基于脂质组学方法的哮喘脂质生物标志物筛选论文

2020年2月20日19:27:52基于脂质组学方法的哮喘脂质生物标志物筛选论文已关闭评论
基于脂质组学方法的哮喘脂质生物标志物筛选论文
摘要
研究背景:
哮喘是一种严重危害人类健康的慢性气道炎症疾病,其患病率呈逐年增长 的趋势。大部分哮喘患者通过标准化药物治疗可以达到临床症状的控制,但是部 分重症哮喘患者即使在积极药物治疗的情况下,症状控制仍不理想。基于表型的 个体化治疗是哮喘治疗的新方向,识别特定表型的特征将有助于哮喘的预后评 估,且可能有助于个体化治疗方案的选择。但由于哮喘的异质性,一种表型并不 能解释所有患者,其治疗并不能使所有哮喘患者获益。生物标志物可以提供有关 疾病诊断、预后评估、表型及治疗反应等信息。因此,需进一步研究来发现更多 的生物标志物,通过使用合适的生物标志物进行哮喘表型分层,有助于哮喘药物 的研发和指导治疗。
研究发现,脂质代谢可能参与哮喘的发病机制。脂质是生物膜的基本组成部 分,也是机体的代谢产物,在细胞能量储存、组成结构和信号传导中起关键作用。 通过脂质组学分析,可以发现机体疾病状态下异常表达的脂质,可用于疾病生物 标志物及发病机制的研究。因此,可以研究哮喘潜在的脂质生物标志物,可能用 于寻找新的治疗靶点及指导哮喘的个体化治疗。
目的:
本研究通过超高效液相色谱-电喷雾-质谱(ultra high performance liquid
chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry,UHPLC-ESI-MS)的方法
对哮喘患者的血浆进行脂质分析,筛选哮喘的潜在脂质生物标志物。
方法:
1、 研究对象的收集以2018年7月至2018年12月于郑州大学第一附属呼 吸内科门诊确诊的35例哮喘患者(哮喘组)以及32例健康对照者(对照组)为 研究对象,采集所有研究对象的血液并分离血浆用以分析,收集年龄、性别、体 重指数(body mass index, BMI)等基本信息。
2、 血楽丙二醛的检测基于丙二醛(malonaldehyde, MDA)和硫代巴比妥酸 反应可以产生红色产物的显色反应,对两组血浆MDA进行定量检测。
3、 血浆脂质组学分析通过UHPLC-ESI-MS的方法进行血浆脂质分析,采 用LipidSearchsoftwareversion4.1软件进行峰识别、脂质鉴定、定量等处理,对 提取得到的数据进行总峰面积归一化。应用Simca-P14.1软件对经Pareto-caling 预处理后的数据进行多变量统计分析及单变量统计分析,多变量统计分析包括 主成分分析、偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminantanalysis, PLS- DA)、正交-偏最小二乘判别分析(orthogonal-partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA),单变量统计分析包括T检验、变异倍数分析,R软件绘制 热图。
4、 显著性差异脂质的筛选选择同时满足OPLS-DA模型得到的变量投影重 要性(variableimportancefortheprojection,VIP) >1 及尸<0.05 的脂质作为具有 显著性差异的脂质。对显著性差异的脂质进行相关性分析,用SPSS21.0软件绘 制显著性差异脂质的受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲
线,应用Z检验对ROC曲线下面积进行比较。正态分布的计量资料用I ±s表示, 应用〖检验进行比较。P<0.05差异具有统计学意义。
结果:
1、 哮喘组和对照组的年龄、性别、BMI差异均无统计学意义(P>0.05)。
2、 哮喘组血浆MDA含量为(7.75±1.83) pM,高于对照组的(5.28±1.94) |iM,差异具有统计学意义(P<0.05)。
3、 PLS-DA模型和OPLS-DA模型可以区分哮喘组和对照组血浆样本,模型
未发生过拟合。
4、 哮喘组和对照组血浆中共检测到1338种脂质,分别为711种甘油磷脂、 350种鞘脂、233种甘油酯、20种脂肪酸、13种留醇脂、9种糖脂、2种孕烯醇 酮脂。
5、 哮喘组和对照组血浆中具有16种显著性差异的脂质,分别为 PC(18:lp/18:2)> PC(16:0/18:1), PC(18:0/22:5), PC(18:0e/20:4), PC(18:lp/20:3), PC(40:4), PC(32:1), PC(18:l/22:5), PC(18:0/20:3), SM(d20:0/18:2), PS(39:0), SM(dl8:l/18:l), SM(dl8:0/18:l), SM(d22:l/18:l), PE(18:1/18:2), PS(18:0/20:4), 和对照组相比,哮喘组除PE(18:1/18:2)、PS(18:0/20:4)水平下调外,其余14种显 著性差异脂质水平均上调。
6、 显著性差异脂质的相关性分析显示鞘磷脂(SM)和磷脂酰胆碱(PC)之 间呈正相关性。
7、 在14种上调的显著性差异的脂质中,PC(18:lp/18:2)、PC(16:0/18:1)、 PC(18:0/22:5). PC(18:0e/20:4), PC(18:lp/20:3), PC(40:4), PC(32:1), PC(18:l/22:5) 的 ROC 曲线下面积分别为 0.687、0.685、0.677、0.676、0.675、0.664、0.655、
0. 641,差异具有统计学意义(P<0.05)。
结论:
1. 哮喘患者存在脂质代谢紊乱,以甘油磷脂和鞘磷脂代谢改变为主。
2. 血浆中 PC(18:lp/18:2)、PC(16:0/18:1)、PC(18:0/22:5)、PC(18:0e/20:4)、 PC(18:lp/20:3)、PC(40:4)、PC(32:1)、PC(18:l/22:5)可能成为哮喘的潜在脂质生物
标志物。
关键词:哮喘,脂质,脂质组学,生物标志物
Screening of asthma lipid biomarkers based on lipidomics
Postgraduate: MengYang Supervisor: Prof. Zhe Cheng Respiratory internal medicine
Henan Zhengzhou 450052
Abstract
Background :
Asthma is a chronic airway inflammatory disease that seriously endangers human health, and its prevalence is increasing year by year. Most asthma patients can achieve clinical symptoms control through standardized drug treatment, but some severe asthma patients are still not ideal for symptom control even under active drug treatment. Phenotypic-based individualized therapy is a new direction in the treatment of asthma. Identifying the characteristics of a particular phenotype will contribute to the prognosis assessment of asthma and may contribute to the choice of individualized treatment options. But due to the heterogeneity of asthma, the phenotype does not explain all patients, and treatment does not benefit all asthma patients. Biomarkers can provide information about disease diagnosis, prognosis assessment, phenotype, and treatment response. Therefore, further research is needed to find more biomarkers, and the use of appropriate biomarkers for anatomical phenotype of asthma can contribute to the development and guidance of asthma drugs.
Studies have found that lipid metabolism may be involved in the pathogenesis of asthma. Lipids are a basic component of biofilms and a metabolite of the body, playing a key role in cellular energy storage, composition and signaling. Through lipidomics analysis, lipids that are abnormally expressed in the body?s disease state can be found, which can be used for the study of disease biomarkers and pathogenesis. Therefore, we can study the potential lipid biomarkers of asthma, which may be used to find new
therapeutic targets and to guide individualized treatment of asthma.
Objectives :
In this study, ultra high performance liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry (UHPLC-ESI-MS) method was used to analyze the lipids of asthma patients and the purpose is to find potential lipid biomarkers for asthma.
Methods :
1. Collection of subjects 35 asthma patients (asthma group) and 32 healthy subjects (control group) diagnosed in the First Affiliated Respiratory Medicine Department of Zhengzhou University from July 2018 to December 2018 were included in the study. We collected blood from all subjects and separate plasma for analysis and collected basic information such as age, sex, and body mass index.
2. Detection of plasma malondialdehyde Based on the reaction of MDA and thiobarbituric acid, which the color reaction of the red product can be produced, the MDA in the plasma of the two groups was quantitatively detected.
3. Plasma lipidomics analysis Plasma lipid analysis was performed by UHPLC-ESI-MS method, and peak identification, lipid identification, and quantification were performed using LipidSearch software version 4.1 software, and the total peak area was normalized to the extracted data. Multivariate statistical analysis and univariate statistical analysis were performed on the preprocessed date by Pareto- caling using Simca-P14.1 software. Multivariate statistical analysis include principal component analysis and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA), orthogonal-partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA), univariate statistical analysis include T test, fold change analysis, R software was used to draw heat map.
4. Screening of significant differential lipids Lipids satisfying both the variable importance for the projection (VIP)>1 and P < 0.05 were selected as lipids with significant differences. The receiver operating characteristic (ROC) curves of significant differential lipids were plotted using SPSS 21.0 software, and the areas under the ROC curves were compared using the Z test. The measured data of the normal distribution is expressed by x士s and compared by,test. P < 0.05 difference was statistically significant.
Results :
1. There are no significant difference in age, gender and BMI between asthmatic group and control group (P>0.05).
2. The plasma MDA content in the asthma group is (7.75士 1.83) |uM, which is higher than that in the control group (5.28士 1.94) |tiM, and the difference is statistically significant (P<0.05).
3. The PLS-DA model and the OPLS-DA model can distinguish plasma samples between the asthma group and the control group, and the models have not been fitted.
4. 1311 lipids are detected in the asthma group and the control group, which are 711 glycerophospholipids, 350 sphingolipids, 233 glycerides, 20 fatty acyl groups, 13 sterols, 9 glycolipids, 2 pregnenol ketone fat.
