LncRNADlx6-osl在糖尿病肾病小鼠蛋白尿及足细胞损伤中的作用论文

2020年2月27日19:55:29LncRNADlx6-osl在糖尿病肾病小鼠蛋白尿及足细胞损伤中的作用论文已关闭评论

LncRNADlx6-osl在糖尿病肾病小鼠蛋白尿及足细胞损伤中的作用论文

摘要

糖尿病肾病是糖尿病最严重的微血管并发症之一,也是终末期肾病的主要 原因。目前,糖尿病肾病的发病机制复杂,未发现确切的发病机制。近些年来 的研究表明,在高血糖导致的一系列肾脏组织损伤中,足细胞的损伤和数量减 少的白蛋白尿的出现被认为是糖尿病肾病的主要原因。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。是近年 来的研究热点,作用广泛,可从细胞分化、细胞周期、表观遗传等多个层面调 控基因表达。Wnt信号通路介导足细胞损伤的重要途径。糖原合成酶激酶 (GSK-3P)是Wnt信号通路的关键分子之一,在足细胞损伤中起着至关重要的 作用。我们前期实验结果发现,高糖条件下培养的足细胞中GSK-3P表达升高, 足细胞损伤蛋白表达升高,足细胞损伤。然而,LncRNADlx6-osl升高在蛋白尿 的发生和足细胞损伤发展中的作用尚不清楚。

目的:

  1. 明确LncRNADlx6-osl在糖尿病肾病小鼠肾组织中的表达。

2、 确定LncRNADlx6-osl导致足细胞损伤及蛋白尿的作用。

将遗传背景为C57BLKS/J的雄性db/db及同窝出生的db/m小鼠,随机编号分 组,(无干预组)db/m 14w、db/m 22w、db/db 14w、db/db22w,(过表达慢病 毒组)db/m+saline、db/m+con-LV、db/m+Dlx6-osl 4w、db/m+Dlx6-osl 12w(shRNA 慢病毒组)db/db+saline、db/db+con-shRNA、db/db+Dlx6-osl shRNA4w、db/db+ Dlx6-oslshRNA12w,适应性饲养一周,每周监测小鼠血糖,点式白蛋白。在 小鼠出现微量白蛋白尿时db/db组注射带有足细胞特异性标记NPHS2的LncRNA Dlx6-osl shRNA慢病毒(滴度为lxl〇8TU/只),对照组分别注射生理盐水及无 义慢病毒(滴度为lxlO8 TU/只),同时期db/m组注射带有足细胞特异性标记 NPHS2的过表达LncRNADlx6-osl(滴度为lxl08TU/只)慢病毒,对照组分别注 射生理盐水及无义慢病毒(滴度为lxl〇8 TU/只),慢病毒注射后0周、4周、12 周分别处死一部分小鼠,并留取血、尿,肾组织标本。利用PAS染色组织切片、 电镜观察肾组织病理结构变化,利用western blotting检测Podocin、GSK-3P、 P-GSK-3p(s9)、IL-17、MCP-1、B7-1 的表达水平,免疫荧光检测IL-17、Claudin-1、 B7-1的表达水平,RNA原位杂交(FISH)检测LncRNADlx6-osl与足细胞标记蛋 白podocin的表达水平。

结果:

  1. 在2型糖尿病肾病模型鼠db/m中,上调LncRNA Dlx6-osl的表达,FISH 观察到足细胞标记蛋白表达减少,LncRNADlx6-osl在肾小球内表达增多。PAS 染色以及电镜观察,过表达病毒注射后的小鼠肾小球出现系膜细胞增多,系膜 基质增生,电镜观察发现与对照组相比过表达病毒注射后的小鼠肾小球出现基 底膜明显增厚,足突广泛融合,western blotting显示足细胞标记蛋白podocin表 达下调,炎症损伤蛋白IL-17、MCP-1、B7-1表达增多,免疫荧光IL-17、Claudin-l、B7-1表达上调。
  2. 在出现微量白蛋白尿的糖尿病肾病的小鼠中注射shRNA慢病毒下调 LncRNADlx6-osl的表达,FISH观察到 LncRNADlx6-osl表达减少。PAS染色 以及电镜观察,肾小球出现系膜基质增生减轻,电镜观察发现注射shRNA慢病 毒的糖肾小鼠与对照组相比肾小球基底膜增厚减轻,足突融合改善,western blotting显示足细胞标记蛋白podocin表达上调,炎症损伤蛋白IL-17、MCP-1、B7-1表达减少,免疫焚光足细胞标记蛋白Podocin、Synaptopodin表达上调,IL-17、 mcp-1、B7-1表达下调。

结论:

  1. 在2型糖尿病肾病对照模型鼠db/m中,上调LncRNADlx6-osl的表达,导致 肾脏损伤,产生蛋白尿。
  2. 在2型糖尿病肾病模型鼠db/db中,下调LncRNA Dlx6-osl的表达,保护肾脏

结构,减轻蛋白尿。

  1. 在糖尿病肾病蛋白尿的发生发展过程中GSK-3p可能对LncRNA Dlx6-osl 的转录起反馈调节作用;为Dlx6-osl作为糖尿病肾病早期肾脏损害生物标记及治 疗新靶点提供实验依据。

关键词:糖尿病肾病,长链非编码,RNA糖原合成酶激酶

Role of LncRNA Dlx6-osl in proteinuria and podocyte
injury in diabetic nephropathy mice

By MengWen Zhou
Supervisor: Jia Guo
Department of Nephrology
The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University

Abstract

Background:

Diabetic nephropathy is one of the most serious microvascular complications of diabetes and a major cause of end-stage renal disease. At present, the pathogenesis of diabetic nephropathy is complicated, and no exact pathogenesis is found. Studies in recent years have shown that in a series of kidney tissue damage caused by hyperglycemia, the damage of podocytes and the reduction of the number of albuminuria are considered to be the main cause of diabetic nephropathy. Long non-coding RNA (LncRNA) is a non-coding RNA of greater than 200 nucleotides in length. It is a research hotspot in recent years and has a wide range of functions, which can regulate gene expression from various aspects such as cell differentiation, cell cycle and epigenetic. An important pathway by which Wnt signaling mediates podocyte injury. Glycogen synthase kinase (GSK-3p) is one of the key molecules of Wnt signaling pathway and plays a crucial role in podocyte injury. Our previous experimental results showed that the expression of GSK-3p was increased in podocytes cultured under high glucose conditions, and the expression of podocyte injury protein was increased and podocytes were damaged. However, the role of LncRNA Dlx6-osl elevation in the development of proteinuria and podocyte injury is unclear

Objective:

  1. Defining the expression of LncRNA Dlx6-osl in renal tissues of mice with type 2 diabetic nephropathy
  2. To investigate the role of LncRNA Dlx6-osl in proteinuria and podocyte injury in mice with type 2 diabetic nephropathy

Method:

Male db/db with genetic background of C57BLKs/J and db/m mice born in littermates were randomly numbered, (no intervention group) db/m 14w, db/m 22w, db/db 14w,db/db22w , (over-expressed lentivirus group) db/m+saline, db/m+con-LV, db/m+Dlx6-osl 4w, db/m+Dlx6-osl 12w (shRNA lentivirus group) db/db+saline Db/db+con-shRNA, db/db+ Dlx6-osl shRNA 4w, db/db+ Dlx6-osl shRNA 12w, adaptive feeding for one week, weekly monitoring of mouse blood glucose, dot albumin. In the presence of microalbuminuria in mice, db/db group was injected with LncRNA Dlx6-osl shRNA lentivirus (titer lxl〇8 TU/only) with podocyte-specific marker NPHS2, and the control group was injected with normal saline and no. The lentivirus (titer lxl〇8 TU/only) was injected into the db/m group at the same time with the overexpression of LncRNA Dlx6-osl (titer lxl〇8 TU/only) lentivirus with podocyte-specific marker NPHS2. The control group was injected with normal saline and non-sense lentivirus (titer lxl〇8 TU/only), and some mice were sacrificed at 0, 4, and 12 weeks after lentivirus injection, and blood, urine, and kidney were collected. Organize specimens. The pathological changes of renal tissues were observed by PAS staining and electron microscopy. The expression levels of Podocin, GSK-3P, P-GSK-3p(s9), IL-17, MCP-1 and B7-1 were detected by western blotting. The expression levels of IL-17, Claudin-1 and B7-1 were detected, and the expression level of LncRNA Dlx6-osl and podocyte marker protein podocin was detected by RNA in situ hybridization (FISH).

Result :

1 .In the db/m of type 2 diabetic nephropathy model, the expression of LncRNA

Dlx6-osl was up-regulated, FISH observed a decrease in podocyte marker protein expression, and LncRNA Dlx6-osl was increased in glomeruli. PAS staining and electron microscopy showed that mesangial cells in the glomeruli of mice overexpressing virus injection showed mesangial cell proliferation, mesangial matrix hyperplasia, and electron microscopic observation showed that the basement membrane of mouse glomeruli after over-expression of virus injection was compared with the control group. Significantly thickened, the foot process was widely fused, western blotting showed that the podocyte marker protein podocin expression was down-regulated, and the expression of inflammatory damage proteins IL-17, MCP-1, B7-1 increased,immunofluorescence IL-17, Claudin-1,B7-1 The expression is up-regulated.

2.In the mice with diabetic nephropathy with microalbuminuria, shRNA lentivirus was injected to down-regulate the expression of LncRNA Dlx6-osl, and FISH observed a decrease in LncRNA Dlx6-osl expression. PAS staining and electron microscopy showed that the glomerular mesangial matrix hyperplasia was alleviated. Electron microscopy showed that the glycosaminoglycans injected with shRNA lentivirus reduced the glomerular basement membrane thickening and improved the foot process fusion. Western blotting showed The expression of podocyte marker protein podocin was up-regulated, the expression of inflammatory injury proteins IL-17, MCP-1 and B7-1 was decreased, the expression of immunofluorescence podocyte marker proteins Podocin and Synaptopodin was up-regulated, and the expressions of IL-17, mcp-1 and B7-1 were down-regulated.

Conclusion:

  1. Up-regulation of LncRNA Dlx6-osl expression in db/m of type 2 diabetic nephropathy model mice, leading to kidney damage and proteinuria.
  2. In the type 2 diabetic nephropathy model mouse db/db, down-regulate the expression of LncRNA Dlx6-osl, protect the kidney structure and reduce proteinuria.
  3. GSK-3P may play a regulatory role in the transcription of LncRNA Dlx6-osl during the development of diabetic nephropathy proteinuria; provide experimental evidence for Dlx6-osl as a biomarker for DN early renal damage and a new therapeutic target.

