德国ThremElectron公司;
  • 低速赫0机:中国北京白洋医用离心机有限责任公司;
  • 超彳M冰箱:日本松下公司;
  • 微量移液器:德国Eppendorf公司;
  • 生物安全柜济南科及佳商贸有限公司;
  • 制冰机:日本松下公司;
  • 涡旋振荡器济南科及佳商贸有限公司;
  • CFX$96实时荧光定量PCR仪:美国Bio-Rad公司;
  • 4ttC、_20°C冰箱:中国澳柯玛有限公司;
  • 电泳仪:山东爱博科技贸易有限公司;

®West琢nBlot转膜仪:山东爱博科技贸易有限公司;

@Nan©Drop 分光光度计:美国 Thermo Fisher Scientific 公司;

  1. 实验方法 2,1实验设计

首先采用尿液外泌体提取试剂盒(加拿大NorgenBiotek公司)提取膀胱癌患

者尿液中的外泌体,利用透射电镜(TEM)、免疫印迹试验(Western blotting)、 纳米粒径追踪分析(NTA)和流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)四种方法依次 鉴定尿液外泌体。通过检索文献获得在膀胱癌组织中异常表达且与膀胱癌的发生 密切相关的8个IncRNAs作为候选分子,如下:MALAT1,PCAT-1,SPRY4-IT, UCA1,MEG3,H19,UBC1和TUG1。将本研究课题分为两部分即尿液夕卜泌体 IncRNA在training阶段(训练阶段)的筛选和validation阶段(验证阶段)的验 证。首先在训练阶段,通过qRT-PCR分析了上述候选IncRNA在104例膀胱癌患 者和104例健康对照者尿液外泌体中的表达情况。筛选出在膀胱癌尿液外泌体中 差异表达的IncRNA分子。针对异常表达的IncRNAs在训练阶段样本中的qRT-PCR 检测结果,釆用多因素Logistic回归模型构建膀胱癌分子诊断模型。受试者工作 特征曲线(ROC)用于评估该诊断模型对膀胱癌的诊断价值。同时还评估训练阶 段筛选出的差异表达的外泌体IncRNAs在尿液样本中的稳定性。在验证阶段,差 异表达的IncRNAs在另外80例膀胱癌患者和80例健康对照者尿液外泌体中进一 步验证,并采用ROC评估已建立的尿液外泌体IncRNAs诊断模型的对膀胱癌的诊 断效能。此外,还对比了上述诊断模型与尿液脱落细胞学的诊断效能。为了探讨 尿液外泌体lncRNA是否对膀胱癌复发有预后价值,验证组的膀胱癌患者在前2 年每3个月随访评估一次,之后每6个月评估一次。最新的记录是2018年2月 28日。中位随访时间为57个月(范围为4-76个月)。共有45例非浸润性膀胱癌 患者和26例浸润性膀胱癌患者被应用于Kaplan-Meier生存分析,9例患者,包括 5例非浸润性膀胱癌患者和4例浸润性膀胱癌患者因随访信息不完整被排除。通 过Kaplan-Meier方法分析差异表达IncRNAs与上述两组膀胱癌患者五年无复发生 存率(RFS)的关系。将差异表达IncRNAs、年龄、性别、肿瘤病理分期、肿瘤 病理分级以及淋巴结转移情况纳入Cox比例风险回归模型,寻找能够用于预测上 述两组膀胱癌复发的独立危险因素。

2.2尿液外泌体总RNA的抽提和质量控制

提取总RNA之前先打开生物安全柜,紫外灯照射30min。将-80°C冰箱保存的尿 液样本取出在冰上融化。

  • 将融化后的尿液样本于4000转/分离心lOmim留取上清,去除细胞碎片, 然后再次5000转/分离心]0mim每个样本取5mL上清置于10mL高压灭菌离心管中待用。随后加入30〇MLSlunyBl,涡旋40S,在室温下放置15min,使沉淀 剂与外泌体充分接触。
  • 然后室温下2500转/分离心15min,用以沉淀外泌体,轻轻的吸弃上清,尽量 避免重悬起外泌体沉淀物。
  • 加入300 |iLLysisBufferA,充分满旋混勾lmin,室温下静置15min,使裂解

液充分的裂解外泌体。

  • 转移上述裂解液至一新的1.5mL的去酶EP管中,同时加入300 pL 67%异丙 醇,剧烈震荡,充分混匀。
  • 将上述混液转移至尿液外泌体RNA提取试剂盒配备的离心柱中,室温下 14000转玢离心lmin,弃滤液。
  • 加入400 jiL的WashSolutionA,室温下14000转/分离心linin,弃滤液。
  • 重复上述步骤两次。
  • 室龜下14000转/分离心3mim弃收集管。
  • 将柱子安装到一个新的1.5 mL去酶EP管中,加入100uL的ElutionSolutionA, 先室温¥ 2000转/分离心2 min,然后14000转/分离心Imin,RNA存在于管底 的液相中。将提取的总RNA置于冰上待用。

2.3 RNA浓度测定

首先打开电脑及NanoDrop分光光度计,待操作界面准备就绪后,选择测量 类型为单链RNA,开始测量前必须使用双蒸水进行调零。然后吸取1叫的RNA 样本开始测浓度。每次测完样本需用檫镜纸将上样孔檫拭干净,然后双蒸水清洗 上样孔。待所有样本浓度测量完毕使用DEPC水清洗上样孔,并再次调零后即可 关闭N^ioDrop分光光度计。

2.4遊转录PCR

先根据样本数量确定所配体系的体积,然后将配好的体系置于涡旋振荡器轻 微混匀,于4°C离心机上瞬时离心使管侧壁和管盖子上的无液体残留。然后取出 八联管开始上样,每孔加入上述混合体系6pL,随后再加入RNA样本1咫,再用 RNase-freedH20将总体系补充置20吣。打开梯度PCR仪器,设置逆转录反应条 件为:37°C30min,85°C5s,4°C+〇〇。反应完毕后将八联管取出瞬时离心,然后 将获得的cDNA存放于-20°C冰箱。

