粪菌移植对脂多糖诱导的大鼠 急性肺损伤的影响及调控机制论文

2020年2月20日17:49:08粪菌移植对脂多糖诱导的大鼠 急性肺损伤的影响及调控机制论文已关闭评论

粪菌移植对脂多糖诱导的大鼠 急性肺损伤的影响及调控机制论文

摘 要

目的:通过粪菌移植(FMT)处理脂多糖(LPS)诱导的大鼠急性肺 损伤(ALI),研宄对肺组织中胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT) /核因子(NF) -kB信号通路表达的调控,探讨粪菌移植干预ALI可能的作 用机制,为ALI的早期治疗提供新的方法和可能的实验依据。方法:采用 随机数字表法,将15只成年健康雄性SD大鼠分为对照组、模型组和干预 组,每组5只,模型组、干预组分别腹腔内注射LPS复制大鼠ALI模型, 于造模完成24h后,干预组每日给予粪便(10ml/kg)灌胃2次,对照组和 模型组同时给予等量生理盐水灌胃,干预持续2天,于最后一次FMT24h 后,抽取3组大鼠动脉血行动脉血气分析检测,然后处死大鼠,用酶联免 疫吸附试验(ELISA)检测血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞间黏附 分子-l(ICAM-l)的含量,取出左肺检测肺湿/干重比值,右肺行肺组织H-E 染色及病理学评分,免疫组化检测肺泡上皮细胞中的NF-kB的核表达和 ICAM-1的表达,Western印迹法检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达。 收集大鼠粪便样品并提取DNA,对16S核糖体RNA基因(16SrDNA)的 V3、V4区聚合酶链式反应产物(PCR)产物进行高通量测序,并对操作 分类单元(OTU)为分类基础的微生物群落进行生物信息学分析。结果: 与对照组相比,模型组大鼠肺湿干重比(W/D)比值增高(3.40士0.91比 1.74士0.73,户<0.05),肺组织病理评分增力口(分:10.32士0.23                                                                                                                      1.87士0.54, 尸<0.05),动脉血氧分压(Pa02 )均有明显下降[(79.2±5.89)mmHg比 (95.2±2.77)mmHg,lmmHg=0.133kPa,尸<0.05 ];肠道菌群测序结果揭示对 照组含1213个OTU,模型组含1303个OTU,干预组含1207个OTU,共 享OTU为593个,共有的OTU所占百分比为67.5%。模型组多样性指数 显著高于对照组,而模型组的厚壁菌门(在门级)、乳酸杆菌属(在属级) 显著低于对照组,肠道菌群结构较不稳定;模型组血清、BALF中ICAM-1 含量及其胞膜的相对表达量均显著高于对照组[(8.64±0.87)比(7.40±0.32) ng/L、(0.941 士0.035)比(0.739士0.079)ng/L、(0.250士0.010)比(0.076士0.010)] (均户<0.05),且模型组NF-kB的p-P65、p-PI3K及p-AKT (p代表磷酸 化)核蛋白相对表达量均显著高于对照组(4.89士0.27比3.28士0.13、 0.265士0.030 比 0.036士0.013 及 0.444士0.040 比 0.109士0.016)(均 P<0.05)。 FMT后上述损伤效应减轻,干预组肺W/D (2.1U0.81)、肺组织病理评分 (分:5.28士0.94)均显著低于 LPS 组,干预组 Pa02[ (88.0士3.53) mmHg] 显著高于模型组;肠道菌群测序干预组多样性指数显著低于模型组,干预 组乳酸杆菌属显著高于模型组;血清、BALF中ICAM-1含量[(7.44±0.46)、 (0.834士0.040)ng/L]及其胞膜的相对表达量(0.173士0.030)以及NF-KB的 p-P65、p-PI3K 及 p-AKT 核蛋白相对表达量(2.99士0.28、0.090士0.013、0.206士 0.018)均显著低于模型组(均P<0.05)。结论:采用5mg/kgLPS 1次腹腔 内注射可成功复制大鼠ALI模型,ALI大鼠的肠道菌群出现失调,FMT可 以纠正失衡的肠道菌群结构,恢复肠道菌群后的大鼠ALI的肺组织炎症得 以改善,其调控作用机制可能与抑制PI3K/AKT/NF-KB信号通路活化、减 少炎症因子ICAM-1等表达有关。

关键词急性肺损伤;脂多糖类;粪菌移植;大鼠;PI3K/AKT/NF-kB;

细胞间黏附分子-1;肠道菌群;高通量测序

Effects and mechanism of fecal transplantation on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in rats Abstract: Objective: By fecal bacteria transplantation (FMT) deal with lipopolysaccharide (LPS) in rats induced by acute lung injury (ALI)? research in lung tissue of intracellular phosphatidyl inositol kinase (PI3K)/protein kinase (AKT)/-nuclear factor (NF) kappa B predominate signal path expression regulation of fecal bacteria transplanted intervention and its possible mechanism of ALI5 offers a new method for early treatment of ALI and possible experimental basis. Methods : Using the random number table method, will be 15 healthy adult male SD rats were divided into control group, model group and intervention group, each group 5, model group and intervention group respectively intraperitoneal injection of LPS duplicate the ALI rats model, completed building after 24 h9 intervention group give daily waste (10 ml/kg) to fill the stomach 2 times, the control group and model group at the same time gives the amount of normal saline lavage? intervention in the last 2 days, 24 h after the last time in FMT, extraction of three groups of rats arterial blood line detection, arterial blood gas analysis and then put to death in the rat, Enzyme linked immunosorbent (ELISA) to detect serum, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) content, remove the left lung to detect lung wet/dry weight ratio? right lung line HE staining and lung tissue pathology score, immunohistochemical detection of alveolar epithelial cells of the NF-kappa B nuclear expression and ICAM-1 expression levels,

Western imprinting method to detect PI3K/AKT signaling pathway related protein expression. The fecal samples of rats were collected and DNA was extracted. The PCR products of the V3 and V4 regions of the 16S ribosomal RNA gene (16SrDNA) were high-throughput sequenced, and the bioinformatics analysis of the microbial community based on the operational classification unit (OTU) was performed. Results: Compared with the control group, the ratio of wet to dry lung weight (W/D) in model group was increased (3.40士0.91 vs 1.74士0.73,尸<0.05),lung histopathological score increased (score: 10.32士0.23 vs 1.87士0.54,尸<0.05),the partial pressure of arterial blood oxygen (Pa〇2) decreased significantly [(79.20士5.89)mmHg vs (95.20士2.77)mmHg, lmmHg= 0.133kpa?P< 0.05]; The results of intestinal microflora sequencing revealed that the control group contained 1213 OTU? the model group contained 1303 OTU? the intervention group contained 1207 OTU, the Shared OTU was 593 ? and the percentage of Shared OTU was 67.5%. The diversity index of model group was significantly higher than that of the control group, while the firmicutes (at the phylum level) and lactobacillus (at the genus level) of model group were significantly lower than that of the control group, and the intestinal flora structure was relatively unstable; The relative expression of ICAM-1 in serum and BALF of model group and its membrane were significantly higher than that of control group [(8.64士0.87) vs (7.40士0.32) ng/L, (0.941 士0.035) vs (0.739士0.079) ng/L, (0.250士0.010) vs (0.076士0.010)] (all 尸<0.05).The relative expression levels of NF-kB p-P65, p-PI3K and p-AKT (p for phosphorylation) in model group were significantly higher than those in control group (4.89士0.27vs 3.28士0.13, 0.265士0.030 vs 0.036士0.013 and 0.444士0.040 vs 0.109士0.016) (all ^<0.05). The above injury effect was reduced after FMT. Lung W/D (2.11 士0.81) and lung histological score (5.28士0.94) in intervention group were significantly lower than those in model group,and Pa〇2[(88.00士3.53) mmHg] in intervention group were significantly higher than those in model group. The results of intestinal flora sequencing revealed that the diversity index of intervention group was significantly lower than that of model group, and the lactobacillus genus of intervention group was significantly higher than that of model group. ICAM-1 for (7.44士0.46) ng/L in blood serum, for (0.834士0.040) ng/L in BALF and the relative expression of alveolar epithelial cell membrane for (0.173士0.030),the NF-kB p-P65 in relative expression quantity of protein in alveolar epithelial cells (2.99±0.28)5 p-PI3K and p-AKT protein relative expression was downgraded to (0.090士0.013, 0.206士0.018),the detection index in intervention group were significantly lower than that of model group, the differences were statistically significant (all P<0.05).Conclusion: the 5 mg/kg LPS 1 intraperitoneal injection can be copied in the rat model of ALI and ALI of rat intestinal flora imbalance, FMT can correct the imbalance of intestinal flora structure of transplantation, recovery of intestinal flora of rats after ALI inflammation of the lung tissue was improved, its regulation and control mechanism may be related to the inhibition of PI3K/AKT/NF-kB signaling pathway activation, reduce inflammation factors such as ICAM-1 expression.

transplantation; Rats; PI3K/AKT/NF-kB; ICAM-1; Gut microbiota; High- throughput sequencing technology

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是呼吸系统中最常见的急危重 症之一,目前它的发病机制仍不清楚,而它的致病因素却是多种多样[1], 包括感染、创伤、药物、食物等多方面因素。ALI发生后主要表现为肺泡 上皮或者是毛细血管内皮两种细胞严重受损,引起弥漫性肺间质损伤或出 现肺泡广泛水肿以及透明膜形成,进而造成顽固性低氧血症,若病情得不 到及时控制,将进一步发展到严重阶段即急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS),死亡率可高达 30%-60%[2_4],是目前 医学界的研宄热点。而近些年来大量研宄已发现,在机体受到内、外源性 的打击后,多种效应细胞和炎症介质参与是ALI发病的关键环节。

脂多糖(Lipopo- lysaccharide,LPS)是引起炎症反应和休克的关键性介 质之一,是引起ALI的主要因素之一,LPS是革兰阴性杆菌细胞壁的主要 成分,有强大的致炎效应,它可以导致肺泡损伤,从而进一步活化肺泡巨 噬细胞,以及炎症细胞如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸粒细胞 等的浸润,这些炎症细胞与它释放的炎症递质和细胞因子的主要特征就是 引起肺部持续的炎症[25]和微血管通透性增加[5]。LPS还可作用于血管内皮 细胞,可诱导相关细胞因子明显增加,而可以使炎症反应得以启动、放大 和延续的正是这些增加的细胞因子,进一步就是造成机体的严重损伤[6_8]

PI3K家族是一类蛋白激酶,在很多生命活动中它是一种关键信号分 子。Ras分子在细胞因子、生长因子等的诱导下活化或者是酪氨酸磷酸化某些信号分子后,使PI3K活化而生成相应的肌醇脂物质,在细胞内新生 成的肌醇脂物质是新型第二信使,与白细胞激酶C底物、血小板在胞质内 同源结构域的信号分子结合后对相应分子发挥活性调节作用[9' 1()]。NF-kB 是一种广泛存在于体内多种细胞的调节各种细胞因子、粘附分子、趋化因 子的核转录因子,它的活化在失调的复杂的细胞因子网络中是一个关键中 心环节^12]。当遇到各种致炎因子的刺激时,则通过多个信号或者是一个 信号转导途径,促使一系列激酶激活,并与细胞内特定的DNA序列结合, 进而调控这相应靶基因的表达,从而起到转录调节的作用,最终在细胞的 活化、炎症、增殖和凋亡中发挥调控作用,启动下游的炎症反应。近年来, PI3K/AKT信号通路在炎症中的作用日益受到重视,PI3K/AKT信号传导通 路与细胞因子的调控密切相关。目前己有大量体内外实验证实,PI3K/AKT 信号通路在LPS诱导的急性炎症反应中发挥着重要的抑制作用。大量研宄 证实,P13K及其下游分子,AKT参与了 NF-kB活性的调节,其活化后, NF-kB激活后进核,作为转录因子发挥作用,启动下游的炎症反应,促使产 生大量的促炎性细胞因子,启动多种炎症介质mRNA的表达,进而促进合 成与释放细胞因子TNF-a,诱导粘附因子ICAM-1的表达&131,其在ALI 反应中发挥着重要作用。

