基于脑-肠轴调控的 开心散抗抑郁功效物质基础研究论文

2020年2月8日21:13:44基于脑-肠轴调控的 开心散抗抑郁功效物质基础研究论文已关闭评论

基于脑-肠轴调控的开心散抗抑郁功效物质基础研究论文

摘要

在课题组前期研究的基础上,我们发现中药复方开心散具有显著的减轻慢性应激压力 (CUMS)模型小鼠抑郁样行为的作用。对中外文献调研的过程中,我们发现慢性压力应 激导致的下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal,HPA)轴过度激活,打破肠 道菌群组成平衡状态,导致炎症因子大量产生,破坏肠道屏障,增加血脑屏障通透性,导 致中枢神经炎症的发生。以上过程可能在抑郁症的发病环节中起重要影响。因此本论文拟 采用CUMS模型评价开心散调控肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统抗抑郁效用,比 较开心散不同配伍比例的作用差异。进而根据上述系统构建细胞模型筛选功效物质。基于 筛选所得的有效成分,进行配伍组合优化比例,获得开心散功效组分并釆用整体动物实验 验证其抗抑郁效用。本论文以首先从整体动物层面揭示效用、进而根据作用机制建立细胞 模型筛选功效物质、最终获得功效组分再回归整体动物模型进行验证的研宄思路进行。论 文分为五个章节,主要研宄的内容摘要如下:

一、 文献研宂

  1. 对抑郁症临床的发病率、危害性和用药情况,抑郁症病理机制的认识与肠道微生态 -压力应激-中枢神经炎症三大系统在抑郁症病理机制中的作用及相互关系进行综述。
  2. 对中药复方治疗抑郁症的研究进展进行综述。
  3. 对开心散方剂的源流和现代研究进展进行综述。

二、 通过肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统阐明开心散抗抑郁作用机制

  1. 开心散抗抑郁效用评价

本节釆用CUMS模型小鼠作为研究对象,通过行为学评价,如糖水偏嗜实验(SPT)、 强迫游泳实验(FST)、悬尾实验(TST)、开场实验(OFT),发现幵心散的不同配伍比例 均有减轻动物抑郁样行为的功效,其中以人参、远志、石菖蒲、茯苓配比为3:2:2:3 (D_652) 的开心散配伍比例抗抑郁效用最佳。

  1. 开心散调控脑-肠轴作用机制研究

本节分为三部分。第一部分考察了开心散调控肠道微生态抗抑郁的作用机制。以CUMS 模型小鼠的小肠、粪便作为待测生物样本,釆用了酶联免疫吸附(ELISA)法检测小肠组 织中的炎症因子表达情况,发现开心散降低模型小鼠小肠组织炎症因子的表达。我们还发 现模型出现小鼠肠道菌群结构失衡,革兰氏阴性菌相对丰度增加、肠道屏障受损等肠道微生态紊乱现象,而开心散各配伍比例可以降低革兰氏阴性菌的相对丰度,上调屏障蛋白表 达,以D-652的效用最佳。

第二部分选取CUMS动物的脑组织和血清样本进行研宄,发现开心散能够显著下调模 型小鼠血清和脑中炎症因子的表达,同时也能够上调血脑屏障蛋白表达,显示其具有抑制 中枢神经炎症的作用。

第三部分以CUMS模型小鼠HPA轴相关组织,如下丘脑、肾上腺、海马区、血清,测 定压力因子表达。结果发现开心散可以下调模型动物组织和循环中压力因子表达,显示其 具有抑制压力应激导致的HPA轴过度激活的作用。

三、 开心散调控肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统的功效验证

在CUMS模型构建的同时给以抗生素,改变小鼠肠道菌群组成结构,给以开心散并检 测行为学变化。进而釆集生物样本检测与三大系统相关的各项因子并结合肠道菌群分析, 发现开心散调控三大系统的抗抑郁作用能被抗生素所削弱,提示肠道微生态的调控是开心 散实现其抗抑郁效用的重要环节。

四、 基于细胞模型筛选开心散抗抑郁功效物质

  1. 基于肠道炎症模型的功效物质筛选

本节采用小鼠巨噬细胞细胞系(RAW264.7)和小鼠结肠上皮隐窝细胞系(IEC-6)作为 细胞模型,分别检测在LPS刺激作用下,开心散对炎症因子与肠道屏障蛋白表达的影响, 发现人参皂苷Rgl可能为基于该环节的功效物质。

  1. 基于中枢神经炎症模型的功效物质筛选

本节采用小鼠小胶质细胞系(BV2)与原代小鼠皮层星形胶质细胞(MCAST),检测在 LPS刺激作用下开心散对炎症因子与血脑屏障蛋白表达的影响。采用小鼠海马神经元细胞 系(HT22)作为中枢炎性损伤保护的细胞模型,检测在TNF-a损伤下开心散对细胞存活的 保护作用。发现石菖蒲中的细辛醚成分以及人参皂苷类成分是基于此系统的功效物质。

  1. 基于压力应激模型的功效物质筛选

本节釆用大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞细胞系(PC12)和人神经母细胞瘤细胞系(SHSY-5Y), 检测了开心散对压力因子皮质醇(Cortisol)损伤细胞的保护作用。通过对细胞存活率进行 检测,发现在压力应激模型上细胞保护作用趋势最强的物质为来源于远志的远志口山酮III、 来源于石菖蒲的细辛醚类与茯苓的三萜酸类成分。

五、 通过组分配伍,在整体动物模型上验证开心散的功效物质基础

基于上述的细胞模型筛选结果,我们选择了四种分别来源于四味药材的单体化合物:

人参皂苷Rgi、远志口山酮III、a-细辛醚、茯苓酸。采用悬尾与强迫游泳模型,利用正交 试验优化组分配比。然后在CUMS动物模型上进行验证,发现该组分配伍具有显著的抗抑 郁效用,与开心散原方作用相当且具有量效关系。

本研究对开心散抗抑郁的功效物质基础进行了积极探索,揭示了其抗抑郁的功效物质。

关键词:开心散;肠道微生态;压力应激;中枢神经炎症;组分配伍;物质基础

Abstract

Based on our previous studies, we find that the traditional Chinese medicine formula Kai-Xin- San (KXS) significantly ameliorate depression-like behaviors of chronic unpredictable mild stress (CUMS) induced depression animal models. In studying literatures, we find that the cascade of Hypothalamus-Pituitary-Adrenal (HPA) axis stimulation significantly altering gut microenvironment and inducing central neuronal inflammation played an important role in pathogenesis of depression, which is summarized as regulation of''micro ecology-HPA-neuronal inflammation” axis. This hypothesis is also identified with TCM reorganization of depression, which is described as “deficiency of heart and spleen”. Therefore,we developed CUMS depression mice model to evaluate the antidepressant effect of KXS based on regulating gut microbiota-stress- central neuronal inflammation system. Moreover, the anti-depression substance of KXS were screened on series of cell models. Afterwards, the screened substances were re-combined to be verified on CUMS animal model. The paper is divided into four chapters, and the main research content is summarized as follows:

  1. Reviewof previous studies on depression and KXS.
  2. Inthis part, etiology of depression was summarized.
  3. Inthis part, research of anti-depression mechanism of Chinese medicine formulae were summarized.
  4. Inthis part, history and anti-depression mechanism studies of KXS were introduced.
  5. Elucidatinganti-depression mechanism of KXS on regulation of gut micro ecology-stress- central nervous inflammation system.
  6. Anti-depressionefficacy evaluation of KXS.

In this section, CUMS depression mice were used as animal model. A series of behavioral tests, such as sucrose preference test (SPT), forced swimming test (FST), tail suspension test (TST), and opening field test (OFT), were applied for evaluation of anti-depression effect of KXS with different compatibility ratios.

  1. Theanti-depression mechanism of KXS in regulating gut micro ecology.

In this section, the gut microbiota distribution was evaluated by 16sRNA technology by analyzing feces of animals. The inflammatory factors and gut barrier protein in the small intestine were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and western blotting method. We found that KXS treatment could modify the disturbed microbiota distribution, dowoiregulate the enhanced inflammatory factor expressions and upregulate the decreased gut barrier proteins.

  1. Theanti-depression mechanism of KXS in regulating central neuronal inflammatory system

In this section, expressions of inflammation cytokines were determined in brain and blood brain barrier proteins tissue and serum in model animals. KXS treatment could significantly decrease expressions of inflammation cytokines in brain tissues and serum. Meanwhile, the expressions of blood brain barrier proteins were also up-regulated by KXS treatment. Therefore, it seemed that the anti-depression effect of KXS was related to regulation of central neuronal inflammation system.

  1. Theanti-depression mechanism of KXS in regulating the stress system

In this section, the expression of stress factors in related organs of HPA axis of CUMS model animals were determined, including hypothalamus, adrenal gland, hippocampus and serum. The results showed that the enhanced expression of stress factors in organs and serum could all be down regulated by KXS treatment, which indicated that the anti-depression efficacy of KXS was related with HPA axis regulation.

  • Validationof anti-depression efficacy of KXS in regulating gut micro ecology-stress-central inflammation system.

In the animal experiment in this section, a mixed solution of antibiotics was added to animals' drinking water while the CUMS model was established. The antibiotic mix decreased the levels of intestinal bacteria in intestine of the animals. Then anti-depression efficacy of KXS treatment was impaired by antibiotics treatment, which implied that KXS exerted anti-depression effect via regulation of gut micro ecology-stress-central inflammation system.

  1. Screeningthe substance basis of anti-depression effects of KXS based on cell models.
  2. Screeningoffunctional substances based on intestinal inflammation cell models.

Mice RAW264.7 and IEC-6 cell lines were applied as cell models. The effect of KXS on expressions of inflammatory cytokine and barrier proteins were evaluated under conditions of normal and LPS stimulation. Ginsenoside and poria polysaccharides were found to decrease overexpressions of inflammation cytokines led by LPS stimulation.

  1. Screeningof functional substances based on the stress model.

Mice BV2 cell lines and primary mouse cortical astrocytes (MCAST) were used for test expressions of cytokines and blood brain barrier proteins under cytokine stimulation. Besides, mice hippocampal neuronal cell lines were employed as cell model to test cell viability under cytokine damages. It was found that asarones and ginsenosides might be the active substances in regulating neuronal inflammation system.

  1. Screeningof functional substances based on stress cell models.

Rat PC 12 cells and human IEC-6 cell lines were applied as cell models. The effects of KXS on cell viabilities were evaluated under corticosterone stimulation. Polygalaxanthone III, asarones and triterpene acids might be the active substance protecting cells from corticosterone damages.

  1. Verifyingthe material basis of the efficacy of KXS on animal model.

Based on the experimental results of the above cytological studies, we selected four compounds derived from the four herbs respectively: ginsenoside Rgi, polyxanone III, alpha- asarone and pachymic acid. We optimized the compatible ratio of four compounds by orthogonal test and applied FST and TST models to test the anti-depressive efficacy. Afterwards, the anti- depressive efficacy was further evaluated on CUMS animal model. It was found that the compound combination exerted obvious anti-depression effect, which was similar to KXS formula.

Key words: Kai-Xin-San; Gut micro ecology; Stress; central neuronal inflammation; component compatibility; material basis.

 

刖目

随着社会的发展,生活节奏的加快,人们的生活压力越来越大,罹患精神疾病的风险 也越来越重。抑郁症是一种以长期心情低落现象为核心症状的精神疾病,除此之外,抑郁 症患者还经常出现厌食、社会交流障碍等症状,严重时容易出现自杀倾向。目前已经上市 的抗抑郁药物主要为丙咪嗪、氟西汀、文拉法辛等单胺类神经递质重摄取抑制剂,提升抑 郁症患者中脑内单胺类神经递质含量,达到抗抑郁功效。然而,这些药物对40%抑郁症患 者无效,而且有时会加剧抑郁症促使患者自杀。这些事实说明,抑郁症的发病环节绝对不 止单胺类神经递质系统失调这一种,而是存在其他可能的发病机制。现代研宄证实,抑郁 症是发病环节极为复杂的情志疾病。除单胺类神经递质系统失调外,神经营养供给下降与 神经发育受阻、神经内分泌系统紊乱、都是抑郁症发病重要的病理环节。单一解决单胺类 神经递质系统失调的问题无法取得满意的治疗效果。抑郁症治疗药物需要从多环节,多靶 点,多层次起效,才能解决这一复杂疾病。

多环节作用,多靶点起效是中医药治疗的特色与优势。中医药论治抑郁症有着悠久的 历史。开心散是经临床的中医治疗轻、中度抑郁症的有效方剂。该方始载于唐代著名医家 孙思邈所著《备急千金要方》,由人参、远志、石菖蒲、茯苓四味药组成。原书“主心气不 足,五脏不足,甚者忧愁悲伤不乐,忽忽喜忘,朝差暮剧,暮差朝发狂眩”的描述非常类似 于今天临床所见的抑郁症。开心散不仅是世界上最早的“忧愁悲伤不乐”治疗记录,时至今 日,仍然广泛应用于中医临床抑郁症的治疗。

课题组前期研宂发现,神经递质与神经营养因子调控是开心散抗抑郁的重要作用靶点。 开心散通过上调神经递质与神经营养因子合成酶,下调降解酶的表达提升两类物质的表达, 同时还可增益神经生长因子(NGF)促进神经元生长。人参与远志是发挥这些作用的主要 药材,人参皂苷为主要效用组分。但是,开心散中除石菖蒲的有效成分细辛醚外,人参中 的成分人参皂苷,远志中的远志皂苷,茯苓的多糖与三萜类成分,大多难以穿透血脑屏障, 进入中枢神经系统。因此目前研究结果尚无法合理解释开心散抗抑郁作用机制,提示开心 散抗抑郁可能存在其他机制。

近年研究发现,压力应激-肠道微生态-中枢神经炎症系统紊乱是抑郁症重要的病理机制。 慢性压力应激激活HPA轴,导致促肾上腺皮质释放激素(corticotropinreleasing factor,CRF) 大量释放,导致肠道粘膜壁通透性增加,使肠道致病菌易位至肠系膜淋巴结或循环系统, 激活巨噬细胞,产生大量炎性因子。并进入大循环,由血脑屏障上的相应炎性因子转运体 携带入脑,激活小胶质细胞,继而产生大量炎性因子,诱发中枢神经炎症。慢性压力应激 还可改变肠道微生物组成,导致肠道内有益菌的减少和有害菌的增加,增加肠道炎症的发 生几率,并释放内毒素、脂多糖等有害物质进入大循环,破坏血脑屏障,进而加剧中枢神 经炎症。脑内炎症因子的大量累积导致神经递质5-HT与神经营养因子NGF与BDNF表达 下降,直接影响神经元生长发育与传导功能发挥,最终导致抑郁症的发生。因此,调控压

力应激-肠道微生态-中枢神经炎症系统抗抑郁是目前抑郁症治疗的研宄热点。

中医药对抑郁症的病机分析与用药经验与现代医学的压力应激-肠道微生态-中枢神经 炎症系统导致抑郁的认识不谋而合。中医认为,抑郁症病位在脑,在脏为心。心为脾母, 脾为心子。脾的运化功能,有赖于心血滋养,心神统辖。脾运化水谷精微,由脾气转输至 心,滋养心血心神。心气虚弱可致脾运失健,夜不安寐。脾失健运,则血生化乏源,导致 心血不足;运化无力,则易聚湿成痰,上蒙清窍,出现头重如裹,体重乏力,神疲嗜睡等 症。母病及子,子病及母,导致“心脾两虚”。长时间的忧愁不解,容易伤脾,导致精神紧 张,神思恍惚,神志失常。从现代医学来看,“脾”的运化吸收功能主要是在肠道的小肠部 位进行,“心”主神明,则主要在脑。因此,中医药基于心脾的关系治疗抑郁症的认识与现 代医学揭示的抑郁症病理环节中的压力应激-肠道微生态-中枢神经炎症系统调节认识不谋 而合。

细考开心散方剂组成,结合古今抑郁症用药频次分析,我们发现人参、石菖蒲、茯苓不 仅是中医治疗神志疾病的常用药味,而且也常用于脾胃疾病治疗。开心散中的主要药味人 参的有效成分人参皂苷可以通过抑制肠道炎症,外周起效,抑制色氨酸犬尿酸代谢通路, 提高5-HT水平,降低抑郁动物的HPA轴激活,发挥抗抑郁作用。

因此,本研宄拟构建慢性压力应激抑郁动物模型,评价开心散基于肠道微生态-压力应 激-中枢神经炎症系统抗抑郁效用并揭示作用机制。同时,通过根据该调控系统的各个病理 环节,构建细胞模型,挖掘开心散功效物质基础。进而将其组合并在整体动物上加以验证。 从而为经典名方开心散抗抑郁作用机制的阐释与抗抑郁药物开发提供更丰富的现代科学 依据。

 

第一章文献研究

第一节抑郁症的临床治疗和作用机制研究进展

抑郁症是一种精神类疾病,常伴有心情忧郁不乐、忧愁悲伤、食欲不振等症状,严重时 会使抑郁症患者产生自杀念头[1]。作为一种常见的精神类疾病,抑郁症在近年来正在迅速 的危害人类的身体健康。目前抑郁症是继心脑血管疾病、糖尿病、癌症之后的危害人类健 康的第四大杀手。并且正在逐步愈演愈烈。本节的综述将从抑郁症目前发病状况的临床研 宂入手,总结抑郁症发病的作用机制,并对HPA轴的内容进行详细的阐述。

  1. 抑郁症的临床治疗研究

临床上抑郁症的发病种类多样,类型不一。目前认为的抑郁症的发病类型大致如下几 类。包括破坏性心境失调障碍[2]、持续性抑郁障碍或者恶劣心境[31、经前期烦躁障碍^、物 质/药物所致的抑郁症[5]、由于其他躯体疾病所导致的抑郁症[6]等。此外,对于其他特定或 者未特定的抑郁症,相关的临床报道也相当丰富。

第一代抗抑郁药物出现在20世纪50年代,影响最大的是异丙嗪和丙咪嗪。异丙嗪为 单胺氧化酶的抑制剂[7]、而丙咪嗪是三环类抗抑郁药物单胺氧化酶可以促进单胺类神经 递质的降解,因此针对单胺氧化酶的抑制显然能够改善抑郁症的病情。三环类抗抑郁药物 的神经活性多样,除了增加突触间神经递质浓度外,还有其他作用。这两类药物还有多种, 此处不一一列举。值得一提的是,这类单胺氧化酶类抑制剂的副作用很大,包括引起高血 压和性功能衰退等。三环类抗抑郁药还会引起心率失常[9]

第二代抗抑郁药物为5-羟色胺重摄取抑制剂氟西汀是第一个该类型的药物。该药 物较为安全,因此也成为了目前最广泛的抗抑郁药物。进而,去甲肾上腺素重摄取抑制剂 也被开发,比较著名的是文拉法辛。这类药物的作用也是提高单胺类神经递质在突触间的 浓度。但这些药物也有副作用,主要是胃肠道不适反应和失眠等[11]

此外很多抑郁症患者对于第一代、第二代抗抑郁药的敏感性不强,这个比例达到40%。 也因此出现了一些非典型抗抑郁药物用于治疗重度的抑郁症。与喹硫平和阿立哌唑。喹硫 平是5HT-2A和多巴胺D2受体的拮抗剂,阿立哌唑对5HT_2A有拮抗作用[12]。这些机制也 是为了提高突触间神经递质的浓度。此外,还有褪黑素受体的激动剂阿戈美拉汀[13],也可 以基于褪黑素的调控来实现抗抑郁的功效。

除了药物治疗,抑郁症的治疗还包括电休克治疗、颅磁刺激治疗和迷走神经刺激治疗等。

抑郁症也是一种心理疾病[14],釆用心理学的手段也能够对抑郁症进行干预。这些心理 疗法包括认知疗法、认知行为疗法等。

最新的研究认为,大脑外侧缰核的簇状放电是抑郁症发生的充分条件,而氯胺酮能够 抑制这种放电,这种机制与NMDA受体有关[15]。氯胺酮快速抗抑郁的作用提示抑郁症的发病和谷氨酸能系统异常有关。但是氯胺酮是一种毒品,其安全性还有待研究[16]

2抑郁症的发病机制

通过长期以来对于抑郁症的研宄,抑郁症的发病机制大致可以归纳为如下几个方面。 这些研宄充分表明,抑郁症的发病是一个多系统相关的病症,而绝非传统意义上认为的一 般精神疾病。

2.1单胺类神经递质假说和受体假说

单胺类神经递质系统失衡导致了单胺类神经递质的含量降低,受体功能异常是该假说 的核心内容。该假说认为单胺类神经递质5-HT在抑郁症的发病过程中扮演着重要角色。 同时DA和NE也参与了抑郁的发病环节。临床上通过对单胺氧化酶的抑制、抑制单胺类 神经递质的重摄取,上调受体功能可以治疗抑郁症[17]

2.2抑郁症细胞分子机制假说

抗抑郁药物能够增强G蛋白偶联受体的活性,以及cAMP信号通路的活性,PKA/PKC 通路的传导失衡是抑郁症发病的关键环节。抗抑郁药物可以长时间缓慢激活转录因子 CREB来发挥抗抑郁的作用^1。

2.3细胞因子假说

机体的免疫系统激活导致的细胞因子主要是炎性因子和压力因子过量分泌导致了抑郁 症的产生,这主要与HPA轴的功能有关[19]

2.4兴奋性氨基酸系统

其中,y-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸系统是与抑郁症发病最为密切的系统。谷氨酸含 量过高会导致NMDA受体过度激活,从而引起神经元的变性坏死。而GABA异常表达, 则同样会造成神经元的死亡,这种情况经常出现在抑郁症患者的脑中[2G]

2.5神经内分泌系统

抑郁症患者的内分泌系统紊乱,主要为雌激素和甲状腺激素的含量低于正常人水平。 临床上可以通过提高患者的激素水平来治疗抑郁症[21]

3抑郁症的临床常用的西药治疗手段

虽然抑郁症机制复杂,发病环节多样,但是临床上尚未有效果非常全面的抗抑郁药物 的面世。目前所用的药物多为单胺类神经递质重摄取抑制剂,将其用药的情况简要概述如 下。这类药物通常为单胺氧化酶抑制剂苯乙肼等、三环类抗抑郁药阿米替林[24]等、选择 性5_HT重摄取抑制剂氟西汀等、DA选择性抑制剂安非他酮等、5HT-2受体拮抗剂尼法唑 酮等、和一些其他非典型抗抑郁药。除此以外,上文提到的电休克法和心理治疗法也有涉及[25-27]

4下丘脑-垂体-肾上腺轴假说 4.1 HPA轴与抑郁症

HPA轴是抑郁症的关键发病环节目前己经被许多研究所证实。从HPA轴的功能出发来 治疗抑郁症也是目前的热点之一。HPA轴,即下丘脑-垂体-肾上腺轴,是神经内分泌系统 的一条重要的调控路径(见图M-l)。HPA轴的激活与压力密不可分[28_3G]。抑郁症的发病 原因多样,但是过量的压力目前被认为是抑郁症发病的最主要原因。压力应激下,HPA轴 被激活,被激活的HPA可以在轻度压力下维持机体稳态,但过量的压力会引起HPA轴功 能失调,从而引起抑郁症。具体表述如下。应激压力作用于下丘脑室旁核与杏仁核,释放 CRF; CRF促进垂ACTH; ACTH促进肾上腺皮质(adrenal gland cortex)分泌皮质醇(cortisol); 皮质醇作用于海马部位糖皮质激素受体,产生负反馈调节,减少下丘脑CRF释放。正常情 况,HPA轴激活与负反馈调节是机体对应激的适应性与保护性反应。抑郁患者HPA轴功 能异常增高,CRF分泌增多,血浆和尿中皮质醇浓度普遍升高,最终破坏负反馈调节机制,

损害脑中与记忆、情绪密切相关的海马组织,导致神经递质与神经营养因子下降,损害神 经传导与神经可塑性,诱发加剧抑郁[31]

抑郁症患者脑中能够释放CRF的神经元的表达量较高,说明其HPA轴功能充进。对 抑郁症患者使用阻断肾上腺皮质醇分泌的药物,可以将抑郁症患者的HPA轴水平恢复正 常。一般情况下,HPA轴的激活会导致皮质醇的增多损伤海马区神经元,机体会进行负反 馈调节,从而使ACTH迟钝分泌。但是HPA轴功能亢进会导致皮质醇的过量积累,负反 馈平衡被打破,从而引起神经元大量死亡,导致抑郁症的发生。HPA轴亢进的抑郁症患者, 其体内的皮质醇分泌节律更为持久,也更为频繁,说明抑郁症和HPA轴显著相关。

 

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  • HPA轴调控紊乱与炎症系统的关系

HPA轴功能亢进促进炎症因子分泌,导致中枢神经炎症。临床发现,抑郁症患者血清 中IL-1|3、IL-6、TNF-ot等炎症因子水平增高[32]。给予细胞因子EL-2、TNF可以导致与流感 相似的症状与抑郁症状。这些症状几乎在应用细胞因子后立即出现,并在细胞因子治疗终 止后消失。炎性因子加剧抑郁的机理可能为炎症因子激活HPA轴:炎症因子刺激下丘脑 与垂体,促进CRF释放,同时下调下丘脑皮质醇受体表达,导致下丘脑和垂体对皮质醇升 高的敏感性下降,负反馈失调,从而使CRF和糖皮质激素分泌大大增加,糖皮质激素长期 增高可能降低巨噬细胞糖皮质激素受体敏感性,使巨噬细胞产生的前炎性细胞因子增多, 同时激活脑中小胶质细胞加剧分泌炎性因子,损伤神经元与星型胶质细胞。(2)炎症因子 影响神经递质合成:炎症因子水平升高,激活色氨酸犬尿酸代谢通路,导致5-HT含量下 降。中枢神经炎症损伤与抑郁最为密切相关的海马神经元与胶质细胞,导致神经递质与神 经营养因子分泌下降,神经可塑性降低,加剧抑郁症的发生发展

  • HPA轴调控紊乱与肠道微生态的关系

近年来研究发现,肠道微生态紊乱也参与了抑郁症的发生发展。临床观察发现,在导 致抑郁障碍的躯体疾病排序中,功能性胃肠疾病仅次于脑血管意外,排在第二位。抑郁症 患者常见腹泻、便秘,食欲下降等表现,甚至在早期诊断时,往往被误诊为肠易激综合征。 己证实,肠道微生态环境是抑郁症的神经内分泌-炎症因子系统中的重要调控枢纽:

  • 肠道微生物的种类:抑郁症患者与健康人群肠道微生态菌群结构存在显著差异, 表现为肠道内有益菌的减少和有害菌的增加[34]。动物实验研究发现,应激能够改变实验动 物粪便微生物区系,增加好氧菌数量、降低乳酸菌数量。而乳酸菌、双歧杆菌等益生菌己 发现可以缓解动物抑郁样症状[35]。LactobacillusrhamnosusJB-1可以通过迷走神经通路调 节皮质醇和GABA受体,缓解母婴分离所导致的抑郁症状提示了压力应激与肠道菌的 交互关系。益生菌减轻抑郁症状效用还与降低炎症因子表达,调节5-HT表达相关[36]
  • 肠道屏障:抑郁症患者HPA轴功能亢进,CRF增高会导致肠道粘膜壁通透性增 加,使肠道致病菌易位至肠系膜淋巴结或循环系统,激活巨噬细胞,产生大量炎性因子。 并进入大循环,由血脑屏障上的相应炎性因子转运体携带入脑,激活小胶质细胞,继而产 生大量炎性因子,诱发中枢神经炎症[37]。肠道炎症还可激活色氨酸犬尿酸代谢通路,使来 源于食物的色氨酸代谢为犬尿酸、喹啉酸等促炎物质,降低5-羟色胺的重要合成前体色氨 酸的相对含量,造成中枢5-羟色胺合成不足[38]。在心梗后伴抑郁大鼠模型上发现,益生菌 Lactobacillus和Bifidobacterium可通过降低炎症因子和重建肠壁膜屏障而起到抗抑郁的作 用[39]d含有不饱和脂肪酸与Lactobacillushelveticus混合制剂同样具有逆转心梗后大鼠的抑 郁症状的作用。这些研宄均证实了肠道微生态紊乱在抑郁症发生中的重要作用。

压力应激•中枢神经炎症-肠道微生态的调控见

Figure 1-1-2 Regulation on stress- gut microbiota-central neural inflammation system

4.4中医理论对于抑郁症和HPA轴关系的的认识

多环节作用,多靶点起效是中医药治疗的特色与优势。中医并无抑郁症之病名,但其 性情抑郁,多愁善虑,易怒欲哭,心疑恐惧及失眠,胸胁胀闷或痛,咽中如有异物梗塞等 临床症状,却散见于“郁证”、“百合”、“不寐”、“脏躁”、“善忘”、“失眠”、“奔豚”、“梅 核气”等描述。中医认为,抑郁由于七情所伤,或素体虚弱致五脏气机失和,渐致脏腑气 血阴阳失调而形成。“心者,君主之官,神明出焉”,“脑为元神之府”,心脑共主神明。抑 郁症病位在脑,在脏为心。心为脾母,脾为心子。脾的运化功能,有赖于心血滋养,并在 心神的统辖下正常进行。脾运化水谷精微,由脾气转输至心,滋养心血心神。心气虚弱, 心血不足,或心神失常,可致脾运失健,见食欲不振,肢体倦怠,夜不安寐。脾气虚弱, 失其健运,则血的生化来源缺乏,导致心血不足,继而心悸失眠,面色苍白,唇舌色淡。 脾运失健,还易聚湿成痰,上蒙清窍,湿阻清阳,出现头重如裹,体重乏力,神疲嗜睡等 症。母病及子,子病及母,导致“心脾两虚”之证。长时间的忧愁不解,思虑过度,容易伤脾,导致精神紧张,不与人群,形容憔悴,神思恍惚,多寐易惊,怔仲健忘。基于上述 病机分析,以情绪低落(抑郁情绪)为基本线索,查找古今文献中能体现“情感低落”含 义的方剂,统计古今文献治疗抑郁症药物的用药频次[4142],发现其中的人参、茯苓、白术、 干姜、菖蒲、半夏、陈皮等,也是“脾病”的高频治疗药材。

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第二节中医药复方抗抑郁的研究进展

中医药复方是中医治疗抑郁症的基本形式,对中医药复方治疗抑郁症较为详尽的研究, 本节从中医五脏的角度,探讨不同中医药复方基于中医五脏论治抑郁症的研宄进展。

抑郁症,或称抑郁障碍,是由各种原因引起的以抑郁为主要症状的一组心境障碍或情 感性障碍疾病,是一组以抑郁心境自我体验为中心的临床症状群或状态W。因该疾病具有 高发病率、难治愈和高复发率等特点,世界卫生组织预测,到2020年抑郁症将会成为人类 仅次于心血管疾病的第二大危害性疾病[2]。现代研宄认为,抑郁症的发病可能与遗传、应 激性生活事件、内分泌等诸多因素有关。脑内单胺能神经(5•羟色胺能神经和去甲肾上腺 素能神经)功能紊乱,神经元突触间隙5-羟色胺、去甲肾上腺素水平低下是导致抑郁的重 要原因之一。因此,提高单胺类神经元突触间隙的5-HT和NE水平可产生明显的抗抑郁 效果[3]。抑郁症发病机制复杂,目前关于其发病机制研宄主要有以下几个学说,分别是去 甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)及受体学说,5-轻色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT) 及其受体学说,多巴胺(dopamine,DA)及其受体学说,乙醜胆碱(acetylcholine,Ach) 能学说,下丘脑-垂体-肾上腺素轴亢进学说以及下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT)功能减退学 说等[4]。近年来研究也发现,神经营养因子调控失常是抑郁症的另一个重要的致病机理。 临床研究发现,抑郁症患者血清中神经营养因子,尤其是脑源性神经营养因子(BDNF)的 含量下降[5_6]。除了 BDNF之外,NGF与胶质细胞源神经营养因子(GDNF)的水平在抑 郁症病人血清中的含量也同样低下[7_8]。因此,通过对神经营养因子在抑郁症发病机理中的 机制研究,成为当下抑郁症诊断的重要指标与药物开发的重要靶点。

结合现代中医对抑郁症的认识,历代医家多从气郁、肝郁对于抑郁症进行论述,认为 抑郁症的主要病位为肝,涉及五脏,以情志所伤、气机郁滞为抑郁症之因,以气机紊乱、 五脏气血失调为病机[9]。因中药复方具有多成分、多靶点和多环节的整合效应,在辩证施 治原则的指导下,能从多脏腑出发,全面协调各个脏腑功能,以达到减轻或消除抑郁症状。 本文就历代治疗抑郁症常用中药复方及其现代药理研究、临床应用进行综述。

随着抑郁症研究的日益深入,根据现代医学和古代医家的共同分析与探讨,大多数医 家认为抑郁症的产生与情绪因素密切相关,病位主为肝,累及心、脾,日久及肾。正如《素 问》中云“人有五脏化五气,以生喜怒悲忧恐”,又如《景岳全书.郁症》曰“凡五气之郁 则诸病皆有,此因病而郁也。至若情志之郁,则总由乎心,此因郁而病也。”指出疾病使脏 腑功能失调而导致五气之郁,而情志之郁则是因为情志的忧郁时一些躯体症状出现,谓“因 郁而病”。精神活动过极可反作用于五脏,表现出“怒伤肝、喜伤心、思伤脾、悲伤肺、恐 伤肾”。因此,本文以五脏功能失调为基础,结合各个抗抑郁中药复方主要作用脏腑进行归 类整合,为现代研究中药复方抗抑郁研究提供新思路。