Key words: diabetic nephropathy> long-chain non-coding RNA> GSK-3P

LncRNA Dlx6-osl在糖尿病肾病小鼠蛋白尿中的作用

引言

近些年来的研究表明,足细胞损伤或者足细胞病,包括肾小球结构、功能、 数量上的改变,在糖尿病肾病发病机制中起着至关重要的作用[1]。具体来说,足 细胞功能障碍可导致肾小球过度肥大、肾小球硬化,足突广泛融合。高糖诱导 的足细胞凋亡己经被证实是导致糖尿病早期肾小球高滤过的原因,由于足细胞 的耗竭也会导致糖尿病肾病后期结节性和弥漫性肾小球硬化。因此细胞凋亡可 能在糖尿病肾病的早期和晚期起着至关重要的作用[2]

据报道,人类基因组的只有小于2%的被转录成RNA转录物,可编码蛋白质 [3]。这意味着大多数RNA是非编码RNA (ncRNA),分为长ncRNA (长度超过 200个核苷酸)和小ncRNA (小于200个核苷酸)[3]。:IncRNA通过与特定DNA/RNA 或蛋白质部分结合来调节几种基因的表达[4],与其他小的非蛋白质编码RNA (ncRNAs)不同,IncRNAs不是很保守,并且通过不同的机制发挥作用A它们 可以起作用(1)作为将蛋白质复合物结合在一起的支架,(2)作为微小RNA 的海绵,(3)作为微小RNA的宿主基因,(4)作为mRNA衰变的控制者,转 录因子的DNA螯合和表观遗传调节。染色质压实,和(5)通过miRNA结合位点 的mRNA的稳定剂掩蔽,与miRNA不同,只有少量的长链非编码RNA研究发表 在糖尿病肾病领域[5_7]

Wnt信号通路是一个高度保守的信号转导通路W,调节包括肾脏在内的多个 不同器官的发育过程,这些通路调节细胞间的相互作用,特别在胚胎,胎儿的 发育过程中,包括细胞极化,基底膜合成,从而介导多个生理病理过程,例如 炎症、血管生成和纤维化等[9]。糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是组成型活性丝氨 酸/苏氨酸激酶[1()]。最初被发现可以磷酸化和灭活糖原合酶,这是糖原代谢的一

种关键酶,GSK-3由GSK-3a和GSK-3P[11],尽管GSK-3a和GSK-3P具有97%的序

列同源性,单它们的表达模式和细胞功能却不同[12]。在这两种同型中,已知 GSK-3P的活性被增殖,促存活信号降低,如Wnt配体,表皮生长因子,成纤维 细胞生长因子,胰岛素样生长因子-I和II,以及Akfl GSK-3P的激活或抑制调 节各种各样的细胞应答,包括细胞增殖、炎症、分化和细胞凋亡。糖原合成酶 激酶-3卩(GSK-3P)参与各种肾病的发病机制。有研究表明GSK-3P在糖尿病条 件下对足细胞凋亡的有一定作用。在该研究中,我们首次证明GSK-3P的活性在 暴露于高葡萄糖培养足细胞和糖尿病肾小球的中增加,并且在糖尿病条件下增 强足细胞内GSK-3P活性与体外足细胞凋亡有关[14]。我们前期的研究发现高糖环 境可导致足细胞中GSK-3P的表达及活性增加;而GSK-3P表达增多可导致足细 胞标记蛋白表达减少,功能受损。

结合本团队前期利用肾脏病特色生物样本库,通过高通量芯片Arraystar人 类LncRNA芯片V3.0 (上海康成生物公司)分别对糖尿病肾病患者(经肾穿刺活 检确定)血、尿、肾组织标本进行筛选,并与正常对照组进行比较,初步得到 差异表达的LncRNA谱。在LncRNA芯片筛选的结果中,我们发现LncRNA DLX6-AS1 (DLX6 antisense RNA1: RefSeq Gene ID 285987,对应于小鼠的是 Dlx6osl)在糖尿病肾病患者体内的表达水平较正常对照组明显增多。但 LncRNA DLX6-AS1在糖尿病肾病发生发展中的作用是什么?是否参与糖尿病 肾病炎症反应及足细胞损伤尚未有研究明确。

糖尿病肾病病理生理学涉及几种分子机制,包括氧化应激[15]、肾素血管紧 张素系统[16]、转化生长因子(TGF-P)激活[17],蛋白激酶C (PKC)激活、肿瘤 坏死因子a (TNF-a)激活。其中许多因子是参与糖尿病肾病发病机制的主要炎 性介质^1。IL-17在糖尿病肾病的发病机制中的对炎症反应的调节作用依赖于疾 病背景、亚型、组织和受体-配体的相互作用解释[1819]。IL-17是一种多效细胞因 子,通过诱导趋化因子、促炎细胞因子和基质金属蛋白酶的表达[2()],参与组织 炎症、基于实验动物模型和人体研究的新证据,IL-17被认为是哺乳动物免疫系 统的中心角色。由于肾脏可能受到系统性、器官特异性和免疫失调影响,在宿 主防御中作为无辜的旁观者[21]。有关急性肾损伤的研究中说明,肾细胞受损后, 释放多种促炎因子IL-1、IL-6、IL-17、IL-23, NF-a,单核趋化蛋白-1 (MCP-1), 角质细胞来源的趋化因子(KC)和干扰素-g(IFN-g),但是,其在糖尿病肾病中的 具体变化还尚未明确。

B7-1是通常由抗原呈递细胞表达的跨膜蛋白。足细胞的损伤和丢失是糖尿 病肾病的主要标志。在追求参与足细胞病理生理学的可靶向分子时,一些研究 己经将B7-1 (也称为CD80)鉴定为潜在的生物标志物[22]。此外,已经提出B7-1 阻断作为足细胞综合征患者的足细胞特异性治疗,其具有有限的治疗选择,例 如具有局灶性节段性肾小球硬化,微小病变,糖尿病性肾病和狼疮性肾炎[23]。 CTLA4-Ig是B7-1的抑制剂,目前用于治疗自身免疫性疾病@]。并且有研究表明 高糖诱导足细胞B7-1的表达,从而促进足细胞形态学的改变,并最终导致糖尿 病肾病,利用CTLA4-Ig抑制B7-1的表达,缓解高糖环境下培养下足细胞引起的 伤害。这些结果表明CD28/B7-1途径与人类2型糖尿病导致的肾病发病机理相关, 因此CTLA4-Ig治疗可提供对抗糖尿病肾病新的治疗策略[25]

综上所述,糖尿病肾病肾病的发病机制核心与足细胞的损伤、数量减少息 息相关。足细胞的损伤及屏障功能障碍与蛋白尿的发生、发展密不可分。Wnt 信号通路介导是足细胞损伤的重要通路。GSK-3P (糖原合成酶激酶)是Wnt信 号通路的关键分子之一,在足细胞损伤过程中发挥至关重要的作用。而炎症反 应又是足细胞的损伤的重要机制。结合我们前期的LncRNA高通量芯片的结果, 得到的差异表达的长链非编码RNA Dlx6-osl,以及我们前期在高糖培养的足细 胞中GSK-3P升高的发现,本研究主要探讨在糖尿病肾病db/db小鼠中,LncRNA Dlx6-osl是否可以调控GSK-3(3的表达水平,从而影响炎症因子的表达,进而参 与到小鼠蛋白尿的发生。

材料和方法

1实验材料 1.1实验动物

模型小鼠由南京模式动物中心购买,饲养于河南省实验动物中心动物房, 每笼4-5只,分笼饲养,环境为SPF级,环境温度21-24度,IVC-II型独立通 风隔离笼,采用标准颗粒饲料喂养,不限制饮水,隔日更换垫料。垫料、饲料、 饮用水及其它鼠接触的物品均经高温高压灭菌处理后使用。每周测一次血糖, 点式尿蛋白等生化指标。分别在小鼠自然周龄l〇w、慢病毒处理后Ow、4w、12w 处死小鼠,留取血、尿、肾组织标本。

1.4实验主要试剂配制

  • lxSDS上样缓冲液:5xSDS上样缓冲液利用双蒸水稀释5倍。
  • 电泳液(lxRunningBuffer) : 4g甘氨酸、3.03g三轻甲基氨基甲 烷盐酸盐(Tris)、lg十二烷基硫酸钠(SDS)溶于1000毫升双蒸水中,然后用 玻璃棒充分搅拌,可在室温下贮存。
  • 转膜液(lxTransferBuffer) : 4g甘氨酸和3.03g三轻甲基氨基甲烧 盐酸盐(Tris)溶于800毫升双蒸水后,再加入200毫升甲醇搅拌混匀,可在室 温下贮存。
  • 10%过硫酸铵(APS):将5g过硫酸铵溶于5毫升双蒸水中,用EP

管分装并保存于-20°C备用。

  • l〇xTBS溶液:40g三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris)、40g氯化钠(NaCl) 溶于500毫升双蒸水中,然后用玻璃棒充分搅拌,置于4°C保存备用。

lxTBST溶液:100毫升lOxTBS和900毫升双蒸水充分混匀,然后再加入 1毫升吐温-20,充分振荡后可在室温下贮存。

  • 5%脱脂牛奶(Westernblot封闭专用):将2.5g脱脂奶粉溶于50毫

升lxTBST中,充分混勾,置于-20°C或者4°C冰箱中保存备用。

  • TrisBase21g、EDTA0.37g、加入到800亳升双蒸水中,用磁力搅拌 器搅拌均匀,使其完全溶解。将PH调至9.0后定容至1000毫升。再向溶液中加 Tween-20 0.5毫升。常温下能保存3个月,4°C冰箱可长期保存。
  • 封闭液及抗体稀释液5%PSA: 5g牛血清白蛋白,溶于PBS溶液,搅拌 均匀,定容至100毫升,4°C冰箱保存。
  • 蛋白酶K(15ug/毫升):Proteinase-Kstock: lMTris-HCl(pH4)5 毫 升、0.5MEDTA2毫升、5MNaC10.2毫升、无酶水900毫升最后定容至1000毫 升.Proteinase-Kstock7.5 ul加入到 10 毫升 Proteinase-Kbuffer中,现用现配。
  • PBS-T(0,l%pH4):吐温 Tween-20 1 毫升加入 1 升PBS中.