研宄证实,粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)通过重建肠道菌群多样性以及对机体的免疫调节作用,对复发性艰难梭菌感染有明 显治疗效果[14],可以实现肠道及肠道外疾病的治疗。在-11111^等[15]提出了 “肠道发病的中心器官学说”后,肠道屏障功能逐渐引起人们广泛而密切的 关注。近年来,大量证据证实肠道微生物通过“肠-肺轴”影响呼吸道疾病病 理和免疫功能(gut-lung axis)”[1316]。近期研宄证实,肠道微生物菌群在肺炎 链球菌肺炎中起保护性作用,去除肠道微生物菌群,小鼠的细菌传播、炎 症、器官衰竭和死亡明显增高,而FMT可使肠道微生物菌群正常化,并且 明显改善炎症、器官损伤和死亡率[17]

基于上述发现,目前FMT成为肠道微生物菌群研宄的热点,而肠道微 生物失衡可能是影响ALI进展的重要因素,己知PDK/AKT/NF-kB信号通 路在炎症中起着关键作用,研宄表明,肠道菌群的变化能够影响固有免疫 反应,激活肠道核因子(NF) -kB、胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K) /蛋白激 酶(AKT)信号通路而该信号通路在ALI炎症反应中发挥着重要作用。 相关研宄[19]己证实ALI大鼠肠道菌群会发生显著改变,肠道微生物失衡可 能是影响ALI进展的重要因素,但FMT对LPS引起的ALI有无影响及可 能的作用机制还有待探讨。本实验研宄应用FMT干预LPS诱导的ALI大 鼠模型,观察FMT对实验组大鼠肺泡炎症、肠道菌群变化以及肺组织 P-PI3K、p-AKT、NF-kB p65蛋白表达的影响。通过本研宄,为肠道菌群 调节对ALI的防治提供新的思路和可能的实验依据,为更深入探讨肠-肺 轴联系提供基础。

材料与方法

1实验材料与仪器

1.1实验动物

15只清洁级健康雄性SD大鼠(8周龄),体质量180〜200g,购自西南医 科大学动物实验中心,动物合格证号:SYXK(川)2018-065。遵从国际社会医 学研宄组织制定的“实验室动物管理原则”。

1.2主要实验试剂
LPS 美国 Sigma-Aldrich 公司
水合氯醛 上海酶联生物科技有限公司
甲醛 西南医科大学附属医院病理科
RIPA裂解液 上海碧云天生物技术公司
ICAM-1 ELISA 试剂盒 武汉三鹰生物技术有限公司
BCA蛋白定量试剂盒 上海碧云天生物技术公司
PI3K antibody 北京孚博生物科技有限公司
p-PI3K antibody 北京孚博生物科技有限公司
AKT antibody 北京孚博生物科技有限公司
p-AKT antibody 北京孚博生物科技有限公司
NF-kB antibody 北京孚博生物科技有限公司
荧光山羊抗兔二抗 上海碧云天生物技术公司
PVDF 膜 上海碧云天生物技术公司
GADPH 上海碧云天生物技术公司

 

丽春红染色液 上海碧云天生物技术公司
无水乙醇 湖州百化生物有限公司
伊红 上海碧云天生物技术公司
苏木素 上海碧云天生物技术公司
脱脂奶粉 雀巢(Nestle)
1.3主要实验试剂的配制
  • LPS试剂:取出LPSlmg,将其溶于lml的无菌生理盐水中,混匀后 再进行分装,置于冰箱-20W内避光保存。
  • 4%水合氯醛:取4g水合氯醛加入100ml无菌生理盐水中,混匀后备 用。
  • 3%过氧化氢去离子水:取30%过氧化氢10ml加入纯甲醇90ml后充 分混匀。
  • PBST(PH 7.4):称取 Na2HP〇4 8g,NaCl 0.136g,KH2P〇4 2g,KCL 2.6g 力口

入生理盐水中充分混匀后定容至1000ml,高压灭菌后,放在4°C冰箱 中保存。

  • Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液:称取 Trisbase1g,甘氨酸 94.0g, SDS 5.0g,分别加入蒸馏水中充分混匀后定容至1000ml,放置室温保存。
  • TBST缓冲液配制:取100ml的10XTBS缓冲液与5ml Tween 20加 入900ml蒸馏水中充分混匀,现配现用。
  • 4%甲醛:称取多聚甲醛40g,KH2P〇46g,NaOH3.4g,分别加入

生理盐水中充分混均匀定容至1000ml,放在4°C冰箱中保存。

  • 转膜缓冲液:称取 Trisbase8g,甘氨酸 2.9g,SDS 0.37g,甲醇 200ml,

分别加入蒸馏水中充分混匀后定容至l〇〇〇ml,放置室温保存。

大鼠在适宜光线、温度、湿度实验条件下饲养一周,按随机数字表法 分为对照组(NS组)、模型组(LPS组)和干预组(LPS+FMT组)三组, 每组5只。NS组仅于腹腔内注射等体积的生理盐水,LPS组和LPS+FMT 组均腹腔注射LPS 1次,LPS+FMT组在腹腔内注射LPS 24h后以灌胃的方 式进行粪菌移植(l〇ml/Kg)。

2.1.2急性肺损伤大鼠模型制备

带上手套后,在LPS组和LPS+FMT组分别抓出大鼠,每只大鼠均腹

腔注射LPS 1次(5mg.kg-l.d-l )复制ALI动物模型;NS组以同样方式

于腹腔内注射等体积的生理盐水。按无菌操作要求,收集NS组大鼠新鲜

粪便,并用灭菌烧杯称取l〇g,加入37°C无菌生理盐水50mL搅拌,用双

层无菌纱布过滤,将再次过滤液以6000 r/min的速率离心15min,将沉淀

再悬浮于50mL生理盐水,得粪菌液。LPS+FMT组在腹腔内注射LPS 24h

后以灌胃的方式进行粪菌移植(l〇ml/Kg),每天2次,持续两天。NS组和

LPS组则以同样的方式予以等量生理盐水灌胃。

2.2大鼠的一般情况观察

处死前观察各组大鼠的一般情况、饮食、活动、呼吸频率、死亡情况 等,并抽取大鼠动脉血行动脉血气分析检测动脉氧分压(Pa〇2)。

2.3血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)中ICAM-1的含量检测

抽取大鼠腹主动脉血,以3000 r/rain (离心半径:10 em )离心10

min,取上清液冻存待检。完整解剖出大鼠肺组织,结扎左侧肺叶,用灌 胃针插入气管上端灌洗右肺,以lmL生理盐水反复冲洗3遍,离心取 上清液冻存待检。按ELISA试剂盒说明书操作。

ELISA具体步骤

取出-70°C冰箱冻存的血清、BALF上清液标本,首先置于2-8QC进行 解冻,后置于室温条件下1小时,再根据ICAM-1试剂盒说明书步骤检测 大鼠血清、BALF中ICAM-1的浓度:

配制标准品:首先用无菌生理盐水将标准品配制好,然后设标准品孔10 孔于酶标包被板上,浓度设置分别为36ng/L,24ng/L,12ng/L,6ng/L,3ng/L 的5支标准管,以及2支样品和1支空白管。于一孔和二孔中分别加入标 准品100W、标准品稀释液50W,然后混匀后分别于一孔和二孔中各取

100以,再分别加入到三孔、四孔,再各自分别加标准品稀释液50以,混匀; 如上述反复操作至第10孔。

  • 加样:将酶标包被板取出,分别设置空白对照孔,和待测样品孔,每 一组样品需备2个复孔。向己包被了 ICAM-1单抗的酶标板中待测样品孔 中先加样品稀释液40|il,然后再加10|il待测样品,空白孔不加样品及酶标 试剂,加样时尽量不触及孔壁,轻轻摇晃混匀。
  • 温育:为保证密闭性,使用封板膜封闭边缘,然后置于37W温育30 分钟。
  • 洗板:在温育结束后,将板内的液体弃去、甩干,然后每孔加满洗涤 液清洗5次,静置30秒后弃去废液,拍干。
  • 加酶:向每孔内加入己稀释好的生物素标记ICAM-1二抗酶标试剂 50卟空白孔除外。然后将酶标板轻轻摇晃,用封闭板膜封闭,37T孵育 30分钟。
  • 洗涤:上述操作结束后弃去液体并甩干,然后再向每孔加满洗涤液反 复清洗5次。
  • 显色:洗涤后先后向每孔分别加入显色剂A50|iil、显色剂B50|iil,混匀,在避光、37°C条件下显色15分钟。
  • 终止:在显色后向每孔分别加入终止液50W,此时孔内液体出现蓝 色转变为黄色。
  • 测定:用空白孔组调零酶标仪,在450nm波长处分别测量各孔的吸 光度(OD值)。终止液加入后15分钟以内即开始测定。标准曲线的制作 参照标准品的浓度及对应的OD值,再根据样品的OD值换算出对应的样 品浓度。

2.4肺大体观察及肺湿/干重比值(W/D )

将大鼠充分麻醉后处死,解剖胸腔,取出肺组织,观察肺组织有无充血、 渗血、肿胀、坏死灶;取左肺,用滤纸吸干表面附着水分,用天平秤测量 左肺得到肺湿重(W),将肺组织置于80W烤箱内烘烤72小时至组织完全 脱水,再次用天平秤称量右肺组织得到肺干重(D),计算肺湿/干重(W/D) 比值,评价肺组织含水量。

2.5肺组织HE染色

  • 取材,固定:处死大鼠后开胸取右肺下叶,放入生理盐水中洗净血溃, 用4%多聚甲醛液固定组织,使其中的蛋白质变性、凝固,目的是为了防 止细菌的分解或者是细胞死后的自溶,从而能够使细胞保持本来的形态结 构。
  • 脱水和透明:在肺组织成功固定后,按其适当大小进行修剪,之后放 入包埋盒中,使用流水进行冲洗30分钟(目的是使组织中的固定液去除)。 然后将冲洗干净的标本依次置于不同浓度的梯度酒精中脱水,脱水剂为低 浓度到高浓度的酒精,使肺组织块中的水份逐步脱去。再将脱水后的肺组 织块置于无水酒精与二甲苯溶液(其比例为1:1)中2分钟,再置于二甲苯 115分钟,最后二甲苯II 15分钟,共计32分钟替换出组织块的中酒精, 然后进行下一步。
  • 浸蜡和包埋:肺组织块经透明后放在己溶化的石蜡液中,并将其放入 溶蜡箱进行保温。待肺组织块被石蜡完全浸入后,放入己倒有融化的石蜡 液的包埋框中进行包埋,待肺组织冷却凝固成块、变硬后方可切片。
  • 切片和展片:使用轮转式切片机将包埋好的蜡块逐一切成5微米厚薄 的蜡片,在加热的水中将切下的蜡片水浴烫平,然后取出蜡片展平后再贴

到载玻片上,置于温度为45W恒温箱中烘干。

  • 脱蜡:染色前,将切片置于二甲苯I,二甲苯II中分别10分钟,共计20分钟以脱去切片中的石蜡。
  • 水化:使用不同浓度梯度的酒精,将切片分别放入高浓度到低浓度酒 精:100%酒精、95%酒精、80%酒精,各10分钟,然后用自来水洗1分钟, 最后用蒸馏水洗1分钟。
  • 染色:将水化后的切片放入苏木素中染色5分钟,然后用自来水洗1 分钟,放入1%盐酸酒精分化10秒,再使用蒸馏水水洗1分钟。使用伊红 染色液染色5分钟后用蒸馏水水洗1分钟。
  • 不同浓度酒精脱水:将切片分别置于80%酒精浸泡10秒、95%酒精 中浸泡10秒,无水乙醇中浸泡5分钟。
  • 透明:将切片分别置于二甲苯I中浸泡10分钟,二甲苯II中浸泡10 分钟。
  • 封片:将己透明的切片滴上树胶,盖上盖玻片封固。待树胶略干后, 贴上标签。

分别将各组切片置于光镜下观察肺组织病理学改变,根据Mikawa等[12] 的方法,按照病理切片在光镜下肺泡有无充血、有无出血,有无肺泡间隔 增厚,有无间隙或血管壁中性粒细胞浸润聚集,或者是有无透明膜形成等 指标对每个标本的肺损伤进行评分。其损伤的严重程度按如下分值评分:0 分表示无损伤;1分表示轻度损伤;2分表示中度损伤;3分表示重度损伤; 4分即为极重度损伤。五个高倍区域被随机选择,按5个级别的病变分数, 根据每项指标病变的轻重进行半定量分析,以各项评分的总和平均值为每 个样本的肺损伤病理评分。