  1. 柴胡疏肝散

肝为将军之官,主疏泄,司气机。肝主疏泄,其中以调畅气机为首要,肝不仅调畅有形 之血,又能疏泄无形之气,调节和控制机体内的气、血、精、水的代谢[1Q]。抑郁症病位在 肝,肝气郁结是病理改变的重要原因,因此治郁的基本方法是舒畅气机。病变部位在肝, 常表现情绪不稳,动则遇事闷闷不乐,或烦躁易怒,易激惹或常喜叹息,或常喜欠伸等症。 在抗抑郁复方中,柴胡类方对于调节肝主疏泄作用占有重要的地位,约占抗抑郁复方1/3[11]。 这里所谓柴胡类方[1()],是指以柴胡为君药的一类方剂,包括柴胡疏肝散、逍遥散、柴胡加 龙骨牡蛎汤等。此外,抑郁症患者本身多思善虑,肝脏本弱,疏泄功能不强,故当郁症减 轻时,应逐渐加大滋补之力,而不可一味攻伐。

柴胡疏肝散来源于明.张景岳所著《景岳全书》,全方由柴胡、枳壳、白芍、川芎、甘 草、香附组成,具有疏肝理气,活血止痛之功,可用于治疗肝气郁结之胁肋胀痛、胃痛等 症,临床广泛用于治疗抑郁症。现代药理研宄表明,柴胡疏肝散能通过改善抑郁症模型大 鼠HPA轴功能,减少大鼠ACTH和CORT的分泌,从而对抑郁症发挥治疗作用[12]。Rong Fan[13]等采用 ethno pharmacokinetic-and activity-guided isolation (EAGI)方法,发现该法 标记的未知化合物色谱峰是源于枳壳的橙皮内酯水合物。同时橙皮内酯水合物,枳壳和柴 胡疏肝散能显著降低抑郁症患者静止时间,增加运动。提示橙皮内酯水合物可能是柴胡疏 肝散抗抑郁有效成分之一。类似研究X Huang等t⑷采用LC-MS/MS方法,验证和定量大 鼠海马和血浆中的橙皮内酯水合物,发现源于柴胡舒肝散的橙皮内酯水合物具有潜在抗抑 郁作用。该研宂建立了一个敏感、可靠、具体的LC-MS/MS方法,来定量和证实大鼠海马 中橙皮内酯水合物的存在,并有助于抗抑郁作用机制的进一步研究。Yun-HuiLi[15]等通过 慢性应激抑郁大鼠模型(chronic mild stress induced depressive rats),并采用实时焚光定量 PCR和Western blot对大鼠海马的JNK表达进行检测,结果表明柴胡疏肝散能显著改善模 型组大鼠的抑郁状态,其作用机制可能与调节海马JNK的表达有关。

  1. 开心散

心为“君主之官”,“五脏六腑之大主”,主神明。其主血脉和主藏神起着主宰人体整个生 命活动的作用,故为一身之大主。如五脏功能正常,化生五气充足,则心神得养,脑神得 冲,气血阴阳调和,自然情志调达。因此,心主神明与机体情志畅达以及抑郁症发病有密 切联系。目前认为抑郁症主要为心脾两虚症。若病变部位为心,则常表现出心悸胆怯,或 者心中烦乱,坐卧不宁,也不能寐等。

幵心散始载于唐代著名医药学家孙思邈所著《备急千金要方》,全方由人参、远志、石 菖蒲、茯苓4味药组成[16],主用于治疗忧愁悲伤、心神不宁、好忘、心悸怔忡、语无伦次 等症。临床上常见的开心散用药比例另有记载于《医心方》,用治“善忘”的“一两,一两, 一两,二两”(1: 1: 1: 2, K-984) [1火依据病人临床症候的不同表现,可通过调节配伍 比例达到治疗目的,如用于湿邪中阻偏盛症状的抑郁症病人时,加大石菖蒲与茯苓用量, 开窍利湿等。其配伍比例充分体现了中医辩证论治的特色,其原方或加减方,应用于抑郁

症的中医临床治疗。现代药理研究表明,开心散对于治疗抑郁症、改善大脑记忆以及阿尔 茨海默症有明显的疗效。刘屏[18]等通过放免法测定血中皮质醇含量;HPLC测定大脑神经 递质含量,研宄发现,开心散(3: 2: 2: 3)在多种抑郁症动物模型,如小鼠悬尾模型, 强迫游泳模型上,可缩短悬尾小鼠静止时间,延长小鼠游泳时间,表现出良好的抗抑郁症 作用。幵心散能够逆转因为抑郁所引起的脑中DA、NE、5-HT含量下降的趋势,并且抑制 5-羟色胺的降解。刘屏同等采用⑶MS大鼠,研宄表明开心散改善⑶MS大鼠的抑郁行 为,可能与增加全脑中单胺递质、Ach含量以及提高海马神经营养能力有关。类似的结果 亦为党海霞等发现CUMS大鼠抑郁模型中,开心散可通过调节HPA轴功能,单胺类神经 递质水平和胆碱能神经系统发挥抗抑郁作用[2()]。在此基础上,刘屏[19]等采用经典悬尾试验 和强迫游泳试验等方法,亦发现开心散可能是通过介导中枢单胺类神经递质系统和5-HT 系统发挥抗抑郁作用。朱悦等[21]对开心散前期的研究发现,开心散(1:1:25:50)的水提物在 大鼠CUMS模型上表现出显著的抗抑郁作用。可以显著DA、NE、5-HT等神经递质与神 经营养因子家族中NGF、BDNF、GDNF与NT3,以及上调相关受体的表达。目前研宄发 现,记载于不同古籍的开心散类方其抗抑郁作用差别较大。刘屏[21]等利用经典孤养结合 CUMS抑郁模型,并建立HPLC和UPLC-Q-TOF检测方法,研究给类古书记载方剂,结果 表明《医心方》之开心散可显著增加模型大鼠的体重、海马NE和皮层DA的含量。而 《千金要方》之开心散未见抗抑郁作用。因此在探究开心散抗抑郁作用方面,应充分结合 古籍案例,开展有效研宄。虽然目前对于开心散治疗抑郁症机理做了大量实验研宄,但因 其效应物质基础不明,具体机制不明,因此在此方向上仍需要进行大量研宄工作。

  1. 越鞠丸

脾为后天之本,是气血生化之源,情志活动以气血为物质基础。脾在志为思,正常的思 虑对机体的生理活动包括脾的运化功能并无不良影响。但思虑过度,则可影响机体正常的 生理活动,其中主要是影响气的正常升降出入运动。从影响脏腑的生理功能来说,思虑太 过,最容易影响脾气的运化功能,导致脾胃之气郁结于中焦。因此,若病变部位在脾,则 常表现出愁眉苦脸、郁郁不乐,甚至不思饮食,神疲乏力等。越鞠丸可治肝脾不和。

越鞠丸为金元医家朱震亨依据其“六郁学说”而创立的治疗郁证的代表方剂,最早出现 于《丹溪心法•卷三•六郁五十二》中[22]。原书记载:“越鞠丸,解诸郁,又名芎术丸。” 可见越鞠丸原本是用于治理郁症的意图十分明显。该方由栀子、苍术、香附、川芎、神曲 组成,具有理气解郁,宽中除满之功。以此方为基础,加减变化治疗原发性抑郁症,中风 后抑郁症,更年期抑郁症,以及不同程度睡眠障碍的不寐证均有显著疗效[23]。陈刚[24]等研 究发现越鞠丸可增加小鼠海马内BDNF的表达,而不增加BDNFmRNA的表达,并呈现快 速抗抑郁作用。同时,陈刚[251等通过小鼠CUMS模型,并采用糖水偏好试验、强迫游泳试 验、悬尾试验等,以此观察越鞠丸快速持久的抗抑郁作用。结果表明NR1和Akt/mTOR 信号通路是抑郁症的重要治疗靶点。最新药理研究发现[26],陈刚等釆用给予ICR和昆明系 小鼠抗抑郁药(越鞠丸和克他命Ketamine)方法探究环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)和BDNF信号快速持久的抗抑郁作用机制,结果表明越鞠丸可通过PKA-CREB-BDNF信 号介导发挥长期持续抗抑郁作用,而克他命则不通过该机制发挥抗抑郁作用。在初步临床 研究中,陈刚等[27]将越鞠丸两种不同剂量合用氟西汀,并釆用汉密尔顿抑郁量表及抑郁自 评量表进行疗效评定。结果有力证明越鞠丸主要通过改善迟滞因子以表现出快速治疗抑郁 症作用。随着现代研宄对越鞠丸治疗机制的越加深入,越鞠丸临床治疗抑郁症使用将更加 广泛。

  1. 百合地黄汤及其加味方

百合地黄汤及其加味方,可清肺润燥。肺为相傅之官,不仅主呼吸之气,亦主一身之 气。部分医家从肺论治疗抑郁症,为辩证治疗抑郁症提供了新思路。若病变部位为肺,常 表现出悲伤欲哭、胸闷胸痛,多汗乏力等症。由此可见,抑郁症多有悲哀表现,而悲之志 属肺,故以悲哀、焦虑等低落情绪为主要表现的郁症应从肺论治。以肺论治,合理应用宣 肺、降肺之药,恢复肺的宣降功能,取得良好的临床疗效。而当临床中从肝心脾肾一脏调 治无明显效果时,可以考虑从肺入手,并且发现疗效明显。由此反应出肺气失宣为抑郁症 主要证型之一。

百合地黄汤源自《金匮要略•百合狐惑阴阳毒病脉证治第三》,治疗未经失治误治的百 合病,原书云:“百合病,不经吐、下、发汗、病形如初者,百合地黄汤主之”。百合地黄 汤由百合和生地黄组成,以泉水煎药,具有润养心肺、凉血清热的功效[28]。管家齐等采 用小鼠CUMS抑郁模型,探究百合地黄汤对抑郁模型小鼠脑内单胺类神经递质的影响,结 果表明百合地黄汤能显著增加脑组织内单胺类神经递质DA,5-HT含量。临床应用亦常用 百合地黄汤加味方治疗抑郁症,百合地黄汤加味(百合,生地黄,龙骨,牡蛎,合欢皮, 夜交藤,茯神,郁金,龙胆草)治疗抑郁症的临床研究[3{)]将68例抑郁症患者随机均分为对 照组和治疗组,在两组分别服用氟西汀胶囊的基础上,给予治疗组百合地黄汤治疗,结果 显示对于存在郁而化火症状的抑郁症,该加味方具有起效快,安全性高的特点。虽然百合 地黄汤及其加味方治疗抑郁症作用效果显著,但现代对其机理研究依然缺乏,其药理作用 和临床研究有待进一步深入。

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第三节开心散的源流与研究进展

开心散的记载,始见于公元652年,“药王”孙思邈所撰《备急千金要方》卷十四“小肠 腑•风虚惊悸第六”。初名“定志小丸”,方剂组成为“昌蒲远志各二两,茯苓人参各三两”,主 治“主心气不定,五脏不足,甚者忧愁悲伤不乐,忽忽喜忘,朝瘥暮剧,暮瘥朝发,狂眩”, 用法为“上四味末之,蜜丸。饮服如梧子大七丸,日三。加茯神为茯神丸,散服亦佳”。全 方由人参、远志、石菖蒲、茯苓四味药组成,方中人参与远志补益心气,石菖蒲与茯苓开 窍化湿,功能益气养心、安神定志。原书记载“主心气不足,五脏不足,甚者忧愁悲伤不 乐,忽忽喜忘,朝差暮剧,暮差朝发狂眩”。后世医家主要将其用于治疗心气不足,神志不 宁,健忘失眠,心怯怔忡等证。从现代医学角度看,开心散所治疗的症状:忧愁不乐,健 忘,头晕目眩等,非常类似于今天临床所见的抑郁症。因此,开心散可以说是世界上最早 的治疗抑郁症的记载。

开心散自唐宋以来,成为历代医家补虚安神,幵心益智的基本方,收载于多家重要方 书,并随证加减剂量和加味,方名也常相应有所改变,与定志丸中药物组成相同,仅配伍 剂量不同,见于历代方书中记载的,就有如下方剂,详见表1-3_1。

表1-3-1历代方书中开心散药味相同方剂一览表 Table 1-3-1 The list of prescriptions that have same herbs as KXS in ancient boo

从方中药物配伍剂量变化看,四味药物的组合可分为“定志丸”与“开心散”两大类。“

志丸”中四味药剂量相对均衡,“开心散”则普遍加重茯苓与菖蒲的用量。此变化皆依据两 方方证兼具心气不足与津凝为湿的双重病理。“定志丸”主治神智障碍诸证,证情偏虚,则 人参茯苓用量大于远志菖蒲。若针对湿浊阻窍,证情偏实的善忘,则加大茯苓菖蒲的用量。 虚实各有所偏,则药量亦随证变。若药量变化,作用殊途,法随证变,可见一斑。

开心散各味中药的有许多报道。中人参中的活性成分有人参皂苷类和多糖类W、远志 中的有效成分有皂苷类、蔗糖酯类、口山酮类[5],石菖蒲中的主要成分是挥发油类[2],而茯 苓中的主要成分是三萜酸类和多糖类[3]。研究表明,这些成分在调控免疫,增进神经系统 功能上有较好的活性。主要包括神经保护、增进学习记忆、抗抑郁等。姜艳艳等研宄了开 心散全方提取物,通过HPLC图谱对比的方法,发现大鼠含药血清中有远志口山酮III和3, 6-二酰基蔗糖酯W,推测这些成分可能具有抗痴呆的活性。

围绕开心散的药效研宄和机理探讨,都有许多报道。刘屏等通过大量实验研宄发现, 开心散在小鼠悬尾与强迫游泳、大鼠慢性应激压力等多种抑郁模型上均有很好的抗抑郁作 用[5],逆转因抑郁所引起的脑中多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺含量下降,抑制5-羟色胺 的降解,并调控BDNF的表达[6_7]。党海霞等发现,开心散的抗抑郁作用与下丘脑-垂体-肾 上腺通路调控有关[11]。张永祥等发现,开心散可以延缓大鼠衰老进程[8],增强东莨菪碱损 伤,乙醇损伤,胸腺切除损伤,双侧杏仁核损伤等多种记忆损伤大鼠的学习记忆能力,增 强海马区神经元长时间记忆(LTP) [9]。黄玉芳等人认为,开心散改善衰老、脑缺血等大鼠 记忆障碍与其抗氧化、消除自由基,保护血管内皮细胞与神经递质调控密切相关[@。赵海 霞VI等以SHSY-5Y作为细胞模型,发现幵心散类方D-652对于皮质酮造成的细胞损伤有 明显的保护作用。刘婉婉[12]等釆用慢性应激压力模型在小鼠模型上也证实了 D-652的抗抑 郁作用。抑郁症的发生可能与中枢神经系统神经递质的含量有关,研究表明,幵心散能够 促进脑中5-HT的合成与释放,提高NE的含量水平。陈小萱[13噚发现神经营养因子BDNF 的表达也可被开心散上调。神经营养因子是抑郁症相关的重要靶点,开心散不仅能够上调 神经营养因子的表达,还能改善神经营养因子受体的功能。近年来的研究表明褪黑素也和 抑郁症关系密切。蔡川^等人通过慢性应激压力大鼠模型,发现开心散可能通过提高大鼠 松果体的一种酶来影响褪黑素的合成。黄妍丽[14]等人发现开心散能够上调大鼠血浆中的褪 黑素浓度,并且能增加褪黑素受体的表达。开心散还具有抗痴呆和改善学习记忆的作用, 研究表明,开心散对D-半乳糖诱导和P-淀粉样蛋白注射导致小鼠学习记忆障碍有改善作 用[15]。研究发现,开心散能够减轻AP1-42对于小鼠海马LTP的抑制作用%,增加海马区 中PSD95的表达,改善海马区神经元突触可塑性[儿开心散还能减少A(31-42诱导的施旺 细胞的凋亡、提高细胞内SOD的活性[18],上调NEP基因的表达,减少内源性AP的产生 [20]。开心散可以通过调控脑内单胺类神经递质来改善学习和记忆功[19-2G]能。开心散对于脑 内胆碱能神经系统也有调控作用[21]

对于开心散的物质基础、配伍规律的深入研宂十分具有临床价值。其中活性成分的筛选, 多系统的共同把握能够让我们更好的去认识开心散,从而指导临床实践。

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第二章基于脑-肠轴调控的开心散抗抑郁作用机制研究

抑郁症的发病机制复杂,仅从中枢神经系统来认识抑郁症的发病过程,则易忽略抑郁 症在其他系统的作用。通过对文献的研宄,我们推测HPA轴调控是抑郁症发病的关键环 节。而开心散中所用药材也应用于“脾胃病”治疗。“脾”主运化,功能与现代医学的小肠 相近。因此,我们拟从肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统三大系统入手、研宄开心散 抗抑郁的作用机制。为后期进行功效物质基础的发现提供研宂基础。

动物体内压力因子(CRF、ACTH、Corticosterone)和炎症因子(IL-1(3、IL-6、TNF-a) 是反映压力系统和免疫系统的重要指标。这些指标在抑郁症患者体内的水平较健康人群显 著升高。体内过高水平的压力因子和炎症因子的表达会导致海马神经元的坏死,从而加剧 抑郁症。肠道微生态的紊乱和肠道屏障功能的下降导致有害菌分泌的促炎物质大量入血是 炎症因子表达水平升高的关键因素。

为了揭示开心散调控肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统抗抑郁的作用机制,我们 建立了小鼠慢性应激压力(CUMS)模型,依据经典方剂文献,以不同配伍比例的开心散 水提取物作为研究对象。釆用糖水偏嗜实验、强迫游泳实验、悬尾实验和开场实验评价不 同配伍比例开心散的抗抑郁功效。进而通过对于动物脑、小肠、血清中的炎症因子和压力 因子、肠道菌的菌群结构、肠道屏障和血脑屏障功能进行分析,揭示开心散综合调控肠道 微生态-压力应激-中枢神经炎症系统的作用机制。

第一节开心散抗抑郁效用评价

为了评价中药复方幵心散不同配伍比例的抗抑郁效用,我们建立了小鼠慢性应激压力 (CUMS)模型,对小鼠进行慢性不可预知的轻度刺激,为期60日。模型成功建立后,以 灌胃的方式给动物服用不同配伍比例的开心散提取物,灌胃10日后,釆用糖水偏嗜实验 (SPT)、强迫游泳实验(FST)、悬尾实验(TST)、开场实验(OFT)来评价动物的抑郁样 评价动物的行为表现。结果发现,模型小鼠出现显著的抑郁样行为,表现为其相对于空白 组糖水偏嗜率降低、悬尾不动时间增加、强迫游泳不动时间增加、开场中心区域时间减少。 不同配伍比例的开心散提取物均能显著减轻动物的抑郁样行为,具体为增加模型动物糖水 偏嗜率、减少其强迫游泳实验和悬尾实验不动时间、增加其开场实验中心区域时间。在三 种配伍比例中,以D-652 (10 g/kg/d)减轻动物抑郁样行为的作用趋势最强。基于上述结 果,我们得出中药复方开心散具有抗抑郁效用,D-652是其抗抑郁作用趋势最强的配伍比 例的结论。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

ANY-MAZE行为分析系统(美国ANY-MAZE公司)、动物行为分析系统(上海吉量公

司)等。

1.2试药和试剂

蔗糖(分析纯、购自阿拉丁公司),实验用超纯水为EPED超纯水系统提供(南京易普 易达科技发展有限公司)。

1.3药材

人参、远志、石菖蒲、茯苳药材购自南京药材公司。人参(尸舰卿gC.A. Mey.)、 远志石菖蒲(Xcomy 如ar^cnv/z’)、茯等(PorzaeocosO 药材饮 片购自南京鹤龄药事服务有限公司,经鉴定为合格药材。

1.4动物

ICR小鼠,雄性,体重22g-25g,购自南京大学动物研究所,动物合格证号No.201812554。

  1. 实验方法 1CUMS模型的建立

将动物安置于培养室,静养7日后,测试动物基础饮水量和基础糖水消耗量,剔除数 值异常的动物。之后,每天对小鼠进行随机不可预测的轻度刺激,包括禁食24h,禁水24 h,湿笼24h,强迫游泳5min,夹尾5min,束缚4h,昼夜颠倒,持续56日,以糖水偏嗜 实验确认模型是否成功。

2.2动物给药 2,2.1药物制备方法

取人参、远志、石菖蒲、茯苳,按3:2:2:3 (D-652)的比例称取总质量为100g的药材, 加入1L纯水,回流提取2小时,滤过,取滤液。剩余药材再次加入0.8 L纯水,继续回流 提取2小时,滤过,合并两次提取液。减压浓缩,冷冻干燥,得干粉。同法制备K-984,即 人参、远志、石菖蒲、茯苓的比例为1:1:1:2;同法制备K-1640,即人参、远志、石菖蒲、 茯苓的比例为1:1:4:8。

动物实验所用药物为提取液滤过后,减压浓缩至每毫升药液中含有lg生药。

2.3糖水偏嗜实验

安置7d后,进行小鼠糖水偏好实验。具体方法为,测试时小鼠单笼饲养,测试前72h, 为小鼠同时提供两瓶1%的糖水(100ml),使之适应;测试前48h,将其中一瓶1%的糖水 替换为纯水(100ml),使之适应;测试前24h,禁食禁水。测试时,分别提供lOOmLl%的 糖水与纯水,4h后,测定每组小鼠的糖水消耗量,计算糖水偏嗜指数。糖水偏嗜率=糖水 消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)*100%。在确认模型成功时和给药后,也按照同法进 行。

2.4悬尾实验

悬尾实验:将小鼠尾部远端夹起,垂直悬吊,使其失去支持物,悬吊6min,米用ANY- MAZE软件记录小鼠在此6min内的不动时间及首次出现不动状态的时间点。

在实验前,应先筛选出不动时间正负偏差在20秒内的动物进行后续给药实验。

2.5强迫游泳实验

将小鼠放置于圆柱形透明水缸之中,使小鼠脚部不能接触水缸底部,强迫小鼠游泳6min, 采用ANY-MAZE软件记录小鼠在此6min内的不动时间及首次出现不动状态的时间点。

在实验前,应先筛选出不动时间正负偏差在20秒内的动物进行后续给药实验。

2.6场实验

将小鼠单只放入密闭黑暗的开场实验测试通用隔音箱,记录小鼠5min内的动作行为表 现,包括中央格停留时间、平均路程、中心区域停留时间等指标。

 

2.7统计学处理与数据表示

釆用SPSS 19.0统计软件进行统计分析,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)分 析,结果以As表示,以P< 0.05表示有显著差异,以P< 0.01表示有极显著差异。文中 所有数据处理如未特别标明,均以此方式进行。

  1. 实验结果

3.1开心散不同配伍比例对于CUMS模型小鼠糖水偏嗜率的影响

为了考察不同配伍比例的开心散对于CUMS模型小鼠快感缺失的行为表现的影响,我 们采用糖水偏嗜实验,考察动物糖水偏嗜率。动物在饲养环境下适应一周后随机分组,再 进行基础糖水测试,结果发现各组之间并未出现显著的基础糖水偏嗜率差异,提示这批动 物可以用于后续实KXS经过为期60日的CUMS模型建立以及为期10日的药物作用后,我们进行了糖水偏嗜 实验。如图2-1-1所示,图为药物作用后动物的糖水偏嗜率情况,数据以相对于空白组的 百分比来呈现。我们发现模型组动物的糖水偏嗜率显著低于空白组(与空白组相比,P<0.05)。 不同配伍比例的开心散作用后,各给药组均表现出削弱模型小鼠糖水偏嗜率降低的作用趋 势,其中,以D-652 (10g/kg/day)的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05),与阳性药氟 西汀(7.2mg/kg/day)的作用趋势相当。提示D-652是开心散各配伍比例中改善模型小鼠快 感缺失的行为状态效用最强的配伍比例。

2-1-1不同配伍比例开心散作用下CUMS模型小鼠糖水偏嗜率的变化
Figure 2-1-1 Changes of sucrose preference rate in CUMS model animals with different compatibility ratio of

3.2开心散不同配伍比例对于CUMS模型小鼠悬尾实验中不动时间的影响

动物的行为绝望是衡量抑郁样行为的指标之一,为了考察不同配伍比例的开心散对于 CUMS模型小鼠行为绝望表现的影响,我们采用了悬尾实验,考察动物在悬尾过程中不动 时间的变化经过为期60日的CUMS模型建立以及为期10日的药物作用后,我们进行了悬尾实 验。如图2-1-2所示,图为药物作用后动物在悬尾实验中不动时间的情况,数据以相对于 空白组的百分比来呈现。我们发现,模型组动物在悬尾实验中不动时间显著升高(与空白 组相比,P<0.01),而经过药物作用后,各给药组均表现出削弱模型小鼠悬尾实验中的不动 时间上调的作用趋势(与模型组相比,P<0.05),开心散各方中,以D-652 (10g/kg/day)的 下调模型小鼠升高的悬尾不动时间的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05),其结果与阳 性药氟西汀(7.2mg/kg/day)相当。提示开心散各配伍比例能够改善小鼠行为绝望的状态。 其中以D-652改善动物行为绝望状态的效用最强。

经过为期60日的CUMS模型建立以及为期10日的药物作用后,我们进行了强迫游泳 实验。如图2-1-3所示,图为药物作用后动物在强迫游泳实验中不动时间的情况,数据以 相对于空白组的百分比来呈现。我们发现,模型组动物在强迫游泳实验中不动时间显著升 高(与空白组相比,P<0.01),而经过药物作用后,各给药组均表现出削弱模型小鼠强迫游 泳实验中的不动时间上调的作用趋势(与模型组相比,P<0.05),开心散各方中,以D_652 (10g/kg/day)的下调模型小鼠升高的悬尾不动时间的作用趋势最强(与模型组相比, P<0.05),其结果与阳性药氟西汀(7.2mg/kg/day)相当。提示开心散各配伍比例能够改善 小鼠行为绝望的状态。其中以D-652改善动物行为绝望状态的效用最强。

2-1-3不同配伍比例开心散作用下CUMS模型强迫游泳不动时间的变化
Figure 2-1-3 Changes of immobile Time of forced swimming test in CUMS model with different compatibility

ratio of KXS

3.4开心散不同配伍比例对于CUMS模型小鼠开场实验中心区域时间的影响

具有抑郁样行为动物会失去探素欲望,这可以用开场实验中动物在中心区域活动的时 间来考察。为了考察不同配伍比例的开心散对于CUMS模型小鼠探索欲望的影响,我们釆 用了开场实验,考察动物在开场实验中心区域活动时间的变化。

经过为期60日的CUMS模型建立以及为期10日的药物作用后,我们进行了开场实 验。我们分析了动物在开场实验中心区域活动时间的变化。如图2-M所示,图为药物作用后动物开场实验中心区域活动时间的情况,数据以相对于 空白组的百分比来呈现。动物通过为期60日的CUMS模型建立以及为期10日的药物作用 后,我们发现,模型组动物在中心区域的活动时间相对于空白组显著变少(与空白组相比, P<0.05),不同配伍比例的开心散作用后,我们发现,D-652(10g/kg/day)、K-984(10g/kg/day)、 K-1640(10g/kg/day)能够削弱模型小鼠在中心区域的活动时间下调的趋势(与模型组相比, P<0.05)。这三种配伍比例的效用相当,且均与阳性药氟西汀相当。提示开心散各配伍比例 均具有增强动物的探索欲望,改善动物抑郁样行为的功效。

  1. 结果与讨论

开心散始载于唐代孙思邈所著的《备急千金要方》,是首次提出可以应用“忧愁悲伤”的 中药复方。自唐代以来,开心散在长期的应用的过程中根据不同的应用需要产生了不同的 配伍比例。方中人参补益心气、远志化痰祛湿、石菖蒲芳香化湿。茯苓渗湿安神。正是这 种组合,能够应对湿邪中阻导致的“郁结”症状、然而在后世对于开心散的应用中,针对 病症的不同,产生了不同的配伍比例。如治疗偏实证的痴呆,则加大茯苓和菖蒲的用量; 而治疗偏虚证的抑郁,则增大人参的用量以补益一身之气。因此对于不同配伍比例的评价, 有助于我们深刻的认识抑郁症和中药对其的调控作用。

本节的实验对于开心散的三种不同配伍比例D-652、K-984、K-1640进行了抗抑郁的效 用评价,发现这三种配伍比例均能改善动物的抑郁样行为,以D-652的作用趋势最强。D- 652中人参的含量较多,这与我们设想的模型动物具有“气虚”的状态有关。由于方中人 参为补益心气的药物,远志、茯苓着重于祛湿、石菖蒲着重于开窍,而在慢性应激压力建 立的过程中,较多采用的禁食禁水、束缚、昼夜颠倒、冷水游泳的方式容易造成动物出现 “气虚”的状态,这可能是含有人参较多的D-652产生较好作用的原因之一。

由于对于抑郁症的行为学研究是基于多种角度来进行的,对应抑郁症发病过程中的多 种表现。如快感缺失、行为绝望、失去对新事物的探索等等。因此,药物对于抑郁症的治 疗作用,不应该只从一种角度进行研究,因此对于多种行为学测试的综合结果进行考量, 才能够得到合理可靠的结果。

我们发现D-652是在动物行为学层面作用趋势最强的开心散配伍比例,但是D-652中 的配比又有定志小丸的说法。但是,由于药物的相同,因此也被算作开心散类方的一种。

行为学实验的结果是对于后续各种生化指标和机制探索的指引,因此,还是需要特别 强调行为学实验在抑郁症研宄中的重要地位。

第二节开心散调控脑-肠轴抗抑郁效用评价与机制研究

本节分为三个部分,分别从肠道微生态、中枢神经炎症和压力应激三个系统,评价开 心散抗抑郁的效用以及研宄其作用机制。

一、开心散调控肠道微生态抗抑郁效用评价与机制研究

为了评价开心散调控肠道微生态系统抗抑郁的效用以及研究其作用机制,我们以第二 章第一节所述的动物为实验材料,在无菌环境下收集获取实验动物的粪便,采用16SrRNA 测序技术测定不同组动物的肠道菌群的种类和数量,评价开心散调控肠道菌系统的效用; 此外,获取动物的小肠组织,采用ELISA法检测动物小肠组织中的炎症相关指标如炎症因 子诸如白细胞介素(IL-lp、IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-a);采用蛋白免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测动物的小肠组织中肠道屏障蛋白(Z0-1)、紧密连接蛋白(Occludin) 的表达,评价开心散调控肠道屏障系统的效用。结果发现模型小鼠的肠道菌群相对于正常 动物,表现为有害菌的种类和丰度升髙、肠道炎症因子含量上调、肠道屏障蛋白减少。此 外开心散提取物能改善模型小鼠的肠道菌群结构、表现为使益生菌的丰度上调、有害菌的 丰度下降。同时,我们发现,模型小鼠小肠中的炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a显著升高, 开心散不同比例能够削弱模型小鼠中的炎症因子水平过高的状态,且能够上调肠道屏障蛋 白Z0-1和Ocdudin的表达,修复肠道屏障。结论:开心散可以通过调控肠道微生态系统 从而产生抗抑郁的效用。在此系统上,D-652和K-1640的效用较强。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

多功能酶标仪(PerkinElmer拍金埃尔默公司);蛋白电泳及曝光系统(BIO-RAD公司)

等。

1.2试药和试剂

ELISA试剂盒购自南京金益柏公司;Tris、甘氨酸等购自南京索莱宝公司,未特别注明 来源的试剂,均购自Sigma_Aldrich公司 1.3样品

动物各组织样品为自取,取下后立即用液氮速冻,至于-80摄氏度保存。

  1. 实验方法

2.1生物样本的收集

处死动物,常规眼眶取血,常温静置2h后3500 rpm/min,4□离心,吸取血清。剩余组 织均为常规取法,液氮速冻,-80摄氏度保存。

2.2动物粪便的16SrRNA测序技术及生物信息学分析

进行粪便DNA提取,再对提取的DMA进行PCR扩增,进行Pooling和切胶纯化。比 对测序数据,进行OTU和群落分析,再进行alpha diversity分析,进行丰度和多样性的计 算。再进行beta diversity分析,可以计算菌群指数。

  • ELISA法测定小肠中炎症相关因子的表达

取动物相应组织组织,液氮速冻后置于-80度过夜,称取适量组织,加入20倍量PBS, 匀浆,制备匀浆液按照各炎症因子ELISA试剂盒的说明书,绘制标准曲线,采用酶标仪检 测吸光度,并以此作为所测相关因子定量的依据。

  • WB法检测屏障相关蛋白的表达 4.1蛋白提取与处理

取适量组织于离心管中,加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail,混匀后4□匀浆 lOmin,直至充分溶解。冰上放置20min,放入转速为l,3000rpm,4]的离心机里离心25min; 保存于_80C冰箱。

