达比加群酯对支气管哮喘小鼠气道重塑的抑制作用及其机制探讨论文

2020年2月20日17:50:24达比加群酯对支气管哮喘小鼠气道重塑的抑制作用及其机制探讨论文已关闭评论

达比加群酯对支气管哮喘小鼠气道重塑的抑制作用及其机制探讨论文

摘要

背景:

支气管哮喘(哮喘)是一种常见且严重影响患者生活质量的气道慢性炎症 性疾病,其病理特征是慢性气道炎症、气道高反应性和气道重塑。气道重塑在 不同程度上贯穿整个支气管哮喘病程,是哮喘患者出现不可逆性肺通气功能障 碍的主要原因。气道重塑包括杯状细胞增生肥大、血管增生、气道平滑肌增厚、 细胞外基质沉积。

近年研宂表明,凝血酶具有促炎、促增殖及促进平滑肌细胞分泌细胞外基 质等作用,参与哮喘气道重塑。达比加群酯是新型直接凝血酶抑制剂,广泛应 用于抗凝治疗。研究表明,达比加群酯可在细胞水平上抑制凝血酶诱导的细胞 外基质的分泌。但是,达比加群酯是否在体内抑制哮喘气道重塑尚不明确。

YAP/TAZ是Hippo信号通路的下游效应分子,介导细胞的增殖、迁移、分化 等。YAP/TAZ广泛表达于肺部结构细胞,参与肺发育及多种肺疾病的发生发展。

YAP/TAZ是否参与哮喘气道重塑尚不清楚。

目的:

在哮喘小鼠模型中,明确达比加群酯是否可以减轻哮喘气道重塑;明确抑 制YAP/TAZ是否可以减轻哮喘气道重塑。

方法:

选取SPF级别的6-8周龄的雄性BALB/c小鼠。将所有小鼠饲养在SPF级 动物室中,使用无菌水和放射线照射的饲料喂养小鼠,予12小时光/暗循环。

根据实验要求将小鼠随机分为6组(1)空白组;(2)0VA哮喘模型组(OVA 组);(3)OVA/地塞米松组(OVA/Dex组);(4)OVA/达比加群酯5mg组 (OVA/Dab5mg 组);(5)OVA/达比加群酯 10mg 组(OVA/DablOmg 组);⑹ OVA/ 维替泊芬组(OVA/Ver 组),每组 6 只。OVA 组、OVA/Dex 组、OVA/Dab5mg 组、OVA/DablOmg、OVA/Ver组,于第1天、第7天分别予致敏液腹腔注射致 敏,随后分别于第14、15、16、21、22、23天以2mg/ml OVA激发溶液滴鼻激 发。达比加群酯干预组于第13天开始予以相应浓度的饲料喂食。在激发液滴鼻 激发前30分钟,地塞米松和维替泊芬干预组腹膜内注射相应量的溶液。在最后 一次激发后24小时内处死小鼠,收集肺泡灌洗液及肺组织。使用HE、PAS、 Masson染色等方法观察肺的病理变化,使用免疫蛋白印迹法检测总 YAP(t-YAP)、磷酸化 YAP(p-YAP)结果

  • BALF细胞计数结果示:OVA组BALF中细胞明显升高,与空白组有 统计学差异(P<〇.〇〇l) ; OVA/Dex组与OVA组相比较,BALF中细胞计数明 显减少,差异具有统计学意义(P<〇.〇〇l) ; OVA/达比加群酯5mg组BALF中 细胞数较OVA模型组显著减少,差异有统计学意义(P<0.001) ; OVA/达比加 群酯10mg组及OVA/维替泊芬干预组BALF中细胞数均较OVA组明显减少, 差异有统计学意义(P<〇.〇5)。
  • HE染色结果示:空白组可见正常小气道及肺泡结构,OVA组气道及 血管旁炎症细胞较空白组明显增多(p<0.05),地塞米松组炎症细胞较OVA组 明显减少(p<0.05);与OVA模型组相比较,达比加群酯5mg组气道及血管 旁的炎症细胞明显减少(p<0.05),达比加群酯10mg组炎性细胞有所减少;与 OVA组相比较,YAP抑制剂维替泊芬组气道及血管旁炎症细胞明显减少 (p<0.05),与达比加群酯组相近。
  • Masson染色结果示:OVA组与空白组相比,OVA组气道及血管旁 胶原纤维的沉积明显增加(p<0.05);与OVA模型组相比,达比加群酯5mg组支气管及血管旁胶原沉积较轻(p<0.05);与OVA模型组相比较,YAP抑 制剂维替泊芬组支气管旁胶原沉积较轻(p<0.05),与达比加群酯组相近。
  • PAS染色结果示:OVA组较空白组杯状细胞明显增多(p<0.001); 与OVA模型组相比较,达比加群酯5mg组及YAP抑制剂维替泊芬组杯状细胞 明显减少(p<0.05),且两组增生肥大情况相近。
  • Westernblotting结果示:OVA模型组中,t-YAP表达明显上调,p-YAP 表达明显降低,提示去磷酸化YAP (YAP活化形式)表达上调;达比加群酯干 预使p-YAP表达上调,提示其抑制去磷酸化YAP (YAP活化形式)表达;YAP 抑制剂维替泊芬干预抑制t-YAP、p-YAP表达,但对抑制t-YAP更为显著。 结论:

达比加群酯、YAP抑制剂均可减轻哮喘气道重塑;达比加群酯可能通过抑 制YAP活化,减轻哮喘气道重塑。

关键词气道重塑达比加群酯凝血酶YAP

Inhibition of airway remodeling in micewith bronchial asthma by dabigatranetexilateon and the mechanisticinvestigationName: Cheng WeiyingSupervisor: Cheng Yuanxiong

ABSTRACT

Background:

Bronchial asthma (asthma) is a common and serious influence quality of life of patients with chronic inflammatory airway disease, the pathology is characterized by chronic airway inflammation and airway hyperresponsiveness、 airway remodeling.airway remodeling in varying degrees throughout the course of bronchial asthma,is the main cause of irreversible pulmonary ventilation function obstacle .airway remodeling including hypertrophy of goblet cell hyperplasia n vascular proliferation > airway smooth muscle thickening and the extracellular matrix deposition.

In recent years,studies have shown that thrombin has a proinflammatory、 promote proliferation and promote the smooth muscle cell secretion of extracellular matrix, and so on, and participate in asthmatic airway remodeling.dabigatran etexilateon is a new direct thrombin inhibitor, is widely applied in anticoagulant therapy.Research has shown that dabigatran etexilateon can inhibit the secretion of extracellular matrix induced by thrombin in vitro. In vivo, dabigatran etexilateon whether inhibit airway remodeling of asthma is unclear.

YAP/TAZ is a downstream effector molecule of Hippo signaling pathway, which mediates the proliferation, migration and differentiation of cells, etc. YAP/TAZ is widely expressed in lung structural cells, and is involved in the development of lung and the occurrence and development of a variety of lung diseases. Whether YAP/TAZ is involved in airway remodeling in asthma is unclear. Objective:

In the mouse model of asthma, to determine whether dabigatran etexilateon can reduce airway remodeling in asthma;to determine whether inhibition of YAP/TAZ can alleviate airway remodeling in asthma;

Methods:

Male BABLb/ c mice aged 6-8 weeks with SPF were selected.All mice were kept in SPF grade animal chamber, sterile water and radioactive feed were fed to mice, and light/dark cycle was given for 12 hours.The mice were randomly divided into six groups :(1) blank group;(2) OVA asthma model group(OVA group);(3) OVA/ dexamethasone group(the OVA/Dex group);(4)OVA/dabigatran etexiteon 5mg group(the OVA/Dab5mg group);(5) OVA/dabigatran etexiteon 5mg group(the OVA/DablOmg group);(6)OVA/ Verteporfin group(OVA/Ver group), 6 mice in each group,OVA model group,OVA /Dex group,OVA /Dab5mg group^OVA /DablOmg group and OVAA^er group were respectively sensitized by intraperitoneal injection of sensitizing solution on day 1 and day 7.The nasal drip was then stimulated with 2mg/ml OVA solution on day 14、15、 16、21、22、23,respectively.The

dabigatran-etexilateon intervention group was fed with the corresponding concentration of feed on the 13th day, and the corresponding amount of solution was injected into the peritoneum of the dexamethasone and vetipofen intervention groups 30 minutes before the excitation of nasal drops.Mice were sacrificed within 24 hours after the last stimulation, and alveolar lavage fluid and lung tissue were collected to observe the pathological changes of the lung.Western blotting was used to detect t-YAPandp-YAP.