2.6肺组织免疫组化染色

  • 石蜡切片脱蜡至水,室温放置30分钟后,入-20W丙酮中固定10分钟以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟;
  • 3%过氧化氢室温孵育5-10分钟;
  • 使用PBS冲洗2次,每次5分钟;
  • 染色:①加入1-3滴的兔血清工作液(试剂1,无色液体),37W或 者室温孵育10-30分钟,倾去血清后勿洗;©再快速加入1-3滴比例适当 的封闭血清稀释的一抗抗体,室温或者37W孵育1-2小时或4小时过夜;

③PBS液冲洗,5分钟3次;④滴加1-3滴生物素化二抗工作液(试剂2 ), 室温孵育10-30分钟;⑤PBS液冲洗,5分钟3次;⑥滴加1-3滴试剂3, 室温孵育10-30分钟;⑦PBS液冲洗,5分钟3次;⑧滴加1-3滴显色剂 (DAB,5-20分钟)显色;⑨自来水反复冲洗、复染、封片。

分别将各组切片置于光镜下进行观察。在显微镜下通过放大10X10倍 后的图像再进行摄取,将摄取的图像分别输入图象分析系统Image Pro Plus6.0(Media Cybernetics公司)内,首先对图象进行一个灰度变换,使染 色的阳性区域和背景明显区分开,采用软件系统进行自动测量阳性面积、 积分光密度,并算出平均光密度(OD值),进行半定量分析处理。进行观 察的每张切片分别随机取采取3个视野(每个视野区域内至少包括一个肺 血管)。最后取其均值为OD值,表示ICAM-1、NF-kB p-P65的相对表达 量。

2.7 WesternBlot 检测 p-PI3K、p-AKT 蛋白表达量

  • 样品制作:取大鼠右肺组织在冰上剪碎,后在液氮中研磨成粉,后取研 磨后的组织100mg加入适量全细胞RIPA裂解液lml(含10%PMSF蛋白酶 抑制剂),混匀,将离心管置于"C医用冷藏内旋转混合器上过夜。过夜后 取出离心管,置于冰上保持低温环境,用超声波细胞破碎仪将管内液体超 声6次,每次5秒。在4°C恒温超速离心机中12000转离心15分钟。取上 清液后,转移到新的无菌EP管中,BCA法测定蛋白浓度,用Thermo Scientific全波长扫描式多功能读数仪于波长562nm处检测OD值,以OD 值作纵坐标,以标准蛋白质溶液浓度作横坐标,绘出标准曲线。样品的蛋 白浓度就是根据样品的OD值计算得出,然后调整蛋白浓度。将适量的上 清液加入5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液,上样缓冲液与上清液比列为1:4, 盖紧管盖,震荡混匀,加热煮沸10分钟,使蛋白完全变性,冰上迅速冷却, 放于-20W冰箱中冻存备用。
  • 制胶(SDS-PAGE凝胶):先将洗净而且干燥的两块玻璃板底端对齐, 尔后安放在灌胶支架上,组装好制胶器。再将配置好的10%浓度的分离胶

(双蒸水 1.3ml; 30%Acr-Bis:1.7mh lMTris,PH8.8:1.9ml; 10%SDS: 50ul; 10%APS:50ul; TEMED: 2ul)缓慢注入玻璃,防止产生气泡。灌好胶后, 使用95%无水乙醇压平胶面,观察有无渗漏。静置一段时间,待分离胶聚 合后,弃去上层无水乙醇,并用吸水纸吸干。再往上层加入事先配置好的 5%浓度的浓缩胶(双蒸水 1.4ml;30%Acr-Bis:0.33ml; lMTris,PH8.8:0.25ml; 10%SDS: 20ul; 10%APS:20ul; TEMED: 2ul),混匀后缓慢灌入胶槽,然 后缓慢插上梳子,注意不要产生气泡。静置下,等到浓缩胶聚合后,再慢 慢拔出梳子,再使用双蒸水冲洗胶孔。

  • 上样与电泳:安装好电泳槽,注意避免槽内缓冲液漏出,后将足量电 泳缓冲液加入电泳槽内,将分别吸取对照组l〇ul、模型组12ul、干预组8ul 体积的样品蛋白,以及3ul蛋白Marker,缓慢加入胶孔内,盖上电泳槽盖 子,打开电源,将浓缩胶恒压调整为80V,30min,待Marker分禹出来后, 改电压调整为120V,60 min,进行蛋白分离,直至目的蛋白条带到达分离 胶底部。
  • 转膜:电泳结束后,用塑料取胶器撬出小玻璃,再根据Marker提示, 将分子大小为37KDa的GADPH蛋白的浓缩胶切下,然后放在转膜缓冲液 中浸泡10分钟。将依据凝胶大小剪下的PVDF膜放入甲醇中浸泡10秒, 然后放入转膜缓冲液中浸泡。将转印滤纸、海绵垫、凝胶均放在转膜缓冲 液中平衡浸泡备用。然后按三明治夹心法:负极(黑)-海绵垫-3层印迹滤 纸-凝胶-PVDF膜-3层印迹滤纸-海绵垫-正极(红),固定好后,放入转移

槽,添加电泳缓冲液,盖上盖子,开启电泳仪,米用恒流(300mA,持续 60分钟)。

  • 染膜:取出转膜夹子,打开夹子,使用平头镊子夹取PVDF膜,放于 1%的丽春红中进行染色,观察条带变化。若成功转膜,即可出现整齐清晰 的红色条带,方可进行下一步操作。将膜取出后置于TBST缓冲液的平皿 中,将染在膜上的丽春红洗去。
  • 封闭:转膜完毕后,立即把印迹后的PVDF膜放置到5%脱脂牛奶溶 液中,室温,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。
  • —抗孵育:用TBST溶液冲洗取出的PVDF膜3次,每次冲洗5分钟。 分别将按一定比例稀释好的一抗溶液兔抗大鼠PI3K (1:1000) —抗,兔抗 大鼠p-PI3K(l:500)—抗,兔抗大鼠AKT(1:2000)—抗,兔抗大鼠p-AKT

(1:1000) —抗,GADPH (1:10000) —抗,和 PVDF 膜封入孵育盒内,4°C 过夜。

  • 二抗孵育:一抗孵育完毕之后,即次日取出PVDF膜,在摇床上用 TBST洗膜3次,每次5分钟,立即向孵育盒内加入按一定比例稀释好的二抗(羊抗兔二抗),室温在摇床上缓慢摇动孵育1小时。然后取用TBST 于室温下脱色,在摇床上洗5次,每次5分钟。
  • 蛋白检测:使用X光片自动洗片机器,将洗出的胶片进行扫描,存 放于电脑,然后使用凝胶图象处理系统,经过系统处理图片上的特异条带 灰度值,而得到数字,然后再分析目标条带与内参条带的净光密度值,以 及它们之间的比值,并进行半定量分析处理。

2.8肠道菌群测序

处死大鼠前,收集大鼠大便放入冻存管进行冻存,根据实验需要提取 粪便样品DNA,采用Qiagen公司的基因组抽提试剂盒,对两组粪便样本 的基因组进行抽提,然后对16SrDNAV3、V4区进行扩增,并进行DNA纯

化,最后行MiSeq宏基因组测序并行统计分析。

2.9统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件将各组数据进行统计学分析,所有定量数据 均使用均数±标准差(&±S)形式表示。多组间比较应用单因素方差分析; 组间两两比较时,方差齐时采用LSD法;P<0.05为结果具有统计学意义的 标准。

结 果

1 ALI模型制备成功

通过观察肺组织病理学改变、肺的W/D比值、动脉血氧分压(Pa02)
等表明大鼠的ALI模型建立成功。并且FMT对ALI大鼠肺组织有改善作用。

1.1大鼠的一般状态变化

对照组的大鼠一般情况良好,腹腔注射生理盐水后能正常饮食,呼吸频 率平稳(50-60次/分),活动灵活,对光、声等外界的刺激反应灵敏,无脱 毛、暗淡等的表现;而同时间的模型组和干预组大鼠腹腔注射LPS后较少 饮食,呼吸频率增快(95-115次/分),活动明显减少,对外界刺激反应迟 钝,皮毛暗淡无光。干预组经FMT后,较模型组大鼠的饮食、活动、对光、 声等刺激反应明显好转,呼吸频率减慢(74-86次/分)。

1.2肺组织肉眼观察

大鼠肺组织的肉眼观察:对照组的大鼠肺组织呈现浅粉红色,其表面 非常光滑,包膜也完整,触摸感觉柔软,弹性表现良好,未见有充血、水 肿以及坏死灶的改变(图1A)。而模型组可见大鼠的肺组织色泽出现发暗, 有瘀斑,有充血、水肿,有坏死灶,体积明显増大,包膜下有片状出血, 切面可见淡红色的液体溢出,并出现肺不张改变(图1B)。干预组可见大 鼠肺组织色泽有所恢复,瘀斑范围减小,充血和水肿程度明显减轻(图1C)。

图一:大鼠肺组织肉眼观察

A:对照组;                     B:模型组;                              C:干预组

Figure 1: macroscopic observation of rat lung tissue A: control group; B: model group ;C: intervention group

1.3肺组织病理学观察和评分

常对照组大鼠肺组织高倍镜下见肺泡结构完整,间隔较窄,肺泡壁 较薄,肺间质及肺泡腔无充血、水肿、出血,无炎性细胞浸润(图二A)。 模型组肺组织高倍镜下见肺泡壁及肺泡间隔增厚,肺泡结构不完整,肺间 质毛细血管明显扩张、有充血、有水肿,部分出现肺泡间隔断裂,肺间质 和肺泡腔内可见渗出大量的液体,并有大量中性粒细胞浸润,部分肺组织 出现实变(图二B)。干预组肺损伤程度明显减轻,肺泡出血、PMN浸润 减少(图二C)。与对照组比较,模型组的肺组织病理评分有明显增高, 干预组肺组织病理评分也有增高,但与模型组相比,其增高的幅度不明显, 差异具有统计学意义(P<〇.〇5),见表1。

ABC

图二:大鼠肺组织病理改变

A:对照组(HEx400); B:模型组(HEx400); C:干预组(HEx400)

Figure 2: pathological changes of rat lung tissue A: control group (HE 400);B: model group (HE 400);C: intervention group (HE 400)

1.4肺湿/干重(W/D)比值

与对照组相比,模型组肺组织W/D比值明显增高,干预组肺组织W/D 比值增高,但增高的幅度没有模型组明显,差异有统计学意义(P<0.05), 见表1。

1.5动脉血氧分压(Pa〇2)

与对照组大鼠相比,模型组大鼠的Pa〇2和干预组大鼠的Pa〇2均有下 降,但干预组大鼠的Pa〇2下降的幅度没有模型组明显,其差异具有统计学 意义(P<〇. 〇5)(见表1)。

表1各组大鼠肺组织病理学评分、(W/D)、Pa〇2比较(又±S)

Table 1 Comparison of lung tissue pathology score ,(W/D),and Pa〇2 in rats of each

group,' ( X士S)

组别 只数 病理学评分(分) 肺W/D Pa〇2 (mmHg)
对照组 5 1.04 士 0.38 1.74 士 0.73 95.2 士 2.77
模型组 5 10.4 士 1.46a 3.4 士 0.91a 79.2 士 5.89a
干预组 5 5.28 士 0.94ab 2.11 士 0.81b 88.0 士 3.53ab

注:W/D为湿/干重比值,与对照组比较,aP<0. 05,与模型组比较,bP <0. 05

Note: W/D is the wet/dry weight ratio, compared with the control group, aP < 0.05, compared with the model group, hP < 0.05

2各组大鼠粪便样本经检测肠道菌群结果

2.1对检测的原始数据进行整理和质量评估

对检测到的原始数据进行分类整理,然后做质量评估,第一步需要去 除引物的接头序列(TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC)。第二步则 将成对的reads拼接成为一条序歹lj,拼接时需要根据PE reads之间的overlap 关系来完成。第三步是从融合后的数据中分割出各样本的数据,需要参照 各样本的barcode序列。第四步去除各样本中在20以下的碱基,并切除reads 中含有N部分的序列以及长度阈值为200bp的短序列。第五步是过滤低复 杂度的序列,从而获得最终能用于分析的序列。本实验送检的14个粪便样 本经检测后所含总有效序列为764278条,优质序列数为744061条。各样 本序列数如表所示,见表2。