(11 )KTBT(AP stop solution):分别加入Tris-HCl (50mM)7.9g、NaCl (150mM) 8.7g、KC1 (10mM)0.75g、RNase-free 水900 毫升,最后无酶水定容至 1000毫 升

  • 抗体封闭液及稀释液:PBS-T15毫升、300吣山羊血清(终浓度2%) 标记为A,10毫升A液中加入330ul30%BSA (终浓度1%)标记为“封闭液”,取5 毫升A液加入5毫升PBS (0.05%Tween、1%山羊血清)330ul30%BSA (终浓度

1%)标记为“稀释液”。

2实验方法 2.1实验分组

动物分组:(无干预组)db/ml4w、db/m22w、db/dbl4w、db/db22w,(过 表达慢病毒组)(113/111+3&1丨1^、(113/111+0〇11-1^、(113/111+〇1\6-〇314\¥、(113/111〇1\6-〇3112\¥ (shRNA 慢病毒组)db/db+saline、db/db+con-LV、db/db+Dlx6-os shRNA4w、 db/db+Dlx6-osl shRNA 12w

2.2小鼠一般生化指标测定 2.2.1血糖

首先,将血糖仪及试纸取出,试纸正面朝上插入血糖仪,待取小鼠尾静脉 血液,滴入血糖指示孔,读取显示器上数值,测量3次取平均值。 2.2.2点式白蛋白

由郑州大学第一附属医院肾病实验室专业实验人员利用全自动分析仪测量 尿点式。

2.2.3肾重体重比

首先,小鼠处死前,利用天平称体重,处死后,剪短其下腔静脉,心尖处 进针注射生理盐水灌洗肾脏,将肾脏取下,除去被膜,利用分析天平称取肾重, 并取二者比值。

2.3分离肾小球

  • 用苯巴比妥麻醉小鼠后,剪断其下腔静脉,通过心尖注射约40毫升含 有铁粉(三氧化二铁;)的PBS缓冲液。
  • 灌注结束后分离肾脏,将肾脏立即转移至预冷过的PBS缓冲液中,剥 离肾脏外层包膜后,将肾脏从中间横切为两段。将肾脏髓质清除,剩余部分的 肾组织切为1mm3左右大小的碎块。
  • 加入胶原酶及DNA酶I后37°C水浴消化30分钟,同时轻轻地搅拌。然 后用一个表面平整的杵将消化后的组织压过100微米孔径的细胞筛,再用5毫升 PBS缓冲液冲洗细胞筛。冲下的组织离心后弃掉上清液,以2毫升PBS重新混悬 沉淀,再将混悬液至于磁铁上聚集。
  • 用预冷后的PBS缓冲液冲洗肾小球3遍。将分离出来的肾小球中移至玻 璃管中,并加入RIPA裂解液,将玻璃管置于冰上。在动物组织匀浆机上以 15000rpm的转速匀浆。匀浆时间10秒海次,间隔半分钟,连续2-3次。

2.4组织(PAS)糖原染色

  • 烘烤:切片置于60°C烤片机中2小时;
  • 石蜡切片脱蜡、梯度入水:切片按照“二甲苯(1)10分钟—二甲苯(11)10 分钟—95%、70%、30%无水乙醇各2分钟—蒸馏水2分钟”的顺序透明脱蜡;
  • 1%过碘酸水溶液覆盖玻片样本上,平放于染色架上,室温避光孵育12

分钟;

  • 蒸馏水洗涤5分钟,2遍;
  • Schiff试剂滴于玻片样本上,室温孵育15分钟;
  • 流水冲洗1分钟后自然晾干;
  • 苏木素浸染4分钟;
  • 1%盐酸酒精分化1秒,流水冲洗2分钟;
  • 酒精梯度脱水,二甲苯透明,按照步骤2的顺序反过来进行;
  • 晾干切片,中性树胶封片;光学显微镜下观察肾组织的形态结构, PAS阳性为红色,细胞核为蓝色。

2.5电镜标本观察

将切好的小鼠肾组织标本送至郑州大学第一附属医院电镜室,由专业技术 人员处理,制作电镜标本,并由电镜室专业技术人员指导下观察与拍摄。

2.6肾组织蛋白提取

  • 蛋白提取取绿豆大小的肾组织放入预冷的研磨杵,然后置于冰上,加 入1毫升蛋白提取液(每1毫升RIPA裂解液中加入10微升蛋白酶抑制剂,10 微升磷酸酶抑制剂,10微升PMSF)。
  • 使用研磨杵充分研磨组织,冰上静置裂解20分钟。
  • 4°C 12000 rpm离心10分钟,收集上清液于干净的EP管中,取 5xLoading Buffer稀释蛋白上清液至终浓度为lx,并吹打混句,置于干浴锅中 99°C,10分钟,取出后立即冰上冷却5分钟。
  • 提好的蛋白样品可放-80°C保存。

2.7 BCA法测定样品蛋白浓度

  • 标准品的加样:按照说明书对蛋白标准品进行稀释(终浓度为5mg/ 毫升)。稀释的标准品利用移液枪转移到96孔板的每个孔中,并用PBS将每个孔 补足至20|ul。
  • 待测蛋白样品的加样:先用PBS将所提取的待测样品稀释10倍。
  • 按照50:1的比例将试剂盒中的A、B液混句,配置成所需的BCA工作液 (现用现配,24小时内稳定)。
  • 取200|ilBCA工作液加至96孔板各孔中,充分震荡混合均匀。
  • 将96孔板置于37°C的恒温箱内孵育30分钟。
  • 取出96孔板,将其放置于全自动酶标仪上。检测并记录562nm波长的

各孔吸光值。绘制标准曲线,进而估算待测样品的蛋白浓度(待测蛋白样品的 浓度为:测出样品的吸光度X稀释倍数,单位为|Hg/|Lll)。

2.8免疫蛋白印迹法(Western Blot)

  • 清洗实验所需要用到的物品。
  • 将洗好的玻璃板静置晾干,对应放在制胶架上,在玻璃板之间加入双 蒸水检查密闭性,如无液面下降,可将水晾干后备用,如密闭性差,应重新检 查原因后,重复上述步骤。
  • 根据所要分离的蛋白分子量大小,选择合适的分离胶浓度,按比例加 入双蒸水、30%Acr-Tris (29:1)、分离胶缓冲液4x、10%APS、TEMED。混匀

液体,加入玻璃板约三分之二处,加入1毫升异丙醇确保分离胶液面平整,静置 30-40分钟,待分离胶凝固,将异丙醇倒出,并将残余异丙醇用滤纸擦干净。

取出裁剪好与胶大小一致的PVDF膜,放入甲醇中激活1分钟。将跑好的胶, 保留完整泳道,用切胶板切至合适大小,放置转膜滤纸的PVDF膜上,整个转膜 结构从上至下为海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵,赶走气泡,放入半干 转自动转膜仪中,将按钮旋转至对应的胶厚度,选择Transfering,按照蛋白分子 量选择合适的转膜时间,开始转膜。

  • 封闭将转好的PVDF膜从转膜仪中取出,放入5%脱脂牛奶中,置于 水平摇床上,封闭2小时。
  • 孵育一抗:将PVDF膜从牛奶中取出,在lxTBST中,每次3分钟洗5次。 然后取出PVDF膜,放入稀释好的一抗中,4°C孵育过夜。
  • 孵育二抗:将PVDF膜从一抗中取出,在lxTBST中,每次3分钟洗5 次,放入稀释好的二抗中,室温孵育1小时,将PVDF膜从二抗中取出,在lxTBST 中,每次3分钟洗5次。
  • 显色:ECL显色液按1:1混合A、B两液,少量多次滴加到PVDF膜上, 利用天能全自动化学发光成像分析仪中进行曝光。

2.9 RNA原位杂交

  • 60°C烤片30分钟后,在二甲苯(Xylene)和酒精(Ethanol)中脱蜡,室温,按下表顺序:
  • 蛋白酶K,37°C孵化10分钟蛋白酶K现用现配,将蛋白酶K的储存 液加入蛋白酶K缓冲液中。将玻片放入湿盒中,每张玻片加入大约300ul的液 体,使其完全覆盖住组织。在37°C孵箱中消化10分钟。
  • 将玻片放进PBS中清洗两次
  • 每张玻片加入300ul新鲜的3%过氧化氢,在室温下孵育10 (10-60)分 钟;然后弃掉过氧化氢,在PBS中清洗两次。
  • 杂交:将玻片放到湿盒中,每张玻片加入50 |iL预先配好的杂交混合 液。盖上无菌盖玻片,在孵箱中杂交lh,温度根据经验法则,低于RNATm温 度30°C(约50-60°C左右,推荐55°C)
  • 依次将盖玻片取下,将玻片尽快放入室温5xSSC中。如果盖玻片不好 取下就直接放入5xSSC中,几分钟后盖玻片脱离玻片再转移到另一个装有5xSSC 的盒子中。
  • 在PBS-T中洗3x3分钟
  • 加入新鲜配制的八^\3?1110^1^>^111丨(36代386111;至少15〇111,室温孵育 7-15分钟,注意避光。
  • 在PBS-T中洗3x3分钟
  • DAPI染核,4°C避光保存24h后观察

2.10肾组织免疫荧光

  • 烘烤:切片置于60°C烤片机中2小时;
  • 石蜡切片脱蜡、梯度入水:切片按照“二甲苯®10分钟—二甲苯(11)10 分钟—95%、70%、30%无水乙醇各2分钟—蒸馏水2分钟”的顺序透明脱蜡;
  • PBS洗3遍,每次5分钟
  • 抗原修复:高压锅热修复:首先将片子放入抗原修复液(EDTAPH=9.0) 连同容器放入高压锅中加热至沸腾,盖上压力阀至喷气后持续1-4分钟。
  • 待修复液恢复至室温后,PBS洗3次,每次清洗10分钟。
  • Triton 通透,30分钟。
  • 用5%的PSA封闭30分钟,然后弃去封闭液,用PBS缓冲液洗3次,每次

清洗10分钟。

  • 孵育一抗(1%PSA稀释1:100),然后放在湿盒中,置于4°C冰箱过夜。 弃去一抗,用PBS缓冲液洗3次,每次清洗30秒钟。然后于避光环境下孵育

荧光二抗(1%PSA稀释,1: 200) 1小时。

  • 弃去二抗,在避光的环境下用PBS缓冲液洗3次,每次清洗10分钟。
  • 用含有DAPI或PI的甘油封片。

2.11统计学方法

本研究中相关数据统计学分析采用SPSS 21.0进行,涉及的计量资料数据均 使用均数±标准差的方式表示,多组间比较使用one-way ANOVA单因素方差分 析,PO.05,表示差异有统计学分析。

实验结果

1观察2型糖尿病肾病小鼠生理及肾脏病理变化。

1.1糖尿病肾病小鼠随着时间延长尿蛋白逐渐增加。

将实验小鼠接回SPF级动物房,适应性饲养1周,分别在小鼠自然周龄10w、 14w、22w处死1批小鼠,留取血、尿、肾组织标本(详见图1.1)。发现糖尿病 肾病小鼠的点式白蛋白,随着时间增长逐渐增加,并且相比db/m正常对照组小详见图1.2)。

图1.2:小_点式白蛋白

每组小鼠分别取5只,测量尿微量白蛋白 与血肌酐的比值,尿点式白蛋白,正常对照小鼠db/m,糖尿病肾病小鼠db/db,与对照组相 比,糖尿病肾病小鼠尿蛋白随着財间延长逐渐升高〇P<〇.〇5),*与同周龄正常对照组小鼠相比 差异有统计学意义.

1.2糖尿病肾病小鼠的血糖及肾重体重比变化

为了观察血糖与肾重体重比在糖尿病肾病的发生发展中的变化,分别在小 鼠自然周龄l〇w、14w、22w处死小鼠时留取血液,肾脏组织标本。发现随着糖 肾小鼠周龄的增加,肾重体重比低于同周龄的正常对照小鼠血糖逐渐升高,并 且差异有统计学意乂。图1.3小鼠血糖变化散点图                图1.4小鼠肾重体重比散点图

图1.3-4:每组小鼠分别取5只,测量血糖及肾重体重比,与对照组相比,糖尿病肾病 小鼠血糖随着时间延长逐渐升高,〇P<〇.〇5),*与同周龄正常对照组小鼠相比差异有统计学意 义.而肾重体重比低于同周龄的db/m小鼠,〇P<0.05), *与同周龄正常对照组小鼠相比差异有 统计学意义.