2.4.2蛋白浓度的测定

用BCA法测试蛋白的浓度,根据TRAN Protein Quantitative Kit试剂盒的说明,进行常 规吸光度测定即可。

2.4.3 Western Blot 实验

将蛋白用SDS、(3-巯基乙醇等变性。取变性蛋白上样,加入预先配置好的8%的聚丙烯 酰胺凝胶中电泳2小时左右,转至硝酸纤维素膜(4口,120minL5%用TBS_T配制的脱脂 奶粉室温封闭膜2h后,分别用ZO_l抗体(1: 2000)、Occludin抗体(1:4000)与GAPDH 抗体(1:5000)4□孵育过夜。用TBS-T洗膜6次,一次10min,再和HRP偶联第二抗体(1:10000) 室温孵育lh后,ECL化学发光显色,凝胶成像检测,利用ImageJ软件分析条带的灰度值,以GAPDH作为样品内参。

 

  1. 实验结果

3.1不同配伍比例的开心散影响CUMS模型小鼠肠道菌群的变化

为了研宄不同配伍比例的开心散对动物肠道菌群变化的影响,我们采用了 16S rRNA测 序技术对肠道菌群的种类和丰度进行测定如图2-2-1-1所示,图为不同种肠道菌群的丰度在各组动物之间的变化情况,数据结果 以相对于空白组的丰度来表现。因为在动物行为学的研究中,我们发现不同比例的开心散 中的高剂量组(lg/kg/day)在行为学实验中的趋势比较明显,因此在后续的生化检测中仅 选取高剂量组进行实验。实验结果表明,动物经过CUMS模型的建立过程后,模型小鼠的 賜道菌的种类和丰度产生了非常明显的改变,在变化最为明显的12种肠道微生物中,表现 为沉w/w所、历方也你7_ww、等的显著下调,你r等的显著上调, 而给药不同配比的开心散后,开心散给药组能够将部分肠道菌调至与空白组接近的状态 (与模型组相比,P<0.05)。开心散显著的上调了革兰氏阳性菌的丰度,下调了革兰氏阴性 菌的丰度。提示这两种类型细菌的改变有可能是开心散抗抑郁的作用环节之

3.2不同配伍比例的开心散对模型小鼠肠道促炎物质表达的影响

为了研宄不同配伍比例的开心散对模型小鼠肠道炎症因子表达的影响,我们釆用了 ELISA法,检测各组动物小肠中促炎物质LPSIL-lpIL-6、TNF-a的表达情况。

如图2-2_1-2所示,图为开心散作用后,各组动物小肠中炎症因子的表达情况。数据结 果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物小肠组织中促炎因子得 到了显著上调、如IL-lp (与空白组相比,P<0.01)、IL-6 (与空白组相比,P<0.05)、TNF- a (与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS模型小鼠的肠道中出现了炎症反应。而经过不 同配伍比例的开心散作用后,各给药组小肠中的炎症因子水平相对于模型组得以下调,各 配伍比例均能削弱模型组中IL-1P的上调趋势,其中K-984的作用趋势最强(与模型组相 比,P<0.05);各配伍比例均能削弱模型组中IL-6的上调趋势,其中D_652的作用趋势最 强(与模型组相比,P<0.05);各配伍比例均能削弱模型组中TNF-a的上调趋势,其中D- 652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)。此外,氟西汀作用后、亦能发现IL-6、TNF_ a的表达量相对于空白组有所下调(与模型组相比,P<0.05),但是其作用趋势不如开心散 各提取物。对于炎症因子的下调,提示了开心散不同配伍比例均有对于肠道炎症水平的调 控作用。其中D_652具有最强的调控小肠中炎症因子水平,恢复小肠内稳态的效用。

IL-1P

iili

°。令

IL-6

3.3不同配伍比例的开心散对模型小鼠肠道屏障蛋白表达的影响

为了研宄不同配伍比例的开心散对模型小鼠肠道屏障蛋白表达的影响,我们采用了 WB法,检测各组动物小肠组织中肠道屏障蛋白ZO-1和Ocdudin的表达情况。

如图2-2-1-3所示,图为不同配伍比例的幵心散作用后,各组动物小肠组中肠道屏障蛋 白ZO-1和Ocdudin的表达情况,数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果 表明,模型组动物小肠组织中肠道屏障蛋白ZO-1的表达相对于空白组显著下调(与空白 组相比,P<0.05)、肠道屏障蛋白Ocdudin的表达显著下调(与空白组相比,P<0.05),这 显示了肠道屏障功能下降。而各开心散给药组具有上调模型小鼠中肠道屏障蛋白ZO-1表 达水平的作用趋势,以D-652 (10g/kg/day)的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.01);同 样,各开心散给药组也有上调肠道屏障蛋白Ocdudin表达水平的作用趋势,以D-652 (10g/kg/day)的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.01)。提示开心散各配伍比例能够修 复肠道屏障功能,D-652是各开心散给药组中具有最强修复肠道屏障功能效用趋势的配伍 比例。

2-2-3开心散上调动物肠道屏障连接蛋白表达
Figure 2-2-1-3 KXS improves intestinal barrier function in animals

  1. 结果与讨论

抑郁症的病理环节多样,发病机理复杂,并不是仅仅局限于单胺类神经递质或者神经 营养因子系统的紊乱。许多临床研宄表明,抑郁症患者的肠道菌群结构和正常人差别巨大, 且抑郁症患者的肠道屏障功能下降,容易被病原体破坏引起机体产生炎症反应。因此本节 的实验从肠道微生态的功能出发,考察开心散抗抑郁的功能是否与肠道菌群有关。通过实 验结果,发现模型小鼠在服用开心散后,在十二个丰度明显改变的菌属中,上调了模型动 物革兰氏阳性菌的相对丰度,下降模型动物革兰氏阴性菌的相对丰度。从而减轻了模型动 物中革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,即脂多糖的水平,从而降低了肠道炎症反应,而肠 道屏障的相关功能蛋白的表达上调,肠道屏障功能得到一定的修复。这可能与开心散中的 人参、远志、茯苓中的多糖类物质有关。在相关的文献报道中,中药物质的多糖具有增强 免疫,改善肠道功能的作用。肠道微生态功能的正常,对于机体的内分泌调节的正常,脑 肠之间的交联“对话”意义重大。

对于肠道微生态的研究,目前的技术手段是从肠道菌群的结构和菌群的数量入手进行 研宄,这多是基于肠道微生物组成十分复杂,而且绝大部分的肠道菌无法在体外培养。因 此从组学的角度研宄是研究肠道菌的捷径。然而仅阐明了肠道菌群中有害菌的比例下调, 益生菌的比例增加,的确能够说明抑郁症和肠道有害菌的“激活”关系密切。对于有害菌 宄竟是如何作用的,目前的研究思路是认为其分泌的炎性因子会引起肠道功能的破坏,这 也是我们进行肠道炎症因子和肠道屏障功能的缘由。

阐明了模型动物中有害菌的比例上调,其分泌的过量炎症因子对肠道屏障功能产生损 伤,而药物的作用能够削弱这种环节的发生,这对于抑郁症的全新机制的探索具有十分重 要的启示。

二、开心散调控中枢神经炎症系统抗抑郁效用评价与机制研究

为了评价不同配比的开心散调控中枢神经炎症系统抗抑郁的效用,我们以第一节所述 的动物为实验材料,获取实验动物的前额皮质、海马区、血清等生物样本,釆用ELISA法 检测动物脑组织和血清中的炎症相关指标,如促炎物质LPS、IL-lp、IL-6、TNF-a。釆用 WB法检测前额皮质中与血脑屏障相关的的屏障蛋白(Z0-1)、紧密连接蛋白(Occludin)、 紧密连接蛋白-5 (Claudin-5)的表达,评价开心散修复血脑屏障系统的效用。结果:模型 组动物相较于空白对照组,其前额皮质、海马区、血清中的炎症因子的表达水平显著升高, 而不同配伍比例的开心散能够下调模型组动物脑组织中炎症因子表达过高的趋势,而氟西 汀组炎症因子水平与模型组相比并未能有显著的降低。而在血脑屏障相关蛋白的表达中, 开心散能够上调模型小鼠的血脑屏障相关蛋白ZO-1、Occludin、紧密连接蛋白-5 (Claudin- 5)的表达,显示出修复血脑屏障的作用。结论:开心散的抗抑郁功效可能与其调控中枢神 经炎症系统以及修复血脑屏障功能有关有关。D-652是基于该系统效用最强的开心散配比。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

多功能酶标仪(PerkinElmer拍金埃尔默公司);蛋白电泳及曝光系统(BIO_RAD公司)

等。

1.2试药和试剂

ELISA试剂盒购自南京金益柏公司;Tris、甘氨酸等购自南京索莱宝公司,未特别注明 来源的试剂,均购自Sigma-Aldrich公司 1.3样品

动物各组织样品为自取,取下后立即用液氮速冻,至于-80摄氏度保存。

  1. 实验方法

2.1生物样本的收集

处死动物,常规眼眶取血,常温静置2h后3500rpm/min,4C离心,吸取血清。剩余组 织均为常规取法,液氮速冻,-80摄氏度保存。

  • ELISA法测定生物样品中炎症相关因子的表达 血清取20pL直接按试剂盒操作即可。

取动物相应组织组织,液氮速冻后置于-80度过夜,称取适量组织,加入20倍量PBS, 匀浆,制备匀浆液按照各炎症因子ELISA试剂盒的说明书,绘制标准曲线,采用酶标仪检 测吸光度,并以此作为所测相关因子定量的依据。

  • WB法检测屏障相关蛋白的表达 2,3.1蛋白提取与处理

取适量组织于离心管中,加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail,混匀后4Z匀浆 lOmin,直至充分溶解。冰上放置20min,放入转速为l,3000rpm,4]的离心机里离心25min;

保存于-80 =冰箱。

2.3.2蛋白浓度的测定

用BCA法测试蛋白的浓度,根据TRAN Protein Quantitative Kit试剂盒的说明,进行常 规吸光度测定即可。

  • WesternBlot 实验

将蛋白用SDS、p-巯基乙醇等变性。取变性蛋白上样,加入预先配置好的8%的聚丙烯 酰胺凝胶中电泳2小时左右,转至硝酸纤维素膜(4巳120min)。5%用TBS-T配制的脱脂 奶粉室温封闭膜2h后,分别用Z0-1抗体(1: 2000)、Occludin抗体(1:4000)与GAPDH 抗体(1:5000)4□孵育过夜。用TBS-T洗膜6次,一次10min5再和HRP偶联第二抗体(1:10000) 室温孵育lh后,ECL化学发光显色,凝胶成像检测,利用ImageJ软件分析条带的灰度值,

以GAPDH作为样品内参。

 

  1. 实验结果

3.1不同配伍比例的开心散对模型小鼠血清中促炎物质表达的影响

为了研宄不同配伍比例的开心散对模型小鼠血清中炎症因子表达的影响,我们釆用了 ELISA法,检测各组动物血清中促炎物质LPSIL-lpIL-6、TOF-a的表达情况。

如图2-2-2-1所示,图为开心散作用后,各组动物血清中炎症因子的表达情况。数据结 果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物血清组织中促炎因子得 到了显著上调、如IL-lp (与空白组相比,P<0.01)、IL-6 (与空白组相比,P<0.05)、TNF- a (与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS模型小鼠的血清中出现了炎症反应。而经过不 同配伍比例的开心散作用后,各给药组血清中的炎症因子水平相对于模型组得以下调,各 配伍比例均能削弱模型组中IL-1P的上调趋势,其中D-652的作用趋势最强(与模型组相 比,P<0.05);各配伍比例均能削弱糢型组中IL-6的上调趋势,其中K-1640的作用趋势最 强(与模型组相比,P<0.05);各配伍比例均能削弱模型组中TNF-ct的上调趋势,其中D- 652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)。此外,氟西汀作用后、亦能发现IL-lpIL- 6的表达量相对于空白组有所下调(与模型组相比,P<0.05),在IL-ip作用水平上其作用 趋势不如开心散各提取物,而在IL-6的作用水平上其作用较开心散稍强。对于炎症因子的 下调,提示了开心散不同配伍比例均有对于血清炎症水平的调控作用。其中D-652具有最 强的调控血清中炎症因子水平的效用。

3.2不同配伍比例的开心散对模型小鼠血脑屏障蛋白表达的影响

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠血脑屏障蛋白表达的影响,我们采用了 WB法,检测各组动物小肠组织中血脑屏障蛋白ZO-1、OcciudinClaudin-5的表达情况。

如图2_2-2-2所示,图为不同配伍比例的开心散作用后,各组动物前额皮质中血脑屏障 蛋白ZO-1、OcdudiiiClaudin-5的表达情况,数据结果以相对于空白组含量的百分比呈 现。实验结果表明,模型组动物前额皮质组织中血脑屏障蛋白Z0-1的表达相对于空白组 显著下调(与空白组相比,P<0.05)、血脑屏障蛋白Ocduditi的表达显著下调(与空白组相 比,P<0.01),血脑屏障蛋白Claudin_5的表达显著下调(与空白组相比,P<0.01)。这显示 了肠道屏障功能下降。而各开心散给药组具有上调模型小鼠中血脑屏障蛋白Z0-1表达水 平的作用趋势,以K-984 (10g/kg/day)的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05);各开心 散给药组具有有上调血脑屏障蛋白Occiudin表达水平的作用趋势,以D-652 (10g/kg/day) 的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.01);各给药组具有上调血脑屏障蛋白Claudin-5表 达水平的作用趋势,以D-652 (lOg/kg/day)的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.01)提 示开心散各配伍比例能够修复血脑屏障功能,D-652是各开心散给药组中具有最强修复血 脑屏障功能效用趋势的配伍比例。

3.3不同配伍比例的开心散对模型小鼠脑中促炎物质表达的影响 3.3.1不同配伍比例的开心散对模型小鼠前额皮质中炎症因子表达的影响

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠前额皮质中炎症因子表达的影响,我们釆 用了 ELISA法,检测各组动物前额皮质中促炎物质LPSIL-lpIL-6、TNF-a的表达情况图为开心散作用后,各组动物前额皮质中炎症因子的表达情况。数 据结果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物前额皮质组织中促 炎因子得到了显著上调、如IL-lp (与空白组相比,P<0.05)、IL-6 (与空白组相比,P<0.01)、 TNF-a (与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS模型小鼠的前额皮质中出现了炎症反应。 而经过不同配伍比例的开心散作用后,各给药组前额皮质中的炎症因子水平相对于模型组 得以下调,各配伍比例均能削弱模型组中IL-1P的上调趋势,其中D-652的作用趋势最强 (与模型组相比,P<0.05);各配伍比例均能削弱模型组中IL-6的上调趋势,其中K-1640 的作用趋势最强(与模型组相比,P<〇.〇5);各配伍比例均能削弱模型组中TNF-cx的上调 趋势,其中D—652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)。此外,氟西汀作用后、亦能 发现IL-6、TNF-a的表达量相对于空白组有所下调(与模型组相比,P<0.05),但效用不如 开心散各提取物。对于炎症因子的下调,提示了开心散不同配伍比例均有对于前额皮质炎 症水平的调控作用。其中D-652具有最强的调控前额皮质中炎症因子水平的效用。

图L2-2-3开心散下调模型小鼠前额皮质中炎症因子表达
Figure 2-2-2-3 KXS down-regulates the expression of inflammatory factors in prefrontal cortex of model

3.3.2不同配伍比例的开心散对模型小鼠海马区中促炎物质表达的影响

为了研宄不同配伍比例的开心散对模型小鼠海马区中炎症因子表达的影响,我们釆用 了 ELISA法,检测各组动物海马区中促炎物质LPSIL-lpIL-6、TNF-a的表达情况图为开心散作用后,各组动物海马区中炎症因子的表达情况。数据 结果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物海马区组织中促炎因 子得到了显著上调、如IL-lp (与空白组相比,P<0.05)、IL-6 (与空白组相比,P<0.05)、 TOF-a (与空白组相比,P<0.01),这表明CUMS模型小鼠的海马区中出现了炎症反应。而 经过不同配伍比例的开心散作用后,各给药组海马区中的炎症因子水平相对于模型组得以 下调,各配伍比例均能削弱模型组中IL-ip的上调趋势,其中K-1640的作用趋势最强(与 模型组相比,P<0.05);各配伍比例均能削弱模型组中IL-6的上调趋势,其中K-984的作 用趋势最强(与模型组相比,P<0.05);各配伍比例均能削弱模型组中TOF-a的上调趋势, 其中D-652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.01)。此外,氟西汀作用后,亦能发现IL- 6、TNF-a的表达量相对于空白组有所下调(与模型组相比,P<0.05),但效用不如开心散 各提取物。对于炎症因子的下调,提示了开心散不同配伍比例均有对于海马区炎症水平的 调控作用。其中D-652具有最强的调控海马区中炎症因子水平的效用。

3.3.3不同配伍比例的开心散对模型小鼠下丘脑中促炎物质表达的影响

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠下丘脑中炎症因子表达的影响,我们采用 了 ELISA法,检测各组动物下丘脑中促炎物质LPSIL-lpIL-6、TNF-a的表达情况图为开心散作用后,各组动物下丘脑中炎症因子的表达情况。数据 结果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物下丘脑组织中促炎因 子得到了显著上调、如IL_lp (与空白组相比,P<0.05)、IL-6 (与空白组相比,P<0.01)、 TOF_a (与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS模型小鼠的下丘脑中出现了炎症反应。而 经过不同配伍比例的开心散作用后,各给药组下丘脑中的炎症因子水平相对于模型组得以 下调,各配伍比例均能削弱模型组中IL-1P的上调趋势,其中D-652的作用趋势最强(与 模型组相比,P<0.05);各配伍比例均能削弱模型组中IL-6的上调趋势,其中K-1640的作 用趋势最强(与模型组相比,P<〇.〇5);各配伍比例均能削弱模型组中TNF-a的上调趋势, 其中D-652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)。此外,氟西汀作用后,亦能发现IL_ IPIL-6的表达量相对于空白组有所下调(与模型组相比,P<0.05),但效用不如开心散各 提取物。对于炎症因子的下调,提示了开心散不同配伍比例均有对于下丘脑炎症水平的调 控作用。其中D-652具有最强的调控下丘脑中炎症因子水平的效用。

  1. 结果与讨论

我们发现,在抑郁症的病理环节的状态,血脑屏障相关蛋白表达下降,说明血脑屏障 的通透性很有可能与正常状态不同。很多报道认为中药复方的大多数成分无法进入血脑屏 障,很有可能是忽略了病理条件下血脑屏障的状态。

受到过量压力应激的影响,抑郁样的行为出现,同时肠道系统也发生紊乱,表现为肠 道屏障功能下降以及肠道微生态失衡,有害菌的比例上调。从而这些细菌释放的过量促炎 物质导致了炎症因子的过量分泌。通过肠道屏障由血入脑,从而通过功能下降的血脑屏障 系统进入中枢,造成中枢神经炎症,引起神经细胞的损伤,从而加重抑郁。实验中发现动 物的血清与中枢中的炎症因子上调的趋势均被开心散所上调,显示出开心散具有调节中枢 神经炎症系统的能力。开心散的大部分物质虽不能在正常生理条件下透过血脑屏障,但是 在病理条件下存在通过的可能。此外,近来也有诸多文献报道了人参皂苷、人参多糖、远 志多糖、a-细辛醚等均具有调节免疫的功能,这类成分在开心散的水提液中均能检测到。 因此,可以猜测,这类成分可能是开心散基于中枢神经炎症系统抗抑郁的有效成分。

基于实验结果,可以解释抑郁症调控肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症的发病环节, 以及开心散对于此系统的作用。我们从源头表述如下:具有抑郁样行为的动物的肠道微生 态失衡可以被开心散所逆转、从而炎症因子分泌变少,从肠道到中枢的炎症反应减轻,加 上开心散对于肠道屏障的修复作用,炎性因子就更加不容易入血。此外,压力应激也会产 生肠道屏障功能的失调,开心散还具有调控压力系统的作用。

 

三、开心散调控压力应激抗抑郁效用评价与机制研究

为了评价开心散调控压力应激系统抗抑郁的效用,研宄其作用机制,我们以第一节所 述的动物为实验材料,获取实验动物的下丘脑、海马区、肾上腺、血清等生物样本,采用 ELISA法分别对其中的压力因子如促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)、促肾上腺皮质激 素(ACTH)、皮质甾酮(Corticosterone)进行含量测定。结果发现,模型组动物相较于空 白对照组,其下丘脑、海马区、肾上腺、血清中的压力因子的表达水平显著升高,而不同 配伍比例的开心散能够下调模型组中压力因子表达过高的趋势,而氟西汀组中相关压力因 子的水平与模型组相比并未能有显著的降低。我们得到的结论是,开心散的抗抑郁功效可 能与其调控压力应激系统有关。在此系统上,D-652的效用较强

  1. 仪器和实验材料 1仪器

多功能酶标仪(PerkinElmer珀金埃尔默公司);蛋白电泳及曝光系统(BIO-RAD公司)

等。

1.2试药和试剂

ELISA试剂盒购自南京金益柏公司;Tris、甘氨酸等购自南京索莱宝公司,未特别注明 来源的试剂,均购自Sigma-Aldrich公司 1_3样品

动物各组织样品为自取,取下后立即用液氮速冻,至于-80摄氏度保存。

  1. 实验方法

2.1生物样本的收集

处死动物,常规眼眶取血,常温静置2h后3500 rpm/min,4□离心,吸取血清。剩余组 织均为常规取法,液氮速冻,-80摄氏度保存。

2.2 ELISA法测定血清、组织中压力因子的表达

取动物相应组织组织,液氮速冻后置于-80度过夜,称取适量组织,加入20倍量PBS, 匀浆,制备匀浆液按照各压力因子ELISA试剂盒的说明书,绘制标准曲线,采用酶标仪检 测吸光度,并以此作为所测相关因子定量的依据。

  1. 实验结果

3.1不同配伍比例的开心散对模型小鼠血清中压力因子表达的影响

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠血清中压力因子表达的影响,我们釆用了 ELISA法,检测各组动物血清中压力因子CRFACTHCorticosterone的表达如图2-2-3-1所示,图为开心散作用后,各组动物血清中压力因子的表达情况。数据 结果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物血清中压力因子得 到了显著上调、如CRF (与空白组相比,P<0,05)、ACTH (与空白组相比,P<0.01)、 Corticosterone (与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS模型小鼠压力因子过量表达,压 力系统调控紊乱。而经过不同配伍比例的开心散作用后,各给药组血清中的因子水平相 对于模型组得以下调,各配伍比例均能削弱模型组中CRF的上调趋势,其中D-652的作 用趋势最强(与模型组相比,P<〇.〇5);各配伍比例均能削弱模型组中ACTH的上调趋 势,其中D_652的作用趋势最强(与模型组相比,P<〇.〇5);各配伍比例均能削弱模型组 中Corticosterone的上调趋势,其中D-652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)。此 外,氟西汀作用后、亦能发现CRFACTHCorticosterone的表达量相对于空白组有所 下调(与模型组相比,P<0.05),但是其作用趋势不如开心散各提取物。对于血清压力因 子的下调,提示了开心散不同配伍比例均有对于压力应激系统的调控作用。其中D-652 具有最强的调控血清中压力因子的水平。

3.2不同配伍比例的开心散对模型小鼠组织中压力因子表达的影响 3.2.1不同配伍比例的开心散对模型小鼠下丘脑中压力因子表达的影响

为了研宄不同配伍比例的开心散对模型小鼠下丘脑中压力因子表达的影响,我们釆用 了 ELISA法,检测各组动物下丘脑中压力因子CRF的表达情况。,图为开心散作用后,各组动物下丘脑中压力因子的表达情况。数据 结果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物下丘脑中的CRF得到 了显著上调(与空白组相比,PO.01),这表明CUMS模型小鼠下丘脑中压力因子CRF过 量表达,压力系统调控紊乱。而经过不同配伍比例的开心散作用后,各给药组下丘脑中的 压力因子CRF水平相对于模型组得以下调,各配伍比例均能削弱模型组中CRF的上调趋 势,其中D-652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)。此外,氟西汀作用后、亦能发 现CRF的表达量相对于空白组有所下调(与模型组相比,P<0.05),但是其作用趋势不如 开心散各提取物。对于下丘脑压力因子的下调,提示了开心散不同配伍比例均有对于压力 应激系统的调控作用。其中D_652具有最强的调控下丘脑中压力因子的水平的效用。

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2-2_3_2开心散下调模型小鼠下丘脑中压力因子表达
Figure 2-2-3-2 KXS down-regulates the expression of pressure factors in hypothalamus of model animals

3.2.2不同配伍比例的开心散对模型小鼠肾上腺中压力因子表达的影响

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠肾上腺中压力因子表达的影响,我们釆用 了 ELISA法,检测各组动物肾上腺中压力因子ACTHCorticosterone的表达情如图2-2_3-3所示,图为开心散作用后,各组动物肾上腺中压力因子的表达情况。数据 结果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物肾上腺中的压力因子 得到了 ACTH显著上调(与空白组相比,P<0.01); Corticosterone显著上调(与空白组相 比,P<0.01 ),这表明CUMS模型小鼠肾上腺中压力因子ACTHCorticosterone过量表达, 压力系统调控紊乱。而经过不同配伍比例的开心散作用后,各给药组肾上腺中的压力因子 ACTH水平相对于模型组得以下调,各配伍比例均能削弱模型组中ACTH的上调趋势,其 中D-652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05);各给药组肾上腺中的压力因子 Corticosterone水平相对于模型组得以下调,各配伍比例均能削弱模型组中Corticosterone的 上调趋势,其中D-652的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)此外,氟西汀作用后压 力因子ACTHCorticosterone的表达并没有显著的下调。对于肾上腺中压力因子的下调, 提示了开心散不同配伍比例均有对于压力应激系统的调控作用。其中D-652具有最强的调 控肾上腺中压力因子的水平的效用。

2-2_3-3开心散下调模型小鼠肾上腺中压力因子表达
Figure 2-2-3-3 KXS down-regulates the expression of stress factors in adrenal gland of model animals

3.2.3不同配伍比例的开心散对模型小鼠海马区中压力因子表达的影响

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠海马区中压力因子表达的影响,我们采用 了 ELISA法,检测各组动物海马区中压力因子Corticosterone的表达情如图2-2-34所示,图为开心散作用后,各组动物海马区中压力因子的表达情况。数据 结果以相对于空白组含量的百分比呈现。实验结果表明,模型组动物海马区中的压力因子 得到了 Corticosterone显著上调(与空白组相比,P<0.01),这表明CUMS模型小鼠海马区 中压力因子Corticosterone过量表达,压力系统调控紊乱。而经过不同配伍比例的开心散作 用后,各给药组海马区中的压力因子Corticostenme水平相对于模型组得以下调,各配伍比 例均能削弱模型组中Corticosterone的上调趋势,其中D-652的作用趋势最强(与模型组相 比,P<0.05)。此外,氟西汀作用后对海马区中压力因子Corticosterone的表达并没有显著 的下调。对于海马区中压力因子的下调,提示了开心散不同配伍比例均有对于压力应激系 统的调控作用。其中D-652具有最强的调控海马区中压力因子的水平的效用。

  1. 结果与讨论

压力应激激活下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal,HPA)轴,促使压

力因子的产生,最终以皮质留酮损伤海马神经元的形式导致或者加剧抑郁症。正常情况下, HPA轴所相关的负反馈调节并不会使机体进入病理情况,但是过量的压力应激会导致负反 馈调节失控,因此皮质甾酮才能损伤海马区的神经元细胞。通过对于血清和组织中的压力 因子的检测,我们发现模型小鼠的压力因子水平相较于空白组显著上调,证实了我们对于 CUMS模型小鼠会产生该类型病理变化的猜测。同时,开心散作用组能够下调压力因子上 调的趋势,因此我们认为,开心散具有在该系统下的调控作用。开心散的抗抑郁功效可能 与其调控压力应激系统有关。

在曰常生活中,压力应激是抑郁症发病的关键环节之一。过量的压力作用于压力中枢, 使得HPA轴正常调控功能被打破,最终造成神经元的死亡。是抑郁症非常具有可能的发病 环节之一。压力应激系统起作用的过程主要是依赖于压力因子。药物对于压力因子的调控, 就很有可能成为药物产生抗抑郁作用的关键因素,我们发现,开心散具有调控压力因子表 达水平的作用,该作用的机制很有可能是其中的物质直接作用于这些激素的受体或者参与 了这些激素的合成代谢。对于其物质基础和深入的作用机制还需要更进一步的探讨。

我们阐明了开心散对于压力应激系统的调控,也说明了从此角度进行开心散物质基础 和深入的作用机制的探索是有可行性的。在压力应激也是D-652的作用趋势最强,于是我 们可以猜测,人参中的成分很有可能产生对于此系统的调控。

【参考文献】

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  • Rong Fan, Xi Huang, Yang Wang, et al. Ethno pharmacokinetic and Activity-Guided Isolation of a New Antidepressive Compound from Fructus Aurantii Found in the Traditional Chinese Medicine Chaihu-Shugan- San: A New Approach and Its Application[J], Evidence-Based Complementaiy and Alternative Medicine^ 2012(7): 1-8.