表2大鼠粪便菌群V3、V4区16SrDNA序列数

Table 2 Number of 16SrDNA sequences in V3 and V4 regions of fecal flora of rats

样品编号 总有效序列 优质序列 样品编号 总有效序列 优质序列
A1 36913 35772 A2 39816 38320
A3 74782 72674 A4 36221 35377
A5 73510 71560 B1 72612 70673
B2 78450 76704 B3 39174 38355
B4 83862 81779 B5 39973 38716
Cl 39857 38569 C2 74705 72916
C3 38068 37163 C4 36335 35483

注:A1-A5为对照组样品编号;B1-B5为模型组样品编号;C1-C4为干预组样品编号 Note: A1-A5 is the control group sample number;Bl-B5 is the sample number of the model group;Cl-C4 was the sample number of the intervention group

2.2优质序列长度分布

如图三所示,可见优质序列多分布在430bp附近区域。

图三:优质序列分布长度
Figure 3: Distribution length of high-quality sequence

  • OTU的产出及单样品的物种分布

在OTU聚类结果的条件下,获取OTU聚类中的有代表性的序列,一 般情况下,我们选择作为OTU的代表性序列是丰度最高的序列,进行各类 的OTU分析。同时在大于5个样本的时候,会去除只对应一条reads的 OTU。在本实验中,我们送检的粪便样本总共分析出了 15门,20纲,30 目,48科,50属。在OTU产出后,分别统计出各个样品中含有OTU的 情况及每个OTU中含有序列的数目,最后结果如维恩图(图四)所示。正 常对照组大鼠粪便含有1213个OTU;模型组大鼠粪便含有1303个OTU; 干预组大鼠粪便含有1207个OTU;三组共有593个OTU,共有的OTU 所占百分比的比例为31.6%;三组总的丰富度为1873个OTU。

图四:操作分类单元列表生成图 A、对照组;B、模型组;C、干预组

Figure 4: Generating a graph by manipulating the taxon list A、The control group; B、The model group;C、The Intervention group在门水平,所送检粪便样本共检测出15个门类,其中存在于大鼠肠 道中的主要菌群为厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),放 线菌门(Actinobacteria),还包括变形杆菌门(Proteobacteria),暂定种聚 糖菌门(CandidatusSaccharibacteria),疵微菌门(Verrucomicrobia),柔膜 菌门(Tenericutes),消化螺杆菌门(Nitrospirae),迷踪菌门(Elusimicrobia), 未分类菌门(unclassified ),脱铁杆菌门(Deferribacteres),浮霉菌门 (Planctomycetes),绿弯菌门(Chloroflexi),黏胶球形菌门(Lentisphaerae),芽 孢单菌门(Gemmatimonadetes)等。而厚壁菌门在对照组、模型组和干预 组所占百分比分别为63.87%、61.85%与75.45%;拟杆菌所占百分比分别 为31.12%、35.33%与18.08%;放线菌门所占百分比分别为3.32%、1.47% 与2.49%。见图五。

图五:对照组、模型组与干预组样本在门水平微生物分布 A、           对照组;B、模型组;C、干预组

Figure 5: Distribution of microorganism at phylum level in control group, model group and intervention groupA、The control group; B、The model group;C、The Intervention group

在属水平,所送检大鼠粪便样本共检测出50个具体种属,包括乳酸杆 菌属(Lactobacillaceae)、颤杆菌属(Oscillibacter)、未分类菌属(unclassified)、 梭菌属(Clostridium XlVa)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)等。其中乳酸 杆菌属(Lactobacillaceae)、未分类属(unclassified)分布最多。乳酸杆菌 属在对照组、模型组与干预组所占百分比分别为36.23%、30.64%与45.9%, 未分类菌属分别占25.95%、34.06%与24.5%。正常组、模型组与干预组中 肠道菌群分类及分布均存在明显不同,见图六。

图六:对照组、模型组与干预组在属水平微生物分布
A、对照组;B、模型组;C、干预组

Figure 6: Microbial distribution at genus level in control group, model group and intervention group

A、The control group; B、The model group;C、The Intervention group

  • Alpha多样性分析

与对照组比,模型组的多样性指数、丰富度指数均明显升高,但差异 无统计学意义(^0.05);与模型组比,干预组的多样性指数、丰富度指数 均明显降低,但差异无统计学意义(尸>0.05);覆盖率指数均在0.99上, 说明所构建文库的库容足够大,能代表所研宄动物肠道菌群中绝大多数细

菌,见表3。多样性指数包括Chaol/ACE指数(图七)、Shannon指数(图 八)、Simpson指数(图八)。

组别 Shannon Simpson Chao ACE Coverage
对照组 3.30 0.13 682.38 779.61 0.99
模型组 3.63 0.09 768.67 829.88 0.99
干预组 3.22 0.13 684.01 757.26 0.99
表3对照组、模型组与干预组菌群Alpha多样性分析 Table 3 Analysis of the Alpha diversity of bacteria in the control group, model group and intervention group
注:Shannon/Simpson:多样性指数;Chaol/ACE:丰富度指数;Coverage:覆盖率指数Note: Shannon/Simpson: diversity index;Chao 1/ACE: richness index;Coverage: the Coverage index

Chao diversity Plot

图七:大鼠大便菌群丰富度指数(Chaol/ACE)分析 A、 对照组;B、模型组;C、干预组 Figure 7: Analysis of fecal flora richness index (Chaol/ACE) in rats A、The control group; B、The model group;C> The Intervention group

图八:大鼠大便菌群多样性指数(Shannon/Simpson)分析 A、 对照组;B、模型组;C、干预组 Figure 8: Analysis of the diversity index of fecal flora in rats (Shannon/Simpson)

A、The control group; B、The model group;C、The Intervention group

  • p多样性分析

送检样本得出对照组、模型组与干预组是相对独立的。蓝色圆形表示对 照组大鼠粪便样本,黄色方形表示模型组大鼠粪便样本,绿色菱形表示干 预组大鼠粪便样本,由图可知LPS因素对模型组、FMT因素对干预组菌群 是有影响的,但具体影响机制尚不明确(见图九)。

-03      -02 -0.1     0.0 Of 0-2PCoA1(15t2%)

图九:大鼠大便菌群微生物多样性分析 A、对照组;B、模型组;C、干预组

Figure 9: Microbial diversity analysis of rat fecal flora A、The control group; B、The model group;C、The Intervention group

2.6物种丰度差异分析

基于PICRUSt功能二级分类结果,比较样本或组间丰度差异,找出样 本或组间丰度存在显著差异的功能分类,默认筛选条件为P$0.05。当比较 对象为样本时,采用fisher exact test;当比较对象为组时,采用Welch’s t-test。 最后将检验得到的pvalue值采用FDR做Multiple test correction得到qvalue值。

2.6.1 门水平:

在门水平,对照组明显多于模型组的门类有7个,包括厚壁菌门、放线 菌门、疣微菌门等,模型组多于对照组的门类有8个,包括拟杆菌门、变 形菌门、绿弯菌门、暂定种聚糖菌门等。结果表明模型组肠道内常见菌群 中厚壁杆菌门、放线菌门、疣微菌门减少,而拟杆菌门、变形杆菌门有增 多趋势,但其中仅放线菌门的比较,P值<0.05,差异具有统计学意义。

与干预组相比,对照组明显增多的门类有7个,包括脱铁杆菌门、 Crenarchaeota、拟杆菌门等,模型组明显增多的门类仅有3个,包括脱铁 杆菌门、拟杆菌门、浮霉菌门等,干预组多于对照组的门类有9个,包括 厚壁菌门、柔膜菌门、绿弯菌门等,干预组多于模型组的门类有12个,包 括厚壁菌门、广古菌门、绿弯菌门、未分类菌门等,结果表明干预组肠道 内常见菌群中厚壁菌门等又恢复,但差异无统计学意义,仅未分类菌门的 比较,尸值<0.05,差异具有统计学意义(见图十)。

图十:在门水平物种丰度差异比较的误差线图 A、对照组;B、模型组;C、干预组

左图所示为不同功能丰度在两个样品(组)中的丰度比例,中间所示为95%置信度区间 内,功能丰度丰度的差异比例,最右边的值为P值,P值<0.05,表示差异显著,功能 丰度用红色标识。

Figure 10: Error plot for comparison of species abundance differences at phylum level The control group; B> The model group;C> The Intervention group The left figure shows the abundance ratio of different functional abundances in the two samples (groups), and the difference ratio of functional abundances in the 95% confidence interval is shown in the

middle. The value on the far right is p value, p value < 0.05 indicates significant difference,and the functional abundances are marked in red.

2.6.2 属水平:

属水平,对照组多于模型组的种属有5个,包括Corynebacterium、 Coprobacter、Asaccharobacter、Parvibacter 等。其中具有显著差异的种属为 Asaccharobacter,差异具有统计学意义,P<0.05 (尸=0.013);模型组明显多 于对照组的种属有20个,包括Bifidobacterium、 Butyricimonas、 Allobaculum等。其中具有显著差异的种属为Allobaculum,差异具有统计学意义,P<0.05 (P=0.027)。与干预组相比,对照组明显增多的种属有16 个,模型组明显增多的种属有18个,包括Bamesiella、Delftia、Psychrobacter

模型组;C、干预组

左图所示为不同功能丰度在两个样品(组)中的丰度比例,中间所示为95%置信度区间 内,功能丰度丰度的差异比例,最右边的值为P值,P值<0.05,表示差异显著,功 能丰度用红色标识。

Figure 11: Error plot for comparison of species abundance differences at the genus level A> The control group; B> The model group;C> The Intervention group The left figure shows the abundance ratio of different functional abundances in the two samples (groups), and the difference ratio of functional abundances in the 95% confidence interval is shown in the

middle. The value on the far right is p value, p value < 0.05 indicates significant difference, and the functional abundances are marked in red.

3 FMT对ALI大鼠肺组织的影响 3.1 Western Blot 分析

与对照组相比,模型组中p-PI3K、p-AKT表达量上调,与模型组比较, 干预组中P-PI3K、p-AKT表达量明显下调。见表4、图十二。

组别 只数 P-PI3K p-AKT
对照组 5 0.036士 0.013 0.109 士 0.016
模型组 5 0.265士 0.03a 〇_444士 0.04a
干预组 5 0.090士0• 013ab 0.206±0. 018ab
表4粪菌移植对急性肺损伤大鼠肺组织中p-PI3K、p-AKT表达量的影响(X±S) Table 4 Fecal bacteria transplantation on acute lung injury in rat lung tissue P - PI3K, the influence of P - AKT expression quantity . ( X士S)

图十三:大鼠肺组织免疫组化NF-kB p-P65的变化 A:对照组 24h (SPx400); B:模型组 24h (SPx400); C:干预组 24h (SPx400) Figure 13 Immunohistochemical changes of NF-kB p-P65 in rat lung tissue A:The control group 24h (SPX 400);B: The model group 24h (SP X400);C: The intervention group 24h (SPX400)

表5粪菌移植对急性肺损伤大鼠肺组织中NF-kB p-P65含量的影响(又士S)

Table 5 Effects of fecal bacteria transplantation on NF-kB p-P65 content in rat lung tissue after acute lung injury ( X士S)

组别 只数 NF-kB核表达
对照组 5 0.022 士 0.006
模型组 5 0.130±0.034a
对照组 5 0.039士0.007ab
注:与对照组比较,? <0. 05, 与模型组比较,¥<0. 05

 

Note: Compared with the control group, aP < 0.05, compared with the model group, bP < 0.05

3.3 ICAM-1表达的变化

对照组血清、BALF中的含量及肺泡上皮细胞膜ICAM-1表达的变化为 [(7.4士0.32)ng/L、(0.739士0.079) ng/L、(0.076士0.010)];模型组为[(8.64士0.87) ng/L、(0.941 士0.035) ng/L、(0.250士0.010) ],ICAM-1 表达均显著上调, 高于对照组(P <0. 01);干预组为[(7.4钍0.46) ng/L、(0.83钍0.〇4〇) ng/L、

(0.173士0.030)],与模型组相比,ICAM-1表达均显著下调(P<0. 05)(见 表6)〇

表6各组大鼠ICAM-1在血清、BALF中含量、肺泡上皮细胞膜表达情况(又±S) Table 6 The content of ICAM-1 in serum, BALF and the expression of alveolar epithelial cell membrane in each group ( X士S )