Results:

  • BALF cell count results showed that BALF cells were significantly increased in the OVA group, which was statistically different from the blank group (P<0.001).Compared with the OVA group, the cell count in BALF was significantly decreased in the OVA/Dex group,and the difference was statistically significant (P<0.001).The number of cells in BALF in the OVA/ dabigatran etexilateon 5mg group was significantly lower than that in the OVA group, and the difference was statistically significant (P<0.001).The number of BALF cells in the OVA/ dabigatran etexilateon lOmg group and OVA/ verteporfin intervention group was significantly lower than that in the OVA group, and the difference was statistically significant (P<0.05).
  • The results of HE staining showed that normal small airway and alveolar structures could be seen in the blank group, and inflammatory cells in the airway and beside blood vessels were significantly increased in the OVA group compared with the blank group (p<0.05), while inflammatory cells were significantly decreased in the dexamethasone group compared with the OVA group (p<0.05). Compared with the OVA group, the inflammatory cells in the airway and beside blood vessels were significantly reduced in the dabigatran etexilateon 5mg group (p<0.05), and the inflammatory cells were decreased in the dabigatran etexilateon lOmg group.Compared with the OVA group, the number of inflammatory cells in the airway and beside blood vessels was significantly reduced in the YAP inhibitor verteporfin group (p<0.05), which was similar to that in the dabigatran etexilateon group.
  • PAS staining results showed that the number of goblet cells in the OVA

 

group was significantly higher than that in the blank group (p<0.001).Compared with the OVA model group, goblet cells were significantly reduced in the dabigatran etexilateon 5mg group and the YAP inhibitor verteporfin group (p<0.05), and hypertrophy was similar in the two groups.

  • The results of Masson staining showed that: compared with the blank group, the deposition of collagen in the airway and collateral vessels was significantly increased in the OVA group (p<0.05).Compared with the OVA group, the bronchial and paravascular collagen deposition was less in the dabigatran etexilateon 5mg group (p<0.05).Compared with the OVA model group, the peribronchogenic collagen deposition was less in the YAP inhibitor verteporfin group (p<0.05)? which was similar to that in the dabigatran etexilateon group
  • Westem blotting results showed that t-YAP expression was significantly up-regulated and p-yap expression was significantly decreased in the OVA model group, suggesting up-regulated expression of dephosphorylated YAP(activated form of YAP).Dabigatran etexilateon intervention up-regulated the expression of p-YAP, suggesting that it inhibited the expression of dephosphorylated YAP(activated form of YAP).The intervention of the YAP inhibitor verteporfin inhibited the expression of t-YAP p-yap, but the inhibition of t-YAP was more significant.

Conclusion:

Both dabigatran etexilateon and YAP inhibitors can alleviate airway remodeling in asthma.Dabigatran etexilateon may reduce airway remodeling in asthma by inhibiting YAP activation.

KEYWORDS: Airway remodeling ; dabigatran etexilateon ; thrombin ; Yes-assoeiated protein(YAP)

支气管哮喘(哮喘)是一种常见的气道慢性炎症性疾病,严重影响患者的 生活质量。目前,全世界约有3亿哮喘患者[1],其中中国有3000万。各国哮喘 发病率从1%〜30%不等,且有逐年上升趋势。这是一个全球性的卫生问题,严重 影响患者生活质量,且治疗费用不断上升,患者和社区负担日益加重[1]。哮喘对卫 生保健系统和社会造成无法承受的负担,其原因是在工作场所中生产力的丧失, 特别是儿童哮喘和其对家庭的破坏,而且它还造成全世界许多人的死亡,包括 年轻人[1]。世界各地面管理哮喘的卫生保健提供者临着不同的问题,这取决于 当地环境、卫生系统和获得资源的途径[1]。哮喘以反复发作性喘息、气短、胸 闷和咳嗽等为主要症状,这些症状的发生、频率和强度随时间而变化,其重要 病理特征包括气道炎症及气道重塑。哮喘的治疗已得到国际上的一致同意,并 为哮喘管理制定了指南[M]。然而,这些指南的治疗方法大多针对气道炎症。目 前针对哮喘气道重塑方面尚无明确的治疗方法。

若哮喘反复发作,随着病程的延长可产生一系列气道结构的改变,称为气 道重塑(airwayremodeling)。这些结构变化包括上皮损伤、细胞外基质增加、 气道平滑肌增生/肥大、杯状细胞肥大和增生以及血管生成增加[5]。气道重塑在 哮喘的病理生理学中起着重要作用,它在不同程度上贯穿整个疾病过程[5],使 患者出现不可逆或部分不可逆的气流受限,以及持续存在的气道高反应性,降 低患者对吸入激素的敏感性。虽然在其他气道慢性炎症性疾病也可见气道重塑, 如慢性阻塞性肺疾病,但哮喘中的一些气道结构性改变具有显著不同[6]。目前 尚无有效的手段阻止或逆转气道重塑的过程[2]

气道重塑可导致不可逆性气流受限,是哮喘持续和不断加重的关键环节[7], 其表现包括细胞外基质增加、气道平滑肌增生/肥大、杯状细胞肥大和增生以及 血管生成等。细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)是由结缔组织细胞产生 并分泌的大量大分子物质形成的一个复杂的网状结构,充满气道壁细胞外空
间。细胞外基质的大分子由所存在的全部细胞分泌,其组成取决于细胞类型、 分化状态和代谢状态。ECM分子由纤维蛋白(胶原蛋白、弹性蛋白)、结构蛋白 或黏附蛋白(纤维连接蛋白和层粘连蛋白)组成,嵌在含有透明质酸或透明质酸 (HA)等糖胺聚糖的水合多糖凝胶中。葡聚糖、蛋白聚糖和结构蛋白吸附水分子 形成高度水合的凝胶状基质,其中嵌入了不溶性纤维蛋白,使基质具有强度、 刚性和弹性。细胞外基质成分的改变可使其具有的强度、刚性等发生变化。直 到最近,ECM还被认为是一种惰性支架,在支持和维持组织结构方面具有机 械作用。然而,己有研究表明,ECM还可以调节多种细胞功能,如发育、迀 移和增殖火在某些哮喘中可观察到胶原纤维增生,而这些纤维可能被不规 则地处理,但胶原纤维的确切性质尚未完全确定。哮喘患者上皮下组织中I型 和III型胶原的含量明显高于正常对照组[1G],这种瘢痕形成可能具有较大的功 能意义。ECM是一个动态结构,为了维持其稳态,需要在合成[11]和控制ECM 组分降解之间达到平衡。