5. There are 16 significant differential lipids in plasma between the asthma group and the control group, which are PC (18:lp/18:2), PC (16:0/18:1), and PC (18:0/22:5), PC (18:0e/20:4)? PC (18:lp/20:3)? PC (40:4), PC (32:1), PC (18:1/22:5), PC (18:0/20:3), SM (d20:0/18:2), PS (39:0), SM (dl8:l/18:l)? SM (dl8:0/18:l)? SM (d22:l/18:l)? PE (18:1/18:2), PS (18:0/20:4). Compared with the control group, except for PE (18:1/18:2) and PS (18:0/20:4), the other 14 significant differential lipids in the asthma group are up-regulated.
6. Correlation analysis of significant differential lipids show a positive correlation between sphingomyelin (SM) and phosphatidylcholine (PC).
7. Among the 14 up-regulated significant differential lipids, the areas under the ROC curves of PC(18:lp/18:2)、PC(16:0/18:1)、PC(18:0/22:5)、PC(18:0e/20:4)、 PC(18:lp/20:3)、PC(40:4)、PC(32:1)、PC(18:l/22:5) are 0.687,0.685, 0.677,0.676,
0. 675, 0.664, 0.655, 0.641, respectively. And the difference are statistically significant (P <0.05).
Conclusions :
1. Asthma patients have lipid metabolism disorders, with mainly changes in the metabolism of glycerophospholipids and sphingomyelin.
2. PC (18:lp/18:2)? PC (16:0/18:1), PC (18:0/22:5), PC (18:0e/20:4)? PC (18: lp/20:3), PC (40:4), PC (32:1), and PC (18:1/22:5) may be potential lipid biomarkers of asthma.
Key words: asthma; lipid; lipidomics; biomarkers
1前言
哮喘是由气道上皮细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种细胞以及细胞组分 参与的慢性气道炎症性疾病,以气道炎症、气道高反应性、气道重塑为特点[1]。 目前,全球至少有3亿哮喘患者,其中,中国哮喘患者约3000万M。近年来,哮喘 患病率呈逐年增长的趋势,已成为严重危害人类健康的慢性气道炎症疾病之一, 其反复发作可导致慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺源性心脏病等,严重影响 患者的生活质量,造成沉重的社会负担。
哮喘是一种异质性疾病,并不具有相同的临床病程和治疗反应。糖皮质激素、 P 2-受体激动剂、白三烯调节剂是哮喘的常用药物[3],大部分哮喘患者通过糖皮 质激素、P2-受体激动剂等标准化药物治疗后可以达到临床症状的控制,但是部 分重症哮喘患者即使在积极药物治疗的情况下,哮喘症状控制仍不理想。基于表 型的个体化治疗是哮喘治疗的新方向。虽然目前还没有被广泛接受的特定哮喘 表型的定义,但识别特定表型的特征将有助于哮喘的预后评估,且可能有助于个 体化治疗方案的选择。生物标志物可以提供有关疾病诊断、预后评估、表型及治 疗反应等信息。外周血嗜酸性粒细胞、呼出气一氧化氮等作为评估哮喘气道炎症 及控制水平的指标t4, A有助于预测嗜酸性粒细胞或Th2细胞参与的过敏反应的 哮喘患者对激素治疗或者革E向治疗(如抗IL-5)的反应性,但其相关治疗不能使 所有哮喘患者获益,因为并不是所有哮喘都是嗜酸性粒细胞或Th2相关性哮喘。 因此,需要进一步研究来发现更多的生物标志物,通过使用合适的生物标志物进 行哮喘表型分层,有助于哮喘药物的研发和指导治疗。研究生物标志物定义的哮 喘表型,可以寻找新的治疗靶点,为不同表型哮喘患者选择最合适的个体化治疗 方案。
代谢组学的概念是Nicholson等在20世纪90年代提出来的,是继基因组 学、转录组学、蛋白组学后的新的分析诊断技术。代谢组学是对包括碳水化合物、 氨基酸、有机酸、核苷酸和脂类在内的小分子进行系统的分析,可用于疾病生物 标志物以及致病途径的研究[6,7]。与基因组学、蛋白质组学相比,代谢组学与机 体的生理联系更加紧密。疾病导致机体的病理生理过程变化,最终引起机体的代 谢产物发生相应的改变。使用代谢组学发现生物标志物是极具前景的,现己用于 多种疾病的生物标志物及发病机制的研究,如心血管疾病[8]、风湿炎症性疾病[9]、 多囊卵巢综合征[1Q]。代谢组学具有将遗传因素、环境因素与特定病理状态联系起 来的巨大潜力[11],而哮喘是受到环境和遗传双重影响的复杂疾病[12,13]。因此,研 究哮喘的代谢谱有助于进一步阐明哮喘的发病机制[13]。
脂质组学是代谢组学的一个重要分支,是对机体的脂质系统进行综合的分 析,可以用于发现疾病的生物标志物、疾病的诊断和理解疾病的病理生理过程[14_ 16]。脂质是生物膜的基本组成部分,也是生物体的代谢产物,在细胞能量储存、 组成结构和信号传导中起关键作用t1'根据其结构,脂质可以分为八大类:甘油 磷脂、鞘脂、脂肪酸、甘油酯、留醇脂、孕烯醇酮脂、糖脂、聚酮。脂质代谢对 许多疾病,如阿尔茨海默病[18]、心血管疾病[19]、癌症[2(),21]、慢性阻塞性肺疾病[22] 都有很大的影响。亦有研究发现,脂质代谢可能和哮喘参与哮喘的发病过程。对 哮喘小鼠的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)进行代谢分 析发现,BALF中鞘磷脂(dl8:l/24:l)含量增加,并且其水平随着哮喘的严重程 度的增加而增加[23]。赵蕴伟等[24]亦发现哮喘急性发作期血中1-磷酸-鞘氨醇 (sphingosine 1-phosphate, S1P)水平随着哮喘严重程度的增加而逐渐升高,表明 S1P可以作为一项评估哮喘严重程度的指标。有研究发现,S1P可以增加哮喘小 鼠的气道高反应,加重炎性反应[25]。以上研究结果表明,脂质代谢可能参与哮喘 的发病过程。因此,探索脂质代谢在哮喘中的作用机制,寻找潜在的脂质生物标 志物,更好的了解哮喘表型,为找到哮喘治疗的新靶点提供希望。
目前,应用于代谢组学分析的技术多为核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和质谱(massspectrometry,MS)。NMR和MS是代谢组学中使用的两种主 要的分析平台[26],后者与其它技术连用克服MS的局限性,如液相色谱-质谱联 用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS )、气相色谱-质谱联用(gas- chromatography-mass spectrometry, GC-MS) [27,28]、NMR 法的样本预处理相对比 较简单,需要较少的样本量,并需要相对较短的分析时间,使其成为一种强大的 高通量技术,能够快速分析大量样本[29],但其灵敏度、分辨率较低,无法测量低 丰度代谢物。与NMR相比,质谱有高特异性和灵敏度,同时与色谱的联用可以 显著弥补MS的不足之处,而UHPLC-ESI-MS比普通的LC-MS分离度更高,可 以更有效的寻找有差异的代谢产物。
因此,本研究通过UHPLC-ESI-MS的组学方法进行脂质分析,研究哮喘患 者和健康对照者之间血浆脂质代谢产物的差异,筛选哮喘潜在的脂质生物标志 物,并可能为后续研究脂质代谢在哮喘发病中的作用提供一定的基础。
2对象和方法
2.1主要试剂
甲酸铵 Sigma
甲醇 Thermo Fisher
乙腈 Thermo Fisher
异丙醇 Thermo Fisher
MTBE 沃凯
DdH2〇 Arium mini
磷酸缓冲盐盐溶液 Hyclone
脂质氧化(MDA)检测试剂盒 碧云天
2.2主要仪器
Q Exactive plus 质谱仪
UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱仪器
色谱柱
低温高速离心机 混匀仪
纯水仪 Sartorius
酶标仪 Tecan
Thermo Scientific™ Carefusion
2.3研究对象