组别 只数 血清(ng/L) BALF (ng/L) ICAM-1膜表达
对照组 5 7.40士 0.32 0.739士 0.079 0.076士 0.010
模型组 5 8.64士 0.87a 0.941 士0.035a 0.250士 0.010a
对照组 5 7.44士 0.46ab 0.834土0.040ab 0.173 士0.030ab

注:与对照组比较,aP<0. 05,与模型组比较,bP <0. 05 Note: Compared with the control group, aP < 0.05, compared with the model group, hP <图十四:各组大鼠肺组织ICAM-1在肺泡上皮细胞膜表达的免疫组化检测结果 A:对照组 24h (SPx400); B:模型组 24h (SPx400); C:干预组 24h (SPx400)

Figure 14 Immunohistochemical detection of ICAM-1 expression in alveolar epithelial cell membrane of rat lung tissues in each group

A:The control group 24h (SPX 400);B: The model group 24h (SP X400);C: The intervention group 24h (SPX400)

讨论

1 LPS诱导ALI大鼠模型的建立

ALI是一种严重的弥漫性肺疾病,是由于各种因素,直接或间接的导 致弥漫性肺泡-毛细血管膜损伤,是临床中较为常见的病症类型,目前,它 的发病机制仍不清楚,治疗效果欠佳[2()'21],其发病率及致死率仍高,但 Wang等[22]研宄发现,早期肺损伤是可逆的。而近几年相关研宄发现, ALI特征之一是过度肺部炎症^,在机体受到内、外源性打击后,多种效 应细胞和炎症介质参与是其发病的关键环节。当体内出现系统性炎症反应 综合征(SIRS)或代偿性抗炎症反应综合征(CARS)平衡失调,以炎症 和肺水肿为主要病理表现。LPS是革兰阴性(G-)菌外膜的主要组成部分,是 引起休克和炎症反应的关键性介质之一。当LPS进入动物或者是人体内, 可使在肺组织中的白细胞、巨噬细胞聚集,组织蛋白渗出,最终使血管内 皮细胞和肺泡上皮细胞引起强烈免疫和炎症反应,诱导肺损伤[23],是实验 研宄ALI的经典模型。目前广泛采用LPS大鼠尾静脉静脉注射的方式复制 ALI和ARDS动物模型[24],由此可迅速出现肺组织水肿、渗出以及急性炎症 反应,导致低氧血症,动物会在短期内因呼吸衰竭而死亡。本实验给大鼠 腹腔注射LPS,观察大鼠的一般状态、肺组织肉眼观和病理学改变、肺损 伤评分、肺组织的W/D比值、Pa02等,发现模型组大鼠的一般状态变差、 肺组织炎症反应明显、肺水肿严重、Pa〇2下降等表明大鼠的ALI模型成功 建立。关于实验动物的选择,既往用来模拟肺损伤实验的动物有家兔、大 鼠、小鼠、山羊、狗等,其中大鼠易饲养、生长繁殖迅速、成本低、体型大小合适、给药方便及采样容易,故本实验结合大鼠的这些优点而选用了 SD大鼠作为此次实验研宄模型。

通过该实验研宄,与对照组相比较,发现模型组大鼠所检测的动脉血 氧分压、肺湿干重比值、肺组织病理学改变和肺损伤评分等各指标均有显 著差异,并且存在统计学意义。由于持续性低氧血症是ALI发生时的主要 临床症状表现,因为肺实质和肺间质水肿、通气/血流比例失调,出现肺的 换气功能障碍,表现为Pa02降低,故可以通过Pa02来评价肺气体交换功能 的客观依据,是评估肺损伤轻重的指标之一。在本实验中,模型组在干预 后24小时所检查的动脉血气分析中的氧分压提示较对照组均有明显下降, 考虑是在LPS作用下,肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞受损后出现肺换 气功能障碍相关。而肺泡上皮和肺内毛细血管的通透性增高,使肺内液体 的渗出和回吸收都无法正常进行,从而导致液体在血管外潴留产生水肿, 与此同时,由于异常增高的通透性,所产生的炎症介质、炎症细胞也一起 渗入到血管外,并产生一系列微血管的变化,进一步引起炎症反应。在炎 性细胞和内皮细胞的相互作用下,使微血管的屏障损坏,进一步导致通透 性异常,引起出血和损伤。病理改变表现为肺间隔增宽、肺间质和肺泡充 血、水肿、出血、炎性细胞浸润等。肺湿干重的比值代表了肺的含水量值, 可以代表肺水肿轻重的指标,故其比值高低可用来评价大鼠急性肺损伤的 严重程度。在该实验中模型组的肺组织出现了充血、水肿、炎性细胞浸润 等损害,肺损伤评分也明显升高,肺组织的湿干重比值亦明显升高,这些 均提示肺内炎症反应剧烈,其病理生理变化是符合ALI的,提示腹腔注射 LPS诱导大鼠ALI的模型建立成功。

2肠道微生态失衡对肺的影响

人体最大的细菌及内毒素存库即是人们的肠道,定植在人体肠道中的种 类繁多、数量庞大的微生物就统称为肠道菌群,它的总数高达lxlO4,是 我们人体细胞总数的10倍左右[25]。在如此众多微生物之中,细菌是占据主 要地位的,其总量可占微生物总数的99%以上。而这肠道不仅是人体内最 大的内毒素存库,而且是触发人体全身炎症介质释放的一个启动器。目前 肠道菌群被认为是人类后天获得的一种重要器官,这源于肠道的屏障功能, 分别包括了强大的免疫、机械和生物屏障功能,对肠道细菌和内毒素的移 位可以进行有效阻止,故对肠源性感染的防治发挥了重要意义。在正常情 况下,肠黏膜的完整性对肠道中内毒素、细菌起到屏障作用,使这些大量 的有害物质被限制在肠道中,而不能产生移位进入机体的其他部位。若在 病理情况下,如感染、创伤等的应激状态,会减弱肠道的屏障功能,此时, 屏障破坏后使大量的内毒素、细菌侵入循环,发生菌群移位,导致肠源性 的内毒素血症,并激发炎症介质产生连锁反应,甚至可能发生多器官功能 障碍综合症(MODS)。其中,最先发生损伤的器官就是肺,故引起ALI的 重要原因之一是肠源性感染,其原因可能与失衡的微生态引起肠道细菌移 位相关,主要表现为穿过肠道黏膜层的细菌,移位到固有层继而到达肠系 膜的淋巴结或更远处的器官,导致炎症介质的大量释放[26]。这使我们更加 关注调整肠道功能在ALI防治中的作用。研宄表明,当机体暴露于感染、 创伤、休克等致病因素发生ALI时,肺泡上皮细胞受损,上皮屏障崩溃促 使体液聚集于肺实质和肺间质[1127],前炎症细胞因子的大量释放,促进细 胞自噬和细胞凋亡,募集中性粒细胞浸润,瀑布式启动炎症信号通路,最终导致弥漫性肺损伤。

近年来,大量证据证实肠道微生物通过“肠-肺轴”影响呼吸道疾病病理 和免疫功能(gut-lung axis)”[1316]。有研宄发现,失衡的肠道菌群微生态在肠 道会大量增加革兰氏阴性杆菌的数量,从而肠源性的内毒素释放也会大量 增加,这些内毒素经由下腔静脉随血液循环回到右心房中,再经由肺动脉 和毛细血管的血流灌流到其他各个器官,其中肺脏受内毒素损伤,导致肺 部疾病的发生发展。而当机体由各种原因造成ALI时,对机体而言属于应 激反应,此种情况下机体会发生一串联的病理生理改变,通过损伤肠道的 免疫、机械、化学及生物屏障,从而破坏肠道的屏障功能,肠道菌群失调, 穿过肠粘膜屏障的肠内毒素、细菌及有害物质进入血液循环,导致肠源性 的感染,属于二次打击机体,使原本机体的肺损伤进一步加重,从而形成 恶性循环[23]

3 FMT对ALI大鼠肠道菌群的影响

人体肠道内寄居着数量庞大、种类繁多的微生物,形成肠道微生态稳 态,故肠道是人体最大的细菌及内毒素存库,而肠道微生态失衡与多种肠 内、肠外疾病相关,包括肠道菌群失调、糖尿病和肥胖等[28],肠源性感染 是引起急性肺损伤的重要原因。而我们课题的前期研宄已证实LPS诱导的 大鼠急性肺损伤会导致肠道菌群的紊乱,表现为肠道菌群数量増多、多样 性增加、菌群分布不均一性増加。

在本实验中,通过对模型组大鼠肠道菌群测序,其结果揭示LPS诱导 的ALI大鼠组的肠道菌群出现失调,其改变符合我们的前期研宄,主要表 现为:©在Alpha多样性分析的结果中显示大鼠肠道菌群多样性増加,且 不均一性也増加,菌群结构相比较不稳定,在实验数据中表现为Chaol/ACE 指数和Shannon指数较高及较低的Simpson指数。考虑这可能是与机体发 生ALI后的应激反应有关,从而在肠道菌群中产生菌群的多样性增多,关 于其中多样性增多的具体机制目前尚不清楚。微生物多样性在群落生态学 中的研宄,主要通过单样品的多样性分析(Alpha多样性),其分析结果可 以反映出研宄的微生物群落中的丰度、多样性,而群落的物种丰度和多样 性可以用一系列统计学分析指数来估计。Alpha多样性分析就是衡量样本 物种多样性的一种方式,是指一个特定区域或生态系统内的多样性,通常 采用物种丰富度来度量。通过分别计算以下各指数值:ACE、Chao、 Shannon、Simpson,同时制作所有样品的这些指数的箱形图和稀释性曲线。 再根据各样本的OTU丰度分布情况绘制Rank-abundance曲线,并计算出 常用的多样性指数,包括:覆盖率指数:coverage指数;丰富度指数: Chaol/ACE指数;多样性指数;Shannon/Simpson指数;其中Coverage数 值越高,则表明该样本中的序列没有被测出的概率越低,进而反映了本次 测序结果能代表样本的真实情况;Shannon值越大,Chaol/ACE指数越高, 说明群落菌群的多样性越高、菌群结构反而越不稳定;Simpson指数值越 大,说明群落的菌群多样性越低、菌群结构比较稳定。©在卩多样性结果 分析中,模型组与对照组是相对独立的,对照组样本的个体相似性相对较 高,而模型组内样本各个体对环境异质性的反应差异较大,说明LPS在诱 导ALI后出现的肠道菌群失衡中的菌群组成有所差异,即模型组内肠道菌 群的种类和结构亦有明显差异,表明经LPS诱导ALI后对大鼠的内环境变 化影响不同,模型组内各个体对ALI发生的反应性及耐受性也是大不相同 的。对模型组与正常对照组之间进行主坐标分析PCA,进行PCoA分析 应用加权的散点图来分析。③在物种丰度差异分析结果中显示:与对照组 比较,在门水平,模型组厚壁菌门、放线菌门等减少,而拟杆菌门等有增 多趋势。但差异无统计学意义,考虑和检测样本偏少有关。在属水平,模 型组乳酸杆菌属、Romboutsia菌属等减少,未分类菌属等增多,差异具有 统计学的意义。肠道菌群在门、属水平的减少可能为ALI发生后肠道的应 激反应所导致,这对早期发现ALI的发生可能有重要意义。而在模型组中 目前研究较少的菌属表现为增多的趋势,提示我们对这些不知名的及未分 类的菌属有必要进一步进行深入的研宄。因物种丰度差异是基于物种分类 的结果,通过计算在不同水平上各rank的丰度,根据样本或组间丰度差异 的比较,找出样本或组间丰度存在显著差异的物种分类,一般只针对门和属 的水平,筛选条件为P$〇.〇5。首先对同分类的OTU进行聚类,然后对每 个样品物种丰度进行标准化处理。当比较对象为组时,采用Welch’s t-test。 最后将检验得到的p-value值米用FDR做Multiple test correction得到 q-value 值。