杯状细胞分布于整个气道,占气道上皮细胞总数的六分之一,其主要作用 是分泌粘液,是非软骨气道组织中黏蛋白的唯一来源[121。气道粘液是气道第一 道屏障一粘液屏障,由黏蛋白与糖结合物、其他蛋白和脂质体混合而成,具有 一定的黏附能力。气道纤毛运动可将分泌的粘液清到口咽部,此过程可清除炎 症后死亡的细胞和侵入呼吸道的微颗粒,通过人体主动咳嗽排出体外,起到维 护呼吸道微环境正常的作用。ManuyakomW及Seiler F等人研究证实,与正 常人相比较,哮喘患者气道杯状细胞数与正常人相比常高出2-3倍[131'新生 杯状细胞会分泌大量黏蛋白,由黏蛋白组成的粘液成分也较正常人多。上皮杯 状细胞数量的增加导致粘液分泌过多进入管腔,大气道中的分泌物可能被吸入 较小的气道[15'16]。从第二级气道到细支气管,各种大小的气道都有粘液堵塞[17]。 虽然有些哮喘患者可能死于心律失常或过度平滑肌痉挛而没有粘液分泌过多 [18],但大多数患者有粘液分泌过多[19'2()]、支气管内粘液阻塞,最终导致窒息。 在致死性的哮喘发作期间,超过50%的气道可能被粘液堵塞[21]。粘液黏度越高,

粘液纤毛清除率越低[22]。大大小小的气道被分泌物和炎性渗出物堵塞,这些分 泌物和炎性滲出物的黏度如此之大,导致病人对高剂量的吸入支气管扩张剂反 应很差[18]。所以粘液可能需要支气管镜检查和灌洗才能清除。在哮喘患者和小 鼠模型中,气道杯状细胞会发生增生与化生,增生的杯状细胞表达大量的 MUC5AC,从而形成大量的黏蛋白,造成气道黏液的过度分泌[23]。黏液腺的肥 大及杯状细胞的增生共同导致了哮喘气道的黏液过度分泌[24],是哮喘致死性发 作的原因之一。

因此,防治哮喘气道重塑已成为哮喘治疗的难点和研宄重点。

凝血是指血浆中的可溶性纤维蛋白原变成不溶性纤维蛋白和一系列在血液 中凝集的酶促进生化反应的过程。凝血系统包括多种凝血因子,其中凝血酶是 内部和外部凝血系统活化的共同途径中的关键蛋白,占据着凝血系统的中心位 置。凝血过程不只发生在血管内,近年来,肺内凝血己成为哮喘防治研究热点。 N Engl J Med、Thorax、Blood和许多其他权威期刊最近报道凝血不但发生在受 损的血管中,也发生在哮喘气道中[2526'27]。81〇〇(1—篇文章指出哮喘患者8乂^ 和痰液中均发现凝血关键组分一组织因子、FVII、FX、凝血酶和凝血酶-抗凝 血酶复合体显著增高;在重症哮喘病人及因重症哮喘发作,治疗无效死亡病人 的气道和肺泡中,存在大量凝血终产物纤维蛋白的沉积。哮喘患者局部肺段予 以过敏原激发,同样可见激发肺段凝血的活化[28]

上述研宂结果提示,哮喘患者气道局部凝血异常活化,处于髙凝状态。凝血 系统被认为是炎症反应中不可分割的组成部分[2&27]。多项研究表明,哮喘患者 外周血、诱导痰及支气管肺泡灌洗液(BALF)中凝血活性均显著高于正常人 [27_3()]。虽然凝血激活可以促进针对入侵病原体的保护性炎症反应,但在慢性和/ 或过度炎症反应中,凝血激活可能对宿主有害,例如哮喘患者的肺部过敏性炎 症[25、川。

除了凝血功能外,凝血酶还具有非凝血功能,如调节炎症、组织损伤及纤维 化等,参与多种疾病的发生发展[32]。目前,研宄者普遍认为凝血酶的非凝血功能主要通过活化PAR-1来实现。PAR-1是蛋白酶活化受体(PARS)即凝血酶受体 的亚型之一,在气道上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的细胞膜上广泛表达。 凝血酶-PAR-1不仅可促进哮喘嗜酸性粒细胞炎性浸润,还是哮喘气道重塑的重 要参与者。凝血酶激活PAR-1可刺激肺成纤维细胞增殖、肥大及分泌细胞外基 质133'341。此外,还可以促进ASMC增殖、收缩及细胞内Ca2+动员[35'36]。在 HEK293A细胞中,凝血酶可以通过其受体-蛋白酶活受体(PAR-1)-抑制 YAP-TAZ磷酸化表达,促进YAP/TAZ核转移[37],从而引起促细胞增殖作用。 本课题组前期体外研究结果显示,在TGF-PK Ang II、PDGF、凝血酶中,凝 血酶对ASMC的促进增殖效应是最明显的,仅低于10%FBS[38'4G]。本课题还首 次发现,凝血酶通过诱导ASMC的收缩,起到促增殖及促细胞外基质的分泌作 用[41],细胞外基质成分的改变可引起压力的变化,但其具体调控机制尚不清楚。

凝血酶可通过诱导细胞收缩,从而起到调节多种细胞功能的作用。凝血酶 可诱导肺动脉血管平滑肌细胞[42]、气道上皮细胞[43]、成纤维细胞、人3]^^44]等 多种肺结构细胞收缩。此收缩过程可使细胞骨架蛋白发生变化,从而使得细胞 甚至组织器官发生功能性变化。FuJ在ASMC的增殖迁移实验中证明,Fibulin 与整合素Betal结合后,可降低YAP/TAZ的磷酸化水平,促进ASMC的增殖 和迁移[45]。另有实验证明,S1P通过SlPR2/3/ROCK信号通路,引起YAP/TAZ 去磷酸化及细胞核转移,促进ASMC的增殖、收缩及迁移[46]。据此,YAP/TAZ 的激活,可能在调节ASMC增殖、迁移及收缩方面起到关键作用。在HEK293A 细胞中,凝血酶可通过激活PAR-1(凝血酶受体蛋白),抑制YAP/TAZ磷酸化水 平,促使YAP/TAZ细胞核转位,从而引起促细胞增殖作用[37]。我们前期体外 实验结果证明,凝血酶诱导ASMC收缩,促使其肌动蛋白细胞骨架发生结构重 排,促进ASMC的增殖及细胞外基质分泌。但YAP/TAZ是否调节凝血酶诱导 的细胞收缩、增殖、细胞外基质分泌等生物学过程,目前尚不清楚。凝血酶及其他凝血组分在哮喘气道重塑中的作用己被各国学者认可[2526

32]。临床实验对哮喘患者给予了以肝素为代表的抗凝治疗,但是效果却不相一 致,究其原因可能与肝素的药理作用机制有关。有研究指出静脉内注入或雾化 吸入肝素,都只能使哮喘患者在主观上哮喘症状得到改善[47]。肝素是一种广泛应 用于抗凝的黏多糖硫酸脂,其抗凝作用依赖于与抗凝血酶结合。它引起抗凝血 酶构象变化并被激活以催化凝血因子Ila、IXa、Xa、XIa、Xlla的失活。因此, 肝素是间接凝血酶抑制剂,其并不能精准灭活凝血酶。在哮喘气道中,肝素主 要呈现出广泛的抗炎活性,对气道重塑的作用也建立在抗炎基础上[48]。研究发 现,肝素及其衍生物的抗炎活性取决于肝素的聚阴离子性质和结构可变异性,主 要通过离子结合力与体内带正电荷的蛋白质和细胞因子结合来发挥作用[49]。 Seeds[5G]等也己证实肝素对哮喘的抗炎活性与其抗凝机制无关。另外,由于肝素 间接广泛灭活多种凝血因子,具有明显的致出血副作用,目前临床实践中雾化 吸入肝素尚未被用作哮喘发作时的辅助抗炎治疗。