2.5 qRT-PCR反应

先根据样本数量确定所需配置的混合体系的体积,然后将配好的体系置于涡 旋振荡器轻微混匀,于4°C离心机上瞬时离心使管侧壁和管盖子上的无液体残留。 然后取出八联管开始上样,每孔加入上述混合体系23pL,随后再加入样本cDNA 2卟。打开CFX-96实时荧光定量PCR仪,设置仪器参数为95°C30s,95°C5s, 58°C30s,共45个循环。基因的相对表达量采用rAAQ计算结果,以GAPDH作为 qRT-PCR的内参。

  1. 外泌体透射电子显微镜(TEM)鉴定
  • 首先采用尿液外泌体提取试剂盒(加拿大NorgenBiotek公司)提取膀胱癌患 者尿液(5mL)中的外泌体,制备成外泌体PBS悬液置于冰上备用。
  • 在冰上取20jiL上述外泌体PBS悬液于铜网上,静置lmin,切记用镊子夹铜 网要轻,防止铜网夹破。
  • 用滤纸将样品轻轻吸干,加20队2%醋酸双氧铀水溶液室温染色lmin。
  • 用滤纸沿着边缘将染液吸干,铜网置于白炽灯下烤lOmiiu
  • 将铜网置于透射电子显微镜(^(观丨,02 8^1*,?£1)中,在3001^&〇^8 15,000 to 36,000 magnification.观察拍照,保存图片。
  1. 外泌体表面标志蛋白Western blotting鉴定

首先采用尿液外泌体提取试剂盒(加拿大NorgenBiotek公司)提取膀胱癌患 者尿液(5mL)中的外泌体,按照说明书要求按比例加入lxNuPAGELDS样品 缓冲液(Thermo Fisher Scientific),制备外泌体蛋白。然后按照如下步骤进行外 泌体表面标志蛋白Western blotting鉴定:

  • 清洗和组装玻璃板:在自来水下轻轻擦洗大小两块玻璃板,以去除上次实验 残留的琼脂糖凝胶,使用前必须玻璃板必须烘干,否则会影响灌胶。开始灌胶之 前将玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
  • 灌胶与上样:由于本实验需要检测的蛋白分子是CD9和TSG101,依据抗体说 明书二者分子量皆处于20KD-70KD之间,因此,配制分离胶浓度为10%。按配 胶试剂盒(碧云天)的说明书配制10%分离胶,沿着玻璃轻轻匀速地将分离胶倒 入两块玻璃板之间,切勿晃动。待胶面升到一定高度即可,然后在胶上加入无水 乙醇液封。室温静置30 min。30miri后缓慢倒出无水乙醇,将灌胶支架倾斜使得 残留无水乙醇尽快流出挥发。然后按配胶试剂盒(碧云天)的说明书配置浓缩胶, 浓度为5%。将浓缩胶倒入分离胶上,然后立即插入梳子,静置30 min。将配置 好的凝胶板装入电泳槽中,加入足量的电泳液,小心的拔出梳子,开始上样,上 样前需将蛋白样品煮沸5分钟,然后用微量移液器缓慢的向加样孔中加入20|iL 蛋白样品,避免气泡产生。
  • 电泳:按要求连接正负极,将电压调为80V,待marker全部分散开后,将电 压升高测110V,电泳时间l,5h。
  • 转膜:a.硝酸纤维素膜使用前需要根据目的蛋白分子的条带位置确定膜的大 小,使用前必须先用甲醇激活硝酸纤维素膜;b.在盘子中倒入一定量转膜液, 依次水平放入转膜夹黑面、一块海绵垫、三层滤纸,然后用玻璃棒擀除气泡;c.

然后开始切胶,切胶时应该平稳迅速,防止胶面变干;d.将激活后的硝酸纤维 素膜覆盖在目的胶条上,小心翼翼的除去气泡,然后在其上覆盖三层湿润的滤纸, 再加一层海绵,夹紧转膜夹;e.将转膜夹插入电泳槽中,倒入转膜液使其高度 没过转膜夹的上侧,然后将电泳槽置于冰块中以200inA转膜1.5h。

  • 免疫反应:a.封闭:预先使用AlbuminBovineV (索莱宝科技有限公司)和 TBST配置5%封闭液。待转膜结束以后,取出转膜夹,将硝酸纤维素膜浸没在预 先配制好的封闭液中,室温摇动封闭60 min; b.孵…抗:按照一抗(小鼠抗人 CD9 分子单抗,24KDa,1/1000;小鼠抗人TSG101 分子单抗,50KDa,1/1000) 说明书规定的比例稀释一抗。取出湿盒,将稀释好的一抗滴于孵板上,将转膜后 的硝酸纤维素膜蛋白面朝下覆盖于一抗液滴上,置于4°C冰箱中过夜;c.洗膜: 使用lxTBST浸没硝酸纤维素膜,在脱色摇床上摇动,每次10 min,冼三次;d.孵 二抗:按照二抗(山羊抗鼠,1/5000)说明书规定的比例,稀释二抗,孵育方法 与一抗相同,时间为2h; e.再次洗膜:方法同c。
  • 发光显色:将A、B两种试剂等体积混合,然后滴适量于保鲜膜上,将膜蛋白 面朝下与混合液接触后,将膜移至另一保鲜膜上,放入显影仪中显影。
  1. 外泌体纳米粒径分析(NTA)
  • 预先用试剂盒提取并制备尿液外泌体PBS悬液。
  • 将上述外泌体PBS悬液注入样品池,用盖子封闭。
  • 打开纳米粒径分析仪,放入待测样品,开始上机检测。
  1. 外泌体表面标志蛋白流式细胞仪检测
  • 经抽提分离得到外泌体沉淀。
  • 使用lOOpL经过滤PBS复匀外泌体,密封冰上保存;
  • 样品分别进行CD63和CD81抗体标记,使用不染色外泌体样品的作为阴性 对照。
  • 在BDaccuriC6流式细胞仪镜下检测。
  1. 尿液外泌体IncRNAs稳定性的分析

