MiR-204-5p通过靶基因Cav-1调节大鼠血管平滑肌细胞增殖的研宄论文

2020年2月24日22:08:48MiR-204-5p通过靶基因Cav-1调节大鼠血管平滑肌细胞增殖的研宄论文已关闭评论

MiR-204-5p通过靶基因Cav-1调节大鼠血管平滑肌细胞增殖的研宄论文

中文摘要

MiR-204-5p通过靶基因Cav-1调节大鼠血管平滑肌细胞增殖的研宄

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)及其并发症是导致人类死亡的“头号 杀手”,也是心血管疾病的主要危险因素之一。大量研究表明,动脉粥样硬化是 一种复杂的多因素慢性炎性血管疾病,其中血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell; VSMC)的异常增殖是其关键因素。因此,靶向治疗平滑肌细胞的 异常增殖已经成为治疗动脉粥样硬化的热点。

小核糖核酸(microRNA; miRNA)是长度约为22个核苷酸的小的非编码 核糖核酸。miRNA是一种高效且特异的基因调节因子,可调节靶蛋白并参与基 本的生物过程(包括细胞分化,增殖,凋亡和细胞信号传导途径),在基因的 转录后调节中起重要作用。小窝蛋白-1 (Caveolin-1; Cav-1)能够在抑制肿瘤 的生长,调节肺泡的呼吸作用,介导胞吞作用与信号等方面起重要作用。但是 Cav-1在SD大鼠VSMC中的作用还尚未见相关报道。

为了探究Cav-1蛋白在大鼠VSMC中的作用,本实验培养并鉴定SD大鼠 平滑肌原代细胞,应用SiRNA干扰Cav-1的表达确定Cav-1对细胞增殖起负调 控作用。通过TargetScan预测,Cav-1与miR-204-5p之间有相互作用。研究报 道中指出,microRNA-204-5p(miR-204-5p)是调节细胞增殖的重要因子,在人类 乳腺肿瘤,小鼠乳腺肿瘤以及淋巴瘤中都具有调节肿瘤细胞增殖的作用,在内 皮细胞中,也体现了凋亡相关的作用。然而,miR-204-5p是否会在VSMC中起 作用,以及如何通过特定的靶基因来调节VSMC的功能,这些问题还有待于进 一步的研究。

为了进一步探究miR-204-5p与Cav-1的相关性及在VSMC中的作用,转 染miR-204-5p模拟物与抑制剂,检测相关基因与蛋白的表达水平,检测细胞活 性,周期,凋亡以及关键通路蛋白的表达。建立SD大鼠AS模型并测定基因与 蛋白水平。上述实验证明,miR-204-5p靶向大鼠VSMC中的Cav-1,且降低Cav-1 蛋白的表达、影响VSMC增殖活性、促进增殖信号通路蛋白PPI3K/PI3K的表

达。初步解析了 miR-204-5p及其靶基因Cav-1调控VSMC功能的作用机制, 为miR-204-5p靶向Cav-1调控大鼠VSMC的相关功能提供了理论基础。

关键词:

SD大鼠,平滑肌细胞,MiR-204-5p,小窝蛋白,动脉粥样硬化

 

Abstract

MiR-204-5p regulate the proliferation of rat vascular smooth muscle

cell by targeting Cav-1

Atherosclerosis (AS) and its complications are the leading cause of death in humans and they are one of the main risk factors for cardiovascular disease. A large number of studies have shown that atherosclerosis is a complex multi-factor chronic inflammatory Vascular disease, where Vascular Smooth Muscle Cell is the key factor (Abnormal proliferation of VSMC). Therefore, targeted therapy for abnormal proliferation of smooth muscle cells has become a hot spot in the treatment of atherosclerosis.

Micrornas; Mirnas are small non-coding ribonucleic acids about 22 nucleotides in length. MiRNA is an efficient and specific gene regulator that regulates target proteins and participates in basic biological processes (including cell differentiation, proliferation, apoptosis and cell signaling pathways), and plays an important role in post-transcriptional regulation of genes. Caveolin protein -1 (Caveolin-1; Cav-1) can inhibit tumor growth, regulate alveolar respiration, and play an important role in endocytosis and signal mediation. However, the effect of Cav-1 on VSMC in SD rats has not been reported.

In order to investigate the role of Cav-1 protein in rat VSMC, primary smooth muscle cells of SD rats were cultured and identified in this study. SiRNA interference with the expression of Cav-1 was used to determine that Cav-1 had a negative regulatory effect on cell proliferation. Through TargetScan we matched Cav-1 with miR-204-5p. According to the research reports, microrna-204-5p (mir-204-5p) is an important factor regulating cell proliferation, which plays a role in regulating tumor cell proliferation in human breast tumor, mouse breast tumor and lymphoma, and also plays a role related to apoptosis in endothelial cells. However,

whether mir-204-5p plays a role in VSMC and how it regulates VSMC function through specific target genes remains to be investigated.

In order to further explore the correlation between mir-204-5p and Cav-1 and its role in VSMCs, mir-204-5p mimicks and inhibitors were transfected to detect the expression levels of related genes and proteins, cell activity, cycle, apoptosis and the expression of key pathway proteins. The AS model of SD rats was established and the gene and protein levels were measured. The above experiments proved that mir-204-5p targeted Cav-1 in VSMC of rats, and reduced the expression of Cav-1 protein, affected the proliferation activity of VSMC, and promoted the expression of PPI3K/PI3K in the proliferation signaling pathway. The mechanism of mir-204-5p and its target gene Cav-1 in regulating VSMC function was preliminarily analyzed, providing a theoretical basis for mir-204-5p to regulate the related functions of rat VSMC by targeting Cav-1.

KeyWords:

SD Rat, VSMC, MiR-204-5p, Cav-1, Atherosclerosis, Proliferation

引 言

平滑肌细胞是血管的重要组成部分,在动脉粥样硬化的斑块中,聚集大量 异常增殖的平滑肌细胞。由于SD大鼠动脉粥样硬化的病理发生过程和人类具 有高度的相似性,因此SD大鼠是目前研究动脉粥样硬化实验动物模型的常用 实验动物。Cav-1是平滑肌细胞上调节胞吞胞吐以及其他信息传递功能的关键 蛋白之一,参与多种细胞信号通路的调控。微小RNA是调节生物体内重要的细 胞因子,也是靶向药物以及疾病治疗方式的研究热点。

SiRNA最早由英国David Baulcombe团队在植物中发现,以短小的RNA片 段形式存在,参与RNA干扰(RNAi)现象。Thomas Tuschl在2001年发现合 成的SiRNA,并证明其能够在哺乳动物中发挥专一性基因沉默作用。通过如脂 质体,弱病毒和基因加尾等不同的转染(Transfection)技术SiRNA可以进入细 胞中,并对特定基因产生特异性的精准敲减(Knockdown)效果,SiRNA的这种 功能,让研究基因功能与发现药物目标靶点有了一项重要的工具。

MiRNA是高效特异的基因调控因子,在细胞组织等微环境中大量存在,能 够参与细胞分化、增殖、凋亡和细胞信号通路等基本生物学过程,并在基因转录 后调控中发挥重要作用,是新药物治疗靶点以及病征相关的重要调节因子。

之前的研究报道中指出,Cav-1的减少会使人类平滑肌细胞以及小鼠的平滑 肌细胞增殖能力增强,那么Cav-1的减少对于SD大鼠的平滑肌细胞是否具有相 同的调节作用?若假设成立,那么组织微环境中是否有相应的miRNA可以调节 Cav-1在细胞上的表达变化?目前,关于这方面的研究还尚未见报道。

因此本研究的第一部分实验:用组织块贴壁培养的方法,提取SD大鼠的 原代细胞。并通过免疫组化的方法对原代细胞的平滑肌肌动蛋白进行免疫染色, 鉴定平滑肌特异表达的SMA蛋白。随后通过SiRNA,对其Cav-1进行抑制来 验证Cav-1在SD大鼠VSMC中对增殖的影响,通过对SD大鼠的细胞活力检 测,发现Cav-1具有抑制大鼠VSMC增殖的功能,这与之前Cav-1在人类和小 鼠细胞中的研究结果吻合。

在第二部分实验中,我们通过TargetScan靶向预测以及双荧光素酶测定, 验证了一种可以有效调控Cav-1的miR-204-5p,并通过对细胞活力检测,细胞 周期,凋亡检测,以及细胞生物学的手法探究其在SD大鼠VSMC上的功能。 这一部分研究明确了 miR-204-5p对Cav-1的靶向作用,以及通过Cav-1在SD 大鼠VSMC上的调节功能及其作用方式,为研究动脉粥样硬化的发生发展及相 关治疗提供理论依据。

文献综述

第一节动脉粥样硬化进展

1.1动脉粥样硬化的形成

动脉粥样硬化是冠状动脉疾病、中风、脑梗死和周围血管疾病的主要原因, 因此是全世界发病率和死亡率最常见的病征之一。诱发动脉粥样硬化的因素很 多,近年来,随着科学的发展,更多诱发动脉粥样硬化病的原因己经被确认。 除了内皮细胞的损伤,脂质代谢以外,包括血流动力学损伤,物理化学损伤, 以及肠道微生物群失调,遗传因素,肺炎衣原体等都是引发动脉粥样硬化的成 因m[2]。生物活性物质,包括氧化低密度脂蛋白(LDL)在内,这些活性物质刺激 血管细胞产生炎症分子,并将单核细胞和T细胞聚集到动脉壁。血管壁的单核 细胞是脂质巨噬细胞的前体,这些巨噬细胞形成脂肪条纹,这是动脉粥样硬化 早期的解剖学特征[3]