达比加群酯(Dabigatranetexilateon)是一种新型高效直接凝血酶抑制剂,是 达比加群的前药,在胃肠道吸收后在体内转化为达比加群。达比加群酯具有可 预测的药代动力学和功效学参数,无需频繁监测INR等凝血指标,不易与食物及 其他药物发生相互作用,患者依从性高等优点弥补了传统抗凝药华法林的不足。 自2008年上市以来,美国和其他西方权烕指南一直建议取代华法林用于心房颤 动的抗凝治疗[47]。不久之后,择期髋关节或膝关节术后静脉血栓栓塞和肺血栓 栓塞症的预防也己成为其适应症。然而,令人更加欣喜的是,达比加群对凝血酶 的非凝血功能同样有精准抑制作用。体内外研究发现[5G'511,达比加群能够特异 性阻断凝血酶催化水解PAR-1,抑制凝血酶的多种非凝血功能,如降低脐静脉 和脑内皮细胞的通透性、抑制肺成纤维细胞增殖、收缩蛋白表达及I型胶原、 结缔组织生长因子表达。凝血酶抑制肺成纤维细胞增殖、收缩蛋白表达及I型 胶原、结缔组织生长因子表达的作用在博来霉素诱导的肺纤维化模型中得到了 进一步验证[5GI。那么,达比加群酯在哮喘中的作用又是怎样的呢?新近研究表 明,在屋尘螨诱导的哮喘模型中,达比加群酯能抑制Th2型细胞因子IL-4的表达 [53]。但是,达比加群酯对哮喘气道重塑的作用目前国内外尚未见研究报道。我们课题组的体外预实验结果显示,达比加群酯对凝血酶诱导的气道平滑肌细胞 增殖及细胞外基质分泌具有抑制作用。

Hippo通路最初是在果绳的mosaicb筛选中发现的,后来在人类、小鼠和其 他真核细胞中也发现了该信号通路[55'56]。该通路有4个组成部分,这些包括上游 信号输入分子、核心激酶级联反应链、下游转录共激活因子(YAP/TAZ)和下 游调节因子,是细胞增殖、分化和组织稳态的强大调节因子,对肿瘤的发生、 发展也起到一定调节作用[57'58]。在哺乳动物进化过程中,其组成分子、作用机制 及生物学功能具有高度保守的特点。

Hippo信号通路传递细胞膜到胞核的信息,调控细胞的增殖及凋亡等生理 活动,同时调控不同组织器官的生长、分化及再生能力,参与胚胎发育、组织 器官的形成,在大多数肿瘤发生发展中也起到重要调控作用[59]。而YAP蛋白是 Hippo信号通路下游最关键的效应分子[54],发挥着调节细胞增殖、分化、感应 和传导机械压力信号等生物学效应[57]。YAP是YAP1基因的转录翻译的产物, 因此YAP蛋白也被称为YAP1 (Yes-associated protein 1)。YAP1基因在生 长、DNA修复、发育、内源稳态等方面发挥着作用。研究发现,活化状态的 YAP1可以对生物体起到一个修复的作用,例如促进组织的增殖、分化、再生, 但是在一些不需要增殖的部位发生了增殖则会导致一些不必要的麻烦。

在很多人类疾病的研究中发现,特别是心血管疾病方面如动脉粥样硬化、 高血压病等,其受损的血管平滑肌细胞会出现异常增生,出现血管管腔狭窄、 管壁增厚等非正常的生理现象,从而导致更加严重的病理生理状况。同时,在 这些受损增生的血管平滑肌中可检测到YAP蛋白的异常表达。研究表明, Hippo通路发挥作用主要通过是控制血管平滑肌的表型表达,进一步的控制血 管平滑肌的变异和增殖,从而发挥干预平滑肌细胞生长增殖的作用。YAP/TAZ 在肺动脉高压血管重构过程中也起到重要作用。肺动脉高压(PAH)的特点是血 管收缩及重构,是一种没有有效治疗的破坏性疾病[6()'61]。肺动脉高压血管重构 的特点是由于肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖增加、抗凋亡能力增强,以及肺 动脉外膜成纤维细胞、肌成纤维细胞和肺动脉内皮细胞(PAEC)功能紊乱而引起 的内侧和外膜肥大[62],使得血管刚度增加及力学线性改变。这些变化反过来也 可能促进血管重构的发展。机械信号参与了该疾病的发展,YAP/TAZ越来越被 认为是一个关键的参与者[63]〇YAP/TAZ亚细胞定位受到ECM刚度的严格控制, 硬基质驱动核定位和活化,软基质促进其保持在细胞质内[64]。近年来,已有多 项研宄表明在肺动脉高压中YAP/TAZ的机械活化与血管重构之间存在相互作 用剛。

YAP/TAZ活性的增加可能导致细胞或某些组织器官过度生长、促进迁移和 侵袭等生物过程的激活,这些己在人类多种癌症中得到证实。哮喘是一种气道 慢性炎症性疾病,影响着全球3亿多人[1]。哮喘最常见的治疗药物是消炎药和 支气管扩张剂。虽然这些药物可以减轻疾病症状,但它们无法逆转气道的既定 结构变化。因此,有必要寻找逆转哮喘气道重构的新靶点。有研究表明,气道 平滑肌细胞(ASMCs)和支气管上皮细胞的YAP/TAZ表达增加[69]。YAP/TAZ可 能通过多种机制参与哮喘的发病过程。首先,人们越来越认识到机械力调节基 因表达[7G1,通过激活YAP/TAZ来促进组织再生和重塑[717\正常肺组织的弹 性模量是5kPa,而50kPa的弹性模量足以诱导YAP/TAZ表达,驱动肺动脉内 皮细胞增殖和迁移[73]»哮喘的常见特征之一是大量的气道平滑肌细胞收缩及细 胞外基质沉积,气道上皮细胞和附近间充质细胞感知其对气道官腔及管壁产生 的异常机械压力,从而激活YAP/TAZ,诱导气道重塑[74]。其次,哮喘本质上是 一种气道慢性炎症性疾病。哮喘炎症细胞可能受YAP/TAZ调控。例如,Thl7 细胞在Th2细胞以外的哮喘发病机制中起关键作用[75]。而有研宄表明,TAZ可 促进TH17细胞分化,促进TH17细胞驱动的自身免疫性脑脊髓炎的发生发展 [76],提示TAZ可能通过调节炎症细胞促进哮喘的发生发展。此外,在其他疾病 模型中,许多与哮喘气道重塑相关的细胞因子可激活YAP/TAZ[65],其中 sphingosin -I-(SIP)被发现通过调节YAP信号来刺激ASMCs的增殖、迁移和收 缩[77]。第三,血管生成是哮喘患者气道重塑的共同特征之一,这一点己经得到

前言

了很好的证实[781

我们前期的体外实验己证实,凝血酶可通过激活YAP诱导人气道平滑肌细 胞的收缩、增殖及细胞外基质分泌,达比加群干预以及敲低YAP能明显抑制凝 血酶引起的这一系列现象。那么,在体内达比加群是否能起到减轻哮喘气道重 塑的作用呢?本研究将复制OVA经典哮喘模型,探讨达比加群酯在哮喘气道 重塑中的抑制作用及其机制。

1.1实验仪器

1、 电子天平.................................

2、 超净工作台.............................

3、 摇床.........................................

4、 4T:高速离心机......................................

5、   -80°C储存冰箱.........................

6、 -20°C低温冰箱.........................

7、 振荡器.....................................

8、 常温离心机.............................

9、 22G留置针..............................

10、 MilliporeMillex-GP 针头滤器.

11、 正置显微镜...........................

12、 细胞计数板...........................

13、 煮蛋白机...............................

14、 磁力搅拌器...........................

15、 SpectraMaxM5多功能酶标仪

17、 制冰机

18、 转膜槽...................................

19、 电泳仪...................................

20、 组织脱水机...........................

21、 EG110组织包埋机................