通过FMT后,干预组大鼠肠道菌群测序结果揭示LPS诱导的ALI大 鼠的肠道菌群出现恢复,肠道微生态菌群失衡得到了纠正,主要表现为:©在Alpha多样性分析的结果中显示大鼠肠道菌群多样性减少,且不均一 性也减少,菌群结构相比变得稳定,表现为Chaol/ACE指数和Shannon指 数较低及较高的Simpson指数。考虑这可能是FMT后,重建了新的肠道菌 群,从而使失衡的肠道菌群得以一定的纠正。©在卩多样性结果分析中, 干预组与模型组、对照组是相对独立的,干预组样本个体相似性介于模型组、对照组之间,表明FMT后出现了新的肠道菌群,即干预组、模型组与 对照组之间肠道菌群的种类和结构有明显差异。③在物种丰度差异分析结 果中显示:与模型组比较,在门水平,干预组厚壁菌门、放线菌门、绿弯 菌门等增多,而拟杆菌门等有减少趋势。但差异仍无统计学意义,目前分 析可能与本次检测样本偏少有关。在属水平,干预组乳酸杆菌属、 Romboutsia菌属等明显增多,未分类菌属等减少,差异有统计学意义。肠 道菌群的得以纠正,提示FMT后对机体产生的一部分影响,对研宄ALI 的影响有重要意义。

4微生物与“肠-肺轴”

近年来,大量证据证实肠道微生物通过“肠-肺轴”影响呼吸道疾病病 理和免疫功能(gut-lung axis)[15,29]。正常人体与外界相通的研究表明,当肠 道菌群微生态失衡,释放大量的肠源性内毒素,肺脏受内毒素损伤,导致 肺部疾病的发生发展。而当机体由各种原因造成ALI时,通过损伤肠道屏 障功能(包括化学、机械、免疫和生物屏障),破坏肠道屏障后导致肠道菌 群失调,肠内毒素、细菌及有害物质穿过肠粘膜屏障进入血液循环,引发 肠源性感染,对机体造成二次伤害,肺损伤再次加重,构成恶性循环[23]

5 FMT通过下调PI3K/AKT/NF-KB信号通路影响大鼠ALI的进展

通过FMT重建新的肠道菌群,失衡的肠道菌群得以纠正,从而影响 肠道内外疾病。在本实验中,ALI得以改善,我们又进一步探讨可能存在 的机制,既往相关研宄显示PI3K/AKT/NF-KB信号通路在细胞中普遍存在, 参与调节一系列与ALI相关的生理活动,如细胞凋亡、增值和代谢[17]。同 时PI3K是一种关键信号分子,作为许多生命的活动而言。Ras分子在细胞 因子、生长因子等的诱导下活化或者是酪氨酸磷酸化某些信号分子后,使 PI3K活化而生成相应的肌醇脂物质,在细胞内新生成的肌醇脂物质是新型 第二信使,与白细胞激酶C底物、血小板在胞质内同源结构域的信号分子 结合后对相应分子发挥活性调节作用P'M。近年来,PI3K/AKT信号通路 在炎症中发挥的作用备受关注,它与细胞因子的调控密切相关,在ALI发 病中起重要调节作用。大量研宄证实,AKT是PI3K下游的直接靶蛋白, 被磷酸化后,结合在细胞膜上的AKT即完全激活。NF-kB是一种核转录 因子,能调节体内各种细胞因子、黏附分子和趋化因子,广泛存在于体内 多种细胞,在复杂的细胞因子网络失调中,NF-kB的活化是一个中心环节[13' 在AKT活化后,参与了 NF-kB活性的调节,NF-kB激活后进核, 作为转录因子发挥作用,启动下游的炎症反应,促使产生大量的促炎性细胞 因子,启动多种炎症介质mRNA的表达,进而促进合成与释放细胞因子 TNF-a,诱导粘附因子ICAM-1的表达[515]。ICAM-1属于免疫球蛋白超家 族,是白细胞CD11/CD18系统的配体,存在于许多细胞表面及细胞外基 质,被TNF-a激活后,介导细胞毒性细胞免疫作用,与其配体结合促进T 细胞活化及白细胞从血管内向炎症部位浸润,在肺部炎症级联的激活中起 重要作用。目前大量的实验数据己证实,PI3K/AKT/NF-KB信号通路在LPS 诱导的急性炎症反应中起着重要的抑制作用。在本实验中,大鼠受LPS刺 激后,LPS作用于血管内皮细胞,在内毒素作用下使PI3K活化,在细胞 内生成新的肌醇脂物质,与相应的信号分子结合后,使下游的AKT被磷酸 化后并激活,活化后的AKT促使NF-kB激活后进核,从而启动下游的炎 症反应,促使多种炎症介质表达与细胞因子释放,而诱导ICAM-1表达, 故在模型组的大鼠血清和BALF中检测出较高的ICAM-1含量,ICAM-1 的大量表达,介导炎症细胞与肺血管内皮细胞粘附,损伤肺内皮细胞导致 内皮细胞通透性增加,进一步导致肺组织的损伤,故该组大鼠的肺组织病 理评分高、肺的W/D比值增高、Pa02降低,同步检测的p-PI3K、p-AKT 蛋白表达量、NF-kB的核表达均有明显增高。通过FMT后,肠道菌群结 构发生改变,发现干预组较模型组的p-PI3K、p-AKT蛋白表达量显著减少, NF-kB的核表达亦减少,血清和BALF中的ICAM-1含量明显降低,大鼠 的肺组织病理评分降低、肺的W/D比值降低、Pa〇2升高,提示FMT后, 通过纠正肠道菌群失调,对LPS诱导的大鼠ALI的肺组织有改善作用,具 体的作用机制可能与抑制磷酸化的PI3K、AKT的水平以及NF-kB的核转 位,进一步减少炎症因子ICAM-1的释放相关。

通过前期研宄,我们得到LPS诱导的大鼠ALI会导致肠道菌群的紊乱, 表现为肠道菌群数量増多、多样性增加、菌群分布不均一性増加。而通过 本次研宄,我们发现FMT后的ALI大鼠表现为肠道微生物菌群再次改变 (多样性指数减低,有更多的乳酸杆菌属),而肺损伤减轻,肺W/D比值 降低、肺组织病理评分降低,动脉血氧分压(Pa〇2)升高,伴随着肺组织 NF-kB、P-PI3K及P-AKT表达下调,血清和BALF中ICAM-1降低,这些 发现表明FMT改善了 LPS诱导的大鼠ALI的肺组织炎症,伴随着血清和 BALF中炎症指标ICAM-1的降低和肺组织中PI3K/AKT/NF-KB信号通路 蛋白的减少。

综上所述,FMT通过调控PI3K/AKT/NF-KB通路能对LPS诱导的大鼠ALI

炎症反应起抑制作用,可能与调节肠道中厚壁菌门、拟杆菌门、乳酸杆菌

属等相关,其具体机制可能为上述菌群产生的短链脂肪酸参与抑制PI3K磷 酸化,下调AKT的活化,抑制NF-kB的活化入核,从而进一步减少ICAM-1 等炎症因子的分泌相关,发挥其抗炎修复效应。对于FMT如何调控 PI3K/AKT/NF-KB蛋白及其相关激酶,以及对相关抑炎因子的产生,后续仍 需进一步研宄,但初步研宄已显示出FMT对ALI的改善作用,其来源广, 易于操作,为临床应用提供了实验基础和重要参考。

结论

  1. ALI大鼠存在肠道菌群的失调,大鼠ALI后,肠道菌群表现为厚壁菌 门、放线菌门等减少,乳酸杆菌属等减少,多样性增加,不均一性也增加, 囷群结构不稳定。
  2. FMT能纠正ALI大鼠失衡的肠道菌群结构,在FMT后,失衡的大鼠 肠道菌群得以恢复,表现为厚壁菌门、放线菌门等增多,乳酸杆菌属等增 多,多样性减低,不均一性也减低,肠道菌群结构较稳定。
  3. FMT能改善大鼠ALI的损伤效应,其可能的机制为:FMT后,使失 衡的肠道菌群结构恢复,恢复后的厚壁菌门、乳酸杆菌属等进一步产生的 短链脂肪酸参与抑制PI3K磷酸化,下调AKT的活化,抑制NF-kB的活化入 核,从而进一步减少ICAM-1等炎症因子的分泌,发挥其抗炎修复效应。

参考文献

  1. Su CF, Kao SJ5 Chen HI. Acute respiratory distress syndrome and lung injury: Pathogenetic mechanism and therapeutic implication [J]. World journal of critical care medicine. 2012?l(2):50-60.
  2. RubenfeldGD, Caldwell E, Peabody E, etal. Incidence and outcomes of acute Lung injury [J]. NEngl JMed, 2005, 353(16): 1685—1693.
  3. Luh SP5Chinag CH? Acute lung injury/acute respiratory distress syndrome

(ALI/ARDS): the mechanism, present strategies and future perspectives of therapies [J].浙江大学学报:B 卷英文版,2007,8(l):60-69.

  1. 冯英凯.炎症递质与内毒素肺损伤[J].国外医学呼吸系统分册,2004,24

(5): 913

  1. Kim, Choi, et al. Effect of ginsenoside Rh-2 via activation of caspase-3 and Bcl-2-insensitive pathway in ovarian cancer cells. Physiol. Res. 2016, 65, 1031-1037.
  2. Min, Xiao5Tao5 Zhu? et Emodin ameliorates LPS-induced acute lung injury, involving the inactivation of NF-kB in mice.[J].International journal of molecular sciences?2014?15(ll):19355-19368.
  3. Yao, J.; Pan, D.; Zhao? et al. Wogonin prevents lipopolysaccharide-induced acute lung injury and inflammation in mice via peroxisome proliferator-activated receptor gamma-mediated attenuation of the nuclear factor-kappaB pathway. Immunology 20145 1435 241-257.
  4. Wu5; Du, L.; Zhao, L.; et al. The total alkaloids of Aconitum tanguticum protect against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats. J. Ethnopharmacol. 2014, 155, 1483-1491
  5. Lin5C.; Deng, J.S.; Huang, S.S.; et al. Huang9G.J.Anti-inflammatory activity of Sanghuangporus sanghuangmycelium. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 347.
  6. Wu5C.; Huang, S.S.; Kuo? Y.H.; et al. Ugonin M5 a Helminthostachys zeylanica constituent, prevents LPS-induced acute lung injury through TLR4-mediated MAPKand NF-kB signaling pathways. Molecules 2017,
  1. Huang, G.J.; Deng, J.S.; Chen, C.C.; et al. Methanol extract of Antrodia camphorata protect sagainst lipopolysaccharide-induced acute lung injury by suppressing NF-kB and MAPK pathways in mice. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5321-5329.
  2. Lin, W.C.; Deng, J.S.; Huang?S.; et al. Anti-inflammatory activity of Sanghuangporus sanghuang by suppressing TLR4-mediated PI3K/AKT

/mTOR/IKKB signaling pathway. RSC Adv. 2017, 7, 21234-21251.

  1. Marsland BJ,Trompette A, Gollwitzer ES. The Gut-Lung Axis in Respiratory Disease[J]. (2325-6621 (Electronic)).
  2. van Nood E5 Vrieze A Fau-Nieuwdorp M5 Nieuwdorp M Fau-Fuentes S? et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile[J]. N Engl J Med. 2013,368(5):407-15.
  3. Wilmore DW5 Smith RJ, OfDwyer ST5 et al. The gut:a central organ after surgical stress[J]. Surgery 1988 Nov; 104 (5 ):917-23.
  4. Gray J9 Oehrle K, Worthen G? et al. Intestinal commensal bacteria mediate lung mucosal immunity and promote resistance of newborn mice to infection[J]. Science translational medicine. 2017,9(376).
  5. Liby? K.T.? Sporn5 et al. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.Pharmacol. Rev. 2012?64? 972-1003.

is.贾琼,段丽萍.肠道菌群在自身免疫病中作用的研宄进展m.中华内 科杂志,2018,57(ll):853-857. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0578-1426.

2018.11.013.

