荔枝核总黄酮靶向AKT/mTOR&NF-KB双通路抑制前列腺癌细胞的生长和转移论文

2020年2月26日20:34:36荔枝核总黄酮靶向AKT/mTOR&NF-KB双通路抑制前列腺癌细胞的生长和转移论文已关闭评论

荔枝核总黄酮靶向AKT/mTOR&NF-KB双通路抑制前列腺癌细胞的生长和转移论文

摘要

研宄背景和目的:前列腺癌是老年男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿 瘤之一,其发病率呈明显的增长趋势,且前列腺癌极易发生转移,从而引 发一系列并发症,导致患者死亡。因此,探索和开发治疗前列腺癌的新药 物显得尤为迫切。在前期研究中,我们发现荔枝核总黄酮可明显抑制前列 腺癌细胞的生长和转移,但深入的分子机制尚不明确。本论文选用不同类 型的前列腺癌细胞,采用多种现代分子生物学研究手段,围绕细胞周期调 控、凋亡、转移等方面,探索荔枝核总黄酮抑制前列腺癌细胞生长和转移 的分子机制。

研究方法:利用MTS实验检测了荔枝核总黄酮对前列腺癌细胞增殖的 影响;利用细胞平板克隆实验检测了荔枝核总黄酮对前列腺癌PC3和 DU145细胞体外克隆形成能力的影响;利用流式细胞检测技术,分别检测 了荔枝核总黄酮对前列腺癌PC3和DU145细胞周期和凋亡的影响;分别采 用细胞划痕实验和Transwell实验检测慕枝核总黄酮对前列腺癌PC3和 DU145细胞迀移和侵袭能力的影响;通过观察前列腺癌细胞形态的变化, 探索了荔枝核总黄酮对前列腺癌细胞上皮-间质样转化(EMT)的影响,并通 过Western-Blot检测了蒸枝核总黄酮对前列腺癌细胞中EMT相关蛋白标记 物的影响;为了深入探索荔枝核总黄酮抗前列腺癌的分子机制,我们通过 Western-Blot技术对荔枝核总黄酮可能调控的信号通路上的关键蛋白的表 达情况进行了检测;

研宄结果:MTS实验显示了荔枝核总黄酮可明显抑制前列腺癌细胞 (PC3、DU145)的体外增殖;平板克隆实验进一步证实了荔枝核总黄酮可抑 制前列腺癌PC3、DU145细胞的克隆形成,且与浓度呈正相关;流式细胞 术检测发现荔枝核总黄酮可诱导PC3和DU145细胞的凋亡,但对细胞周期 无调控作用;细胞划痕和Tmnswell实验证明了荔枝核总黄酮降低了前列腺 癌细胞的迀移和侵袭能力;荔枝核总黄酮诱导前列腺癌细胞的形态发生了 明显的改变,并且上调了细胞上皮样蛋白标记物E-cadherin,P-catenin的表 达,同时下调了 Vimtenin的表达,证实慕枝核总黄酮抑制前列腺癌细胞的 转移与EMT相关;通过Western-Blot实验,我们发现了荔枝核总黄酮对卩- AMPK a、Wnt 3a、p-MEKl/2等蛋白无调控作用,但是可显著降低了 p-AKT 及其下游的p-NF-kB、p-mTOR、p-lKBa的表达;

结论和应用:荔枝核总黄酮通过抑制AKT信号通路的激活,靶向 NF-kB、mTOR双通路,减弱肿瘤细胞EMT的发生,诱导前列腺癌细胞发 生凋亡,进而抑制前列腺癌细胞的体外生长和转移。该研究为荔枝核总黄 酮的开发和应用提供了理论基础。

关键词荔枝核总黄酮,前列腺癌,肿瘤转移,EMT,AKT

TOTAL FLAVONOIDS OF LICHI SEED DIMINISH
PROSTATE CANCER PROGRESSION AND METASTASIS
VIA AKT/mTOR&NF-KB DUAL PATHWAY

ABSTRACT

Background: Prostate cancer(PCa) is one of the most common malignant tumors in the genitourinary system in the elderly. Its incidence rate is obviously increasing, and PCa is highly prone to metastasis, which causes a variety of complications, leading to death. Therefore, it is particularly urgent to explore the new drugs for the treatment of PCa. In our previous study, we found that total flavonoids of litchi seed(TFLS) can significantly inhibit the growth and metastasis of PCa? but the molecular mechanism is still unclear. In order to investigatethe underlying molecular mechanism of TFLS anti-prostate cancer and its metastases,different experiments on cell cycle regulation, apoptosis, metastasis were designed in vitro.

Methods: The effects of TFLS on cell proliferation of PCa cells were explored by MTS assay; Colony formation assay was performed to determine the inhibiting effects of TFLS on PC3 and DU145 cells lines; Flow cytometry was used to detect the effects of TFLS on cell cycle and apoptosis of PC3 and DU145 cells lines; In order to explore the effect of TFLS on the metastasis of

PCa cells5 we examined the effect of TFLS on the migration of PC3 and DU 145 cells lines by wound healing test, and evaluated the effect of TFLS on the invasion ability of PC3 and DU145 cells lines using Transwell assay; The effects of TFLS on epithelial-mesenchymal transition (EMT) of PCa cells were examined by observing the morphological changes of PCa cells and detecting the expressions of EMT-related protein using Western-Blot; The possible signaling pathways regulated by TFLS were detected by Western-Blot.

Results: MTS assay showed that TFLS inhibited the proliferation of PCa cells in vitro; Colony formation assay confirmed that TFLS inhibited the colony forming ability of PCa cells in a dose-dependent manner; Cell cycle and apoptosis experiment found that TFLS had no effect on cell cycle, but it could induce apoptosis of PCa cells; Wound healing test and transwell assay demonstrated that TFLS reduced the migration and invasion ability of PCa cells; The TFLS induced the morphological changes of PCa cells, and up-regulated the expression of E-cadherin and P-catenin5 down-regulated the expression of Vimtenin; We also found that the TFLS have no regulation on p-AMPK a? Wnt 3a? p-MEKl/2? but it can significantly reduce the expression of p-AKT and its downstream proteins, such as p-NF-kB? p-mTOR and p-IkB a.

Conclusions: TFLS inhibit the growth and metastasis of PCa cells via induction of apoptosis and attenuation of EMT through AKT/mTOR&NF-KB dual signaling. This study provide a theoretical basis for the development and application of TFLS.

KEY WORDS TFLS,Prostate cancer,metastasis,NF-kB,EMT

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是老年男性泌尿生殖系统最常见的恶 性肿瘤之一,广泛出现于欧美等发达国家。2018年,全球男性中,PCa的 发病率位居所有类型的恶性肿瘤第二位,占到总数量的13.5%,另外,有 105个国家男性发病率最高的恶性肿瘤均是前列腺癌[1]。在美国,PCa造成 的死亡人数位居肿瘤相关死亡的第二名,仅次于肺癌[2]。我国的PCa的发 病率和死亡率虽然低于欧美等国家,但是自2000年以来,随着我国人民生 活水平的提高、人均寿命的增加、人口老龄化的不断加剧,PCa的发病率 呈明显的上升趋势[3]。PCa严重的烕胁着人们的生命健康,影响着人民的生 活质量,已经成为最难解决的一个公共卫生问题。

目前,对于PCa的治疗,主要有外科手术、雄激素阻断治疗、放射治 疗、分子靶向治疗、免疫治疗等[4]。随着医疗水平的提高,早期PCa的治 疗效果越来越理想,PCa原位癌的五年生存率已经接近100 %[5]。由于PCa 发病隐匿,早期临床症状不明显,因此许多PCa患者确诊时已经到了晚期 或已经发生了远端转移[6],目前的医疗水平对于转移性PCa的治疗效果非 常不理想,其致死率超过了 80%%严重威胁到患者的生命健康。因此, 寻求新型、安全有效的防治PCa及其转移的药物具有重要的意义。

近些年,天然药物凭借其药效确切、不良反应小的特点吸引了众多肿 瘤领域研究者的目光[8]。天然的中草药物作为恶性肿瘤(包括PCa)手术及 放化疗的辅助治疗手段,在提高患者生存质量,减轻临床症状,延长生存 期等方面已经显示出其独特的优势。一方面,许多草本药物可以改善化疗 引起的恶心、呕吐以及顺铂治疗引发的厌食症,进而提高肿瘤患者的生活 质量[91()]。另一方面,天然药物可以预防因免疫治疗造成的患者体内的免疫 细胞和细胞因子紊乱,提高免疫治疗的疗效,增加患者的生存期[n]。天然
药物不仅可作为肿瘤治疗过程中的辅助药物,而且多种天然药物提取物已 经成为肿瘤治疗领域的主力军。从植物红豆杉中提取的紫杉醇已经成为了 乳腺癌和卵巢癌治疗的一线药物从喜树杆中分离提取的喜树碱及其衍 生物对于多种恶性肿瘤都有明显的抑制作用,目前喜树碱类药物伊立替康、 拓扑替康、伊立替康等药物都先后获得了美国FDA批准上市,广泛应用于 治疗晚期结肠癌、直肠癌等,且效果显著[13_15]

惹枝核为无患子科植物蒸枝(LitchichinensisSonn.)的干燥成熟种子。 其性温,味甘、微苦,归肝、肾经。有行气散结、祛寒止痛之功,主治寒 疝腹痛,睾丸肿痛等证[16]。在中医临床上,荔枝核常常配伍用于治疗前列 腺炎、睾丸炎、前列腺增生等男性泌尿生殖系统疾病[17_19]。随着对荔枝核 研宄的深入,发现荔枝核有多种生物学作用,包括抗病毒、抗氧化、抗肝 损伤和降血糖等[2Q]。同时,越来越多的研宄己经证实了荔枝核提取物具有 显著的抗肿瘤作用。研宄发现,荔枝核乙酸乙酯相提取物可以抑制肝癌 HepG2细胞的增殖,且效果显著,其IC50仅为59.52(ig/ml[21];荔枝核提取 物可以调控EGFR及其下游Akt和Erk-1 / 2信号通路,通过阻滞细胞周期 于G1或G2/M期,诱导肺癌细胞凋亡,抑制肺癌细胞的增殖[22]。HsuCP 等[23]发现,荔枝核乙醇提取物以剂量依赖方式显著诱导细胞凋亡,并促使 结直肠癌细胞G2/M细胞周期停滞,进而抑制结直肠癌细胞的增殖。目前, 对于荔枝核提取物中抗前列腺癌的活性成分及分子机制的报道相对较少, 这引起了我们的关注。

在前期的工作中,我们发现:蒸枝核正丁醇提取物(n-butyl alcohol extract of Litchi seed,NLS)对PCa多种细胞株均有明显的生长抑制作用[24]。 但是,由于荔枝核成分复杂,荔枝核中抗肿瘤的主要成分和具体的分子机 制尚不明确,这无疑给荔枝核的开发和应用增加了难度。在此基础上,我 们对NLS中的化合物进行了检测,发现NLS中主要包括黄酮类,酚类,倍 半萜和脂肪酸等成分,其中荔枝核黄酮类化合物(本文称为荔枝核总黄酮,

TotolFlavonoidofLichiSeed,TFLS)含量最高。另一方面,有研宄已经证

实荔枝核和荔枝果肉中的黄酮类化合物具有抗乳腺癌MCF-7细胞的活性, 其机制可能与调控线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡相关[25,26],提示TFLS 可能是荔枝核中发挥抗PCa的主要活性成分。鉴于此,我们在本研究中首 先对荔枝核中的总黄酮进行了提取分离,并进一步研究了 TFLS抑制PCa 细胞生长和转移的作用及分子机制,以期为蒸枝核在PCa治疗上的开发和 应用提供理论依据。

  1. 实验材料与方法

2.1实验材料 2.1.1细胞系

人PCa细胞株PC3、DU145细胞均由广西医科大学转化医学研宄中心 &长寿与老年相关疾病教育部重点实验室提供。

2.1.2王要药品

荔枝核购自广西生源堂 2.1.3主要实验试剂

  • RPMI-1640培养基、杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)购自维森特生物技 术有限公司;
  • 胎牛血清、100 x青霉素/链霉素混合液、〇.〇5 %胰酶细胞消化液购 自美国Gibco公司;
  • CellTiter 96® AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS试剂盒, Cat. G3581)购自 Promega 公司;
  • 细胞凋亡检测试剂盒(Cat. 556547)、细胞周期检测试剂盒(Cat. 340242)购自美国BD公司;
  • 总蛋白提取细胞裂解液RIPA(Cat.R0278)、甘氨酸(Cat.V900144)、 Tween-20(Cat. P1379)、氯化钠(Cat. 746398)、APS(Cat. A3678)、TEMED(Cat. T9281)、1% 结晶紫溶液(Cat. V5265)、BSA(Cat.A1933)购自美国 Sigma 公 司;
  • 蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Cat. A32961)、蛋白Marker(Cat. 26616)、 Restore™ PLUSWesternBlotStrippingBuffer(Cat. 46430)、ECL 化学发光检 测试剂盒(Cat. 32106)购自美国ThermoFisher公司;
  • BCA蛋白定量检测试剂盒(Cat. P0011)购自中国碧云天生物科技公