动脉粥样硬化斑块的形成最主要的分为三类,一、脂质堆积,内皮细胞粘 附性增强,导致血液中的脂质,蛋白以及损伤细胞堆积在病变处,形成脂质块, 进而钙化,形成斑块损伤血管。二、血管组织纤维化,成纤维细胞不断增多, 血管细胞病变,呈纤维性损伤,导致血液阻塞,渗出。三、平滑肌的异常增殖, 导致血管瘤效应,导致管腔狭窄,斑块纤维帽脱落,导致动脉粥样硬化[4,5]。其 他的白细胞群,如中性粒细胞,也与动脉粥样硬化斑块的形成有关[5]

动脉粥样硬化的病理变化主要经过以下过程:血管脂质堆积:在损伤的血 管内皮刺激下,单核细胞趋向内皮下间隙,在血管内皮损伤处聚集,形成巨噬 细胞。同时,血管中层的平滑肌细胞也向内皮层迀移,两者在此过程中摄入大 量LDL以及OX-LDL,形成泡沬细胞,由这两种细胞形成的大量泡沬细胞聚集 形成脂纹。形成前期斑块:泡沬细胞聚集之后,胶原纤维、弹性纤维在破损处 富集,随后,蛋白聚糖汇聚在纤维周围,形成主要由纤维构成的易脱落斑点, 称为纤维斑。斑块的粥样病变:在纤维斑块形成之后,聚集而成的大量泡沬细

胞在短时间内坏死崩解,并向血管局部释放出多种溶酶体酶。大量的酶会促进 其他细胞蔓延性的坏死崩解,并在纤维斑块的基础上逐渐演变成粥样斑块。

病变破裂以及并发症:有的斑块会内出血,在斑块内再生的新血管,因为 纤维质和粥样斑的酶解会出现破裂,进而产生内出血。在受到一定的物理损伤 后,有些脆弱的斑块会发生破裂,MMP表达的改变会使纤维帽破裂,在血管中 发生溃疡反应,破裂物会入血,随后形成血栓。同时,血小板的聚集会加重血 栓反应。随着钙盐沉着于斑块,血管会逐渐钙化。病症继续加重后,有可能导 致动脉瘤破裂以致大出血[6]

传统上认为动脉粥样硬化是由于高脂血症引起的动脉腔的逐渐狭窄。随着 对病征的研究,发现在人和小鼠的血管壁慢性炎症中,环境和基因组成的复杂 环境,是促进炎症反应的重要因素。主要不良心血管事件(MACE),包括中风和 心肌梗死(MI),多发生颈动脉和冠状动脉粥样硬化斑块的患者身上。其中大约 三分之二的死亡发生在不稳定的动脉粥样硬化斑块的纤维帽破裂时,导致血栓 形成物质的释放和血小板聚集导致的动脉阻塞[7]

管腔狭窄,会使血流速度变快,对血管壁冲击力加大,血流量减少,是导 致动脉硬化死亡并发症的主要因素之一。之前研究认为,动脉粥样硬化会形成 斑块与血管堆块,依附于内皮,导致血管狭窄,而随着病灶的增大,动脉瘤效 应的增加,管腔狭窄的现象会越发严重。由此,研究者们认为,管腔狭窄会导 致组织器官的供血不足。有研究发现,动脉在存在管腔狭窄的同时,也会产生 代偿扩张和适应性重塑的现象,这让AS患者的病情略有好转。有临床数据表 明,体积大但稳定的斑块往往很安全,基于机体的上述功能,并不会频繁发生 病症恶化的现象。有趣的是,在近期的统计中,意外死于冠心病的病人,在近 期有血管斑块破裂现象的人只占8%,而临床死于冠心病的病人,通常会有两到 三个小的斑块破裂点,这说明,小而不稳定的斑块会引起严重的临床事件。

医学家对不稳定斑块给出了定义:其包括形态学特征上的特点,不稳定斑 块的细胞外脂质变多,核体积变大,其纤维帽结构薄,分布不均匀,胶原含量 和平滑肌数量减少。巨噬细胞,T淋巴细胞,单核细胞,肥大细胞等慢性炎症 相关的细胞会聚浸润该组织,MMP的分泌增加,减少纤维结构稳定,同时加速 血管再生,破坏斑块的稳定[8_1()]

同时,可以看见斑块内膜的表面破溃,有裂开,组织脱落和糜烂的现象。 脂质从破损细胞中释放,形成血栓和肿块。此时,患者会产生不稳定型心绞痛、 心肌梗死和猝死等症状[1112]

针对动脉粥样硬化的治疗方式是心血管疾病领域重大的课题之一,物理疗 法、化学疗法、药物疗法、饮食疗法、纳米疗法、抗炎性疗法、以及基因疗法, 靶向药物疗法等都是减轻或治疗不同病因动脉粥样硬化病征的良好方式[13]。动 脉粥样硬化和移植后动脉硬化的特征都是血管平滑肌细胞(VSMC)的扩张和细 胞外基质的积累。平滑肌细胞异常增殖,是动脉粥样硬化已知的一种致病因素 [14]。所以针对平滑肌细胞增殖的治疗方法是有探索意义的。

1.2动脉粥样硬化的治疗方法

目前,通过对动脉粥样硬化的研究,发现了许多治疗动脉粥样硬化的方法。 一、脂类调节药物治疗:ROS在炎症反应、细胞凋亡、细胞生长、血管张力的 改变以及LDL-胆固醇的氧化中发挥重要作用,而LDL-胆固醇(LDL-C)在动 脉粥样硬化形成中比天然LDL发挥更重要的作用。在所有动脉粥样硬化性心血 管疾病(CVD)的危险因素(如高血压、糖尿病、吸烟和血脂异常)中,都存在血管 壁ROS的生成速度上升现象。他汀类药物,贝特类药物,胆固醇吸收抑制剂, 烟酸类药物,均可降低LDL-C水平,维持HDL-C水平,使得病征减轻[15]。二、抗血小板药物:血小板的黏附、聚集参与AS斑块的形成,阿司匹林、氯吡格 雷等可以良好的抑制血小板的作用,达到减轻动脉斑块增张的作用[1617]。三、 抗炎治疗方法:AS的全部进程都有炎症反应的发生,故而抗炎药物可以良好的 调节病征。四、抗高血压药物:受体通道阻滞剂以及血管紧张素的抑制剂和受 体拮抗剂都能够有效的舒缓血管,达到使血流通畅,减轻阻塞的作用[18-2Q]。五、 抗氧化剂:抗氧化剂能够明显的减少人体内的氧化应激反应,而氧化应激反应 又是血管氧化刺激,以及促进局部炎症的重要刺激因子[2122]。所以应用如丙丁 酚,血清胆红素等药物可以明显抑制血管的氧化反应。值得注意的是,一些类 丙丁酚药物的实验证明,如普罗布考等在不降低血脂的情况下,也可以阻止动 脉粥样硬化的发生。

1.3动脉粥样硬化的模型

在之前的研究中,ApoE-/-小鼠被广泛应用于动脉粥样硬化模型的制作,因 为其基因和代谢调节的缺陷,成模率高,易于饲养繁殖。之前的研究在小鼠模 型上有很多发现,烟酰胺磷酸核糖转移酶能够加重炎症并促进ApoE-/-小鼠模型 的动脉粥样硬化。F11R/JAM-A的肽拮抗剂减少斑块形成,并延长动脉粥样硬 化模型小鼠的存活时间。小鼠血管细胞外腺苷代谢与动脉粥样硬化的易感性相 关。小鼠也常应用于药物试验,依维莫司消耗斑块巨噬细胞,消除斑块内新血 管形成并改善晚期动脉粥样硬化小鼠的存活率[23]

大耳白兔,小型猪也是动脉粥样硬化模型常用动物之一,有研究表明多西 紫杉醇载体的脂质核心纳米颗粒在动脉粥样硬化兔模型中减少动脉粥样硬化病 变、炎症、细胞死亡和增殖。鱼肝油会减少小型猪的动脉粥样硬化。二氯乙酸 盐可以预防临床前兔和小型猪动物模型的血管损伤再狭窄[24]

SD大鼠(Sprague-DawleyRattusNorregicus)是常用的实验动物模型,在 毒理、药理、病理以及临床GLP实验中发挥着不可替代的重要作用。SD大鼠 是封闭群大鼠,由20世纪50年代初,美国科学家经由Wistar大鼠培育而来。 因为SD大鼠在生理代谢以及动脉粥样硬化的病程发展上和人类相似,而且易 于饲养,便于后续试验操作,所以SD大鼠是研究动脉粥样硬化的实验动物模 型的良好选择[25,26]

第二节SiRNA研宄进展

小分子干扰RNA是外源性双链RNA的加工产物,在细胞内能介导 RNAi效应。通过对特异对应的mRNA的识别,并发挥分子海绵与竞争抑制效 应,沉默同源基因的表达。因为其特异性和高效性,具有很高的实用价值。目 前SiRNA己成为许多疾病潜在的治疗手段。对于SiRNA的应用,尽管其非特 异性反应仍然存在,高效而稳定的传递载体有待发掘,在对新的基因突变和适 配性上还有待进一步的研究,但在抗病毒、人类与实验动物肿瘤和基因相关癌 症治疗等许多领域具有潜在的治疗作用[27]

SiRNA的发现是一个偶然,在蠕虫和线虫的体内,SiRNA作为沉默基因表 达的物质被Fire和Mello鉴定出来[28]。他们的实验推翻了当时流行的观点,即 反义RNA是通过碱基对对其mRNA配对而导致沉默,从而阻止其转化为蛋白 质。SiRNA是一种小RNA分子(21-25核苷酸),由Dicer (RNAase III家族 中对双链RNA具有特异性的酶)加工dsRNA而成[29,3G]

制作SiRNA有三个步骤:通过起始阶段的dsRNA被Dicer识别,并被切 割成SiRNA。随后激活的RISC与双链SiRNA结合,使其变为单链结构。最后, 通过聚合酶反应提高SiRNA的量,从而增强反应强度。