 

第三章开心散调控脑-肠轴抗抑郁效用验证

在上一章的研宄中,我们发现开心散的不同配比均有减轻动物抑郁样行为的作用,其 中以D-652的作用趋势最强。通过进行开心散基于脑-肠轴调控的机制研宄,我们发现,不 同配伍比例的开心散具有改善肠道微生态、改善机体肠道炎症和中枢炎症水平,改善机体 压力因子水平以及修复肠道屏障功能和血脑屏障功能的功效,综合各环节的效用D-652是 基于脑-肠轴调控的开心散抗抑郁效用最强的配伍比例的结论。

在本节的研究中,我们依然采取CUMS小鼠模型。在CUMS建立的过程,在模型小鼠 的饮用水中加入抗生素的混合溶液,从而干扰小鼠的肠道微生态功能。我们推测肠道菌可 能是脑-肠轴调控的关键环节之一,如果在对这个环节进行干预后发现开心散的抗抑郁作用 相应有所改变,那么就可以验证开心散具有基于脑-肠轴调控的作用。

根据第二章的实验结果,我们采用综合作用趋势最强D-652作为本次实验的开心散的 试样。我们将从动物行为学入手,对机体内肠道菌群、炎症因子、肠道屏障和血脑屏障功 能、压力因子加以检测。从而对第二章得出的实验结论,即开心散具有调控脑-肠轴抗抑郁 的作用,加以验证。

第一节开心散调控脑_肠轴抗抑郁行为学效用验证

为了验证D-652基于脑-肠轴调控的抗抑郁效用以及研究抗生素影响的肠道菌变化对 CUMS模型小鼠行为学的影响。我们建立了小鼠慢性应激压力(CUMS)模型,对小鼠进 行慢性不可预知的轻度刺激,为期60日。同时在CUMS模建立的整个实验流程中,通过 在动物的饮用水中添加抗生素的混合溶液,将动物的肠道微生物数量降低至正常动物的 10%。模型成功建立后,以灌胃的方式给动物服用D-652 (10g/kg/day),灌胃10日后,采 用糖水偏嗜实验(SPT)、强迫游泳实验(FST)、悬尾实验(TST)、开场实验(OFT)来评 价动物的抑郁样评价动物的行为表现。结果发现,实验结果发现,模型小鼠出现了显著的 抑郁样行为,表现为其相对于空白组糖水偏嗜率降低、悬尾不动时间增加、强迫游泳不动 时间增加、开场中心区域时间减少。长期饮用含抗生素饮用水的并接受造模的动物较模型 组表现出较轻的抑郁样行为。灌胃D-652后,长期服用含抗生素饮用水的模型小鼠在接受 D-652的治疗后,发现抗生素的作用削弱了 D-652的减轻动物抑郁样行为的作用。结果说 明肠道菌的变化对动物的行为学改变有影响,提示开心散具有基于脑-肠轴调控的抗抑郁作 用。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

ANY-MAZE行为分析系统(美国ANY-MAZE公司)、动物行为分析系统(上海吉量公 司)等。多功能酶标仪(PerkinElmer i白金埃尔默公司);蛋白电泳及曝光系统(BIO-RAD 公司)等。

1.2试药和试剂

蔗糖(分析纯、购自阿拉丁公司),实验用超纯水为EPED超纯水系统提供(南京易普 易达科技发展有限公司);抗生素混合溶液为硫酸新霉素、氨苄青霉素钠、甲硝唑、盐酸万 古霉素(购自阿拉丁公司)、每种抗生素按照lg/L配制于动物的饮用水中。未特别注明来 源的试剂,均购自Sigma-Aldrich公司。

1.3样品

人参、远志、石菖蒲、茯等药材购自南京药材公司。人参騰wgC.A. Mey.)、 远志Willd.)、石菖蒲(也omsfatolm簡•丨)、茯苳(Porbcocos)药材饮 片购自南京鹤龄药事服务有限公司,经鉴定为相应药材。同第二章第一节所用的药材。

1.4动物

ICR小鼠,雄性,体重22g-25g,购自南京大学动物研宄所,动物合格证号No.201812577。

  1. 实验方法

2.1 CUMS模型的建立

将动物安置于培养室,静养7d后,测试动物基础饮水量和基础糖水消耗量,剔除数值 异常的动物。获取糖水水平均一正常的动物后,每天对小鼠进行随机不可预测的轻度刺激, 包括禁食24h,禁水24h,湿笼,强迫游泳5min,夹尾5min,束缚4h,昼夜颠倒,持续56 d,以糖水偏嗜实验确认模型是否成功。

2.2动物分组给药方法

表3-1_1动物实验分组和给药剂量 Table 3-1-1 Animal experiment grouping and dosing

2.3糖水偏嗜实验

安置7d后,进行小鼠糖水偏好实验。具体方法为,测试时小鼠单笼饲养,测试前72h, 为小鼠同时提供两瓶1%的糖水(100ml),使之适应;测试前48h,将其中一瓶1%的糖水 替换为纯水(100ml),使之适应;测试前24h,禁食禁水。测试时,分别提供lOOmLl%的 糖水与纯水,4h后,测定每组小鼠的糖水消耗量,计算糖水偏嗜指数。糖水偏嗜率=糖水 消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)*100%。在确认模型成功时和给药后,也按照同法进 行。

2.4悬尾头

悬尾实验:将小鼠尾部远端夹起,垂直悬吊,使其失去支持物,悬吊6min,采用ANY- MAZE软件记录小鼠在此6min内的不动时间及首次出现不动状态的时间点。

在实验前,应先筛选出不动时间正负偏差在20秒内的动物进行后续给药实验。

2.5强迫游泳实验

将小鼠放置于圆柱形透明水缸之中,使小鼠脚部不能接触水缸底部,强迫小鼠游泳6min, 采用ANY-MAZE软件记录小鼠在此6min内的不动时间及首次出现不动状态的时间点。

在实验前,应先筛选出不动时间正负偏差在20秒内的动物进行后续给药实验。

2.6开场实验

将小鼠单只放入密闭黑暗的开场实验测试通用隔音箱,记录小鼠5min内的动作行为表 现,包括中央格停留时间、平均路程、中心区域停留时间等指标。

  1. 实验结果

3.1动物行为学实验结果 3.1.1糖水偏嗜实验

动物的快感缺失是衡量抑郁样行为的指标之一。为了验证D-652基于脑-肠轴调控的抗 抑郁效用以及研究抗生素影响的肠道菌变化对CUMS模型小鼠快感缺失情况的影响,我们 釆用了糖水偏嗜实验,考察动物糖水偏嗜率的变化。动物在饲养环境下适应一周后,随机 分组,再进行基础糖水测试,结果发现各组之间并未出现显著的基础糖水偏嗜率差异,提 示这批动物可以用于后续实验经过为期60日的CUMS模型建立以及抗生素溶液作为饮用水的作用,再经过为期10 日的药物作用后,我们进行了糖水偏嗜实验。如图3-1-1所示,图为药物作用后动物的糖 水偏嗜率情况,数据以相对于空白组的百分比来呈现(空白组为100%)。我们发现抗生素 的影响并不会使正常动物产生显著的糖水偏嗜率的变化。模型组动物的糖水偏嗜率显著低 于空白组(与空白组相比,P<0.05)。而CUMS模型小鼠在抗生素混合溶液的影响下,糖 水偏嗜率得到显著上调(与模型组相比,P<〇.〇5)。D-652 (10g/kg/day)的作用后,模型小 鼠的糖水偏嗜率显著改善(与模型组相比,P<〇.〇5),而长期服用抗生素的模型小鼠在接受 D-652的作用后,其上调模型小鼠糖水偏嗜率的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)。 提示肠道菌功能被抗生素改变后,动物不容易出现快感缺失的行为。而开心散作用于使用 抗生素饮用水的模型动物后,开心散上调模型动物糖水偏嗜率的作用降低,抗生素削弱了 D-652的作用趋势。提示肠道菌的改变是开心散调控抑郁症的环节之一。

3-1_1抗生素作用下的D_652影响动物糖水偏嗜率
Figure 3-1-1 The effect of D-652 on sucrose preference rate in animals by antibiotics

3.1.2悬尾实验

动物的行为绝望是衡量抑郁样行为的指标之一。为了验证D_652基于脑_肠轴调控的抗 抑郁效用以及研究抗生素影响的肠道菌变化对CUMS模型小鼠产生绝望行为情况的影响, 我们采用了悬尾实验,考察悬尾不动时间的变化。

经过为期60日的CUMS模型建立以及抗生素溶液作为饮用水的作用,再经过为期10 日的药物作用后,我们进行了悬尾实验。如图3-1-2所示,图为药物作用后动物的悬尾不 动时间情况,数据以相对于空白组的百分比来呈现(空白组为100%)。我们发现抗生素的 影响并不会使正常动物产生显著的悬尾不动时间的变化。模型组动物的悬尾不动时间显著 高于空白组(与空白组相比,P<0.05)。而CUMS模型小鼠在抗生素混合溶液的影响下,悬尾不动时间显著下调(与模型组相比,P<0.05)。D-652 (10g/kg/day)的作用后,模型小 鼠的悬尾不动时间显著下调(与模型组相比,P<0.05),而长期服用抗生素的模型小鼠在接 受D-652的作用后,其下调模型小鼠悬尾不动时间的作用趋势最强(与模型组相比,P<0.05)。 提示肠道菌被抗生素作用后,动物不容易出现行为绝望。而开心散作用于使用抗生素饮用 水的模型动物后,开心散下调模型动物的强迫游泳不动时间作用趋势变弱,抗生素削弱了 D-652的作用趋势。提示肠道菌的改变是开心散调控抑郁症的环节之一。

3.1.2强迫游泳实验

动物的行为绝望是衡量抑郁样行为的指标之一。为了验证D-652基于脑-肠轴调控的抗 抑郁效用以及研宄抗生素影响的肠道菌变化对CUMS模型小鼠产生绝望行为情况的影响, 我们采用了强迫游泳实验,考察强迫游泳不动时间的变化。经过为期60日的CUMS模型建立以及抗生素溶液作为饮用水的作用,再经过为期10 日的药物作用后,我们进行了强迫游泳实验。如图3-1-3所示,图为药物作用后动物的强 迫游泳不动时间情况,数据以相对于空白组的百分比来呈现(空白组为100%)。我们发现 抗生素的影响并不会使正常动物产生显著的强迫游泳不动时间的变化。模型组动物的强迫 游泳不动时间显著高于空白组(与空白组相比,P<0.05)。而CUMS模型小鼠在抗生素混 合溶液的影响下,强迫游泳不动时间显著下调(与模型组相比,Pa.OShD-eSSdOg/kg/day) 的作用后,模型小鼠的强迫游泳不动时间显著下调(与模型组相比,P<〇.〇5),而长期服用 抗生素的模型小鼠在接受D-652的作用后,其下调模型小鼠强迫游泳不动时间的作用趋势 最强(与模型组相比,P<0.05)。提示肠道菌被抗生素改变后,动物不容易出现行为绝望。 而开心散作用于使用抗生素饮用水的模型动物后,开心散下调模型动物的强迫游泳不动时 间作用趋势变弱,抗生素削弱了 D-652的作用趋势。提示肠道菌的改变是开心散调控抑郁 症的环节之一。

3-1-3抗生素作用下的D-652影响动物强迫游泳不动时间
Figure 3-1-3 The effect of D-652 on FST immobile time in animals by antibiotics

3.1.4开场实验

动物对新事物的探索欲望是衡量抑郁样行为的指标之一。为了验证D-652基于脑-肠轴 调控的抗抑郁效用以及研宄抗生素影响的肠道菌变化对CUMS模型小鼠探索欲望的影响, 我们釆用了开场实验实验,考察动物在开场实验中心区域活动时间的变化。

经过为期60日的CUMS模型建立以及抗生素溶液作为饮用水的作用,再经过为期10 日的药物作用后,我们进行了强迫游泳实验。如图3-1-4所示,图为药物作用后动物的中 心区域活动时间情况,数据以相对于空白组的百分比来呈现(空白组为100%)。我们发现 抗生素的影响并不会使正常动物产生显著的动物中心区域活动时间的变化。模型组动物的 中心区域活动时间显著低于空白组(与空白组相比,P<0.05)。而CUMS模型小鼠在抗生 素混合溶液的影响下,中心区域活动时间显著上调(与模型组相比,P<0.05)。D-652 (10g/kg/day)的作用后,模型小鼠的中心区域活动时间显著上调(与模型组相比,P<0.05), 而长期服用抗生素的模型小鼠在接受D-652的作用后,其上调模型小鼠中心区域停留时间 的作用趋势最强(与模型组相比,P<〇.〇5)。提示肠道菌被抗生素改变后,动物不容易失去 对新环境探索的兴趣。而开心散作用于使用抗生素饮用水的模型动物后,导致开心散上调 模型动物的中心区域时间的作用趋势变弱,抗生素削弱了 D-652的作用趋势。提示肠道菌 的改变是开心散调控抑郁症的环节之一

3-1-4抗生素作用下的D-652影响动物中心区域时间
Figure 3-1-4 The effect of D-652 on center area time by antibiotics

  1. 结果与讨论

动物行为学指标是衡量药物是否具有抗抑郁作用的最重要的标准。在抑郁症的动物模 型中,我们选取的慢性应激压力模型是最适合用于模拟当今社会人们遭受慢性随机的长期 压力,诱发抑郁症的动物模型。

评价动物的抑郁样行为,我们采取了多种类型的行为模式。首先是快感缺失,我们采 用糖水偏嗜实验来模拟,实验结果也的确表明模型动物出现了糖水偏嗜率降低的快感缺失 表现。而悬尾和强迫游泳实验所模拟的行为绝望状态,则很好的体现了抑郁症中求生欲望 差的症状。开始实验则是侧重于动物对于新事物的好奇和探索欲望。三种行为学指标的有 机结合,才能帮助我们更好的下论断。

本节发现开心散减轻动物抑郁样行为的作用被抗生素所削弱。我们己知,开心散对革 兰氏阴性菌的下调,导致其细胞壁组成的主要成分LPS的含量下调,进而引起炎症反应的 减弱可能是其调控脑-肠轴的重要机制。那么抗生素是否改变了开心散所调控的菌群的相对 丰度从而削弱了抗抑郁的作用呢?对于这样的猜想,我们将在下一节进行验证。

值得一提的是,对于肠道微生态的控制,我们还可以釆用无菌小鼠。但是因为无菌小 鼠需要的设备昂贵,且因为其饲养在负压区域,因此无法进行糖水偏嗜实验。在对抑郁症 的研究中,无法进行糖水偏嗜实验会使实验结果的可信度大打折扣,因此,我们采用了抗 生素溶液作为实验的方案,具有其独特的价值。

第二节开心散调控脑-肠轴抗抑郁效用与机制验证

本节分为三个部分,分别从肠道微生态、中枢神经炎症和压力应激三个系统,验证D- 652的抗抑郁效用和其基于脑-肠轴调控抗抑郁的的作用机制。

一、开心散调控肠道微生态抗抑郁效用与机制验证

为了验证D-652调控肠道微生态系统抗抑郁的效用以及研宄抗生素影响的肠道菌变化 对CUMS模型小鼠肠道微生态的影响。我们以第三章第一节所述的动物为实验材料,在无 菌环境下收集获取实验动物的粪便,釆用16SrRNA测序技术测定不同组动物的肠道菌群 的种类和数量,验证D-652调控肠道菌系统的效用和抗生素影响的肠道菌群的变化;此外, 获取动物的小肠组织,采用ELISA法检测动物小肠组织中的炎症相关指标如炎症因子11^ lp、IL-6、TNF-a;采用蛋白免疫印迹法检测动物的小肠组织中肠道屏障蛋白ZO-l、Occludin 的表达,评价开心散调控肠道屏障系统的效用以及抗生素影响的肠道菌群的变化对肠道屏 障功能的影响。结果发现,在肠道菌群的变化上,抗生素影响下,动物的肠道菌的种类和 丰度都显著改变,模型小鼠的肠道菌种类和丰度依然表现为有害菌的增多以及益生菌的减 少,而开心散可以将肠道菌群调控至接近正常状态。在小肠中炎症因子水平的测定上,模 型小鼠小肠中的炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-ot显著升高。长期饮用含抗生素饮用水的并接 受造模的动物较模型组炎症因子的水平较低。灌胃D-652后,长期服用含抗生素饮用水的 模型小鼠在接受D-652的治疗后,其小肠中炎症因子的较D_652组低,但没有显著性差异。 以上各组与模型组相比,均显著削弱了模型小鼠小肠中炎症因子升高的作用趋势。在肠道 屏障的水平测定上,模型小鼠的肠道屏障蛋白ZO-1、Occludin的表达下降、而D-652能够 削弱模型小鼠肠道屏障蛋白下降的趋势。但抗生素的作用与否并不对肠道屏障蛋白的表达 产生影响。这表明D-652对于肠道微生态的调控作用得到验证,并且抗生素影响的肠道菌 变化对于肠道微生态系统具有影响,表现为肠道菌群结构的改变和肠道炎症因子的降低。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

多功能酶标仪(PerkinElmer拍金埃尔默公司);蛋白电泳及曝光系统(BIO-RAD公司)

等。

1.2试药和试剂

ELISA试剂盒购自南京金益柏公司;Tris、甘氨酸等购自南京索莱宝公司,未特别注明 来源的试剂,均购自Sigma-Aldrich公司 1.3样品

动物各组织样品为自取,取下后立即用液氮速冻,至于-80摄氏度保存。

  1. 实验方法

2.1生物样本的收集

处死动物,常规眼眶取血,常温静置2h后3500 rpm/min,4□离心,吸取血清。剩余组 织均为常规取法,液氮速冻,-80摄氏度保存。

2.2动物粪便的16SrRNA测序技术及生物信息学分析

进行粪便DNA提取,再对提取的DNA进行PCR扩增,进行Pooling和切胶纯化。比 对测序数据,进行OTU和群落分析,再进行alpha diversity分析,进行丰度和多样性的计 算。再进行beta diversity分析,可以计算菌群指数。

  • ELISA法测定小肠中炎症相关因子的表达

取动物相应组织组织,液氮速冻后置于-80度过夜,称取适量组织,加入20倍量PBS, 匀浆,制备匀浆液按照各炎症因子ELISA试剂盒的说明书,绘制标准曲线,釆用酶标仪检 测吸光度,并以此作为所测相关因子定量的依据。

  • WB法检测屏障相关蛋白的表达 4.1蛋白提取与处理

取适量组织于离心管中,加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail,混匀后4[匀浆 lOmin,直至充分溶解。冰上放置20min,放入转速为l,3000rpm,4□的离心机里离心25min; 保存于-80 □冰箱。

2.4.2蛋白浓度的测定

用BCA法测试蛋白的浓度,根据TRAN Protein Quantitative Kit试剂盒的说明,进行常 规吸光度测定即可。

2A3 Western Blot 实验

将蛋白用SDS、p-巯基乙醇等变性。取变性蛋白上样,加入预先配置好的8%的聚丙烯 酰胺凝胶中电泳2小时左右,转至硝酸纤维素膜(4口,120min)。5%用TBS-T配制的脱脂 奶粉室温封闭膜2h后,分别用ZO-1抗体(1: 2000)、Occludin抗体(1:4000)与GAPDH 抗体(1:5000)4□孵育过夜。用TBS-T洗膜6次广次10min,再和HRP偶联第二抗体(1:10000) 室温孵育lh后,ECL化学发光显色,凝胶成像检测,利用ImageJ软件分析条带的灰度值,

以GAPDH作为样品内参。

  1. 实验结果

3.1抗生素混合溶液影响下的模型小鼠各给药组肠道菌群分析结果

为了验证D-652调控肠道微生态系统抗抑郁的效用以及研宄抗生素影响的肠道菌变化 对CUMS模型小鼠肠道微生态的影响,我们釆用了 16SrRNA测序技术对肠道菌群的种类 和丰度进行测定,图为不同种肠道菌群的丰度在各组动物之间的变化情况,数据结果 以相对于空白组的丰度来表现(空白组为100%)。实验结果表明,动物经过CUMS模型的 建立过程后,模型小鼠的肠道菌的种类和丰度产生了非常明显的改变,表现为必 5诉foAac纪Www、五/^m^ccus等的显著下调,CWor达acto*等的显著上调。而抗生素的影响 下,肠道菌群的结构和丰度都发生了十分明显的变化,有害菌如乂仙如 邱WMMeW⑽的比重下调更多。而给药不同配比的开心散后,开心散给药组能够将部分 肠道菌调至与空白组接近的状态。抗生素作用后,D-652上调的革兰氏阳性菌和下调革兰 氏阴性菌的作用趋势被抗生素所逆转。这可能是抗生素产生削弱开心散抗抑郁作用的原因

图3-2-1-1抗生素作用下的D»652调控肠道菌群情况 Figure 3-2-2-1 The effect of D-652 on regulating gut microbiota in animals by antibiotics

3.2抗生素混合溶液对于模型动物小肠中促炎物质的表达影响

为了验证D-652调控肠道微生态系统抗抑郁的效用以及研究抗生素影响的肠道菌变化 对CUMS模型小鼠小肠中炎症因子的影响,我们釆用了 ELISA法,检测各组动物小肠中 炎症因子促炎物质LPS、IL_l(i、IL_6、TNF-ot的表达情况如图3-2-1-2所示,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组小肠中炎症因子的表达情况。 数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型组动 物小肠组织中促炎因子得到了显著上调、如IL-1P (与空白组相比,P<0.05)、IL-6 (与空白 组相比,P<0.05)、TNF_a (与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS模型小鼠的小肠中出 现了炎症反应。而经过抗生素的作用后,我们发现,在抗生素影响下,小肠中IL-lp和TNF- (1的水平与模型组相比显著下调(与模型组相比,P<〇.〇5),而IL-6的水平并无明显改变。 D-652能够下调模型小鼠中小肠中的IL-lp的表达水平(与模型组相比,P<0.05)、IL-6的 表达水平(与模型组相比,P<〇.〇5)和TNF-a的表达水平(与模型组相比,P<0.05)。其中, 长期饮用抗生素溶液的小鼠在接受D-652的治疗后,炎症因子IL-lp、IL-6、TNF_a的下调 趋势在各给药组之中最强(与模型组相比,P<0.05)。提示了抗生素溶液的影响还体现在了 对小肠中炎症水平的调控上。

3-2-1-2抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠小肠中炎症因子的表达
Figure 3-2-1-2 The effect of D-652 on regulating inflammatory factors in intestine by antibiotic

3.3抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠中小肠中屏障蛋白的表达

为了验证D-652调控肠道微生态系统抗抑郁的效用以及研究抗生素影响的肠道菌变化 对CUMS模型小鼠肠道屏障蛋白表达的影响,我们釆用了 WB法,检测各组动物小肠组织 中肠道屏障蛋白ZO-1、Occludin的表达情如图3-2-1-3所示,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组小肠中肠道屏障蛋白Z0-1、 Occludin的表达情况,数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实 验结果表明,模型组动物小肠组织中肠道屏障蛋白ZO-1的表达相对于空白组显著下调(与 空白组相比,P<0.05)、肠道屏障蛋白Occludin的表达显著下调(与空白组相比,P<0.05), 这显示了肠道屏障功能下降。而经过抗生素的作用后,我们发现,抗生素并不对肠道屏障 蛋白的表达产生明显影响。而D-652能够显著上调肠道屏障蛋白ZCM表达水平(与模型 组相比,P<0.05); D-652具有上调肠道屏障蛋白Occludin表达水平的作用趋势(与模型组 相比,P<0.05),该趋势能被抗生素给药所逆转。

3-2-1-3抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠中小肠中屏障蛋白的表达 Figure 3-2-1-3 The effect of D-652 on regulating barrier protein expression in animals by antibiotics

  1. 结果与讨论

实验选取的四种抗生素氨苄青霉素钠、甲硝唑、硫酸新霉素和盐酸万古霉素的混合溶 液,这四种抗生素的混合溶液的抗菌谱及其广泛,尤其是对于厌氧菌有极强的杀灭能力。 能够明显的干扰肠道微生态的变化,这是我们优化无菌鼠造成的实验的实际操作困难的尝 试。通过肠道菌的测序证明其达到了我们所需的实验效果。

我们在实验中发现,第二章所述的开心散所改变的十二个菌属中,革兰氏阴性菌和革 兰氏阳性菌的表达情况被相应的逆转了,表现为革兰氏阳性菌的含量下降,革兰氏阴性菌 的含量上升,对肠道菌中LPS的含量检测也证明了这一点,从而加剧了炎症反应。这可能 是开心散抗抑郁的作用被抗生素所削弱的原因。

此外,开心散所上调的乳酸杆菌属、双歧杆菌属和下调的粪球菌属均是由明确报道的 肠道微生态的益生菌和有害菌。然而抗生素作用后,这一类菌种的比例也发生了有害菌丰 度上调的情况,这也值得进一步研究。

接着我们将从中枢神经系统和压力系统进一步验证开心散调控脑-肠轴抗抑郁的作用 机制。

二、开心散调控中枢神经炎症系统抗抑郁效用与机制验证

为了验证D-652调控调控中枢神经炎症系统抗抑郁的效用以及研宄抗生素影响的肠道 菌变化对CUMS模型小鼠中枢神经炎症系统的影响,我们以第三章第一节所述的动物为实 验材料,获取实验动物的下丘脑、海马区、肾上腺、血清等生物样本,采用ELISA法分别 对其中的炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a进行含量测定。评价开心散调控中枢神经炎症系统 的效用以及抗生素影响的肠道菌群的变化对中枢神经炎症系统的影响。并采用蛋白免疫印 迹法检测动物的小肠组织中血脑屏障蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5的表达,评价开心散 调控血脑屏障系统的效用以及抗生素影响的肠道菌群的变化对血脑屏障功能的影响。结果 发现,模型组动物相较于空白对照组,其下丘脑、海马区、肾上腺、血清中的炎症因子1]:- 1P、IL-6、TNF-a的表达水平显著升高,长期饮用含抗生素饮用水的并接受造模的动物较 模型组炎症因子的水平较低。灌胃D-652后,长期服用含抗生素饮用水的模型小鼠在接受 D_652的治疗后,其下丘脑、海马区、肾上腺、血清中炎症因子的较D-652组低,但没有 显著性差异。以上各组与模型组相比,均显著削弱了模型小鼠的下丘脑、海马区、肾上腺、 血清中炎症因子升高的作用趋势。在血脑屏障的水平测定上,模型小鼠的血脑屏障蛋白20-

1、Occludin、Claudin-5的表达下降、而D-652能够削弱模型小鼠血脑屏障蛋白下降的趋 势。但抗生素的作用与否并不对血脑屏障蛋白的表达产生影响。这表明D-652对于中枢神 经炎症的调控作用得到验证,并且抗生素影响的肠道菌变化对于中枢神经系统具有影响, 表现血清和为中枢神经系统的炎症因子降低。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

多功能酶标仪(PerkinElmer珀金埃尔默公司);蛋白电泳及曝光系统(BIO-RAD公司)

等。

1.2试药和试剂

ELISA试剂盒购自南京金益柏公司;Tris、甘氨酸等购自南京索莱宝公司,未特别注明 来源的试剂,均购自Sigma-Aldrich公司 1.3样品

动物各组织样品为自取,取下后立即用液氮速冻,至于-80摄氏度保存。

  1. 实验方法

2.1生物样本的收集

处死动物,常规眼眶取血,常温静置2h后3500 rpm/min,4□离心,吸取血清。剩余组 织均为常规取法,液氮速冻,-80摄氏度保存。

2.2 ELISA法测定生物样品中炎症相关因子的表达 血清取20pL直接按试剂盒操作即可。

取动物相应组织组织,液氮速冻后置于-80度过夜,称取适量组织,加入20倍量PBS, 匀楽,制备匀浆液按照各炎症因子ELISA试剂盒的说明书,绘制标准曲线,采用酶标仪检 测吸光度,并以此作为所测相关因子定量的依据。

  • WB法检测屏障相关蛋白的表达 3.1蛋白提取与处理

取适量组织于离心管中,加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail,混匀后4[匀浆 lOmin,直至充分溶解。冰上放置20min,放入转速为l,3000rpm,4[的离心机里离心25min; 保存于-8〇[:冰箱。

2.3.2蛋白浓度的测定

用BCA法测试蛋白的浓度,根据TRANProteinQuantitativeKit试剂盒的说明,进行常 规吸光度测定即可。

2_3.3 Western Blot 实验

将蛋白用SDS、卜巯基乙醇等变性。取变性蛋白上样,加入预先配置好的8%的聚丙烯 酰胺凝胶中电泳2小时左右,转至硝酸纤维素膜(4口,120min)。5%用TBS-T配制的脱脂 奶粉室温封闭膜2h后,分别用Z0-1抗体(1: 2000)、Occludin抗体(1:4000)与GAPDH 抗体(1:5000)4□孵育过夜。用TBS-T洗膜6次,一次10min,再和HRP偶联第二抗体(1:10000) 室温孵育lh后,ECL化学发光显色,凝胶成像检测,利用ImageJ软件分析条带的灰度值,

以GAPDH作为样品内参。

  1. 实验结果

3.1抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠清中促炎物质的表达

为了验证D_652调控中枢神经炎症系统抗抑郁的效用以及研究抗生素影响的肠道菌变 化对CUMS模型小鼠血清中炎症因子的影响,我们采用了 ELISA法,检测各组动物血清 中促炎物质LPS、IL-lp、IL-6、TNF-a的表达情况。,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组血清中炎症因子的表达情况。 数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型组动 物血清中促炎因子得到了显著上调、如IL-ip (与空白组相比,P<0.05)、IL_6 (与空白组相 比,P<0.05)、TNF-ot (与空白组相比,P<0.05),这表明能从CUMS模型小鼠的血清中发 现机体炎症反应。而经过抗生素的作用后,我们发现,在抗生素影响下,血清中IL-ip水 平相比模型组显著下调(与模型组相比,P<0.05),而IL-6、TNF-a的水平并无明显改变。 D-652能够下调模型小鼠中血清中的IL-lp的表达水平(与模型组相比,P<0.05)、IL-6的 表达水平(与模型组相比,P<0.05)和TNF-a的表达水平(与模型组相比,P<0.05)。其中, 长期饮用抗生素溶液的小鼠在接受D-652的治疗后,炎症因子IL-lpIL-6、TNF-a的下调 趋势在各给药组之中最强(与模型组相比,P<0.05)。提示了抗生素溶液的影响还体现在了 对血清中炎症水平的调控上,抗生素溶液作用下有害菌的数量和比例下降,有助于D-652 对于小鼠产生抑郁样水平的关键环节,即将中枢神经系统的炎症反应向机体正常方向调控

Water Antibiotics

□ CUMS HCUMS+D-652 □ CUMS HCUMS+D-652

H

100

roJluooo^runoulv

3.2抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠各生物样本中血脑屏障相关蛋白的表达

为了验证D-652调控中枢神经炎症系统抗抑郁的效用以及研究抗生素影响的肠道菌变 化对CUMS模型小鼠血脑屏障蛋白表达的影响,我们采用了 WB法,检测各组动物小肠组 织中血脑屏障蛋白ZO-1、Occludin、Claudin_5的表达情况

如图3-212所示,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组小肠中血脑屏障蛋白Z0-1、 Ocdudin、Claudin-5的表达情况,数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为 100%)。实验结果表明,模型组动物小肠组织中血脑屏障蛋白ZO_l的表达相对于空白组显 著下调(与空白组相比,P<0.05)、血脑屏障蛋白Ocdudin的表达显著下调(与空白组相 比,P<0.05),这显示了血脑屏障功能下降。而经过抗生素的作用后,我们发现,抗生素作 用下血脑屏障蛋白ZO-1的表达水平相对于模型组上调(与模型组相比,P<0.05)。而D-652 能够显著上调血脑屏障蛋白ZO-1表达水平(与模型组相比,P<0.05); D-652具有上调血 脑屏障蛋白Ocdudin表达水平的作用趋势(与模型组相比,P<0.05); D-652具有上调血脑 屏障蛋白Claudin-5表达水平的作用趋势(与模型组相比,P<0.05)。长期饮用抗生素溶液 的小鼠在接受D-652的治疗后,血脑屏障蛋白的上调趋势ZO-1、Ocdudin、Claudin-5在各 给药组之中最强(与模型组相比,P<0,05)。提示抗生素对于D-652上调血脑屏障功能的作 用影响不大。

3.3抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠脑中炎症因子的表达 3.3.1抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠前额皮质中炎症因子的表达

为了验证D-652调控中枢神经炎症系统抗抑郁的效用以及研宄抗生素影响的肠道菌变 化对CUMS模型小鼠前额皮质中炎症因子的影响,我们釆用了 ELISA法,检测各组动物 前额皮质中促炎物质LPS、IL_lp、IL-6、TNF_a的表达情况。

如图3_2-2_3所示,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组前额皮质中炎症因子的表达情 况。数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型 组动物前额皮质中促炎因子得到了显著上调、如IL-1P (与空白组相比,P<0.05)、IL-6 (与 空白组相比,P<0.05)、TNF-a (与空白组相比,P<0.05),这表明能从CUMS模型小鼠的 前额皮质中发现机体炎症反应。而经过抗生素的作用后,我们发现,在抗生素影响下,前 额皮质中IL-lp、IL-6水平相比模型组显著下调(与模型组相比,P<0.05),而TNF-a的水 平并无明显改变。D-652能够下调模型小鼠中前额皮质中的IL-lp的表达水平(与模型组 相比,P<0.05)、IL-6的表达水平(与模型组相比,P<0.05)和TNF-ot的表达水平(与模型 组相比,P<0.05)。其中,长期饮用抗生素溶液的小鼠在接受D-652的治疗后,炎症因子IL_ lp、IL-6、TNF-a的下调趋势在各给药组之中最强(与模型组相比,P<0.05)。提示了抗生 素溶液的影响还体现在了对前额皮质中炎症水平的调控上,抗生素溶液作用下有害菌的数 量和比例下降,有助于D-652对于小鼠产生抑郁样水平的关键环节,即将中枢神经系统的 炎症反应向机体正常方向调控。

□ CUMS a CUMS+D-652 □ CUMS H CUMS+D-652

3.3.2抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠海马区中炎症因子的表达

为了验证D-652调控中枢神经炎症系统抗抑郁的效用以及研宄抗生素影响的肠道菌变 化对CUMS模型小鼠海马区中炎症因子的影响,我们采用了 ELISA法,检测各组动物海 马区中促炎物质LPS、IL-lp、IL-6、TNF-a的表达情况。

如图3-2-2-4所示,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组海马区中炎症因子的表达情况。 数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型组动 物海马区中促炎因子得到了显著上调、如IL-ip (与空白组相比,P<0.05)、IL-6 (与空白组 相比,P<0.05)、TNF-a (与空白组相比,P<0.05),这表明能从CUMS模型小鼠的海马区 中发现机体炎症反应。而经过抗生素的作用后,我们发现,在抗生素影响下,海马区中IL- 1P、TNF-a水平相比模型组显著下调(与模型组相比,P<0.05),而IL-6的水平并无明显 改变。D-652能够下调模型小鼠中海马区中的IL-1P的表达水平(与模型组相比,P<0.05)、 IL_6的表达水平(与模型组相比,P<0.05)和TNF-a的表达水平(与模型组相比,P<0.05)。 其中,长期饮用抗生素溶液的小鼠在接受D-652的治疗后,炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a 的下调趋势在各给药组之中最强(与模型组相比,P<〇.〇5)。提示了抗生素溶液的影响还体 现在了对海马区中炎症水平的调控上,抗生素溶液作用下有害菌的数量和比例下降,有助 于D-652对于小鼠产生抑郁样水平的关键环节,即将中枢神经系统的炎症反应向机体正常 方向调控S+D^52

Water Antibiotics

□ CUMS ■

CUMS+D-652

Water Antibiotics

{IOJcoooo2FrunoE<

3.3.3抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠下丘脑中炎症因子的表达

为了验证D-652调控中枢神经炎症系统抗抑郁的效用以及研究抗生素影响的肠道菌变 化对CUMS模型小鼠下丘脑中炎症因子的影响,我们釆用了 ELISA法,检测各组动物下 丘脑中促炎物质LPS、IL_lp、IL_6、TNF-a的表达情况。

如图3-2-2-5所示,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组下丘脑中炎症因子的表达情况。 数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型组动 物下丘脑中促炎因子得到了显著上调、如IL_lp (与空白组相比,P<0.05)、IL-6 (与空白组 相比,P<0.05)、TOF-a (与空白组相比,P<0.05),这表明能从CUMS模型小鼠的下丘脑 中发现机体炎症反应。而经过抗生素的作用后,我们发现,在抗生素影响下,下丘脑中IL- 1P、IL-6水平相比模型组显著下调(与模型组相比,P<0.05),而TNF-ot的水平并无明显 改变。D-652能够下调模型小鼠中下丘脑中的IL-lp的表达水平(与模型组相比,P<0.05)、 IL-6的表达水平(与模型组相比,P<0.05)和TNF_a的表达水平(与模型组相比,P<0.05)。 其中,长期饮用抗生素溶液的小鼠在接受D-652的治疗后,炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a 的下调趋势在各给药组之中最强(与模型组相比,P<0.05)。提示了抗生素溶液的影响还体 现在了对下丘脑中炎症水平的调控上,抗生素溶液作用下有害菌的数量和比例下降,有助 于D-652对于小鼠产生抑郁样水平的关键环节,即将中枢神经系统的炎症反应向机体正常 方向调控。

LPS

3_2-2-5抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠下丘脑中炎症因子的表达

Figure 3-2-2-5 The effect of D-652 on regulating inflammatory factors in hypothalamus by antibiotics