司;

  • 4 x SDS-PAGE蛋白样品缓冲液(Cat. 9173)购自日本TaKaRa公司;
  • Tris碱、SDS购自Genbase生物公司;
  • 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺30%溶液(30%八〇71&111丨(^,。31:. B546017)、4xTris-HCl 分离胶配胶缓冲液,pH8(Cat. C506033)、4x Tris-HCl浓缩胶配胶缓冲液,pH6.8(Cat.C506034)、5x丽春红染色溶液 (Cat. C520005)、脱脂奶粉(Cat. A600669)、4 %多聚甲醛固定液(Cat. E672002) 均购自上海生工生物工程公司;
  • 大孔树脂(Cat.218A011)购自中国Solarbio公司。

2.1.4主要实验耗材

  • 细胞培养瓶(25/75/225 cm2)、细胞培养皿(6/10 cm)、细胞培养板 (6/12/24/48/96 ?L板)、离心管(15/50 ml)、冻存管、移液吸管(1/2/5/10 ml)、 胶原包被Transwell侵袭小室(Cat. 354483)购自美国康宁公司;
  • 10/200/1000 (il 枪头、1.5 mLEP 管购自 AXYGEN 公司;
  • 细胞流式管购自美国BD公司;
  • 22|im微孔细胞过滤器(Cat.SLGP033RB)购自美国密理博公司;
  • —次性针头(直径)25 mm有机系滤器,0.22 |im(Cat. YA0652)购自 索莱宝公司。

2.1.5主要仪器设备

  • 电动移液枪(Eppendorf公司,德国);
  • 细胞培养箱(Thermo公司,美国);
  • 生物安全柜(Thermo公司,美国);
  • 高压蒸汽灭菌锅(GR60DR,ZEALWAY公司,美国);
  • 制冰机(AF206,斯科茨曼集团,美国);
  • 超纯水仪(Milli-QIQ7000,默克密理博公司,美国);
  • 送风定温恒温箱(DKN812C,YAMATO公司,日本);
  • 高速冷冻离心机(CentrifUge 5424R,Eppendorf公司,德国);
  • 脱色摇床(TS-1000型,江苏省其林贝尔仪器制造有限公司);
  • 电泳仪(Powerpac Basic 型,Bio-Rad 公司,美国);
  • 化学发光/荧光/凝胶成像仪(ChampChemi 610,北京赛智创业科 技有限公司,中国
  • 自动填充式液氮罐(Thermo公司,美国);
  • 37°C常规培养箱/烘箱(DNP-9162型,精宏公司,中国);
  • 电子分析天平(奥豪斯CP214型,上海天平仪器厂,中国);
  • 4°C冷藏冰箱、-20°C冷冻冰箱、-80°C低温冰箱、-150°C超低温冰 箱(海尔公司,中国);
  • 荧光倒置显微镜(奥林巴斯科技公司,日本);
  • 全波长酶标仪(Thermo公司,美国);
  • PH 计(Sartrious 公司,德国);
  • 全自动细胞计数仪(CountessII型,Thermo公司,美国
  • 流式细胞分析仪(BDAccuriC6型,BD公司,美国);

2.1.6抗体

  • E-cadherin 单克隆抗体(CST,Cat. 8834);
  • Vimentin 单克隆抗体(CST,Cat. 3390);
  • p-Catenin 单克隆抗体(CST,Cat. 25362);
  • Wnt 3a 兔多克隆抗体(Abeam,Cat. ab28472);
  • p-AKT(Ser473)单克隆抗体(CST,Cat. 4060);
  • AKT 单克隆抗体(CST,Cat.4091);
  • p-AMPKa(Thrl72)单克隆抗体(CST,Cat.50081);
  • p-p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)单克隆抗体(CST,Cat. 4370);
  • p-MEKl/2(Thr286)多克隆抗体(CST,Cat. 9127);
  • P-IkBol (Ser32)单克隆抗体(CST, Cat 2859);

 

  • IkBa单克隆抗体(CST,Cat. 9242);
  • p-NF-KBp65(Ser468)单克隆抗体(CST,Cat. 3039);
  • NF-kBp65 单克隆抗体(CST,Cat. 8242);
  • p-mTOR(Ser2448)单克隆抗体(CST,Cat. 5536);
  • mTOR 单克隆抗体(CST,Cat.2983);
  • GAPDH 单克隆抗体(CST,Cat. 97166);

2.1.7主要工作液及试剂的配制方法

  • 蛋白质电泳缓冲液(10 x Running buffer)

试剂 Tris 碱 甘氨酸 SDS

加入适量灭菌蒸馏水搅拌溶解,再用蒸馏水定容至1000 ml,室温保存 备用,使用时用蒸馏水稀释10倍即可;

⑺蛋白质转印缓冲液(储存液)(10 x Transfer buffer)

试剂                                      用量(g)

Tris 碱                                       19

甘氨酸                                        90

加入适量灭菌蒸馏水搅拌溶解,再用蒸馏水定容至1000 ml,室温储存 备用。

  • 蛋白质转印缓冲液(工作液)(1 xTransferbuffer)________________________________________________________

试剂                                      用量(g)

甲醇                                         200

10 x Transfer buffer                          100

用蒸馏水定容至l〇〇〇ml,充分混匀后使用。

⑷TBS缓冲液(10 x洗膜液)

试剂 氯化钠 Tris 碱

加入适量灭菌蒸馏水搅拌溶解,再用浓盐酸调pH到7.60附近,最后入RPMI-1640培养基、胎牛血清、100X青霉素/链霉素混合液,使胎牛血 清的终浓度为10%,青霉素/链霉素混合液的终浓度为1%,在4°C冰箱储 存备用;

(11) 0.025 %结晶紫工作液

充分混匀后,4°C保存备用。

  • TFLS 储存液(50mg/ml)

精确称量100 mg TFLS粉末,加入2 ml DMSO,在涡旋振荡器上反复 震荡,使TFLS充分溶解。用0.22 um的一次性针头(有机系)滤器过滤药物, 将过滤后的药物按照50 ul/管的体积分装于离心管中,储存于-20 °C备用。 避免反复冻融TFLS储存液,尽量避光使用。

  1. 2实验方法

2.2.1荔枝核总黄酮的提取

  • 回流

⑴配制回流液:取30 L蒸馏水,加入30 L无水乙醇,配置成50 %的 乙醇回流液;

  • 称取1 kg荔枝核粉末装入20 L蒸馏瓶中,倒入10 L回流液。安装 好回流装置,加热至液体微微沸腾,持续1.5 h,此时液体呈暗红色;
  • 使用四层纱布抽滤收取提取液,再次回流,得荔枝核粗提物。

2.2.1.2大孔树脂预处理

使用2 kg大孔树脂填充玻璃柱,加入2.5 L 85 %的乙醇清洗玻璃柱; 然后加入4 L纯净水清洗玻璃柱至液体澄清,pH值为中性。

  • 纯化
  • 将粗提物浓缩3倍体积后,使用8层纱布过滤,待上样;
  • 配制20 %和70 %的乙醇回收液;

 

  • —次上样1.7L上样液lh,加入2.5L20%的乙醇洗脱液洗脱lh; 加入5L70%的乙醇洗脱液洗脱,各流份留样。上样时样本黄斑集中在柱子 上部,随着洗脱过程的进行,逐渐向下移动;
  • 95%乙醇留柱过夜再生,次日上样前纯水洗至澄清中性。
  • 干燥
  • 将2.5 L的70%乙醇洗脱液浓缩至1L得干燥液;
  • 在80-90°C下,过夜干燥,得暗红色粉末;次日将液体挥干且手触 无粘性易碎即得TFLS提取物,精密称量后装于离心管。

2.2.1.5荔枝核总黄酮含量测定(香草醛-盐酸法)

  • 标准曲线测定:精密称取1.00mg(+)-儿茶素标准品,置于25mL 容量瓶中,定容后摇匀,配置成0.4 mg/mL的标准溶液。使用移液枪分别 吸取 04mg/mL 的标准溶液 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL 于 10 mL 具塞刻度试管中,再分别加入6 mL 40 g/L的香草醛甲醇溶液、3 mL浓盐酸, 加入适量超纯水定容混匀,于31°C恒温水浴2 h。以浓度为零标准溶液为空 白液调零,测量500 nm处吸光度A。以质量浓度C为横坐标,吸光度A为 纵坐标,制作标准曲线。
  • TFLS含量测定:分别精密称取供试品1.08 mg、1.83 mg、2.61 mg, 置于25 mL容量瓶中,加入50 %乙醇5ml,超声溶解,加入超纯水定容摇 匀。各取lml供试品液于10 mL具塞刻度试管中,再分别加入6 mL 40 g/L 的香草醛甲醇溶液、3mL浓盐酸,加入适量超纯水定容混匀,于31°C恒温 水浴2h。测量500nm处吸光度A。根据标准曲线,计算TFLS含量。

2.2.2细胞培养

在37°C,5%C02恒温条件下培养PCa细胞株PC3、DU145细胞。细

胞培养时,使用常规RPMI-1640完全培养基,一般要求隔天更换新鲜培养

基。

2.2.2.1细胞复苏

 

  • 提前打开水浴锅,并将温度设置为37°C,将RPMI-1640完全培养 基放在37 °C水浴锅中预热;

⑺将用75 %消毒酒精擦拭过的RPMI-1640完全培养基转移至超净台 内,准备好15 ml离心管,做好标记,加入9 ml预热好的完全培养基;

  • 提前准备好细胞复苏盒,查询好待复苏的细胞存放位置。戴上低温 保护手套小心从液氮罐中取出存放细胞的冻存盒,使用镊子迅速取出待复 苏的细胞,并将其存放于准备好的细胞复苏盒中;
  • 取出冻存管,检查冻存管盖是否拧紧,将冻存管底部插入37°C水 浴锅中,快速摇晃冻存管以解冻细胞,为防止细胞污染。冻存管管口切勿 没过水浴锅中的水位。当冻存管中的冻存液溶解到只剩“黄豆粒”大小时,使 用消毒酒精喷壶润湿擦手纸,轻轻擦拭冻存管外壁及管口。在生物安全柜 中,使用移液管迅速将冻存管中的冻存液转移到准备好的15 ml离心管中;
  • 1000 rpm/min,离心3 min。离心过程中,准备好25 cm2的细胞培养 瓶,用标记笔在培养瓶外侧壁上注明细胞信息。离心结束后用真空负压装 置和巴氏吸管吸走上清,注意离心管底部以免吸走细胞;

⑹加入5 ml RPMI-1640完全培养基,用移液枪小心吹打细胞沉淀以 重悬细胞,将细胞悬液转移至25 cm2的细胞培养瓶。将细胞培养瓶转移至 37 °C,5 % C02的细胞孵育箱中,并将其按照“十”字交叉摇晃以确保细胞在 培养瓶中均匀生长;

  • 24 h后,更换新的细胞培养基,去除培养基中残留的DMSO。具体 方法是:吸走细胞培养上清,加入5 mlD-PBS,轻轻摇晃细胞瓶,洗去细 胞碎片及死细胞,用真空负压装置和巴氏吸管吸走D-PBS,使用移液管沿 细胞培养瓶的侧壁缓慢加入5 ml新的RPMI-1640完全培养基,转移细胞培 养瓶至细胞恒温孵育箱中继续培养;
  • 为保证细胞生长状态,一般需要隔天进行细胞换液,待细胞汇合度 达到80 %〜90 %时即可进行细胞传代操作。

2.2.2.2细胞传代

由于肿瘤细胞具有持续分裂、增殖和生长的能力,若细胞培养容器中 的细胞汇合度过高,细胞直接接触会造成细胞难以继续生长繁殖,此时需 要进行细胞分瓶培养以保证细胞生长状态良好。

(1:)提前将RPMI-1640 完全培养基、0.05%胰酶细胞消化液、D-PBS 缓冲液放入37°C水浴锅中预热;