1) RNaseA孵育

首先收集健康者尿液样本3例(40mL/样本),分成两组(20mL/样本),分

别命名为尿液组以及尿液外泌体RNA组。a.在尿液组,将每个样本平分成四份, 每份5mL,依次进行如下处理:不加RNaseA (索莱宝,R8021-25)、RNaseA赙 育30min、RNaseA赙育60min、RNaseA孵育90min,其中加入的RNaseA比例 是0.01mg/ml。到截止时间立即加入RNase A抑制剂(索莱宝,R8060-1000) (150U/ml),终止反应。上述操作均在室温下进行。然后使用尿液外泌体RNA 提取试剂盒(加拿大NorgenBiotek公司)提取尿液外泌体RNA,逆转成cDNA于 -2(TC冰箱冻存。b.在尿液外泌体RNA组,将每个样本平分成四份,每份5mL, 首先使用尿液外泌体RNA提取试剂盒(加拿大NorgenBiotek公司)提取尿液外泌 体RNA,然后依次对所提取的RNA悬液进行如下处理:不加RNase A、RNase A 孵育30 min、RNase A孵育60 min、RNase A孵育90 min,其中加入的RNase A比 例是賴lmg/ml。到截止时间立即加入RNase A抑制剂(150U/ml),终止反应, 逆转_DNA于-2(TC冰箱冻存待用。上述操作均在冰上进行。最后通过qRT-PCR 评估外泌体MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT1的表达水平。

2) -80°C长时间储存

首先收集徤康者尿液样本3例(20mL/样本),将每个样本平分成四份,每 份5mL,依次进行如下处理:-80°C冰箱存放Omonth、-80°C冰箱存放lmonth、 -80°C冰箱存放2 month、-8(TC冰箱存放3 month。到截止时间立即使用尿液外泌 体RNA提取试剂盒(加拿大Norgen Biotek公司)提取膀胱癌患者尿液外泌体RNA, 逆转成cDNA。最后通过qRT-PCR评估外泌体MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT1的 表达水平。

  1. 数据处理及统计分析

采用计算法得出ln_A的相对表达量,由于其分布情况不符合正态分 布,后续的检验釆用非参数秩和检验进行分析;LncRNA在膀胱癌组和对照组间 的表达差异采用Mann-Whitney U检验进行分析;LncRNA诊断模型是通过釆用 Matlab软件(MATLAB, R2014a,Natick, USA)进行Logistic回归分析所建立 的。ROC用于评估IncRNA及诊断模型的诊断效能,该过程是在MEDCALC 15.2.2 (MedCalc,Mariakerke,Belgium)统计软件上进行。Kaplan-Meier生存分析用 于分析膀胱癌复发相关指标。Cox比例风险回归模型用于确定复发预测的独立预 后因素•所有统计学数据分析采用SPSS STATISTICS 22.0 (IBM,Chicago, IL,USA)。PC0.05被认为有统计学差异。

结果

  1. 尿液外泌体的鉴定

为确定所提取的沉淀为外泌体,本实验首先通过尿液外泌体试剂盒提取膀胱 癌患者尿液中的外泌体,制备成一定浓度的外泌体悬液待用,然后通过TEM、 western blotting, NTA和流式细胞仪表面标志物检测对外泌体进行鉴定。透射电 子显微镜结果显示,外泌体为直径60-150 nm的茶托状有被小泡,稳定存在于 PBS平衡盐溶液中(图la)。Western blotting结果显示,提取的尿液外泌体蛋白 裂解液中含有外泌体特征性的蛋白分子TSG101和CD9 (图1 b)。使用 ZETASIZERNanoseries-Nano-ZS仪器分析提取的外泌体悬液,检测到粒子平均 粒径以及主峰均在夕卜泌体的粒径范围内,其中20nm -200nm范围占98.1%,与外 泌体的粒径分布相吻合(图1 c)。使用荧光直标抗体CD63和CD81结合BDaccuri C6flewcytomenter流式细胞仪分析外泌体悬液中CD63和CD81两个外泌体特 异性蛋白分子的表达情况,得到的经染色后外泌体均呈阳性,其中CD63的阳性 率为90.9%,CD81的阳性率为93.6% (图1 d)。综上所述,TEM、外泌体标志 蛋白western blotting检测、外泌体NTA以及流式细胞仪外泌体表面标志物检测 结果均征实尿液中存在外泌体,为进一步研究外泌体标志物奠定前期基础。

  1. 运用qRT-PCR筛选IncRNA分子

通过检索文献获得在膀胱癌组织中异常表达且与膀胱癌的发生密切相关的8 个 IncRNA 分子作为候选分子,如下MALAT1,PCAT-1,SPRY4-IT1,UCA1, MEG3, H19, UBC1和TUG1。本研究课题分为两部分即尿液外泌体IncRNA在 training阶段(训练阶段)的筛选和validation阶段(验证阶段)的验证。首先 在训练阶段,我们抽提了 104例膀胱癌患者和104例健康对照者尿液外泌体中的 RNA,然后釆用qRT-PCR分析了上述8个候选IncRNA分子在尿液外泌体中的 表达情况,以筛选出差异表达的IncRNA分子。其中筛选分子的标准是:(1)所 有样本中的尿液外泌体lncRNAs经qRT-PCR扩增以后的Ct值均小于35; (2) 表达该尿液外泌体IncRNA分子的样本数量占总样本量的比例不能低于75%; (3 ) IncRNA在膀胱癌组和健康对照组的表达具有统计学差异(i> <0.01)。通过 qRT-PCR分析,依据上述筛选标准,MALAT1, PCAT_1及SPRY4-IT1的表达

水平在膀胱癌患者尿液外泌体中明显高于健康对照人群(均p<0.001)(图2a-c)。 ROC曲线分析评估三个尿液外泌体IncRNA分别诊断膀胱癌的效能,3个分子的 AUC (ROC 曲线下面积)分别为 0.844 (95%Cl = 0.787-0.890,灵敏度=72.1% 和特异度=84.6%),0.832(95% CI=0.774 - 0.880,灵敏度=72」% 和特异度=81.7%) 以及 0.760(95%C1=0.696 - 0.817,灵敏度=66.3% 和特异度=76.9%),(图 2d-f)。 随后,在训练阶段,我们选取了另外80例膀胱癌患者和80例健康对照者尿液样 本,进一步验证上述三个尿液外泌体IncRNA分子的表达情况,同样,尿液外泌 体MALAT1,PCAT-1及SPRY4-IT1在验证组得到的异常表达趋势与训练组的 一致(表2)。尿液外泌体MALAT1,PCAT-1及SPRY4-IT1的表达水平在膀胱 癌患者尿液外泌体中明显高于健康对照人群(均P<〇.〇〇l)(图3a-c)。3个分子 诊断膀胱癌的AUC分别为0.785 (95% CI = 0.714-0.846,灵敏度=78.7%,特异度= 67.5%),0.810 (95%可信区间为 0.741-0.868,灵敏度=71.2%,特异度=80.0%)和 0.799(95%可信区间为 0.728-0.858,灵敏度=87.5%,特异度=65%)(图 3d-f)。