  1. 结果与讨论

实验釆取抗生素溶液以造成小鼠的肠道微生态产生的差异,该方法虽不如无菌鼠直接 和说服力强,但是由于其操作简单、应用广泛,从而也作为一种常见的手段。对肠道菌群 的分析来看,的确发现了肠道菌群产生了变化。并且,我们看到了肠道微生态的差异对于 动物的抑郁样行为有一定的影响,服用抗生素溶液作为饮用水的小鼠表现为更加能够对抗 慢性压力应激。

而在我们认为开心散可能调控中枢神经炎症系统各项生物指标均优与行为学趋势一致 的变化。这说明压力应激会导致肠道微生态系统的紊乱,这种紊乱很可能是有害菌的数量 和和类型增多,从而导致了炎症反应和抑郁症的加重。对于开心散调控脑-肠轴抗抑郁的作 用的验证,我们进一步验证了循环和中枢神经炎症系统进行了验证。我们发现由于肠道微 生态革兰氏阴性菌的比例上调导致肠道炎症反应加剧,而在血清和脑中炎性因子的表达的 总体趋势依然是抗生素削弱了开心散的效用。

实验初期的动物水平整体表象非常重要,对于中枢神经炎症的进一步的机制研究,从 体外多种细胞模型的结合入手,凭借细胞模型单纯、易于操作的优势,可以得到较为客观 准确的结论。

我们将进一步从压力因子的表达入手,完成HPA轴效应相关三大系统的综合验证。

三、开心散调控压力应激系统抗抑郁效用与机制验证

为了验证D-652调控调控压力应激系统抗抑郁的效用以及研宄抗生素影响的肠道菌变 化对⑶MS模型小鼠压力应激系统的影响,我们以第三章第一节所述的动物为实验材料, 获取实验动物的下丘脑、海马区、肾上腺、血清等生物样本,采用ELISA法分别对其中的 压力因子CRF、ACTH、Corticosterone进行含量测定。评价开心散调控压力应激系统的效 用以及抗生素影响的肠道菌群的变化对压力应激系统的影响。结果发现,模型组动物相较 于空白对照组,其下丘脑、海马区、肾上腺、血清中的压力因子CRF、ACTH、Corticosterone 的表达水平显著升高,长期饮用含抗生素饮用水的并接受造模的动物较模型组压力因子的 水平较低。灌胃D-652后,长期服用含抗生素饮用水的模型小鼠在接受D-652的治疗后, 其下丘脑、海马区、肾上腺、血清中压力因子的较D-652组低,但没有显著性差异。以上 各组与模型组相比,均显著削弱了模型小鼠的下丘脑、海马区、肾上腺、血清中压力因子 升高的作用趋势。这表明D-652对于压力应激系统的调控作用得到验证,并且抗生素影响 的肠道菌变化对于压力应激系统具有影响,表现为下丘脑、海马区、肾上腺、血清压力因 子的降低。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

多功能酶标仪(PerkinElmer拍金埃尔默公司);蛋白电泳及曝光系统(BIO-RAD公司)

等。

1.2试药和试剂

ELISA试剂盒购自南京金益柏公司;Tris、甘氨酸等购自南京索莱宝公司,未特别注明 来源的试剂,均购自Sigma-Aldrich公司 1.3样品

动物各组织样品为自取,取下后立即用液氮速冻,至于-80摄氏度保存。

  1. 实验方法

2.1生物样本的收集

处死动物,常规眼眶取血,常温静置2h后3500 rpm/min,4□离心,吸取血清。剩余组 织均为常规取法,液氮速冻,-80摄氏度保存。

2.2 ELISA法测定血清、组织中压力因子的表达

取动物相应组织组织,液氮速冻后置于-80度过夜,称取适量组织,加入20倍量PBS, 匀浆,制备匀浆液按照各压力因子ELISA试剂盒的说明书,绘制标准曲线,采用酶标仪检 测吸光度,并以此作为所测相关因子定量的依据。

 

  1. 实验结果

3.1抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠血清中压力因子的表达

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠血清中压力因子表达的影响,我们采用了 ELISA法,检测各组动物血清中压力因子CRF、ATCH、Corticosterone的表达情况,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组血清中压力因子的表达情况。 数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型组动 物血清中的压力因子CRF得到了显著上调(与空白组相比,P<0.05),模型组动物血清中 的压力因子ATCH得到了显著上调(与空白组相比,P<0.05),模型组动物血清中的压力因 子Corticosterone得到了显著上调(与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS模型小鼠血清 中压力因子CRF、ATCH、Corticosterone过量表达,压力系统调控紊舌U而经过抗生素的 作用后,我们发现,在抗生素影响下,血清中的压力因子CRF、ATCH、Corticosterone水 平并未与正常饮用水组有明显差异。D-652能够下调模型小鼠中血清中的CRF、ATCH、 Corticosterone的上调趋势。长期饮用抗生素溶液的小鼠在接受D-652的治疗后,血清中压 力因子CRF、ATCH、Corticosterone的下调趋势在各给药组之中最强(与模型组相比, P<0.05)。实验验证了 D-652的下调血清压力因子水平的功效。而抗生素的使用对于压力应 激系统的影响不够显著,仅有微弱改变趋势。

3.2抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠组织中压力因子的表达 3.2.1抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠下丘脑中压力因子的表达

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠下丘脑中压力因子表达的影响,我们采用 了 ELISA法,检测各组动物下丘脑中压力因子CRF的表达情况。

如图3-2-3-2所示,图为第三章第一节中所涉及小鼠各组下丘脑中压力因子的表达情况。 数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型组动 物下丘脑中的压力因子CRF得到了显著上调(与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS模 型小鼠下丘脑中压力因子CRF过量表达,压力系统调控紊乱。而经过抗生素的作用后,我 们发现,在抗生素影响下,下丘脑中的压力因子CRF水平并未与正常饮用水组有明显差 异。D-652能够下调模型小鼠中下丘脑中的CRF的上调趋势。长期饮用抗生素溶液的小鼠 在接受D-652的治疗后,下丘脑中压力因子CRF的下调趋势在各给药组之中最强(与模型 组相比,P<0.05乂实验验证了 D-652的下调下丘脑压力因子水平的功效。而抗生素的使用 对于压力应激系统的影响不够显著。提示了在实验条件下的肠道菌群的变化情况并不会对 D-652调控压力应徼系统造成干CUMS CUMS+D-652

3-2-3-2抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠下丘脑压力因子的表达
Figure 3-2-3-2 The effect of D-652 on regulating stress factors in hypothalamus by antibiotics

3.2.2抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠肾上腺中压力因子的表达

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠肾上腺中压力因子表达的影响,我们釆用 了 ELISA法,检测各组动物肾上腺中压力因子ATCH、Corticosterone的表达情况中所涉及小鼠各组肾上腺中压力因子的表达情况。 数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型组动 物肾上腺中的压力因子ATCH得到了显著上调(与空白组相比,P<0.05),模型组动物肾上 腺中的压力因子Corticosterone得到了显著上调(与空白组相比,P<0.05),这表明CUMS 模型小鼠肾上腺中压力因子ATCH、Corticosterone过量表达,压力系统调控紊乱。而经过 抗生素的作用后,我们发现,在抗生素影响下,肾上腺中的压力因子ATCH、Corticosterone 水平并未与正常饮用水组有明显差异。D_652能够下调模型小鼠中肾上腺中的ATCH、 Corticosterone的上调趋势。长期饮用抗生素溶液的小鼠在接受D-652的治疗后,肾上腺中 压力因子ATCH、Corticosterone的下调趋势在各给药组之中最强(与模型组相比,P<0.05)。 实验验证了 D-652的下调肾上腺压力因子水平的功效。而抗生素的使用对于压力应激系统 的影响不够显著。提示了在实验条件下的肠道菌群的变化情况并不会对D-652调控压力应 激系统造成干预。

3-2-3-3抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠血清肾上腺因子的表达
Figure 3-2-3-3 The effect of D-652 on regulating stress factors in adrenal by antibiotics

3.2.3抗生素混合溶液影响下的CUMS模型小鼠海马区中压力因子的表达

为了研究不同配伍比例的开心散对模型小鼠海马区中压力因子表达的影响,我们釆用 了 ELISA法,检测各组动物海马区中压力因子Corticosterone的表达情况图为第三章第一节中所涉及小鼠各组海马区中压力因子的表达情况。 数据结果以相对于空白组含量的百分比呈现(空白组为100%)。实验结果表明,模型组动 物海马E中的压力因子Corticosterone得到了显著上调(与空白组相比,P<0.05),这表明 CUMS模型小鼠海马区中压力因子Corticosterone过量表达,压力系统调控紊乱。而经过抗 生素的作用后,我们发现,在抗生素影响下,海马区中的压力因子Corticosterone水平并未 与正常饮用水组有明显差异。D-652能够下调模型小鼠中海马区中的Corticosterone的上调 趋势。长期饮用抗生素溶液的小鼠在接受D-652的治疗后,海马区中压力因子Corticosterone 的下调趋势在各给药组之中最强(与模型组相比,P<〇.〇5)。实验验证了 D-652的下调海马 区压力因子水平的功效。而抗生素的使用对于压力应激系统的影响不够显著。提示了在实 验条件下的肠道菌群的变化情况并不会对D-652调控压力应激系统造成干预。

 

  1. 结果与讨论

压力应激激活下丘脑-垂体-肾上腺(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal,HPA)轴,促使压

力因子的产生,在动物体内,最终以皮质甾酮损伤海马神经元的形式导致或者加剧抑郁症。 正常情况下,HPA轴所相关的负反馈调节并不会使机体进入病理情况,但是过量的压力应 激会导致负反馈调节失控,因此皮质留酮才能损伤海马区的神经元细胞。通过对于血清和 组织中的压力因子的检测,我们发现模型小鼠的压力因子水平相较于空白组显著上调,证 实了我们对于CUMS模型小鼠会产生该类型病理变化的猜测。同时,开心散作用组能够下 调压力因子上调的趋势,因此我们认为,开心散具有在该系统下的调控作用。幵心散的抗 抑郁功效可能与其调控压力应激系统有关。

基于目前的结果,我们的确发现抗生素作用后开心散对于CUMS小鼠的抑郁样行为和 机制发生了改变。从肠道菌群和肠道炎症的结果可以看出,开心散对于肠道微生态的调控 是其抗抑郁的重要环节,但是对于压力应激系统的验证,还需要更多深入的研宄。

【参考文献】

  • Aydemir 0, Deveci A, Taneli F. The effect of chronic antidepressant treatment on serum brain-derived neurotrophic factor levels in depressed patients: a preliminary study. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry.2005(29): 261-265,.
  • Okamoto T, Yoshimura R, Ikenouchi-Sugita A;et, al. Efficacy of electroconvulsive therapy is associated with changing blood levels of homovanillic acid and brain-derived neurotrophic factor in refractory depressed patients: a pilot study. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2008(32): 1185-1190.

 

第四章开心散抗抑郁功效物质的细胞学筛选研究

我们基于整体动物实验的结果,揭示了开心散调控脑-肠轴抗抑郁的作用机制。然而, 对于中药复方的研究不能仅从作用机制的角度进行考察。这是因为中药复方物质多样,作 用靶点多样。若不能指出中药复方的功效物质基础,会导致中药复方质量标准制定过程遇 到困难,而且也对于方剂功效的后续研宂造成困难。因此,对于中药复方功效物质基础的 研究就显得尤为重要。为了发现开心散抗抑郁的功效物质基础,我们选择采取体外细胞学 筛选的方案。在已经明确证明了开心散具有调控肠道微生态、中枢神经炎症、压力应激这 三大系统的作用机制之后,我们拟定建立肠道炎症细胞模型、中枢神经炎症模型、压力应 激细胞保护模型,从全方、部位、单体三个层级分别进行细胞学筛选,从而得到抗抑郁导 向下的开心散功效物质。我们综合评价七种细胞模型中表达趋势较强的单体成分,并参考 其原方中的物质含量,进行组合。初步发现开心散抗抑郁的四种功效物质。分别是来自人 参中的人参皂苷Rgi、来自远志的远志口山酮III、来自石菖蒲的a-细辛醚、以及来自茯苓 的茯苓酸。需要特别指出的是,这四种单体并不能说是开心散的替代。它们的组合是从开 心散原方中获得功效物质的一部分,开心散的功效物质基础研宄还有待深入。

第一节基于肠道炎症模型的开心散抗抑郁功效物质的筛选

一、基于肠道炎症因子表达调控的开心散功效物质细胞学研究

本部分实验的目的是筛选出基于肠道炎症模型中肠道炎症因子表达水平调控的开心散 中抗抑郁功效物质。因此我们建立小鼠巨噬细胞(RAW264.7)模型,加以药物作用,釆用 qPCR法检测L-lp、IL-6、TNF-a的mRNA水平的表达。采用LPS刺激该细胞并加以药物 作用,采用qPCR法检测IL-1(3、IL-6、TNF-a的mRNA水平的表达。结果发现从全方、成 分到单体的不同层面有不同程度的基于肠道炎症因子的表达水平调控的活性,其中在单体 层面上,作用趋势最强的前三个单体为人参皂苷Rgl、人参皂苷Rbi、茯苓酸。我们的得到 的结论是,人参和茯苓中的成分为基于肠道炎症因子表达水平的最有效的成分。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

二氧化碳培养箱(Thermo3100,美国Thermo公司),生物安全柜(1300seriesA2,美国 Thermo公司),超速台式冷冻离心机(Microfage22RCentriftige,BECKMAN公司),倒置 显微镜(TE-2000, Nicon公司),超微量紫外/可见分光光度计(DENOVIXDS-11,美国), 荧光实时定量PCR仪(ABScience7500,美国),电子天平(BT125型,赛多利斯科学仪器 有限公司),超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司),酶标仪(Perkin Elmer)等。

1.2细胞系

RAW264.7,购自ATCC,存于本实验室液氮保存罐中。

1.3试药和试剂 1.3.1试药

全方层面:制备D-652、K-984、K-1640的冻干粉,溶解后作为全方的试药。

成分层面:人参总皂苷、远志总皂苷、石菖蒲总挥发油、茯苓多糖(纯度均大于80%) 购自南京源叶公司。

单体层面:人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、人参皂苷Re、远志口山酮III、3,6-二酰基 蔗糖酯、(X-细辛醚、P-细辛醚、茯苓酸、去氢茯苓酸、猪苓酸C购自四川维克奇公司。 1.3.2试剂

H-DMEM、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、青霉素/链霉素(P/S)购自Gibco公司, 异丙醇(分析级)、三氯甲烷(分析纯)、无水乙醇(分析纯)均购自国药上海公司,逆转 录试剂盒、qPCR检测试剂盒均购自Transgen公司,其他未特别注明的试剂,均购自sigma- aldrich公司。细胞培养所用的耗材均有Coming公司提供。

  1. 实验方法

2.1样品冻干粉的制备

即取人参、远志、石菖蒲、茯苓,按3:2:2:3,(D-652)的比例组总体积为100g的药材, 加入lOOOmL纯水,回流提取2小时,滤过,取滤液。剩余药材再次加入800mL纯水,继 续回流提取2小时,滤过,合并两次提取液。同法制备K-984,人参、远志、石菖蒲、茯苓 的比例为1:1:1:2。同法制备K-1640,人参、远志、石菖蒲、茯苓的比例为1:1:4:8。-80□预 冻过夜、置于冷冻干燥仪冻干,计算得率。

2.2细胞培养方案

RAW264.7 细胞的培养基 H-DMEM(89%), FBS(10%),P/S (1%)。细胞复苏于 60mm 的培 养皿中,待细胞密度达到80%,吹打传代,每隔48h更换一次培养基,每四天进行一次传 代。待细胞传代三次生长状态稳定后,将细胞以1.0 xl〇4个/cm2的密度种于6孔细胞培养 板,培养体积为2ml,给药3h前,需要将培养基换为新鲜培养基。

2.3细胞给药方案的设计

各药物用DMSO溶解成实验最高浓度1000倍的母液,作用48h。LPS用H-DMEM溶 解成lmg/ml的母液,与药物共同作用。

2.4 qPCR法检测相关mRNA的表达水平

细胞末次给药24h后,抽去细胞培养液,PBS清洗三遍,抽干,放置于-80T过夜,按 照Trizol试剂盒说明书所列步骡,提取细胞总RNA,测定含量和纯度后,取满足TransGen cDNA制备试剂盒要求的RNA样本,制备cDNA,制备后测定含量和纯度,按照TmnsGen qTOP Mix试剂盒的实验步骤,进行qPCR实验。qPCR反应程序参考TransGen qTOP Mix 试剂盒的说明。确认相关指标的转录水平。实验用引物表见表4-1-M。实验结果

3.1开心散提取物冻干粉得率

开心散冻干粉的得率如表4-1-1-2所示。

表4-1-1-2开心散冻干粉得率
Table 4-1-1-2 The rate of KXS by freezing dry progress

3.2基于RAW264.7细胞系的筛选结果

为了评价开心散各物质对肠道炎症的干预作用,筛选去具有调控肠道炎症因子水平的 开心散功效物质,我们模拟肠道炎症环境,选择RAW264.7细胞株。这是基于RAW264.7 作为巨噬细胞的一类,可以对外源性的促炎物质产生应答从而分泌炎症因子。因此,我们 釆用LPS对RAW264.7细胞进行刺激,在LPS作用的同时,加入全方、成分、单体三个层 次的药物。首先,我们需要考察适宜实验条件下的LPS作用浓度。之后,药物与LPS (1 |ig/ml)共作用细胞48h后,釆用qPCR法考察RAW264.7中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF- ot的mRNA水平表达。我们发现,各种药物在没有LPS (lpg/ml)刺激RAW264.7的条件 下,不会显著改变炎症因子的表达。经过系列筛选,我们在全方层次筛选出基于肠道炎症 体外细胞模型下调LPS (lpg/ml)刺激致RAW264.7中炎症因子过量表达作用趋势最强的 比例是D-652;在部位层次筛选出基于肠道炎症体外细胞模型中下调LPS (1叫/ml)刺激 致RAW264.7中炎症因子过量表达趋势最强的成分是人参总皂苷(GRSaponin)、茯苓多糖 (POPolysaccharide);在单体层次筛选出基于肠道炎症因子表达水平调控细胞模型中下调 LPS (1 gg/ml)刺激致RAW264.7中炎症因子过量表达趋势最强的前三个化合物依次是人 参阜苷 Rgi (GinsenosideRgi)、人参阜苷 Rbi (GinsenosideRbi)、茯苳酸(Pachymicacid)。

3.2.1适合实验条件的LPS作用于RAW264.7细胞的浓度确定

为了确定适合实验条件下的LPS刺激RAW264.7细胞的作用浓度,我们将不同浓度的 LPS作用于RAW264.7细胞。课题组的前期研究表明,LPS合适的作用时间为48h,因此 采用48h作为本研宄中LPS的作用时间。不同浓度的LPS作用48h后,采用qPCR法检测 不用浓度LPS作用后RAW264.7中炎症因子IL-1(3、IL-6、TNF-a的mRNA水平表达。结 果以相对于空白组的倍数呈现。

图4-1-1-1为合适的LPS刺激浓度的确定。对于合适的LPS浓度的确定,我们选择的 标准是基于IL-l(i、IL-6、TNF-a的mRNA的相对表达量,合适的LPS的浓度对这三种炎 症因子的增长不应太高(大于10倍)也不应过低(小于2倍),同时考虑到对于试剂、样 品的节约以及实验操作的简便。因此,我们在确定LPS刺激48h是较为合适的作用时间的 条件下,发现LPS的浓度为(1 pg/ml)(与空白组相比,P<0.01)为本实验中合适的LPS 刺激浓度。

3.2.2基于RAW264.7细胞系的开心散全方层次筛选结果

为了评价开心散各配伍比例对肠道炎症的干预作用,我们模拟肠道炎症环境,选择 RAW264.7细胞株,利用LPS进行刺激,加以开心散各配伍比例D-652、K-984和K-1640, 考察开心散各配伍比例对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述开心散各配伍比例按将不同浓度(1、3、lOpg/ml)加至RAW264.7 细胞。采用qPCR法考察RAW264.7中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-ot的mRNA表达水平。 如图4-1-1-2A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后, RAW264.7细胞中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-1-1-2B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0,05)。 上述各配伍比例均可以削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-lp表达上,D-652 的效用优于K-984和K-1640,其中以D-652 (10 [ig/ml)的效用最强(与LPS组相比, P<0.01);在 IL-6 表达上,D-652 的效用优于 K-984 和 K-1640,其中以 D-652 (10 pg/ml) 的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在TNF-a表达上,D-652的效用优于K-984和K- 1640,其中以D-652 U0pg/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基 于肠道炎症模型中的肠道炎症因子表达水平调控模型的开心散全方层次的筛选上,D-652 具有最强的下调LPS刺激后RAW264.7中炎症因子IL-6、TNF-a的mRNA表达水 平上调的趋势。提示D-652是具有调控肠道炎症的开心散中的有效各配伍比例。

4-1-1-2基于RAW264.7细胞系的全方的筛选结果
Figure 4-1-1-2: Screening results at formulae levels based on RAW264.7 cell line

3.2.3基于RAW264.7细胞系的开心散部位层次筛选结果

为了评价开心散部位对肠道炎症的干预作用,我们模拟肠道炎症环境,选择RAW264.7 细胞株,利用LPS进行刺激,加以开心散部位人参总皂苷(GRSaponin),远志总皂苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils)、茯苳多糖(PO Polysaccharide)。考察开心散

部位对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述开心散部位按将不同浓度(1、3、10㈣ml)加至RAW264.7细胞。 采用qPCR法考察RAW264.7中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-ot的mRNA表达水平。如图 4-1-1-3A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,RAW264.7 细胞中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-1-1-3B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL4|3、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述有效部位均可以削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-1(3表达上,人参总皂 苷与茯苓多糖效用优于远志总皂苷与石菖蒲挥发油,其中以人参总皂苷(10^g/ml)与茯苓 多糖(10pg/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在IL-6表达上,人参总皂苷与茯 苓多糖效用优于远志总皂苷与石菖蒲挥发油,其中以人参总皂苷(10 pg/ml)与茯苓多糖 (l〇lig/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在TNF-ot表达上,人参总皂苷的效用 优于远志总皂苷、石菖蒲挥发油和茯苓多糖,其中以人参总皂苷(10 Hg/ml)的效用最强 (与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基于肠道炎症模型中的肠道炎症因子表达水平调 控模型的开心散部位层次的筛选上,人参总皂苷和茯苓多糖具有最强的下调LPS刺激后 RAW264.7中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-ct的mRNA表达水平上调的趋势。提示人参总皂 苷和茯苓多糖是具有调控肠道炎症的开心散中的有效部位

3.2.4基于RAW264.7细胞系的来源于人参中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对肠道炎症的干预作用最强的单体,我们模拟肠道炎症环 境,选择RAW264.7细胞株,利用LPS进行刺激,本组选用了来源于人参中的三个单体成 分人参阜苷 Rgi (GinsenosideRgi)、人参阜苷 Rbi (GinsenosideRbi)、人参阜苷 Re (Ginsenoside Re),考察人参中的单体成分对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述人参中单体成分按将不同浓度(5、15、50pM)加至RAW264.7细 胞。采用qPCR法考察RAW264.7中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-ot的mRNA表达水平。 如图4-M-4A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后, RAW264.7细胞中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF_ot的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-1-1-4B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述单体均可以削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-1(3表达上,人参皂苷Rgl、 人参皂苷Rh的效用优于人参皂苷Re,其中以人参皂苷Rgl (50pM)、人参皂苷Rbi (50 fxM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在IL-6表达上,人参皂苷Rgl、的效用优于 人参皂苷Rh和人参皂苷Re,其中以人参皂苷Rgl (50|iM)的效用最强(与LPS组相比, P<0.01);在TNF-a表达上,人参皂苷Rgl、人参皂苷Rh的效用优于人参皂苷Re,其中 以人参皂苷Rgi (50pM)、人参皂苷Rln (50pM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。 我们发现,在基于肠道炎症模型中的肠道炎症因子表达水平调控模型的来源于人参中单体 层次的筛选上,人参皂苷Rgi和人参皂苷Rh具有最强的下调LPS刺激后RAW264.7中炎 症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平上调的趋势。提示人参皂苷Rgl和人参皂 苷Rh是开心散中具有调控肠道炎症的有效物质。

4-1-M基于RAW264.7细胞系的人参中单体的筛选结果
Figure 4-1-1-4 Screening results of monomers in Ginseng based on RAW264.7 cell line

3.2.5基于RAW264.7细胞系的来源于远志中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对肠道炎症的干预作用最强的单体,我们模拟肠道炎症环 境,选择RAW264.7细胞株,利用LPS进行刺激,本组选用了来源于远志中的两个单体成 分 3, 6’-二酸基蔗糖酯(3,6’-Disinapoylsucrose)、远志口山酮 III (Polygalaxanthone III), 考察远志中的单体成分对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述远志中单体成分按将不同浓度(5、15、50pM)加至RAW264.7细 胞。采用qPCR法考察RAW264.7中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平。 如图4-1-1-5A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后, RAW264.7细胞中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-ot的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-1-1-5B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述单体均可以削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-ip表达上,远志口山酮III 的效用优于3, 6’-二酰基蔗糖酯,其中以远志口山酮III (50pM)的效用最强(与LPS组 相比,P<0.05);在IL-6表达上,远志口山酮III的效用优于3, 6’-二酰基蔗糖酯,其中以 远志口山酮III (50pM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.05);在TNF-a的表达上,远 志口山酮III的效用优于3, 6’-二酰基蔗糖酯,其中以远志口山酮III (50pM)的效用最强 (与LPS组相比,P<0.05)。我们发现,在基于肠道炎症模型中的肠道炎症因子表达水平调 控模型的来源于远志中单体层次的筛选上,远志口山酮III具有最强的下调LPS刺激后 RAW264.7中炎症因子IL-1J3、IL-6、TNF-ot的mRNA表达水平上调的趋势。提示远志口山 酮III是开心散中具有调控肠道炎症的有效物质。

4-1-1-5基于RAW264.7细胞系的远志中单体的筛选结果
Figure 4-1-1-5 Screening results of monomers in Polygala tenuifolia based on RAW264.7 cell line

3.2.6基于RAW264.7细胞系的来源于石菖蒲中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对肠道炎症的干预作用最强的单体,我们模拟肠道炎症环 境,选择RAW264.7细胞株,利用LPS进行刺激,本组选用了来源于石菖蒲中的两个单体 成分a-细辛醚(a-Asarone)、(3-细辛醚((3-Asarone),考察石菖蒲中的单体成分对该细胞中

炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述石菖蒲中单体成分按将不同浓度(5、15、50pM)加至RAW264.7细 胞。采用qPCR法考察RAW264.7中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-amRNA表达水平。 如图4-1-1-6A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后, RAW264.7细胞中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-amRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-1-1-6B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-1(3、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述单体均不能明显削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL_lp表达上,a-细辛醚、

(3_细辛醚在实验浓度下均不能削弱LPS导致表达上调趋势;在IL-6表达上,a-细辛醚、p- 细辛醚在实验浓度下均不能削弱LPS导致表达上调趋势;在TNF-a的表达上,a-细辛醚、 P-细辛醚在实验浓度下均不能削弱LPS导致表达上调趋势。我们发现,在基于肠道炎症模 型中的肠道炎症因子表达水平调控模型的来源于石菖蒲中单体层次的筛选上,a-细辛醚、 细辛醚均不能削弱LPS刺激后RAW264.7中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA表 达水平上调的趋势。提示石菖蒲中的物质可能不是开心散中具有调控肠道炎症的有效物质

4-1-1-6基于RAW264.7细胞系的石菖蒲中单体的筛选结果
Figure 4-1-1 -6 Screening results of monomers in Acorus tatarinowii based on RAW264.7 cell line

3.2.7基于RAW264.7细胞系的来源于茯苓中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对肠道炎症的干预作用最强的单体,我们模拟肠道炎症环 境,选择RAW264.7细胞株,利用LPS进行刺激,本组选用了来源于茯苓中的三个单体成 分茯苳酸(Pachymicacid)、去氢茯苳酸(Dehydropachymicacid)、猪苳酸 C (Polyporenic acid C),考察茯苓中的单体成分对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述茯苓中单体成分按将不同浓度(2、6、20 hM)加至RAW264.7细胞。 采用qPCR法考察RAW264.7中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平。如图 4-M-7A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,RAW264.7 细胞中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-1-1-7B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0,05)。 上述部分单体具有明显削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-1J3表达上,茯苓酸 的效用优于去氢茯苓酸和猪苓酸C,其中以茯苓酸(20 jxM)的效用最强(与LPS组相比, P<0.01);在IL-6表达上,茯苓酸的效用优于去氢茯苓酸和猪苓酸C,其中以茯苓酸(6 pM) 的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在TNF-a的表达上,茯苓酸的效用优于去氢茯苓 酸和猪苓酸C,其中以茯苓酸(20pM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现, 在基于肠道炎症模型中的肠道炎症因子表达水平调控模型的来源于茯苓中单体层次的筛 选上,茯苓酸能削弱LPS刺激后RAW264.7中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-ot的mRNA表 达水平上调的趋势。提示茯苓中的物质可能是开心散中具有调控肠道炎症的有效物质。

图4-1-1-7基于RAW264.7细胞系的茯苓中单体的筛选结果
Figure 4-1-1-7 Screening results of monomers in Poria Cocos based on RAW264.7 cell line

二、基于肠道屏障炎性损伤保护调控的开心散功效物质细胞学研究

本部分实验的目的筛选出基于肠道炎症模型中肠道屏障炎性损伤保护的开心散中抗抑 郁的功效物质。因此我们建立小鼠结肠上皮隐窝细胞(IEC-6)细胞模型,加以药物作用, 采用qPCR法检测Occludin、ZO-l的mRNA水平的表达。之后采用LPS进行损伤该细胞, 再加以药物作用,采用qPCR法检测Occludin、Z0_1的mRNA水平的表达。结果发现从 全方、成分到单体的不同层面有不同程度的基于肠道屏障炎性损伤保护调控的活性,其中 在单体层面上,作用趋势最强的前三个单体为人参皂苷Rgl、人参皂苷Rh、茯苓酸。我们 得出了以下结论人参和茯苓中的成分为基于肠道屏障炎性损伤保护的最有效的成分。

!.仪器和实验材料 1.1仪器

二氧化碳培养箱(Thermo3100,美国Thermo公司),生物安全柜(1300seriesA2,美国 Thermo公司),超速台式冷冻离心机(Microfuge22RCentrifUge,BECKMAN公司),倒置 显微镜(TE-2000, Nicon公司),超微量紫外/可见分光光度计(DENOVIXDS-11,美国), 荧光实时定量PCR仪(ABScience7500,美国),电子天平(BT125型,赛多利斯科学仪器 有限公司),超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司),酶标仪(Perkin Elmer)等。 1.2细胞系

IEC-6,购自ATCC,存于本实验室液氮保存罐中D 1.3试药和试剂 1.3.1试药

全方层面:制备D-652、K-984、K-1640的冻干粉,溶解后作为全方的试药。

成分层面:人参总皂苷、远志总皂苷、石菖蒲总挥发油、茯苓多糖(纯度均大于80%)

购自南京源叶公司。

单体层面:人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、人参皂苷Re、远志口山酮III、3,6-二酰基 蔗糖酯、a-细辛醚、P-细辛醚、茯苓酸、去氢茯苓酸、猪苓酸C购自四川维克奇公司。 1.3.2试剂

H-DMEM、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、青霉素/链霉素(P/S)购自Gibco公司, 异丙醇(分析级)、三氯甲烷(分析纯)、无水乙醇(分析纯)均购自国药上海公司,逆转 录试剂盒、qPCR检测试剂盒均购自Transgen公司,其他未特别注明的试剂,均购自sigma- aldrich公司。细胞培养所用的耗材均有Coming公司提供。

  1. 实验方法 1细胞培养方案

圧<:-6细胞的培养基}1-〇1^以(89%)^85(10%),?/8(1%)。此外需添加浓度为10阳/1111 的胰岛素。细胞复苏于60mm的培养皿中,待细胞密度达到80%,吹打传代,每隔48h更 换一次培养基,每四天进行一次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后,将细胞以1.0 xlO4 个/cm2的密度种于6孔细胞培养板,培养体积为2ml,给药3h前,需要将培养基换为新鲜 培养基。

2.3细胞给药方案的设计

各药物用DMSO溶解成实验最高浓度1000倍的母液,作用48hLPSH-DMEM溶 解成lmg/ml的母液,与药物共同作用。

  • qPCR法检测相关mRNA的表达水平

细胞末次给药24h后,抽去细胞培养液,PBS清洗三遍,抽干,放置于-80CC过夜,按 照Trizol试剂盒说明书所列步骤,提取细胞总RNA,测定含量和纯度后,取满足TransGen cDNA制备试剂盒要求的RNA样本,制备cDNA,制备后测定含量和纯度,按照TransGen qTOP Mix试剂盒的实验步骤,进行qPCR实验。qPCR反应程序参考TransGen qTOP Mix 试剂盒的说明。确认相关指标的转录水平。实验用引物表见表4-1-2-1。