1.3 LncRNA Dlx6-osl在db/db小鼠的肾小球中高表达

RNA荧光免疫原位杂交在db/db小鼠及正常对照小鼠db/m的肾脏组织中的 Dlx6-osl的表达进行定位,并且与足细胞标记蛋白podocin进行共染(详见图 1.5),与正常对照组相比,糖肾小鼠DlX6os-l的表达增多,podocin表达减少, 足细胞损伤。

图1.5: RNA免疫荧光原位杂交Dlx6-osl与足细胞标记蛋白podocin在肾组织中共染, 糖肾小鼠肾小球中Dlx6-osl表达随周龄增加逐渐增多,podocin表达减少,足细胞损伤。(放 大倍数:400倍,标尺=50微米)

  1. 糖尿病肾病小鼠肾脏病理表现

为了了解糖尿病肾病小鼠的肾脏组织发生的病理变化,通过肾脏石蜡切片 PAS染色法光镜观察:db/db组与db/m组相比肾小球系膜细胞增多,系膜基质 增生,肾小球硬化。通过制作电镜组织切片,透射电镜观察:db/db组与db/m 组相比小鼠肾小球基底膜逐渐增厚,系膜基质增多,足突出现广泛融合。

图1.7小鼠肾小球基底膜厚度

  • db/m 14w ■ db/m 22w ▲ db/db 14w ▼ db/db 22w

图1.6小鼠肾脏PAS染色及透射电镜

图1.6:通过光镜分别观察不同周龄正常小鼠及糖尿病肾病小鼠肾小球PAS染色(放大 倍数400标尺=50微米),并且通过透射电镜观察小鼠肾脏组织的超微结构(放大倍数12000 倍,标尺=1微米)。图1.7每组小鼠不同视野肾小球基底膜厚度平均值±标准差散点图 〇P<0.05),*与同周龄正常对照组小鼠相比差异有统计学意义.图1.8每组小鼠不同视野下每 个微米足突数平均值±标准差散点图db/m:正常对照小鼠组,db/db:糖尿病肾病小鼠组 (尸<0.05), *与同周龄正常对照组小鼠相比差异有统计学意义.

  1. 糖尿病小鼠肾组织B7-1、Claudin-1、IL-17的表达变化。

为了观察糖尿病肾病小鼠肾脏组织肾小球中的B7-l、Claudin-l、IL-17变化。 利用免疫焚光 B7-1 与 Synaptopodin,Claudin-1 与 Podocin,IL-17 与 Synaptopodin 共染观察到随着肾组织损伤的加重,相对于正常对照小鼠db/m组,Pododn与 Synaptopodin 的表达减少,B7-1、Claudin-1、IL-17 的表达增多。

Western blot实验随着肾组织损伤的加重,相对于正常对照小鼠db/m组 MCP-1、B7-1、Claudin-1、IL-17 表达升高,podocin 表达减少。

图1.9-11小鼠肾组织切片免疫荧光观察不同周龄正常小鼠及糖尿病肾病小鼠肾小球中 B7-1、Claudin-1、IL-17的表达变化,及肾小球结构损伤变化。(放大倍数400倍,标尺=50 微米)图12免疫蛋白印迹观察不同周龄正常小鼠及糖尿病肾病小鼠肾小球中各种蛋白表达 变化。

2正常对照小鼠尾静脉注射具有足细胞特异启动子的过表达 Dlx6-osl的慢病毒小鼠蛋白尿增多,肾脏损伤加重

结合我们前一部分观察到的实验结果在糖尿病肾病小鼠肾小球组织中 Dlx6-osl呈现高表达,这与我们在糖尿病肾病患者肾组织基因芯片筛查的结果一 致,小鼠尿蛋白加重,并且出现糖尿病肾病相关的肾脏病理表现。相关损伤标 记蛋白B7-1、Claudin-1、IL-17表达升高。

为了探究LncRNADlx6-osl在糖尿病肾病小鼠蛋白尿中的作用,在正常小 鼠尾静脉中注射带有足细胞启动子的过表达Dlx6-osl慢病毒,Dlx6-osl在小鼠 肾组织中的表达状态,对照组注射无义慢病毒,在正常对照组中注射生理盐水, 观察在在足细胞中特异过表达Dlx6-osl后是否影响小鼠的尿蛋白及肾脏病理变 化。

2.1 FISH观察注射慢病毒后肾小球内Dlx6-osl的表达变化

RNA荧光免疫原位杂交在各组小鼠肾脏组织中的Dlx6-osl的表达进行定 位,并且与足细胞标记蛋白pododn进行共染(详见图2-1),与正常对照组相 比,过表达慢病毒注射组小鼠相对于注射无义慢病毒及正常生理盐水注射组, Dlx6os-l的表达明显上调,podocin表达减少,足细胞损伤。

2.2过表达Dlx6os-l小鼠随着时间延长尿蛋白逐渐增加。

分别在小鼠注射病毒后的周龄〇w、4w、12w处死1批小鼠,留取血、尿、肾 组织标本(详见图2.2)。发现过表达D1X60S-1小鼠的点式白蛋白,随着注射周 龄时间增长,相对注射空载对照慢病毒组,正常对照组小鼠,尿微量白蛋白增 高(尸<0.05,图 1-2)。图2.4小鼠血糖变化散点图
图2.5小鼠肾重体重比散点图图2.4-2.5:每组小鼠分别取5只,测量血糖及肾重体重比,与正常小鼠注射生理盐水对 照组及注射乱序慢病毒相比,注射过表达慢病毒组血糖及肾脏体重比与同周期小鼠无明显 差异。〇P<0.05),*与同周龄正常对照组小鼠相比差异〇P<0.05),*与同周龄正常对照组小鼠相 比差异有统计学意义.db/m+saline :正常db/m小鼠注射生理盐水对照组,db/db+saline:糖 尿病肾病小鼠注射生理盐水对照组,db/m+con-LV:正常db/m小鼠注射乱序慢病毒组, db/m+Dlx6-os 1正常小鼠注射过表达Dlx6-os 1慢病毒组

2.4过表达Dlx6os-l后小鼠肾脏病理表现

为了了解过表达Dlx6os-l后小鼠的肾脏组织发生的病理变化,通过肾脏石 蜡切片PAS染色法光镜观察:db/m+Dlx6-osl组与db/m+saline组和db/m+con-LV 相比肾小球系膜细胞增多,系膜基质增生,肾小球硬化。通过制作电镜组织切 片,透射电镜观察:db/m+Dlx6-osl组与db/m+saline组和db/m+con-LV相比小鼠肾小球基底膜逐渐增厚,系膜基质增多,足突出现广泛融合。

图2.6小鼠肾脏PAS染色及透射电镜

图2.6通过光镜分别观察不同周龄正常小鼠及糖尿病肾病小鼠肾小球PAS染色(放大倍数 400标尺=50微米),并且通过透射电镜观察小鼠肾脏组织的超微结构(放大倍数12000倍,标 尺=1微米)。图2.7每组小鼠不同视野肾小球基底膜厚度平均值±标准差散点图(P<0.05),* 与同周龄正常对照组小鼠相比差异有统计学意义.图2.8每组小鼠不同视野下每个微米足 突数平均值±标准差散点图(P<0.05),*与同周龄正常对照组小鼠相比差异有统计学意义. db/m+saline :正常db/m小鼠注射生理盐水对照组,db/db+saline:糖尿病肾病小鼠注射生理 盐水对照组,db/m+con-LV:正常db/m小鼠注射乱序慢病毒组,db/m+Dlx6-osl正常小鼠注 射过表达Dlx6-osl慢病毒组

2.5糖尿病小鼠肾组织B7-1、Claudin-1、IL-17的表达变化。

为了观察糖尿病肾病小鼠肾脏组织肾小球中的B7-1、Claudin-1、IL-17变化。 利用免疫焚光 B7-1 与 Synaptopodin,Claudin-1 与 Podocin,IL-17 与 Synaptopodin

共染,发现过表达Dlx6-osl正常db/m小鼠相对于db/m+saline组和db/m+con-LV 组,Podocin 与 Synaptopodin 的表达减少,B7-1、Claudin-l、IL-17 的表达增多。

Western blot发现过表达Dlx6-osl组小鼠,相对于正常对照小鼠db/m组 MCP-1、B7-1、Claudin-1、IL-17表达升高,podocin表达减少,肾组织损伤的加重。

GAPDH

图2.10小鼠肾小球Claudin-1的表达

图2.9-2.11小鼠肾组织切片免疫荧光观察不同周龄正常小鼠及糖尿病肾病小鼠肾小球 中B7-1、Claudin-1、IL-17的表达变化,及肾小球结构损伤变化。(放大倍数400倍,标尺 =50微米)图2.12免疫蛋白印迹观察不同周龄正常小鼠及糖尿病肾病小鼠肾小球中各种蛋 白表达变化。db/m+saline :正常db/m小鼠注射生理盐水对照组,db/db+saline:糖尿病肾 病小鼠注射生理盐水对照组,db/m+con-LV:正常db/m小鼠注射乱序慢病毒组, db/m+Dlx6-osl正常小鼠注射过表达Dlx6-osl慢病毒组

3 糖尿病肾病小鼠尾静脉注射特异具有足细胞启动子的 Dlx6-oslshRNA慢病毒,小鼠蛋白尿缓解,保护肾脏组织。

为了进一步探究LncRNADlx6-osl在糖尿病肾病小鼠蛋白尿中的作用,在 正常小鼠尾静脉中注射带有特异足细胞启动子的过表达Dlx6-osl慢病毒后,发 现LncRNADlx6-osl表达上调正常db/m小鼠出现尿蛋白增加,肾脏组织出现糖 尿病肾病病理表现。因此我们利用

带有特异足细胞启动子Dlx6-oslshRNA慢病毒注射在糖尿病肾病小鼠尾静 脉注射,下调Dk6-sl,观察是否缓解糖尿病肾病小鼠的尿蛋白,保护其肾脏结 构损伤。

3.1 FISH观察注射慢病毒后肾小球内Dlx6-osl的表达变化

RNA荧光免疫原位杂交在各组小鼠肾脏组织中的Dlx6-osl的表达进行定 位,并且与足细胞标记蛋白pododn进行共染(详见图3-1),与糖尿病肾病注 射生理盐水组和糖尿病肾病小鼠注射乱序无义慢病毒组相比,Dlx6-oslshRNA慢 病毒注射组小鼠相对于注射乱序无义慢病毒及正常生理盐水注射组,D1X60S-1 的表达明显下调,podocin表达增多,足细胞损伤缓解。图3.1:RNA免疫荧光原位杂交Dlx6-osl与足细胞标记蛋白podocin在肾组织中共染(放 大倍数:400倍,标尺=50微米)

图3.2小鼠慢病毒注射流程图       图3.3各组小鼠点式白蛋白变化

图3.2:小鼠Dlx6-oslshRNA慢病毒注射流程图;图2.3:每组小鼠分别取5只,测量 尿微量白蛋白与血肌酐的比值即尿点式白蛋白,与对照组相比,糖尿病肾病小鼠 Dlx6-oslshRNA慢病毒组尿蛋白明显缓解(P<0.05),#与同周龄糖尿病肾病小鼠相比结果又差 异且差异有统计学意义。db/db+saline:糖尿病肾病小鼠注射生理盐水对照组,db/m+saline : 正常db/m小鼠注射生理盐水对照组,db/db+con-shRNA:糖尿病肾病db/db小鼠注射乱序 无义慢病毒组,db/db+Dlx6-oslshRNA糖尿病肾病小鼠注射Dlx6-oslshRNA慢病毒组

3.3糖肾病小鼠注射Dlx6-oslshRNA慢病毒后血糖及肾重体重比变化为了观察血糖与肾重体重比在糖尿病肾病的发生发展中的变化,分别在小 鼠注射病毒后的周龄〇w、4w、12w处死1批小鼠处死小鼠时留取血液,肾脏组织 标本。发现Dlx6-os 1 shRNA慢病毒后注射后的小鼠血糖和肾重体重比相对于同时 期小鼠无差异。说明Dlx6-osl对于小鼠蛋白尿及肾脏损伤的作用与血糖和肾重体 重比无明显关联。Time after injection (weeks)

图3.4-3.5:每组小鼠分别取5只,测量血糖及肾重体重比,与糖尿病肾病小鼠注射生理 盐水对照组及注射乱序无义慢病毒相比,注射Dlx6-osl shRNA慢病毒组血糖及肾脏体重比与 同周期小鼠无明显差异。〇P<0.05), #与同周龄糖尿病肾病小鼠相比差异有统计学意义.