  • 用真空负压装置和巴氏吸管吸走旧培养基,加入合适体积D-PBS, 轻轻摇晃培养瓶,小心吸去D-PBS;
  • 根据细胞器皿加入合适体积的0.05 %胰酶细胞消化液,一般25 cm3 加入lml,75 cm3加入2 ml,轻晃细胞培养瓶底部,使细胞消化液与细胞 充分接触。然后将细胞培养瓶放置在细胞培养箱中孵育一段时间。由于不 同肿瘤细胞的贴壁及粘附能力的存在差异,因此用0.05 %胰酶细胞消化液 孵育的时间是不同的,?03、〇1;145细胞一般在37°〇孵育21^11左右。孵 育后,用倒置显微镜观察肿瘤细胞细胞形态,若细胞体积收缩变圆表明此 时细胞粘附力下降,消化适度,立即加入完全培养基,终止消化;若细胞 体积未变圆,可适当延长消化时间。小心吹打细胞,使细胞彻底分离,将 培养瓶中所有液体转移至一个干净的离心管中。
  • 1000rpm/min,离心3min。弃去细胞培养上清,加入合适体积的完 全培养基,重悬细胞沉淀。根据细胞数量,将细胞悬液转移至合适大小的 细胞培养器皿中,置于37 °C,5 % C02恒温孵箱中静置培养。

2.2.2.3细胞计数

实验室通过Countess II型全自动细胞计数仪进行细胞计数,具体操作 方法如下:

⑴取出细胞,D-PBS清洗细胞后,用0.05 %胰酶细胞消化液消化细胞, 使用完全培养基中止消化,1000 rpm/min,离心3 min;

  • 用酒精清洗自动细胞计数板,显微镜下观察,确保计数板中无细胞

残留;

  • 离心后,弃细胞上清,加入合适体积的完全培养基,使用移液管反 复吹打,重悬细胞,制备成单细胞悬液。充分混匀后,吸取细胞悬液20 |Lll, 按照;h 1的体积加入20 |Lll台盼蓝染液,用移液枪吹打混匀,取10 jlll缓慢 打入自动细胞计数板中;
  • 将自动细胞计数板插入CountessII型全自动细胞计数仪中,待仪器 完成自动对焦后,根据细胞类型,调整细胞相关参数,如细胞的横纵比等, 点击自动计数;
  • 记录全自动细胞计数仪上显示的活细胞数量。

2.2.2.4细胞冻存

由于肿瘤细胞具有持续分裂增殖的特性,为防止细胞体外培养出现污 染、细胞特性和功能改变,可将肿瘤细胞培养代数比较小的细胞储存于低 温环境下,供后续研究使用。细胞生长主要分为四个时期,分别是:调整 期、对数生长期、稳定期和衰亡期。处于对数生长期的细胞,细胞活力和 状态都是最佳的,可选择处于对数生长期的肿瘤细胞进行细胞冻存。

⑴提前将RPMI-1640完全培养基、已过滤的胎牛血清、0.05 %胰酶细 胞消化液、D-PBS缓冲液放入37°C水浴锅中预热;

  • 准备好细胞冻存盒,在冻存盒底部加入合适体积的异丙醇。
  • 配制细胞冻存液:实验室常规的方法是按照完全培养基:胎牛血清: DMSO=6:3:l的比例,配制合适体积的冻存液。可根据细胞培养特性调整胎 牛血清的比例。充分混匀后备用。冻存液宜现配现用或储存于4°C冰箱,在 1周之内使用完毕;
  • 取出状态良好的细胞,使用0.05 %胰酶细胞消化液消化细胞,消化 完成后,1000rpm/min,离心3min,小心吸去上清液,尽量吸干净。加入 适量冻存液重悬细胞,取50 (il悬液进行细胞计数(参照方法2.2.3),用细胞 冻存液调整细胞浓度为1 x106/ml;
  • 取出干净的细胞冻存管,在管壁上做好标记。包括细胞名称,细胞 代数、冻存时间、操作者姓名等,特殊情况下还应标明细胞培养条件;
  • 将细胞悬液按照lml/管,分装于细胞冻存管中。转移细胞冻存管 至细胞冻存盒,并放入-80°C冰箱。24 h后,可将冻存盒中的冻存的细胞转 移至液氮做长期保存。必要时,需间隔一段时间取出一支细胞,复苏后观 察细胞状态。

2.2.3细胞增殖实验(MTS检测法)

  • 药物配制

从-20°C冰箱中取出TFLS储存液(50mg/ml),室温溶解。用RPMI-1640 完全培养基稀释TFLS储存液,调整TFLS的浓度分别为20、40、80、120、

160、240、320 |ig/ml

  • 分组及给药

取对数生长期的?0&细胞(?03、01;145),0.05%胰酶细胞消化液消化 后,进行细胞计数,调整PC3、DU145的细胞浓度为3xl〇4/ml,每孔接种 100(il细胞悬液于96孔板中,同时,设置不加细胞的阴性对照。将96孔板 转移至细胞孵育箱中过夜培养。待细胞完全贴壁后,每孔分别加入100 |il 含不同浓度TFLS的RPMI-1640完全培养基,TFLS的终浓度分别为10、 20、40、60、80、120、160 (ig/ml,每个浓度设置6个平行副孔,同时设置 溶剂对照组(5 %。的DMSO)和阴性对照组,将96孔板置于37°C,5% C02培 养箱中分别继续培养;

  • MTS检测

继续培养24、48 h后,弃去上清液,每孔中重新加入100(il RPMI- 1640 完全培养基。然后,用排枪向每个孔中加入 20 (il MTS 试剂,置于 37°C , 5 % C02培养箱中孵育2 h,使用酶标仪检测490 nm处各组吸光度OD值,

计算细胞相对活性:

给药组OD值-空白对照组(9D值 溶剂对照组c©值-空白对照组c©值x                              °

  • 结果分析

使用GraphPad Prism 5绘制细胞相对活性曲线,使用SPSS 20.0计算 TFLS对PCa细胞的半数抑制浓度IC50。

2.2.4细胞平板克隆实验

  • 药物配制

从-20 °C冰箱中取出TFLS储存液(50 mg/ml),室温溶解。用RPMI-1640 完全培养基稀释TFLS储存液,调整TFLS的浓度分别为50、100 (ig/ml。

  • 接种细胞

取对数生长期的PCa细胞(PC3、DU145),胰酶细胞消化液消化后,加 入适量的培养基反复吹打成单细胞悬液,必要时可经细胞筛子过滤保证能 获得单细胞悬液;进行细胞计数,调整PC3和DU145的细胞浓度为2x 105/ml。依次进行10倍稀释,调整细胞终浓度为200个/ml。反复吹打混匀 后,加入2 ml细胞悬液至6孔板中。将6孔板置于37 °C,5 % C02培养箱 中继续培养。

  • 分组及给药

继续培养24 h后,待细胞完全贴壁,用真空负压装置和巴氏管小心吸 弃细胞培养上清液,用D-PBS缓冲液清洗细胞两次,每孔中分别加入2 ml 含50、100 (ig/mlTFLS的RPMI-1640完全培养基,每组设3个平行孔,同 时设置溶剂对照组(5 %。的DMSO)和阴性对照组,将6孔板置于37 °C,5 % C02培养箱中分别继续培养;

  • 定期观察细胞状态及换液

每隔4天更换一次含对应浓度TFLS的完全培养基。定期观察细胞状态, 若培养皿中出现多个肉眼可见的克隆即可终止培养;

  • 细胞固定与染色

弃去培养基,用D-PBS洗涤细胞两次。加入适量的4 %多聚甲醛,在

室温下固定30 min;弃去多聚甲醛,用D-PBS洗涤细胞两次;用0.025 %的 结晶紫染色20 min;用超纯水清洗掉结晶紫,晾干后,用扫描仪扫描实验 结果;

  • 结果分析

用Image-J软件对图片处理分析,计算克隆数量。使用GraphPadPrism 5绘制克隆数量统计图,使用SPSS 20.0对统计结果进行分析。

2.2.5细胞迀移实验

我们采用细胞划痕愈合实验,评估TFLS对PC3、DU145细胞迀移能 力的影响。

  • 实验准备

实验前,用标记笔在六孔板背面画两条平行直线横穿过6孔板,粗细 均匀。

  • 药物配制

从-20 °C冰箱中取出TFLS储存液(50 mg/ml),室温溶解。用无血清RPMI- 1640培养基稀释TFLS储存液,调整TFLS的浓度分别为50、100 (ig/ml。

  • 接种细胞

显微镜下观察肿瘤细胞生长状况,当细胞汇合度达到70〜80 %左右,用

  1. 05 %胰酶细胞消化液消化处于对数生长期的PC3和DU145细胞并用完全 培养基终止和重悬,接着进行细胞计数。经调整后,按照每孔6 xl〇5个/ 孔和8 x 1〇5个/孔的细胞密度分别将PC3、DU145细胞接种于6孔板中,保 证过夜能长满。
  • 分组及给药

当细胞汇合度> 95 %,向6孔板中加入20 |ig/ml的Mitomycin(丝裂霉 素C),置于37°C恒温孵育箱,孵育两小时,以抑制肿瘤细胞增殖。然后用 无菌的10 |iil枪头管尖在细胞生长单层垂直划线,尽量与孔板背面的横线垂 直;用D-PBS缓冲液小心清洗细胞3次。分别加入配制好的含50、100 (ig/ml

TFLS的无血清RPMI-1640培养基,同时设置溶剂对照组(5 %。的DMSO)和

阴性对照组。

  • 观察细胞迀移情况

在加药后0、8、16和24 h四个不同时间点,分别用倒置显微镜对同一 视野固定位置进行拍照,每个孔固定观察点不应少于12 - 16个。

  • 结果分析

使用Image-Pro Plus软件对图片进行处理分析,统计不同时间各观察点 划痕面积,计算细胞迀移率。其中我们将0 h的划痕面积默认为100 %,假设 为S;xh的划痕面积为Sx,贝1J:

x h的细胞迀移率=UX) x 100%

使用GraphPad Prism 5绘制细胞迁移率统计图,使用SPSS 20.0对统计

结果进行分析。

2.2.6 TFLS对PCa细胞细胞形态的影响

  • 药物配制

从-20°C冰箱中取出TFLS储存液(50mg/ml),室温溶解。用RPMI-1640 完全培养基稀释TFLS储存液,调整TFLS的浓度分别为50、100 (ig/ml。

  • 接种细胞

取对数生长期的PCa细胞(PC3、DU145),0.05 %胰酶细胞消化液消化 后,加入适量的培养基反复吹打成单细胞悬液,必要时可经细胞筛子过滤 保证能获得单细胞悬液;进行细胞计数,调整PC3和DU145的细胞浓度为 1 x l〇5/ml。反复吹打混匀后,加入4 ml细胞悬液至6 cm细胞培养皿中, 将细胞培养皿置于37 °C,5 % C02培养箱中继续培养。

  • 分组及给药

继续培养24 h后,待细胞完全贴壁,用真空负压装置和巴氏管小心吸 弃细胞培养上清液,用D-PBS缓冲液清洗细胞两次,每个细胞培养皿中分 别加入4 ml含50、100 (ig/ml TFLS的RPMI-1640完全培养基,同时设置溶 剂对照组(5 %。的DMSO)和阴性对照组,将细胞培养皿置于37°C,5 % C02 培养箱中分别继续培养24 h和48 h。

  • 细胞形态观察

在倒置显微镜观察TFLS处理后,PC3、DU145细胞形态的变化情况, 并选择合适的拍照视野进行拍照。

2.2.7细胞侵袭实验

为了评估TFLS对PC3、DU145细胞侵袭能力的影响,我们进行了 Transwell 实验。

  • TFLS处理PCa细胞(方法同2.6)
  • 细胞侵袭

TFLS分别作用24、48 h后,弃去培养基,用D-PBS缓冲液清洗细胞 两次。用0.05 %胰酶细胞消化液消化细胞,离心后加入适量无血清 RPMI-1640培养基重悬细胞。进行细胞计数,调整细胞浓度为8 x l〇5/ml。 同时,将已经加入了 500 (il无血清RPMI-1640培养基的Transwell小室中置 于37°C细胞培养箱中水化2 h,小心吸出培养基,将Transwell小室放置于 24孔板中。分别向Transwell小室中加入100 (il PC3、DU145细胞悬液,细 胞数量为8 x 1〇4个/孔,与此同时,向24孔板中各加入800 (il含20 %胎牛 血清的培养基,将装有Transwell小室的24孔板置于37 °C、5 % C02孵箱 中继续培养。

  • 细胞固定与染色

继续培养24 h后,小心吸去Transwell小室中的培养基,用D-PBS润 洗小室底部。将Transwell小室浸泡于4 %多聚甲醛中,室温对细胞进行固 定,作用时间为30 min;然后,用D-PBS润洗Transwell小室三次后,将其 浸泡于0.025 %结晶紫中,对细胞进行染色,作用时间为20 min;用超纯水 清洗Transwell小室三次,用洁净的棉签小心,润湿后小心擦拭掉Transwell 小室中上室的细胞,在显微镜下观察,确保完全擦拭干净。将小室置于通 风橱中,晾干后,用倒置显微镜观察穿过Transwell小室的位于小室底部的 细胞,并拍照记录。