3.尿液外泌体IncRNAs稳定性

作为一个良好的诊断生物标志物,其最基本的要素就是应当在体液中具备良 好的稳定性,因此为了验证我们筛选出来的尿液外泌体IncRNAs稳定性,确定 外泌体的双层膜结构是否能够保护其所含IncRNA分子,我们选取了以下两种实 验来进行证明:(1)分别对同一批健康人的尿液及所提取的外泌体IncRNAs用 RNase A孵育Omim 30mim 60min和90min,分析外泌体膜能否保护其内的 IncRNA分子免受RNA酶的降解;(2)将同一批健康人的尿液样本等体积分别 保存在-80°C冰箱0、1、2和3个月,观察-80°C环境长期储存是否会影响尿液外 泌体中的IncRNAs的含量。第一个实验结果表明,尿液在经过Rnase A孵育Omin, 30min,60min和90min后,其外泌体内的IncRNAs表达量并无明显变化(图4a-c); 而所提取的相同一批健康人的尿液外泌体IncRNA在经过Rnase A孵育30min后 就开始被降解(图4d-f)。以上实验表明外泌体膜可以保护外泌体中的IncRNA 分子免受RNA酶的降解。第二个实验结果表明,尿液在经过-80°C保存1、2和 3个月后,其外泌体内的IncRNAs表达量并无明显变化(图4g-i),表明尿液可 以在-80 °C环境中长期储存,此举不会对尿液外泌体内的IncRNAs含量造成影 响。综上所述,外泌体对其所含的IncRNA具有保护作用,表明尿液外泌体具有良好的稳定性,可以作为膀胱癌诊断标志物的优势载体。

  1. 建立尿液外泌体IncRNA分子诊断模型

多项研究表明肿瘤标志物联合检测可以提高肿瘤标志物诊断效能,因此为了 进一步探索己筛选出的尿液外泌体MALATl,PCAT-1及SPRY4-IT1是否可以 通过联合检测进一步提高诊断效能,我们针对上述三个异常表达的尿液外泌体 IncRNA分子在训练阶段标本中的qRT-PCR的检测结果,采用Logistic多元回归 分析建立分子诊断模型:Logit (P=BC) = 0.6577 - 0.0695xMALATl - 0.0686xPCAT-l -0.0015XSPRY4-IT1。采用R0C曲线分析该模型对膀胱癌的诊断 效能,其 AUC 为 0.854 (95% 0=0.799-0.899,灵敏度=70.2%,特异度=85.6%, 图 5a)。

  1. 验证尿液外泌体IncRNA分子诊断模型

为了进一步验证上述尿液外泌体IncRNA分子诊断模型用以区分膀胱癌患者 和徤康人的诊断效能,我们又将验证阶段中的尿液外泌体MALAT1, PCAT-1及 SPRY4-IT1基因的相对表达量;代入到上述诊断模型中,采用R0C曲线分 析该诊断模型的AUC为0.813 (95%CI=0.744-0.870,灵敏度=62.5%,特异度= 85.0%,图5b),进一步验证表明我们建立的诊断模型对于膀胱癌具有较高的诊 断效能。

目前临床上用于膀胱癌诊断的无创检测手段最常见的就是尿液脱落细胞学 检测,然而,多项研究证实其在低级别膀胱肿瘤的鉴定中是相对无效的。此外, 良性疾病如膀胱内炎症,亦可引起细胞形态的变化,与膀胱癌细胞很难区分。因 此我们统计了验证阶段研究人群的尿液脱落细胞学检查结果,采用R0C曲线分 析了尿液脱落细胞学对膀胱癌的诊断效能,其AUC为0.619(95% CI=0.539-0.694, 灵敏度=25%,特异度=98.7%,图5c)。以上数据表明,我们所建立的尿液外泌体 IncRNA分子诊断模型的诊断效能(AUC=0.813,图5b)明显高于尿液脱落细 胞学(AUO0.619,户 <0.001)。

  1. 尿掖外泌体IncRNA分子表达与膀胱癌患者临床病理学特征 的_性分析

我们分析了尿液外泌体MALATl,PCAT-1及SPRY4-IT1与验证组膀胱癌患者临床病理特征的相关性。统计分析结果表明,尿液外泌体PCAT-1和 SPRY4-IT1的表达量增高与膀胱癌TNM分期显著相关(均P<0.05)。然而,我 们没有发现这三个IndlNA分子与患者的年龄、性别、肿瘤分级以及淋巴结转移 之间有任何显著的相关性(均尸>0.05)(表3)。

7.尿液外泌体lncRNA分子与膀胱癌患者无复发生存期(RFS)