3.4 D1X6 os-lshRNA下调后小鼠肾脏病理表现

为了了解Dlx6os-l下调后小鼠的肾脏组织发生的病理变化,通过肾脏石蜡 切片PAS染色法光镜观察:db/db+Dlx6-oslshRNA组与db/db+saline组和 db/db+con-shRNA相比肾小球系膜细胞增多,系膜基质增生,肾小球硬化的情况 明显改善。通过制作电镜组织切片,透射电镜观察::db/db+Dlx6-oslshRNA组 与db/db+saline组和db/db+con-shRNA相比小鼠肾小球基底膜增厚,系膜基质增 多,足突出现广泛融合的情况明显减轻。图3.6:小鼠肾脏PAS染色及透射电镜    图3.8小鼠肾小球基底膜足突个数

图3.6通过光镜分别观察不同周龄正常小鼠及糖尿病肾病小鼠肾小球PAS染色(放大倍 数400标尺=50微米),并且通过透射电镜观察小鼠肾脏组织的超微结构(放大倍数12000 倍,标尺=1微米)。图3.7每组小鼠不同视野肾小球基底膜厚度平均值±标准差散点图 (P<0.05), #与同周龄db/db+saline小鼠相比差异有统计学意乂.图2.8每组小鼠不同视野下 每个微米足突数平均值±标准差散点图(P<0.05), #与同周龄db/db+saline小鼠相比差异有统 计学意义.db/db+saline:糖尿病肾病小鼠注射生理盐水对照组,db/m+saline :正常db/m小 鼠注射生理盐水对照组,db/db+con-shRNA:糖尿病肾病db/db小鼠注射乱序无义慢病毒组, db/db+Dlx6-oslshRNA糖尿病肾病小鼠注射Dlx6-oslshRNA慢病毒组

3.5糖尿病小鼠肾组织B7-1、Claudin-1、IL-17的表达变化。

为了观察糖尿病肾病小鼠肾脏组织肾小球中的B7-1、Claudin-1、IL-17变化。 利用免疫荧光 B7-1 与 Synaptopodin,Claudin-1 与 Podocin,IL-17 与 Synaptopodin 共染,发现 Dlx6-oslshRNA 慢病毒组,相对于 db/db+saline 组和 db/db+con-shRNA 组,Podocin 与 Synaptopodin 的表达增多,B7-1、Claudin-1、IL-17 的表达明显

减少。

Western blot 发现 Dlx6-oslshRNA 慢病毒组,相对于 db/db+saline 组和 db/db+con-shRNA 组,MCP-1、B7-1、Claudin-1、IL-17 表达减少,podocin 表达

增多,保护肾组织结构。

图3.10小鼠肾小球Claudin-1的表达           图3.11小鼠肾小球IL-17的表达

图3.9-3.11小鼠肾组织切片免疫荧光观察不同周龄shRNA慢病毒小鼠及糖尿病肾病小 鼠肾小球中B7-1、Claudin-1、IL-17的表达变化,及肾小球结构损伤变化。(放大倍数400 倍,标尺=50微米)图3.12免疫蛋白印迹观察不同周龄正常小鼠及糖尿病肾病小鼠肾小球中 各种蛋白表达变化。

4 LncRNADlx6-osl的对糖尿病肾病蛋白尿可能作用机制

根据课题组前期实验结果,在正常培养条件下的足细胞中加入miR-346的 mimic (类似物),可明显降低GSK-3p mRNA及蛋白的表达,结合本实验通 过\¥63〖6111匕1〇1:发现,在小鼠体内中注射过表达1^10反1^八〇1\6〇31慢病毒可使肾小 球组织GSK-3P的mRNA明显增多,反之在小鼠体内中注射shRNA LncRNA Dlx6osl慢病毒可使肾小球组织GSK-3P的mRNA明显增多,符合ceRNA机制变化趋势(图4.13)。

图4.13 db/m:正常对照小鼠组,db/db:糖尿病肾病小鼠组db/m+saline :正常db/m

小鼠注射生理盐水对照组,db/db+saline:糖尿病肾病小鼠注射生理盐水对照组, db/m+con-LV:正常db/m小鼠注射无义慢病毒组,db/m+Dlx6-osl正常小鼠注射过表达 Dlx6-osl慢病毒组db/db+saline:糖尿病肾病小鼠注射生理盐水对照组,db/m+saline :正 常db/m小鼠注射生理盐水对照组,db/db+con-shRNA:糖尿病肾病db/db小鼠注射乱序无 义慢病毒组,db/db+Dlx6-oslshRNA糖尿病肾病小鼠注射Dlx6-oslshRNA慢病毒组

讨论

糖尿病是由于缺乏或未能维持正常葡萄糖稳态而导致的代谢紊乱[26]。已知 糖尿病与心血管,肾脏和脑血管疾病的风险增加有关,导致高发病率和死亡率 [27],糖尿病的有害作用包括微血管(糖尿病性肾病,心肌病,神经病和视网膜 病)和大血管(CAD,外周动脉疾病和中风)并发症。糖尿病引起的微血管并 发症是其发病机制中涉及的几种分子途径基因的失调表达的结果[28]

将近2 %的基因组转录为蛋白质编码RNA,剩余的70-90 %转录为 ncRNAs^。非编码RNA如tRNA,rRNA和剪接体RNA是许多细胞机器的关键组 成部分[3()]。除了这些经典的ncRNA之外,microRNA和IncRNA被认为是基因表达 的重要调节因子。长期以来,IncRNA被认为是缺乏蛋白质编码潜能和低水平进 化保守的转录“噪音”[31]。然而,在过去十年中,出现了强有力的证据表明IncRNAs (1)在各种细胞过程中受到调节,(2)表现出细胞类型特异性表达,(3)定 位于特定细胞器,以及(4)与人类疾病相关[3Q]。目前先进的转录组学技术,如 RNAseq,转录组学和新一代测序,己经确定了几种新的IncRNAs转录本,它们 可能是从基因的内含子区域进化而来的[32],这些非蛋白质编码基因位点在人体 中转录多达50,000个IncRNA,并且在其他物种中保守性差。这些IncRNA中有多 少是有功能的[33],基于它们的基因组位置。IncRNA被分为五个亚类:基因间 IncRNA,转录起始位点相关RNA,内含子IncRNA,天然反义转录物(NAT)和 一些转录假基因[34]

这些是大的间插不同的ncRNA或lincRNA,其存在于序列空间中并且不与蛋 白质编码基因重叠。迄今为止表征的大多数基因间IncRNA被发现通过RNA聚合 酶II转录并产生含有IncRNA的剪接,polyA,并且平均长度为约l,000bp。例如Xist, H19,HOTAIR和MALAT1[32]。短寿命的中等长度IncRNA (200-2,000nt)通过 RNApol II从启动子上游区和增强子区转录^1。这些短转录物(启动子相关的转 录物),即PROMPT,是从启动子上游转录物处理的这些转录本具有类似 蛋白质编码的特征,例如5’加帽和poly A拖尾,并且以复制数发生并且容易被外 来体降解启动子相关转录物的功能尚不清楚。目前尚不清楚它们是否具有 一些调节功能,或者这些仅仅是转录副产物。平均长度小于2kb的短转录物 (eRNA)是双向转录物。然而,它们的持续性和生物学功能也是未知的。这些

由己知来源于蛋白质编码基因的内含子的小ncRNA组成。最近的研究表明, IncRNAs也在注释基因的内含子中编码[36]。例如,已证明IncRNAs COLDAIR参 与植物春化并位于FLC的第一个内含子中;一种阻抑基因[37]。己经显示这些 IncRNA在各种细胞和病理过程中起作用。例如,已发现许多这些IncRNA在癌症 中差异表达[32]

这些IncRNA在基因组中从蛋白质编码基因或非蛋白质编码基因的反对链转 录,并调节基因有义链的功能,和/或其他几种基因[37]。这些也具有蛋白质编码 RNA的特征,例如剪接5’加帽和多腺苷酸化,并且最初在细菌中发现[32]。NAT 的公知的例子是Xist/TSIX,该控制X染色体失活[38]

假基因是其亲本基因的残基,由于无义,移码和其他突变而丧失了其编码 功能[39]。一些假基因转录成长度超过200 nt的长链非编码RNA,具有高水平的序 列保守性[4Q]。己知两种类型的假基因:(a)表达假基因,它们是完成假化的途 径中的中间体,和(b)采用新突变的死假基因。假基因的一个例子是通过假化 法从蛋白质编码基因Lnx3进化而来的Xist lncRNA[41]。最近的研究表明糖尿病肾 病(DN),视网膜病变,神经病和心肌病中几种IncRNA的调节异常,这表明它 们在病理生理学中具有潜在作用,因此是糖尿病引起的微血管并发症的潜在治 疗靶点[36]

糖尿病包括1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、妊娠期糖尿病和 其他特定类型的糖尿病[42]。I型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病,通常出现在 儿童期和成年早期。尽管T1DM的确切病因尚不清楚,但认为主要是由于遗传因 素并且涉及广生膜岛素的膜岛B细胞的免疫破坏。T2DM是成人发病,非膜岛素 依赖性DM,是最常见的糖尿病类型,超过所有糖尿病病例的90%,并归因于环 境和遗传因素[42]。IncRNA最近在包括糖尿病在内的多种人类疾病中获得了广泛 的关注。在T1DM和T2DM中均观察到几种IncRNA的异常表达。并且发现一些改 变的IncRNA在两者中都是常见的。在不同类型的DM中失调的IncRNA及其功能 都不同而且我们前期在糖尿病病人以及糖尿病肾病病人的肾脏组织以及血清中 都验证了LncRNADLx6-ASl的表达升高,并且出现了肾脏功能的下降,因此在 本研究在糖尿病肾病模型小鼠做了进一步验证,结果与人标本中的表达相关一 致。

IncRNAs和糖尿病肾病

己经有研究显示几种IncRNA调节DN中的表观遗传变化和相关的代谢记忆。 并且已经提出DN可以诱导肾组织中IncRNA的差异表达,导致其病理生理学中涉 及的多个分子途径的失调。例如,陈等人。研究表明,与db/m对照小鼠相比, DN小鼠模型中311个改变的IncRNA的差异表达[43]。发现这些IncRNA靶向富含谷 胱甘肽代谢信号传导的几种不同途径,表明IncRNA可以参与几种DN相关途径的 表达。