  • 结果处理

使用Image J软件处理图片,定量穿过Transwell小室的细胞。使用 GraphPad Prism 5绘制统计图。重复实验三次,用SPSS 20.0对实验结果进 行统计分析。

2.2.8细胞周期实验

  • TFLS处理PCa细胞(方法同2.6)

2.2.8.2细胞样品准备与染色

细胞周期检测实验中的细胞样品准备、染色主要根据试剂商的操作手 册进行:

⑴药物分别作用24、48 h后,弃去培养基,用D-PBS缓冲液清洗细 胞两次。用0.05 %胰酶细胞消化液消化细胞,离心后用完全培养基重悬细 胞,进行细胞计数;

  • 取5 x 1〇5细胞,300 g/min,离心5 min,弃上清,留约50 ul液体, 加入1 mL Buffer Solution,低速渦旋混勾;
  • 重复上述步骤;
  • 400 g/min,离心5min。弃全部上清,加入250 ul恢复至室温的 SolutionA,用手轻敲管子轻轻混合,室温孵育10 min;
  • 加入200 (il恢复至室温的SolutionB,用手轻敲管子轻轻混合,室 温孵育10 min;
  • 加入200 |il预冷的SolutionC,用手轻敲管子轻轻混合,室温避光 孵育10 min。

2.2.8.3样品检测与分析

用带滤芯流式管过滤细胞后,使用BD Accuri C6流式细胞仪检测红色 荧光(PI),同时检测光散射情况,每组检测10000个细胞。 2.2.8.4结果处理

使用GraphPadPrism 5绘制细胞周期统计图。

2.2.9细胞凋亡实验

  • TFLS处理PCa细胞(方法同2.6)

2.2.9.2细胞样品准备与染色

细胞凋亡检测实验中的细胞样品准备、染色主要根据试剂商的操作手 册进行:

⑴药物分别作用24、48 h后,弃去培养基,用D-PBS缓冲液清洗细 胞两次。用0.05 %胰酶细胞消化液消化细胞,离心后加入完全培养基重悬 细胞,进行细胞计数;

  • 取2 x 1〇5细胞,300 g/min,离心5 min,弃上清,加入1 mL预冷 的D-PBS,低速涡旋混匀;
  • 重复上述步骤;
  • 300 g/min,离心 5 min,弃全部上清,加入 100 ul 1 XBindingBuffer,

重悬细胞;

  • 加入5 ulAnnexinV - FITC和5 ulPI,进行细胞染色;设置Annexin V- FITC与PI单染管,用于调节补偿;低速涡旋混勾,室温避光孵育15 min;
  • 加入 400 ul 1 xBindingBuffer。

2.2.9.3样品检测与分析

用带滤芯流式管过滤细胞后,用BD Accuri C6型流式细胞仪检测绿色 荧光(Annexin V - FITC)和红色荧光(PI),每组检测10000个细胞。

2.2.9.4结果处理

使用GraphPad Prism 5绘制细胞凋亡情况统计图,使用SPSS 20.0对实 验结果进行统计分析。

2.2.10 蛋白印迹实验(Westem-Blot)

2.2.10.1细胞总蛋白样品的制备与提取

  • 蛋白裂解液的配制:取1个蛋白酶和磷酸酶抑制剂药丸,用l〇ml RIPAbuffer蛋白裂解液溶解,充分溶解后,按照1 ml/管分装至1.5 ml离心 管,储存于-20 °C冰箱备用。
  • TFLS 处理 PCa 细胞(同 6);

⑶药物分别作用24、48 h后,弃去培养基,用D-PBS缓冲液清洗细 胞两次,用真空负压装置和巴氏吸管将D-PBS彻底吸去。根据细胞密度和 细胞培养器皿,加入适量的蛋白裂解液,通常10 cm的细胞培养皿加入400 |iil蛋白裂解液,6 cm的细胞培养皿加入200 |iil蛋白裂解液为宜。轻摇细胞 培养皿底部,使细胞与蛋白裂解液充分接触,将细胞放在冰上裂解5 min, 然后用细胞刮沿着不同方向轻轻刮下细胞,用1.5 ml离心管收集细胞裂解 液和细胞碎片。将离心管插入冰上孵育1 h,然后将离心管转移到-80°C超低 温冰箱保存,蛋白样品在-80 °C超低温冰箱可保存较长时间。

2.2.10.2蛋白浓度测定(BCA法)

为保证蛋白上样质量一致,需提前测定蛋白样品的蛋白浓度。蛋白浓 度的测定方法有很多,在本研究中,我们采用BCA法测定总蛋白浓度,根 据BCA定量试剂盒说明书进行测定:

  • 提前打开37°C恒温孵育箱,从-80°C超低温冰箱中取出蛋白样品, 放在冰上使其溶解,4°C,12000rpm/min离心15min,离心后用移液枪小 心的将上清液转移到新的离心管中,切勿吸到管底细胞碎片和沉淀;
  • 稀释蛋白样品:取6 |il上述蛋白样品,加至84 |il超纯水中,蛋白 样品被稀释15倍;
  • 配制标准蛋白:取2.5 ml标准蛋白稀释液溶解5 mg标准蛋白,配 制成2000 (ig/ml的标准蛋白储存液。用超纯水依次倍比稀释标准蛋白储存 液,标准蛋白终浓度分别为 0、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000(ig/ml;
  • 配制BCA工作液(包括A液和B液):根据蛋白样品数量配制BCA 工作液,假设蛋白样品数量为N,已知浓度的标准蛋白数量为8个,每个

样品需要工作液体积为200 (II,每个样品设置3个副孔,贝IJ:

试剂盒中A液的体积=(8 + N + 2) X 200 X3

按照A液:B液= 50:1比例,加入B液,配置成工作液,混合均匀, 工作液一般现用现配;

  • 向96孔板每孔中依次加入8个不同浓度的标准蛋白25 (il/?L,同时 加入已经稀释的待测蛋白样品各25 pl/?L,标准品和待测蛋白样品各设置3 个重复以保证检测结果的准确性;
  • 充分混匀BCA工作液,然后用多通道移液器向每孔中各加入200 |il,尽量避免产生气泡。贴上封板膜,将96孔板放入37°C恒温孵育箱中孵 育 30 min;
  • 取出96孔板,用注射器小心去除气泡,用酶标仪检测562腿波长 处的吸光度OD值。以标准蛋白样品的蛋白浓度为X轴,其测定的吸光度 OD值为Y轴,绘制标准曲线。为保证测定结果的准确性,绘制的标准曲 线的相关系数R2值需大于0.99,否则需要重新测量。将蛋白样品测定吸光 度OD值代入标准曲线公式,计算待测样品的蛋白浓度。此时计算出的蛋 白浓度需乘以样品的稀释倍数才是样品的实际蛋白浓度。

2.2.10.3蛋白样品变性

  • 调整蛋白浓度:由于不同蛋白样品的蛋白浓度不同,为保证上样时 蛋白量和体积一致,需将不同蛋白样品的蛋白浓度调成一致。首先根据实 验需求确定蛋白的上样总质量,根据蛋白的上样总质量和样品的浓度,用 RIPAbuffer稀释蛋白样品,使不同蛋白样品的蛋白浓度相同。
  • 加入Loadingbuffer:将合适体积的蛋白样品与4 xLoadingbuffer 按3:1的比例均匀混合。
  • 变性蛋白样品:将混合后的蛋白样品放置在温度高于95°C的试管 加热器中,煮沸5 min,然后立即将其插在冰盒上,备用。若暂时不使用该 蛋白样品,应储存至-80°C超低温冰箱。
  • 配制 SDS-PAGE 胶
  • 配胶装置的组装与密闭性的检测:

用超纯水清洗配套的配胶用玻璃板,配胶用的玻璃板通常有两种规格 的,即厚度分别为1.0 mm和1.5 mm的,根据实验需求选择合适规格的玻 璃板。将其插入绿色夹子中,在水平桌面上轻摇玻璃板,使薄厚玻璃板的 底部对齐,固定好玻璃板。将绿色夹子固定于水平放置的制胶塑料架上, 组装好配胶装置。在薄厚玻璃板之间缓慢加满超纯水,静置30 min以上, 检测玻璃板是否存在漏液现象。若薄厚玻璃板之间的水位未下降或轻微下 降,说明配胶装置密闭性好,可进行SDS-PAGE胶的配制。此时,倒出薄 厚玻璃板之间的超纯水,将配胶装置放置于通风橱中,晾干配胶装置装置 后备用。若薄厚玻璃板之间存在明显的液位下降,说明配胶装置的密闭性 差,此时需要重新组装配胶装置或更换玻璃板后重新检漏。

  • 配制SDS-PAGE分离胶:

根据待测目的蛋白的分子量选择配制合适浓度的分离胶,低浓度的分 离胶用于检测大分子量的蛋白质,高浓度的分离胶用于检测小分子量的蛋 白质,常规分子量的目的蛋白推荐的分离胶浓度参见表2-1。按照表2-2中 的配方,配制合适体积分离胶,通常一块玻璃板需配制10 ml分离胶,根据 配制分离胶的数量,调整各成分的体积。配置时,先将体积合适的30 % Acrylamide、1.5 M Tris-HC1(PH 8.8)、10 % SDS、超纯水混合,然后加入 10 % 的APS、催化剂TEMED后,立即混合均匀,将分离胶缓慢转移至玻璃板 中,避免气泡的产生,当分离胶液面高度上升至绿色夹子上端的横带时, 停止转移。在玻璃板中缓慢加入合适体积异丙醇以压平分离胶的液面。室 温静置40 min左右,在确定分离胶彻底凝固后,缓慢倒出玻璃板中的异丙 醇,将配胶装置放置与通风橱中,晾干后可进行下一步实验。

配胶用的梳子同样有1.0 mm和1.5 mm的两种规格,另外,每个规格 的梳子通常分为10孔的大梳子和15孔的小梳子,根据待测样品的数量及 上样的体积,选择与玻璃板配套的梳子,用超纯水清洗干净,晾干后备用。 参照表2-3中的配方,配制合适体积的浓缩胶,通常一块SDS-PAGE胶需 配制4 ml浓缩胶,根据配SDS-PAGE胶的数量,调整各成分的体积。配置 时,同样需要先将体积合适的 30 % Acrylamide、1.0 M Tris-HC1(PH6.8)、10 % SDS、超纯水混合,然后再加入10 %的APS、催化剂TEMED,立即混合 均匀后,将浓缩胶缓慢转移至玻璃板中,避免气泡的产生。若有气泡产生, 用200(11移液枪枪头轻轻挑去。在浓缩胶中插入准备好的梳子。室温静置 40 min左右,在确定浓缩胶彻底凝固后,拆去玻璃板外固定用的夹子。将 SDS-PAGE胶连同玻璃板一块装入一次性塑料手套,在手套中倒入少量1 x Running buffer缓冲液,保持SDS-PAGE胶湿润,放入4°C冰箱备用,配置 好的SDS-PAGE胶可以保存1周左右。

  • 电泳

取出准备好的蛋白样品,彻底解冻后,短暂离心,放置于冰盒中,备 用。拿出存放于4 °C的SDS-PAGE胶,将两块配胶玻璃板对称地安装在电 泳槽内,若只有一块胶,需用塑料板补平。向两块胶板围成的空间里加满 新鲜配制的1x Running Buffer,小心的拔出梳子。混勾蛋白样品后,按照 20- 50 |ig总蛋白/每孔的量,加入等量的蛋白样品。同时,每块胶上需留有 一个孔加入8 |iil蛋白预染marker标记用于指示蛋白的大小,用1 x loading buffer将此孔的上样体积调整至与待测样品上样体积相同。若有多余的上样 孔没有加入样品,则需要加入相同体积的lx loading buffer。上样完成后, 向电泳槽内补加1x Running Buffer至指定刻度。打开电泳仪电源,设置电 泳条件为:恒压,90 V,启动仪器,开始电泳。当样品中的溴酚蓝指示带 跑出浓缩胶后,可将电压调整至120 V继续电泳,当胶中的溴酚蓝指示线 即将跑出胶体时,停止电泳。