  1. 实验结果

为了评价开心散各物质对肠道炎症的干预作用,筛选出开心散中具有对抗肠道屏障炎 性损伤的物质,我们模拟炎性损伤肠道屏障功能的环节,因此选择IEC-6细胞。这是基于 IEC-6作为肠上皮细胞的一类,具有构成肠道屏障的功能,同时动物实验证明,肠道炎症 对肠道屏障功能造成损伤是肠道炎症过程与抑郁症相关的环节。因此,我们釆用LPSIEC-6细胞进行损伤,在LPS作用的同时,加入全方、成分、单体三个层次的药物。首先, 我们需要考察适宜实验条件下的LPS作用浓度。之后,药物与LPS (10jig/ml)共作用细 胞48h后,釆用qPCR法考察IEC-6中肠道屏障蛋白OccludinZO-1的mRNA水平表达。 我们发现,各种药物在没有LPS (10pg/ml)损伤IEC-6的条件下,部分药物能够轻度上调 但不会显著改变肠道屏障蛋白的表达。经过系列筛选,我们在全方层次筛选出基于肠道炎 症体外细胞模型削弱LPS (10 pg/ml)损伤致IEC-6中肠道屏障蛋白下调趋势最强的比例 是D-652和K-1640;在部位层次筛选出基于肠道炎症体外细胞模型中下调LPS (lpg/ml) 损伤致EC-6中肠道屏障蛋白过量表达趋势最强的成分是茯苓多糖(POPolysaccharide)和 人参总皂苷(GR Saponin);在单体层次筛选出基于肠道屏障炎性损伤保护调控细胞模型中,

上调LPS (lOjig/ml)损伤致IEC-6中肠道屏障蛋白表达下调,趋势最强的前三个化合物依 次是人参皂苷 Rgi (GinsenosideRgi)、远志 口山酮(Polygalaxanthonelll)、3,6’•二酰基蔗 糖酯(3,6’ -Disinapoylsuerose )。

3.1适合实验条件的LPS作用于EEC-6细胞的浓度确定

为了确定适合实验条件下的LPS损伤IEC-6细胞的作用浓度,我们将不同浓度的LPS 作用于IEC-6细胞。课题组的前期研究表明,LPS合适的作用时间为48h,因此釆用48h作 为本研宄中LPS的作用时间。不同浓度的LPS作用48h后,采用qPCR法检测不用浓度 LPS作用后IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA水平表达。结果以相对于空 白组的倍数呈现图4-1-2_1为合适的LPS损伤浓度的确定。对于合适的LPS浓度的确定,我们选择的 标准是基于Occludin、Z0-1的mRNA的相对表达量,合适的LPS的浓度对这三种肠道屏 障蛋白的损伤不应过大(小于0.3倍)也不应过小(大于0.7倍),同时考虑到对于试剂、 样品的节约以及实验操作的简便。因此,我们在确定LPS损伤48h是较为合适的作用时间 的条件下,发现LPS的浓度为(lOpg/ml)(与空白组相比,P<0.01)为本实验中合适的LPS 损伤浓度。

3.2基于IEC-6细胞的开心散全方层次筛选结果

为了评价开心散各配伍比例对肠道炎症的干预作用,我们模拟炎性损伤肠道屏障功能 的环节,选择IEC-6细胞,利用LPS进行损伤,加以开心散各配伍比例D-652、K-984和 K-1640,考察开心散各配伍比例对该细胞中肠道屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述开心散各配伍比例按将不同浓度(1、3、10pg/ml)加至IEC-6细胞。 采用qPCR法考察IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA表达水平。如图4-1-2- 2A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,IEC-6细胞中腸 道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS损伤后,如图4-1-2-2A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述各配伍比例均可以削弱LPS导致的肠道屏障蛋白表达下调趋势。在Ocdudin表达上, D-652、K-1640 的效用优于 K-984,其中以 D-652 (10gg/ml)与 K-1640 (10gg/ml)的效 用最强(与LPS组相比,P<0.01);在ZO-1表达上,D_652、K_1640的效用优于K-984, 其中以 D-652 (10[ig/ml)与 K-1640 (10pg/ml)的效用最强(与 LPS 组相比,P<0.01)。 我们发现,在基于肠道炎症模型中的肠道屏障炎性损伤保护调控模型的开心散全方层次的 筛选上,D-652和K-1640具有最强的上调LPS损伤后IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、 ZO-1的mRNA表达水平下调的趋势。提示D-652和K-1640是具有调控肠道屏障炎性损 伤保护的开心散最优配伍比

3.3基于IEC-6细胞的开心散部位层次筛选结果

为了评价开心散部位对肠道炎症的干预作用,我们模拟炎性损伤肠道屏障功能的环节, 选择IEC-6细胞,利用LPS进行损伤,加以开心散部位人参总皂苷(GRSaponin),远志总 皇苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils)、茯苓多糖(PO Polysaccharide)。 考察开心散部位对该细胞中肠道屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述开心散部位按将不同浓度(1、3、加至IEC-6细胞。釆用 qPCR法考察IEC-6中肠道屏障蛋白OccludinZO-1的mRNA表达水平。如图4-1-2-3A所 示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,IEC-6细胞中肠道屏障 蛋白OccludinZO-1的mRNA的表达水平未见显著变化。

LPS损伤后,如图4-1-2-3B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示LPS 显著上调肠道屏障蛋白OccludinZ0-1的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述有效部位均可以削弱LPS导致的肠道屏障蛋白表达下调趋势。在Ocdudin表达上,人 参总皂苷与茯苓多糖效用优于远志总皂苷与石菖蒲挥发油,其中以人参总皂苷(10 gg/ml)、 茯苓多糖(lOpg/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在ZO-1表达上,人参总皂 苷与茯苓多糖效用优于远志总皂苷与石菖蒲挥发油,其中以人参总皂苷(10 gg/ml)、茯等 多糖(lOpg/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基于肠道炎症模型 中的肠道屏障炎性损伤保护调控模型的开心散部位层次的筛选上,人参总皂苷与茯苓多糖 具有最强的上调LPS损伤后IEC-6中肠道屏障蛋白OccludinZO-1的mRNA表达水平下 调的趋势。提示人参总皂苷与茯苓多糖是具有调控肠道屏障炎性损伤保护的开心散中的有 效部位。

3.4基于IEC-6细胞的来源于人参中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对肠道炎症的干预作用最强的单体,我们模拟炎性损伤肠 道屏障功能的环节,选择IEC-6细胞,利用LPS进行损伤,本组选用了来源于人参中的三 个单体成分人参阜苷Rgi (GinsenosideRgi)、人参阜苷Rbi (GinsenosideRbi)、人参阜苷 Re (GinsenosideRe),考察人参中的单体成分对该细胞中肠道屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述人参中单体成分按将不同浓度(5、15、50 pM)加至IEC-6细胞。 釆用qPCR法考察IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA表达水平。如图4_1-2- 4A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,IEC-6细胞中肠 道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA的表达水平未见显著变化。

{■SS 名 x }<sce£t*>-o iunoluv,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述单体均可以削弱LPS导致的肠道屏障蛋白表达下调趋势。在Occludin表达上,人参皂 苷Rgi、的效用优于人参皂苷Rh、人参阜苷Re,其中以人参皂苷Rgl (50pM)、的效用 最强(与LPS组相比,P<0.01);在ZO-1表达上,人参阜苷Rgl的效用优于人参皂苷Rln、 人参皂苷Re,其中以人参皂苷Rgl (50 ^M)、的效用最强(与LPS组相比,P<0,01);我 们发现,在基于肠道炎症模型中的肠道屏障炎性损伤保护调控模型的来源于人参中单体层 次的筛选上,人参皂苷Rgi具有最强的上调LPS损伤后IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、 ZO-1的mRNA表达水平下调的趋势。提示人参皂苷Rgl是开心散中具有调控肠道屏障炎 性损伤保护的有效物质。

3.5基于IEC_6细胞的来源于远志中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对肠道炎症的干预作用最强的单体,我们模拟炎性损伤肠 道屏障功能的环节,选择EC-6细胞,利用LPS进行损伤,本组选用了来源于远志中的两 个单体成分 3, 6’-二酰基庶糖酯(3,6’-Disinapoylsucrose)、远志 口山酮 III(Polygalaxanthone III),考察远志中的单体成分对该细胞中肠道屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述远志中单体成分按将不同浓度(5、15、50 pM)加至IEC-6细胞。 釆用qPCR法考察IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA表达水平。如图4小2- 5A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,IEC-6细胞中肠 道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS损伤后,如图4-1-2-5B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA的表达水平(与空白组相比,PO.05)。 上述单体均可以削弱LPS导致的肠道屏障蛋白表达下调趋势。在Ocdudin表达上,远志口 山酮III的效用优于3, 6’-二酰基蔗糖酯,其中以远志口山酮III (50pM)的效用最强(与 LPS组相比,P<0.01);在ZO-1表达上,远志口山酮III的效用优于3, 6’■二酰基蔗糖酯, 其中以远志口山酮III (50pM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基于 肠道炎症模型中的肠道屏障炎性损伤保护调控模型的来源于远志中单体层次的筛选上,远 志口山酮III和3, 6’-二酰基蔗糖酯具有最强的上调LPS损伤后IEC-6中肠道屏障蛋白 Occludin、ZO-1的mRNA表达水平下调的趋势。提示远志口山酮III和3, 6’-二酰基蔗糖 酯是开心散中具有调控肠道屏障炎性损伤保护的有效物质。

3.6基于EC-6细胞的来源于石菖蒲中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对肠道炎症的干预作用最强的单体,我们模拟炎性损伤肠 道屏障功能的环节,选择正C-6细胞,利用LPS进行损伤,本组选用了来源于石菖蒲中的 两个单体成分a-细辛醚(a-Asarone)、P-细辛醚(p-Asarone),考察石菖蒲中的单体成分对 该细胞中肠道屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述石菖蒲中单体成分按将不同浓度(5、15、50 pM)加至IEC-6细胞。 釆用qPCR法考察IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、ZO_l的mRNA表达水平。如图4-1-2- 6A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,IEC-6细胞中肠 道屏障蛋白Occiudin、ZO-1的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS损伤后,如图4-1-2-6B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述单体均能明显削弱LPS导致的肠道屏障蛋白表达下调趋势。在Ocduditx表达上,p-细 辛醚的效用优于a-细辛醚,其中以p-细辛醚(15[iM)的效用最强(与LPS组相比,PO.05); 在ZO-1表达上,a-细辛醚的效用优于p-细辛醚,其中以a-细辛醚(15 pM)的效用最强 (与LPS组相比,P<0.05)。我们发现,在基于肠道炎症模型中的肠道屏障炎性损伤保护调 控模型的来源于石菖蒲中单体层次的筛选上,cx-细辛醚、P-细辛醚能削弱LPS损伤后IEC- 6中肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA表达水平下调的趋势。但效用不如其他药材 来源的单体。

3.7基于正C-6细胞的来源于茯苓中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对肠道炎症的干预作用最强的单体,我们模拟炎性损伤肠 道屏障功能的环节,选择EEC-6细胞,利用LPS进行损伤,本组选用了来源于茯苓中的三 个单体成分茯苳酸(Pachymic acid)、去氢茯等酸(Dehydropachymic acid)、猪等酸C (Polyporenic acid C),考察茯等中的单体成分对该细胞中肠道屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述茯苓中单体成分按将不同浓度(2、6、20 pM)加至IEC-6细胞。釆 用qPCR法考察IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA表达水平。如图4小2-7A 所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,IEC-6细胞中肠道屏 障蛋白Occludin、ZCM的mRNA的表达水平未见显著变化。

LPS损伤后,如图4-1-2-7B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示LPS 显著上调肠道屏障蛋白OccludinZO-1的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述单体均不具有明显削弱LPS导致的肠道屏障蛋白表达下调趋势。在Occludin表达上, 茯苓酸、去氢茯苓酸和猪苳酸C均不具有明显削弱LPS导致的肠道屏障蛋白表达下调趋 势;在ZO_l表达上,茯苓酸、去氢茯苓酸和猪苓酸C均不具有明显削弱LPS导致的肠道 屏障蛋白表达下调趋势。我们发现,在基于肠道炎症模型中的肠道屏障炎性损伤保护调控 模型的来源于茯苓中单体层次的筛选上,茯苓酸、去氢茯苓酸和猪苓酸C不能削弱LPS损 伤后IEC-6中肠道屏障蛋白Occludin、ZO-1的mRNA表达水平下调的趋势。提示茯苓中 的物质可能不是开心散中具有调控肠道屏障炎性损伤保护的有效物质。

  1. 结果与讨论

采用体外实验筛选出中药复方的功效物质是在该领域研究中的一项十分常见的做法。 基于前期动物实验的结果,我们发现开心散抗抑郁的作用机制可能与肠道微生态-压力应 激-中枢神经炎症系统有关。正是基于此,我们采取了相应的细胞筛选。肠道微生态的紊 乱,有害菌引起的肠道炎症是我们在动物实验中发现的一个重要病理环节。因此,我们 选用了 RAW264.7细胞。RAW264.7是小鼠巨噬细胞,受到促炎物质的激活后,就会开始 炎症因子的合成,因此采用该细胞考察开心散各成分能否对抗炎症因子的合成。在实验 中,我们发现人参和茯苓中的成分,尤其是人参皂苷类成分在此系统上有较强的作用趋 势,此外,茯苓多糖也表现出了较强的作用趋势。这与文献中对它们能够调控免疫的研 宄的结论是互相支持的。

之所以选用RAW264.7细胞,更重要的一个原因是该细胞存在于小鼠的肠道中,作为 巨噬细胞介导免疫反应。外来促炎物质会使其分泌炎症因子,在肠道中过量的炎症因子 表达就会引起肠道炎症。在实验中我们发现人参皂苷Rgi、人参皂苷Rh、茯苓酸是基于 该环节作用最强的三个单体成分,这与他们调节免疫的功能有关。

采用体外实验筛选出中药复方的功效物质是在该领域研宄中的一项十分常见的做法。 基于前期动物实验的结果,我们发现开心散抗抑郁的作用机制可能与肠道微生态-压力应 激-中枢神经炎症系统有关。正是基于此,我们釆取了相应的细胞筛选。肠道微生态的紊 乱,有害菌引起的肠道屏障的炎性损伤损伤是我们在动物实验中发现的一个重要病理环 节。因此,我们釆用了 IEC_6考察开心散各种成分能否修复肠道屏障的原因是,^06是 一种上皮细胞,这种细胞可以表达构成肠道屏障的关键蛋白。过量的炎症因子会对肠道 屏障功能造成损伤,肠道屏障的损伤也是肠道炎症的一个表现,而且肠道屏障的功能是 否正常,直接关系到炎症因子能否从消化道入血,进而引起中枢或其他炎症反应。

我们在实验中发现,人参皂苷Rgl、远志口山酮和3, 6’-二酰基蔗糖酯是基于本模型 中效用最强的单体。后两个单体来自远志,说明远志中的物质很有可能的作用机制是基 于肠道屏障功能的调控。

第二节基于中枢神经炎症系统的开心散抗抑郁功效物质的筛选

一、基于中枢炎症因子表达调控的开心散功效物质细胞学研究

本部分实验的目的是筛选出基于中枢炎症因子表达水平调控的开心散中抗抑郁功效物 质。因此我们建立小鼠小胶质永生化细胞(BV2)模型,加以药物作用,釆用qPCR法检 测L-lp、IL-6、TNF-a的mRNA水平的表达。釆用LPS刺激该细胞并加以药物作用,釆 用qPCR法检测IL-1|3、IL-6、TNF-a的mRNA水平的表达。结果发现从全方、成分到单 体的不同层面有不同程度的基于中枢炎症因子的表达水平调控的活性,其中在单体层面上, 作用趋势最强的前三个单体为远志口山酮III、人参皂苷Rgl、a-细辛醚。我们的得到的结 论是,远志、人参和石菖蒲中的成分为开心散基于中枢炎症因子表达水平调控的最有效的 成分。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

二氧化碳培养箱(Thermo 3100,美国Thermo公司),生物安全柜(1300 series A2, 美国Thermo公司),超速台式冷冻离心机(Microfuge 22R Centrifuge,BECKMAN公 司),倒置显微镜(TE-2000, Nicon公司),超微量紫外/可见分光光度计(DENOVIXDS- 11,美国),荧光实时定量PCR仪(ABScience7500,美国),电子天平(BT125型,赛 多利斯科学仪器有限公司),超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司),酶标仪 (PerkinElmer)等 1.2细胞

BV2,购自ATCC,存于本实验室液氮保存罐中。

1.3试药与试剂 1.3.1试药

全方层面:制备D-652、K-984、K-1640的冻干粉,溶解后作为全方的试药。

成分层面:人参总皂苷、远志总皂苷、石菖蒲总挥发油、茯苓多糖(纯度均大于80%) 购自南京源叶公司。

单体层面•.人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgi、人参皂苷Re、远志口山酮III、3,6-二酰基蔗 糖酯、ex-细辛醚、P-细辛醚、茯苓酸、去氢茯苓酸、猪苓酸C购自四川维克奇公司。

1.3_2试剂

H-DMEM、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、青霉素/链霉素(P/S)购自Gibco公司, 异丙醇(分析级)、三氯甲烷(分析纯)、无水乙醇(分析纯)均购自国药上海公司,逆转 录试剂盒、qPCR检测试剂盒均购自Transgen公司,其他未特别注明的试剂,均购自sigma- aldrich公司。细胞培养所用的耗材均有Coming公司提供。

  1. 实验方法

2.1细胞培养方案

 

BV2 细胞的培养基 MEM (88°/〇), FBS (10°/〇),P/S (1%),丙酮酸钠(100X,1°/〇)。 细胞复苏于60mm的培养皿中,待细胞密度达到80%,吹打传代,每隔48h更换一次培养 基,每四天进行一次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后,将细胞以1.0 xlO4个/cm2的 密度种于6孔细胞培养板,培养体积为2ml,给药3h前,需要将培养基换为新鲜培养基。 2.2细胞给药方案的设计

各药物用DMSO溶解成实验最高浓度1000倍的母液,作用48h

LPSH-DMEM溶解成lmg/ml的母液,与药物共同作用。

2.3 qPCR法检测相关mRNA的表达水平

细胞末次给药24h后,抽去细胞培养液,PBS清洗三遍,抽干,放置于-80°C过夜,按 照Trizol试剂盒说明书所列步骤,提取细胞总RNA,测定含量和纯度后,取满足TmnsGen cDNA制备试剂盒要求的RNA样本,制备cDNA,制备后测定含量和纯度,按照TransGen qTOPMix试剂盒的实验步骤,进行qPCR实验,确认相关指标的转录水平。引物表见4-3-

Mo

表实验用引物表

  1. 实验结果

为了评价开心散各成分对中枢神经炎症的干预作用,筛选出具有中枢神经炎症因子调 控作用的开心散功效物质,我们模拟中枢神经炎症环境,选择BV2细胞株。这是基于BV2 作为小胶质细胞,可以对外源性的促炎物质产生应答从而分泌炎症因子。因此,我们釆用 LPS对BV2细胞进行刺激,在LPS作用的同时,加入全方、成分、单体三个层次的药物。 首先,我们需要考察适宜实验条件下的LPS作用浓度。之后,药物与LPS (lgg/ml)共作 用细胞48h后,釆用qPCR法考察BV2中炎症因子IL-1(3、IL-6、TNF-a的mRNA水平表 达。我们发现,各种药物在没有LPS (l|xg/ml)刺激BV2的条件下,不会显著改变炎症因 子的表达。经过系列筛选,我们在全方层次筛选出基于中枢神经炎症体外细胞模型下调LPS (1 pg/ml)刺激致BV2中炎症因子过量表达作用趋势最强的比例是D-652;在部位层次筛 选出基于中枢神经炎症体外细胞模型中下调LPS (1 pg/ml)刺激致BV2中炎症因子过量表 达趋势最强的成分是人参总阜苷(GRSaponin)、远志总阜苷(PRSaponin);在单体层次筛 选出基于中枢神经炎症因子表达水平调控细胞模型中下调LPS (1呢/ml)刺激致BV2中炎 症因子过量表达趋势最强的前三个化合物依次是远志口山酮III (Polygalaxanthonelll)、人 参阜苷 Rgi (GinsenosideRgi)、a•细辛醚(a-Asarone)。

3.1适合实验条件的LPS作用于BV2细胞的浓度确定

为了确定适合实验条件下的LPS刺激BV2细胞的作用浓度,我们将不同浓度的LPS 作用于BV2细胞。课题组的前期研究表明,LPS合适的作用时间为48h,因此釆用48h作 为本研究中LPS的作用时间。不同浓度的LPS作用48h后,采用qPCR法检测不用浓度 LPS作用后BV2中炎症因子IL-lp、IL_6、TNF-a的mRNA水平表达。结果以相对于空白

组的倍数呈现。

图4-2-1-1为合适的LPS刺激浓度的确定。对于合适的LPS浓度的确定,我们选择的 标准是基于IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的相对表达量,合适的LPS的浓度对这三种炎 症因子的增长不应太高(大于10倍)也不应过低(小于2倍),同时考虑到对于试剂、样 品的节约以及实验操作的简便。因ik,我们在确定LPS刺激48h是较为合适的作用时间的 条件下,发现LPS的浓度为(1 jig/ml)(与空白组相比,P<0.01)为本实验中合适的LPS 刺激浓度。

0.1 0,3 1.0 3.0 10.0

LPS (fig/mi)

图4-2-1-1基于BV2细胞系的LPS作用浓度的确定
Figure 4-2-1-1 Determination of LPS concentration based on BV2 cell line

3.2基于BV2细胞系的开心散全方层次筛选结果

为了评价开心散各配伍比例对中枢神经炎症的干预作用,我们模拟中枢神经炎症环境, 选择BV2细胞株,利用LPS进行刺激,加以开心散各配伍比例D-652、K-984和K-1640, 考察开心散各配伍比例对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述开心散各配伍比例按将不同浓度(1、3、10pg/ml)加至BV2细胞。 采用qPCR法考察BV2中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平。如图4-2-1- 2A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,BV2细胞中炎症 因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-2-1-2A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述各配伍比例均可以削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL_ip表达上,D-652 的效用优于K-984和K-1640,其中以D-652 (10呢/ml)的效用最强(与LPS组相比, P<0.01);在 IL-6 表达上,D-652 的效用优于 K-984 和 K-1640,其中以 D-652 ClOpg/ml) 的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在TNF-a表达上,D-652的效用优于K-984和K- 1640,其中以D-652 (10呢/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基 于中枢神经炎症模型中的中枢神经炎症因子表达水平调控模型的开心散全方层次的筛选 上,D-652具有最强的下调LPS刺激后BV2中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA表 达水平上调的趋势。提示D-652是具有调控中枢神经炎症的开心散最优配伍比例。

4-2-1-2基于BV2细胞系的全方层次的筛选结果 Figure 4-2-1-2: Screening results at formulae levels based on BV2 cell line

3.3基于BV2细胞系的开心散部位层次筛选结果

为了评价开心散部位对中枢神经炎症的干预作用,我们模拟中枢神经炎症环境,选择 BV2细胞株,利用LPS进行刺激,加以开心散部位人参总皂苷(GR Saponin),远志总皂 苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils)、茯苳多糖(PO Polysaccharide)。考 察开心散部位对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述开心散部位按将不同浓度(1、3、10 pg/ml)加至BV2细胞。釆用 qPCR法考察BV2中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-ol的mRNA表达水平。如图4-2-1-3A所 示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示I给药48小时后,BV2细胞中炎症因子 IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-2-1-3B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述有效部位均可以削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-lp表达上,人参总皂 苷与远志总皂苷效用优于石菖蒲挥发油与茯苓多糖,其中以人参总皂苷(10gg/ml)与远志 总皂苷(lOpg/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在IL-6表达上,人参总皂苷与 远志总皂苷效用优于石菖蒲挥发油与茯苓多糖,其中以人参总皂苷(10 pg/ml)与远志总皂 苷(10|ig/ml)的效用最强(与LPS组相比,PO.01);在TNF-a表达上,人参总皂苷的效 用优于远志总皂苷、石菖蒲挥发油和茯苓多糖,其中以人参总皂苷(10pg/ml)的效用最强 (与LPS组相比,PO.01L

我们发现,在基于中枢神经炎症模型中的中枢神经炎症因子表达水平调控模型的开心 散部位层次的筛选上,人参总皂苷和茯苓多糖具有最强的下调LPS刺激后BV2中炎症因 子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平上调的趋势。提示人参总皂苷和茯苓多糖是具 有调控中枢神经炎症的开心散中的有效部位基于BV2细胞系的药材有效部位层次的筛选结果
Figure 4-2-1-3 Screening results based on jfractions of BV2 cell line

3.4基于BV2细胞系的来源于人参中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢神经炎症的干预作用最强的单体,我们模拟中枢神 经炎症环境,选择BV2细胞株,利用LPS进行刺激,本组选用了来源于人参中的三个单 体成分人参阜苷Rgi (GinsenosideRgi)、人参阜苷Rbi (GinsenosideRbi)、人参阜昔Re (GinsenosideRe),考察人参中的单体成分对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述人参中单体成分按将不同浓度(5、15、50 gM)加至BV2细胞。采 用qPCR法考察BV2中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平。如图4-2-1-4A 所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,BV2细胞中炎症因 子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-2-1-4B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述单体均可以削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-lp表达上,人参皂苷Rgl、 人参皂苷Re的效用优于人参皂苷Rh,其中以人参皂苷Rgl (50 pM)、人参皂苷Re (50 pM)的效用最强(与LPS组相比,PO.01);在IL-6表达上,人参皂苷Rgl、的效用优于 人参皂苷Rb!和人参皂苷Re,其中以人参皂苷Rgl (50pM)的效用最强(与LPS组相比, P<0.01);在TNF-a表达上,人参皂苷Rgl、人参皂苷Re的效用优于人参皂苷Rh,其中 以人参皂苷Rgi (50pM)、人参皂苷Re (50|nM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。 我们发现,在基于中枢神经炎症模型中的中枢神经炎症因子表达水平调控模型的来源于人 参中单体层次的筛选上,人参皂苷Rgi和人参皂苷Re具有最强的下调LPS刺激后BV2中 炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平上调的趋势。提示人参皂苷Rgi和人参 皂苷Re是开心散中具有调控中枢神经炎症的有效物质。

(lrasecox)<zaE*4-o-McnouJ

3.5基于BV2细胞系的来源于远志中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢神经炎症的干预作用最强的单体,我们模拟中枢神 经炎症环境,选择BV2细胞株,利用LPS进行刺激,本组选用了来源于远志中的两个单 体成分3,6’-二酰基薦糖酯(3,6’"013丨1^〇>1511(:1'(^)、远志口山酮111(?〇1>^13乂_]1〇1^111), 考察远志中的单体成分对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述远志中单体成分按将不同浓度(5、15、50pM)加至BV2细胞。采 用qPCR法考察BV2中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平。如图4-2-1-5A 所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,BV2细胞中炎症因 子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-2小5B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-ct的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述单体均可以削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-lp表达上,远志口山酮III 的效用优于3, 6’-二酰基蔗糖酯,其中以远志口山酮III (50pM)的效用最强(与LPS组 相比,P<0.01);在IL-6表达上,远志口山酮III的效用优于3, 6’-二酰基蔗糖酯,其中以 远志口山酮III (5〇txM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在TNF-a的表达上,远 志口山酮III的效用优于3, 6’-二酰基蔗糖酯,其中以远志口山酮III (50pM)的效用最强 (与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基于中枢神经炎症模型中的中枢神经炎症因子表 达水平调控模型的来源于远志中单体层次的筛选上,远志口山酮III具有最强的下调LPS 刺激后BV2中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平上调的趋势。提示远志口 山酮III是开心散中具有调控中枢神经炎症的有效物质
Figure 4-2-1-5 Screening results of monomers in Polygala tenuifolia based on BV2 cell line

3.6基于BV2细胞系的来源于石菖蒲中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢神经炎症的干预作用最强的单体,我们模拟中枢神 经炎症环境,选择BV2细胞株,利用LPS进行刺激,本组选用了来源于石菖蒲中的两个 单体成分a-细辛醚(a-Asarone)、卩-细辛醚(卩-Asarone),考察石菖蒲中的单体成分对该细 胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述石菖蒲中单体成分按将不同浓度(5、15、50 pM)加至BV2细胞。 采用qPCR法考察BV2中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平。如图4-2-1- 6A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,BV2细胞中炎症 因子IL-ip、IL-6、TNF-ot的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-2-1-6B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,PO.05L 上述部分单体能明显削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-lp表达上,a-细辛醚 的效用优于(3-细辛醚,其中以a-细辛醚(50pM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01); 在IL-6表达上,心细辛醚的效用优于p-细辛醚,其中以a•细辛醚(50 pM)的效用最强(与 LPS组相比,P<0.01);在TNF-a的表达上,a-细辛醚的效用优于p-细辛醚,其中以a-细 辛醚(50fxM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基于中枢神经炎症模 型中的中枢神经炎症因子表达水平调控模型的来源于石菖蒲中单体层次的筛选上,a-细辛 醚能削弱LPS刺激后BV2中炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平上调的趋 势。提示a-细辛醚可能是开心散中具有调控中枢神经炎症的有效物质。

3.7基于BV2细胞系的来源于茯苓中单体筛选结果

为了评价幵心散单体层次中对中枢神经炎症的干预作用最强的单体,我们模拟中枢神 经炎症环境,选择BV2细胞株,利用LPS进行刺激,本组选用了来源于茯苓中的三个单 体成分获苳酸(Pachymicacid)、去氧茯苳酸(Dehydropachymicacid)、猪等酸 C(Polyporenic acid C),考察茯苳中的单体成分对该细胞中炎症因子表达的影响。

首先,我们将上述茯苓中单体成分按将不同浓度(2、6、20 pM)加至BV2细胞。采 用qPCR法考察BV2中炎症因子IL-ip、IL-6、TNF-a的mRNA表达水平。如图4-2-1-7A 所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,BV2细胞中炎症因 子IL-ip、IL-6、TNF-cx的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS刺激后,如图4-2-1-7B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调炎症因子IL-lp、IL-6、TNF-a的mRNA的表达水平(与空白组相比,P<0.05)。 上述部分单体具有明显削弱LPS导致的炎症因子表达上调趋势。在IL-1(3表达上,茯苓酸 的效用优于去氢茯苓酸和猪苓酸C,其中以茯苓酸(20 fiM)的效用最强(与LPS组相比, P<0.05);在IL-6表达上,茯苓酸的效用优于去氢茯苓酸和猪苓酸C,其中以茯苓酸(6pM) 的效用最强(与LPS组相比,P<0.05);在TNF-a的表达上,茯苓酸的效用优于去氢茯苓 酸和猪苓酸C,其中以茯苓酸(6gM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.05)。我们发现, 在基于中枢神经炎症模型中的中枢神经炎症因子表达水平调控模型的来源于茯苓中单体 层次的筛选上,茯苓酸能削弱LPS刺激后BV2中炎症因子IL-lp、IL_6、TNF-a的mRNA 表达水平上调的趋势。提示茯苓酸可能是开心散中具有调控中枢神经炎症的有效物质。

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4-2-1-7基于BV2细胞系的茯苓中单体的筛选结果
Figure 4-2-1-7 Screening results of monomers in Poria Cocos based on BV2 cell line

二、基于血脑屏障炎性损伤保护的开心散功效物质细胞学研究

本部分实验的目的是筛选出基于血脑屏障炎性保护的开心散中抗抑郁功效物质。因此 我们建立小鼠原代皮层星形胶质细胞(MCAST)模型,加以药物作用,采用qPCR法检测 Occludin、ZO-1、claudin-5的mRNA水平的表达。之后采用LPS进行损伤该细胞,再加以 药物作用,采用qPCR法检测Occludin、ZO-1、claudin-5的mRNA水平的表达。结果发现 从全方、成分到单体的不同层面有不同程度的基于中枢炎症因子的表达水平调控的活性, 其中在单体层面上,作用趋势最强的前三个单体为a-细辛醚、人参皂苷Rgl、3, 6-二酰基 蔗糖酯。我们的得到的结论是,石菖蒲、远志和人参中的成分为开心散基于基于血脑屏障 炎性保护的最有效的成分。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

二氧化碳培养箱(Thermo3100,美国Thermo公司),生物安全柜(1300 seriesA2, 美国Thermo公司),超速台式冷冻离心机(Microfuge 22R Centriflige,BECKMAN公 司),倒置显微镜(TE-2000, Nicon公司),超微量紫外/可见分光光度计(DENOVIXDS- 11,美国),荧光实时定量PCR仪(ABScience7500,美国),电子天平(BT125型,赛 多利斯科学仪器有限公司),超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司),酶标仪 (PerkinElmer)等 1.2细胞

MCAST,为自行原代取材,原代取材所用的动物购自南京大学模式生物研宄中心, 动物合格证号SWXK-1221 1.3试药与试剂 1.3.1试药

全方层面:制备D-652、K-984、K-1640的冻干粉,溶解后作为全方的试药。

成分层面:人参总皂苷、远志总皂苷、石菖蒲总挥发油、茯苓多糖(纯度均大于80%) 购自南京源叶公司。

单体层面:人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、人参皂苷Re、远志口山酮III、3,6-二酰基蔗 糖酯、a-细辛醚、…细辛醚、茯苓酸、去氢茯苓酸、猪苓酸C购自四川维克奇公司。