选取2018年7月至2018年12月郑州大学第一附属呼吸内科门诊确诊的35 例支气管哮喘患者(哮喘组)为研究对象,并以同时段32例健康体检者为对照 组。本实验通过郑州大学第一附属医院伦理委员会批准,所有参与者均签署知情 同意书。
支气管哮喘患者的纳入标准:(1)哮喘的诊断符合2018 GINA全球哮喘处 理和预防策略的诊断标准[1]; (2)年龄18-75岁,性别不限;(3)近4周无感染 史;(4)无其他肺部疾病,无心脏、肝肾、颅脑等其他系统疾病;(5)未使用调 脂药物;(6)可以配合肺功能检查,依从性良好;(7)自愿参加并签署知情同意 书。
排除标准:(1)近4周有感染史;(2)合并其它肺部疾病;(3)合并心脏、 肝肾、颅脑等其他系统疾病;(4)使用调脂药物;(5)不能配合肺功能检查;(6) 孕妇及哺乳期妇女。
健康对照组纳入标准:(1)年龄18-75岁,性别不限;(2)无哮喘病史,无 心脏、肝肾、颅脑等其他系统疾病;(3)无过敏性疾病病史;(4)近4周无感染 史;(5)未使用调脂药物;(6)肺功能、肝肾功能均正常;(7)自愿参加并签署 知情同意书。
2.4资料采集及标本处理
对纳入的研究对象进行全面的资料采集,包括姓名、性别、年龄、职业、身 高、体重、症状体征、病程、家族史、过敏性鼻炎史等信息,记录第1秒用力呼 气量(forced expiratory volume in one second, FEV1)、用力肺活量、FEV1 占预计
值的百分比、呼气流量峰值等肺功能指标。
所有研究对象均在空腹的条件下采集外周静脉血约5mL,保存于含有乙二 胺四乙酸的抗凝采血管中,轻轻上下颠倒数次,然后将抗凝管立即插入冰中或转 入4°C冰箱。在lh之内处理血液标本。在离心机中以1500 r/min,4°C的条件下 水平离心lOmin,用移液枪吸取上层淡黄色血浆至1.5mL冻存管中,置于液氮速冻。
2.5血浆丙二醛的检测
基于丙二醛(malonaldehyde, MDA)和硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)
反应可以产生红色产物的显色反应,对哮喘组和对照组血浆中的MDA进行定量
检测。 2.5.1配置试剂
(1) 标准品的配置将标准品在稀释前进行震荡混匀。稀释比例按表1的配 置方法进行,稀释待用。标准品用样品稀释液稀释后,静置lOmin以上,反复搓 动帮助其溶解。
表1标准品配置方法
标准品号 标准品浓度 配置方法
1号标准品 50JLIM 原始浓度10 |iL标准品加入190|iL蒸馏水
2号标准品 20JLIM IOOJIL的1号标准品加入150|iL蒸馏水(弃去50|iL)
3号标准品 IOJLIM 100|iL的2号标本品加入100(iL蒸馏水
4号标准品 5JLIM IOOJIL的3号标本品加入IOOJIL蒸馏水
5号标准品 2|LIM 100|iL的4号标本品加入150|iL蒸馏水(弃去50|iL)
6号标准品 IJLIM 100|iL的号标本品加入IOOJIL蒸馏水
(2)TBA存储液的配置:1.48mgTBA+4000|iL的TBA配置液。TBA配制 液加热到70°C以促进溶解,完全溶解后再使用。室温避光保存。
(3) MDA检测工作液的配置:根据需测定的样品数量,按说明书在临检测 前配制新鲜适量的MDA检测工作液。MDA检测工作液配置如下:12mLTBA 稀释液+4000|iLTBA储存液+240|iL抗氧化剂。MDA检测工作液加热到70°C以 促进溶解,完全溶解后再使用,当天使用。
2.5.2试验步骤
(1) 将血浆从-80°C冰箱取出,冻融,备用。
(2) 标记73个小的玻璃试管,分别为空白对照组、标准品组、样品组。
(3) 将处理后的样品按照下列表2的操作表加样。
表2样品加样方法
空白对照标准品样品
PBS 0.1 mL - -
标准品 - O.lmL -
待测样品 - - O.lmL
MDA检测工作液 0.2mL 0.2mL 0.2m
(4) 混匀后,沸水浴加热15min。加热时避免液体暴沸派出。
(5) 水浴冷却至室温,lOOOr/min室温离心lOmin。取200叫上清加入到
96孔板中,随后用酶标仪在532nm测定吸光度。
(6) 测定:用酶标仪时,以空白孔调零,532nm波长处依次测量各个孔的 吸光度。依据标准品浓度以及对应的吸光度计算出标准曲线的直线回归方程,然 后再根据样品的吸光度计算样品的相应浓度。
2.6血浆脂质组学分析 2.6.1样品制备
(1) 质控样本(quality control, QC)的制备:分别取等量的各组样本混合为 QC样本,用于本实验的系统稳定性及本实验所用仪器状态的评价,同时用来平
衡色谱-质谱系统。
(2) 样品的预处理:取样本100叫,加水200叫,涡旋混合,加入240叫 预冷的甲醇,涡旋混合后加入800pLMTBE,涡旋混合,低温水浴中超声 20min,室温方文置30min,在离心机中以14000gl0°C的条件下离心15min,取 上层有机相,吹干氮气,质谱分析时加入200pL 90%异丙醇/乙腈溶液复溶,涡 旋,在离心机中以14000gl0°C的条件下离心15min,然后取样品的上清进样 分析。QC样本和剩余的待测样本分别进行UHPLC-ESI-MS检测。
2.6.2色谱条件
样品采用UHPLC Nexera LC-30A超高效液相色谱系统,使用ACQUITY UPLCCSHC18,1.7pm (2.1mmxl〇〇mm)的色谱柱进行分离。色谱柱的柱温 为45°C;流速300|iL/min;进样量3|iL。流动相组成A: 10 mM甲酸铵乙腈水 溶液(乙腈:水=6:4,v/v),B:10mM甲酸铵乙腈异丙醇溶液(乙腈:异丙醇=1:9, v/v)。梯度洗脱程序如下:0-2 min, B维持在30%; 2-25 min,B从30%线性 变化至100%; 25-35min,B维持在30%。整个分析过程中样品置于10°C自动 进样器中。采用随机的顺序对样本进行连续的分析,其目的是为了避免因仪器 检测信号的波动而对实验结果造成影响。
2.6.3质谱条件
分别采用电喷雾电离(electrospray ionisation, ESI)正离子和负离子模式进 行样品的检测。样品经UHPLC分离后采用Q Exactive plus质谱仪(Thermo
Scientific™)进行质谱分析。ESI源条件如下:正离子喷雾电压为3.0 kV,鞘 气45arb,辅助气lOarb,扫描气larb,毛细管温度350°C,MS1扫描范围 200〜1800;负离子喷雾电压为2.50kV,鞘气45arb,辅助气lOarb,扫描气 larb,毛细管温度350°C,MS1扫描范围250〜1800。脂质分子和脂质碎片的质 量电荷比,按照下列方法采集:每次全扫描后采集10个碎片图谱。MS1在M/Z 200时分辨率为70000,MS2在M/Z 200时分辨率为17500。
2.7数据处理及分析
采用LipidSearchsoftwareversion4.1进行峰识别、脂质鉴定、峰提取、峰对 齐、定量等处理。提取得到的数据,删除RSD>30%的脂质分子。
对LipidSearch提取得到的数据,删除组内缺失值>50%的脂质分子,对数 据进行总峰面积归一化。应用Simca-P14.1软件进行模式识别,数据经Pareto- caling预处理后进行多变量统计分析及单变量统计分析,多变量统计分析包括无 监督的主成分分析(principal component analysis, PCA)、有监督的偏最小二乘判 别分析(partial least squares-discriminantanalysis, PLS-DA)和正交-偏最小二乘判 另ll分析(orthogonal-partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA ),单变量 统计分析包括T检验、变异倍数分析(fold change analysis,FC),R软件绘制热 图。采用SPSS21.0软件进行数据处理,绘制显著性差异脂质的受试者工作特征 (receiver operating characteristic, ROC)曲线,应用Z检验对ROC曲线下面积进行 比较。正态分布的计量资料i±s表示,用〖检验进行比较。P<0.05为差异具有 统计学意义。
3结果
3.1 —般资料
根据纳入和排除标准,共纳入哮喘患者35例,年龄18〜72岁;健康对照组 32例,年龄21〜69岁。哮喘组的性别、年龄和BMI与对照组相比,差异均无统 计学意义(P>0.05),见表3。
表3哮喘组和对照组一般资料的比较
对照组哮喘组x2"P
例数3235
性别(男/女) 13/19 14/21 0.003a 0.958
年龄(岁) 39.85土 13.22 39.37±13.40 -0.135 0.893
BMI (kg/m2) 22.75士 3.32 22.57士 3.44 -0.914 0.847
注:a:除性别组间比较统计量为x2值外,其余项目统计量均为H直。
3.2哮喘组和对照组血浆MDA含量的比较
MDA是脂质过氧化产物,是一种常用的脂质过氧化指标。哮喘组(Ast)血 浆MDA的含量为(7.75±1.83) pM,高于对照组(Ctl)的(5.28±1.94) pM,差 异具有统计学意义(P<〇.〇5),见图1。
3.3哮喘组和对照组血浆脂质组学分析
3.3.1试验质量控制
将分析得到的QC样本基峰色谱图(base peak chromatogram, BPC)进行谱