  • 转膜

电泳即将完成时,开始准备转膜。

  • 裁剪滤纸和聚偏氟乙烯(?〇1}^11}^(^11£?11101^(1£,?\^^)膜:用裁纸器将滤纸裁剪成10x8 cm的长方形,每块胶需要6张滤纸。PVDF膜有两 种规格:0.22 (im和0.45pm,根据目的蛋白的分子量,选择合适规格的PVDF 膜,并用裁纸器将其裁剪成9 x 7 cm的长方形,备用;
  • 清洗转膜工具:用超纯水清洗夹膜镊子、搪瓷盘、海绵垫片、玻璃 棒、转膜夹板、绿色切胶塑料板等;
  • 在搪瓷盘中加入合适体积的1 xTransferbuffer,将滤纸浸泡在1 x Transferbuffer中,将夹膜镊子、海绵垫片、玻璃棒、转膜夹板、绿色切胶 塑料板放入转I吴液中。然后打开转I吴夹板,水平放入搪瓷盘中,转I吴夹板 的白面朝下。在转膜夹板的白面上铺一个海绵垫片,反复用转膜液冲洗海 绵垫片,用玻璃棒赶走海绵垫片上的气泡。依次在海绵垫片上铺上三层滤 纸,每铺一层同样反复用转膜液冲洗,并用玻璃棒赶走气泡;将裁剪好的 PVDF膜放入甲醇中浸泡10 s左右,用于活化PVDF膜上面的正电基团, 使其更容易跟带负电的蛋白质结合;用1 x Transfer buffer润洗PVDF膜中 后,将其放置于滤纸上,避免滤纸与PVDF膜之间气泡的产生,用1 x Transfer buffer润洗PVDF膜,防止PVDF膜干燥;
  • 电泳完成后,关闭电泳仪,拿出电泳槽,取出电泳槽中的玻璃胶板, 用超纯水清洗玻璃板表面。用绿色切胶塑料板小心撬开玻璃板,沿着分离 胶和浓缩胶的分界线切去浓缩胶。将分离胶从玻璃板上分离出来,并转移 到PVDF膜的正中间,小心的擀去气泡。同时,在分离胶的上方依次铺上 三层滤纸,反复用lx Transfer buffer冲洗每一层滤纸,避免气泡的产生, 在滤纸上方放置一个海绵垫片,合上黑色转膜夹板,固定好转膜夹板,将 其插入转膜槽中,插入时注意,转膜夹板的白面正对转膜槽的红色面,转 膜夹板的黑色面正对转膜槽的黑色面。向转膜槽旁放置一块冰袋,避免转 膜过程中温度过高,倒入足量的转膜液。由于我们转膜用的方法是湿转, 所以转膜液需没过PVDF膜,否则可能造成转膜失败。取一个泡沬箱,里 面装满碎冰,将转膜槽插入冰中,周围放置一圈低温冰袋。打开电源,在 200 mA条件下,恒流转膜2.5 h左右,转膜时间可根据目的蛋白分子量大 小进行调整。

2.2.10.7丽春红预染蛋白

丽春红本身带负电荷,可以与带正电荷的氨基酸残基结合,同时丽春 红也可以与蛋白质的非极性区相结合,形成红色的条带。而且,这种对蛋 白的染色是可逆的,可以用超纯水等洗去。因此,转膜结束后可使用丽春 红预染PVDF膜,检测转膜效果;

  • 准备三个塑料盒子,用超纯水洗干净。将1 X丽春红染液倒入其中 的一个盒子中,另外两个盒子中装满超纯水;
  • 关闭电源,取出转膜夹板,用转膜镊子夹出PVDF膜,将其放入装 有丽春红溶液的的盒子里,染色10 s左右,迅速取出,转移至超纯水中;
  • 此时观察PVDF膜上的蛋白分布情况及是否有气泡来判断转膜效 果,用剪刀修剪PVDF膜,去除膜上多余的部分。用圆珠笔在膜上做好标 记,用于区别膜的正反面及区分不同的膜,与胶直接接触的PVDF膜为正 面,另一面为反面。将剪裁后PVDF膜放入抗体孵育盒中,最后在摇床上 用超纯水洗涤除去丽春红背景。
  • PVDF 膜封闭

为了减少抗体的非特异性结合,需要在抗体孵育前,使用封闭液对 PVDF膜进行封闭,实验室常规使用的封闭液是5 %的脱脂牛奶。由于脱脂 奶粉中含有磷酸化蛋白,如果目的蛋白是磷酸化蛋白时,用5 %的脱脂牛奶 封闭会造成背景过深,一般不用脱脂奶,而使用5 %的BSA溶液。不同种 类、不同公司的抗体对封闭液的要求有所差异,因此在封闭前,需详细阅 读抗体说明书,配置好合适的封闭液。将封闭液倒入抗体孵育盒中,封闭 液需覆盖PVDF膜,放置于水平摇床上,室温慢摇1.5 h。

  • —抗孵育

封闭完成后,倒掉封闭液,加入合适体积的TBST洗膜液,水平摇床 上快摇10 min/次,重复三次。于此同时,根据抗体说明书上的推荐抗体浓 度和稀释液的种类,配制一抗稀释液,每个抗体孵育盒大约需要5 ml的一 抗稀释液。TBST洗膜完成后,将一抗稀释液倒入含有PVDF膜的抗体孵育

盒中,将其置于水平摇床上,4 °C孵育抗体过夜。

2.2.10.10 二抗孵育

一抗孵育完成后,回收一抗。向含有PVDF膜的抗体孵育盒中倒入合 适体积的TBST洗膜液,水平摇床上快摇10 min/次,重复三次。同时,用 5%脱脂奶粉配制二抗稀释液,配制二抗稀释液时,需根据一抗的种属来源 选择合适种类的二抗。常规使用的二抗稀释倍数为1:5000,可根据实验结 果做适当的调整。将二抗稀释液倒入含有PVDF膜的抗体孵育盒中,水平 摇床上室温慢摇lh。二抗孵育完成后,加入TBST洗膜液,水平摇床上快 摇10 min/次,洗膜3次,然后即可进行化学发光。

2.2.10.11化学发光显影

显影液的配制:首先,从4 °C冰箱取出化学发光A溶液和B溶液。 按照1:1的比例,将两种溶液混合;

  • 显影液孵育:将显影液倒入一个干净的抗体孵育盒中,用镊子将 PVDF膜正面朝下,平放在含显影液的抗体孵育盒中,轻摇盒子底部,使显 影液和PVDF膜均匀、充分接触,室温孵育1 min;
  • 打开化学发光/荧光/凝胶成像仪,调至化学发光模式,等待仪器内 温度下降至-46 °C左右;
  • 将PVDF膜转移到化学发光/荧光/凝胶成像仪平台上,调至自动曝 光模式,进行拍照。若成像结果不理想,可选择积分模式,一次拍取多张 照片,从中选择曝光时间合适的照片进行分析。

2.2.10.12膜再生

同一张膜可以检测多个目的蛋白。但由于孵育过抗体后,膜的背景会 加深,因此需要用膜再生液(Stripping buffer)处理一下孵育过抗体的PVDF

膜。

  • 用TBST洗膜液快速洗膜3次,每次10 min。
  • 加入适量的膜再生液,置于水平摇床,室温慢摇30 min。

⑶用TBST洗膜液快速洗膜3次,去除残留的膜再生液,每次10 min。

  • 重新封闭后可孵育新的抗体。

2.2.10.13数据分析

实验重复三次,用Image J软件分析目的条带和内参蛋白的灰度值,用 GraphPad Prism 5绘制统计图,使用SPSS 20.0对统计结果进行。

2.2.11统计学分析

文中的统计图均使用GraphPad Prism 5.0软件汇制,数据以means 士 SD 呈现。使用SPSS 20.0进行统计学检验,/检验(Student’s t-test)用于两样 本间比较;单因素方差分析(one-way ANOVA)用于三组及三组以上的组间 比较。对于后续的样本之间的多重比较,假定方差齐性,使用LSD检验; 未假定方差齐性,使用DunnettfsT3检验。P<0.05,认为有统计学意义(*:尸 <0.05; **:尸 <0.01;)。

  1. 实验结果
    • TFLS的含量测定

在本研宄中,我们提取了荔枝核中的黄酮类化合物,并以儿茶素为标 准品,使用香草醛-盐酸法对提取物中的黄酮含量进行了检测。经测定,工 作曲线的R2=0.9977,回归方程为:r = 11.262Z-0.0023;计算得:提取 物中,荔枝核总黄酮的含量约为42.61 %。

  • TFLS抑制前列癌细胞的增殖

我们应用MTS法检测了 TFLS对PC3、DU145细胞增殖的影响。结果 显示(图3-1): TFLS作用于PC3、DU145细胞后,这两种PCa细胞的相对 细胞活性均受到了不同程度的抑制,而且随着TFLS浓度的增加,PC3、 DU145细胞的相对细胞活性均逐渐下降。另外,TFLS不仅对PC3、DU145 细胞活性的抑制存在剂量依赖性,而且还存在一定的时间依赖性,随着 TFLS作用时间的延长,TFLS对PC3、DU145细胞的IC50也随之下降。 TFLS处理PCa细胞48小时,PC3、DU145的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别仅为 67.2、91.4 |ig/ml,均小于 100 |ig/ml, 详见表3-1。

另外,我们还采用平板克隆形成实验观察了不同浓度的TFLS对PCa 细胞株PC3、DU145的克隆形成能力的影响,见图3-2。结果发现:经不同 浓度的TFLS处理8天后,DU145细胞克隆形成能力明显降低,其克隆数 量和克隆大小均明显小于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。高浓度 TFLS (100|ig/ml)处理DU145细胞8天后,几乎杀死所有肿瘤细胞。对于 PC3细胞,低浓度TFLS (50 (ig/ml)虽然没有降低肿瘤细胞的克隆数量, 但是减小了克隆的大小,而高浓度TFLS (100 (ig/ml)显著抑制了 PC3细 胞的克隆形成,这些结果提示TFLS可抑制PC3、DU145细胞的克隆形成。

图3-1 TFLS抑制PCa细胞的增殖

用不同浓度的TFLS处理PCa后,MTS法检测细胞活力的变化,结果显示:随着药物浓度的增加和
药物作用时间的延长,PC3(A)、DU145(B)细胞活力均逐渐降低。

Figure 3-1 The inhibition of TFLS on proliferation of PCa cells The PCa cells were treated with different concentrations of TFLS, The tumor cell viability was detected by

MTS method. The results showed that the cell viability of PC3 (A), DU145 (B)gradually decreased with

the increasing dose and time of TFLS.

(A)不同浓度的TFLS对PCa细胞克隆形成能力的影响;(B)定量PCa细胞的克隆数量;克隆数目
用均数士标准偏差表示,与对照组相比:^P<0.05; *><0.01。

Figure 3-2 TFLS inhibit the colony forming ability of PCa cells.

(A) The effect of different concentrations of TFLS on the colony forming ability of PCa cells; (B)
Quantification of the number of colonies of PCa cells; the number of colonies was expressed by mean 士SD,
compared with the control group: *尸< 0.05; **尸<0.01.

3.3 TFLS对前列癌细胞细胞周期的影响

通过上述研究,我们证实了 TFLS能抑制PCa细胞的增殖。然而TFLS 究竟是通过什么方式抑制PCa增殖,目前尚不明确。细胞周期是细胞生长 活动的基本过程通过改变细胞周期调控蛋白的表达,阻滞肿瘤细胞的 细胞周期,进而抑制其增殖是是目前肿瘤药物开发常用的方法为了探 索TFLS是否通过调控PCa细胞的周期,抑制PCa的增殖,我们通过流式 细胞仪检测了 TFLS对PC3、DU145细胞周期的影响。结果显示:与对照 组相比,低浓度TFLS (50|ig/ml)处理后,PCa细胞处于Gl、S和G2各 期的比例并无明显差异,见图3-3,而将TFLS的浓度增加到100 (ig/ml后, 结果并未发生明显变化,两种PCa细胞出现了相同的现象。这些研宄结果 表明:TFLS对PC3、DU145的细胞周期没有调控作用。

(A)流式细胞仪检测TFLS对PCa细胞周期的影响;(B) PC3细胞周期分布条形图;(C)

DU145细胞周期分布条形图。

Figure 3-3 The effect of TFLS on cell cycle in PCa cells
(A) Detect the effect of TFLS on cell cycle in PCa cells by Flow cytometry; (B) Bar plot of the cell

cycle distribution of PC3; (C) Bar plot of the cell cycle distribution of DU145.