22、 RM2235 切片机.................................... 上海精科精密仪器(中国)

................... 苏州医疗设备厂(中国)

..............上海心仪器设备(中国)

..... Eppendorf(德国)

.... Thermoforma (美国)

...................................... 海尔(中国)

...安徽合肥艾本森科学仪器(中国)

..... Eppendorf (德国)

苏州碧迪医疗器械有限公司(中国)

............... Merk倒置显微镜(德国)

..... Olympus (日本)

................... 上海天光一分厂(中国)

..... Eppendorf(德国)

.......上海沪西仪器有限公司(中国)

.. Molecular Devices (美国)

................................... Sanyo    ( 0本)

..... Bio-Rad (美国)

..... Bio-Rad (美国)

................... SAKURA公司(日本)

.............................. Leica公司(德国)

.............................. Leica公司(德国)

 

23、光学显微镜及成像系统

1.2试剂

1.2.1主要试剂购买

1、   鸡卵清蛋白(OVA).................

2、 氢氧化铝凝胶........................

3、 PBS..........................................

4、 4%多聚甲醛...........................

5、 戊巴比妥钠............................

6、 全蛋白提取试剂盒................

7、 BCA法蛋白浓度检测试剂盒..

8、 5xSDS-PAGE蛋白上样缓冲液

9、 预染蛋白Marker...................

10、 YAP—抗.................................

11、 磷酸化YAP —抗...................

......................... Sigma公司(美国)

.. Thermo Scientific (美国)

..... Hyclone (美国)

......................... 广州学友生物(中国)

广州威佳生物技术有限公司(中国) ......江苏凯基生物技术公司(中国)

.. Thermo Scientific (美国)

......................... 中国碧云天(中国)

.. Thermo Scientific (美国)

.... Santa Cruz (美国)

....................................   CST  (美国)

北京博奥森生物技术有限公司(中国)

...北京博奥森生物技术有限公司(中国) .......南京建成生物技术有限公司(中国)

......南京建成生物技术有限公司(中国)

……南京建成生物技术有限公司(中国) ......南京建成生物技术有限公司(中国)

……南京建成生物技术有限公司(中国) ......南京建成生物技术有限公司(中国)

.............................. 广州学友生物(中国)

.............................. 广州学友生物(中国)

.............................. 广州学友生物(中国)

.............................. 广州学友生物(中国)

24> Tris-碱..........................................
25、30%丙烯酰胺溶液.............................. ........................ 杭州弗德生物(中国)
26、Tween-20......................................... ....................... 广州学友生物(中国)
27、十一烷基磺酸钠(SDS)...................... ....................... 广州学友生物(中国)
28、Tris-盐酸(PH8.8) .................................... ..................... 上海百赛生物(中国)
29、Tris-盐酸(PH6.8)..................................... ..................... 上海百赛生物(中国)
3(K RIPA............................................... .................... 江苏碧云天生物(中国)
3KPMSF.................................................. .................... 江苏碧云天生物(中国)
32、甲醇................................................. ................... 广州化学试剂厂(中国)
33、TBS 粉末........................................ .................... 武汉博士德生物(中国)
34、0.22叩 PVDF 膜............................................... ........................ 杭州弗德生物(中国)
35、磷酸酶抑制剂.................................... ................... 江苏碧云天生物(中国)
36、ECL超敏发光试剂盒......................... ........................ 杭州弗德生物(中国)
37、地塞米松干粉.................................... ............................ Sigma公司(美国)
38、维替泊芬(Verteporfin)............... ............................. MCE公司(中国)
39、达比加群酯5mg饲料........................ ......... 广州一科生物有限公司(中国)
40、达比加群酷5mg饲料........................ ......... 广州一科生物有限公司(中国)
41、达比加群酯胶囊................................ .勃林格殷格翰药业有限公司(德国)

1.3耗材

玻璃盘、瓷盘、容量瓶、量筒、玻璃板、不同规格烧杯(大、中、小)、棉 垫、刀子、剪刀、尺子、铅笔、保鲜膜、滤纸、毛笔、不同规格注射器(lml、 5ml、20ml)、酒精灯、手术剪、眼科剪、酒精灯、离心管(15ml, 50ml)、弯 镊、眼科、EP 管(500ul, 1.5ml,4ml)、样品枪(2.5ul,10ul,20ul,200ul, 1ml)、枪头(10ul,20ul、200ul,1ml)、冰盒、载玻片、盖玻片、匀浆机磁 珠及小管,震荡匀浆机

  • OVA哮喘小鼠模型建立及治疗组给药
    • OVA哮喘小鼠模型建立

SPF级6-8周龄的雄性BALB/c小鼠,购自南方医科大学实验动物中心, 重约25g/只。将所有小鼠饲养在SPF级动物室中,并予12小时光/暗循环,用 无菌水及灭菌饲料喂养小鼠。整个动物实验过程均严格按照伦理要求进行。根 据实验要求将小鼠随机分为6组;(1)空白组;(2) OVA哮喘模型组(OVA 组);(3)OVA/地塞米松组(OVA/Dex组);(4)OVA/达比加群酯5mg组 (OVA/Dab5mg 组);(5)OVA/达比加群酯 10mg 组(OVA/DablOmg 组)(6)OVA/ 维替泊芬组(OVA/Ver组)

致敏阶段:在建模的第1天和第7天致敏,总共2次。在实验前制备致敏 溶液(称重48mgOVA,加入PBS至12ml,并在过滤后加入等体积的A1 (OH) 3凝胶)。具体的致敏方法如下(1)用lml注射器吸取0.2ml致敏溶液,并 排出空气备用;(2)抓住小鼠:右手的拇指和食指抓住鼠的尾部,左手的拇指 和食指抓住鼠头部和背部的毛皮,然后拿起小鼠,尾巴被拉回来,并用尾指夹 住尾巴。腹腔向上,头低位;(3)取抽吸好致敏溶液的注射器。混匀后,针尖 朝上,平行插入皮肤后,将针与腹腔以45°方向插入腹腔,进入腹腔,回抽无 血后,注射致敏溶液;(4)致敏成功后将小鼠放回笼中,并抚摸以稳定小鼠状态。

激发阶段:在第二次致敏后,分别于第14、15、16、21、22、23天滴鼻激 发。实验前配制激发液2mg/ml OVA溶液,准备50ml离心管盛装沾有异氟烷的 纱布。具体激发方法如下:(1)麻醉小鼠:右手拇指和食指抓住小鼠尾部,左 手拇指和食指抓住头部和背部毛发,使小鼠进入含异氟醚的50ml离心管,麻醉 6秒左右;(2)取出鼠:右手拇指和食指抓住小鼠尾部并向后拉。左手的拇指 和食指抓住鼠标背部的毛皮,右手拾起尾巴并向后拉,左手小指夹住鼠的尾部, 取头高位;(3)用200ul规格移液器吸取50ul激发液,分次滴至小鼠鼻孔。最后把 小鼠放回笼中,并抚摸以稳定小鼠状态,注意观察小鼠有无鼻子瘙痒、咳嗽等 表现。

12干预组给药 2.2.1溶液配置:

维替泊芬溶液配置:1.使用生理盐水配置10%的DMSO; 2.取2.50毫升10% DMSO溶解50mg维替泊芬,注意避光,溶解2分钟;3.再取2.50毫升生理盐 水加入步骤2中;4.步骤3 —共5毫升溶液,分装至8管EP管,每管610微升, 负2(TC保存;5.每次激发前30分钟,取一 EP管,每只小鼠腹腔注射100微升。

地塞米松溶液配置:1.使用生理盐水配置10%的DMSO;2.取lmllO%DMSO 溶液25mg地塞米松,充分溶液;3.取400ul步骤2中的地塞米松溶液,加入15ml 离心管中,加入生理盐水9.6ml,分装至6管EP管,每管1.5ml,负20°C冰箱保 存;4.每次激发前30分钟,取一 EP管,室温解冻,注射剂量按2.5mg/kg体重

计算。 2.2.2干预组给药

饲料喂食达比加群酯10mg/g治疗组(OVA/DablOmg组):造模方法同上,在 第13天开始予以喂食含达比加群酯饲料(达比加群酯/饲料为10mg/g),至第24 天。