图重叠比较,可以看出各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠,见图2和图
3。图2为样品正离子模式BPC重叠图谱,图3为样品负离子模式BPC重叠
图谱。
本实验将所有试验样本和QC样本提取得到的峰,经Pareto-scaling后进行 无监督的PCA分析,图4为所有试验样本和QC样本的总体样本PCA得分图。 如图4所示,可见QC样本聚集在一起,并位于各组的中间。
结合QC样本BPC图的比较和QC样本与总体样本PCA分析,表明本实验 所用仪器分析系统的稳定性较好,试验数据稳定可靠,重复性较好。由此,本次 实验筛选出的具有差异的脂质可以反映出哮喘组和对照组血浆脂质代谢产物的 差异。
2样品正离子模式BPC重叠图谱
图3样品负离子模式BPC重叠图谱
-60 -40 -20 0 20 40 t[l] 60
图4总体样本的PCA得分图
3.3.2脂质分子多变量统计分析
由于脂质组数据具有多维且某些变量间高度相关的特点,运用传统的单变
量统计分析无法充分准确地挖掘潜在信息,需要运用多变量统计分析的方法对 采集的多维数据进行降维和归类分析。目前常用的多变量统计分析方法有监督 法和非监督法。非监督法常用的为PCA分析,有监督法常用的为PLS-DA分析 和OPLS-DA分析。
3.3.2.1 PCA 分析
PCA分析是将原本鉴定到的脂质按一定的权重通过线性组合后产生新的特 征变量,通过主要新变量(主成分)对各组数据进行归类。因为PCA分析没有 加入任何的人为因素,因此,得到的PCA模型可以很好地反映出实验数据的原 始状态,有利于我们对实验数据的整体情况进行有效的了解,同时可以对实验数 据从整体上进行把握。因此,在数据分析中,一般先采用PCA分析,观察组间 样本的总体分布趋势。
图5为PCA得分图,图中t[l]代表主成分1,t[2]代表主成分2,图中的每 一标注点代表可一个批次的样本。从PCA得分图可以看出,哮喘组和对照组样 本点重叠较多,哮喘组和对照组分离不明显,仅从PCA得分图无法看出两组之 间血浆脂质存在明显的差异。PCA分析为无监督分析的方法,不能忽略组内差 异、消除与研究目的无关的随机误差,不利于发现组间差异和差异化合物,这就 需要通过有监督方法(如PLS-DA、OPLS-DA分析)来解决。因此,接下来我们 对鉴定到的脂质进行了有监督的PLS-DA分析和OPLS-DA分析。
tm3.3.2.2 PLS-DA 分析
与PCA只有一个数据集不同,PLS-DA在分析时会自动加上另外一个隐含 的数据集Y,它在降维的同时结合了回归模型,较PCA能够更高效的提取组间 差异信息。实际中,PLS-DA得分图常被用来直观地展示模型的分类效果,图中 两组样品的分离程度越大,说明模型的分类效果越显著。
为了避免有监督模型在建模过程中发生拟合,采用置换检验对模型进行进 行检验,以保证模型的有效性。评估模型可靠有效的标准为[3()]: (1)所有蓝色的 Q2点从左到右均低于最右的原始的蓝色的Q2点;(2) Q2点的回归线(虚线) 与横坐标交叉或者小于0。当Q2回归直线与Y轴的截距<0.05时,模型不存在 过拟合现象。
图6为哮喘组和对照组的PLS-DA得分图,图中t[l]代表主成分1,t[2]代表 主成分2。由PLS-DA得分图可以看出,PLS-DA模型基本能区分哮喘组和对照 组的血浆样本。图7为哮喘组和对照组PLS-DA模型的置换检验图,Q2回归直 线与Y轴的截距为-0.118,可以看出PLS-DA模型不存在过拟合现象,PLS-DA
模型可靠。
-03 ■ I 1 i ' i ■ i ■ i~
-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8
200 permutations 2 components
图7哮喘组和对照组PLS-DA置换检验图
3.3.2.3 OPLS-DA 分析
OPLS-DA分析是PLS-DA的扩展,可以滤除与分类信息无关的信息,将相 关的信息主要集中在第一个预测成分。图8为哮喘组和对照组的OPLS-DA得分 图,图中t[l]代表主成分1。从图8可以看出,OPLS-DA模型能分哮喘组和对照 组样本。图9为哮喘组和对照组OPLS-DA模型的置换检验图,Q2回归直线与 Y轴的截距为-0.241,可以看出OPLS-DA模型未发生过拟合,OPLS-DA模型可
非〇-15 -10
3.6显著性差异脂质分子的筛选 3.6.1血浆脂质整体分析
对67个血浆样本(哮喘组35个,对照组32个)进行脂质谱检测,总共检 测到1338种脂质,分别为711种甘油磷脂(53.14%)、350种鞘脂(26.16%)、 233种甘油酯(17.41%)、20种脂肪酸(1.50%)、13种甾醇脂(0.97%)、9种糖 脂(0.67%)、2种孕烯醇酮脂(0.15%)。图10为检测到的脂质种类分布图。
■甘油憐脂 ■鞘脂 ■甘油酯 ■脂肪酸 ■甾醇脂 ■糖脂
■孕烯醇酮脂
711种甘油磷脂分别为336种磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines, PCs)、145种 磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamines,PEs)、52种磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositols, Pis)、45 种磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserines, PSs)、9 种心 磷脂(cardiolipins,CLs)、4 种磷脂酰甘油(phosphatidyl glycerols,PGs)、2 种磷脂酸 (phosphatidic acids,PAs)、3 种溶血磷脂酰肌醇(lysophosphatidylinositols, LPIs)、 1种溶血磷脂酰甘油(lysophosphatidylglycerols,LPGs)、1种溶血磷脂酰丝氨酸 (lysophosphatidylserines, LPSs)、33 种溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidyl ethanolamines, LPEs)、80 种溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholines, LPCs)。
350种鞘脂分别为162种鞘磷脂(sphingomyelins,SMs)、15种神经节苷脂 (gangliosides, GM3)、7 种植物鞘氨醇(phytosphingosine,phSM)、3 种鞘氨醇 (sphingosine,So)、1 种硫脂(sulfatide, ST)、120 种神经酰胺(ceramides, Cers)、27 种 CerGl、7 种 CerG2、4 种 CerG3、2 种 CerG2GNAcl、2 种 CerG3GNAcl。
233种甘油酯分别为218种甘油三酯(triglycerides, TGs)、15种甘油二酯 (diacylglycerols, DGs)。
20种脂肪酸分别为3种0-酰基-1-轻基脂肪酸((0-acyl)-1-hydroxy fatty acid, QAHFA)、5 种蜡酉旨(wax exters,WE)、12 种乙酉先肉毒碱(acyl carnitine, AcCa)〇
13种甾醇脂分别为1种谷甾醇酷(sitosterol ester, SiE)、12种胆固醇醋 (cholesteryl esters, chEs)〇
9种糖脂分别为1种二半乳糖二酰基丙三醇(digalactosyldiacylglycerol, DGDG)、4 种半乳糖二酉先基丙三酉享(monogalactosyldiacylglycerol, MGDG)、4 种硫 酸甘油二酯(sulfoquinovosyldiacylglycerol,SQDG)。
2种孕稀醇酮脂为2种辅酶(coenzyme, Co)。
3.6.2显著性差异脂质分子的筛选
根据OPLS-DA模型得到的变量投影重要性(variable importance for the projection, VIP)用来衡量各个脂质的表达模式对各组样本分类判别的影响强度 和解释能力,挖掘具有生物学意义的差异脂质。
在本实验中,我们首先以VIP>1初步筛选出哮喘组和对照组血浆中的差异 脂质,然后采用单变量统计分析用以验证差异脂质是否具有显著性,P<〇.〇5说 明哮喘组和对照组血浆中的脂质具有显著性差异。以同时满足VIP>1和P<0.05 作为哮喘组和对照组之间具有显著性差异脂质的筛选标准。
本实验中,在哮喘组和对照组血浆中检测到16种具有显著性差异的脂质, 详见表4。由表4可以看出,哮喘组和对照组血浆中检测到的16种具有显著性 差异的脂质中,PS(18:0/20:4)和PE(18:1/18:2)的 6)1(1〇1^11§6值分别为0.78、0.74, 其值小于1,其余14种脂质的fold change值均大于1。fold change反应的是两 组间倍数变化的关系,此结果表明,哮喘组和对照组鉴别到的血浆16种具有显 著性差异的脂质中,哮喘组和对照组相比,除PS(18:0/20:4)和PE(18:1/18:2)水平 下调外,其余14种脂质水平均上调。
表4哮喘组和对照组的显著性差异脂质