3.4 TFLS诱导前列癌细胞凋亡我们通过Annexin V和PI两种染料标记肿瘤细胞,通过流式细胞检测 技术检测了 TFLS对PC3、DU145细胞凋亡的影响。结果显示:与对照组 相比,PCa细胞经TFLS处理24 h和48 h后,凋亡细胞的比例明显增加, 药物作用时间越长,凋亡细胞的比例越高,差异具有统计学意义(尸<〇.〇5)。 同时,随着TFLS作用浓度的逐渐增加,凋亡细胞的比例也逐渐增加,PC3、 DU145细胞均存在这一现象(图3-4)。通过这些结果,我们认为TFLS可能 通过诱导PCa细胞凋亡,抑制其增殖。

图3-4 TFLS诱导PCa细胞凋亡

(A)流式细胞仪检测TFLS对PCa细胞凋亡的影响。按照PI和Annexin V的染色情况,细胞被分为 四个象限,分别是位于左下方的活细胞(PI阴性/AnnexinV阴性)、位于右下方的早期凋亡细胞(PI

阴性/AnnexinV阳性)、位于右上方的晚期凋亡细胞(PI阳性/AnnexinV阳性)和位于左上方的坏
死细胞(PI阳性/AnnexinV阴性);(B)PC3细胞凋亡数量(AnnexinV阳性)条形统计图;(C)DU145
细胞凋亡数量(AnnexinV阳性)条形统计图。凋亡细胞数量以均数士标准差来表示,结果与对照组

进行对比:*P<0.05;**P<0.01。

Figure 3-4 TFLS induce apoptosis in PCa cells

(A) Detect the effect of TFLS on apoptosis in PCa cells by Flow cytometry. The cells were divided into four quadrants according to the staining of PI and Annexin V, include the live cells at the lower left (PI

negative/Annexin V negative), early apoptotic cells at the lower right (PI negative/Annexin V positive),
Late apoptotic cells (PI positive/Annexin V positive) atthe upper right and necrotic cells at the upper left
(PI positive/Annexin V negative); (B) Bar plot of apoptotic cells(Annexin V positive cells) of PC3; (C)Bar
plot of apoptotic cells(Annexin V positive cells). The apoptotic cells are showed as mean±SD, compared

with control group: *P<0.05; **P<0.01.

  1. 5 TFLS抑制前列癌细胞转移

为了探索TFLS对PCa细胞转移的影响,我们首先通过细胞划痕实验 观察了 TFLS对PC3、DU145细胞迀移能力的影响。实验结果显示:TFLS 明显抑制PC3、DU145细胞的迀移(图3-5),随着TFLS作用时间的延长和 浓度的增加,这种抑制效果更加明显。在24 h,对照组的PC3细胞迀移率 已经达到了 50 %,而TFLS处理组(100 (ig/ml)的迁移率仅为(29.4 ± 0.05)%, 远低于对照组,差异具有显著的统计学意义。有趣的是,TFLS对迀移能力 更强的DU145细胞(24 h的细胞迁移率约为70 %)展现出更强的抑制效果, TFLS低浓度(50 (ig/ml)处理后的DU145细胞在24 h的细胞迀移率为(21.6 士 0.08)%,而TFLS高浓度(100 (ig/ml)处理的DU145在24 h的细胞迀移率 更是仅为(13.6 ± 0.03) %,细胞迀移率为对照组的1/5左右。

图3-5 TFLS以浓度依赖的方式抑制PCa细胞的迁移能力 (A) TFLS对PC3细胞迁移的影响,上图展示了 PCa细胞迁移的代表性图片;(B)定量分析PC3 细胞平均迁移率;(C) TFLS对DU145细胞迁移的影响,上图展示了 PCa细胞迁移的代表性图片; (D)定量分析DU145细胞平均迁移率。肿瘤细胞的迁移率以均数士标准差来表示,结果与对照组

进行对比:*P<0.05;**P<0.01。

Figure 3-5 TFLS inhibit the migration of PCa cells in a dose-independent manner (A) Effects of TFLS on migration of PC3,representative pictures was presented; (B) Quantitative analysis of average wound healing degree of PC3; (C) Effects of TFLS on migration of DU 145, representative pictures was presented; (D) Quantitative analysis of average wound healing degree of DU 145. Quantification data are showed as mean士SD, compared with control group: *尸<0.05; **P<0.01.

在此基础上,我们使用含Matrigel胶的Transwell小室检测了 TFLS对 PC3、DU145细胞侵袭能力的影响。在PC3细胞株中,TFLS处理后的PC3 细胞的穿过Tmnswell小室的数量明显少于未处理的PC3细胞,而且穿过 Transwell小室的细胞数量与药物浓度及作用的时间呈正相关,见图3-6。 TFLS高浓度(100 (ig/ml)处理24 h后,侵袭到下室的PC3细胞数量仅为对照组的15.2 %左右,而TFLS咼浓度(100 (ig/ml)处理48 h后,侵袭到下室的 PC3细胞数量甚至不足对照组的10%,抑制效果显著。对于DU145细胞, TFLS展示出更强的细胞侵袭抑制作用,TFLS高浓度(100 (ig/ml)处理48 h 后的DU145细胞侵袭到下室的细胞数量仅为对照组的2.8 %。

图3-6 TFLS减弱了 PCa细胞的侵袭能力

(A)TFLS对PC3细胞侵袭的影响,上图展示了 PCa细胞侵袭的代表性图片(><200倍);(B)TFLS
对DU145细胞侵袭的影响,上图展示了 PCa细胞侵袭的代表性图片(><200倍);(C)定量分析PC3
细胞侵袭的细胞数量;(D)定量分析DU145细胞侵袭的细胞数量;侵袭的肿瘤细胞数以均数±标准
差来表示,结果与对照组进行对比:*P<0.05;**P<0.01。

Figure 3-6 The invasive ability of PCa cells was attenuated by TFLS
(A) The effect of TFLS on invasion of PC3 cell, A representative picture was shown (magnification 20〇x);
(B) The effect of TFLS on invasion of DU145 cell, A representative picture was shown (magnification
20〇x); (C) Invasion cell number of PC3 cell was quantified ;(D) Invasion cell number of DU145 cell was
quantified ; Data are expressed as mean 士SD, compared with the control group: *尸< 0.05; **尸<0.01.

  • TFLS抑制前列癌细胞上皮间充质转化

为了探索TFLS是否是通过减弱PCa上皮间充质样转换(Epithelial mesenchymal Transition, EMT),进而抑制PCa的转移,我们首先观察了 TFLS 对PCa细胞形态的影响,见图3-7A。从结果中可见:未处理过的PCa细胞 呈现间充质样,其胞体形状为长梭状,生长较为弥散,部分细胞可见清晰 的伪足。TFLS处理PCa细胞(48 h)后,细胞的形态发生了明显的变化,肿 瘤细胞胞体变成椭圆状,细胞伪足消失。这些结果提示TFLS可能抑制了 PCa 细胞 EMT〇为了进一步验证TFLS是否抑制PCa细胞的EMT,我们通过Westem- Blot检测了 PC3、DU145细胞中EMT相关蛋白标记物钙粘附蛋白E (E-Cadherin)、波形蛋白(Vimtenin)、P-连环蛋白(P-Catenin)的表达情况。 通过WestemBlot的结果,我们可以发现:相比于对照实验组,TFLS处理 后的PCa细胞的上皮样标记物E-Cadherin、P-Catenin的表达量明显增加; 相反,细胞间质样标记物Vimtenin的表达量明显下降,我们在两种PCa中 均发现了这一现象(图3-7B-D)。这些结果进一步证明了 TFLS抑制了 PCa 细胞EMT的发生。

图3-7 TFLS减弱了 PCa细胞上皮间充质转化

(A)用TFLS (100 jig/ml)处理PCa细胞48小后,显微镜下(x 200倍)观察PCa细胞的形态;(B) Western-blot检测了 TFLS对上皮间充质转化相关标记蛋白表达的影响;(C)定量分析PC3细胞中上
皮间充质转化相关标记蛋白表达情况;(D)定量分析DU145细胞中上皮间充质转化相关标记蛋白表 达情况;定量结果以均数士标准差来表示,结果与对照组进行对比:*尸<0.05; **尸<0.01。

Figure 3-7 TFLS attenuate EMT in PCa cells .

(A) The PCa cells were treated with TFLS(100 |ig/ml) for 48 h, the morphology of PCa cells were observed
by microscope(magnification 200x)? A representative picture was shown; (B) Western blot analysis the
expression of EMT-related proteins in PCa cells; (C) Quantitative analysis of the expression of EMT-related
proteins in PC3 cells; (D) Quantitative analysis of the expression of EMT-related proteins in DU145 cells.
Data are expressed as mean 士SD, compared with the control group: *尸< 0.05; **尸<0.01.

3.7 TFLS抑制AKT信号通路的激活为了进一步探讨TFLS抑制增殖、转移及EMT分子机制,我们筛选了 多条与癌症生存、增殖、EMT、转相关的信号通路,通过Western-Blot 实验观察其激活情况。如图3-8所示,经TFLS处理后的PC3和DU145细 胞,WNT、AMPK和MAPK信号通路上的关键蛋白,包括磷酸化的AMPK a、MEKl/2、P44/42 MAPK以及Wnt3a的蛋白表达量均未发生明显的改变。 TFLS显著降低了 DU145细胞中磷酸化AKT蛋白的水平,反而对总AKT 的表达变化无明显的调控作用的影响。而对于PC3细胞,虽然TFLS处理 24 h时,磷酸化AKT和总AKT均未发生明显的变化,但是随着TFLS作 用时间的延长,磷酸化AKT的表达量下降,这些结果证实了 TFLS抑制了 AKT信号通路的激活。

图3-8在肿瘤细胞中检测几条相关肿瘤相关信号通路变化

(A) Western-blot检测了肿瘤相关的信号通路上关键蛋白表达变化;(B)定量分析PC3细胞中p-AKT、 AKT、p-AMPKa、p-MEKl/2、p-P44/42MAPK 蛋白表达情况;(C)定量分析 DU145 细胞中 p-AKT、 AKT、p-AMPKa、p-MEKl/2、p-P44/42MAPK蛋白表达情况;定量结果以均数士标准差来表示,结

果与对照组进行对比:*尸<0.05; **尸<0.01。

Figure 3-8 Several tumor-related signaling pathway are detected (A) Western blot analysis the expression of tumor-related signaling proteins in PCa cells; (B) Quantitative analysis of the expression of p-AKT、AKT、p-AMPKa、p-MEKl/2、p-P44/42MAPK in PC3 cells; (C)

Quantitative analysis of tiie expression of p-AKT、AKT、p-AMPK a、p-MEK 1/2、p-P44/42 MAPK in
DU145 cells. Data are expressed as mean 士SD, compared with the control group: *尸< 0.05; **尸<0.01.

3.8 TFLS调控AKT/mTOR&NF-KB双信号通路

AKT蛋白磷酸化后,通过调控下游相关信号通路,进而促进了前列腺 癌的发生与进展过程。在确定TFLS对AKT的调控作用后,我们又检测了 TFLS对AKT信号通路下游的几个靶蛋白表达水平的影响。实验结果显示 (图3-9) : TFLS处理后的PC3和DU145细胞,iKBa及其下游蛋白NF-icB 的磷酸化水平均受到了显著的抑制,同时mTOR蛋白的磷酸化水平也显著 降低,其磷酸化水平与TFLS的浓度和作用时间呈现正相关。同时,TFLS 未显示出对IkBou NF-kB、mTOR总蛋白表达的调控作用。这些结果证实 了 TFLS对AKT/mTOR&NF-KB双信号通路的调控作用。

图3-9在肿瘤细胞中检测AKT信号通路上相关蛋白的变化

(A) Western-blot检测了 AKT信号通路上相关蛋白的表达;(B)定量分析PC3细胞中相关蛋白表达
情况;(C)定量分析DU145细胞中相关蛋白表达情况;定量结果以均数士标准差来表示,结果与对

照组进行对比:*P<0.05; **P<0.01。

Figure 3-9 The protein in AKT signaling pathway are detected
(A)Western blot analysis the expression of the protein in AKT signaling pathway in PCa cells; (B)
Quantitative analysis of the expression of the protein in PC3 cells; (C) Quantitative analysis of the
expression of the protein in DU145 cells. Data are expressed as mean 士SD, compared with the control

group: *尸< 0.05; **尸<0.01.