在另一项研究中,Wang等人。还发现了具有DN的db/db小鼠肾组织中1,018 个IncRNA的差异表达。在这些差异表达的IncRNA中,CYP4B1-PS1-001显着下 调。CYP4B1-PS1-001的过表达抑制了肾小球系膜细胞(MCs)的增殖和纤维化。 所有这些发现表明CYP4B1-PS1-001在小鼠MCs的增殖和纤维化中的关键作用 [44]。长的非编码RNA转移相关的肺腺癌转录物1 (MALAT1)在多种细胞中表达。 在糖尿病大鼠[44WPSTZ诱导的DN小鼠模型[45]中报道了 MALAT1的表达增加。最 近有研究观察到STZ诱导的糖尿病大鼠和高血糖(HG)暴露的HK-2细胞中肾 MALAT1表达增加。MALAT1表达的增加和miR-23c的表达减少有关。进一步下 调MALAT1导致ELAVL1,NLRP3, Caspase-1的表达降低和促炎细胞因子IL-ip, 上调miR-23c表达。这些结果表明MALAT1的上调通过靶向miR-23c及其下游靶 标EVAL1促进肾细胞凋亡和DN。又有研宄进一步证实了MALAT1在DN中的作 用。谁显示糖尿病小鼠肾皮质MALAT1水平升高。小鼠足细胞显示MALAT1的 初始增加,然后下降。MALAT1减少后,卩-catenin易位至细胞核,MALAT1RNA 结合蛋白,丝氨酸/精氨酸剪接因子1 (SRSF1)的表达增加。抑制MALAT1通 过抑制MALATllncRNA结合蛋白(SRSF1)来纠正足细胞损伤。发现MALAT1 水平低于P-连环蛋白的调节,并且P-连环蛋白的敲低导致MALAT1水平降低。这 些结果为MALAT1在DN中的潜在作用提供了证据。反义线粒体非编码RNA-2 (ASncmtRNA-2)也已显示在DN的动物模型和高葡萄糖处理的MCs人肾小球系 膜细胞中上调。高等人。结果表明,一氧化氮合酶抑制剂NG-硝基-1-精氨酸甲 酯(L-NAME)可抑制ASncmtRNA-2的表达。此外,ASncmtRNA-2上调伴随着 TGFP1及其下游基因纤连蛋白的增加。这些作者提出ROS介导的ASncmtRNA-2 上调通过增加促纤维化因子的转录来促进DN。报道了来自患有肾病的db/db糖尿 病小鼠和响应于HG的MC中肾组织中14种IncRNA的差异表达。其中, LincRNA-Gm4419显示NF-kB为其靶标,表明其在肾纤维化中的作用。敲除

Gm4419抑制促炎细胞因子的表达,肾纤维化的生物标志物和MCs中[45]的细胞增 殖减少,表明lincRNA-Gm4419通过NF-KB/NLRP3炎性体途径促进MC炎症,纤 维化和增殖高血糖症状[45]。长的非编码RNA牛磺酸上调基因1 (Tugl)调节PPARY 共激活因子a (PGC-la,由Ppargcla编码),并显示在糖尿病环境的肾小球中差 异表达[46]。这种IncRNA的过度表达与糖尿病小鼠的生化和组织学特征的显着改 善以及PGC-la及其下游靶基因的升高表达相关,表明Tugl通过靶向糖尿病小鼠 足细胞中的线粒体生物能量来起作用段等人。最近还发现,Tugl通过 microRNA-377改善了ECM的积聚,靶向DN中的PPARy[47]。DN的主要特征之一 是肾小球中ECM的过度积累。Alvarez和DiStefano报道,IncRNA浆细胞瘤变异易 位1 (PVT1)介导DN中肾小球的ECM积聚[47]。这些作者表明,PVT1调节ECM 相关蛋白(TGF-pi,PAI-1和FN1)的表达。他们的研究结果表明,PVT1通过调 节ECM表达促进DN的进展[48]。Alvarez等人。据报道,miR-1207-5p来源于PVT1 IncRNA,并被肾细胞中的高葡萄糖和TGFP1上调。他们进一步表明像PVT1—样, miR-1207-5p也独立于PVT1增加TGF-pi,PAI-1和FN1的表达。这表明葡萄糖和 TGFP1以其宿主基因PVT1的独立方式调节miR-1207-5p表达。总之,这些结果表 明miR-1207-5p及其宿主基因在DN的发病机制中起重要作用[48]。据报道,基因型 基因座rsl3447075和rs2648862与糖尿病诱导的终末期肾病(ESRD)密切相关[49]。 rsl3447075位于的转录物变体中的一个的编码部分PVT1,指示关联PVT1在介导 敏感性ESRD可归因于糖尿病[49]。观察到db/db和db/m小鼠中IncRNA ENSMUST00000147869的肾皮质表达降低,这与Cyp4al2a水平相关[49]。小鼠MCs 中这种IncRNA的过表达纠正了成纤维细胞增殖和纤维化指数,表明 ENSMUST00000147869在MC增殖和纤维化中的作用以及作为DN的潜在生物标 志物[5()]。加藤等人,报道,在肾小球和MC暴露于TGFP1或高葡萄糖中,40种 microRNA及其宿主IncRNA转录物OncRNA-MGC)的表达增加。此外,在糖尿 病Chop-/-小鼠中观察到簇微小RNA和IncRNA-MGC的表达降低,并且对DN的保 护。敲除lnc-MGC抑制了簇微小RNA的表达,并且还改善了糖尿病小鼠的细胞外 基质沉积和细胞肥大[5()]。因此他们提出IncRNA-MGC可用作控制DN进展的治疗 靶点。周等人,研究了IncRNA MIAT (心肌梗死相关转录物)在糖尿病引起的 肾小管损伤中的作用。他们发现糖尿病诱导的肾小管以及高糖暴露的人肾小管 上皮细胞(HK-2)细胞中MIAT和Nrf2的表达均下降,这与血清肌酐和尿素氮呈 负相关。高葡萄糖下MIAT的过表达诱导的逆转Nrf2表达的抑制作用,表明MIAT/

Nrf2轴作为高糖环境诱导的肾小管上皮细胞损伤的重要信号通路^1。长的非编 码RNA是基因表达的重要调节剂,并通过与特定细胞部分结合来控制基因表达。

IncRNAs的发现为糖尿病微血管并发症的分子病因学增加了一层新的复杂 性。已经鉴定了几种IncRNA并且通过解除调节途径,例如纤维化,氧化应激,

内皮功能障碍等,均涉及糖尿病的微血管并发症。然而,lncRNA的的具体作用 机制尚未有准确的描述。因此,需要进一步探究疾病病因以及病理学中的作用 模式,以了解它们在糖尿病及糖尿病肾病发病机制中的作用。更好地了解新鉴 定的IncRNA的机制可以为早期诊断以及更好的设计治疗方法的铺平道路。我们 的研究前期从人的肾组织、血清、尿液标本开始,均发现了差异差异表达的 LncRNA,并且这种差异具有统计学意义,为了在动物进一步验证以及探讨 LncRNA Dlx6-osl的作用机制,我们分别使用了过表达和shRNA干预LncRNA Dlx6-osl的表达,观察了肾脏结构损伤以及小鼠蛋白尿的变化。

GSK-3P与糖尿病肾病

最近的研究表明,GSK-3P参与各种细胞的凋亡过程。然而,GSK-3P在糖尿 病条件下对足细胞凋亡的功能作用研究较少[52],并且有证据表明,在糖尿病的 条件下足细胞损失牵涉细胞凋亡的过程与db/m小鼠相比,12周龄db/db小鼠 的肾小球中Akt的磷酸化显著降低,并且发现足细胞凋亡与Akt磷酸化的显著降 低相关此外,Snsztak等人^表明高葡萄糖诱导细胞外活性氧产生,p38 MAPK活化,促进足细胞凋亡。他们还首次证明,在小鼠1型和2型糖尿病模型中, 细胞凋亡先于足细胞耗竭,尿白蛋白排泄和肾小球系膜基质扩张[55]。GSK-3P促 进PI3K/Akt活化,从而减低氧化应、内质网应激以及内在凋亡信号,所有这些都 与糖尿病肾病的发病机理有关,因此,GSK-3P被认为在糖尿病条件下促进足细 胞凋亡中起关键作用。

同时,一些先前的研究发现,外源性细胞凋亡信号传导也参与糖尿病肾病 中进行性细胞死亡。使用来自人肾活检标本的显微切割的肾小管间质进行无偏 差基因表达谱分析,发现TRAIL,在糖尿病肾病其诱导骨保护素和Fas的受体表 达。通过免疫组织化学染色评估,肾小球和近端小管TRAIL表达在糖尿病肾脏中 也显著高于对照组[56]。此外,TRAIL以剂量依赖的方式,诱导高葡萄糖培养的 人近端肾小管细胞凋亡增强[56]。相比之下,尽管Verzola等人[57],结果显示,人 糖尿病肾小球和肾小管中凋亡细胞数明显增多,同时Fas和Fas配体表达明显增 加,凋亡与这些分子的表达无明显关联。总而言之,内在和外在的凋亡途径似 乎都与糖尿病肾病中的足细胞损失有关。但是具体GSK-3p的表达在糖尿病肾病 中是否参与到足细胞的损伤中,并且如何参与到糖尿病肾病的发展,尚未有研 究明确说明。我们前期研究结果表明,在高糖培养基和糖尿病肾小球中培养的 足细胞中GSK-3(3活性增加,这增强的GSK-3(3活性与足细胞凋亡有关,提示 GSK-3P促进足细胞凋亡。

基于这些发现,推断GSK-3P在糖尿病条件下参与足细胞凋亡过程,参与足 细胞的损伤机制尚未明确。结合我们前期的研究,GSK-3P在高糖培养的足细胞 中表达升高,并且与miR-346的表达成负相关,在我们本次实验中也发现对 LncRNA Dk6-osl干预会影响GSK-3P的表达,所以GSK-3P可能在糖尿病肾病的 足细胞损伤中起关键作用。

在目前研究的糖尿病性肾病的发病机制中,炎症反应也是重要的组成部分, 有研究证实,在大鼠糖尿病肾病的早期,TLR4在肾小管细胞和足细胞中增加。 可以看到糖尿病肾病中慢性炎症进展的恶性循环,因为上调的TLR4增加了 IL-17 的产生。IL-17A的过表达刺激TLR4信号传导途径。然而,与先前的发现相反, Thl7细胞也可能在糖尿病肾病中发挥保护作用。大量这些细胞的存在似乎延迟 了 1型糖尿病的发作。Thl7的这种自相矛盾的功能需要进一步研究。此外,雷帕 霉素抑制TLR4通过雷帕霉素(mTOR)的机制目标,减少IL-17A水平的增加, 减少白蛋白尿和肾脏恶化。