的相关性分析

为了探讨尿液外泌体IncRNA是否对膀胱癌复发有预后价值,验证阶段的膀 胱癌患者在前2年每3个月随访评估一次,之后每6个月评估一次。最新的记录 是2018年2月28日。中位随访时间为57个月(范围为4-76个月)。共有45例 非浸润性膀胱癌患者和26例浸润性膀胱癌患者被纳入后续生存分析中,有9例 患者,包括5例非浸润性膀胱癌患者和4例浸润性膀胱癌患者因随访信息不完整 被排除。在非浸润性膀胱癌患者组,Kaplan-Meier生存分析结果显示,尿液外泌 体MALAT1和PCAT-1高表达患者的五年无复发生存率(RFS)明显低于相应的 低表达组(尸=0.002,尸<0.001,图6a-b)。随后进行单因素Cox比例风险回归分 析,非浸润性膀胱癌患者组的RFS与尿液外泌体PCAT-1 (尸=0.001 )、MALAT1 (P =0.005)及肿瘤分期(尸=0.001)具有统计学的相关性。将上述结果(包括 尿液外泌体PCAT-1、MALAT1和肿瘤分期)纳入多因素Cox比例风险回归进一 步分析,发现尿液外泌体PCAT-1 (P=0.018)和肿瘤分期(P = 0.036)是非浸润 性膀胱癌RFS的独立预后因素(表4)。然而在浸润性膀胱癌患者组,生存分析 显示尿液外泌体MALAT1,PCAT-1及SPRY4-IT1的表达量均与RFS无关,单变 量Cox比例风险回归分析也显示尿液外泌体MALAT],PCAT-1及SPRY4-IT1 的表达量、患者年龄、性别、肿瘤分期、分级以及有无淋巴结转移均与浸润性膀 胱癌患者组的RFS无关(均0.05,表5)。

讨论

非浸润性膀胱癌(Ta、Tis、T1)大约占膀胱癌总数的70%,临床上针对这 类肿瘤的治疗方案主要是经尿道膀胱肿瘤电切术,辅以膀胱内化疗或免疫治疗。 该类型膀胱癌最大的特点就是容易复发,据统计约有70%的患者术后会复发,部 分患者甚至会进展为浸润性膀胱癌或者远处转移。因此该类型患者术后需要定期 做膀胱镜检查以监测肿瘤是否复发,故检查过程中的疼痛会给患者带来极大的痛 苦。除此之外定期膀胱镜复查以及复发后多次经尿道膀胱肿瘤电切术需要耗费一 大笔昂贵的医疗费用,给患者及其家庭带来巨大的经济压力[5]。因此,对膀胱 癌进行准确的早期诊断、开展及时有效的早期治疗以及研发新的无创性的复查手 段是改善膀胱癌预后、降低膀胱癌复发率和死亡率的关键,同时也给患者及其家 庭带来福音。目前膀胱镜病理活检、尿脱落细胞学检测以及影像学检查是临床上 用于膀胱癌诊断的主要技术手段。但是膀胱镜病理活检给患者带来明显的疼痛、 紧张、焦虑等不适感,进而影响到患者复查的依从性。而尿液脱落细胞学检测灵 敏度低,且与膀胱内良性疾病难以区分[9]。近年来随着生物学技术的迅猛发展, 有关膀胱癌病理机制的研究以及诊疗技术的研发已经取得长足的进步,但是肿瘤 的发生发展是一个纷繁复杂的病理过程,能够用于膀胱癌早期诊断和预后评估的 高效且无创的生物标志物仍未被医学界发现,因此这已成为广大医学研究者亟待 突破的难题。

近年来,随着分子技术的飞速发展,外泌体悄然成为生物医学的热门研究领 域。外泌体是活细胞通过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成的膜性囊 泡,广泛存在于多种体液中,包括血液、尿液、唾液、胸腹水等。目前认为外泌 体调控肿瘤发生的分子机制主要是作为重要的细胞间物质和信息交流的工具。随 着外泌体研究的日趋深入,外泌体在肿瘤诊断上的意义已经突显出来。研究表明, 外泌体lncRNAs可用于区分肿瘤细胞和正常细胞,其表达水平也反映了肿瘤细胞 病理状况的动态变化以及疾病状态[41]。因此,有越来越多的学者致力于深入研 究外泌体hicRNAs与肿瘤进展机制,并深度剖析肿瘤特异性外泌体IncRNAs表达 谱,以期找到恶性肿瘤分子诊断与靶向治疗的切入点[42]。外泌体作为肿瘤标志 物的优势是目前很多生物标志物所无法比拟的,例如:外泌体脂质双层膜是天然 的保护屏障,可以保护IncRNAs不被降解;肿瘤细胞释放的外泌体,其内包含了

多种肿瘤相关生物活性物质,能够更加准确的反应肿瘤病理状况的动态变化过程, 比传统的肿瘤标志物更特异、更实时;肿瘤细胞释放的外泌体广泛存在于多种体 液中,如血液和尿液,相比于组织样本,更易收集且具有无创性,此外可在病情 发展过程中及时监测分子标志物的变化。因此研究外泌体IncRNAs作为一种无创 液体活检生物标志物,不仅能够动态反应肿瘤整体分子信息,而且可通过反复取 样实现大规模肿瘤筛查、诊断和预后监测,优势显著[43]。Lin LY等[44]利用RNA 测序技术分别对5例健康对照者、10例I期胃癌患者的血浆以及4组人原发性胃 上皮细胞和胃癌细胞培养上清进行了外泌体RNA表达谱分析,研究发现,外泌 体IncUEGCl的表达水平在I期胃癌患者组以及胃癌细胞组均显著高于对照组, IncUEGCl在区分早期胃癌患者与健康个体时AUC为0.876,其诊断的准确性明 显高于癌胚抗原,从而得出肿瘤源性外泌体IncUEGCl在早期胃癌的诊断中具有 很大的潜在应用价值。Xu H等[45]通过TaqMan PCR对训练组和验证组研究人群 的血清外泌体InRNAs表达情况进行评估,发现肝细胞癌患者组的血清外泌体 lnRNAsENSG00000258332.1和LINC00635的表达水平明显高于其他各组,并且 与门静脉肿瘤栓塞、淋巴结转移、TNM分期以及总生存率显著相关,与此同时 还发现血清外泌体ENSG00000258332.1、LINC00635与血清AFP联合检测可以 提高肝细胞癌的诊断灵敏度和特异度,具有更高的诊断价值。Zhang等[46]发现 非小细胞肺癌血清外泌体MALAT1的表达水平与肿瘤分期和淋巴转移显著正相 关,提示血清外泌体MALAT1有望成为非小细胞肺癌诊断和预后的非侵袭性的 生物标志物。