1.3.2试剂

H-DMEM、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、青霉素/链霉素(P/S)购自Gibco公司, 异丙醇(分析级)、三氯甲烷(分析纯)、无水乙醇(分析纯)均购自国药上海公司,逆转 录试剂盒、qPCR检测试剂盒均购自Transgen公司,其他未特别注明的试剂,均购自sigma- aldrich公司。细胞培养所用的耗材均有Coming公司提供。

  1. 实验方法

2.1细胞培养方案

小鼠原代皮层星形胶质细胞(MCAST)的培养基为,DMEM/F12(89%),FBS(10%),

P/S (1%)。原代培养过程如下:取出生一天的小鼠,冰上取脑,置于HBSS中,显微镜下 分离大脑皮层,将分离的大脑皮层收集,用0.25%的胰蛋白酶37°C消化20min,吹散均匀 后,800rpm/min,4°C,4min,离心弃去上清,下层组织吹散后过尼龙膜,用MCAST的完 全培养基重悬,细胞密度为500个/叫。48h后换液。细胞密度到达90%时,0.25%TE消化 传代种板。待细胞密度达到70%时,加入相应药物,培养48小时。

2.2细胞给药方案的设计

各药物用DMSO溶解成实验最高浓度1000倍的母液,作用48h

LPSH-DMEM溶解成lmg/ml的母液,与药物共同作用。

2.3 qPCR法检测相关mRNA的表达水平

细胞末次给药24h后,抽去细胞培养液,PBS清洗三遍,抽干,放置于-80T过夜,按 照Trizd试剂盒说明书所列步骤,提取细胞总RNA,测定含量和纯度后,取满足TransGen cDNA制备试剂盒要求的RNA样本,制备cDNA,制备后测定含量和纯度,按照TransGen qTOP Mix试剂盒的实验步骤,进行qPCR实验,确认相关指标的转录水平。

引物表和qPCR反应程序与第三章第一节中所列相同。

3.实验结果

为了评价幵心散各物质对中枢神经炎症的干预作用,筛选出具有对抗血脑屏障炎性损 伤的开心散功效物质,我们模拟炎性损伤血脑屏障功能的环节,因此选择MCAST细胞。 这是基于MCAST作为星形胶质细胞,具有构成血脑屏障的功能,同时动物实验证明,中 枢神经炎症对血脑屏障功能造成损伤是中枢神经炎症过程与抑郁症相关的环节。因此,我 们采用LPS对MCAST细胞进行损伤,在LPS作用的同时,加入全方、成分、单体三个层 次的药物。首先,我们需要考察适宜实验条件下的LPS作用浓度。之后,药物与LPS (10 叩/ml)共作用细胞48h后,采用qPCR法考察MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、 Claudin-5的mRNA水平表达。我们发现,各种药物在没有LPS (10pg/ml)损伤MCAST 的条件下,部分药物能够轻度上调但不会显著改变血脑屏障蛋白的表达。经过系列筛选, 我们在全方层次筛选出基于中枢神经炎症体外细胞模型削弱LPS (10 pg/ml)损伤致 MCAST中血脑屏障蛋白下调趋势最强的比例是D-652和K-984;在部位层次筛选出基于 中枢神经炎症体外细胞模型中下调LPS (lpg/ml)损伤致MCAST中血脑屏障蛋白过量表 达趋势最强的成分是石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils)、人参总皂苷(GRSaponin);在单 体层次筛选出基于血脑屏障炎性损伤保护调控细胞模型中,上调LPS (10 pg/ml)损伤致 MCAST中血脑屏障蛋白表达下调趋势,最强的前三个化合物依次是ot-细辛醚(a-Asarone)、 人参阜苷 Rgi (GinsenosideRgi)、3, 6’-二酰基鹿糖醋(3,6’-Disinapoylsucrose)。

 

3.1适合实验条件的LPS作用于MCAST细胞的浓度确定

为了确定适合实验条件下的LPS损伤MCAST细胞的作用浓度,我们将不同浓度的 LPS作用于MCAST细胞。课题组的前期研究表明,LPS合适的作用时间为48h,因此釆 用48h作为本研究中LPS的作用时间。不同浓度的LPS作用48h后,釆用qPCR法检测不 用浓度LPS作用后MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA水平表

达。结果以相对于空白组的倍数呈现。

图4-2-2-1为合适的LPS损伤浓度的确定。对于合适的LPS浓度的确定,我们选择的 标准是基于Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的相对表达量,合适的LPS的浓度对这 三种血脑屏障蛋白的损伤不应过大(小于0.3倍)也不应过小(大于0.7倍),同时考虑到 对于试剂、样品的节约以及实验操作的简便。因此,我们在确定LPS损伤48h是较为合适 的作用时间的条件下,发现LPS的浓度为(lOpg/ml)(与空白组相比,P<0.01)为本实验 中合适的LPS损伤浓度。

图4-2-2-1基于MCAST细胞系的LPS作用浓度的确定 Figure 4-2-2-1 Determination of LPS concentration based on MCAST

3.2基于MCAST细胞的开心散全方层次筛选结果

为了评价开心散各配伍比例对中枢神经炎症的干预作用,我们模拟炎性损伤血脑屏障 功能的环节,选择MCAST细胞,利用LPS进行损伤,加以开心散各配伍比例D-652、K- 984和K-1640,考察开心散各配伍比例对该细胞中血脑屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述开心散各配伍比例按将不同浓度(1、3、10|ng/ml)加至MCAST细 胞。采用qPCR法考察MCAST中血脑屏障蛋白Qccludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA表 达水平。如图4-2-2-2A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时 后,MCAST细胞中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平未见显 著变化。

以LPS损伤后,如图4-2-2-2A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调血脑屏障蛋白Occludin、Z0-1、Claudin-5的mRNA的表达水平(与空白组相比, P<0.05)。上述各配伍比例均可以削弱LPS导致的血脑屏障蛋白表达下调趋势。在Occludin 表达上,D-652、K-984 的效用优于 K-1640,其中以 D-652(10pg/ml)与 K-984(10|ig/ml) 的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在Z0-1表达上,D-652、K-984的效用优于K- 1640,其中以 D-652 (10 pg/ml)与 K-984 (10 pg/ml)的效用最强(与 LPS 组相比,P<0.01); 在 Claudin-5 表达上,D-652、K-984 的效用优于 K-1640,其中以 D-652 (10 pg/ml)与 K- 984 (10吗/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基于中枢神经炎症模 型中的血脑屏障炎性损伤保护调控模型的开心散全方层次的筛选上,D-652和K-984具有 最强的上调LPS损伤后MCAST中血脑屏障蛋白Occhidin、ZO-1、Claudin-5的mRNA表 达水平下调的趋势。提示D-652和K-984是具有调控血脑屏障炎性损伤保护的开心散最优 配伍比例图4-2-2_2基于MCAST细胞系的全方层次的筛选结果
Figure 4-2-2-2: Screening results at formulae levels based on MCAST

3.3基于MCAST细胞的开心散部位层次筛选结果

为了评价开心散部位对中枢神经炎症的干预作用,我们模拟炎性损伤血脑屏障功能的 环节,选择MCAST细胞,利用LPS进行损伤,加以开心散部位人参总皂苷(GRSaponin), 远志总阜苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils )、茯苳多糖(PO Polysaccharide)。 考察开心散部位对该细胞中血脑屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述开心散部位按将不同浓度(1、3、10 pg/ml)加至MCAST细胞。采 用qPCR法考察MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA表达水平。 如图4-2-2-3A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后,MCAST 细胞中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平未见显著变化。

以LPS损伤后,如图4-2-2-3B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平(与空白组相比, P<0.05)。上述有效部位均可以削弱LPS导致的血脑屏障蛋白表达下调趋势。在Occludin 表达上,石菖蒲挥发油与人参总皂苷效用优于远志总皂苷与茯苓多糖,其中以石菖蒲挥发 油(lOpg/ml)与人参总皂苷(lO^g/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在ZO-1 表达上,石菖蒲挥发油与人参总皂苷效用优于远志总皂苷与茯苓多糖,其中以石菖蒲挥发 油(10|ig/ml)与人参总阜苷(10pg/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在Claudin- 5表达上,石菖蒲挥发油的效用优于人参总皂苷、远志总皂苷和茯苓多糖,其中以石菖蒲 挥发油(l〇Mg/ml)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。

我们发现,在基于中枢神经炎症模型中的血脑屏障炎性损伤保护调控模型的开心散部 位层次的筛选上,石菖蒲挥发油与人参总皂苷具有最强的上调LPS损伤后MCAST中血脑 屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA表达水平下调的趋势。提示石菖蒲挥发油 与人参总皂苷是具有调控血脑屏障炎性损伤保护的开心散中的有效部位。

3.4基于MCAST细胞的来源于人参中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢神经炎症的干预作用最强的单体,我们模拟炎性损 伤血脑屏障功能的环节,选择MCAST细胞,利用LPS进行损伤,本组选用了来源于人参 中的三个单体成分人参阜苷Rgi (GinsenosideRgi)、人参阜苷Rbi (GinsenosideRbi)、人 参皂苷Re(GinsenosideRe),考察人参中的单体成分对该细胞中血脑屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述人参中单体成分按将不同浓度(5、15、50 pM)加至MCAST细胞。 釆用qPCR法考察MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA表达水 平。如图4-2-2-4A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后, MCAST细胞中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平未见显著变 化。

以LPS损伤后,如图4-2-2-4B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平(与空白组相比, P<0.05)。上述单体均可以削弱LPS导致的血脑屏障蛋白表达下调趋势。在Occludin表达 上,人参皂苷Rg!、的效用优于人参皂苷Rbi、人参皂苷Re,其中以人参皂苷Rgl(50pM)、 的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在ZO-1表达上,人参皂苷Rgl的效用优于人参皂 苷Rb!、人参皂苷Re,其中以人参皂苷Rgl (50 pM)、的效用最强(与LPS组相比,P<0.01); 在Claudin-5表达上,人参皂苷Rgi的效用优于人参皂苷Rh、人参皂苷Re,其中以人参 皂苷Rgl (50|iM)、的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基于中枢神经炎 症模型中的血脑屏障炎性损伤保护调控模型的来源于人参中单体层次的筛选上,人参皂苷 Rgi具有最强的上调LPS损伤后MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的 mRNA表达水平下调的趋势。提示人参皂苷Rgl是开心散中具有调控血脑屏障炎性损伤保 护的有效物质。

图4-2_2«4基于MCAST细胞系的人参中单体的筛选结果
Figure 4-2-2-4 Screening results of monomers in Ginseng based on MCAST

 

3.5基于MCAST细胞的来源于远志中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢神经炎症的干预作用最强的单体,我们模拟炎性损 伤血脑屏障功能的环节,选择MCAST细胞,利用LPS进行损伤,本组选用了来源于远志 中的两个单体成分3,6s•二酸基鹿糖酯(3,6’-Disinapoylsucrose)、远志口山酮III (Polygalaxanthone III),考察远志中的单体成分对该细胞中血脑屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述远志中单体成分按将不同浓度(5、15、50 pM)加至MCAST细胞。 采用qPCR法考察MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5mRNA表达水 平。如图4-2-2-5A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后, MCAST细胞中血脑屏障蛋白OccludinZO-1Claudin-5mRNA的表达水平未见显著变 化。

以LPS损伤后,如图4-2-2-5B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平(与空白组相比, P<0.05)。上述单体均可以削弱LPS导致的血脑屏障蛋白表达下调趋势。在Occludin表达 上,3, 65-二酰基蔗糖酯的效用优于远志口山酮III,其中以3, 6’-二酰基蔗糖酯(50 nM) 的效用最强(与LPS组相比,P<0.05);在ZO-1表达上,3, 6’-二酰基蔗糖酯的效用优于 远志口山酮III,其中以3, 6’-二酰基蔗糖酯(50^M)的效用最强(与LPS组相比,P<0.05); 在Claudin-5的表达上,3, 6’-二酰基蔗糖酯的效用优于远志口山酮III,其中以3, 6’-二酰 基蔗糖酯(50^M)的效用最强(与LPS组相比,P<0.05)。我们发现,在基于中枢神经炎 症模型中的血脑屏障炎性损伤保护调控模型的来源于远志中单体层次的筛选上,3, 6’-二 酰基蔗糖酯具有最强的上调LPS损伤后MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-l、Claudin- 5 的 mRNA 表达水平下调的趋势。提示 3, 6’-二酰基蔗糖酯是开心散中具有调控血脑屏障 炎性损伤保护的有效物质。

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S

4-2-2-5基于MCAST细胞系的远志中单体的筛选结果
Figure 4-2-2-S Screening results of monomers in Polygala tenuifolia based on MCAST

3.6基于MCAST细胞的来源于石菖蒲中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢神经炎症的干预作用最强的单体,我们模拟炎性损 伤血脑屏障功能的环节,选择MCAST细胞,利用LPS进行损伤,本组选用了来源于石菖 蒲中的两个单体成分a-细辛醚(a-Asarone)、p_细辛醚(卩-Asarone),考察石菖蒲中的单体 成分对该细胞中血脑屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述石菖蒲中单体成分按将不同浓度(5、15、50 pM)加至MCAST细 胞。采用qPCR法考察MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA表 达水平。如图4-2-2-6A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时 后,MCAST细胞中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平未见显

著变化。

以LPS损伤后,如图4-2-2-6B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平(与空白组相比, P<0.05)。上述单体均能明显削弱LPS导致的血脑屏障蛋白表达下调趋势。在Occludin表 达上,a-细辛醚的效用优于P-细辛醚,其中以a-细辛醚(50 pM)的效用最强(与LPS组 相比,P<0.01);在ZO-1表达上,a-细辛醚的效用优于p-细辛醚,其中以a-细辛醚(50pM) 的效用最强(与LPS组相比,P<0.01);在Claudin_5的表达上,a-细辛醚的效用优于p-细 辛醚,其中以a-细辛醚(50pM)的效用最强(与LPS组相比,P<0.01)。我们发现,在基 于中枢神经炎症模型中的血脑屏障炎性损伤保护调控模型的来源于石菖蒲中单体层次的 筛选上,a-细辛醚能削弱LPS损伤后MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5 的mRNA表达水平下调的趋势。提示a-细辛醚可能是开心散中具有调控血脑屏障炎性损 伤保护的有效物质。

4-2-2_6基于MCAST细胞系的石菖蒲中单体的筛选结果
Figure 4-2-2-6 Screening results of monomers in Acorus tatarinowii based on MCAST

 

3.7基于MCAST细胞的来源于茯苓中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢神经炎症的干预作用最强的单体,我们模拟炎性损 伤血脑屏障功能的环节,选择MCAST细胞,利用LPS进行损伤,本组选用了来源于茯苓 中的三个单体成分获苳酸(Pachymicacid)、去氢茯苳酸(Dehydropachymicacid)、猪苳酸 C (Polyporenic acid C),考察茯苓中的单体成分对该细胞中血脑屏障蛋白表达的影响。

首先,我们将上述茯苓中单体成分按将不同浓度(2、6、20 gM)加至MCAST细胞。 采用qPCR法考察MCAST中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA表达水 平。如图4-2-2-7A所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,给药48小时后, MCAST细胞中血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平未见显著变 化。

以LPS损伤后,如图4-2-2-7B所示,图中的数据结果以相对于空白组的倍数表示,LPS 显著上调血脑屏障蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5的mRNA的表达水平(与空白组相比, P<0.05)。上述单体均不具有明显削弱LPS导致的血脑屏障蛋白表达下调趋势。在Ocdudin 表达上,茯苓酸、去氢茯苓酸和猪苓酸C均不具有明显削弱LPS导致的血脑屏障蛋白表达 下调趋势;在ZO_l表达上,茯苓酸、去氢茯苓酸和猪苓酸C均不具有明显削弱LPS导致 的血脑屏障蛋白表达下调趋势;在Claudin-5的表达上,茯苓酸、去氢茯苓酸和猪苓酸C均 不具有明显削弱LPS导致的血脑屏障蛋白表达下调趋势。我们发现,在基于中枢神经炎症 模型中的血脑屏障炎性损伤保护调控模型的来源于茯苓中单体层次的筛选上,茯苓酸、去 氢茯苓酸和猪苓酸C不能削弱LPS损伤后MCAST中血脑屏障蛋白Occhidin、ZO-1、 Claudin-5的mRNA表达水平下调的趋势。提示茯苓中的物质可能不是幵心散中具有调控 血脑屏障炎性损伤保护的有效物质。

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图4-2-2-7基于MCAST细胞系的茯苓中单体的筛选结果
Figure 4-2-2-7 Screening results of monomers in Poria Cocos based on MCAST

三、基于神经元炎性损伤保护的开心散功效物质细胞学研究

本部分实验的目的是筛选出基于神经元炎性损伤保护的开心散中抗抑郁功效物质。因 此我们建立小建立小鼠海马神经元永生化细胞(HT22)模型,并用炎症因子TNF-a损伤 HT22细胞,采用MTT法检测细胞的存活率,考察各药物对于炎性损伤的保护作用。结果 发现从全方、成分到单体的不同层面有不同程度的基于中枢炎症因子的表达水平调控的活 性,其中在单体层面上,作用趋势最强的三个单体人参皂苷Rgla-细辛醚、人参皂苷Rbl。 我们的得到的结论是,人参和石菖蒲中的成分为开心散基于基于神经元炎性损伤保护的最 有效的成分。

  1. 仪器和实验材料
  2. 1仪器

二氧化碳培养箱(Thermo 3100,美国Thermo公司),生物安全柜(1300seriesA2, 美国Thermo公司),超速台式冷冻离心机(Microfuge 22R Centrifuge,BECKMAN公 司),倒置显微镜(TE-2000, Nicon公司),超微量紫外/可见分光光度计(DENOVIXDS-

  • 美国),荧光实时定量PCR仪(ABScience7500,美国),电子天平(BT125型,赛 多利斯科学仪器有限公司),超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司),酶标仪

(PerkinElmer)等 1.2细胞

HT22,购自ATCC,存于本实验室液氮保存罐中。

1.3试药与试剂 1.3.1试药

全方层面:制备D-652、K-984、K-1640的冻干粉,溶解后作为全方的试药。

成分层面:人参总皂苷、远志总皂苷、石菖蒲总挥发油、茯苓多糖(纯度均大于80%) 购自南京源叶公司。

单体层面:人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、人参皂苷Re、远志口山酮III、3,6-二酰基蔗 糖酯、a-细辛醚、P_细辛醚、茯苓酸、去氢茯苓酸、猪苓酸C购自四川维克奇公司。

1.3.2试剂

H-DMEM、月台牛血清(FBS)、马血清(HS)、青霉素/链霉素(P/S)购自Gibco公司, 异丙醇(分析级)、三氯甲烷(分析纯)、无水乙醇(分析纯)均购自国药上海公司,逆转 录试剂盒、qPCR检测试剂盒均购自Transgen公司,其他未特别注明的试剂,均购自sigma- aldrich公司。细胞培养所用的耗材均有Corning公司提供。

  1. 实验方法

2.1细胞培养方案

HT22 细胞的培养基 H-DMEM (89%),FBS (10%),P/S (1%)。细胞复苏于 60mm 的培养皿中,待细胞密度达到80%,吹打传代,每隔48h更换一次培养基,每四天进行 一次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后,将细胞以1.0 xlO4个/cm2的密度种于6孔细 胞培养板,培养体积为2ml,给药3h前,需要将培养基换为新鲜培养基。

2.2细胞给药方案的设计

各药物用DMSO溶解成实验最高浓度1000倍的母液,作用48h。

TNF-ot用H-DMEM溶解成0.1mg/ml的母液,与药物共同作用。

2.3. MTT法检测HT22细胞存活率

细胞种板于96孔板中,密度为10cdly>l。给药前需要换液,药物作用48h,给药两次。 TNF-a与药物共同作用。96孔板上A1孔不加任何试剂,再预留空白对照。给药48h后, 每孔加入终浓度为5pg/ml的MTT,放入37□培养箱中孵育3h,后吸走MTT,每孔加入 150mlDMSO,置于37]摇床上孵育30min。之后在波长为570nm处,用酶标仪测定吸光 度。分析细胞存活率 3.实验结果

为了评价开心散各成分对中枢神经炎症的干预作用,筛选出具有对抗神经元炎性损伤 作用的开心散功效物质,我们模拟神经元炎性损伤环节,选择HT22细胞株。这是基于HT22 作为小鼠海马神经元的永生化细胞,具有神经元的特征并可以被炎症因子如TNF-a损伤。 因此,我们采用TNF-a对HT22细胞进行损伤,在TNF-cx作用的同时,加入全方、成分、 单体三个层次的药物。首先,我们需要考察适宜实验条件下的TNF-ot作用浓度。之后,药 物与TNF-ot (lO^g/ml)共作用细胞48h后,采用MTT法考察HT22细胞的存活率。我们 发现,各种药物在没有TNF-a(10pg/ml)损伤HT22的条件下,不会直接引起HT22细胞 的死亡。经过系列筛选,我们在全方层次筛选出基于神经元炎性损伤模型对抗TNF-a (10 Hg/ml)损伤致HT22死亡趋势最强的比例是D-652;在部位层次筛选出基于神经元炎性损 伤模型对抗TNF-a( 10 pg/ml)损伤致HT22死亡趋势最强的成分是人参总皂苷(GR Saponin)、 石菖蒲挥发油(ATRVolatileOils);在单体层次筛选出基于神经元炎性损伤模型对抗TNF- a( 10 |ig/ml)损伤致HT22死亡趋势最强的前三个化合物依次是、人参皂苷Rgl(Ginsenoside Rgi)、a-细辛醚(a-Asarone)、人参阜苷 Rbi (GinsenosideRbi)。

 

3.1适合实验条件的TNF-ot作用于HT22细胞的浓度确定

为了确定适合实验条件下的TNF-a损伤HT22细胞的作用浓度,我们将不同浓度的 TNF-a作用于HT22细胞。课题组的前期研究表明,TNF_a合适的作用时间为48h,因此 釆用48h作为本研宄中TNF_a的作用时间。不同浓度的TNF-a作用48h后,采用MTT法 检测不用浓度TOF-a作用后HT22细胞的存活率。结果以相对于空白组的百分比呈现为合适的TNF-a损伤浓度的确定。对于合适的TNF_a浓度的确定,我们选 择的标准是基于HT22细胞的存活率,合适的TNF-a的浓度对HT22细胞的损伤不应太高 (大于50%)也不应过低(小于70%),同时考虑到对于试剂、样品的节约以及实验操作 的简便。因此,我们在确定TNF-ot损伤48h是较为合适的作用时间的条件下,发现TNF-a 的浓度为(l〇pg/ml)(与空白组相比,P<0.01)为本实验中合适的TNF-a损伤浓度,此时 HT22的存活率为65.04%。

图4-2-34基于HT22细胞系的TOF-a作用浓度的确定
Figure 4-2-3-1 Determination of TNF-a concentration based on HT22 cell line

3.2基于HT22细胞系的开心散全方层次筛选结果

为了评价开心散各配伍比例对神经元炎性损伤保护的干预作用,我们模拟神经元炎性 损伤环节,选择HT22细胞株,利用TNF-a进行损伤,加以开心散各配伍比例D-652、K- 984和K-1640,考察开心散各配伍比例对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述开心散各配伍比例按将不同浓度(0.1、0.3、1、3、10 pg/ml)加至 HT22细胞。采用MTT法考察HT22细胞的存活率。如图4-2-3-2A所示,图中的数据结果 以相对于空白组的百分比表示,给药48小时后,HT22细胞的存活率不会因为药物直接作 用而产生变化。

以TNF-(x损伤后,如图4-2-3-2B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表示, TNF-a显著降低了 HT22细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述各配伍比例均可以 对抗TNF-a造成的HT22细胞的死亡。D-652的效用优于K-984和K_1640,其中以D-652 (lOpg/ml)的效用最强(与TNF_<x组相比,P<0,01)。我们发现,在基于神经元炎性损伤 保护模型的开心散全方层次的筛选上,D-652具有最强的对抗TNF-a损伤致HT22细胞死 亡的趋势。提示D_652是具有神经元炎性损伤保护效用的开心散最优配伍比例。

A □O-lMg/ml 口0.3四加丨 _1Qpg/ml _3,0四.㈣■ICXOjjgMi!

3.3基于HT22细胞系的开心散部位层次筛选结果

为了评价开心散部位对神经元炎性损伤保护的干预作用,我们模拟神经元炎性损伤环 节,选择HT22细胞株,利用TNF-a进行损伤,加以开心散部位人参总皂苷(GRSaponin), 远志总皂苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils)、茯苓多糖(PO Polysaccharide)。 考察开心散部位对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述开心散部位按将不同浓度(0.1、0.3、1、3、10[ig/ml)加至HT22细 胞。采用MTT法考察HT22细胞的存活率。如图4-2-3_3A所示,图中的数据结果以相对 于空白组的百分比表示,给药48小时后,HT22细胞的存活率不会因为药物直接作用而产 生变化。

以TNF_ct损伤后,如图4-2-3-3B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表示, TNF-a显著降低了 HT22细胞的存活率(与空白组相比,P<a〇5)。上述有效部位均可以对 抗TNF_a造成的HT22细胞的死亡。人参总皂苷、石菖蒲挥发油的效用优于远志总皂苷和 茯苓多糖,其中以人参总皂苷(lOpg/ml)石菖蒲挥发油(3pg/ml)和的效用最强(与TNF- ct组相比,P<0.01)。我们发现,在基于神经元炎性损伤保护模型的开心散部位层次的筛选 上,人参总皂苷和石菖蒲挥发油具有最强的对抗TNF-a损伤致HT22细胞死亡的趋势。提 示人参总皂苷和石菖蒲挥发油具有神经元炎性损伤保护效用的开心散中的有效部位。

i-TNF-a

3.4基于HT22细胞系的来源于人参中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对神经元炎性损伤保护的干预作用最强的单体,我们模拟 神经元炎性损伤环节,选择HT22细胞株,利用TNF-a进行损伤,本组选用了来源于人参 中的三个单体成分人参皂苷Rgi (GinsenosideRgi)、人参阜苷Rb! (GinsenosideRbi)、人 参皂苷Re (GinsenosideRe),考察人参中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述人参中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50 pM)加至HT22 细胞。釆用MTT法考察HT22细胞的存活率。如图4-2-3-4A所示,图中的数据结果以相 对于空白组的百分比表示,给药48小时后,HT22细胞的存活率不会因为药物直接作用而 产生变化以TNF-a损伤后,如图4-2-3-4B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表示, TNF-a显著降低了 HT22细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述单体均可以对抗 TNFw造成的HT22细胞的死亡。人参皂苷Rgl、人参皂苷Rh的效用优于人参皂苷Re, 其中以人参皂苷Rgi (15jiM)、人参皂苷Rh (5〇kM)的效用最强(与TNF-a组相比, P<0.01)。我们发现,在基于神经元炎性损伤保护模型的来源于人参中单体层次的筛选上, 人参皂苷Rgi和人参皂苷Rh具有最强的对抗TNF-a损伤致HT22细胞死亡的趋势。提示 人参皂苷Rgl和人参皂苷Rh是开心散中具有神经元炎性损伤保护效用的有效物质。

3.5基于HT22细胞系的来源于远志中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对神经元炎性损伤保护的干预作用最强的单体,我们模拟 神经元炎性损伤环节,选择HT22细胞株,利用TNF-ot进行损伤,本组选用了来源于远志 中的两个单体成分3,6’-二酰基鹿糖酯(3,6’-Disinapoylsucrose)、远志口山酮III (Polygalaxanthone III),考察远志中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述远志中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50 pM)加至HT22 细胞。釆用MTT法考察HT22细胞的存活率。如图4-2-3-5A所示,图中的数据结果以相 对于空白组的百分比表示,给药48小时后,HT22细胞的存活率不会因为药物直接作用而 产生变化

以TNF-tx损伤后,如图4-2-3-5B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表示, TNF-a显著降低了 HT22细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述单体均不可以对抗 TNF-a造成的HT22细胞的死亡。远志口山酮III、3, 6’-二酰基蔗糖酯在实验浓度下均不 能明显削弱TNF-ct导致的HT22细胞的死亡。我们发现,在基于神经元炎性损伤保护模型 的来源于远志中单体层次的筛选上,远志口山酮III和3, 65-二酰基蔗糖酯和不是开心散中 具有神经元炎性损伤保护效用的有效物质。

图4-2-3-5基于HT22细胞系的远志中单体的筛选结果
Figure 4-2-3-S Screening results of monomers in Polygala tenuifolia based on HT22 cell line

3.6基于HT22细胞系的来源于石菖蒲中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对神经元炎性损伤保护的干预作用最强的单体,我们模拟 神经元炎性损伤环节,选择HT22细胞株,利用TNF-a进行损伤,本组选用了来源于石菖 蒲中的两个单体成分a-细辛醚(a-Asarone)、P-细辛醚(p-Asarone),考察石菖蒲中的单体 成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述石菖蒲中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50 pM)加至HT22 细胞。釆用MTT法考察HT22细胞的存活率。如图4-2-3-6A所示,图中的数据结果以相 对于空白组的百分比表示,给药48小时后,HT22细胞的存活率不会因为药物直接作用而 产生变化。

以INF-cx损伤后,如图4-2-3-6B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表示, TNF-a显著降低了 HT22细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述单体均能明显对抗 TNF-ct造成的HT22细胞的死亡。我们发现,在基于神经元炎性损伤保护模型的来源于石 菖蒲中单体层次的筛选上,a-细辛醚、卜细辛醚均不能削弱TNF-a损伤后HT22细胞的存 活率上调的趋势。a-细辛醚的效用优于卜细辛醚(p-Asarone),但两者均能显著对抗TNF- a造成的HT22细胞的死亡,其中以a-细辛醚(50pM)的效用最强(与TNF-<x组相比, P<0.01)。提示a-细辛醚和(3■细辛醚可能是开心散中具有神经元炎性损伤保护效用的有效 物质A □ 0 5pM □ 1-5pM 0 5\iM | 15pM | 50yM B n .5pM □ 1.5pM 1 5pM ■ 15pM ■ 50|jM

图4-2-3-6基于HT22细胞系的石菖蒲中单体的筛选结果
Figure 4-2-3-6 Screening results of monomers in Acorus tatarinowii based on HT22 cell line

3.7基于HT22细胞系的来源于茯苓中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对神经元炎性损伤保护的干预作用最强的单体,我们模拟 神经元炎性损伤环节,选择HT22细胞株,利用TOF-a进行损伤,本组选用了来源于茯苳 中的三个单体成分茯等酸(Pachymicacid)、去氢茯苳酸(Dehydropachymicacid)、猪等酸 C (PolyporenicacidC),考察茯苓中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述茯苓中单体成分按将不同浓度(0.2、0.6、2、6、20^M)加至HT22 细胞。采用MTT法考察HT22细胞的存活率。如图4-2-3-7A所示,图中的数据结果以相 对于空白组的百分比表示,给药48小时后,HT22细胞的存活率不会因为药物直接作用而 产生变化以TNF-a损伤后,如图4-2-3-7B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表示, TNF-a显著降低了 HT22细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述部分单体可以明显 对抗TNF-a造成的HT22细胞的死亡。其中以茯苓酸(20^M)的效用最强(与TNF-a组 相比,P<0.05)。我们发现,在基于神经元炎性损伤保护模型的来源于茯苓中单体层次的筛 选上,茯苓酸能对抗TNF-ot损伤后HT22细胞的死亡。提示茯苓酸可能是开心散中具有神 经元炎性损伤保护效用的有效物质。

  1. 结果与讨论

最终神经细胞受到的损伤导致的神经细胞功能异常或死亡是抑郁症发病或加重的直接 原因。导致抑郁症的原因有很多种,本次研宄选取的中枢神经炎症系统是较少涉及的领域 之一。我们从两个方面来进行中枢神经炎症系统的研究,一方面考察药物是否能够直接对 抗炎性损伤,另外一方面,考察药物对于损伤后的保护作用。我们采用了 BV2作为细胞模 型,BV2是小鼠小胶质细胞的永生化细胞系,小胶质细胞具有介导中枢神经炎症的功效, 相当于“脑中的巨噬细胞”。小胶质细胞可以被促炎物质激活,从而分泌炎症因子,介导中 枢神经炎症。药物对于降低中枢神经系统炎症因子的过量表达对于抑郁症的调控具有十分 重要的意义。

远志口山酮III、人参皂苷Rgb 〇t-细辛醚是基于该模型的效用最强的三个单体。这可以 解释为人参和远志具有免疫调节的作用,而石菖蒲中的成分因为可以通过血脑屏障,加之 中医认为芳香性的药物多能上行,直接作用于中枢,调控中枢神经系统的免疫过程。可以 推测人参、远志和石菖蒲对于调控中枢神经系统抗抑郁有直接的作用,而茯苓中的成分可 能是间接作用。

外周和中枢炎症因子损伤星形胶质细胞的屏障功能,因此我们选用了 MCAST作为细 胞模型,去考察开心散对于星形胶质细胞受到炎性损伤后屏障功能的修复。星形胶质细胞 所形成的屏障功能对于神经元细胞的保护意义重大。