4.讨论

PCa是影响全世界老年男性的主要健康问题之一,严重威胁着人类的 生命健康。PCa极易发生远端转移,给PCa的治疗增加了极大的困难[29]

目前临床上治疗PCa的药物[m]主要包括雄激素合成阻滞剂、雄激素受体 (AndrogenrecepTOR,AR)抵抗齐[[、各类化疗药物、放射性药物等。这些药物 的出现,给PCa患者增加了生存的希望,在PCa的治疗上取得了显著的成 效。然而这些药物对患者的机体损伤很大,极大的降低了患者的生活质量。 因此开发高效、低毒的新药物对PCa的治疗至关重要。

天然药物是指具有一定药理活性的动物药、植物药和矿物药[32],凭借 低毒的特性,天然药物受到了众多研宄者的追捧。根据中国抗肿瘤药物市 场研宄报告(2016版)统计显示:2016年,在整个抗肿瘤药物医院市场中, 植物生物碱和其他天然药占据了 21.20 %的市场份额,高居抗肿瘤药物市场 的第一位。其中,紫杉醇以3.71 %的市场份额处于绝对领先的地位,已经 成为市场上最受欢迎的抗肿瘤药物。

在前期研究中,我们已证实了 NLS具有抗PCa活性,并且黄酮类成分 在NLS中含量最高。随着对荔枝核研究的深入,荔枝核黄酮类化合物抑制 肿瘤的作用逐渐被报道那是否黄酮类成分是荔枝核抗PCa的主要活性 成分呢?在本研究中,我们发现了 TFLS具有在pg/ml范围内抑制PCa细胞 株PC3、DU145体外增殖的作用,同时TFLS可以抑制PC3和DU145的克 隆形成,从而证实了 TFLS的抗PCa活性。

随后,我们对TFLS的抗PCa的机制进行了探索。目前,已报道的荔 枝核抗肿瘤的机制复杂多样,主要包括诱导癌细胞自噬、促进癌细胞凋亡、 阻滞癌细胞细胞周期、抑制细胞端粒酶活性等P3,33_^。我们通过研宄发现, TFLS处理后的PCa细胞,凋亡细胞比例明显增加,结果显示TFLS通过诱 导PCa细胞凋亡,进而抑制其增殖。另外,我们还发现TFLS对PCa细胞 的细胞周期无调控作用。

远端转移是恶性肿瘤的特征之一,为其治疗增加了难度[36,37]。本研究 发现了 TFLS处理后的PCa细胞PC3、DU145的迀移能力和侵袭能力都明 显下降,即TFLS有效抑制了 PCa细胞的体外转移。这极大的吸引了我们 的关注,抑制PCa的转移对于PCa的治疗意义重大。原发性PCa治疗效果 比较理想,而转移性PCa的治愈率不足20 %。因此,在此基础上,我们着 重研宄了 TFLS抑制PCa细胞体外转移的分子机制。

EMT即上皮-间充质转化,是指上皮细胞逐渐转化为具有间质特征的细 胞。EMT是肿瘤细胞提高迀移和侵袭能力的重要生物学过程,原发性上皮 样肿瘤细胞发生EMT,上皮标志蛋白表达减少,细胞极性降低,细胞间粘 附减弱,间质标志蛋白表达升高,细胞迁移、侵袭能力增强[38,39]。研究已 经证实了 EMT在PCa细胞发展和转移过程中发挥着重要的作用我们首 先通过形态学观察,发现了相较于正常培养条件下的PC3、DU145细胞, TFLS处理后的PC3、DU145细胞的胞体变得椭圆、细胞界限变得模糊不清, 同时部分肿瘤细胞的伪足消失,呈现明显的上皮样特征,这些变化表明 TFLS可能抑制了 PCa细胞EMT的发生。为了证实我们的猜测,我们检测 了一些EMT相关蛋白的表达情况。其中E-Cadhenrin、Vimtenin、P-Catenin 是EMT重要的调控蛋白。E-Cadhenrin主要在上皮细胞中表达,在胚胎发 育,组织纤维化和癌症中的EMT期间表达量下降,E-Cadhenrin功能的丧 失促进了 EMT的发生[4142]。卩-Catenin是粘附连接的一个组成部分,它可以 直接与钙粘蛋白E结合,起到细胞间粘附的作用,并且在胚胎发育、癌症 和纤维化的各种研究中被用作EMT的标志物[43]。Vimtenin作为常见的鉴定 癌症细胞经历EMT的标记物,其表达量与肿瘤的侵袭和转移能力正相关 [44]。通过研究发现,TFLS明显升高上皮细胞标志物E-Cadhenrin、p-Catenin 的表达量,下调了间充质样细胞标记物Vimtenin的表达。这些结果充分证 明了,TFLS 通过调控 E-Cadhenrin、Vimtenin、P-Catenin 等蛋白的表达,抑 制PCa细胞EMT,减弱了 PCa的转移能力。

为了进一步明确TFLS抑制PCa生长和转移的分子机制,我们通过 Western-Blot检测了与PCa细胞增殖和转移密切相关的信号通路的激活情 况。大量研宄已经证实了 AMPK、WNT、MAPK、AKT信号通路在PCa 的发生和发展过程中发挥着重要的作用[45_48]。在本研究中,我们通过比较 TFLS预处理的PC3、DU145细胞和未处理的PC3、DU145细胞的蛋白表 达差异,发现:TFLS 对 AMPKa、MEK1/2、P44/42MAPK 以及 Wnt3a 等 蛋白的调控作用不明显,而显著降低了磷酸化AKT(Ser473)的蛋白水平,对 总AKT的水平没有发生变化。AKT信号通路在PCa的发生与发展过程中 发挥着重要的调节作用,AKT蛋白在一系列的刺激情况下,在特定位点发 生磷酸化,磷酸化的AKT易位至细胞质和细胞核,并激活与肿瘤细胞存活、 增殖、细胞周期进程、迀移和血管生成相关的下游靶标,促进PCa的发生 和进展[49,5()]。相反,研究表明:AKT信号通路的失活会诱导PCa细胞发生 凋亡,并且抑制PCa细胞转移[5152],这与我们的研究结果完全一致,证实 了 TFLS可能是通过抑制AKT信号通路发挥了抗PCa活性。

在此基础上,我们又对AKT的下游靶标蛋白进行了检测,结果显示 TFLS同时降低了 AKT信号通路下游的p-lKBa和p-NF-KB的蛋白水平。磷 酸化的AKT激活各种下游信号分子,包括IKK蛋白。IKK-a和IKK-P的激 活致使IicB蛋白的磷酸化和降解,进而导致IkB和NF-kB复合物的解离, NF-kB信号通路的激活[53,54]。除此之外,近年来,有人提出NF-kB亚基的 磷酸化代表了调节NF-kB转录活性的第二种机制[55_57]。同时,Qin等[58]已 经报道TFLS可以抑制NF-kB信号通路,这与我们的研究结果一致,充分 证明了 TFLS对NF-kB信号通路的抑制作用。NF-kB信号通路与EMT的发 生密切相关,研究表明,NF-kB信号通路激活后,可以通过直接或间接调 控抑制肿瘤细胞上皮样表型,促进间质样表型,进而促进EMT转化[59]。通 过本研宄,我们证实了 TFLS通过调控NF-kB信号通路减弱PCa细胞EMT, 抑制PCa细胞的迀移和侵袭。NF-kB信号通路的失活同时会上调促细胞凋 亡的蛋白的表达,而下调抑制细胞凋亡的蛋白表达,进而诱导PCa细胞发 生凋亡,抑制其增殖[6G61],我们的研宄结果也证明了这一现象。

有趣的是,我们发现TFLS不仅降低了 AKT/NF-kB信号通路的活性, 同时也抑制了 AKT/mTOR信号通路的激活。mTOR也是AKT信号通路下 游的一个重要靶蛋白。AKT可以通过磷酸化或间接磷酸化TSC2而直接激 活mTORCl;同时,通过磷酸化TSC2, AKT还可以使复杂的TSC1/TSC2 不活跃,从而间接刺激mTOR激酶活性[62]。据报道:mTOR在结直肠癌、 胃癌、胆囊癌、肝癌、乳腺癌、肾细胞癌和肺癌等各种癌症的迀移、侵袭 和EMT中发挥关键作用[63,64]。mTOR通过调控RhoA和Racl蛋白在结直 肠癌、胆囊癌和PCa中介导EMT的发生[65_67]。Vo BT等_证实AKT/mTOR 信号通路的过度激活增强了 PCa细胞PC3的迀移能力,而通过研宄,我们 发现:TFLS抑制了 AKT/mTOR信号通路的激活,进而降低了 PCa细胞PC3 和DU145转移能力。另一方面,mTOR信号通路的激活与肿瘤细胞的凋亡 也密切相关,Su CC等[69]发现抑制剂AICAR可以通过调控mTOR信号通路 诱导PCa细胞的凋亡。在本研究中,我们证实了 TFLS通过调控AKT/mTOR 信号通路,诱导PCa细胞发生凋亡,进而抑制PCa细胞的体外生长。

综上所述,TFLS通过抑制AKT信号通路的激活,调控AKT下游靶基 因NF-kB和mTOR,减弱PCa细胞EMT,进而抑制PCa转移;同时通过 诱导肿瘤细胞凋亡,进而抑制PCa的增殖。本研宄中,我们使用体外实验 证实了 TFLS的抗PCa作用,具有一定的局限性,目前我们也正在准备相 应的动物模型,开展相关实验,在体内水平近一步验证TFLS的抗肿瘤作用。

全文小结

  1. TFLS不仅能抑制PCa细胞PC3和DU145的增殖,还可以抑制其克

隆形成。

  1. TFLS虽然对PCa细胞PC3和DU145的周期无调控作用,但可诱导 凋亡PC3和DU145细胞发生凋亡。
  2. TFLS显著抑制PCa细胞PC3和DU145的迀移和侵袭;其抑制PCa 转移的分子机制与减弱PCa细胞的EMT相关。
  3. TFLS可靶向AKT/NF-KB&mTOR双通路,通过诱导细胞凋亡、减 弱EMT,进而抑制PCa细胞的生长和转移。

 

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综述

荔枝抗肿瘤研究进展
摘要

慕枝(LitchichinensisSonn.)属热带及亚热带植物,其种子是一种 的传统中药材,具有广泛的药理作用。近些年国内外学者对荔枝进行了 深入的研宄,尤其是在抗肿瘤方面取得了较大的进展。本文结合国内外 相关文献,对荔枝在抗肿瘤的活性成分以及分子机制方面研宄的最新进 展进行综述。

关键词荡枝,抗肿瘤,分子机制

ABSTRACT

Litchi? a Sapind plant, is a kind of traditional Chinese herbal medicine, which has a lots of pharmacological effects. In recent years, many scholars have made deep research to the litchi, especially in anti-tumor progress. In this review, the latest research progresses on the anti-tumor activities of Litchi and the underlying molecular mechanisms are summarized.

KEY WORDS Litchi,anti-tumor,molecular mechanisms

恶性肿瘤作为全球重大的公共卫生问题之一,极大地危害人类的健康, 并将成为新世纪人类的第一杀手。我国的恶性肿瘤患者的发病率和死亡率 也是逐年递增[^],给国家财政造成了巨大的负担。在恶性肿瘤的三大治疗 方法中,药物治疗占有重要的地位,在批准的药物中,80%来自天然化合 物[3]。凭借低毒、资源丰富、价格低廉等独特的优势,天然药物已成为目前 开发治疗癌症药物的重要途径之一。

慕枝(LitchichinensisSonn.)属于热带和亚热带植物,广泛分布于中 国的西南部、东南部及亚洲东南部。荔枝核是荔枝的干燥成熟种子,是我 国的一味传统的中药材。其性温,味甘、微苦,归肝、肾经,有行气散结、 祛寒止痛之功,主治寒疝腹痛,睾丸肿痛等证[4]。随着现代药理学对荔枝果 实、荔枝果皮和荔枝核研究的深入,荔枝展示出广泛的药用价值,研究已 证实荔枝各部位提取物具有降血糖、抗菌、降血脂、降血糖、阵痛、消炎、 抗纤维化、抗氧化等诸多药理作用[5_11]

近些年,随着对荔枝,尤其是荔枝核抑制恶性肿瘤的药理作用及相关 分子机制的研宄日渐增多,荔枝的抗肿瘤活性作用也逐渐被展现。本文总 结了荔枝在不同类型的肿瘤中的作用及分子机制的最新研宄进展,以期为 荔枝在抗肿瘤领域的深入开发提供一些参考。

  1. 荔枝对乳腺癌的影响

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,尽管其总体生存率有所改善,但乳 腺癌仍是造成全球女性人口死亡的重要原因[12]。研究证明荔枝具有抑制乳 腺癌细胞增殖的活性,有望开发成乳腺癌治疗的新型药物。Wang课题组[13] 研究发现:荔枝果壳水提物以浓度依赖和时间依赖的方式抑制乳腺癌细胞 MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖和克隆形成,同时荔枝果壳水提物还可以 抑制乳腺癌移植瘤的生长。这引起了众多学者对荔枝果壳水提物中发挥抗 乳腺癌的成分的探索。ZhaoM通过对荔枝果皮提取物的分离鉴定,得到了 多个化合物,通过实验证明了这些物质均对乳腺癌MCF-7细胞具有增殖抑 制活性,其中表儿茶素、原花色素B2对乳腺癌MCF-7细胞抑制效果显著, 其半数抑制浓度(IC50)分别仅为102和99 (ig/ml。另一方面,通过检测这些 化学成分对正常人肺成纤维细胞的毒性作用,发现这些物质的毒性作用甚 至小于紫杉醇,有很大的开发价值。除此之外,荔枝核各提取相的提取物 也展示出抑制乳腺癌细胞增殖的活性,荔枝核石油醚相、乙酸乙酯相、D101 树脂吸附相和水相对乳腺癌MCF-7细胞均有一定程度的抑制作用,其中乙 酸乙酯相的抑制效果最明显,其IC50仅为53.8 mg/L。通过更深入的研宄 发现荔枝核乙酸乙酯相提取物可诱导乳腺癌细胞凋亡的发生[15]。除此之外, 荔枝核中的倍半萜内酯类化合物小白菊内酯可以通促进乳腺癌细胞 MDA-MB-231中EGF受体的磷酸化介导活性氧(ROS)的产生,进而抑制 乳腺癌细胞的增殖[16]