并且近期有研究证实,免疫相关分子B7-1/CD80是2型糖尿病肾病足细胞损 伤的关键介质。2型糖尿病患者肾活检标本中足细胞B7-1的诱导表达增加。遗传 和流行病学研究揭示了 B7-1基因的两个单核苷酸多态性与糖尿病肾病的关联。 此外,B7-1配体CD28的可溶性同种型水平的增加与2型糖尿病患者的ESRD进展 相关。体外高葡萄糖条件促使足细胞中磷脂酰肌醇3激酶依赖性上调B7-1,并且 足细胞中B7-1的异位表达增加细胞凋亡并诱导细胞骨架的破坏,其被B7-1抑制 剂CTLA4-Ig逆转。在两种小鼠糖尿病肾病模型中体内也诱导了 B7-1在足细胞的 表达,并且用CTLA4-Ig处理防止了这些动物中尿白蛋白排泄的增加并且改善了 肾脏病理学[25]

紧密连接(TJ)在调节肾脏中水和溶质的细胞旁通透性方面起关键作用。 然而,TJ在肾小球足细胞中的功能作用尚不清楚。在糖尿病性肾病中,紧密连

接蛋白,特别是紧密连接蛋白-1的基因表达在足细胞中显着上调,伴随着更紧密 的过滤狭缝和足突之间TJ样结构的出现。有研究报告了一种daudin-1转基因小鼠 模型的产生,该模型具有特异性在肾小球足细胞中的多西环素诱导型转基因表 达。发现成熟足细胞中claudin-1基因表达的诱导导致了严重的蛋白尿[58]。Claudins 是TJ的主要结构和功能组件。紧密连接蛋白是由至少28个成员的家族组成的四 跨蛋白质,其在肾单位的各个区段中表达,包括肾小球[59]。Claudin-1主要在健 康小鼠肾脏的肾小球壁层上皮的TJ表达,在患有糖尿病肾病的动物的足细胞中 被显着上调[6Q]。然而,daudin-1在足细胞病理生理学中的确切作用尚未明确阐明。 我们发现使用了过表达和shRNA干预LncRNA Dlx6-osl的表达,下游炎症因子、 趋化因子的表达也会随之改变。

总的来说,我们的研究着眼于LncRNA Dlx6-osl是否通过竞争性结合miRNA 346调控GSK-3P的表达,并且影响下游炎症因子、趋化因子的表达,从而进一步 探讨糖尿病肾病小鼠足细胞损伤及蛋白尿发生发展的作用机制。

结论

  1. 在2型糖尿病肾病模型鼠db/m中,上调LncRNADlx6-osl的表达,导致肾脏 损伤,产生蛋白尿。
  2. 在2型糖尿病肾病模型鼠db/db中,下调LncRNADlx6-osl的表达,保护肾脏

结构,减轻蛋白尿。

  1. 在糖尿病肾病蛋白尿的发生发展过程中LncRNADlx6-osl可能对GSK-3P 的转录起反馈调节作用;为LncRNADlx6-osl作为DN早期肾损害的生物标记及治疗新靶点提供实验依据。

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综述

LncRNA与糖尿病肾病

摘要:糖尿病肾病是继发于糖尿病的进行性疾病。目前用于疾病临床管理 的策略可以延迟其发作并防止进展,但是相当大比例的患者仍然发展为肾衰竭。 因此,对更先进的药物的需求对改进治疗策略至关重要。最近的研究支持长链 非编码RNA (IncRNA)在人类疾病发IncRNA在糖尿病肾病发展中的调节作用 可能导致鉴定治疗干预的新靶点。

糖尿病肾病

糖尿病肾病是由肾小球毛细血管损伤引起的糖尿病进行性微血管并发症, 其特征为持续性白蛋白尿,肾小球滤过率下降和动脉血压升高。糖尿病肾病的 其他组分包括肾小球病,肾小球膜细胞增殖和细胞外基质(ECM)的积累,以 及受损自噬和增加的肾内一氧化氮的产生[1]。糖尿病肾病是糖尿病患者预期寿命 降低的主要原因。由于糖尿病发病率的增加,糖尿病肾病的年发病率在过去十 年中增加了一倍以上[2],如今占所有终末期肾病(ESRD)的近50%[3]

目前针对糖尿病肾病的治疗选择集中在降低高血压和高血糖以减少白蛋白 尿和减缓疾病进展。血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体阻断剂,高 血压主要是由两种主要类型的治疗剂通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的 管理虽然这两类药物都能有效降低糖尿病肾病患者的高血压和微量白蛋白尿, 但两者都没有显示出预防糖尿病患者发生白蛋白尿的功效[4]。强化血糖控制还可 显著降低糖尿病患者发生微量白蛋白尿和进展为临床严重形式的肾病的风险, 并可能是糖尿病肾病一级预防的最有效方法[5]。尽管在大多数患者中血管紧张素 转换酶抑制剂和血管紧张素II受体阻断剂的有效性不一致,但仍然可以防止糖 尿病肾病和ESRD的发展,肾脏替代疗法可用于控制这些患者的尿毒症和肾功 能衰竭的其他代谢后果,并且这些人的5年生存率<50%[6]。显然,现在我们迫 切需要更有效的治疗策略来预防糖尿病肾病的发展和进展。

LncRNA

在过去二十年中,哺乳动物转录组的深度RNA测序揭示了超过100,000种 不同的RNA,远远超过估计的20,000种蛋白质编码基因,这表明哺乳动物基因 组的蛋白质编码潜力非常有限,而且这些RNA的大部分都是序列确实是非编码 的[7,8]。虽然曾经被认为是“进化性垃圾”或“转录噪音”,但最近的观察结果表明, 非编码RNA (ncRNA)通过与RNA,DNA或蛋白质相互作用来调节蛋白质编 码基因的表达,从而参与细胞的多种生物活动。通常,ncRNA根据其大小分为 两个主要亚类(长链或者短链)。长链ncRNAs (IncRNAs)被定义为由RNA 聚合酶II产生的长于200个核苷酸的转录物但是缺乏蛋白质编码潜力,因此将 它们与小的ncRNA的其他亚类分开,所述小ncRNA的范围从几个到200个核 苷酸并且包括微小RNA (miRNA),小核RNA,环状RNA和小核仁RNA[9]。 与信使RNA (mRNA)相比,IncRNA通常保守性较低,丰富程度较低,组织特 异性较高[1G]。研究已经表明,IncRNAs发挥各种各样的生物学功能,并且它们 的异常表达于不同的疾病,包括癌症和心脏系统,神经系统以及代谢性疾病[11]。 IncRNA的功能的机制仍在不断研究。近来研究增多的是IncRNAs功能在某些情 况下作为转录调节,而其它IncRNAs显示为支架或行为用作诱馆抑制蛋白质或 miRNA的[12],尽管取得了所有这些进展,但IncRNA在许多人类疾病中的分子 功能仍然难以捉摸,需要更详细的功能研究来揭示IncRNAs的生物学作用。

LncRNA与糖尿病肾病

1型糖尿病和2型糖尿病发生率的日益增加是导致各种微血管及大血管并发 症增多的主要原因[13]。大约40%的糖尿病患者会发生糖尿病肾病,也是导致慢 性肾脏病(CKD)和终末期肾病(ESRD)的主要原因。作为基因表达的调节因 子,LncRNAs可以发挥顺式或者反式作用[14],顺式作用的LncRNA沉默或激活 位于同一染色体上的基因表达,而反式作用LncRNA影响染色体上的基因的表 达而不是通过转录他们的基因,是将蛋白质募集到靶位点或转录因子来调节基 因表达[15]。之前研究认为LncRNA被认为具有低水平表达[16]并且已经有大量文 献研究表明,LncRNAs发挥各种各样的生物学功能和它们的异常表达已与不同 的疾病,包括癌症以及心脏、神经、和代谢性疾病有关由于现在DN的治 疗选择仍然有限,因此需要新的有效治疗方法,靶向LncRNA治疗正在逐步进 入人们的视野。随着基因组学技术的进步,包括大规模并行,高通量测序,越 来越多的研究证明了 IncRNA在癌症和其他疾病的发展中的关键作用。例如 五Tug-1、MALAT1、HULC、HOTAIR等与涉及不同形式的癌症生物过

程相关联。尽管对糖尿病肾病中IncRNA的研究相对较新,但已有多项研究支持 这些分子参与疾病的发病机制和进展。

Erbb4-IR

糖尿病肾病(DN)是终末期肾病的主要原因,由于DN的当前治疗选择仍 然有限,因此迫切需要新的有效治疗方法,包括靶向IncRNA的治疗方法[17]。发 现了 IncRNA,lnc-MGC,其作为40个miRNA簇的支架,并且在诱导早期1型 DN的发生发展中起重要作用。此外,最近通过使用2型DN(T2DN)的小鼠模 型办/办进行肾脏肾小球的RNA-Seq分析,确定了一种IncRNA,Tugl (牛磺 酸上调基因1)在DN中的作用[18]。研究发现TUG1水平在人DN中下调,并且 糖尿病小鼠中Tugl的足细胞特异性转基因表达阻止了 DN的生化和组织学特征 的发生[19]

并且有研究发现,在的办/办小鼠模型中新型致病性IncRNA,

五的表征。沿?554-/7?促进转化生长因子P (TGF-P) / Smad信号,是最

关键的促进DN肾纤维化信号传导途径之一@,211利用Smad3基因敲除(KO) 小鼠中的高通量RNA-Seq,在单侧输尿管梗阻性肾病和抗肾小球基底膜肾小球 肾炎小鼠模型中鉴定了 21种与肾脏炎症和纤维化相关的差异表达的IncRNA。 在两种肾损伤模型小鼠中,染色质免疫沉淀证明Smad3蛋白直接与五的 保守启动子区域结合,表明办抑心从是Smad3的直接靶基因。为了探索这种新 型IncRNA在T2DN中可能的功能作用,作者发现了五在野生型小鼠的 肾脏中水平显着上调,而在Smad3KO必/办小鼠中没有显著上调,原位杂交 和荧光原位杂交分析表明,五主要在系膜和肾小管上皮细胞的细胞核中 表达。ErWHWT?你表达通过晚期糖基化终产物通过Smad3依赖性机制而不是高 葡萄糖特异性诱导。重要的是,肾脏特异性沉默五大大改善了办/办小 鼠的肾脏组织学和减少白蛋白尿,可能是由于TGF-p/Smad3介导的抑制肾纤维 化[221在机理上,作者提供了证据表明lncRNA£rW^-/i?作为抑制的诱 饵起作用,这是一种确定的肾脏保护性miRNA,参与糖尿病和非糖尿病条件下

TGF-p/ Smad依赖性肾纤维化的进展。

但是在TGF-p/ Smad3信号传导和IncRNA五之间存在前馈环,因为 通过TGF-p/ Smad3信号通过晚期糖基化终产物正向调节表达,而敲低 五抑制必/必小鼠中TGF-pimRNA表达和Smad3活化[23]。因此,越来 越多的人认识到IncRNAs可能是DN和其他肾脏疾病的潜在新型治疗靶点。致 病性IncRNA的功能丧失,例如Inc -MGC和凡或保护性IncRNA (例如 化以)的功能获得,可能是新的药理学干预策略,以改善微血管和大血管并发 症生化和组织学特征的关键。然而,由于小鼠和人类IncRNAs序列之间的相似 性是适度的,因此理解特定IncRNA的高级结构也是至关重要的[24]