尽管早在1978年,反义寡聚核苷酸(antisense oligonucleotide)就被提出 作为一种基因治疗的方法,此外RNA干扰(RNA interference,RNAi)的研究 也获得了 2006年诺贝尔奖的认可。但是,RNA疗法的研发却并不是一帆风顺 的。直到 Ionis Pharmaceuticals 的反义寡核苷酸疗法(ASO) Spinraza(nusinersen) 和 Tegesedi (inotersen),以及 Alnylam Pharmaceuticals 的 SiRNA 疗法 Onpattro (patisiran)在2016年左右才相继获得FDA的批准。

SiRNA疗法可以被广泛应用于包括抗病毒治疗,抗肿瘤治疗,神经系统疾 病治疗在内的各种疾病的治疗。通过转染SiRNA并抑制疾病相关的关键mRNA 并抑制其蛋白表达,达到抑制疾病的作用。在科研实验中,以及对基因的检测 方法探究中,SiRNA的用处是巨大的。但是,由于其大分子和电子特性,SiRNA 基本不能被单独应用。SiRNA必须在载体的作用下抵消细胞识别和自我凝集, 才能转运到机体组织和细胞内发挥作用。双链寡核苷酸是高度亲水的,易扩散, 难聚集和被吸收,如果不进行修饰,则无法在组织中被良好的吸收。因此其修 饰和处理的方法,包括使用脂质纳米颗粒(Solid lipid nanoparticles,SLN)帮 助双链寡核苷酸被运送到靶点组织,并且在同时保护核苷酸免于降解。以及使 用N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)结合到SiRNA上,从而促进肝细胞靶向摄取 SiRNA,(这种方法对双链和单链寡核苷酸都有效)[3132]

目前最多的研究是SiRNA在肿瘤方面的研究,通过导入包含SiRNA的活 性或纳米物质,是SiRNA被应用到肿瘤细胞治疗的主要方向肿瘤的发生是 多种基因共同作用的结果,而SiRNA可以通过对同族基因进行保守性抑制,来 达到抑制肿瘤的作用,通过可降解葡萄糖纳米载体技术,可以运载SiRNA进入 癌症组织RNAi在同一基因家族中具有广泛抑制作用,也被称作家族抑制 作用,即注射一种保守序列同源SiRNA,可以同时抑制多种mRNA^,36]

在病毒性疾病的治疗中,ALN-RSV01 (Alnylam Pharmaceuticals,MA,USA) 利用经典的SiRNA方法,合成了第一种对抗病原体的SiRNA,它能够通过中 断N蛋白合成来抑制RSV复制并阻断病毒对细胞的感染[37_4()]。通过SiRNA可 以特异性地抑制某个基因的表达,用以治疗基因缺陷或过量表达性病征,调节 遗传病[41_43]。应用SiRNA能够在哺乳动物中抑制特定基因表达的特性,产生类 似基因敲除的效应,还具有可调控控制时间,自由选择发育阶段进行敲减的特 点。故而在基因功能研究中,应用SiRNA转染的方式,达到抑制特异基因的

第三节Cav-1在动脉粥样硬化中的作用

Yamada在1995年首次提出“小窝”一词,用来描述胆囊上皮细胞上“与细胞 外相沟通的囊泡、气泡、孔洞或凹陷”。随后,在其他细胞的表面也发现了类似 的结构。这一词便成为了描述“直径约50-100nm,微囊结构或co形状的细胞质 膜松弛结构”的专有名词,小凹细胞表面质膜内陷,被认为在调节细胞信号和分 子转运等方面发挥重要作用。这些细胞器富含鞘磷脂和胆固醇,其特征是存在 蛋白 Cav-1[44]。

小窝蛋白,它的首次发现是在1950年代,这是一个嵌入结构与细胞质膜上 的多种形式。它由多种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白、糖脂和胆固醇组成。小 窝蛋白-1是小窝膜的主要成分,它属于包括Cav-2和Cav-3在内的三个基因家 族。Caveolin-1和Caveolin-2在大多数细胞中共同表达,并在质膜和其他内部 细胞膜中共定位,而Caveolin-3的表达本质上局限于肌肉细胞。以往的研究表 明,敲除Caveolin-1导致的Caveolae缺失可导致癌症、糖尿病和血脂异常。而 同时Cav-1是动脉粥样硬化的明显特征之一。然而,Cav-1在不同组织和细胞 中的作用是并不相同的。

  • Cav-1的促动脉粥样硬化作用
  • Cav-1与内皮细胞

Cav-1在内皮细胞中是作为促进动脉粥样硬化因子存在的,Cav-1促进内皮 细胞高表达炎症反应因子,使LDL-C迅速堆积,对于动脉粥样硬化病程进展和 斑块的形成有促进的作用。实验发现,在小鼠体内内皮细胞进行基因编译,内 皮特异性高表达Cav-1的小鼠其动脉粥样硬化的发展更迅速。RalA激活的PLD2 产生的磷脂酸会加速Caveolae介导的内吞作用和内皮细胞的运输[45]。在内皮细 胞中,LDL颗粒是促进病征的关键因子,组织和血液中的LDL-C被转运到内 皮后进行修饰,这个过程会加速动脉粥样硬化的发展。

通常,大分子的物质如蛋白与部分RNA等穿越细胞的方式有两种:液相融 合胞吞作用,以及受体介导的分子通道效应。而这两种调节方式,都与细胞的 小窝关键蛋白Cav-1息息相关。Cav-1缺之的内皮细胞,可通过阻碍白细胞进入动脉壁并产生调节性T细胞的反应来减少动脉粥样硬化。在体内和体外实验 中发现,敲除Cav-1的小鼠,其主动脉内皮细胞对于LDL-C的摄取量明显降低 [46]。在人类脐带静脉内皮细胞实验中,将Cav-1的表达降低,发现LDL的摄取 量明显下降,这表明,在人的内皮细胞中,Cav-1对LDL的摄取有调节作用[47]

氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是一种对组织和细胞有氧化损害作用的大分 子物质。内皮细胞上,LOX-1是ox-LDL的主要受体[48]。研究发现,ox-LDL可 以反向调节Cav-1,促使内皮细胞中的Cav-1表达增加。而Cav-1又可以通过 NF-kB信号通路上调ox-LDL的受体LOX-1的表达,增加ox-LDL的聚集和摄 入,形成恶性循环。实验人员通过抑制Cav-1,发现ox-LDL进入内皮细胞的过 程受到阻碍[49_51]。这些证据都表明,Cav-1能够促进内皮细胞对于脂类的吸收, 进而引起炎症反应,加速推进动脉粥样硬化的进程。

同时,Cav-1还直接或间接调控内皮中的炎症反应。内皮型一氧化氮合成酶 (eNOS)是内皮细胞合成一氧化氮(NO)的关键酶,Cav-1对于eNOs具有调节作 用。研究发现,Cav-1会通过和eNOs来抑制其酶活性,而Cav-1会通过苯丙氨酸 92与eNOS结合。有实验证明,Cav-1的寡聚化可以以温度依赖性方式破坏,使 得Cav-1单体/寡聚体的比例能够用作翻译后修饰的指标。Iwakiri和DurAn等人 发现eNOS广生的NO可与邻近蛋白质上的疏基反应(S-亚硝基化),从而调节多 种细胞过程,如蛋白质运输,氧化还原状态,内皮通透性和细胞周期[52]。在HUVEC 中,A23187诱导的Cav-1 Cysl56 S-亚硝基化,Cav-1 Tyrl4磷酸化和Cav-1寡聚 体的去稳定化可被eNOS或Src抑制阻断。Bakhshi和Zimnicka用TNF-a处理的 人肺微血管内皮细胞和白蛋白上报道了类似的结果。Cav-1 Cysl56 S-亚硝基化和 Tyrl4磷酸化使Cav-1寡聚体不稳定。通过计算机模拟预测Cav-1结构,当Cav-1 Tyr 14被磷酸化时,N端区域将会移动,可能重新定向附近的Cav-1支架结构域 (SCD),从而形成有利于与其他相互作用的界面。含有Cav-1结合基序的蛋白 质。为了支持这种模型结论,Chen等人发现磷酸化的Cav-1 Tyrl4表现出更强的 与eNOS的结合[52,53]。但在天然低密度脂蛋白(nLDL)等病理因素作用下,eNOS 的活性会受到异常的抑制,上述过程被中断,导致血管功能紊乱,促使动脉粥样 硬化发生。另有的研究发现,Cav-1会介导内毒素抑制内皮素-1诱导eNOs的活性

[54]Cav-1还可以调节VEGF刺激的血管再生进程,Cav和Rac能够共同调节

窦状内皮细胞中内皮毛细血管的形成和通道孔洞的收缩过程[55]

3.2 Cav-1的抑制动脉粥样硬化作用 3.2.1 Cav-1与巨噬细胞

Cav-1的缺失会抑制巨噬细胞的吞噬作用,减缓巨噬细胞清除凋亡坏死细 胞的速度。在巨噬细胞中,Cav-1具有抑制动脉粥样硬化的作用。有研究发现 Cav-1缺失小鼠胸腺和脾脏中的凋亡细胞数量增加(通过组织裂解物中 Caspase-3裂解增加和原位TUNEL染色增加证明)。然而,Cav-1缺失小鼠中 凋亡细胞的增多是由于巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬清除减少,而不是淋巴细胞 群中细胞凋亡的内在缺陷。Cav-1缺乏的巯基乙酸盐诱发的腹膜巨噬细胞 (TG-PM)中,胸腺细胞对大肠杆菌(E.coli) K-12 Bio-Particles的体外吞噬作 用的能力下降[56]

另有报道使用Cav-1 (-/-) ApoE (-/-)小鼠并将其移植到Cav-1获得的骨 髓(BM)细胞中(+/+) ApoE (-/-)或 Cav-1 (_/-) ApoE (-/-)小鼠,反向实 验得到相同结果。实验发现携带Cav-1 (-/-) BM衍生的巨噬细胞的Cav-1 (+/+) 小鼠比携带Cav-1 (+/+) BM-的Cav-1 (+/+)小鼠产生显着更大的损伤。Cav-1 (-A)巨噬细胞更容易发生细胞凋亡,更容易诱发炎症[57]