乳腺癌作为女性常发的恶性肿瘤,具有明显的激素依赖,雌激素、孕 激素、泌乳素等作为在乳腺癌的发生与发展过程中发挥着重要的作用[17_19]。 实验证实:荔枝核提取物可以降低小鼠血清中雌二醇、孕酮和泌乳素的水 平[2()],这提示荔枝核可作为乳腺癌内分泌治疗的药物或辅助药物。黄水才 等[21]通过临床实验证实了荔枝核对乳腺癌内分泌治疗的功效。他们通过荔 枝核胶囊与来曲唑联合治疗乳腺癌患者,荔枝核胶囊显著降低了患者的发生,改善了患者生活质量。通过更深入的研究,李关宁等[22]发现荔枝核 中增加来曲唑降激素作用的主要成分可能是皂苷类。由此可见,荔枝在乳 腺癌治疗上的广大前景。

  1. 荔枝对肝癌的影响

刘冬等[23]调查了市面上常见的10个品系的荔枝对恶性肿瘤细胞增殖的

影响,结果显示不同品系的荔枝果肉提取物都可以抑制肝癌细胞的增殖。 除了荔枝果肉之外,荔枝其他的多个部位都具有抗肝癌的活性,其中最受 人关注且研究最多的就是荔枝核。荔枝核水提物不仅抑制了 S180、HePG2 细胞的体外增殖,同时可以抑制肝实体瘤在小鼠体内的生长。研究发现,

小鼠体内的肝癌实体瘤在经过荔枝核水提物(62 g/kg)治疗后,肿瘤大小仅为 对照组的58 %[24]。同时,荔枝核乙酸乙酯相提取物也可以抑制肝癌HepG2 细胞的增殖,且效果显著,其IC50仅为59.52|ig/mlP5]。熊爱华等[26]通过 MTT法检测不同浓度的荔枝核含药血清培养后HepG2细胞的增殖抑制率, 结果显示:随着荔枝核浓度的增加,HepG2细胞活性逐渐降低,证实了荔 枝核含药血清对肝癌的抑制作用。这引起了众多学者对荔枝核抗肝癌的活 性成分进行探索。Wen L等[27]从荔枝核中分离出一种化合物-肉桂酰胺B1, 肉桂酰胺B1对HepG2表现出强烈的抗增殖作用,并且没有明显的细胞毒 性,充分体现了其开发价值。除了荔枝核的提取物,荔枝果壳提取物也展 示出对肝癌细胞的强抑制作用,研宄发现荔枝果壳提取物对肝癌细胞的 IC50为80 |ig/ml,并且通过肝癌移植瘤动物模型再次证实了荔枝果壳提取 物的抗肝癌作用[28]

荔枝抑制肝癌的机制复杂多样,引起了众多学者的广泛关注,其中被 报道最多的机制是通过诱导肝癌细胞凋亡。大量研究已经证明肝癌细胞在 经过荔枝核含药血清[24]、荔枝果壳提取物[28]等处理后,其凋亡细胞的比例 明显升高,证明了荔枝可以诱导肝癌细胞凋亡。为了更深入的探索荔枝诱 导肝癌细胞凋亡的机制,学者们进行了大量的研究。凋亡的启动是细胞内 一系列化学分子通过信号传导的方式引发的,线粒体凋亡途径是引起细胞 凋亡的主要途径之一,是目前研究凋亡的热点[29]。Bd-2和Bax己经被证 实是线粒体凋亡途径中的重要调控蛋白,Bd-2可以通过不同的调控机制抑 制细胞凋亡的发生,而Bax与Bd-2蛋白对抗,促进细胞凋亡的发生[3G-32]。 荔枝核水提物可以通过下调Bd -2的表达,诱导肝癌细胞凋亡的发生[24]

吕俊华等也发现,荔枝核提取物可以降低肝癌荷瘤小鼠中Bd-2的表达, 增加Bax的表达,抑制肝癌在小鼠体内生长[33]。这些结果证明了荔枝可以 通过线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡。

另一方面,张菊艳等[25]发现,用荔枝核乙酸乙酯相刺激小鼠脾脏淋巴 细胞后,淋巴细胞的增殖率达到了 320%,远超过对照组。同时,荔枝核乙 酸乙酯相作用于淋巴细胞和肝癌细胞共培养体系降低了肝癌细胞的活性。 而肝癌荷瘤小鼠经荔枝核治疗后,血清中的IL-lp的水平也明显增高。这些 研究证实了荔枝核提取物还可以通过增强免疫功能,抑制恶性肿瘤的生长。

研宄还发现荔枝果壳提取物处理后的肝癌细胞,处于G0/G1的细胞明 显增高,而G2/M的细胞数几乎为0,即荔枝果壳提取物阻遏了肝癌细胞的 生长周期。这些结果提示荔枝果壳提取物可通过调控肝癌细胞周期进而抑 制肿瘤细胞增殖[27]

  1. 荔枝对肺癌的影响

荔枝核提取物及荔枝果壳提取物抗肺癌的功效和机制研宄不断深入, 并取得了显著的成效。研宄显示:荔枝核提取物处理肺癌A549和NCI-H66 细胞后,细胞的增殖和克隆能力明显下降。通过对其分子机制的探索,发 现荔枝核提取物可以调控EGFR及其下游Akt和Erk-1 / -2信号通路,通过 阻滞细胞周期于G1或G2 / M期,诱导细胞凋亡抑制肺癌细胞的增殖[34]。 而荔枝果皮含有高水平的表儿茶素,可形成各种长度的低聚物。表儿茶素 具有抗肺癌的功效,除了几种A或B型表儿茶素二聚体外,其他可溶性低 聚物在荔枝果皮中很少被鉴定出来。为了探索荔枝果皮中的抗肺癌活性成 分,Gong Y等@应用活性追踪分离的方法对荔枝果皮中的成分进行了分离。 通过两轮柱层析,获得了比荔枝花青素具有更强的抗氧化和抗肺癌细胞 (A549)增殖的活性级分S3。将S3进一步分离得到了 P1-P4四个组分, 通过检测发现:在这四个化合物中,P1和P2对肺癌细胞的增殖无抑制作用, 而P3和P4可以抑制肺癌细胞的增殖,令人惊奇的是将这四个化合物混合

在一起展示出更强的抗肺瘤活性,甚至高于顺铂。遗憾的是,目前的研宄 尚未明确这些组分的具体化学结构,荔枝果壳中是否存在抗肺癌的单体化 合物以及何种化合物依然值得科学家进行探索。

  1. 蒸枝对结直肠癌的影响

在Hsu CP等[36]的研宄中,探索了富含多酚的荔枝核乙醇提取物对两种 结肠直肠癌细胞系C〇1〇320DM和SW480的增殖、细胞周期和凋亡的影响。 结果表明,荔枝种子乙醇提取物以剂量依赖性方式显著诱导细胞凋亡,并 促使结直肠癌细胞G2 /M细胞周期停滞,荔枝核乙醇提取物抑制了细胞周 期蛋白的表达并提高凋亡蛋白Bax和caspase3的表达量,下调了 Bcl-2的 表达,进一步证明了荔枝核对结直肠癌细胞周期和凋亡的调控作用,该研 宄表明了荔枝核提取物可作为结直肠癌的潜在预防剂。EmaniieleS[37]的工作 对荔枝果实提取物对结肠癌细胞的影响做了系统的研宄。结果表明:荔枝 外果皮,中果皮和内果皮部分降低了 HT29细胞的活力和克隆生长。这些作 用是由于细胞周期停滞在G2 / M期,同时造成半胱天冬酶依赖性细胞死亡。 有趣的是,荔枝外果皮和内果皮还可以通过增加结直肠癌细胞中自噬相关 蛋白1/自噬激活激酶1 (ATG1/ULK1)的表达量,上调beclin-1、LC3和 p62蛋白的表达,引发细胞自噬反应。这是首次发现荔枝的抗肿瘤作用与细 胞自噬有关。同时在其他结肠癌细胞中也观察到荔枝提取物的抑制作用, 包括HCT116和Caco-2细胞。

  1. 荔枝对前列腺癌的影响

前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常的恶性肿瘤,在中医临床上,荔枝 核常常配伍用于治疗前列腺炎、睾丸炎、前列腺增生等男性泌尿生殖系统 疾病@,39]。荔枝核是否具有抗前列腺癌的作用,目前尚没有研究报道。最近 的一项研宄发现荔枝核正丁醇提取物对多种前列腺癌细胞,包括PC3, DU145, RM1和C4-2B均有生长抑制作用。荔枝核正丁醇提取物通过抑制 Akt信号通路的激活,调控细胞周期和细胞凋亡相关的蛋白的表达,诱导细

胞凋亡和细胞周期G1/S期阻滞,抑制前列腺癌的体外增殖。同时,荔枝 核正丁醇提取物通过降低前列腺癌EMT的表型转化显著降低细胞迁移和侵 袭。重要的是,通过小鼠前列腺癌移植瘤模型证明了荔枝核正丁醇提取物 的抗肿瘤作用和荔枝核正丁醇提取物的安全性这些研究结果表明,荔 枝核正丁醇提取物具有发展成为安全和有效的抗前列腺癌的潜力,为前列腺 癌的临床应用提供了新的思路。

  1. 荔枝对卵巢癌的影响

荔枝果实中的Oligonol,是一种低分子酚类化合物,对多种类型的肿瘤 都有显著的抑制作用。在卵巢癌细胞系中,Oligonol通过抑制NF-kB活化, 增加p-ERK,TRAF2和p-lKBa的表达增加,降低p65和COX-2的表达, 促进卵巢癌SKOV-3细胞的凋亡,抑制卵巢癌SKOV-3细胞的活力[41]

  1. 荔枝对子宫肌瘤的影响

荔枝可作为中药的重要成分之一,已经在一些肿瘤的临床治疗上得到 了应用。橘荔散结丸是老中医罗元恺所创制的一味中药,其主要成分就包 括荔枝核,橘荔散结丸主治女性子宫肌瘤,已临床应用近30年,成绩斐然, 药效显著。然而橘荔散结丸治疗子宫肌瘤分子机制尚不明确,吸引了广大 学者对其药理机制进行探索。众所周知,局部雌激素和孕激素的堆积是造 成女性子宫肌瘤的重要原因之一,橘荔散结丸可降低患者体内的雌激素和 孕激素的水平,达到治疗子宫肌瘤的目的[42]。同时,橘荔散结丸还可以通 过降低患者子宫肌瘤组织中雌激素受体a、卩的水平,进而增强米非司酮对 子宫肌瘤的治疗效果[43]。而荔枝核降低血清中雌二醇、孕酮和泌乳的水平 的能力已经在动物实验水平和临床实验水平得到了证实[2G21],这些研究间接 证明了荔枝核的抗子宫肌瘤的功效。

  1. 其他

荔枝还可以通过调控一些特殊的蛋白的表达,在癌症的治疗上发挥功 效。脂联素是从脂肪组织中特异性分泌的[44],血清脂联素水平降低是导致

癌症发生的危险因素,如乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、结肠癌和胃癌 等[45_47]。荔枝中的低分子酚类被证明可以增加多种类型的肿瘤患者体内脂 联素的水平,从而缓解恶性肿瘤的进展[48]

9.展望

荔枝是一种常见的天然药物,自然资源非常丰富。几百年前,荔枝核 已经被用于治疗多种疾病,同时取得了比较好的疗效。近些年,关于荔枝 成分在肿瘤的治疗和预防领域取得了令人惊喜的效果,吸引了大量研究者 的目光。因此,荔枝中各种抗肿瘤的活性成分及分子机制逐渐暴露。目前, 已经证实了荔枝果实、荔枝果壳、荔枝核等各成分的提取物通过诱导细胞 凋亡、阻滞细胞周期、增强细胞自噬、加强机体免疫力等机制,抑制不同 类型的肿瘤的生长。然而,目前对于荔枝的研宄主要集中在各成分的提取 物上,虽然充分证实了这些提取物的抗肿瘤活性,但是由于这些成分包含 的化合物性质不明且复杂多样,严重制约了荔枝的开发和应用。同时,对 荔枝的研究大多只停留在体外研究和动物实验水平,临床研究相对比较匮 乏,距离荔枝在抗肿瘤领域的临床应用,还有很长的路。

综上所述,荔枝在抗肿瘤领域具有的巨大的开发潜力,但是前路漫漫, 对荔枝的研宄仍然任重而道远。相信随着对荔枝的研究更加全面且深入的 进行,荔枝一定能在肿瘤治疗上发挥出重要的作用

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