词料喂食达比加群酯5mg/g治疗组(OVA/Dab5mg组):造模方法同上,在第 13天开始予以喂食含达比加群醋饲料(达比加群酷/饲料为5mg/g),至第24天。

OVA/地塞米松干预组(OVA/Dex组):建模方法与上述相同,分别于14、 15、16、21、22、23天予以地塞米松溶液腹腔注射。在激发前1小时,称重小 鼠的体重并计算所需剂量(2.5mg/kg)。取提前配制的地塞米松溶液(具体浓 度:2.5mg/ml)室温解冻,再对小鼠进行经腹腔注射给药。具体给药方法如下:(1) 用lml注射器按小鼠对应所需要给药物的体积,抽吸取地塞米松溶液,并排出 空气后备用;(2)抓住鼠右拇指和食指抓住小鼠尾巴,并往回拉小鼠的尾部。 左手的拇指和食指抓住小鼠头部和背部的毛皮,右手取尾部后,将鼠尾拉回,

左手尾指夹住尾巴,腹腔向上,取头低位;(3)取吸好地塞米松溶液的注射器并 晃动混匀,针尖平面朝上,并且在平行插入皮肤后,将针以与腹腔45°的方向 插入腹腔,并在回抽无血液后,将地塞米松溶液注入腹腔;(4)给药成功后将小 鼠放回笼中,并抚摸以稳定小鼠状态,注意观察小鼠有无鼻子瘙痒、咳嗽等表 现。OVA/维替泊芬干预组(OVA/Ver组):建模方法与上述相同,分别在第14、 15、16、21、22、23天腹腔注射维替泊芬溶液。在激发前1小时,称重小鼠的 体重并计算所需剂量。提前取出配制好的维替泊芬溶液,室温解冻,再对小鼠 进行经腹腔注射给药。具体给药方法如下:(1)用lml注射器按小鼠对应所需要 给药物的体积取自维替泊芬溶液,取出空气;(2)抓住鼠:右手拇指和食指抓 住尾巴拉回,左手的拇指和食指抓住鼠标头部和背部的毛皮。拿起尾巴,夹住 小鼠的尾巴然后将其拉回来,腹腔向上,头低位;(3)取吸好维替泊芬溶液的注射 器,晃动混匀,针尖平面朝上,并将针平行地插入皮肤。然后将针头与腹腔以 45°的方向插入腹腔。回抽无血,将维替泊芬溶液注入腹腔;(4)给药成功后将小 鼠放回笼中,并抚摸以稳定小鼠状态,注意观察小鼠有无鼻子瘙痒、咳嗽等表 现。

  • OVA哮喘小鼠标本的留取

3.1留取血清标本

最后一次激发24小时后开始留取小鼠组织标本。(1)麻醉小鼠:用lml注 射器抽取0.2ml 1 %戊巴比妥钠溶液,右手拇指和食指抓住小鼠尾部并向后拉, 左手拇指和食指抓住小鼠的头部和背部皮毛,拿起并拉回尾巴,左手小指夹住 尾巴,腹腔朝上,头低;取出吸有麻醉剂的注射器,针尖向上倾斜,并将针平 行插入皮肤。然后针头与腹腔以45°的角度穿入腹腔,回抽完无血液后,向腹 腔内注射麻醉药;(2)待小鼠深度麻醉(肌张力明显减退)后,将小鼠侧卧位置于左 手掌,左手大拇指将颈背部皮肤轻轻向后压,使眼球最突出;(3)准备1.5mlEP管进行采血,切除小鼠血液周围眼球周围的胡须。再用眼科镊迅速摘取眼球,将 小鼠倒立,左手食指与大拇指放松并改变手势,将小鼠的放血侧放置在最低点, 用1.5ml EP管,收集流出的血液;(4)全血在室温下保存2小时,然后在低 温离心机中离心(3000g离心5分钟,4°C),上清液为血清,储存在200ulEP 管中,并储存于-80°C冰箱。

3.2支气管肺泡灌洗液及细胞分类计数、细胞涂片染色

  • 用lml注射器取2管生理盐水,分别为8ml、0.6ml; (2)取血后,

用针将小鼠固定在泡沫板上,然后沿着前中线,使用眼科剪刀剪开颈部皮肤, 用镊子轻轻地将颈部肌肉组织分开,露出气管;(3)用22G留置针穿刺气管, 进入隆突上部(观察,不要太深),缝合线固定;(4)把准备的注射器连接到 留置针上,将生理盐水缓慢均匀地灌洗到肺部,然后将灌洗液慢慢均匀地抽回。 反复两次后抽出灌洗液,保存于实现准备好的1.5mlEP管中,置于冰上,回收量约 1.0ml(回收量至少80%);                           (5)肺泡灌洗液的离心(1500ipm,5分钟,4°C);

⑹收集离心上清液,将上清液储存在200ulEP管中后,将其储存在-80°C的冰 箱中;(7)取上清液后,将剩余的细胞沉淀重新悬浮于200W生理盐水(37°C) 中,混合后取2(Hil灌洗液,计算细胞计数板上的细胞总数。

3.3小鼠肺组织处理

各组随机取3只小鼠行幵胸取肺组织。

  • 麻醉小鼠:用lml注射器抽取2ml1 %戊巴比妥钠溶液,右手拇指和 食指抓住小鼠尾部并向后拉,左手拇指和食指抓住鼠的头部和背部皮毛,拿起 小指并拉回尾巴,腹腔朝上,头低;取出吸有麻醉剂的注射器,针尖倾斜向上, 并将针平行插入皮肤。然后针头与腹腔以45°的角度穿入腹腔,回抽完无血液, 向腹腔内注射麻醉药;
  • 取血后,在泡沫板上用针固定小鼠,沿前中线用眼科剪,剪开颈部皮 肤。用镊子轻轻地分离颈部肌肉组织并暴露气管;
  • 剪开胸腔,用组织镊分离出右肺门组织,用两个组织镊夹在肺门与左

支气管出处之间,摘除右肺,并立即将其浸泡到装有4%多聚甲醛的容器中;

  • 用组织镊分离出左肺门,用两个组织镊夹在肺门与右支气管出处之间, 摘除左肺,放入冷冻管后,用液氮冷却15分钟,然后保存在-80°C冰箱中备用。

4小鼠标本检测

4.1肺组织病理检测 4.1.1制备石蜡切片

  • 将新鲜标本在4%福尔马林溶液中固定24小时,取出大小约 lcm*lcm*0.3cm的组织块,用流水冲洗12小时。
  • 依次用75%、100%的乙醇脱水,二甲苯透明三次,浸入60°C石蜡中进行 包埋。
  • 在准备切片之前,蜡块应预先冷却2小时以上(-20°C)。切片时,将嵌 入式组织蜡块固定在切片机的样品罐中,切成4um厚度的切片;将下层板置于 4(TC的温水中进行压平,然后粘附在载玻片上,自然干燥,在室温下长时间保 存。

4.1.2 HE 染色

通过HE染色观察OVA哮喘小鼠肺部病理情况。操作步骡如下:(1)取 出制备的蜡片,烘烤60分钟后,将进行脱蜡,二甲苯溶液15分钟,二甲苯溶 液15分钟,无水乙醇10分钟,无水乙醇10分钟。95%酒精10分钟,85%酒 精5分钟,75%酒精5分钟,然后在蒸馏水中浸泡2分钟;(2)去除水分(确 保蒸馏水润湿整个组织并均匀分布),然后进行核染料溶液染色5分钟,清水 洗5秒钟;(3)细胞浆染色溶液染20秒,着色剂洗2次;(4)自然干燥后, 用中性树脂密封;(5)最终观察气道、血管周围炎性细胞浸润情况;进行肺部 炎症量化评分:每组小鼠至少选取6张不同切片中的20个视野进行炎症评分。 肺炎症的量化标准有两个:支气管周围炎症和血管周围炎症。0分:没有检测 到炎症细胞;1分:偶有成套炎症细胞;2分:绝大多数支气管或血管只包绕一 层的炎症细胞;3分:大多数支气管及血管周围有2层炎症细胞;4分:大多数 支气管或血管周围包绕超过2层的炎症细胞。