巨噬细胞中减少Cav-1会促进由脂质多糖激发的血红素加氧酶-1定位异 常,进而导致过度炎症反应,加速动脉粥样硬化。Cav-1通过p38-MAPK途径 抑制巨噬细胞内质网应激,诱导细胞凋亡的作用,可以加速血管斑块的清除。 Cav-1作为CD206的结合蛋白,对于二肽基肽酶-4抑制剂在人和小鼠巨噬细胞 的抗炎作用中起着至关重要的作用,可以促进炎症反应的减少,减缓动脉粥样 硬化的发生[58_6()]。Cavl与膜脂筏上的CFTR共定位,与巨噬细胞的炎症和凋亡 有关,受到CFTR表达降低的影响。随着CFTR的沉默,肺泡巨噬细胞(AM) 的mRNA和蛋白水平升高,Cavl的负转录调节因子结合蛋白(SREBP)的表达和 转录活性下降,但总胆固醇和游离胆固醇量没有变化。这些发现表明,CFTR 在AM中的沉默导致炎症表型和凋亡,这与Srebp介导的Cavl调控有关[61]。 AM在Cav-1敲减表达后分泌重要的促炎细胞因子和选择性增强TNF-a和IL-6 的产生,同时显著抑制LPS刺激的抗炎细胞因子IL-10的生产。在RAW264.7 细胞中过表达Cav-1可增加p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化,而抑制 c-JunN端激酶,细胞外信号调节激酶MAPK和Akt磷酸化。在RAW264.7细 胞中使用p38抑制齐[J,可以显著抑制lps诱导的Caveolin-1产生的细胞因子的抗 炎调节作用[62]

3.2.2 Cav-1与平滑肌细胞

血管平滑肌细胞(VSMC)是血管介质的主要细胞成分,它的迀移和增殖 导致新内膜的形成,其增殖使血管对动脉粥样硬化特别敏感。许多激素和生长 因子作用于VSMC导致迁移,增殖和细胞外基质的分泌以及这些过程的调节或 功能障碍是动脉粥样硬化的最可能原因。

对于动脉粥样硬化来说,平滑肌细胞的功能一直备受争议,动脉瘤效应虽 然多有发现,但并不是动脉粥样硬化的主要成因。平滑肌细胞在动脉粥样硬化 斑块中被大量发现,而且在动脉粥样硬化的病灶中,通常都会发现平滑肌的大 量聚集,而且斑块内的平滑肌细胞呈合成型,不具有收缩功能。Cav-1缺乏的 主动脉平滑肌细胞在增殖、迀移和内皮素信号转导方面表现出细胞异常[63]

近来研究发现,新生内膜形成是动脉粥样硬化过程的一个特征性现象,异 常增生的内膜由平滑肌细胞的病理性转移和增殖引起。并随着病程的加深,平 滑肌细胞会大量吸收氧化蛋白以及致炎因子,形成泡沬细胞团,并在病征后期 破裂,形成血管损伤以及血栓。在人和小鼠的平滑肌中,Cav-1具有抗平滑肌 细胞转移及增殖的功能,从而发挥抗动脉粥样硬化作用[64]

VSMC的病理性增殖在动脉粥样硬化病变的发展中起主要作用。VSMC生 长受到多种化合物的刺激,例如血小板衍生生长因子和血管紧张素11[65]。血管 紧张素II激活许多级联途径,包括Ras/MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)。有人 提出内源性CO在生理和病理条件下均在调节血管张力中起重要作用,调节 VSMC丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性。当Cav-1表达受到抑制之后,一 氧化碳抑制平滑肌增殖的作用消失。有的实验发现,在添加PDGF因子之后, VSMCs中Cav-1的表达量降低[66]。在VSMC中,高浓度的E2和DHT抑制血 小板衍生生长因子(PDGF)或胰岛素样生长因子(IGF-1)诱导的DNA合成, 表明雌激素,雄激素及其各自的拮抗剂在控制血管壁细胞增殖中的复杂性,量依赖性和细胞特异性相互作用,VSMC增殖的抑制可能有助于血管保护和血 管损伤的重塑反应。Cav-1在动脉平滑肌细胞中将I型肌醇1,4, 5-三磷酸受体 和典型的瞬时受体电位3通道组装成功能信号复第四节microRNA-204-5p的研宄进展

4.1 microRNA 的产生

关于miRNA的报道最早出现在1993年,Lee等人对线虫发育过程的研究 中,注意到在线虫发育早期,Lin-4基因的突变所引起的基因失活使得其很多应 该出现的发育延缓。同时,Lin-4基因的缺失突变造成了完全相反的现象,它使 线虫越过L1期特有的发育,直接进入了之后的阶段。研究发现,虽然lin-4的 蛋白水平变少,但是其转录水平并未改变。这种特殊的调控机制能够影响mRNA 的活性,它的原理可能需要lin-4的反式作用以及lin-4的3’UTR的顺式作用。 后来的实验证明,这种负调控机制是lin-4编码的小RNA片段通过互补阻断翻 译。这种小的RNA片段,被命名为microRNAs。

MicroRNAs(miRNAs)是一种小的非编码RNA,长度约为22个核苷酸,与 革巴mRNA的3’ untranslation region (3’-UTR)结合并作用,导致翻译抑制或mRNA 降解。miRNA是一种高效、特异的基因调控因子,在调控靶蛋白和参与细胞分 化、增殖、凋亡和细胞信号通路等基本生物学过程的基因转录后调控中发挥着 至关重要的作用^,69L据预测,这些miRNA可以调节大约30%的所有蛋白编 码基因的活性。蛋白质编码基因异常与非编码microRNA之间的相互作用,是 过去十年来肿瘤学领域最令人兴奋但又出人意料的发现之一。这个调控网络的 复杂性将癌症研究重新定义在miRNAs上,它曾经被认为是基因组产生的垃圾, 却对癌症的发生、发展和传播起着至关重要的作用。自然发生的miRNAs是非 常短的转录本,它从来不会产生蛋白质或氨基酸链,而是在转录、转录后和/ 或翻译水平上通过调控细胞过程(如生长、发育和分化;)中的蛋白质表达来发挥 作用。

4.2 miRNA的调控功能

miRNA的调控功能是十分重要的,在果蝇实验中,miRNA能调控细胞增 殖、介导凋亡过程重要调控因子及相关的脂肪代谢。同时在生物体水平上, miRNA会促进线虫极性的形成,调节哺乳动物的造血干细胞的分化过程,并在

其中起了重要作用。动物(尤其是人;)miRNA的生物合成过程己经初具规模。 首先,miRNA基因的初级转录产物Cpri-miRNA)在细胞核中被RNase III Drosha切割成为前体miRNA (pre-miRNA)。在最初的剪切后,pre-miRNA在 转运蛋白exportin-5的作用下由核内转到胞质中,然后由另一种RNase III Dicer进一步切割产生成熟的miRNA。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起 组成 RISC (RNA-induced silencing complex)复合体,从而引起革E mRNA 的 降解或者翻译抑制miRNA与革EmRNA的互补程度可能决定了 mRNA向蛋 白转化被阻断的机制。已经发现完全互补或接近完全互补可以诱导RISC对 mRNA的降解,部分互补可以通过阻断核糖体对mRNA的信号通路来抑制 mRNA的翻译。由于每个miRNA都有数百或数千个mRNA靶点,因此它们控 制着编码基因组的一大部分。miRNA-coding基因的调控是有重要作用的,因为 他们可以参与任何类型的病理生理过程和途径,如b细胞生存(miR-15a和 miR-16-1),b细胞谱系的命运(mir-181),大脑模式(mir-430),胰腺细胞胰岛素 分泌(mir-375),脂肪细胞发展(mir-145)细胞增殖控制(mir-125-b和let-7),或细 胞生存(let-7家族)。

Mature microRNA

mRNA target cleavage Transtationaf repression mRNA deadeny/ation

图1.2 miRNA的合成过程[71]

Fig 1.2 miRNA synthesis process

4.3 miRNA对Cav-1的调节探索

近年来,针对人和小鼠微囊蛋白Cav-1的多种miRNA被发现,包括 miR-199a-5p[72]、miR-203a-3p[73]、miR-103/107[74]、miR-192-5p[75]、miR-124-3p[76] 等等。这些miRNA通过靶向人类Cav-1调控胰岛素敏感性、热量限制、ROMK 通道、肿瘤细胞迀移和侵袭[77]。miR-290在乳腺癌的增殖和迀移中发挥重要作 用,miR-307已被报道为大鼠和人类胰岛素分泌细胞系的直接靶点[78LmiR-181b 和miR-29a参与PI3K和TGF-p/ Smad2/3信号通路在B细胞在小鼠早期胚胎发 展发展[79_82]。在胚胎成纤维细胞发育过程中,miR-290在不涉及MAPK信号通 路的情况下影响成纤维细胞的衰老,miR-290/292-5p激活免疫蛋白的分泌[83]。 以上现象表明,miRNA普遍影响细胞增殖。miRNA能重新定位细胞核,如在 人类细胞核中被发现的miR-29b证明,尽管他们体积小,但特定的miRNA仍 包含控制其亚细胞定位的特定核苷酸序列。这种定位支持已经证实的假设,即 miRNA可以在DNA水平上调控转录过程。例如,人类miR-373与E-cadherin (CDH1)启动子结合,从而诱导其表达[84]

本实验中,应用TargetScan软件预测可能Cav-1的miRNA并对其进行效果 监测,在 miR-431,miR-290,miR-204-5p 中发现 miR-204-5p 对 Cav-1 的调控 作用最为明显。