  1. Li Y? Liu XY? Ma MM, et al. Changes in intestinal micro flora in rats with acute respiratory distress syndrome[J]. World J Gastroenterol, 2014? 21;20(19):5849-5858. DOI:10.3748/wjg.vil9.5849.
  2. Kang, S.; Im5 K.; Kim, G.; et al. Antiviral activity of 20(R)-ginsenoside Rh2 against murinegammaherpesvirus[J]. Ginseng. Res. 2017,41,496-502. [CrossRef] [PubMed]
  3. Phua J? Badia JR? Adhikari NK, et al. Has mortality from acute respiratory distress syndrome decreased over time?: A systematicreview[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2009, 1 79(3): 220-7.
  4. Schneberger D, Aulakh G, Channabasappa S? et al. Tolllike receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to

chicken barn air [ J ]. Journal of Occupational Medicine and Toxicology, 2016(1): 31

  1. Jiang, T. Zhang, N. Yin, et al.9 Geraniol alleviates LPS induced acute lung injury in mice via inhibiting inflammation and apoptosis5Oncotarget 8 (2017)71038.
  2. Feng Y?Yang Q, Xu J5 Effects of HMGB1 on PMN apoptosis during LPS-induced acute lung injury.Exp Mol Pathol?2008?85:214-222.
  3. Azad MB?Konya T?Maughan H?et al.Gut microbiota of heathy Canadian infants:profiles by mode of delivery and infant diet at 4 months [J]. C -MA? 2013,185 (5) :385-394.
  4. Berks J5 Viswanathan V K5 Savkovic S D?et al.Itestinal epithelial responses to enteric pathogens:effects on the tight junction barrier,ion transport,and inflammation [J]. Gut.2003552(3):439-451.
  5. Chang, J.S.; Lin?J.; Deng, J.S.; et al. Preventive effects of Velvet Antler (Cervus elaphus) against lipopolysaccharide induced acute lung injury in mice by inhibiting MAPK/NF-kB activation and inducing AMPK/Nrf2 pathways. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2018? 2018, 2870503.
  6. 严丽军,汤琪云.肠道菌群与粪菌移植在炎症性肠病中的作用[J].世 界华人消化杂志,2016,24(9广1386-1392.
  7. Ding BS, Hong N5 Christofidou-Solomidou M? Anchoring Fusion throm-bomodulin to the endothelial lumen protects against injury-induc-ed lung thrombosis and inflammation.Am J Respir Crit Care Med. 2009 Aug

1;180(3):247-56

  1. Hilty M BC, Pedro H5 Cardenas P? et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways[J]. PloS one. 2010?5(l):e
  2. Zhuang, J.; Yin, J.; Xu, C.; et al. 20(S)-ginsenoside Rh2 induce the apoptosis and autophagy in U937 and K562 Cells. Nutrients 2018, 10,328

英汉缩略词对照表

英文缩写 英文全称 中文全称
FMT faecal transplantation 粪菌移植
ALI acute lung injury 急性肺损伤
ARDS Acute respiratory distress syndrome 急性呼吸窘迫综合征
SIRS Systemic inflammatory response 全身炎症反应综合征
CARS Compennsatory anti-inflammatory Response syndrome 代偿性抗炎症反应综合征
LPS Lipopolysaccharide 脂多糖
PI3K phosphatidylinositol 3-kinase 磷脂酰肌醇3-激酶
AKT protein kinase B 蛋白激酶B
NF-kB nuclear-factor-k B 核因子kB
ICAM-1 intercellularadhesionmolecule-1 细胞间粘附分子-1
BALF bronchoalveolar lavage fluid 支气管肺泡灌洗液
HE hanatoxylin-esoin 苏木素-伊红染色
ELISA enzyme linkedimmunosorbent assay 酶联免疫吸附测定
Pa〇2 Atrerial oxygen tension 动脉血氧分压
OUT Operation Classification Unit 操作分类单元
W/D Wet/dry 湿干重比
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳

 

PBS phosphate- buffered saline 磷酸盐缓冲液
TBST Tris-buffered saline with teen-20 吐温三羟甲基氨基甲烷盐
缓冲液
PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride 苯甲基磺酰氟
PVDF Polyvinylidene difluoride 聚偏二氟乙烯
SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠
RIPA Radiolmmunoprecipitation Assay 放射免疫沉淀测定
OD Optical density 光密度

致 谢

作为一名临床型研宄生,从本课题最初设计到最终完成的整个研宄过 程中,让我对科研有了更深层次的认识,建立了一定的科研思维、科研实 践能力和科研逻辑,为今后医学科研之路的发展和进步打下了基础。

衷心感谢我的导师范贤明教授对我各个方面的关心和支持!在 生活上,无论是平日的宽容和理解还是生病时的关怀和帮助,都让学生感 到无比温暖与贴心。在学习上,对我严格教诲和辛勤培养,他严谨的科研 精神、求真务实的学术精神,让我受益终生。在工作上,让我收获了精益 求精的工作态度和面对挑战不畏惧的信心,而这一切离不开恩师的悉心培 养,在此谨向恩师致以衷心的感谢和崇高的敬意!

感谢我的家人和朋友一直以来对我的理解,支持与陪伴!感谢 他们这一路在背后的默默付出。衷心感谢对论文进行评审以及答辩委员会 的各位专家教授!

脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤中相关通路研究进展

综 述

急性肺损伤(ALI)是临床常见的一种急危重症综合征,是指由各种各 样的肺内外致病因素(除心源性因素以外的包括间接因素:严重的非胸部 创伤、大量输血(液)、仓ll伤性湿肺、重症胰腺炎、中毒、体外循环、DIC 等,直接因素:严重肺部感染、脓毒血症、淹溺、吸入有毒气体等多方面因 素)导致的急性、进行性缺氧性加重的呼吸衰竭,主要临床症状表现为进 行性低氧血症和呼吸窘迫非均一性渗出性病变是其肺部影像学主要表 现,而参与其主要的发病机制是中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞 等多种炎性细胞的浸润、激活和血管内皮细胞的损伤[2],以及活化多种细胞 因子、众多促炎因子、粘附分子和趋化因子等的过度表达,并伴随着产生 的多种炎性介质所形成的炎性级联反应。其病理特征主要表现为肺部容积 减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调。ALI发展至严重阶段被称为急 性呼吸窘迫综合征(ARDS),其中脓毒血症是诱导ARDS发生的重要病因, 其死亡率高达30%-60%[3]。ALI的发生机制涉及较多细胞、多种途径且有 众多因子参与,目前其机制尚未完全阐明,就如何减轻这种机体免疫反应

所造成的组织损伤,降低其炎症反应对机体的危害仍是研宄的热点[4]。 脂多糖(LPS)是一种内毒素,是G-细菌胞壁外膜的一种重要成分,有害于宿主,可激活机体的免疫应答,激活白细胞,诱使炎症因子(TNF-a、 IL-ip、IL-6等)的释放[5],而引起发热、白细胞反应、内毒素血症等。当 细菌被机体内免疫系统杀灭后死亡溶解或被抗生素等人工破坏时,其通过 被释放到细胞外对宿主产生毒性效应[6]。近年来它己成为研宄ALI的最佳

诱导剂。目前报道较多的关于LPS诱导ALI模型的建立上,较为成熟的标 准和方法有三种,分别是通过气道内滴入LPS,腹腔注射LPS,还有尾静脉注 射LPS,是典型的原发性或继发性ALI模型,也称为间接或直接ALI模型 [7_9]。因此选用不同的途径进行LPS刺激是根据各自不同的实验目的和实 验需求,这一点极其重要。尽管气道内滴入LPS致直接肺损伤模型,组织病 理变化、细胞学和蛋白水平变化都更明显,但注射后的动物发生肺损伤快 而重,很容易死亡。而LPS腹腔注射所产生的肺组织的病理生理变化更符 合继发性肺损伤模型,操作中疾病的病理改变、疾病进程相对发生较慢一 些,易于干预。本文拟从LPS诱导的ALI模型为背景出发,对ALI发病机 制中相关通路进行系统性综述。

  1. Nrf2/HO-l通路与ALI的发病机制

Nrf2是自身抗氧化应激调节因子,它包含7个功能域(Nrf2 — ECH homology domains,Neh),命名为 Nehl〜Neh7〇 Nrf2 的 Neh2 区是主要的调节功能域,包含7个与泛素结合的赖氨酸残基以及调节Nrf2活性的2个 序列(DLG序列和ETGE序列)。Nrf2下游众多靶蛋白中最受关注的就是 HO-1、NQOl和7—谷氨酰半胱氨酸合成酶,也是研宄最多的抗氧化蛋白 [1Q]。Nrf2/HO-l通路与多种疾病的发生有密切关系。近年来有研宄表明, Nrf2可以减弱急性期的炎症反应,依赖于其作为转录调节因子是内源性抗 氧化系统的关键因子,故Nrf2/HO-l通路在肺损伤中也发挥着重要的保护 作用,是机体重要的抗炎、抗氧化通路。在ALI发生时,中性粒细胞在炎 症反应部位聚集并激活,产生炎症级联反应,释放出活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),而ROS的革E细胞是肺血管内皮细胞和肺泡上皮细 胞,进一步导致内皮细胞和上皮细胞凋亡,肺泡上皮细胞释放血管内皮生 长因子引起肺泡水肿,导致肺脏气体交换功能障碍[11]。Zhu等在LPS 诱导ALI小鼠模型的研究中发现,老鹃草素可以显著逆转LPS诱导的肺损 伤病理改变,发现老鹃草素可以抑制NF-kB的激活,同时可以上调Nrf2 的表达,表明老鹃草素可以通过激活Nrf2信号通路对LPS诱导的ALI起 到一定的抗炎治疗作用。Tao等研宄发现类胡萝h素和食品添加剂胭脂 素作为一种新的Nrf2活化剂,能够通过干扰Keapl-C151,并阻止Nrf2泛 素化并延长其半衰期,可以使Nrf2+/+小鼠ALI的严重炎症反应减轻,而 对Nrf2-/-小鼠则无此作用。幻111等[14]研宄表明,敲除Keapl可以促进Nrf2 依赖基因HO-1等的表达,从而抑制LPS刺激的巨嗤细胞中炎症相关基因 表达,表明Nrf2可以对ALI发挥抗炎保护作用。而有研宄表明Nrf2基因 敲除小鼠,更易发生脓毒症性腹膜炎和内毒素休克,病死率较高[15]。巩红 岩等研宄发现Nrf2/HO-l信号通路的激活参与了远端缺血预处理减轻大鼠 内毒素性急性肺损伤[16]。综上表明Nrf2信号通路的激活可以对ALI起到保护作用,通过抑制氧化应激、减轻炎症反应、调节细胞凋亡和自噬等途径。 2. Toll样受体(TLR)途径与ALI的发病机制

TLR是新近发现的“桥梁”[17],是连接先天性免疫与获得性免疫应答 的受体,是先天免疫系统中的细胞跨膜受体及高度保守的模式识别受体之 一,对急性炎症反应、细胞信号转导途径及细胞的凋亡均发挥着重要的作 用。最早被发现的TLR家族成员就是TLR4,通常认为,TLR4能识别革兰 氏阴性菌的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)[1819]。通过 TLR4 与 LPS 的 直接结合,或者TLR4与LBP-LPS-CD14结合,结合后可以将信号转入到细 胞内,进而导致炎症反应的启动,激活后的TLR4将活化一系列的下游分子, 使炎症反应进一步发展放大。在ALI中,表达在肺泡内皮细胞、上皮细胞

等的TLR4在CD14和髓样分化蛋白-2形成的结合蛋白辅助下,能够识 别出PAMPs(如LPS),而且这种识别是一种特异性的识别,识别后可以通 过MyD88依赖性或MyD88非依赖性蛋白分子的募集,使一系列的下游 分子如NF-kB、MAPK等激活,活化后进一步导致多种炎症介质的合成并 释放,其中包括促炎介质和抗炎介质,这两者之间的失衡是ALI进一步 发生发展的一个关键环节[2()]。促炎介质TNF-a是启动ALI最重要的启动 因子,IL-lp是主要调节物质,启动因子通过一系列的释放、聚集和粘附造 成肺泡-毛细血管的损伤[2122]。调节物质在急性反应中能诱导促炎因子等的 产生,进而继续放大肺部的炎症反应。据大量文献报道,在LPS诱导的 ALI动物模型的肺组织中能够检测到高浓度的TNF-a、IL-lp、IL-6 [23_25]。 秦丽[26]等研宄发现黄芪-丹参防治ALI的作用机制与其抑制TLR4/NF-kB 信号通路有关。因此,如果能调节TLR4的信号通路转导,就可能调控在不同病理阶段的炎性反应,从而对ALI的防治发挥重要意义。