  • PAS 染色

也称为糖原染色或高碘酸希夫染色。它用于显示糖原和其他多糖物质的分 布。操作如下:(1)取制好的蜡片,烤片60分钟后,依次放置二甲苯溶液一 15 分钟,二甲苯溶液二15分钟,无水乙醇一 10分钟,无水乙醇二10分钟,95% 乙醇10分钟,85%乙醇5分钟和75%乙醇5分钟。在自来水中浸泡2分钟;

  • 按照说明书予以染色、封片,最后镜下观察PAS染色情况:糖原、粘蛋白成 分为紫红色,细胞核为蓝色;(3)每组随机选取10个高倍视野,使用Image-Pro plus0软件计算有核上皮细胞总面积及PAS阳性细胞面积,使用SPSS 22.0统 计软件对PAS阳性细胞面积百分比进行统计学分析。
  • Masson 染色

Masson染色是用于显示组织中纤维染色的方法之一。它是胶原纤维染色的 权威和经典技术方法。操作步骤如下:(1)取出制备的蜡片,烘烤60分钟后, 将二甲苯溶液一 15分钟,二甲苯溶液二15分钟,无水乙醇一 10分钟,无水乙 醇二10分钟。95%酒精10分钟,85%酒精5分钟,75%酒精5分钟,然后在 蒸馏水中浸泡2分钟;(2)去掉多余水分,保持组织湿润,细胞核染色染料溶 液约60秒,倒出,用清水冲洗30秒左右;(3)细胞浆染色溶液染色约40秒, 倾倒,冲洗约30秒;(4)黄色分离溶液分离约7分钟,弃去分色溶液;(5) 蓝色复染将溶液染色约5分钟,倒出,用无水乙醇冲洗;(6)自然干燥并用无 毒中性胶密封;(7)镜检,胶原纤维呈蓝色;细胞质、肌肉和纤维素是红色的, 核是蓝紫色的;(8)最后使用成像系统,每组小鼠切片选取10个高倍视野, 用Image-Pro plus 6.0软件对蓝色纤维化区进行量化。结果以扫描蓝色区域面积 的比例表示,使用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析。

4.2肺组织蛋白免疫印迹 4.2.1肺组织全蛋白提取步骤

提前制备裂解液:根据RIPA: PMSF:磷酸酶抑制剂=100: 1: 1的比例配置

裂解液。

  • 称量肺组织(每个标本剪30mg左右),放入震荡均质器的小管中, 按200ul/20mg的比例加入制备的裂解液,加入磁珠,在震荡匀浆机中迅速 匀浆,30S/次,3次,直至肺组织呈液态,看不见颗粒(若仍有组织颗粒,可重复)。
  • 用lml移液枪将匀浆移至5mlEp管中,冰上放置lOmin,然后将蛋白 质放入预先冷却的4°C离心机中,转速为15000rpm,30min。
  • 离心结束后,将上清液转移到另一个1,5mlEP管中并测量体积(避免 吸到沉淀物)。
  • 根据BCA法蛋白质含量检测试剂盒说明书确定蛋白质浓度(取20)。 将5x上样缓冲液加入剩余的蛋白质中(加入体积为剩余蛋白质体积的1/4)。 并在振荡器中摇动并置于煮沸的蛋白质仪器中。在100°C下煮沸10分钟使 蛋白质变性。

(4)将完全变性的蛋白质样品分配到1.5 ml EP管中,立即储存在-80QC冰 箱中或直接进行蛋白质分析免疫印迹。

4.2.2蛋白浓度的测定

  • 制备蛋白质标准溶液(5mg/ml);
  • 配制BCA工作液:试剂A与试剂B按50: 1配制适量工作液,充分 混匀(200ul/孔);
(3)按下表加样

编号 A B c D E F G H 样品
工作液(ul) 200 200 200 200 200 200 200 200 200
PBS(ul) 20 19 18 16 12 8 4 0 16
BSA(ul) 0 1 2 4 8 12 16 20 0
蛋白样品 0 0 0 0 0 0 0 0 4
  • 添加完成后,在37°C下孵育30分钟;
  • 孵育后,用酶标仪测定OD值(波长562pm),用EXCEL绘制标准 曲线,根据标准曲线计算蛋白质样品的蛋白质浓度
  • 计算样品量:在随后的凝胶电泳中,选择20路蛋白质体系,样品的 体积V是蛋白质加载量(20呢)与浓度C的比率。

4.2.4蛋白免疫印迹技术(YAP分子量75KD)

4.2.4.1液体配制

  • 10%SDS:称取lgSDS粉末,溶于10ml去离子水中,摇动并混合, 并在室温下储存。
  • 10%AP:称取O.lgAP,溶于lml去离子水中,摇匀混合,现用。
  • 5x电泳液(储备液):按Tris碱(55g)、甘氨酸(47克)、SDS (2.0g)比例,涡旋溶解在500ml去离子水中,并在4°C下储存。
  • lx电泳溶液(工作液):现在配好后即可使用,测量1〇〇毫升储备溶 液并在400毫升去离子水中稀释。
  • l〇x转移溶液(储备溶液):按57克Tris碱的比例;甘氨酸:37.54g, 涡旋溶于250ml去离子水中,并在4°C下储存。
  • lx转膜溶液(工作溶液):现配即可使用,取50mll〇x转移溶液, 并用100ml甲醇在350ml去离子水中稀释。
  • TBST:取一包TBS粉末,将其溶于2000ml去离子水中,在涡旋中混合约30分钟。至液体澄清无明显的粉末,期间缓慢加入4ml的Tween-20。置 于4°C冰箱储存。
  • 5%BSA封闭溶液:称量5gBSA粉末,溶于30mlTBST中,摇动 并混合,并储存在4°C的冰箱中。

3A3.2免疫蛋白印迹

  • 电泳装置组装:用去离子水清洗四块干净的玻璃板和梳子,自然干燥 或在60°C的培养箱中干燥。组装玻璃板,底座和橡胶框架,注意玻璃板的方向, 短板朝内,上下对齐;
  • 测漏试验:用塑料移液管将去离子水加到长板和短板之间的凹槽中, 没到短板边缘,等待约10分钟,观察液位是否下降。如果有下降,请移除设备 并重新开始。如果没有,请使用干净的干燥滤纸吸去离子水,以确保水箱干燥;
(3)分离凝胶的制备:选择配置10%丙稀酰胺分离胶,具体成分比例、添 加顺序见下表:

试剂 体积(ml)
去离子水 5.7
30%丙烯酰胺 5.1
Tris 盐酸(pH6.8) 3.9
10%SDS 0.15
10% AP 0.15
TEMED 0.006
总计 15.06

(4)灌注分离凝胶.•将上述成分加入50 ml离心管,最后加AP和TEMED, 然后快速混匀,并使用lml样品枪同时将分离凝胶填充到两个玻璃罐中。每次 离开时都要小心避免出现气泡。使用塑料移液管向两侧的玻璃罐中加入一定量 的去离子水,以覆盖分离凝胶表面并隔离空气,促进分离胶的快速固化。注意 控制水的强度,避免冲压凝胶表面;

 

  • 大约40分钟后,在分离胶与去离子水交界处可观察到平直的分界线,
代表胶己凝固,倾斜装置倒出水,用干净的滤纸小心吸尽胶面以上的水; (6)配置浓缩胶:配5 %丙稀酰胺的浓缩胶,比例如下表:

试剂 体积(ml)
去离子水 2.7
30%丙烯酰胺 2.1
Tris 盐酸(pH6.8) 0.5
10%SDS 0.04
10% AP 0.04
TEMED 0.004
总计 5.384
  • 浓缩凝胶的灌注:将上述成分加入50ml离心管中。加入AP和TEMED 后,快速混合并混合,用lml样品枪将浓缩的凝胶倒入分离橡胶表面。避免产 生气泡。然后快速将梳子插入平面和垂直方向,并使用20ul样品枪吸收溢出的 凝胶;
  • 上样和电泳:凝胶在约30分钟内固化。取下底座,将橡胶框架插入 电泳槽,在内槽中加入新的lx电泳溶液,然后从末端拉出梳子。将蛋白质样品 从-80°C冰箱中取出并解冻并摇动。根据最大装载量,用lxLoadingBuffer填充 其他样品体积。从左到右依次添加标记物(4txl)和每个样品。将外罐加入到先 前(3次或更少)回收的lx电泳液中,没过橡胶板的底部。插入电泳仪,调整 电泳参数,将浓缩胶的参数设置为80V,时间30分钟,观察色带进入分离层, 调整参数,电压120V,时间100分钟;
  • 转膜过程:当色带移至距玻璃板底部约3cm的距离时,开始转膜准 备。配制lx转移液并预先冷却,准备剪刀、镊子、刀片、尺子、铅笔、瓷盘, 根据目标蛋白质的分子量,比较标记条带示例,切出合适的PVDF薄膜。取下 玻璃板,撬开两块玻璃板,注意避开橡胶块。在凝胶上滴一点去离子水,使其

保持湿润。根据Markei•的分子量,找到目标蛋白质所在的区域。用刀片切割上 边缘和下边缘,并切除一半标记带,并将切割的胶转移到含有回收的lx转移液 (在3次内)的瓷板中。在瓷板中,薄膜夹(黑色向下),用转膜液润湿的棉 垫和厚滤纸从底部到顶部放置。将切割的PVDF薄膜剪一个标记,将其放入装 有甲醇的玻璃盘中,滲透1分钟,用镊子夹住并小心地盖胶上以避免气泡。再 次小心地盖住湿的厚滤纸和棉垫,然后用滚筒驱除气泡,然后关闭胶片夹。将 转移膜支架放入转移膜槽中,并将预冷却的新鲜lx转移溶液倒入转膜槽内中。 将电流设定为200mA。根据靶蛋白的分子量和实验经验确定时间。在该研究中, YAP和p-YAP蛋白的分子量为75KD,p-actin分子量为43KD,膜转移时间为 90分钟。

  • 封闭:将制备的5%BSA以每格5ml的量加入封闭的盒子中,取出 PVDF膜,根据右上角的标记将蛋白质面朝下放入封闭的盒子中。将封闭的盒 子置于室温振荡器中并缓慢温育1小时;
  • 一抗孵育:弃去封闭溶液,用于TBST将膜洗涤3次,5分钟每次, 并在室温下于快速摇床上洗涤PVDF膜。根据一抗说明书,用5%BSA稀释一 抗(1: 1000)。用一抗将PVDF膜覆盖在盒子中,将其置于4°C摇床中,孵育 过夜;
  • 二抗体的孵育:回收第一抗体,每次用TBST洗涤膜3次,每次5 分钟,并在室温下快速洗涤膜。用5%BSA以1: 5000的比例稀释二抗。选择 相应的二抗浸泡PVDF膜,在室温下在慢速摇床上孵育1小时;
  • (显影):在二抗孵育后,回收第二抗体,并且每次用TBST洗涤 3次,每次5分钟。在避光中将ECL发光液体与A和B液体以1: 1的体积比 例混合。在胶片清洗结束前打开显影单元。在避光环境中,将PVDF膜蛋白表 面颠倒,并加入混合的ECL发光液以覆盖膜,并等待反应1-2分钟。将PVDF 膜蛋白面朝上,放入显影装置,选择程序自动曝光,等待显影结束,拍照;
  • 蛋白质印迹结果分析:使用ImageJ图像分析软件分析显色条带的灰度值,p-YAP/t_YAP灰度比值表示为YAP活化程度。

5统计学方法

使用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行统计学分析。数据均采用均数土 标准差表示。若符合方差齐性的比较,则采用最小显著差别(LSD) -t检验。 采用单因素方差分析(One-wayANOVA)对多个组间的多个样本的均数进行比 较分析,比较各组间的差异则采用LSD-t检验进行分析。对于多个独立样本的 两两比较,采用Mann WhiteneyU法进行比较。差异具有统计学意义,标准为 P<0.05〇

结果

1 一般表现

实验前,各组小鼠行为能力及毛发正常;在模型准备过程中,模型组及干预组 具有不同程度的异常表现。

  • 空白组.•在激发时无呼吸急促、烦躁不安等表现,毛发有光泽。
  • OVA组:激发约10分钟后,有不同程度的烦躁,耳朵和鼻子不同程度地被 抓伤,呼吸短促,多次激发后有大小便失禁等症状,严重的有行动迟缓或伏案 不动,毛发松散,无光泽。
  • OVA/Dex组:激发约10分钟后,呼吸稍快,无明显烦躁,无大小便失禁, 无行动缓慢及伏案不动现象,毛发有光泽。
  • OVA/Dab5xng及OVA/DablOmg组;激发约10分钟后,有轻度的烦躁不安, 呼吸稍快,偶有大小便失禁,无呼吸减慢,无行动缓慢及伏案不动现象,毛发 有光泽。
  • OVA/Vei组:激发约10分钟后,有轻度的烦躁不安,呼吸稍快,偶有大 小便失禁,无呼吸减慢,无行动缓慢及伏案不动现象,毛发正常。

2气道炎症

肺泡灌洗液进行细胞计数,结果显示OVA模型组BALF中细胞明显升高, 与空白组有统计学差异(P<0.001) ; OVA/地塞米松组与OVA模型组相比较, BALF中细胞计数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.001) ; OVA/达比加群 酯5mg组BALF中细胞数较OVA模型组明显减少,差异有统计学意义 (P<0.001) ; OVA/达比加群酯10mg组及OVA/维替泊芬干预组BALF中细胞 数均较OVA哮喘模型组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(结果见图 1)

图1达比加群酯可减少肺泡灌洗液中的细胞 (**P<0_00Ws.空白组;#P<0.05vs.OVA 组;邱P<0.001vs.0VA 组)

Figure 1. Dabigatran etexilate reduced the number of cells in alveolar lavage fluid

(**P<0.001vs.空白组#P<0.05vs.OVA 组;肋PCO.OOlvs.OVA 组)

每组的小鼠肺切片均行HE染色以评估肺部炎性细胞浸润情况,包括支气 管和血管周围炎症的浸润。

  • 空白组结果示:正常小气道及肺泡结构,气道上皮完整,粘膜无水肿, 气道壁上的平滑肌层没有增厚,血管和气道周围的炎症细胞很少(图A);
  • 与空白组相比,OVA组上皮增生明显,上皮不完整,黏膜褶皱增大, 官腔狭窄,平滑肌层增厚。血管及气道周围炎症细胞浸润明显增加(p<0.001)(图 B、G);
  • 地塞米松组结果示:与OVA组相比,粘膜上皮完整性增加,血管和 气道周围炎症细胞明显减少(p<〇.〇5)(图C、G);
  • 达比加群酯5mg组结果示:与OVA组相比,粘膜上皮完整性增加, 没有明显的平滑肌层增厚,血管和气道周围炎症细胞明显减少(p<〇.〇5),与 地塞米松组相近(图D、G);
  • 达比加群酯10mg组结果示:与OVA组相比,粘膜上皮完整性增加 血管和气道周围炎症细胞减少(图E、G);
  • YAP抑制剂维替泊芬组结果示:与OVA组相比,粘膜上皮完整性增 加,粘膜肌层无明显增厚,血管和气道周围炎症细胞明显减少(p<〇.〇5);与 达比加群酯5mg组相比,炎症细胞浸润情况相近(图F、