液体活检技术的出现,标志着人类在攻克肿瘤的道路上又前进了一大步。液 体活检作为一种无创诊断技术,包括游离循环肿瘤细胞(CTCs)检测、循环肿 瘤DNA (ctDNA)检测、外泌体及循环RNA (CirculatingRNA)检测等,与传统 的组织活检相比,液体活检具备微创性、实时动态检测、提供全面检测信息等独 特优势,为肿瘤诊断和预后提供早期预测的依据[47]。尿液外泌体作为液体活检 的一个重要分支,近年来一直备受关注[48]P Rodriguez M等[49]采用高通量测序 技术分析了 20例前列腺癌患者和9例健康男性患者的尿液外泌体micmRNAs, 发现 5 个 microRNAs (miR-196a-5p,miR-34a-5p,miR-143-3p* miR-501-3p 和 miR-92a-l_5p )在前列腺癌患者尿液外泌体中明显低表达,随后通过qRT-PCR 在更多的样本量进行筛选验证,最终得出miR-196a-5p和miR-501_3p可作为诊 断前列腺癌的非侵袭性生物标志物。I§mM等[50]通过qRT-PCR检测了 30例前列 腺癌患者和49例前列腺良性增生患者尿液样本中的外泌体GAS5和lincRNA-p21 的表达水平,发现前列腺癌患者和前列腺良性增生患者的外泌体lincRNA-p21水 平存在显著差异。这些数据表明,尿液外泌体IinCRNA_P21可用于鉴别前列腺癌 患者与前列腺良性增生患者,有助于提高对前列腺癌患者恶性状态的诊断预测。 2016年9月7日Exosome Diagnostics公司宣布其开发了一种非侵入性尿液检测方 法:ExoDx®Prostate(IntelliScore)(EPI),该EPI测试结合专有算法分析尿液的外 泌体RNA的3个生物标志物,通过美国26家泌尿外科中心纳入的1500多名患者 临床评价研究,证实该EPI测试能够更准确地预测患者是否患有高分级前列腺癌 (Gleason评分为7或更高),并且因此有可能避免初始活检带来的不适、并发症 和费用。该方法已经获得FDA批准[51]。利用从尿液外泌体中捕获的疾病信息, 为临床医生提供实时的肿瘤诊断和预后评估的依据,从而选择及时有效的治疗方 法、改善病人预后、避免不必要的检查程序以及降低总体医疗费用,这正是液体 活检的使命所在。临床检测的尿液样本可以实现无创采集,这是其作为理想的生 物标志物来源的主要优势,釆集过程相比于血液、腹水等其他体液更加快速且性 价较高。此外对于泌尿系统恶性肿瘤…膀胱癌而言,尿液外泌体更是具备得天独 厚的检测优势,因为膀胱癌细胞浸没于尿液中,可直接分泌外泌体进入尿液,促 进内皮细胞管形成和肿瘤进展[40]。因此尿液外泌体能够直接反映膀胱癌的病理 学状态,并且可以实现对患者术后和药物治疗过程中的实时动态监测。因此尿液 是研究膀胱癌生理和病理的一个很好的样本来源。目前己经有研究人员成功地从 膀胱癌患者尿液中分离出外泌体,并发现在膀胱癌患者和健康人尿液外泌体之间 具有不同的RNA表达谱[52]。然而,有关尿液外泌体IncRNAs作为膀胱癌诊断标 志物的研究仍比较少见。在本研究中,我们首先通过TEM、NTA、流式细胞术和 Western blotting分析验证了尿液中外泌体的存在性。通过检索文献获得在膀胱癌 组织中异常表达且与膀胱癌的发生密切相关的8个IncRNA分子(MALAT1, PCAT-1,SPRY4-IT1,UCA1,MEG3,H19,UBC1 和TUG1)作为候选分子。 然后通过qRT-PCR在两组独立研究人群中筛选并评估了上述八个候选IncRNA分 子在尿液外泌体中的表达情况,发现3个IncRNA分子(MALAT1,PCAT-1和

SPRY4-IT1)在膀胱癌患者尿液外泌体中显著高于健康对照人群(均尸<0.001)。 ROC曲线分析结果显示上述三个分子用于诊断膀胱癌的AUC、灵敏度和特异度 均比较高。我们的此项研究为膀胱癌液体活检开辟了一条全新的无创性的检测途 径。

LncRNAs参与调解了多种重要的细胞信号活动,如基因表达、招募染色质修 饰物、调解X染色体失活(XIST)、基因组印记、蛋白质折叠和蛋白质活性等, …旦异常表达则可能会导致体内生物学功能紊乱,进而导致恶性肿瘤的发生发展 [53]。本研究发现的三个膀胱癌尿液外泌体IncRNA分子(MALAT1,PCAT-1和 SPRY4-IT1)在肿瘤的发生发展过程均发挥不同程度的致癌作用。MALAT1最早 发现于非小细胞肺癌中,定位于人染色体llql3.1上,因其参与非小细胞肺癌的 转移而被命名。后续研究发现MALAT1在多种肿瘤中异常表达,包括肝细胞癌、 膀胱癌及宫颈癌等,通过与细胞核内多种蛋白质相互作用,在转录以及转录后水 平参与基因表达调控[54]。Xie H[55]等采用CR1SPR技术发现MALAT1能够抑制 成熟的miR-125b的表达,并增加其靶基因(Bcl-2和MMP-13)的表达,但对 pri-miR-125b和pre-miR-125b没有影响。他们通过Pull Down技术,利用生物素标 记的MALAT〗-RNA探针能够捕获Ago2蛋白和miIM25b,从而发现MALAT1对 miR-125b的负调控依赖于Ag2蛋白。另有研究发现,TGF-p诱导发生EMT的膀 胱癌细胞中MALAT1的表达明显升高,体内、外实验均证实MALAT1与zestel2 抑制因子(suzl2)相关,这种关联导致EMT相关蛋白标志物E-cadherin表达下降, N-cadherin和纤连蛋白表达增加。靶向抑制MALAT1或suzl2以后,能够抑制 TGF-p诱导的膀胱癌EMT效应,并在动物模型中证明了MALAT1或suzl2基因敲 除能够抑制肿瘤转移[56]。这些数据表明,抑制MALAT1可成为阻止膀胱癌继续 恶化的一种治疗选择。PCAT-1是前列腺癌相关转录本1 (prostate cancer-associated transcripts 1),最早发现于前列腺癌中,作为一个转录调节子, 在前列腺癌的进展中发挥关键作用[57]。近年来,发现其在膀胱癌组织中也高表 达。LiuL等[58]发现PCAT-1在膀胱癌组织中的表达水平显著高于正常尿路上皮。 在膀胱癌细胞T24和5637中敲减PCAT-1以后,其细胞增殖受到抑制,而凋亡明 显增加,表明PCAT-1在膀胱癌发生发展中也发挥重要作用。SPRY4-IT1位于人 染色体5q31.3上,最早被发现于黑色素瘤细胞中,参与黑色素瘤细胞的侵袭和 转移[59]。后续研究发现,SPRY4-IT1参与多种肿瘤的进展,其中包括膀胱癌。 有研究通过体内、外功能实验发现,SPRY4-IT1基因的表达下调可抑制膀胱癌细 胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进肿瘤细胞凋亡。机制实验发现SPRY4-IT1可 以直接与miR-101-3p相互作用,下调miR-101-3p,从而可以有效逆转miR-101-3p 对EZH2的抑制作用。因此,SPRY4-IT1通过与miR-101-3p的海绵作用正向调控 EZH2的表达,并在膀胱癌进展中发挥致癌作用[60]。该研究阐明了IncRNA SPRY4-IT1作为miRNA海绵在膀胱癌中的作用,并为IncRNA指导的膀胱癌诊断 和治疗提供了新思路。以上一系列有关MALAT1,PCAT-1和SPRY4-IT1在膀胱 癌中功能机制的研究,为我们的研究结果提供了有力的理论依据,并进一步证实 这三种尿液外泌体来源的IncRNA作为膀胱癌诊断的生物标志物的具有重大的潜 在应用价值。