3.MAPK信号转导通路与ALI的发病机制

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激 酶,己证实它是一类重要信号系统存在于生物体内的大多数的细胞内,主要 是真核细胞将细胞外刺激的信号转导至细胞及其核内,从而介导细胞反应。 目前己发现的MAPK信号转导通路有:细胞外调节激酶通路(Ras/ERK MAPK通路)、c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶通路(JNK/SPAK通 路)、P38MAPK通路与ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶I(BMK1)。[27]其中 细胞外信号调节激酶(ERK)是MAPK亚族的信号转导途径,在生物体内 尤为重要,可将胞外的信号转导至胞核内,是核转录激活的重要调节分子, 且能直接介导早期的基因发生变化,通过影响细胞命运的一系列变化,在ERKMAPK的级联反应中发挥放大作用和在细胞增殖、基因表达调控中发 挥关键的作用。在生理状态下,ERK是MEK的唯一下游底物,表明ERK 在该通路中调节细胞骨架、控制细胞周期中起着重要作用。P38MAPK信 号通路在介导炎症反应和细胞因子生成中也起着重要的作用,内毒素是其 主要激活剂之一,包括激活炎症反应、与炎症因子生成的调控关系等多个 方面。LPS能激活所有的MAPKs,通过活化、转录调节等使促炎因子表达, 故MAPKs在LPS介导的ALI中发挥着无比重要的作用。p38MAPK在炎 症反应中的作用表现为抑制脂多糖诱导单核细胞产生肿瘤坏死因子 (TNF)、脓毒血症和内毒素休克。己有实验发现阻断p38MAPK信号通路, 可以减轻ARDS发病过程中失控的炎性反应,进而有效地保护毛细血管内 皮细胞和肺泡上皮细胞[28]。Zheng等[29]的实验研宄表明,通过使用 SB239063可阻断p38MAPK信号通路表达,减轻ALI炎性反应。这说明 LPS能导致肺组织p38MAPK的磷酸化,通过p38MAPK激活后可以促进 释放更多的炎症因子,P38MAPK的4种亚型的活化可能与ALI的发生和发

展有着错综复杂的作用机制。

  1. PI3K/AKT信号通路与ALI的发病机制

PI3K是一个异源性二聚体,在磷脂激酶家族中,PI3K家族作为AKT 激活过程中的关键环节,发挥着重要的生物学特征。AKT是真核细胞中参 与细胞信号转导的关键分子,在细胞凋亡、细胞侵袭等多方面均有调控功 能,其在肺组织炎症等许多呼吸道炎症反应中均发挥了至关重要的作用 [3Q]。Choi等[31]研宄发现通过抑制PI3K/AKT信号通路来抑制蛋白激酶C-5 的表达,能够使过敏性呼吸道的炎症反应减轻。邓旺等研宄表明,激活 PI3K/AKT信号通路后,肺泡钠通道和Na+-K+-ATP活性增强,可以使ALI时肺泡内多余的水肿液清除和肺泡内的蛋白液渗出减轻,从而减轻肺 组织的损伤[32]。有研宄发现异氟烷可抑制小鼠肺部炎症反应,这种保护作 用是通过激活AKT、PI3K/AKT信号传导通路的表达而发挥作用。在血红 素加氧酶-1与七氟烷联合LPS诱导的ALI模型中,激活后的磷酸化的PI3K 和磷酸化的AKT,在减轻ALI中发挥着重要作[33]。有研宄证实,LPS诱 导的ALI模型中,LPS导致的肺微血管内皮损伤,使肺血管内外失衡及肺 泡毛细血管屏障破坏,增加了肺泡通透性,使进入肺泡富含蛋白的液体增 多,从而引起肺不张、肺泡萎陷、通气/血流比例失调,发生呼吸衰竭,但 可以由PI3K/AKT激活后提高的肺泡细胞内环磷腺苷酸的含量来改善LPS 等多种因素诱发的ALI。Wang等研宄发现,侵入人体肺泡上皮细胞的金 黄色葡萄球菌与活化PI3K/AKT信号通路有关[34]。综上表明,在较多的 动物模型研宄中,PI3K/AKT信号转导通路调控细胞相关因子在ALI中 发挥着作用。

总结及展望:到目前,内毒素性ALI的发病率及死亡率仍很高,寻找新 的有效治疗方式刻不容缓。然而其发病机制错综复杂,目前,对内毒素性ALI 的发病机制的研宄主要通过对各个相关通路的调控来抑制炎症反应、抗氧 化以及抑制细胞的凋亡等发挥积极的治疗作用。鉴于ALI的发生、发展均 与相关通路的激活、调控息息相关,因此,在ALI早期,可以试图阻断 TLR4/NF-KB信号通路、MAPK信号转导通路的途径,从而抑制炎症的发 展和炎症的级联反应,而在损伤晚期,可以通过激活Nrf2/HO-l通路、 PI3K/AKT信号通路途径,抑制炎症因子的释放,从而促进肺损伤的康复。 为ALI的治疗提供了更多的治疗靶点,也为降低临床上内毒素患者的病死 率提供了更多的治疗方案。

参考文献

  1. Jesus V? Fernandez R5 Alfonso A? et A clinical classification of the acute respiratory distress syndrome for predicting outcome and guiding medical therapy[J].Critical Care Medicine,2015, 43 (2) :346-353
  2. 汪雪峰,陈思煜,陈锋.急性肺损伤发病机制的研宄进展m.海峡药学,2013,01:102-104.
  3. Su CF? Kao SJ? Chen HI. Acute respiratory distress syndrome and lung injury: Pathogenetic mechanism and therapeutic implication[J]. World journal of critical care medicine.2012,1 (2): 50-60.
  4. 严伟民,姜虹,陈万涛.大鼠LPS吸入性肺损伤模型制备的研宄m. 组织工程与重建外科杂志,2010, 6(2): 96-100.
  5. 李琦,钱桂生,张青,等.递增剂量脂多糖致伤对大鼠SIRS-肺损伤的 影响[J].第三军医大学学报,2001, 23(11广1264 -1267.
  6. Gutsmann T? Schromm AB? Brandenburg K. The physicochemistry of endotoxins in relation to bioactivity. Intern J MedMicrobiol, 2007, 297 (5) :341-352.
  7. 陈娇,钱晓明,聂时南.急性肺损伤动物模型的研宄现状m.医学研究生 学报,2013, 26 (8) :851-853.
  8. 陈英华,吕嘉文,翟启良,等.LPS直接及间接作用致小鼠肺损伤模型的 建立[J].中国临床解剖杂志,2015, 33⑷=439-443.
  9. 李成玉.内毒素致大鼠急性肺损伤模型的建立[J].临床肺科杂志,2012, 17

(40) :657-659.

  1. 胡流芳,王迎,任汝静,等.KeaplNrf2/ARE信号通路的抗氧化应激作 用及其调控机制[J].国际药学研宄杂志,2016, 43(1): 146-166. DOI: 10. 13220/j. cnki. jipr.2016. 01. 022.
  2. Yang CY, Chen CS,Yiang GT,et al. New insightsinto the Immune

molecular regulation of the pathogenesis of acute respiratory distress syndrome[J] . Int J Mol Sci ,    2018 ,       1 9(2) :    588 . DOI :

  1. 3390/ijmsl9020588.
  2. Zhu G,Xin X,Liu Y,et al. Geraniin attenuates LPS-induced acute lung

injury via inhibiting NF-kB and activating Nrf2 signaling path­way s[J] .Oncotarget, 2017,     8(14) :  22835-22841 . DOI :

  1. 18632/oncotarget. 15227.
  2. Tao S? Rojo de la Vega M, Quijada H,et al Bixin protects mice against ventilation—induced lung inj ury in an NRF2-dependent manner[J]. Sei Rep, 2016, 6: 18760. DOI: 10. 1038/srepl
  3. Kim JH, Choi YK, Lee KS, et al. Functional dissection of Nrf2- dependent phasellgenesin vascular inflammation and endotoxicinjury using KeaplsiRNA[J]. Free Radic Biol Med, 2012, 53(3): 629 -640. DOI: 101016/j. freeradbiomed. 2012.04. 019.
  4. Magesh S? Chen Y,Hu L. Small molecule modulators of Keapl -Nrf2-ARE pathway aspotential preventive and therapeutic agents [J]. Med Res Rev, 2012, 32(4): 687-726. DOI: 10. 1002/med. 21257.
  5. 巩红岩,郑芳,贾志杰,等.Nrf2/HO-l信号通路在远端缺血预处理减轻小 鼠内毒素性急性肺损伤中的作用[J].中国麻醉学杂志,2018, 38(2): 245-249. DOI: 10. 3760/cma. j. issn. 0254-1416. 2018. 02. 031
  6. Akira S? Takeda K, Kaisho T. Toll -like receptors: critical pro-teins linking innate and acquired immunity [j] . Nat Immunol,2001,2(8): 675 — 680.
  7. De Nardo D. Toll -like receptors: Activation, signalling and transcriptional modulation [j] . Cytokine,2015,74(2): 181-189.
  8. Lu YC,Yeh WC,Ohashi PS. LPS/TLR4 signal transduction pathway [j] . Cytokine,2008,42(2): 145 —151.
  9. Butt Y, Kurdowska A,Allen TC. Acute Lung Injury: A Clinical and Molecular Review [ J]. Arch Pathol Lab Med, 2016, 140 (4): 345-350.
  10. Puthothu B, Bierbaum S? Kopp MV, et al. Association of TNF- alpha with severe respiratory syncytial vims infection and bronchial asthma [j] . Pediatr Allergy Immunol, 2009, 20(2):157-163.
  11. Mukhopadhyay S, Hoidal JR, Mukherjee TK. Role of TNFal-pha in pulmonary pathophysiology [j]. Respir Res,2006,7:125•
  12. Xu C5Chen G5Yang W5et Hyaluronan ameliorates LPS-induced acute lung injury in mice via Toll-like receptor(TLR) 4-dependent signaling pathways

[j] . Int Immunop-harmacoh 2015, 28(2): 1050 —1058.

  1. FengG,JiangZY,SunB,et al. Fiset in Alleviates Lipopo- lysaccharide Induced Acute Lung Injury via TLR4 -Mediated NF -kappaB Signaling Pathway in Rats [j]. Inflammation,2016,39(1): 148 —157.
  2. Jiang W,Luo F,Lu Q,et The protective effect of Trillin LPS-induced acute lung injury by the regulations of inflamma-tion and oxidative state

[J]. Chem Biol Interact, 2016, 243:127 -134.

  1. 秦丽.基于TLR-4/NF-kB信号通路探讨黄芪一丹参防治急性肺损伤的 实验研究[D].中国人民解放军医学院,
  2. Pearson G,Robinson F,Beers Gibson T5et al. Mitogen-activa-ted protein (MAP) kinasepathway s:regulation and physiologi-cal functions [J]. Endocr Rev,2001,22(2):153-183.
  3. Sim YS? Kim SY,Kim EJ,et al. Impaired expression of MAPK is

associatrd with the downregulation of TNF-a,IL-6,and IL-10 in my co-bacterium abscessus lung disease [J]. Tuberc Respir Dis

(Seoul)2012J2(3):275-283.

  1. Zheng DY? Zhou M?Jin J5et al. Inhibition of p38MAPK downregulates the expression of IL-lpto protect lung from acute injury in intestinal ischemia reperfusion rats [J]. Mediators Inflamm5201652016:9348037.
  2. 黄春容,何婉媚,易慧,等.Ghrelin通过AKT/ERK信号通路对LPS诱 导的肺泡上皮细胞凋亡的影响[J].中国免疫学杂志,2017,33 (8) :1129-1134.HuangCR? He WM? Yi H? et al. Effects of Ghrelin on human

alveolar epithelial cell apoptosis in response to lipopolysaccharide through AKT/ERK signaling pathway[J]. Chin J Immunol, 2017, 33 (8) :1129-1134.

  1. Choi YH5 Jin GY? Li LC? et al. Inhibition of protein kinase C delta attenuates allergic airway inflammation through suppression of PI3K/Akt/m TOR/HIF-1 alpha/VEGF pathway[J]. PLo S One, 2013? 8(11): e
  2. 邓旺.PI3K-Akt信号通路上调急性肺损伤大鼠肺泡上皮钠通道表达[J]. 基础医学与临床,2012,32 (9) : 1004-1008
  3. Zhao S,Wu J,Zhang L, et al. Post-conditioning with sevoflurane induces heme oxygenase-1 expression via the PI3K/Akt pathway in lipopolysaccharide? induced acute lung injury [J]. MolecularMedicine Reports, 2014, 9(6):2435-2440 .
  4. Wang JH,Zhang K,Wang N,et al. Involvement of phosphatidyli -nositol 3-Kinase/Akt signaling pathway inbeta lintegrin-mediatedinter nalization of Staphylococcus aureus by alveolar epithelial cells [j] . J Microbiol,2013,51(5):644-650.