研究内容

第一节Cav-1对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

1材料与方法

1.1材料 1.1.1实验动物

SPF级6周龄SD大鼠,取自辽宁长生生物公司。

1.1.2试剂及耗材

4%多聚甲醛购买自碧云天;盖玻片,载玻片,DAB显色液,脱脂奶粉, 辣根过氧化物酶二抗,橘柠檬酸盐溶液购自博士德公司;cDNA第一链合成试 剂盒,实时荧光定量试剂盒购自北京天根;CCK8试剂,Trizol全RNA提取液 购自碧云天;氯仿,无水酒精,异丙醇,二甲苯购自北京试剂厂;各种规格枪 头购自Axygen;各种型号离心管购自NEST; SMA抗体及相关二抗购自上海 生工和索莱宝公司(PK110016等)。

1.1.3主要设备

1.1.4主要溶液配制

20%细胞培养液:取10ml胎牛血清FBS,溶解于40ml的DMEM中,得到10%

浓度的DMEM细胞培养液。保存于4°C冰箱。

10%细胞培养液:取5ml胎牛血清FBS,溶解于45ml的1640中,得到10%浓

度的DMEM细胞培养液。保存于4°C冰箱。

PBS缓冲液:磷酸二氢钾(KH2P〇4):0.27g,磷酸氢二钠(Na2HP〇4):1.42g,氯化 钠(NaCl):8g,氯化钾(KCl)0.2g,加去离子水约100ml充分搅拌溶解,然后加入 浓盐酸调PH至7.4,最后定容到1L。分装于50ml离心管中,存于4°C冰箱。 1.2方法

1.2.1 SD大鼠血管平滑肌细胞原代提取

  • 准备好手术器械,无菌手术环境,4°C磷酸盐缓冲液。
  • 取长生生物公司6周龄SD大鼠,性成熟,约200g,脱颈处死。
  • 浸泡于75%酒精之中,3分钟。
  • 点燃酒精灯,将消毒后的SD大鼠放置于无菌环境的手术板上,剔 除胸腹毛发。
  • 沿腹中线剥开毛发,剪开胸腹部,暴露主动脉。
  • 小心提起整条动脉,上至心脏,下至下肢动脉,将整条主动脉剪下, 并迅速放置于4°C磷酸盐缓冲液中。
  • 用镊子在显微镜下降血管内血液挤压出,并更换全新的PBS清洗, 直到血管呈现干净的乳白色胶皮管状。
  • 剥离血管外膜及结缔组织。
  • 剪下分支血管,剪开主动脉。
  • 刮去血管的内膜,外膜。牵拉法分离出中膜。
  • 随后将中膜清洗干净,放在20%的DMEM培养基中,用洁净的手 术剪将中膜剪碎至1立方毫米大小的碎块。
  • 将碎块平铺于25cm细胞培养瓶,并用微量的培养液,保持湿润。
  • 倒置培养瓶,于37°C,5%C〇2恒温培养箱中放置1.5小时,使组织 块贴壁。
  • 将20%DMEM培养液5ml注入培养瓶背面,轻轻翻转,浸润细胞。

绝对静止3天。之后每2天换一次培养液。

1.2.2大鼠血管平滑肌细胞鉴定

  • 将传代细胞放入有洁净盖玻片的培养皿中,放置于37°C,5%C〇2恒温 培养箱中,静置培养2天,使细胞爬满整片盖玻片。
  • 将细胞爬片放置于4°CPBS中清洗,操作轻柔,避免损伤细胞。
  • 将清洗好的细胞爬片放置于4°C的4%多聚甲醛中,固定5分钟,使细 胞形态固定。
  • 弃去多聚甲醛,将细胞爬片用4°CPBS清洗3次,去除残留的多聚甲

醛。

  • 将细胞爬片放入透化液中,透化1分钟,暴露靶点。(透化液为0.1% Trison,或者2%异丙醇)
  • 用4°CPBS清洗细胞爬片3次,去除多余透化液。
  • 用1:1000稀释的SMA—抗(上海生工生物有限公司)孵育细胞爬片, 于湿盒内4°C孵育过夜。(或常温孵育3小时)
  • 用4°CPBS清洗细胞爬片3次,去除残留的一抗。
  • 放入:L1000稀释的HRP二抗中(索莱宝公司),常温孵育2小时。
  • 弃去多余二抗,并用4°CPBS清洗细胞爬片。
  • 用DBA显色液试剂显色,在光学显微镜下观察。
  • 将另一张细胞爬片放入1:1000稀释的FITC二抗中(上海生工),常温 避光孵育2小时。
  • 弃去多余二抗,并用4°CPBS清洗细胞爬片。
  • 在荧光显微镜下观察。

1.2.3 SiRNA的细胞转染

  • 将SD大鼠血管平滑肌细胞于6孔板中培养。(10%FBSDMEM培养液)
  • 在37°C,5% C〇2的恒温培养箱中培养至细胞长满6孔板的60%-80%。
  • 弃去培养液,用4°CPBS清洗干净,并饥饿细胞1小时。
  • 将 15|tiL 的 Lipofectamine 2000 (ThermoFisherScientific 公司)稀释在 485pL 1640培养液中,静置5分钟。
  • 将15|iL的FITC-SiRNA稀释在485|iL 1640培养液中,静置5分钟。
  • 将4、5中的两溶液混合,至lmL,充分轻柔混合后,静置15分钟。
  • 将6中溶液加入到6孔板中。
  • 于37°C,5%C〇2的恒温培养箱中培养2小时。
  • 向6孔板中加入lmL10%FBS 1640培养液,继续在37°C,5%C〇2的

恒温培养箱中培养24小时。

  • 用荧光显微镜观察转染效率。

1.2.4细胞的PCR提取

  • 取转染好的细胞,弃去培养基,用4°CPBS清洗干净。
  • 每孔中加lmlTrizol,室温中裂解15min(或4°C过夜),4°C12000r/M 离心lOmin取上清。
  • 上清中加200|uL4°C预冷的氯仿,上下颠转15s,室温中静置5min,4°C 12000g离心15min,离心管倾斜45°吸取上清至新离心管中。
  • 上清中添加与之等量的-20°C预冷的异丙醇(约500|til),充分混匀后, 室温中静置lOmin,并在离心机中4°C 12000g离心lOmin。
  • 将管中液体弃掉,加入lml 75% DEPC水配制的乙醇溶液洗涤,7500 g 离心5min重复3次。弃掉管内液体,超净台中干燥5min-10min。(干燥时间 过长会减少RNA溶解量并使OD260/280比值偏低)
  • lOOfilDEPC水溶解RNA,测定浓度后标记分装冻于-80°C冰箱中。 2.5MTT法测量细胞活力
  • 将5 X 1〇3个SD大鼠血管平滑肌细胞种于96孔板中(NEST),在37°C, 5% C02的恒温培养箱中培养至细胞长满60%-80%。
  • 弃去培养液,用4°CPBS清洗干净,并饥饿细胞1小时。
  • 将 15|uL 的 Lipofectamine 2000 (ThermoFisherScientific 公司)稀释在 85pL 1640培养液中,静置5分钟。
  • 将15|iL的FITC-SiRNA稀释在85|iL 1640培养液中,静置5分钟。
  • 将4、5中的两溶液混合,至200pL,充分轻柔混合后,静置15分钟后 加入孔中。每种试剂设置至少3孔重复。
  • 于37°C,5%C〇2的恒温培养箱中培养2小时。
  • 向96孔板中加入200|iL 10% FBS 1640培养液,继续在37°C,5% C〇2

的恒温培养箱中培养24小时。

  • 提前1小时向每孔细胞种加入10|iL5%MTT溶液,培养1小时。
  • 弃去全部液体,用4°CPBS清洗一遍。
  • 向每孔中加入DMSO,将细胞颜色结晶溶解。之后用酶标仪490nm测

量吸光度,并计算出其活力。

1.2.7细胞划痕实验

  • 将SD大鼠细胞在6孔板中培养,至铺板60%-80%。
  • 转染SiRNA,在24小时后弃去培养基,用4°CPBS清洗3遍。

3;)用无菌直尺校正,用无菌枪头在6孔板中线划开细胞,产生划痕,并用 光学显微镜捕捉划痕位置。

  • 用ImageJ软件测量划痕初始大小比例。
  • 加入10% FBS 1640培养液,在恒温培养箱中培养,并分别在6小时, 12小时,24小时的时间段再次测量划痕大小。
  • 计算细胞迀移愈合速度。

1.2.8实时荧光定量测量SiRNA对Cav-1的影响

  • 用天根公司cDNA第一链合成试剂盒,将留存的RNA反转录为cDNA。
  • 设计特异性RT-PCR引物,以内参基因Beta-Actin为参照,在实时定量 PCR扩增仪上进行光感拓增,根据公式2_AAQ(AACt = ACt (case)—ACt (control)) 计算基因的表达情况。引物的具体信息见下表。

表1.2荧光定量PCR引物 Table 1.2 Primers of RT-PCR

实验结果显示为平均值±标准误,运用双尾t检验分析,P值<0.05则差异 性显著*,P值<0.01差异非常显著**,P值<0.001差异极显著***〇

2实验结果

组织块贴壁法是将动物体组织块干涸紧贴在培养瓶中,将血管平滑肌层用 镊子撕取清洗,用手术剪剪碎成一毫米立方的小块,用少量的培养液冲散在细 胞培养瓶中(图1.1 A)。静置培养两周,时刻观察培养基颜色,不要摇动培养 瓶,在显微镜下可以观察到,细胞从紧贴在培养瓶上的组织块中爬出,在组织 块周围形成峰谷状生长的细胞群(图1.1 B)。将组织块和原代细胞混合的培养 瓶中的组织块冲下,之后将细胞用胰酶消化并传代(图1.1 C)。为了进行免疫 组化实验制作免疫荧光玻片,需要将细胞进行玻片爬片培养,将干净的盖玻片 用双蒸水洗净,并用胰酶与双抗去除玻片上残留的细胞碎片与细菌,将处理好 的玻片与细胞进行共培养,得到细胞爬片(图1.1 D)。