Lipidlon IonFormula CalMz RT-(min) VIP fold change P
PS(39:0) C45 H87O10N1 PI 832.61 11.94 1.76 1.23 0.040
PS(18:0/20:4) C44 H77O10N1 PI 810.53 11.52 1.45 0.78 0.008
PC(16:0/18:1) C43 H83O10N1 PI 804.58 11.02 1.93 1.21 0.013
PC(18:lp/18:2) C45 H83 09 N1 PI 812.58 10.70 1.77 1.19 0.030
PC(18:lp/20:3) C47 H85 09 N1 PI 838.60 10.75 1.42 1.19 0.016
PC(18:0e/20:4) C47H87 09N1 PI 840.61 11.65 1.26 1.21 0.019
PC(18:0/20:3) C47 H87O10N1 PI 856.61 11.46 2.65 1.28 0.027
PC(18:l/22:5) C49 H85 O10N1 PI 878.60 10.80 2.67 1.29 0.020
PC(18:0/22:5) C49 H87O10N1 PI 880.61 11.42 1.01 1.29 0.024
PC(32:1) C40 H79 08 N1 PI 732.55 10.02 1.08 1.34 0.044
PC(40:4) C48 H89 08 N1 PI 838.63 11.59 1.22 1.35 0.024
PE(18:1/18:2) C41 H75 08 N1 PI 740.52 10.63 2.94 0.74 0.047
SM(dl8:l/18:l) C42 H82 08 N2 PI 773.58 10.03 1.32 1.22 0.021
SM(dl8:0/18:l) C42 H84 08 N2 PI 775.60 10.94 1.88 1.19 0.046
SM(d20:0/18:2) C44 H86 08 N2 PI 801.62 11.09 1.04 1.18 0.049
SM(d22:l/18:l) C46 H90 08 N2 PI 829.64 12.02 2.63 1.17 0.044
注:Lipidlon :脂质分子;IonFormulaC :脂质分子式;alMz:理论质荷比;RT-(min):保 留时间;fold change:变异倍数
3.6.3显著性差异脂质分子的热图
热图表现的是一个数据矩阵,可以通过使用颜色梯度使数据间的差异实现 可视化。图11为显著性差异脂质的热图。红色表示高表达脂质,蓝色表示低表 达脂质,其中,列表示样本,行表示脂质。由图11可以直观的看出,哮喘组血
浆中显著性差异脂质的表达明显高于对照组。
group ■ group
IH 4 H Asthma SM(d18:1/18:1) 3 ■ Control
SM(d18:0/18:1) ^ ^pc
SM(d20:0/18:2) 〇 KPS
w -1 ■ SM
PC(16:0/18:1) |_2 PS(18:0/20:4) PC(18:1p/18:2) SM(d22:1/18:1)
PS(39:0)
PC(18:1p/20:3) PC(18:0e/20:4)
PC(18:0/20:3)
PC(18:1/22:5)
PC(18:0/22:5)
PC(32:1)
PC(40:4)
PE(18:1/18:2)
图ii显著性差异脂质分子的热图
3.6.4显著性差异脂质分子的相关性分析
通过相关性分析可以帮助衡量显著性差异脂质分子之间的相关密切程度, 进一步了解生物状态变化过程中脂质分子之间的相互关系。相关性最高为1,为 完全的正相关;相关性最低为-1,为完全的负相关。当两个脂质的线性关系增强 时,相关系数趋于1或-1。
图12显示了哮喘组和对照血浆显著性差异脂质分子的相关性分析。由图12 可以看出,在16种显著性差异的脂质分子中,SM代谢和PC代谢之间呈正相关 性。除PC(40:4)、PC(32:1)外,SM和其它7种显著性差异PC的相关系数均在
0. 8〜1.0之间,即两者之间呈高度的正相关性。PS(18:0/20:4)除和PE(18:1/18:2) 呈正相关外,与SM及PC之间均呈负相关性,与PS (39:0)亦呈负相关性。
-1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
图12哮喘组和对照组显著性差异脂质的相关性分析
3.6.5潜在脂质生物标志物的筛选
临床中,常应用升高的物质作为预测、诊断疾病等的标志物。在16种显著 性差异的脂质中,PS(18:0/20:4)和PE(18:1/18:2)是下调的,其可能作为哮喘排除 的脂质指标,因此我们从14种上调的脂质中筛选潜在的脂质生物标志物。通过 比较ROC曲线下面积(area under curve,AUC)来评判显著性差异脂质作为哮 喘生物标志物的潜能。表5为14种上调的显著性差异脂质的AUC及95%可信 区间(confidence interals,CI),其中,PC(18:lp/18:2)、PC(16:0/18:l)、PC(18:0/22:5)、 PC(18:0e/20:4),PC(18:lp/20:3),PC(40:4) ,PC(32:1),PC(18:l/22:5),PS(18:0/20:4) 和PE(18:1/18:2)这8种脂质的ROC曲线下面积具有统计学意义(P<0.05),说
明其作为哮喘脂质生物标志物的潜能较其它脂质大,说明可能作为哮喘的潜在
脂质生物标志物。图13为筛选出的8种哮喘潜在脂质生物标志物的ROC曲线。
表5哮喘组和对照组显著性差异脂质的AUC
脂质 AUC 95%CI 直
PC(18:lp/18:2) 0.687 0.556〜0.817 0.009
PC(16:0/18:1) 0.685 0.685〜0.813 0.009
PC(18:0/22:5) 0.677 0.547〜0.806 0.013
PC(18:0e/20:4) 0.676 0.545〜0.806 0.013
PC(18:lp/20:3) 0.675 0.546〜0.804 0.014
PC(40:4) 0.664 0.531 〜0.797 0.021
PC(32:1) 0.655 0.523〜0.788 0.029
PC(18:l/22:5) 0.641 0.509〜0.774 0.047
PC(18:0/20:3) 0.638 0.506〜0.771 0.052
SM(d20:0/18:2) 0.632 0.496〜0.769 0.063
PS(39:0) 0.632 0.499〜0.765 0.063
SM(dl8:l/18:l) 0.628 0.493〜0.763 0.073
SM(dl8:0/18:l) 0.618 0.482〜0.754 0.098
SM(d22:l/18:l) 0.613 0.477〜0.748 0.114
1-灵敏度
图13筛选出的8种潜在脂质生物标志物的ROC曲线
4讨论
由于哮喘具有异质性及不同的表型,部分重症哮喘患者即使经过积极药物 治疗,症状控制仍不理想。基于表型的个体化治疗是哮喘治疗的新方向。识别特 定表型的特征将有助于哮喘的预后评估,且可能有助于个体化治疗方案的选择。 生物标志物可以提供有关疾病诊断、预后评估、表型等信息。因此,需进一步研 究来发现更多的生物标志物,进行哮喘表型分层,有助于哮喘药物的研发和指导 治疗。
研究发现,哮喘患者的体内代谢可以发生变化,且与哮喘的严重程度、控制 水平等有关w,32]。脂质组学是代谢组学的一个重要分支,应用脂质组学发现新的 生物标志物是极具前景的,已用于多种疾病新的生物标志物及发病机制的研究。 本研究通过UHPLC-ESI-MS的方法对哮喘患者及健康对照者的血浆进行脂质代 谢的研究,其目的是筛选哮喘的潜在脂质生物标志物,可能有助于研究哮喘表型, 寻找新的治疗靶点,有助于个体化治疗方案的选择及预后评估。
脂质可以分为八大类:甘油磷脂、鞘脂、脂肪酸、甘油酯、留醇脂、孕烯醇 酮脂、糖脂、聚酮。本研究发现,哮喘患者与健康对照者血浆中16种显著性差 异的脂质分别为12种甘油磷脂和4种鞘脂,以甘油磷脂的差异为主。甘油磷脂 包括PS、PC、PE等,是细胞膜骨架的重要生物分子,是构成细胞膜结构,参与 许多生物调节过程,在多种疾病的发生和发展中发挥作用,例如癌症、动脉粥样 硬化[33_35]。本实验中12种显著性差异的甘油磷脂分别为9种PC、2种PS、1种 PE,其以PC的差异为主。PC是哺乳动物生物膜最丰富的磷脂,约占磷脂的40- 50% jied等[36]研究结果表明,哮喘患者血清中PC水平的增加和哮喘发病相关,
并受哮喘风险等位基因的影响。在我们的实验中,哮喘患者和健康对照者血装中 差异脂质以PC为主,说明PC代谢在哮喘发病中可能占据着重要的作用。筛选 出的16种显著性差异脂质中,PS(18:0/20:4)和PE(18:1/18:2)水平是降低的,说明 其可能作为排除哮喘的脂质指标。我们对14种上调的显著性差异的脂质进行 ROC 曲线下面积进行比较,PC(18:lp/18:2)、PC(16:0/18:1)、PC(18:0/22:5)、 PC(18:0e/20:4)、PC(18:lp/20:3)、PC(40:4)、PC(32:1)、PC(18:l/22:5)这 8 种脂质 的ROC曲线下面积具有统计学意义,提示其作为哮喘的潜在脂质生物标志物的 潜能较其它脂质大,但其ROC曲线下面积小于0.7,这可能和本实验中样本量