肿瘤的发生发展所涉及的病理生理极为复杂,单一的通路机制无法诠释整个 疾病的全局,因此仅通过某一个肿瘤相关IncRNA分子无法给临床医生提供更可 靠的肿瘤诊断依据。临床研究证实肿瘤标志物的联合检测不仅能够明显提高肿瘤 的筛查鉴别能力,而且可以提高诊断肿瘤的准确度、灵敏度和特异度。本课题组 长期致力于非编码RNA作为肿瘤标志物的基础与临床研究,构建的膀胱癌血清 miRNA诊断模型以及IncRNA诊断模型均具备较高的诊断效能,但是目前关于尿 液外泌体IncRNA诊断模型在膀胱癌中的应用研究尚不存在,因此,我们结合临 床无创诊断的需求,独辟蹊径,通过比较膀胱癌患者与健康人IncRNA分子的表 达差异,筛选出三个膀胱癌尿液外泌体特异性IncRNA分子,并将其纳入多元 Logistic回归模型中,建立了尿液外泌体IncRNAs诊断模型:Logit (P) = 0.6577 - 0.0695><MALAT1 -0.0686xPCAT-l -0.0015xSPRY4-ITl,发现其用于区分膀胱癌 与健康个体的AUC为0.854,且诊断效能明显优于传统的尿液细胞学检查。

目前临床用于非浸润性膀胱癌的常规治疗方法主要是经尿道膀胱肿瘤切除 术(TURBT)和术后膀胱内灌注化疗(IPOIC) [6]。但是仍有70%的患者复发, 约15%的患者将在5年内进展为浸润性膀胱癌。因此,非浸润性膀胱癌患者需要 定期行膀胱镜复查,给患者带来极大的心理负担。由于分子水平的变化通常提前 于形态学的变化,因此尿液外泌体分子生物标志物,作为一种无创性的肿瘤生物 学行为监测指标,可提供更早、更精确的复发预测。考虑到这一点,我们进一步

研究了尿液外泌体IncRNA分子是否可以作为非浸润性膀胱癌患者复发预测的指 标。我们随访了验证阶段的膀胱癌患者,共有45例非浸润性膀胱癌患者被应用 于Kaplan-Meier■生存分析,有5例非浸润性膀胱癌患者因随访信息不完整被排除。 结果显示,尿液外泌体MALAT1和PCAT-1高表达患者的五年无复发生存率(RFS) 明显低于相应的低表达组。此外多因素Cox比例风险回归分析发现尿液外泌体 PCAT-1是非浸润性膀胱癌复发的独立预后因素。另冇其他学者研究发现PCAT-1 表达升高与胃癌以及肝细胞癌预后不良显著相关,进…步表明该分子在肿瘤患者 预后中发挥重要作用[61-62]。综上所述,我们的研究为探索非浸润性膀胱癌复发 预测的无创性检测指标开辟了一条全新的途径,既可减免膀胱镜定期复查带来的 不适感,也具备早期发现的潜在优势。

除上述创新之处以外,与以往研究相比,我们的此项研究还具备以下优势。 首先是我们选取了训练阶段和验证阶段两大独立研究人群来验证标志物以及模 型的诊断效率,纳入的尿液样本数量较多,且更加严谨和系统。其次,考虑到一 个良好的生物标志物最基本的要素就是在体液中的稳定性,因此本研究还系统评 估了尿液外泌体的稳定性。通过RNase A孵育和-80°C环境长期储存这两组实验, 我们证明外泌体对其所含的IncRNA具有保护作用,表明尿液外泌体具有良好的 稳定性,可以作为膀胱癌诊断标志物优势载体。

综上所述,本研究发现外泌体MALAT1,PCAT-1和SPRY4-IT1在膀胱癌患 者尿液中显著升高,将这三个分子纳入Logistic多元回归分析,构建了膀胱癌诊 断模型,并发现该模型用于区分膀胱癌与健康人具有较高的诊断效能,明显优于 传统的尿液脱落细胞学检查。此外我们还发现尿液外泌体IncRNA PCAT-1可以 作为非肌层浸润性膀胱癌患者复发监测的预后指标。我们此项研究为膀胱癌诊断 和预后评估开辟了一条新的非侵袭性的检测途径。

结论

  1. 本研究通过提取和分析尿液外泌体的IncRNAs,发现外泌体MALAT1,PCAT-1

和SPRY4-IT1在膀胱癌患者尿液中表达升高,可作为膀胱癌诊断的潜在肿瘤 标志物。

  1. 基于多元Logistic回归分析构建膀胱癌诊断模型1^〇£社〇>) = 0.6577 -
  2. 0695xMALATl -0.0686xPCAT-l -0.0015xSPRY4-ITl,其诊断效能AUC 明