注:(A)将组织块剪碎成1立毫米的小块,并将组织块平铺并粘附于瓶底。(B)静置 培养14天,可以观察到细胞从组织块(黑色区域)中爬出。(C)传代后细胞培养7天后状 态。(D)细胞爬片状态。常用的鉴定平滑肌的方法有:染色法,免疫组化法,细胞公司基因鉴定。 本实验中,得到大鼠平滑肌细胞,应用纤维蛋白与胶原蛋白染色法,对平滑肌 特异表达的SMA蛋白进行免疫组化鉴定。Masson染色方法是鉴定纤维蛋白与 肌蛋白的良好方法,纤维蛋白呈现蓝色染色,肌蛋白呈现红色染色(图1.2A)。 在图1.2 A中可以看见大量肌蛋白被染色呈现的红色,与细胞核呈现的蓝黑色, 初步鉴定该细胞为肌细胞。SMA是平滑肌细胞特异性表达的蛋白,是平滑肌细 胞的管家基因,用HRP辣根过氧化物酶修饰的二抗进行鉴定,并用DAB进行 显色反应(图1.2 B,C)。用FITC荧光修饰的二抗进行二次鉴定,并在荧光 显微镜下观察(图1.2D)。鉴定的结果表明,该细胞为大鼠平滑肌细胞。

图1.2大鼠血管平滑肌细胞鉴定
Fig. 1.2 Identification of rat vascular smooth muscle cells

注:(A)通过对胶原蛋白和纤维蛋白的染色,鉴定纤维细胞和平滑肌细胞。SMA作 为大鼠血管平滑肌细胞的标志蛋白,(B,C)辣根过氧化物酶DAB染色结果。(D) FITC 焚光免疫结果均检测出平滑肌细胞周围表达SMA。

SiRNA因为其所带电荷与链式结构,在没有辅助转染的情况下,是难以进 入到细胞中发挥作用的,所以应用脂质体转染的方式,将SiRNA转染到VSMC 中。脂质体lip2000购买自赛默飞世尔公司,是一种亲膜脂质,能够将SiRNA 包裹在脂质体中,并通过细胞膜对脂质体的胞吞作用将SiRNA导入到细胞之 中。将SiRNA与脂质体混合后与细胞共同培养,并在SiRNA上用FITC荧光修 饰,在荧光显微镜下观察可以发现,用脂质体转染的SiRNA所表达的荧光显示 在细胞内部,表明SiRNA已经被细胞吞入,成功转染到了细胞之中。根据自然 光和荧光对比图可以发现,SiRNA的转染效率可以达到70%-80% (图1.3)预 实验中,SiRNA-137具有最显著的干扰作用。

总细胞数的70%-80%在转染了 SiRNA后,提取细胞的RNA,进行实时荧光定量。从预选SiRNA 中,找到了干扰效率最高的SiRNA-137,并分别在24h和48h干扰的情况下检 测Cav-1的表达效率,可以发现,转染了 SiRNA-137的实验组,Cav-1的表达 量被减弱为对照组的一半,并且在48h时抑制效率要高于24h,表明在48h内, SiRNA均有抑制Cav-1表达的作用(图1.4)。随后,在96孔板中,应用MTT 检测细胞活性,在酶标仪进行吸光度测定,通过结果可以发现,在48h时,SiRNA 转染后的细胞Cav-1敲减效应最显著,其增殖活性最高(图1.5)。细胞划痕实 验鉴定细胞迀移与愈合速率的良好方法,将处理好的细胞用细胞刮刀进行划痕 处理,暴露出相近的无细胞空隙,并实时观察划痕处的愈合速率,在相同时间 内愈合面积比例大的细胞,其愈合迀移能力强。SiRNA转染组的迀移效率比对

.4.2 MTT细胞活力照空白组的效率高,说明Cav-1的减少有助于平滑肌细胞的愈合。(图1.6)。 2.4.1 RT-PCR

图1.5 MTT细胞活力检测
Fig 1.5 MTT cell viability assay

注:在转染SiRNA-137后,用MTT检测细胞活力变化,发现转染了 SiRNA-137的大

鼠VSMC增殖活性升高,并在48h差异显著。

2.4.3划痕实验

图1.6细胞划痕实验

Fig 1.6 Cell scratch experiment

注:(A)在显微镜下,对NC组VSMC进行划痕损伤。6小时后,伤口愈合约20%。 (B)在显微镜下,对SiRNA组VSMC进行划痕损伤。6小时后,伤口愈合约50%。 3讨论

SiRNA根据Cav-1的DNA序列设计而合成,但并不是所有的SiRNA都能 够结合并发挥其作用,本研究合成了三种SiRNA: 137/431/221,经过验证, SiRNA-137对Cav-1的抑制作用最显著,而SiRNA-431的抑制效率只有 20%-30%,SiRNA-221的抑制效率小于10%。故而在正式进行试验前,应用三 种SiRNA进行预实验是有必要的,以达到对Cav-1的显著敲减。

平滑肌细胞的培养需要对活体动物进行组织的提取,而组织的活性直接关 系到原代细胞培养的成功与否。所以活体动物应小于六周龄,采取血管平滑肌 的过程不应超过一个小时。通过组织块贴壁法提取大鼠原代平滑肌细胞,并通 过标志蛋白染色等免疫组化方法鉴定平滑肌细胞,随后向平滑肌细胞中转染 SiRNA,并通过FITC荧光法检测转染效率。随后,将转染了 SiRNA的细胞通 过MTT和划痕实验,检测其增殖活性与迀移效率。SiRNA具有将Cav-1的 mRNA降解抑制的功能,实现抑制Cav-1表达的作用。

4小结

  • 提取大鼠原代血管平滑肌细胞,并通过SMA特异标志验证培养的细 胞是大鼠血管平滑肌细胞。
  • SiRNA转染效率达到70%-80%,并通过减少mRNA的含量,成功抑 制了 Cav-1的表达。
  • MTT的结果表明,转染SiRNA后细胞增殖活性升高。划痕实验结果 表明,转染SiRNA后,细胞的迀移速率升高。减少Cav-1会增加大鼠血管平滑 肌细胞的增殖和迀移速率。

第二节MiR-204-5p对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

1材料与方法

1.1材料 1.1.1实验生物

SD大鼠血管平滑肌细胞,SPF级SD大鼠购自辽宁长生生物有限公司。 1.1.2试剂及耗材

Western蛋白免疫痕迹相关试剂和电泳玻璃仪器购买自MYM和君意公司;

cDNA第一链合成试剂盒,荧光定量试剂盒购自北京天根;CCK8试剂,Trizol全

RNA提取液购自碧云天;三氯甲烷溶液,分析纯乙醇溶液,异丙醇及其他化学

纯品购自北京试剂厂;1.5mL离心管购自NEST;抗体及相关二抗购自Abcom;

突变载体购自广东锐博公司,高脂高糖饲料以及饲料添加剂购自博泰宏达公司;

血液胆固醇,HDL,LDL检测试剂盒购自索莱宝。

1.1.3仪器设备

20%细胞培养液:取10ml胎牛血清FBS,溶解于40ml的DMEM中,得到 10%浓度的DMEM细胞培养液。保存于4°C冰箱。

10%细胞培养液:取5ml胎牛血清FBS,溶解于45ml的1640中,得到10% 浓度的DMEM细胞培养液。保存于4°C冰箱。

PBS 缓冲液:磷酸二氢钾(KH2P〇4):0.27g,磷酸氢二钠(Na2HP〇4):1.42g, 氯化钠(NaCl):8g,氯化钾(KCl)0.2g,加去离子水约100ml充分搅拌溶解,然后 加入浓盐酸调PH至7.4,最后定容到1L。分装于50ml离心管中,存于4°C冰 箱。

1.2方法

1.2.1荧光素酶鉴定

  • 酶切,联合

图2.1酶切载体示意图

Fig 2.1 Schematic diagram of enzyme digestion vector

设计扩增引物如下:

r-Cav-l-3UTR-F(49)(XhoI)GGCGCTCGAGGTGCCAATTCCAAGTTGCTATC r-Cav-l-3UTR-R(916)(NotDAATGCGGCCGCGTGAAACTGAATAGACCCGAGG 拓增引物总长度:868bp,斜粗体标注Xhol酶切位点和Notl酶切位点,之

前序列为保护碱基。

r-Cav-l-3UTR-MUT-F376GGTTATAGTTTCCCTTGAGTTTCAGGATATGGCT

r-Cav-l-3UTR-MUT-R369TGAAACTCAAGGGAAACTATAACCTCATCGCCTA

2) PCR反应体系设计为30叫总体系,在PCR仪中进行拓增,最后吸取5pLPCR 产物点样,在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳分析,并按照PCR纯化试剂盒方式 纯化。

图2.2联合载体拓增后PCR
Fig. 2.2 PCR of combination-vectors

  • 二次酶切

用Xhol,Notl对上述纯化产物和载体进行双酶切,酶切反应体系如下:

l〇x H 缓冲液 4|iL,DNA 约 2 |ig,内切酶(10 U/吣各 l|iL,DEPC H2〇 补足

到40(iL,在37°C恒温箱中放置4小时。之后酶切回收纯化

  • 连接,转化,

将DNA与载体连接后,将连接好的突变载体加入到DH5a感受态细胞中, 让感受态细胞吸收,随后37°C培养12-16小时。

  • 菌落PCR鉴定

挑取单菌落,进行PCR。实验分五组,分别进行PCR。PCR反应完成后, 用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳分析,每孔中加入Buffer染色后的化L PCR反应

体系,用载体上游和载体下游引物扩增的条带理论大小为lioobp左右。之后将 阳性的克隆送测序公司测序进一步鉴定。

ISOObp

lOOObp

图2.3转化结果PCR
Fig. 2.3 PCR of transformation results

6)突变载体构建

利用PCR突变的方法,在野生型载体基础上,设计突变引物将靶序列 AAAGGGAA (Position 353-360)突变为 TTTCCCTT。

表2.2突变载体构建

菌落扩大培养提取质粒

挑取上述平板上的单菌落,接种到含Amp抗生素(抗生素浓度100 |ig/ml)