较小有关,需要大样本继续研究及验证。PS主要参与细胞的凋亡过程[37],哮喘 患者BALF增高表达的PS可能是由T细胞和嗜酸性粒细胞诱导支气管上皮细 胞的凋亡导致的[38,39]。本实验中,哮喘患者血浆中PS(39⑼水平是增加的。结合 既往研究及PS和凋亡的关系,提示PS可能参与哮喘发病过程中细胞凋亡信号 的传导。甘油磷脂经磷脂酶A1或磷脂酶A2的代谢水解脂肪链后产生溶血磷脂 [4Q],如LPCs、LPEs、LPSs,它们与细胞膜上的G蛋白偶联受体结合,调控细 胞内信号传导,参与人体内免疫、炎症、肿瘤等多种疾病的发病过程[41]。研究发 现LPC在哮喘中具有促进炎症的作用,哮喘患者血浆及BALF中LPC含量水平 增高。高水平的LPC可促进IL-ip、IL-18、IL-33等炎症介质表达[42],气道持续 暴露于LPC可能导致卩-肾上腺素能受体脱敏并增加气道平滑肌细胞对Ca2+的敏 感性,从而导致气道平滑肌收缩及对P-受体激动剂不敏感综上所述,甘油 磷脂代谢途径,尤其是PC代谢途径可能是哮喘发病机制的核心,有可能作为哮 喘治疗的新革巴点。
鞘脂是一种普遍存在的细胞膜成分,参与细胞增殖、自噬、凋亡、分化和细 胞分裂等多种细胞活动[44,45]。鞘脂有多种,包括Cer、S1P、SM。体外研究证明,
类黏蛋白(oroscomucoid,ORM)通过结合丝氨酸棕榈酰转移酶(serinepalmitoyl- CoAtransferase, SPT) 抑制鞘脂的合成,影响鞘脂的稳态[46]。 ORM 蛋白 由类黏 蛋白1样蛋白3基因(〇1^〇〇11111〇〇丨(1-11丨1^卩1'(^1113,01^01^)编码,而0腸01^ 与哮喘易感性相关[47]。ORM蛋白的水平明显影响鞘脂代谢,因此推测鞘脂的代 谢异常可能是哮喘发病的重要因素。本实验筛选出的4种显著性差异鞘脂均为 SM。SPT是SM合成的第一个限速酶,SPT基因敲除的小鼠或者使用SPT抑制 剂可以使肺组织SM的合成改变,使气道重构及气道高反应性增加[48]。SM在鞘 磷脂酶的作用下产生Cer,然后通过神经酰胺酶和鞘氨醇激酶(sphingosine kinases, SPHK)的作用下转化为鞘氨醇和S1P[49,5()]。SIP通过激活不同的信号通路介导 多种生物过程,既作为细胞内第二信使,又作为特定细胞表面G蛋白偶联受体 S1P受体的配体[51]。S1P和SPHK与肥大细胞的活化、气道炎症和气道高反应性 等有关[52],这些都是哮喘发病机制的关键特征。批准用于治疗多发性硬化症的 S1P受体激动剂FTY720,可以与S1P受体结合,降低ORMDL3的表达,减轻 哮喘小鼠的气道炎症和气道高反应应用SPHK抑制剂也显示出这种作用[49, 54],这提示S1P受体和SPHK可能成为基于鞘脂的哮喘治疗的新靶点,S1P受体 激动剂及SPHK抑制剂可能是一种治疗哮喘的新方法。本实验中,SM(dl8:l/18::〇、
SM(dl8:0/18:l)、SM(d20:0/18:2)、SM(d22:l/18:l)的 ROC 曲线下面积虽然差异无
统计学意义,可能和样本量较小有关,但是4种SM可能可以区分哮喘患者和健 康者的脂质指标,需要大样本进一步研究及验证。
通过显著性差异脂质的相关性分析可以看出,SM和PC之间呈正相关,且与 大部分PC正相关性较高。SM可以通过在鞘磷脂合酶的作用下由Cer产生,或者在 鞘磷脂酶的作用下水解Cer产生[55]。而鞘磷脂合酶也调节PC,是甘油磷脂代谢的 一部分[56],这说明SM代谢途径和PC代谢途径可能是哮喘发病的主要脂质致病途 径。PS(18:0/20:4)水平是下调的,和所有显著性差异的SM和PC均呈负相关性, 说明PS(18:0/20:4)可能具有不同的代谢途径。SM和PC的变化是本实验中主要的 变化,且两者之间相关性高,这表明进一步阐明这些途径及相互关系将有助于提 高对哮喘发病机制的理解。
哮喘是一种炎症性疾病,过度的氧化应激会加重气道炎症、支气管痉挛及肺 组织损伤[57,58]。活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)产生增加或抗氧化防御 机制失衡导致氧化应激,其通过作用于蛋白质、脂质和DNA影响细胞生物活动 过程。甘油磷脂、鞘脂等脂质通常含有高水平的多不饱和脂肪酸,发生过氧化, 产生一系列脂质过氧化产物,如MDA和4-羟基壬烯酸。MDA是脂质过氧化的标 志物[59]。本实验中,哮喘患者血浆中的MDA含量显著高于健康对照者,说明哮 喘患者存在过度的脂质过氧化。的研究发现LPC可以增加ROS的产 生,Nobata等[61]研究表明,吸入LPC可以使支气管收缩、气道反应性增加,这说 明脂质代谢、脂质过氧化与哮喘之间可能存在密切的相互作用。目前我们对脂质 过氧化机制的理解及其在哮喘发病机制调节中的作用仍然有限,但考虑到脂质 过氧化在哮喘的发病中起到关键作用,提不针对脂质过氧化的抗氧化治疗有可 能是哮喘的一个潜在治疗策略。
对于哮喘脂质生物标志物的分析,本研究中的一个不足之处是样本量小。本 研究中筛选出有前景的哮喘脂质生物标志物,但还需要进一步验证所筛选出的 潜在脂质生物标志物如何应用于临床,进一步研究其可能定义的哮喘表型,为不 同哮喘患者提供最适合的个体化治疗方案。
5结论
1、 哮喘患者存在脂质代谢紊乱,以甘油磷脂和鞘磷脂代谢改变为主。
2、 血浆中 PC(18:lp/18:2)、PC(16:0/18:1)、PC(18:0/22:5)、PC(18:0e/20:4)、 PC(18:lp/20:3)、PC(40:4)、PC(32:1)、PC(18:l/22:5)可能成为哮喘的潜在脂质生物
标志物。
6参考文献
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综述
基于代谢组学的哮喘研究进展和前景
杨梦综述 程哲审校
代谢组学是对生物体代谢产物进行综合的分析,是后基因组学时期的一门 新学科,它构成了基因组学、转录组学及蛋白组学的共同生物系统的核心,是目 前世界上最活跃的生命科学研究领域之一。目前,代谢组学在哮喘中的研究越来 越多,本文对代谢组学在哮喘中的研究进展及前景做一综述。
1代谢组学概述
代谢组学的概念是由Nicholson在1999年首次提出,是对生物体特定时间 和条件下的大量代谢物进行综合的分析,其目的是对给定样本中大量代谢物的 变化给与分析,然后进行深入的数据挖掘和生物信息分析代谢组学的研究 对象是各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物,这些小分子的代谢物的相 对分子质量在1000以下。代谢物包括碳水化合物、氨基酸、核酸、脂类、维生 素、有机酸、多酚、生物碱等,这些产物不仅仅可以是内源性的,而且还可以来 源于药物代谢、环境物质以及宿主和肠道微生物群之间的共同代谢[2]。内源性和 外源性因素的微小变化可以反映在代谢物水平上。因此,代谢组学具有将遗传、 环境与特定病理状态联系起来的巨大潜力W。随着代谢组学的逐步发展,其成为 研究代谢过程、识别疾病的潜在生物标志物及研究发病机制的重要工具生 物样品制备和仪器技术的进步和成就使得对各种代谢物的高通量分析成为可能, 也激发了代谢组学在支气管哮喘研究中潜在应用的极大兴趣。
2代谢组学技术
完整的代谢组学研究包括样品前处理、样品分析、数据处理与分析。代谢组 学的研究样本可以来源于包括血液、尿液、唾液、粪便、脑脊液、呼出气冷凝液
(exhaled breath condensate,EBC)、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)等的机体生物体液以及细胞、活检组织等。机体的生物体液样本 预处理方法多样,包括液液萃取、固相萃取法等,而细胞及组织可用超声破碎提 取。非靶向分析和靶向分析是代谢组学研究的两种传统策略[8]。非靶向代谢组学 是对样品中存在的广泛代谢物进行分析,其具有最佳的代谢产物覆盖率,但对低 丰度代谢物的重复性较差,敏感性有限与非靶向代谢组学相比,靶向代谢组 学是对特定的代谢物和相关代谢途径进行分析,因其灵敏度高、动态范围广、定 量精度高等优点,被认为是代谢物定量的金标准[1()]。动态多重反应监测和平行反 应监视的靶向代谢量化是两种新出现的策略,它们都可以用可靠的定量阵列来 测量大量的代谢产物,目前已被证明是研究代谢组学的有力工具[11]。虽然所有这 些技术都能同时识别和定量存在与机体的的众多代谢产物,但它们中没有一个 能够覆盖整个代谢体。然而,多个分析平台的结合有助于提高代谢覆盖率。
目前,应用于代谢组学分析的技术多为核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)和质谱(mass spectrometry,MS)。NMR及MS是代谢组学研究时使用的两 种主要的分析平台[12],后者也可以与其它的技术联用弥补其缺点,如气相色谱- 质谱联用(gas-chromatography- mass spectrometry, GC-MS )、液相色谱-质谱联用 (liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS) [13,14]、超高效液相色谱串联 质谱、超高效液相色谱_四极杆_飞行时间质谱、毛细管电泳
2.1核磁共振技术