PVT-1

已显示PVT1可增加细胞增殖并抑制细胞凋亡。此IncRNA使用在土著美国 人[一个全基因组关联的方法最初被鉴定为糖尿病ESRD的电位轨迹4 ]和PVT1 变体,至今已用在其他糖尿病肾病有关的人群[25]。PVT1最初的特点是参与了 位于其所在的8号染色体和Burkitt淋巴瘤中其他染色体之间的复发易位[26]。 PVT1的过度表达也有助于卵巢癌,乳腺癌和其他癌症的发展。

在系膜细胞中,PVT1表达被葡萄糖上调,而PVT1的抑制与ECM蛋白, 纤连蛋白和IV型胶原al的mRNA和蛋白水平以及ECM蛋白,TGF-pi和纤溶 酶原激活物抑制剂的调节因子的显着降低相对应。这些发现表明,PVT1可能通 过涉及ECM积累的机制介导糖尿病肾病的发展和进展,这是由于合成增加和特 定ECM组分降解减少所导致的。

虽然PVT1导致ECM失调的机制尚不清楚,但我们发现六个注释的miRNA 中有四个映射到该基因座,miR-1205, miR-1207-3p,miR-1207-5p 和 miR-1208, 人肾小球系膜细胞高血糖上调[27],表明PVT1可能通过miRNA介导的作用影响 ECM的积累。已经报道了具有驻留miRNA的宿主非编码RNA的类似发现。例 如,在肾小球系膜细胞,miR-216a和miR-217,它们都位于IncRNA RP23-298H6.1-001 (RP23),以及 RP23 本身,由 TGF-pi 诱导。这些 miRNA 靶向磷酸酶和张力蛋白同源物,一种Akt活化的抑制剂,导致肾小球系膜细胞 存活和肥大。还发现RP23的抑制降低了 ECM相关基因的表达。在另一个实例 中,miR-192与其宿主基因CJ241444共同调节,其也由TGF-pi诱导[27]。此外, 转录因子HNF-lp显示直接激活编码miR-200簇的IncRNA的转录[28]。来自 HNF-ip敲除小鼠和表达显性失活突变体HNF-ip的肾上皮细胞的肾脏中宿主 IncRNA和miR-200的表达均降低。

MALAT1

MALAT1调节癌症中炎性细胞因子的产生并且在早期糖尿病视网膜病 变中异常表达[3()]。最近的一项研究发现,与年龄和性别匹配的对照动物相比, 来自链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠肾脏中MALAT1表达上调。增加的MALAT1 水平与血清淀粉样蛋白A3, TNF和IL-6基因的上调有关,所有这些都有助于炎 症。此外,MALAT1的抑制阻止了内皮细胞响应高葡萄糖产生活性氧。在暴露 于吸气性缺氧的小鼠中,MALAT1表达在肾近端小管细胞上调⑺,32]。因此,了 解MALAT1在糖尿病背景下影响肾代谢的机制可能会深入了解基于IncRNA的 新型糖尿病引起的微血管并发症治疗策略的发展。

MIAT

MIAT,也称为RNCR2 (视网膜非编码RNA2)或Gomafu,基于其基因座

内的变异与心肌梗塞风险的关联而被鉴定。在糖尿病的微血管并发症中,与非 糖尿病大鼠相比,链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的视网膜MIAT水平明显更高, 而db/db小鼠则是非糖尿病对照组的2型糖尿病模型^1。同样,与非糖尿病患 者的特发性视网膜前膜相比,糖尿病患者纤维血管膜中的MIAT水平显着升高 [33]。相反,在糖尿病大鼠的肾小管中,MIAT水平显着下降,与血清肌酐和血尿 素氮呈负相关[34]。肾小管上皮细胞(HK-2)的高葡萄糖处理也显示MIAT表达 降低。MIAT的过度表达逆转了高葡萄糖介导的对Nrf2的抑制,Nrf2调节细胞 对氧化剂暴露的抗性。发现MIAT改善Nrf2稳定性,导致细胞活力增加。相反, MIAT沉默对细胞活力的影响被Nrf2过表达逆转[34]。视网膜和肾小管之间不同 发现的原因可能源于MIAT在每种特定细胞类型中可能发挥的不同作用。在视网 膜中,糖尿病条件下MIAT表达的抑制改善了体内视网膜微血管功能障碍,并通 过作为miR-150-5p的竞争性内源性海绵,在体外抑制内皮细胞增殖,迀移和管 形成,并产生反馈环VEGF和miR-150-5p。探索肾小管细胞中MIAT -miR-150-5p 关系的其他研究可能会揭示这些差异。

CYP450

使用IncRNA阵列和定量RT-PCR,与对照db/m动物相比,观察到具有糖 尿病肾病早期症状的肥胖2型糖尿病db / db小鼠肾组织中CYP4B1-PS1的显着 下调[35]。CYP4B1-PS1-001在许多肾细胞中表达,例如HK-2, BHK-21和小鼠肾 小球系膜细胞(MMC)。在高葡萄糖水平的存在下,MMC显示增殖增加,其 被CYP4B1-PS1-001逆转。过表达CYP4B1-PS1-001在高葡萄糖条件下的MMC 中,增殖细胞核抗原和细胞周期蛋白D1的水平也降低,这两者都是增殖的指标, 以及纤维连接蛋白和胶原蛋白I,它是高葡萄糖条件下ECM的主要成分。相反, MMC中的CYP4B1-PS1-001敲低对应于在低葡萄糖条件下增殖细胞核抗原,细 胞周期蛋白D1和纤连蛋白的表达增加。这些结果支持CYP4B1-PS1-001在MMC 的增殖和纤维化中的作用,但是这种IncRNA促成ECM失调的机制目前仍不清 楚。

对从链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠和未治疗的对照动物的肾小球获得的 RNA的测序发现,在小鼠12号染色体上的DLK-DI03基因组区域内的miRNA 簇显着上调[18]。该 miRNA megacluster 由 lnc-megacluster (Inc-MGC) IncRNA 主持。在糖尿病肾病小鼠模型和用TGF-pi或高葡萄糖处理的肾小球系膜细胞的 肾小球中,近40个miRNA和lnc-MGC的巨型细胞的表达协调增加。鉴定了巨 型细胞内miRNA的几种常见靶基因,包括TNRC6B,CUGBP2, CPEB4, PUM2, BHC80, ATF3和EDEM3,与对照动物相比,在糖尿病小鼠的肾小球中显着减 少,并且相对于对照条件,用TGF-J31或高葡萄糖处理的MMC显着减少。基于 证据表明lnc-MGC受内质网,应激相关转录因子,Chop (或DNA损伤诱导转 录本3)的调节,作者用ChopsiRNA处理MMC并观察到高葡萄糖和TGF-pi 诱导的水平降低lnc-MGC表达式。在糖尿病诱导的Chop-knockockout小鼠的 肾小球中,Inc -MGC的水平候选簇miRNA也显着下降。用靶向lnc-MGC的单 一寡核苷酸处理影响宿主IncRNA,常驻miRNA簇,簇miRNA和促纤维化基因 的靶基因的表达,以及小鼠和人肾小球系膜细胞中糖尿病肾病的特征性降低。 该研究优雅地证明了新的IncRNA及其组成miRNA在糖尿病肾病中的广泛功 能,并引入了潜在药理学干预的新靶点。

LncRNA作为治疗干预目标

虽然IncRNA代表有吸引力的候选物作为治疗靶标,但该领域目前仍处于发 育的早期阶段。然而,用于靶向蛋白质编码基因表达的方法可用于体内操作 lncRNA[36]。例如,与编码转录物一样,可以使用RNAi技术抑制IncRNA水平[37]。 该方法利用结合互补序列并抑制IncRNA靶标表达的siRNA。SiRNA不仅是阐 明基因功能的有用工具,而且它们也代表了一类令人兴奋的治疗方法。许多基 于siRNA的疗法的临床试验正在进行中,特别是对于癌症的治疗,并且可以在 其他地方找到对这些的全面综述[38]。基于siRNA的治疗剂抑制癌症和其他疾病 中的基因表达的能力,以及在动物模型中没有相应的毒性增加的效力的改善, 表明这些分子可以有效靶向IncRNA的表达和功能。或者,可以引入反义寡核苷 酸(ASO)和锁定的核酸GapmeR以分别阻断IncRNA活性或诱导酶介导的降解。 在注射人肺癌细胞的小鼠中,靶向MALAT1的ASO在肿瘤细胞和相关的基质 细胞中积累,并有效地减少肿瘤转移[39]。进行腹腔注射针对MALAT1的GapmeRs 以确定IncRNA是否是小鼠后肢缺血后出生后新生血管形成所必需的[4Q]。 GapmeRs治疗显着抑制血流恢复和毛细血管密度,并损害内皮细胞增殖,导致 血管生长减少。在另一项研究中,针对心脏肥大相关转录物(一种与病理性心 脏重塑相关的IncRNA)的GapmeRs有效地预防了肥大和疾病的发展%。通过 基于核酸的治疗方法差异性地敲除亚细胞IncRNA分布。核因子IncRNA似乎被 ASO更有效地抑制,而细胞质IncRNAs受到siRNAs的强烈影响[42],而利用 RNAse-H依赖性降解的GapmeRs适用于核或染色质相关的IncRNAs [43]。因此, 考虑感兴趣的IncRNA的亚细胞定位是重要的,因为某些方法,例如RNAi,可 能不适合核或染色质相关的IncRNA,因为RNA诱导的沉默复合物定位于胞质 溶胶中[43]

IncRNA也可以通过阻断分子相互作用来靶向。例如,使用掩盖蛋白质结合 位点的小分子抑制齐II,或结合IncRNA上的蛋白质结合位点并干扰IncRNA-蛋白 质相互作用的简单寡核苷酸,可以抑制这些分子的功能效应。虽然IncRNA功能 的分子机制仍未完全了解,但蛋白质复合物的分子支架和染色质复合物指南等 特征可能成为干扰的目标。例如,破坏HOTAIR与PRC2之间的相互作用可能 会减少乳腺癌的转移。

靶向IncRNA的另一种方法是通过破坏二级结构。例如,设计用于结合靶 IncRNA的小分子抑制剂可以改变二级结构特征。同样地,靶向IncRNA中特定 序列的寡核苷酸可用于消除天然折叠。在有益的IncRNA缺失导致疾病发展的情 况下,换句话说,在肾小球膜细胞中具有ECM降解的激活剂的情况下,可以使 用基因治疗方法来恢复缺失分子的水平。

糖尿病肾病中新兴的IncRNA领域不仅提供了增强我们对疾病发病机制的 新机制的了解的机会,而且还开发了用于治疗和预防疾病的改进疗法。因为 IncRNA显示组织和细胞类型特异性表达,它们代表药物开发的理想靶标。然而, 在临床主流应用之前,需要解决IncRNA的快速生物降解相关的问题。在未来十 年内,我们预计反义技术的发展将在临床中有效地抑制IncRNA的表达,并且其 他技术成功临床应用以抑制或恢复lncRNA表达和功能将为开发用于治疗糖尿 病肾病的类似方法提供机会。尽管siRNA,ASO和GapmeRs在治疗人类疾病方 面具有潜在的治疗价值,但在这些方法成为临床现实之前,仍然需要解决与这 些技术的稳定性,细胞摄取和脱靶效应相关的挑战[38,44][35,41]

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