的4 ml LB液体培养基中,于220 rpm摇床培养12小时;然后提取质粒。

  • 双焚光素酶报告实验流程

在37°C,5%C〇2的恒温培养箱中,培养293T细胞。当细胞处于对数生长 期时,在96孔板中接种1.5 X104个细胞,每孔100吣标准培养液,于37°C恒 温箱培养中静置24h。之后用培养基稀释miRNA-mimics和NC,靶基因3’UTR 双报告基因载体和突变载体以及转染试剂(LipofectamineTM2000)。5min后 三者混合,共50|iL,轻轻摇匀,静置25min。

向293T细胞中加入上述50|iL混合液,最终每孔总体积150pL。其中mimics 转染浓度均为50nM,质粒浓度为250ng/?L,每组设3个复孔。6h后再加100pL 10% FBS的新鲜培养基。荧光素底物与荧光素Buffer使用前平衡至室温,加入 常温stop&Glo底物,现配现用。转染48h后吸出培养基,以35pL/孔加入1 X PBS,并加入luciferase底物35吣/?L,振荡lOmin,测定荧光值。加入 30|iLStopreagent,振荡lOmin,以荧光照度计测定荧光值。靶实验分组见表2.3。

  • 在37°C,5% C〇2的恒温培养箱中培养至细胞长满6孔板的60%-80%。
  • 弃去培养液,用4°CPBS清洗干净,并饥饿细胞1小时。
  • 将 15|uL 的 Lipofectamine 2000 (ThermoFisherScientific 公司)稀释在 485pL 1640培养液中,静置5分钟。
  • 将 15|iL 的 FITC-miRNA-204-5p 稀释在 485|iL 1640 培养液中,静置 5

分钟。

  • 将4、5中的两溶液混合,至lmL,充分轻柔混合至终浓度为50nM, 静置15分钟。
  • 将6中溶液加入到6孔板中。
  • 于37°C,5%C〇2的恒温培养箱中培养2小时。
  • 向6孔板中加入lmL10%FBS 1640培养液,继续在37°C,5%C〇2的 恒温培养箱中培养24小时。
  • 用荧光显微镜观察转染效率。

1.1.3 细胞全蛋白的提取与WesternBlot

  • 实验前准备:1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。2.匀 浆缓冲液:1. 〇 MTris-HCl(pH 8) 1. 0 ml; 10%SDS 6. 0 ml; P-巯基乙醇 0. 2 ml; ddH2〇2. 8 ml。3.转膜缓冲液:甘氨酸 2. 9g; Tris5. 8g; SDSO. 37g;甲醇 200 ml;力卩 ddH2〇 定容至 1000 ml。4. 0• 01 M PBS(pH7. 4): NaCl 8. 0 g; KC10• 2 g; Na2HP〇4 1. 44 g; KH2PO4 0• 24 g;力卩 ddH2〇 至 1000 ml。5•包被液(5% 脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0 g溶于20 ml的0.01 M PBS中。6. PDGF膜, SDS凝胶玻璃板等。
  • 全蛋白提取
  • 每瓶细胞分别用胰酶消化下培养孔,并放置于无菌离心管中。加4°C 预冷的PBS (0.01MpH2〜7.3)清洗后12000r/m离心,再冲起,再离心,重

复3次。然后弃去洗液。

  • 每管细胞加400|iL含PMSF,磷酸酶抑制剂,蛋白酶抑制剂,EDTA 抑制剂的裂解液,于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇

动。

  • 裂解完后,于4°C下12000 rpm离心5 min。(提前开离心机预冷) 将离心后的上清分装转移倒新的1.5 ml的离心管中,加入LoadingBuffer并在 95°C水浴锅中水浴5分钟。
  • 可以放于-20°C备用。
  • SDS凝胶电泳
  • 按说明书配制10% SDS凝胶,随后将制备好的全蛋白预混业按1mm 孔每孔15pL蛋白样品添加到SDS凝胶孔中。
  • 110V电压电泳至Marker条带分离。随后取出,按照滤纸,PDGF膜, SDS凝胶,滤纸的方式自阳极到阴极放置,夹好。在电泳槽中以280mA电流转

膜40分钟。

  • 将吸附蛋白的PDGF膜放于封闭液中常温封闭3小时,之后转移到相 应的一抗中,4°C孵育过夜。之后在TBST中清洗干净,在二抗中孵育2小时。 再用TBST清洗干净,用显色液显色,在仪器中观察。

1.1.4 CCK8细胞活力测定

  • 在96孔板中培养细胞,并转染miRNA-204-5p与Cav-1。设置对照组,

单转染组,多转染组,空白组。每组3个重复。

  • 向96孔板中加入10|iL的CCK8并孵育一小时。
  • 在酶标仪下测定吸光光度。

1.1.5细胞周期和凋亡测定

  • 在6孔板中培养SD大鼠血管平滑肌细胞,并转染miRNA-204-5p与 Cav-1。
  • 按照细胞周期与凋亡试剂盒说明(碧云天)将细胞提取。
  • 分别按照周期试剂与凋亡试剂进行染色。
  • 在流式细胞仪上进行检测。

1.1.6大鼠动脉粥样硬化模型建立与测定

  • SD大鼠来自于辽宁长生生物有限公司,总共12只,分为6只对照组, 6只实验组。
  • 实验组SD大鼠饲喂高脂高胆固醇饲料。对照组饲喂维持饲料。两种饲 料均购自北京博泰宏达公司。
  • 在饮水中加入油脂和丙基硫氧嘧啶,饲喂给实验组。对照组饲喂清水。 (水经过二次蒸馏)
  • 一次性注射60万U的维生素D注射液给实验组,每周一次,维持4周。
  • 饲喂8周,观察大鼠变化,检测血液指标,血管切片,验证模型成功。 2.7血管石蜡切片
  • 将模型大鼠麻醉,用中性甲醛心脏灌流固定,剖出主动脉血管,平铺于 滤纸上将斑块血管以载玻片夹紧,放入4%多聚甲醛中固定12h。
  • 将主动脉修剪后放入包埋盒中并做好标记,50%乙醇浸泡0.5h,70%乙 醇浸泡24h,然后依次在80%,90%,100% A液,100% B液乙醇中浸泡lh。
  • 在_^甲本A和__^甲本B中各浸泡30min后放入石錯缸A,B中各 lh。
  • 石蜡切片机切片,厚度4pm,展片于防脱载玻片上。
  • 将切片放置于65°C烘箱中烤片1.5h。之后放置于二甲苯A和二甲苯 B中各lOmin脱蜡。(可适当延长时间直至切片上无蜡痕)
  • 依次置于 100%A,100%B,90%,80%,70%乙醇中 3min 复水。
  • 苏木素染核5min,流水冲洗lmin,于流水中静置5min。伊红染色 lmin,流水冲洗lmin〇
  • 梯度酒精脱水,二甲苯透明,滴加中性树胶封片。

2实验结果

2.1双荧光素验证

双荧光素酶检测法是通过细胞内转录因子与目的基因相互结合,引发荧光 反应来鉴定转录因子是否打靶基因的方法。当目的基因突变后,转录因子不能 与之结合,其荧光反应将会变弱(图2.4 A,B)。将Cav-1荧光素酶报告载体 的顺式结构突变后,miR-204-5p对Cav-1的抑制效应变弱。证明miR-204-5p是 通过靶向Cav-1特异序列来实现对其抑制效应(图2.4 C)。

51 ..GCGAUGAGGUUAUAGAMGGGAA... CAV1 31 UTR

111 It! II I I

3' UCCGUAUCCUACUG-UUUCCCUU mo-miR-204-5p353-360

图2.4双荧光素酶验证 Fig. 2.4 Validation of double luciferase 注:(A)Cav-l-3 ’ -UTR中可能的靶点定位在353-360。(B) 293T细胞共转染含有大鼠 Cav-1基因3’-UTR的荧光素酶报告载体和miR-204-5p mimics或miRNC。(C)转染24 h后

进行荧光素酶检测。

2.2 miR-204-5p模拟物减少Cav-1的表达

用实时定量PCR的方式,将转染miR-204-5p mimics或inhibitor的大鼠平 滑肌细胞进行mRNA水平的检测,可以发现,转染了 miR-204-5pmimics的细 胞miR-204-5p的表达量上升,Cav-1的表达量下降。而转染了 miR-204-5p inhibitor的细胞miR-204-5p的表达量下降,Cav-1的表达量上升。miR-204-5p的表达量是通过回型引物进行测定(图2.5A,B)。WesternBlot是鉴定蛋白表 达的常用方法,通过对条带灰度值的测定可以对蛋白的表达进行相对定量比较。 将转染miR-204-5p mimics和inhibitor的细胞提取全蛋白,并用WB方式进行
蛋白检测,结果表明,转染miR-204-5pmimics的细胞Cav-1的表达量下降,转 染 miR-204-5p inhibitor 的细胞 Cav-1 表达量升高(图 2.5 C,D)。Cav-1 是调

节多种细胞信号通路的上游蛋白,Cav-1的下游蛋白中,调控增殖的信号通路 蛋白PI3K/Akt,以及调控凋亡的蛋白P38在VSMC的增殖和凋亡调控上有着重 要的作用。PI3K蛋白是促进细胞增殖的蛋白之一,激活PI3K使其磷酸化会促 进细胞的增殖。Akt的表达升高会减缓细胞的增殖,同时受到PI3K的调控。P38 是丝裂原激酶的一种,会促进细胞的凋亡。通过WB检测上述蛋白,结果表明, 转染了 miR-204-5p mimics的细胞中,PI3K的磷酸化水平升高,P38蛋白水平 无显著变化,而Akt的表达水平降低(图2.6 A),证明miR-204-5p可能革巴向 Cav-1促进细胞增殖信号通路,促进细胞增殖。转染了 miR-204-5p inhibitor的 细胞中,PI3K的磷酸化水平降低,Akt的表达上升,P38的表达水平下降(图 2.6 B),证明 miR-204-5p inhibitor 减少 miR-204-5p 对 Cav-1 的抑制使细胞增殖 信号通路蛋白受到抑制,抑制了细胞增殖。