NMR是基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下吸收射频辐射而产生 能级跃迀的谱学技术,是代谢组学研究的主要技术方法之一,其优点是高选择性、 高重复性,需要较少的样品制备。NMR法的样本预处理相对比较简单,需要较 少的样本量,并需要相对较短的分析时间,使其成为一种强大的高通量技术,能 够快速分析大量样本[21]。NMR法也是非破坏性的,可以对完整的代谢物进行分 析,并能够保留样品用于重复或进一步的深入分析,但其灵敏度较低,无法测量 低丰度代谢物,难以鉴定具体的化合物。由于缺乏适当的分离系统,数千个代谢 物信号重叠,这使得精确识别代谢物的结构成为一项艰巨而复杂的任务。尽管如 此,最新的技术已将这些缺点降为最低,并提高了 NMR的灵敏度和分辨率。高 敏感的冷冻探针和微探针的使用使得低丰度的代谢产物的检测低限降低3-5倍 [22,23]。此外,先进的NMR方法如二维核磁共振技术,近年来取得了很大进展,
异核相关谱、全相关谱及联用LC-MS-NMR,提高了光谱分辨率和代谢物鉴定能
力[24, 25] 〇
2.2液相色谱-质谱技术
MS研究的主要是是离子的质荷比(即质量-电荷比),是将样品中的组分进行 电离,成为有不同荷质比的离子,最终得到质谱图,确定其质量[13]。MS具有高 灵敏度和高特异性的优点,因此也广泛运用。LC-MS是代谢组学研究中广泛使 用的分析平台,超高液相色谱分离技术的运用使得LC-MS联用技术更具优势。 反相液相色谱和亲水相互作用液相色谱是两种主要的色谱分离技术[26],它们提 供了互补的代谢信息最近,二维和多维液相色谱已经成为强大的分析技术, 通过组合两个或多个具有正交特征的色谱柱,提供更高的峰容量和更好的分辨 率新建立的二维液相色谱-质谱联用方法可以在一次运行中同时分析代谢组, 并被视为在有限量样品中进行大规模代谢组学研究的有效工具[28]。
2.3气相色谱-质谱技术
GC-MS被广泛用于代谢组学,其优点在于高灵敏度和特异性、高通量、高 分离度,成为代谢组学研究最主要的技术之一。GC可以耦合到各种类型的质量 分析仪,例如单四极杆、三重四极杆、离子阱和飞行时间。由于其更高的灵敏度、 分辨率和质量准确度,新开发的GC/Q-Orbitrap MS系统已被证明可以极大地提 高识别未知代谢物的能力色谱分离技术也得到了改进。通过组合两个正交 柱,二维GC实现了峰值容量的倍增性增加™。GC-MS主要用于分析挥发性(即 天然挥发性和通过衍生化产生的挥发性)和热稳定代谢物。通过GC-MS检测的 代谢物主要与三羧酸循环、糖酵解、尿素循环、氨基酸代谢和脂肪酸代谢等有关。 最近,一种快速和敏感的基于GC-MS的方法已被开发用于的短链和中链脂肪酸 的定量,被证明是研究寄主肠道微生物区系效应的有效工具[31,32]。GC-MS还被 用于探讨神经递质、激素和嘌呤代谢在不同神经系统疾病中的失调%,34]。
3代谢组学在哮喘中的研究进展
哮喘是由包括气道上皮细胞、嗜酸粒细胞、中性粒细胞等多种细胞及细胞组 分参与的慢性气道炎症性疾病目前,全球至少有3亿哮喘患者,其中,中国
哮喘患者约3000万其患病率呈现逐年上升的趋势。哮喘反复发作可引起多 种并发症,包括慢性阻塞性肺疾病、肺源性心脏病、支气管扩张等,严重影响患 者的生活,造成沉重的社会负担。
哮喘是具有环境和遗传双重影响的疾病,发病机制尚未完全清楚是导 致其部分患者缺乏有效治疗的重要原因。代谢组学是对包括碳水化合物、氨基酸、 有机酸、核苷酸和脂类在内的小分子进行系统分析,可以发现一些复杂的慢性疾 病的新的生物标志物和用于致病途径的研究[4(),41]。使用代谢组学发现新的生物 标志物是极具前景,现已用于多种疾病的生物标志物及发病机制研究,如心血管 疾病[42]、风湿炎症性疾病[43]、阿尔茨海默症[44]。代谢组学适合研究具有环境因 素成分的疾病,其代谢物的变化代表了包括遗传和环境相互作用在内的完整的 病理生理过程哮喘受到环境和遗传因素的影响^,381因此,代谢谱有助于 阐明哮喘的生物学机制[38]。下面就代谢组学近年来在支气管哮喘的研究及进展 做一简单总结。
3.1基于代谢组学的哮喘模型小鼠代谢组学的研究
目前,多项研究构建了哮喘模型小鼠,对其血清/血浆、BALF以及肺组织等 进行代谢物的研究。Quinn等[45]进行的研宄哮喘小鼠的血清和BALF的代谢物, 观察到与哮喘有关的四条通路:鞘脂代谢途径、精氨酸和脯氨酸代谢途径、甘油 磷脂代谢途径、神经营养因子信号通路。这些途径之间存在着可转换的关系,这 加强了它们之间的生物相关性。例如,鞘脂和甘油磷脂途径共享氨基酸丝氨酸; 此外,它们通过甘氨酸与精氨酸和脯氨酸代谢相连。神经营养素信号通路和精氨 酸通路都与一氧化氮的释放有关[46, 47]。这些潜在的靶点和途径可能是哮喘发病 机制的核心,有可能作为新的治疗靶点。
研究发现,哮喘模型小鼠BALF中鞘磷脂(dl8:l/24:l)水平增加,并且随 着哮喘的严重程度而增加[45]。鞘脂调节失调与肺和其他呼吸系统疾病亦有密切 关系,如肺癌[48]、肺囊性纤维化[49]和特发性肺间质纤维化[5()]。1-磷酸-鞘氨醇 (sphingosine-l-phosphate, S1P)是鞘脂代谢产物之一,由鞘氨醇激酶(sphingosine kinases, SPHK)催化而成,可参与细胞的生长、存活、增殖分化等生物学过程[51]。 在卵清蛋白致敏的小鼠中,S1P/SPHK途径触发气道高反应性[52]。研宄发现,小 鼠气管内滴注S1P类似物FTY72可以减轻抗原诱导的气道炎症和气道高反应性 [53]。相反,在哮喘模型小鼠中,鼻内滴注S1P可导致抗原诱导的气道炎症加重 及对乙酰甲胆碱的敏感性增加[54]。SPHK抑制剂可减轻气道高反应性,抑制肥大 细胞活化[55],SPHK抑制剂治疗改善了小鼠哮喘模型的免疫反应因此,对于 激素不敏感的患者或者P2-受体激动剂不能耐受、糖皮质激素应用有明显副作用 的哮喘患者,S1P类似物及SPHK抑制剂有望成为是一种全新的哮喘治疗方法。
3.2基于代谢组学的哮喘患者代谢组学的研究
血清/血浆、尿液、EBC、BALF、脑脊液、唾液、粪便、活检组织及细胞等 均可作作为代谢组学的研究对象。类似于哮喘模型小鼠,这些研究发现哮喘患者 中的代谢产物与健康人不同。下文介绍了近几年来代谢组学在哮喘患者中的研究。
3.2.1血楽/血清代谢组学研究
流行病学调查显示,儿童哮喘患者中男性的发病率高,但在青春期以后女性 的哮喘发病率为男性的2倍,且在重症哮喘患者中以女性为主^1,造成此种差异 的机制目前尚不清楚。研究发现,肥胖、性激素、痩素水平可能是导致哮喘差异 的相关因素t58_61h提亦哮喘患者的代谢可能参与了哮喘的发病,对相关代谢广物 及代谢产物途径在哮喘发病中作用机制进行研究可以进一步阐明哮喘的发病机 制。
Kelly等[62]应用非靶向代谢组学的方法分析哮喘和对照组儿童血浆进行代谢 组学分析,发现哮喘的发生与烟酰胺代谢途径、嘧啶代谢、纤维蛋白原相关肽、 胆汁代谢产物和肠道微生物代谢产物对甲酚硫酸盐代谢产物的改变有关。
Reinke等%发现内源性糖皮质激素水平与吸入糖皮质激素(inhaled corticosteroids, ICS)的剂量相关,并且在口服糖皮质激素治疗的患者中进一步发 生转变,这与糖皮质激素对下丘脑-垂体-肾上腺轴抑制的剂量依赖是一致的,还 发现其它代谢物如脯氨酰羟脯氨酸与ICS剂量相关@1。脯氨酰羟脯氨酸是骨胶 原降解的标志物,可能反映出与糖皮质激素治疗相关的骨质疏松和骨损伤的风 险呈剂量依赖性增加[63]。然而,与健康对照者相比,发现了未经治疗的哮喘患者 发生了与哮喘相关的代谢改变[63,64],这支持哮喘具有独立的代谢特征。相关研究 报道了哮喘相关的不同代谢物和潜在的代谢途径,但次黄嘌呤在这两项研究中 都是一致的[63,64],这进一步证实了嘌呤途径在哮喘中的作用,也符合动物研究 [65_67]的结果。
3.2.2呼出气冷凝液代谢组学研究
呼出气冷凝液(EBC)由挥发性气体(如一氧化氮)[68]和非挥发性化合物(如类 花生酸类物质和细胞因子;)组成越来越多地被作为研究疾病生物标志物的研 究对象。EBC可以通过非侵入性方法获得,反映气道上皮的生理状态,从而提 供肺部情况的重要信息。
Paris等[7G]将核磁共振代谢组学应用于EBC,可以正确地区分肥胖和纤痩受 试者。与纤痩受试者相比,肥胖受试者的乙烯、乙二醇、乙醇、正戊酸短链脂肪 酸和羟丁酸浓度增加,甲酸、甲醇、琥珀酸酯、丙酮、乙酰丙酮、丙酸、乙酸和 乳酸浓度降低。由于这些代谢物参与能量稳态和炎症过程,因此,肥胖构成了一 种特殊的呼吸代谢表型。一项大规模调查研究发现,肥胖可以增加哮喘的患病率 和发病率,加重哮喘的严重程度[71]。Maniscalco等基于NMR的代谢组学方法 分析EBC中的代谢产物,研究发现,肥胖的哮喘患者呈现出特定的代谢类型, 这与仅为肥胖或仅为哮喘患者的代谢完全不同。这种表型差异表明,在成年肥胖 哮喘患者中,哮喘发病过程中存在独特的病理生理途径,进一步研究这种表型对 哮喘发病机制的研究及对哮喘的诊断和治疗都具有重要的意义。
3.2.3尿液代谢组学研究
研究尿液代谢组学与非肥胖哮喘患者临床特征(如肺功能、血嗜酸性粒细胞) 的关系,结果表明尿液中醛类和烷烃可能成为预测哮喘急性发作的标志物[72]。由 于任何单一的哮喘生物标志物都可能缺乏敏感性、特异性、稳定性和可操作性[73], 各种指标,包括代谢物的组合,越来越多地被用来诊断哮喘及其亚型[38,74_7'Ta〇 等[78]对儿童尿液进行代谢组学分析,结果显示使用8种尿液代谢产物(天冬氨 酸、硬脂酸、十七烷酸、苏糖醇、乙酰半乳糖胺、黄嘌呤核苷、次黄嘌呤和尿酸) 的组合来鉴别哮喘,受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic, ROC)曲线 下面积值在各组之间大于0.97,显示出极好的哮喘辨别能力以及区分哮喘控制 不良或控制良好的亚型。