显高于尿液脱落细胞学。

  1. 尿液外泌体IncRNAPCAT-l可以作为非浸润性膀胱癌患者复发的独立预后指 标,为膀胱癌预后监测开辟了新的非侵袭性的检测途径。

ISG101 •*            •          _*                 50KU

图1:尿液外泌体的特征。(a)外泌体透射电镜;(b)外泌体标志蛋白CD9 和TSG101 Western Blotting;   (c)外泌体粒径分析;(d)外泌体流式细胞仪表面标志物检测。

Figure 1: Characterization of UEs. (a) UEs were analyzed under TEM which exhibited a cup-shaped membrane morphology with a diameter of 60-150nm. Typical exosomes were highlighted using white arrows. Left figure: scale bar = 200nm; Right figure scale bar = lOOnm. (b) UEs-enriched protein markers including CD9 (24KD) and TSG101 (50KD) were analyzed by Western blotting in exosomes (E) and exosome-depleted supernatant (EDS). Three urine samples were used, (c) The sizes of urine exosomes were characterized via the NTA characterization system and the majority of vesicle particles were mainly between 60 and 150 nm in diameter, (d) Flow cytometry analysis was performed to detect the positive rate of CD63 and CD81 specific antibodies on the surface of exosomes.

图2:尿液外泌体IncRNA MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT1的差异表达趋势及 其检测膀胱癌的诊断效能。使用qRT-PCR检测膀胱癌患者组(ii=104)和健康 对照组(n=104)中尿液外泌体 IncRNAMALATl (a)、PCAT-l (b)和 SPRY4-IT1

  • 的表达水平(户<0.001)。ROC曲线分析显示尿液外泌体IncRNAMALATl
  • 、PCAT_1 (e)和SPRY4-IT1 (f)在训练组中对膀胱癌的诊断效能。*** 表示尸<0.001。

Figure 2. Concentrations of UE-derived MALAT1, PCAT-1 and SPRY4-IT1 and their diagnostic performance for detection of BC. Concentrations of UE-derived MALAT1 ⑻,PCAT-1 (b) and SPRY4-IT1 (c) in BCs (n=104) vs. healthy controls (n=104) using qRT-PCR assay in the training set (P<0.001). ROC curve analysis showing the diagnostic performance for BC of UE-derived MALAT1 (d), PCAT-1 (e) and SPRY4-IT1 (f) in the training set. *** represents P <0.001.

图3:验证尿液外泌体IncRNA MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT1的差异表达趋 势及其检测膀胱癌的诊断效能。使用qRT-PCR检测验证组膀胱癌患者(n=80) 与健康对照(n=80)中尿液外泌体IncRNA MALAT1 (a)、PCAT-1 (b)和 SPRY4-IT1 (c)的表达水平(P<0.001 )。ROC曲线分析显示尿液外泌体IncRNA MALAT1 (d)、PCAT-1 (e)和SPRY4-IT1 (f)在验证组中对膀胱癌的诊断效 能。***表示尸<0.001。

Figure 3. Validation of UE-derived MALAT1, PCAT-1 and SPRY4-IT1 as biomarkers for BC diagnosis and their diagnostic performance. Concentrations of UE-derived MALAT1 (a), PCAT-1 (b) and SPRY4-IT1 (c) in BCs (n=80) vs. healthy controls (n=80) using the qRT-PCR assay in the validation set (P<0.001). ROC curve analysis showing the diagnostic performance for BC of UE-derived MALAT1 (d), PCAT-1 (e) and SPRY4-IT1 (f) in the validation set. *** represents P <0.001.

图4:尿液外泌体IncRNA的稳定性。尿液组和尿液外泌体RNA组分别与RNase A孵育Omin、30min、60min和90min。RNase A对尿液组外泌体IncRNA水平无 影响(a-c)。而尿液外泌体RNA组在30 min内经过RNase A处理完全降解(d-f)。 尿液样本在-80°C的环境存放1个月、2个月和3个月,这种处理方式对尿液外泌 体IncRNA的含量无影响(g-i)。*代表户<0.05, **代表户<0.01, ***代表尸<0.001。 Figure 4. Stability of UEs. Urine group and exosome isolated nucleic acids group were incubated with RNase A for 0, 30, 60, and 90 minutes, respectively. RNase A had no effect on the level of exosomal IncRNAs in urine group (a-c). However, exosome isolated nucleic acids group were completely degraded by the treatment of RNase A within 30 min (d-f). Urine samples were incubated at -80 °C for 1, 2, and 3 months, and this treatments had no effect on the level of exosomal IncRNAs (g-i).* represents P <0.05, ** represents P <0.01, *** represents P <0.001.

图5:评估尿液外泌体IncRNA诊断模型和尿液脱落细胞学对膀胱癌的诊断价值。 使用ROC分析尿液外泌体IncRNA诊断模型在训练组(a)和验证组(b)中对 膀胱癌的诊断价值;ROC分析尿液脱落细胞学对验证组膀胱癌的诊断价值(c)。 Fig. 5: Evaluation the diagnostic performance of 3-lncRNA panel and urine cytology for BC diagnosis. ROC analysis was used to evaluate the performance of 3-lncRNA panel for the detection of BC in the training set (a) and in the validation set (b); ROC analysis revealed the diagnostic performance of urine cytology for BC diagnosis in the validation set (c).     Months

图6:尿液外泌体IncRNA MALAT1和PCAT-1在非浸润性膀胱癌患者中的复发 预测价值。Kaplan-Meier分析显示,验证组尿液外泌体lncRNAMALATl (a) 和PCAT-1 (b)的表达升高与非浸润性膀胱癌患者无复发生存率较低有关。

Fig. 6: Recurrence prediction of UE-derived MALAT1 and PCAT-1 expression for NMIBC. Kaplan-Meier curve revealed that overexpression of UE-derived MALAT1 (a) and PCAT-1 (b) was relative to a poor recurrence-free survival in NMIBC patients from the validation set.

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