注:(A-D)过表达miR-204-5p后miR-204-5p mRNA表达水平上升,Cav-1表达水平下 降。转染miR-204-5pinhibitor后,得到相反的结果。GAPDH

图2.6 miR-204-5p对Cav-1相关蛋白的影响 Fig. 2.6 Effect of miR-204-5p on Cav-1 related proteins 注:Western blot 检测转染 miR-204-5pNC、mimic、InNC 或 inhibitor 24 h 后 VSMCs 中蛋白表达情况。(A)在转染miR-204-5p mimics组中,P38/MAPK的表达未发生明显变化, PPI3K表达水平升高而Akt表达抑制。(B)在转染miR-204-5p inhibitor组中,PPI3K表达 水平降低,P38表达水平受到抑制,Akt的表达显著上升。

2.3 miR-204-5p对大鼠血管平滑肌细胞的增殖活性的影响

CCK8优于MTT的地方在于不必重新溶解有色结晶,避免了重复性差,以 及容易出现误差等缺陷。在转染miR-204-5p mimics后,通过定时测定VSMC 的OD值,得到其增殖活性的变化。结果表明,在转染miR-204-5pmimics24 小时后,实验组的细胞增殖活性明显高于对照组(图2.7 A)。在转染miR-204-5p inhibitor 48小时后,实验组的细胞增殖活性明显低于对照组(图2.7 B)。说明miR-204-5p mimics遗够促进细胞的增殖活性,的增殖活性降低。.5 miR-204-5p影响大鼠血管平滑肌细胞的凋亡

细胞凋亡分为两个阶段,凋亡准备阶段的早期凋亡,和凋亡裂解的晚期凋 亡。通过流式细胞仪的分选,可以将早期凋亡细胞,晚期凋亡细胞与正常细胞 进行分类,并通过PI/FITC-A标记进行观察。结果表明,转染miR-204-5p mimics
的细胞在细胞凋亡上并没有显著的变化,细胞并未因miR-204-5p的转染而受到 物理性的凋亡影响,miR-204-5p mimics并不会显著影响细胞的凋亡(图2.9 A)。 在转染了 miR-204-5p inhibitor的细胞中,发现其早期凋亡细胞显著上升,这和 之前P38蛋白水平变化促进凋亡的现象相吻合(图2.9 B)。

对细胞的凋亡没有显著影响。(B)抑制组的细胞早期凋亡显著升高,晚期凋亡降低,使 细胞维持早期凋亡表型。 2.6大鼠模型的建立

制作大鼠动脉粥样硬化模型,常用的方法有物理损伤法,化学处理法,以 及饲料饲喂法。其中物理损伤法以及化学处理虽然造模速度最快,但并不能反 映人类疾病的发生发展过程,而且对实验动物的损伤也是最大的。饲料饲喂法 制作的大鼠动脉粥样硬化模型能够充分反映人类病程的发展过程,并且对实验 动物的损伤最小,同时,对于外周血的测量以及体重指标的实时监测也有益处。 缺点是周期较长。饲料饲喂法采用高糖高脂饲料,搭配添加丙基硫氧嘧啶的双 蒸水共同饲喂的方式,并在造模过程中向实验动物体内注射定量的VD3。大鼠 在造模成功后体内各个组织中Cav-1和miR-204-5p的表达量检测(图2.10)。 测量外周血指标,并参照国际动脉粥样样硬化血液参数进行对照,结果表明,
模型大鼠与对照组大鼠相比,血液中总胆固醇含量显著上升,HDL含量显著下 降,LDL含量显著上升。通过计算,模型大鼠的血液AS指标为15远远高于标 准规定的正常值4。从外周血结果分析,大鼠模型造模成功(图2.11 A)。同 时,在培养的8周中,对大鼠的体重进行检测,可以发现,在成模过程中,模 型鼠的体重渐渐低于对照组,并在成模时显著低于对照组(图2.11 B)。虽然 体重变低,但通过解剖灌流后发现,模型组大鼠的脏器呈现明显的脂肪堆积, 肝脏呈现脂肪肝病变,并在腹腔中有大量的游离脂肪。而对照组虽然体重高, 但脏器均正常。通过对血管进行染色,发现模型组的斑块面积远大于对照组(图 2.11 C)。

图2.10大鼠体内各组织器官miR-204-5p和Cav-1的表达分布 Fig. 2.10 Expression and distribution of miR-204-5p and Cav-1 in rat tissues and organs 注:SD大鼠组织中Cav-1基因和miR-204-5p表达的分析。(A) Cav-1和miR-204-5p

在体内不同组织中表达。(B)血管中miR-204-5p表达高于心脏。2.7大鼠动脉粥样硬化切片观察

为了观察大鼠模型平滑肌层的病变,制作大鼠血管的石蜡切片以及HE染 色。从切片结果可以发现,模型组大鼠的平滑肌细胞异常增殖并向内膜层大量 迀移。内皮柱状细胞排列紊乱,平滑肌细胞大量堆积(图2.12 A)。实验将斑 块血管的内外膜剥离,取出其平滑肌层,并用实时定量PCR以及WB的方法测 定其中Cav-1与miR-204-5p的表达,发现大鼠平滑肌层细胞的Cav-1表达降低, miR-204-5p的表达水平升高(图2.12 B,C)。但是否通过靶基因Cav-1影响 血管平滑肌的相关功能及其参与的信号调控网络仍有待进一步的研究。

3讨论

本研究提供了 miR-204-5p通过靶向Cav-1调控大鼠VSMC增殖、细胞周 期进展和凋亡的证据,并提供了其潜在机制的信息。miRNAs在病理过程中尤 其是在CVD中的重要性已经被发现。miRNA在垂体中以组织特异性和时间依 赖性的方式发挥作用。之前报道说明,已经证明miR-124过表达通过直接靶向 PK15细胞中的Cav-1降低小凹结构的密度。许多miRNA参与了与细胞增殖相 关的信号转导信号通路。miR-204被报道在多种人类癌症中具有抑癌作用%_89]。 最近的研究表明miR-204-5p可以抑制人乳头状甲状腺癌和胃癌细胞的增殖[9Q91]。这些结果提示miR-204-5p对细胞增殖具有调控作用。然而,在VSMCs中, miR-204-5p与Cav-1之间没有发现相关性。据我们所知,这是首次系统研究 miR-204-5p与VSMCs中Cav-1的关系。通过基于生物信息学的分析和荧光素 酶分析,确定了 Cav-1是miR-204-5p在大鼠VSMCs中的直接靶点。

Cav-1被认为是肿瘤疾病,尤其是腺癌疾病的一个重要决定因素[92,93]。它 也被认为是内皮细胞中参与动脉粥样硬化斑块形成的重要标记蛋白之一[94]。先 前的研究表明,ApoE-/-小鼠中缺乏Cav-1导致动脉粥样硬化病变形成减少。 因此,这种细胞类型的Cav-1表达可能是促动脉粥样硬化的然而,在另 一项研究中,FrankP.G.表明,巨噬细胞中Cav-1的缺失可以促进胆固醇醋的积 累,这是细胞内CHOL稳态改变的结果。这一发现提示了巨噬细胞中Cav-1的 抗动脉粥样硬化作用[98]。血管平滑肌细胞转移向内膜,是内膜的形成和扩散的 关键。与血小板源生长因子(PDGF),血管紧张素ii(AngII)TGF-(3[99],和酪氨酸 激酶FGF活性相关,为VSMCs形成动脉粥样硬化斑块的机制提供了证据[1QQ1Q1]。有报道称,一氧化碳(CO)是一种细胞增殖抑制因子。一项研究发现,CO 暴露显著增加平滑肌细胞中Cav-1的表达,降低细胞增殖。转染Cav-1 SiRNA 后,抑制了 Cav-1的表达,抑制了 CO的作用[1Q2]。综上所述,这些数据表明, Cav-1在参与动脉粥样硬化发展的不同细胞类型中具有不同的功能,而在人和 小鼠的VSMCs中,缺乏Cav-1促进细胞增殖[_。本研宄通过转染miR-204-5p mimics和miR-204-5p inhibitor,分别建立miR-204-5p过表达和下调,并检测 miR-204-5p和Cav-1的表达水平。在大鼠模型中,我们发现miR-204-5p表达量 升高而Cav-1的表达量下降,而它们之间的关系还需要在动物模型中进行进一 步验证。

在信号通路蛋白的表达上,肿瘤抑制基因PTEN编码的产物可导致PIP3在 D3去磷酸化生成PIP2,从而引起PI3K/Akt信号通路的负调控,抑制细胞增殖, 促进细胞凋亡[1Q41Q5]。本实验中,miR-204-5p激活PI3K/Akt信号通路,促进 VSMC 增殖。相比之下,miR-204-5p inhibitor 抑制了 PI3K/Akt。P38 丝裂原活 化蛋白激酶(P38/MAPK)与细胞凋亡和细胞周期密切相关,这种调控反应最初是 由于与应激反应和钙离子通道有关而被发现的,并在多种肿瘤中被发现[1%1()7]。 然而,在本实验中,P38的表达并没有发生明显的变化,因此miR-204-5p靶向 Cav-1的具体调控彳g号通路和机制,大鼠彳吴型中相关指标的变化等还有待进一 步探索。

4小结

  • miR-204-5p靶向大鼠VSMCs中的Cav-1,增加分裂期细胞,促进 PPI3K/PI3K的表达,促进细胞增殖。
  • 成功建立了大鼠动脉粥样硬化模型。

 

结 论

Cav-1抑制SD大鼠平滑肌细胞的增殖。 miR-204-5p 靶向 SD 大鼠 VSMC 中的 Cav-1。

miR-204-5p降低Cav-1蛋白的表达、VSMC增殖活性、调节细胞周期

与凋亡。

miR-204-5p促进增殖信号通路蛋白PPI3K/PI3K的表达。

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