可变气流限制和气道高反应性是哮喘的标志,固定气流受限是哮喘预后不 良的有力预测因素[79]。在儿童和成人哮喘中,肺功能参数与代谢变化之间也有联 系[72,8'这些变化包括脂质过氧化代谢物以及其他代谢途径,如甘油磷脂、 核苷酸相关代谢物[8()]。Loureiro等应用微固相萃取的方法,采用二维气相色谱 -质谱联用技术分析非肥胖哮喘患者尿液的脂质代谢产物,研究发现与脂质过氧
化有关的尿液代谢物也与非肥胖哮喘的呼出气一氧化氮水平和血嗜酸性粒细胞 计数有关。
3.2.4呼出气中挥发性有机化合物的代谢组学研究
呼出气中的挥发性有机化合物(volatile organic compounds, VOCs)在过去几
年中作为非侵入性生物标志物引起了人们的极大兴趣。GC-MS是鉴定呼出气的 VOCs的金标准。基于传感器的电子鼻具有允许复合VOCs信号的即时测试但不 选择性地识别单独的分子组分的优点。最近的一项研究使用基于量子级联激光 的光谱法来检测和识别呼出的VOCs,这可以区分健康儿童和患有稳定性哮喘或 肺囊性纤维化的儿童[81]。快速且相对易于使用的技术的组合提供了分子识别的 可能性,使得这些方法具有吸引力,但是需要进一步的验证。
荟萃分析和系统评价显示呼出气中VOCs是哮喘诊断的有希望的生物标志 物[82]。两项前瞻性研究进一步将VOCs扩展到哮喘监测@_8火通过纵向监测呼 出的VOCs,特别是通过电子鼻技术,可以准确地区分哮喘发作与稳定状态[83]。 此外,在VOCs和痰嗜酸粒细胞增多之间发现了一种联系@1。Van等发现可 以区分儿童控制或未控制哮喘的呼出气VOCs,并在在14天内准确预测哮喘急 性发作。与VOCs生物标志物相反,呼出气一氧化氮水平与哮喘控制无关,并且 不是这些研究中恶化的重要预测指标[84,85]。因此,呼出气中VOCs可以预测哮 喘的临床相关变化并有助于哮喘管理。
3.2.5哮喘严重程度、表型与代谢变化的研究
由于代谢组学可以反映基因和环境的相互作用,它可能受到药理学和非药 理学的强烈干预影响。因此,需要将疾病和疾病严重程度对代谢物的影响与治疗 所产生的影响区分开来。
与哮喘严重程度相关的代谢产物变化可用作诊断和管理中的特定生物标志 物。严重哮喘最显着的临床特征之一是糖皮质激素抵抗。Park等[75]应用高分辨 率代谢组学对尿液进行代谢组学分析,确定了重症哮喘患儿糖皮质激素耐药的5 种潜在生物标志物。Loureiro等应用固相微萃取的代谢组学方法,研究了非肥 胖成人哮喘患者尿液中氧化应激相关代谢物与哮喘严重程度之间的相关性,研 究表明脂质过氧化相关的脂质代谢广物可以预测非肥胖哮喘患者的临床及实验 相关参数,如哮喘的严重程度、外周血嗜酸性粒细胞、呼出气一氧化氮。
Reinke等[63]研究发现,与对照组相比,轻度哮喘患者的代谢变化与外源性 代谢物(如饮食中的脂质)有关,而中度和重度哮喘患者的代谢变化(如油酸乙醇 胺、S1P、N-棕榈酰牛磺酸)可能参与激活迷走神经瞬时受体电位香草酸亚型1 (transient receptor potential vanilloid type 1,TRPV1)受体,TRPV1 在哮喘发病中 具有一定的作用。Reinke等发现哮喘患者的全身代谢产物是以哮喘严重程度 依赖性方式的发生转变,并且似乎与应用糖皮质激素治疗无关。中/重度哮喘和 对照组相比,可以发现许多差异丰富的代谢物,如S1P、油酰乙醇胺、N-棕榈酰 牛磺酸[63]。
脂质组学是代谢组学的一个重要分支,旨在对脂质系统进行综合的分析。 McGeachie等[86]的研究表明,当使用短效02-受体激动剂治疗时,脂质S1P可能 用来预测哮喘控制。赵蕴伟等[87]发现,S1P与不同严重程度哮喘环节的嗜酸性粒 细胞水平均呈正相关,与第1秒用力呼气量(forced expiratory volume in one second, FEV1)呈负相关,且哮喘发作期患者血中SIP水平随病情加重而逐渐升高,评 估轻、中、重度哮喘的ROC曲线的曲线下面积分别为0.948、1.000、1.000,其 对哮喘严重程度具有较高的评估价值。有研究证实,哮喘急性发作缓解后,BALF 中的S1P可以降至正常范围^1。因此,可以推测S1P可以作为一项评估哮喘严 重程度的指标,也可以作为预测哮喘预后的指标,尤其对于因病情无法行肺功能 检查且外周血嗜酸性粒细胞无异常患者的治疗方案的选择、预后的评估具有重 要意义。S1P通过激活G蛋白偶联受体,在肺部疾病中发挥多重作用,包括细胞 迀移、调节内皮和上皮屏障,以及上调炎性代谢途径并在哮喘模型小鼠中激 活TRPV1受体[9()]。TRPV1受体在感觉神经中充当Ca2+离子通道,导致趋化性, 促使支气管收缩、粘液分泌、气道刺激和咳嗽反应[91,92]。因此,推测S1P与哮 喘发病相关,其机制可能是增强哮喘患者中TRPV1的信号传导。
哮喘有两种典型的表型,即嗜酸粒细胞哮喘(eosinophilic asthma, EA)和非嗜 酸粒细胞哮喘(noneosinophilicasthma,NEA)[93],其分类依据的是外周血或痰中粒 细胞的比例〜,95^ —般来说,EA通常表现出更严重的气道高反应性和更高的急 性发作的风险[96]。至于NEA,主要由中性粒细胞组成,表现为控制不良,气道 阻塞状况恶化[97,98]。与炎症表型相关的潜在的疾病机制是临床治疗哮喘的关键, 但人们对此仍然知之甚少。Pang等应用超高效液相色谱-高分辨率质谱技术研 究了具有不同表型哮喘和健康对照者的代谢特征,结果显示不同炎症表型存在 一定程度差异的代谢特征。明确的代谢特征有助于理解哮喘表型的病理生理学 并优化哮喘异质性的治疗策略。
综上所述,大量代谢产物和哮喘的严重程度和哮喘表型相关。代谢物在不同 的研究中不一致,但可以发现部分代谢途径是相同的。成人和儿童的研究也有很 多相同之处,儿童哮喘患和成人哮喘患共同的代谢组支持这两者有共同的病因 学和病理生理特征。儿童哮喘更多地受遗传因素的影响,而成人哮喘更多地受环 境因素和肥胖的影响[1()()]。
4代谢组学现存问题
代谢组学有着快速的发展,从样品收集到数据处理和解释是至关重要的[4G, 1(n,1Q2]。血衆/血清、EBC、尿液、BALF及活检组织、细胞等均可作为研宄对象。 年龄、性别、饮食、昼夜节律都会影响代谢产物。Motta等[103]研究了不同冷凝 温度(-27.3°C和-4.8°C)对EBC代谢物的影响。研究发现,虽然在这两种温度下采 集的样本产生的代谢组学图谱可以区分哮喘患者和对照组患者,但其组成代谢 物各不相同。样本的搜集条件、保存条件、处理流程、样本采集前使用药物等均 可影响代谢组学的结果。目前,代谢组学技术仍然是耗费时间和昂贵的,要求专 业的实验室,需要多学科有经验的工作人员进行分析和解释结果,这在一定程度 上限制代谢组学技术的应用。
5代谢组学展望
代谢组学最初的研究重点是用于疾病生物标志物的发现,用以发现与哮喘 相关的代谢产物。在未来的研究中,必须考虑到一些可能影响机体的外源性因素, 以减少个体间和个体内的变异性。代谢组学研究可以进一步用于定义分子代谢 表型〜]。由于一个以上的病理生理机制可以同时发生,涉及到共同的分子,因此 可能需要使用聚类方法,允许一个元素属于多个聚类。分子哮喘表型的有用性通 过转录驱动的聚类方法得到了证实,这种聚类方法确定了那些可能受益于针对 Th2细胞介导的炎症或糖皮质激素不敏感的特定药物的哮喘患者^4,1(^,可以研 究代谢组学预测和监测特定靶向疗法反应的潜力[1Q6]。
药物代谢组学对药物干预所改变的代谢产物或代谢途径进行综合分析,为 药物干预的有效性和安全性提供了相关数据[1()7,1()8]。这一新出现的领域可以用来
描述哮喘的药物代谢,并可能极大地促进治疗药物的发现、开发和临床应用。结 合药物遗传学和药物代谢组学可以提供新的见解,以此了解与药物反应相关的 基因组和环境影响之间的相互作用。
代谢组学和其它组学(如转录组学、蛋白组学)的结合,即整合组学,除了 用于预测和早期诊断外,在疾病治疗和预后方面的作用也将越来越大[1()9]。Kelly 等[11()]应用加权基因共表达网络分析法对325例哮喘儿童进行血液转录组和代谢 组学的综合分析,以鉴定与哮喘肺功能相关的基因和代谢产物的生物信息网络。 研究结果显示出类黏蛋白1样蛋白3基因(oroscomucoid-1 like protein 3, ORMDL3)在内的多种哮喘基因的机制基础以及在脂质代谢中的作用。相对于单 一组学技术的使用,这种综合方法显示了对哮喘及其亚型的更强的预测能力,以 及更多的生物学洞察力。因此,综合组学是哮喘研究中一个令人兴奋的新途径。
6总结
代谢组学是一个令人兴奋和不断发展的研究领域,从发现疾病的生物标志 物到研究疾病的发病机制。目前,哮喘代谢组学的研究已取得重大成果,可以将 代谢组学应用于哮喘的生物标志物、表型及发病机制等的研究。同时,随着代谢 组学与基因组学、蛋白质组学等技术的相结合,使得改变基因表达、影响酶活性 及细胞信号传导等用于治疗哮喘成为可能。
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