星形胶质细胞是一类在中枢神经系统中占最大比重的细胞,是构成血脑屏障的重要组 成部分。除此以外还能分泌神经营养因子,支持神经元的生长。

血脑屏障功能和星形胶质细胞的功能密切相关,星形胶质细胞的完整性直接影响到血 脑屏障的功能。而检测屏障功能的关键指标,就是紧密连接蛋白的表达情况。血液中各类 过量的因子,尤其是炎症因子,会造成血脑屏障的损伤和星形胶质细胞的部分死亡。因此, 药物对于星形胶质细胞的保护,对于从源头上阻止炎症因子入脑引起中枢神经炎症十分具 有意义。a-细辛醚、人参皂苷Rgl、3, 6-二酰基蔗糖酯是基于该模型的最有效的三个单体, 其产生效用的理由和前文所说的石菖蒲挥发油中的物质直接入脑作用,而人参和远志中的 物质具有一定的免疫调控作用,可以减少炎症因子的产生。

我们选择HT22细胞作为细胞模型,HT22细胞是一种永生化的小鼠海马神经元细胞, 具有神经元细胞的特种。我们选用TNF-a作为损伤因子是基于前期动物实验中该因子是变 化最为显著的因子。实验结果发现,人参、石菖蒲的有效物质是基于该系统的关键物质。 许多文献报道,人参中的单体物质在神经炎症系统上的作用机制,而石菖蒲挥发油中单体 物质也常见于在神经炎症系统和神经保护的研究上,这与文献的结果相互印证。

我们经过了三大系统,三个层次,七种细胞模型的筛选,得到了开心散中具有基于脑 肠轴调控的功效物质,我们采取将其组合的方式,以进行后续的功效确认和进一步的开发。

但是,基于神经系统和肠道系统的筛选还有其他层次的内容,诸如神经营养、神经递 质、肠道粘液分泌等多种环节,对于开心散功效物质基础的研究,此处将进行初步的探索。

第三节基于压力应激系统的开心散抗抑郁功效物质的筛选

一、基于外周压力因子损伤保护的开心散功效物质细胞学研究

为了筛选出基于压力应激系统的幵心散抗抑郁的功效物质,本部分的实验采取对外周 压力因子的损伤保护的细胞模型入手,因而建立了建立大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12) 模型,采用不同浓度的Cortisol损伤细胞,经过药物作用,采用MTT法检测细胞的存活 率,从而筛选出基于外周压力因子保护的开心散功效物质。结果发现从全方、成分到单 体有不同程度的基于压力应激系统的活性,石菖蒲挥发油类成分对此系统的作用十分明 显,以ex-细辛醚对外周压力因子损伤调控的作用趋势最强,然后是茯苓酸和P-细辛醚。

L仪器和实验材料 1.1仪器

二氧化碳培养箱(Thermo3100,美国Thermo公司),生物安全柜(1300seriesA2,美 国Thermo公司),超速台式冷冻离心机(Microfuge22RCentrifuge,BECKMAN公司),倒 置显微镜(TE-2000,Nicon公司),超微量紫外/可见分光光度计(DEN0VIXDS-11,美国), 荧光实时定量PCR仪(ABSdence7500,美国),电子天平(BT125型,赛多利斯科学仪器 有限公司),超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司),酶标仪(Perkin Elmer)等。 1.2细胞系

PC12,购自ATCC,存于本实验室液氮保存罐中。

1.3试药和试剂 1.3.1试药

全方层面:制备D-652、K-984、K-1640的冻干粉,溶解后作为全方的试药。

成分层面:人参总皂苷、远志总皂苷、石菖蒲总挥发油、茯苓多糖(纯度均大于80%) 购自南京源叶公司。

单体层面:人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、人参皂苷Re、远志口山酮III、3,6-二酰基蔗 糖酯、a_细辛醚、(3_细辛醚、茯苓酸、去氢茯苓酸、猪苓酸C购自四川维克奇公司。

1.3.2试剂

H-DMEM、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、青霉素/链霉素(P/S)购自Gibco公司, 异丙醇(分析级)、三氯甲烷(分析纯)、无水乙醇(分析纯)均购自国药上海公司,逆转 录试剂盒、qPCR检测试剂盒均购自Transgen公司,其他未特别注明的试剂,均购自sigma- aldrich公司。细胞培养所用的耗材均有Coming公司提供。

  1. 实验方法 1细胞培养方案

PC12 细胞的培养基 H-DMEM (87%),FBS (6%),HS (6%),P/S (1%)。细胞复苏 于60mm的培养皿中,待细胞密度达到80%,吹打传代,每隔48h更换一次培养基,每四 天进行一次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后,将细胞以1.0 xl〇4个/cm2的密度种于 6孔细胞培养板,培养体积为2ml,在进行给药操作的3h前,将PC12细胞的培养基更换 为 H-DMEM (97°/。),FBS (1%),HS (1°/〇)。然后加药培养 48 小时。

2.2细胞给药方案的设计

各药物用DMSO溶解成实验最高浓度1000倍的母液,作用48h。Cortisol用DMSO溶 解成300mM的母液,与药物共同作用。

  • MTT法检测细胞的存活率

细胞种板于96孔板中,密度为10 cell尔1。给药前需要换液,药物作用48h,给药两次。 Cortisol与药物共同作用。96孔板上A1孔不加任何试剂,再预留空白对照。给药48h后, 每孔加入终浓度为5pg/ml的MTT,放入37□培养箱中孵育3h,后吸走MTT,每孔加入 150ml DMSO,置于37□摇床上孵育30min。之后在波长为570mn处,用酶标仪测定吸光

度。分析细胞存活率。

  1. 实验结果

为了评价开心散各成分对压力应激的干预作用,筛选出具有对抗外周压力因子损伤作 用的开心散功效物质,我们模拟外周压力因子损伤环节,选择PC12细胞株。这是基于PC12 作为大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞,具有神经元的特征且来源于外周组织,并可以被压力因子如 Cortisol损伤。因此,我们采用Cortisol对PC12细胞进行损伤,在Cortisol作用的同时, 加入全方、成分、单体三个层次的药物。首先,我们需要考察适宜实验条件下的Cortisol作 用浓度。之后,药物与Cortisol (300 pM)共作用细胞48h后,采用MTT法考察PC12细 胞的存活率。我们发现,各种药物在没有Cortisol (300pM)损伤PC12的条件下,不会直 接引起PC12细胞的死亡。经过系列筛选,我们在全方层次筛选出基于外周压力因子损伤 模型对抗Cortisol (300 pM)损伤致PC12死亡趋势最强的比例K-1640;在部位层次筛选 出基于外周压力因子损伤模型对抗Cortisol (300 fiM)损伤致PC12死亡趋势最强的成分是 远志总阜苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils);在单体层次筛选出基于外 周压力因子损伤模型对抗Cortisol (300 |iM)损伤致PC12死亡趋势最强的前三个化合物依 次是 a-细辛醚(a-Asarone)、获苳酸(Pachymicacid)、p-细辛醚((3-Asarone)。

3.1适合实验条件的Cortisol作用于PC12细胞的浓度确定

为了确定适合实验条件下的Cortisol损伤PC12细胞的作用浓度,我们将不同浓度的 Cortisol作用于PC12细胞。课题组的前期研究表明,Cortisol合适的作用时间为48h,因此 采用48h作为本研宂中Cortisol的作用时间。不同浓度的Cortisol作用48h后,采用MTT 法检测不用浓度Cortisol作用后PC12细胞的存活率。结果以相对于空白组的百分比呈现。

图4-3-1-1为合适的Cortisol损伤浓度的确定。对于合适的Cortisol浓度的确定,我们 选择的标准是基于PC12细胞的存活率,合适的Cortisol的浓度对PC12细胞的损伤不应太 高(大于50%)也不应过低(小于70%),同时考虑到对于试剂、样品的节约以及实验操作 的简便。因此,我们在确定Cortisol损伤48h是较为合适的作用时间的条件下,发现Cortisol 的浓度为(300pM)(与空白组相比,P<0.01)为本实验中合适的Cortisol损伤浓度,此时 PC12的存活率为55.17%。

100 - 80 - 60 ■ 40 - 20 ■

 1.5 3.0 7.5 15 30 75 1 50 300

%:

Cortlsoi(pM)

4-3_1-1基于PC12细胞系的Cortisol作用浓度的确定

Figure 4-3-1-1 Determination of Cortisol concentration based on PC12 cell line

 

3.2基于PC12细胞系的开心散全方层次筛选结果

为了评价开心散各配伍比例对外周压力因子损伤保护的干预作用,我们模拟外周压力 因子损伤环节,选择PCH细胞株,利用Cortisol进行损伤,加以开心散各配伍比例D-652、 K-984和K-1640,考察开心散各配伍比例对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述开心散各配伍比例按将不同浓度(0.1、0.3、1、3、10 tig/ml)加至 PC12细胞。釆用MTT法考察PC12细胞的存活率。如图4-3-1-2A所示,图中的数据结果 以相对于空白组的百分比表示,给药48小时后,PC12细胞的存活率不会因为药物直接作 用而产生变化

Cortisol损伤后,如图4-3-1-2B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 PC12细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述各配伍比例均 可以对抗Cortisol造成的PC12细胞的死亡。K_1640的效用优于D-652和K-984,其中以 K-1640 (10|ig/ml)的效用最强(与Cortisol组相比,P<0.01)。我们发现,在基于外周压 力因子损伤保护模型的开心散全方层次的筛选上,K-1640具有最强的对抗Cortisol损伤致 PC12细胞死亡的趋势。提示K-1640是具有外周压力因子损伤保护效用的开心散最优配伍

3.3基于PC12细胞系的开心散部位层次筛选结果

为了评价开心散部位对外周压力因子损伤保护的干预作用,我们模拟外周压力因子损 伤环节,选择PC12细胞株,利用Cortisol进行损伤,加以开心散部位人参总皂苷(GR Saponin),远志总阜苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils)、茯等多糖(P0 Polysaccharide)。考察开心散部位对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述开心散部位按将不同浓度(0.1、0.3、1、3、lOpg/ml)加至PC12细 胞。釆用MTT法考察PC12细胞的存活率。如图4-3-1-3A所示,图中的数据结果以相对 于空白组的百分比表示,给药48小时后,PC12细胞的存活率不会因为药物直接作用而产 生变化。

以Cortisol损伤后,如图4-3小3B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 PC12细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述有效部位均可 以对抗Cortisol造成的PC12细胞的死亡。远志总皂苷、石菖蒲挥发油的效用优于人参总皂 苷和茯苓多糖,其中以远志总皂苷(l〇pg/ml)石菖蒲挥发油(lpg/ml)和的效用最强(与 Cortisol组相比,P<0.01)。我们发现,在基于外周压力因子损伤保护模型的开心散部位层 次的筛选上,远志总皂苷和石菖蒲挥发油具有最强的对抗Cortisol损伤致PC12细胞死亡 的趋势。提示远志总皂苷和石菖蒲挥发油是具有外周压力因子损伤保护效用的开心散中的 有效部位。

3.4基于PC12细胞系的来源于人参中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对外周压力因子损伤保护的干预作用最强的单体,我们模 拟外周压力因子损伤环节,选择PC12细胞株,利用Cortisol进行损伤,本组选用了来源于 人参中的三个单体成分人参阜苷Rgi (GinsenosideRgi)、人参阜苷Rbi (GinsenosideRbi)、 人参皂苷Re (GinsenosideRe),考察人参中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述人参中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50 pM)加至PC12 细胞。釆用MTT法考察PC12细胞的存活率。如图4-3-1-4A所示,图中的数据结果以相 对于空白组的百分比表示,给药48小时后,PC12细胞的存活率不会因为药物直接作用而 产生变化。以Cortisol损伤后,如图4-3-1-5B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 PC12细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述部分单体可以 对抗Cortisol造成的PC12细胞的死亡。远志口山酮III的效用优于3, 6’-二酰基蔗糖酯, 以远志口山酮III (15 pM)的效用最强(与Cortisol组相比,P<0.05)。我们发现,在基于 外周压力因子损伤保护模型的来源于远志中单体层次的筛选上,远志口山酮III可能是开 心散中具有外周压力因子损伤保护效用的有效物质。以Cortisol损伤后,如图4-3-14B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 PC12细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述单体均可以对 抗Cortisol造成的PC12细胞的死亡。人参皂苷Rgl、的效用优于人参皂苷Rbi、参皂苷 Re,其中以人参皂苷Rgl (50pM)的效用最强(与Cortisol组相比,P<0.01)。我们发现, 在基于外周压力因子损伤保护模型的来源于人参中单体层次的筛选上,人参皂苷Rgl具有 最强的对抗Cortisol损伤致PC12细胞死亡的趋势。提示人参皂苷Rgl是开心散中具有外周 压力因子损伤保护效用的有效物质。

3.5基于PC12细胞系的来源于远志中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对外周压力因子损伤保护的干预作用最强的单体,我们模 拟外周压力因子损伤环节,选择PC12细胞株,利用Cortisol进行损伤,本组选用了来源于 远志中的两个单体成分3,6’-二酰基庶糖酯(3,6’-Disinapoylsucrose)、远志口山酮III (Polygalaxanthone III),考察远志中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述远志中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50 gM)加至PC12 细胞。釆用MTT法考察PC12细胞的存活率。如图4-3-1-5A所示,图中的数据结果以相 对于空白组的百分比表示,给药48小时后,PC12细胞的存活率不会因为药物直接作用而 产生变化图4-3-1-5基于PC12细胞系的远志中单体的筛选结果 Figure 4-3-1-5 Screening results of monomers in Polygala tenuifolia based on PC 12 cell line

3.6基于PC12细胞系的来源于石菖蒲中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对外周压力因子损伤保护的干预作用最强的单体,我们模 拟外周压力因子损伤环节,选择PC12细胞株,利用Cortisol进行损伤,本组选用了来源于 石菖蒲中的两个单体成分a_细辛醚(a-Asarone)、p-细辛醚(P_Asarone),考察石菖蒲中的 单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述石菖蒲中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50 gM)加至PC12 细胞。采用MTT法考察PC12细胞的存活率。如图4-3-1-6A所示,图中的数据结果以相 对于空白组的百分比表示,给药48小时后,PC12细胞的存活率不会因为药直接作用而 产生变化。

以Cortisol损伤后,如图4-3-1-6B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 PC12细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述单体均能明显 对抗Cortisol造成的PC12细胞的死亡。我们发现,在基于外周压力因子损伤保护模型的来 源于石菖蒲中单体层次的筛选上,a-细辛醚、P-细辛醚均不能削弱Cortisol损伤后PC12细 胞的存活率上调的趋势。a-细辛醚的效用优于p-细辛醚(卩-Asarone),但两者均能显著对抗 Cortisol造成的PC12细胞的死亡,其中以a-细辛醚(50 pM)的效用最强(与Cortisol组 相比,P<0.01)。提示a-细辛醚和P-细辛醚可能是开心散中具有外周压力因子损伤保护效 用的有效物质。

图4-3-1-6基于PC12细胞系的石菖蒲中单体的筛选结果
Figure 4-3-1-6 Screening results of monomers inAcorus tatarinowii based on PC12 cell line

 

3.7基于PC12细胞系的来源于茯苓中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对外周压力因子损伤保护的干预作用最强的单体,我们模 拟外周压力因子损伤环节,选择PC12细胞株,利用Cortisol进行损伤,本组选用了来源于 茯等中的三个单体成分茯等酸(Pachymicacid)、去氢茯等酸(Dehydropachymicacid)、猪 等酸C (PolyporenicacidC),考察茯等中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述茯苓中单体成分按将不同浓度(0.2、0.6、2、6、20pM)加至PC12 细胞。采用MTT法考察PC12细胞的存活率。如图4-3-1-7A所示,图中的数据结果以相 对于空白组的百分比表示,给药48小时后,PC12细胞的存活率不会因为药物直接作用而 产生变化。

以Cortisol损伤后,如图4-3-1-7B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 PC12细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述部分单体可以 明显对抗Cortisol造成的PC12细胞的死亡。其中以茯苓酸(20pM)的效用最强(与Cortisol 组相比,P<0.01)。我们发现,在基于外周压力因子损伤保护模型的来源于茯苳中单体层次 的筛选上,茯苓酸能对抗Cortisol损伤后PC12细胞的死亡。提示茯苓酸可能是开心散中具 有外周压力因子损伤保护效用的有效物质。

B

二、基于中枢压力因子损伤保护的开心散功效物质细胞学研究

为了筛选出基于压力应激系统的开心散抗抑郁的功效物质,本部分的实验采取对中枢 压力因子的损伤保护的细胞模型入手,因而建立了建立人神经母细胞瘤永生化细胞 (SHSY-5Y)模型,采用不同浓度的Cortisol损伤细胞,经过药物作用,釆用MTT法检 测细胞的存活率,从而筛选出基于外周压力因子保护的开心散功效物质。结果发现从全 方、成分到单体有不同程度的基于压力应激系统的活性,石菖蒲挥发油类成分对此系统 的作用十分明显,以ex-细辛醚对中枢压力因子损伤调控的作用趋势最强,然后是茯苓酸 和P-细辛醚。

  1. 仪器和实验材料 1仪器

氧化碳培养箱Thermo3100,美国Thermo公司),生物安全柜(1300seriesA2,美 国Thermo公司),超速台式冷冻离心机Microfuge22RCentrifuge,BECKMAN公司),倒 置显微镜TE-2000, Nicon公司),超微量紫外/可见分光光度计DEN0VIXDS-11,美国), 荧光实时定量PCRABSdence7500,美国),电子天平BT125型,赛多利斯科学仪器 有限公司),超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司),酶标仪(Perkin Elmer)。1.2细胞系

SHSY-5Y,购自ATCC,存于本实验室液氮保存罐中。

1.3试药和试剂 1.3.1试药

全方层面:制备D-652、K-984、K-1640的冻干粉,溶解后作为全方的试药。

成分层面:人参总皂苷、远志总皂苷、石菖蒲总挥发油、茯苓多糖(纯度均大于80%) 购自南京源叶公司。

单体层面:人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl、人参皂苷Re、远志口山酮III、3,6-二酰基蔗 糖酯、a-细辛醚、卩-细辛醚、茯苓酸、去氢茯苓酸、猪苓酸C购自四川维克奇公司。

1.3.2试剂

H-DMEM、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、青霉素/链霉素(P/S)购自Gibco公司, 异丙醇(分析级)、三氯甲烷(分析纯)、无水乙醇(分析纯)均购自国药上海公司,逆转 录试剂盒、qPCR检测试剂盒均购自Transgen公司,其他未特别注明的试剂,均购自sigma- aldrich公司。细胞培养所用的耗材均有Corning公司提供。

  1. 实验方法

2.1细胞培养方案

SHSY-5Y 细胞的培养基 RPMI-1640(84%),FBS(15%),P/S(1%)。细胞复苏于 60mm 的培养皿中,待细胞密度达到80%,吹打传代,每隔48h更换一次培养基,每四天进行一 次传代。待细胞传代三次生长状态稳定后,将细胞以1.0 xl4/cm2的密度种于6孔细胞 培养板,培养体积为2ml给药3h前,需要将培养基换为新鲜培养基。

2.2细胞给药方案的设计

各药物用DMSO溶解成实验最高浓度1000倍的母液,作用48h。Cortisol用DMSO溶 解成300mM的母液,与药物共同作用。

2.3 MTT法检测细胞的存活率

细胞种板于96孔板中,密度为lOcell/pl。给药前需要换液,药物作用48h,给药两次。 Cortisol与药物共同作用。96孔板上A1孔不加任何试剂,再预留空白对照。给药48h后, 每孔加入终浓度为5pg/ml的MTT,放入37□培养箱中孵育3h,后吸走MTT,每孔加入 150mlDMSO,置于37□摇床上孵育30min。之后在波长为570nm处,用酶标仪测定吸光

度。分析细胞存活率。

  1. 实验结果

为了评价开心散各成分对压力应激的干预作用,筛选出具有对抗中枢压力因子损伤作 用的开心散功效物质,我们模拟中枢压力因子损伤环节,选择SHSY-5Y细胞株。这是基于 SHSY-5Y作为人神经母细胞瘤永生化细胞,具有神经元的特征且来源于中枢,并可以被压 力因子如Cortisol损伤。因此,我们釆用Cortisol对SHSY-5Y细胞进行损伤,在Cortisol 作用的同时,加入全方、成分、单体三个层次的药物。首先,我们需要考察适宜实验条件 下的Cortisol作用浓度。之后,药物与Cortisol (300 |iM)共作用细胞48h后,采用MTT 法考察SHSY-5Y细胞的存活率。我们发现,各种药物在没有Cortisol (300 pM)损伤SHSY- 5Y的条件下,不会直接引起SHSY-5Y细胞的死亡。经过系列筛选,我们在全方层次筛选 出基于中枢压力因子损伤模型对抗Cortisol (300 pM)损伤致SHSY-5Y死亡趋势最强的比 例D-652;在部位层次筛选出基于中枢压力因子损伤模型对抗Cortisol (300 pM)损伤致 SHSY-5Y死亡趋势最强的成分是远志总皂苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils);在单体层次筛选出基于中枢压力因子损伤模型对抗Cortisol (300pM)损伤致SHSY- 5Y死亡趋势最强的前三个化合物依次是a-细辛酿(a-Asarone)、茯苳酸(Pachymicacid)、 P-细辛醚(P-Asarone)。

3.1适合实验条件的Cortisol作用于SHSY-5Y细胞的浓度确定

为了确定适合实验条件下的Cortisol损伤SHSY-5Y细胞的作用浓度,我们将不同浓度 的Cortisol作用于SHSY-5Y细胞。课题组的前期研究表明,Cortisol合适的作用时间为48h, 因此采用48h作为本研究中Cortisol的作用时间。不同浓度的Cortisol作用48h后,采用 MTT法检测不用浓度Cortisol作用后SHSY-5Y细胞的存活率。结果以相对于空白组的百 分比呈现-1为合适的Cortisol损伤浓度的确定。对于合适的Cortisol浓度的确定,我们 选择的标准是基于SHSY-5Y细胞的存活率,合适的Cortisol的浓度对SHSY-5Y细胞的损 伤不应太高(大于50%)也不应过低(小于70%),同时考虑到对于试剂、样品的节约以及 实验操作的简便。因此,我们在确定Cortisol损伤48h是较为合适的作用时间的条件下, 发现Cortisol的浓度为(300 |jM)(与空白组相比,P<0.01)为本实验中合适的Cortisol损 伤浓度,此时SHSY-5Y的存活率为64.24%。

图4-3-2-1基于SHSY-5Y细胞系的Cortisol作用浓度的确定 Figure 4-3-2-1 Determination of Cortisol concentration based on SHSY-5Y cell line

3.2基于SHSY-5Y细胞系的开心散全方层次筛选结果

为了评价开心散各配伍比例对中枢压力因子损伤保护的干预作用,我们模拟中枢压力 因子损伤环节,选择SHSY-5Y细胞株,利用Cortisol进行损伤,加以开心散各配伍比例D- 652、K-984和K-1640,考察开心散各配伍比例对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述开心散各配伍比例按将不同浓度(0.1、0.3、1、3、10 pg/ml)加至 SHSY-5Y细胞。釆用MTT法考察SHSY-5Y细胞的存活率。如图4-3-2-2A所示,图中的 数据结果以相对于空白组的百分比表示,给药48小时后,SHSY-5Y细胞的存活率不会因 为药物直接作用而产生变化。

8 0 0 0 0 1 8 6 4 2

O04c8»*—0^}

0)}ej leAJAinu以Cortisol损伤后,如图4_3-2-2B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 SHSY-5Y细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述各配伍比 例均可以对抗Cortisol造成的SHSY_5Y细胞的死亡。D-652的效用优于K-984和K-1640, 其中以D-652 (10pg/ml)的效用最强(与Cortisol组相比,PO.01)。我们发现,在基于中 枢压力因子损伤保护模型的开心散全方层次的筛选上,D_652具有最强的对抗Cortisol损 伤致SHSY-5Y细胞死亡的趋势。提示D-652是具有中枢压力因子损伤保护效用的开心散 最优配伍比例。

 

3.3基于SHSY_5Y细胞系的开心散部位层次筛选结果

为了评价开心散部位对中枢压力因子损伤保护的干预作用,我们模拟中枢压力因子损 伤环节,选择SHSY_5Y细胞株,利用Cortisol进行损伤,加以开心散部位人参总皂苷(GR Saponin),远志总皂苷(PR Saponin)、石菖蒲挥发油(ATR Volatile Oils)、茯苓多糖(PO Polysaccharide)。考察开心散部位对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述开心散部位按将不同浓度(0.1、0.3、1、3、lO^ig/ml)加至SHSY- 5Y细胞。釆用MTT法考察SHSY-5Y细胞的存活率。如图4-3-2-3A所示,图中的数据结 果以相对于空白组的百分比表示,给药48小时后,SHSY-5Y细胞的存活率不会因为药物 直接作用而产生变化。

以Cortisol损伤后,如图4-3-2-3B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 SHSY-5Y细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述有效部位 均可以对抗Cortisol造成的SHSY-5Y细胞的死亡。远志总皂苷、石菖蒲挥发油的效用优于 人参总皂苷和茯等多糖,其中以远志总皂苷石菖蒲挥发油和的效用 最强(与Cortisol组相比,P<0.01)。我们发现,在基于中枢压力因子损伤保护模型的开心 散部位层次的筛选上,远志总皂苷和石菖蒲挥发油具有最强的对抗Cortisol损伤致SHSY- 5Y细胞死亡的趋势。提示远志总皂苷和石菖蒲挥发油是具有中枢压力因子损伤保护效用 的开心散中的有效部位。

3.4基于SHSY-5Y细胞系的来源于人参中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢压力因子损伤保护的干预作用最强的单体,我们模 拟中枢压力因子损伤环节,选择SHSY-5Y细胞株,利用Cortisol进行损伤,本组选用了来 源于人参中的三个单体成分人参皂苷Rgi (GinsenosideRgi)、人参阜苷Rbi (Ginsenoside Rbi)、人参皂苷Re (GinsenosideRe),考察人参中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述人参中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50jaM)加至SHSY- 5Y细胞。采用MTT法考察SHSY-5Y细胞的存活率。如图4-3-2-4A所示,图中的数据结 果以相对于空白组的百分比表示,给药48小时后,SHSY-5Y细胞的存活率不会因为药物 直接作用而产生变化

以Cortisol损伤后,如图4-3-2-4B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 SHSY-5Y细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述单体均可 以对抗Cortisol造成的SHSY-5Y细胞的死亡。人参皂苷Rgi、的效用优于人参皂苷Rbi、 人参皂苷Re,其中以人参皂苷Rgi (15gM)的效用最强(与Cortisol组相比,P<0.01)。 我们发现,在基于中枢压力因子损伤保护模型的来源于人参中单体层次的筛选上,人参阜 苷Rgl具有最强的对抗Cortisol损伤致SHSY-5Y细胞死亡的趋势。提示人参皂苷Rgl是开 心散中具有中枢压力因子损伤保护效用的有效物质。

3.5基于SHSY-5Y细胞系的来源于远志中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢压力因子损伤保护的干预作用最强的单体,我们模 拟中枢压力因子损伤环节,选择SHSY-5Y细胞株,利用Cortisol进行损伤,本组选用了来 源于远志中的两个单体成分3,6’-二酰基庶糖酯(3,6’-Disinapoylsucrose)、远志口山酮III (Polygalaxanthone III),考察远志中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述远志中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50 pM)加至SHSY- 5Y细胞。采用MTT法考察SHSY-5Y细胞的存活率。如图4-3-2-5A所示,图中的数据结 果以相对于空白组的百分比表示,给药48小时后,SHSY_5Y细胞的存活率不会因为药物 直接作用而产生变化。

以Cortisol损伤后,如图4-3-2-5B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 SHSY-5Y细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述部分单体 可以对抗Cortisol造成的SHSY-5Y细胞的死亡。远志口山酮III的效用优于3, 6’■二酰基 庶糖酯,以远志口山酮III (15心)的效用最强(与Cortisol组相比,P<0.05)。我们发现, 在基于中枢压力因子损伤保护模型的来源于远志中单体层次的筛选上,远志口山酮III可 能是开心散中具有中枢压力因子损伤保护效用的有效物质。

A □ 0.5mM □ 1.5mM ■ 15mM _50B □  5pM □ 1.5pM  5mM ■ 15pM _50pM

SHSY-5Y

3.6基于SHSY-5Y细胞系的来源于石菖蒲中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢压力因子损伤保护的干预作用最强的单体,我们模 拟中枢压力因子损伤环节,选择SHSY-5Y细胞株,利用Cortisol进行损伤,本组选用了来 源于石菖蒲中的两个单体成分心细辛醚(cx-Asarone)、卩-细辛醚(P-Asanme),考察石菖蒲 中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述石菖蒲中单体成分按将不同浓度(0.5、1.5、5、15、50 pM)加至SHSY- 5Y细胞。采用MTT法考察SHSY-5Y细胞的存活率。如图4-3-2-6A所示,图中的数据结 果以相对于空白组的百分比表示,给药48小时后,SHSY-5Y细胞的存活率不会因为药物 直接作用而产生变化。

以Cortisol损伤后,如图4-3-2-6B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 SHSY-5Y细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述单体均能 明显对抗Cortisol造成的SHSY-5Y细胞的死亡。我们发现,在基于中枢压力因子损伤保护 模型的来源于石菖蒲中单体层次的筛选上,(X-细辛醚、P-细辛醚均不能削弱Cortisol损伤后 SHSY_5Y细胞的存活率上调的趋势。a-细辛醚的效用优于p_细辛醚(p-Asarone),但两者 均能显著对抗Cortisol造成的SHSY-5Y细胞的死亡,其中以ot_细辛醚(50 pM)的效用最 强(与Cortisol组相比,P<0.01)。提示心细辛醚和p-细辛醚可能是开心散中具有中枢压力 因子损伤保护效用的有效物质A □ 0,5jjM □ 1.5mM _50^ □ 0.5mM 0 1.5■ 5pM ■ _&mM

Control a-Asarone p-Asarone

图4-3_2-6基于SHSY-5Y细胞系的石菖蒲中单体的筛选结果
Figure 4-3-2-6 Screening results of monomers m Acorns tatarinowii based on SHSY-5Y cell line

 

3.7基于SHSY_5Y细胞系的来源于茯苓中单体筛选结果

为了评价开心散单体层次中对中枢压力因子损伤保护的干预作用最强的单体,我们模 拟中枢压力因子损伤环节,选择SHSY-5Y细胞株,利用Cortisol进行损伤,本组选用了来 源于茯等中的三个单体成分茯苳酸(Pachymicacid)、去氢茯等酸(Dehydropachymic acid)、 猪苓酸C (Polyporenic acid C),考察茯苓中的单体成分对该细胞存活率的影响。

首先,我们将上述茯苓中单体成分按将不同浓度(0.2、0.6、2、6、20 jiM)加至SHSY- 5Y细胞。采用MTT法考察SHSY-5Y细胞的存活率。如图4-3-2-7A所示,图中的数据结 果以相对于空白组的百分比表示,给药48小时后,SHSY-5Y细胞的存活率不会因为药物 直接作用而产生变化。

以Cortisol损伤后,如图4-3-2-7B所示,图中的数据结果以相对于空白组的百分比表 示,Cortisol显著降低了 SHSY-5Y细胞的存活率(与空白组相比,P<0.05)。上述部分单体 可以明显对抗Cortisol造成的SHSY-5Y细胞的死亡。其中以茯苓酸(20jxM)的效用最强 (与Cortisol组相比,P<0.01)。我们发现,在基于中枢压力因子损伤保护模型的来源于茯 苳中单体层次的筛选上,茯等酸能对抗Cortisol损伤后SHSY-5Y细胞的死亡。提示茯苓酸 可能是开心散中具有中枢压力因子损伤保护效用的有效物质。

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  1. 结果与讨论

HPA轴被过量激活后,过量的皮质醇是具有神经毒性的物质。会造成神经元的死亡0 因此采用该模型能够较好的模拟开心散的各有效物质对于压力应激所造成的损伤的保护 作用。PC12细胞虽然是肾上腺的一种肿瘤细胞,但是因为其能够对神经生长因子(NGF) 产生响应,故具有一定的神经元的特性,常用于神经生长和神经保护的研宂中。在基于PC12 的外周对压力应激保护的细胞模型上,效用最强的三个单体是ex-细辛醚、茯苓酸、P-细辛 醚。来自石菖蒲中的物质在压力应激系统中起了较强的作用。而且由于石菖蒲的挥发油成 分可以直接通过血脑屏障作用于神经元,因此这样的结果相较一般的体外研宄更有意义。

值得一提的是茯苓中的茯苓酸类的成分也有相对较强的功效。虽然前期的研究表明其 在全方中含量较低,不过我们也并不能直接因为含量的原因否定其作为功效物质。

本研宄所涉及的神经元的损伤分为两部分,一类是来自于炎症因子的损伤,另一类是 来自于压力因子的损伤。过量的皮质醇最终引起了海马区神经元的死亡,加重了抑郁症, 因此对于皮质醇损伤的对抗自然就成了关键环节。

而SHSY-5Y细胞作为人源神经细胞的一种永生化细胞,也能表现出神经元的特性,采 用两种细胞作为筛选模型,是为了增加结果的可信度。我们发现,石菖蒲中的有效成分在 此系统上具有较强的作用趋势。可能是基于石菖蒲中挥发油类成分能够直接进入血脑屏障 作用于神经元上以对抗损伤。其他各类成分也有作用,值得一提的是茯苓中的茯苓酸类的 成分也有相对较强的功效。虽然前期的研究表明其在全方中含量较低,不过我们也并不能 直接因为含量的原因否定其作为功效物质。

【参考文献】

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第五章基于抗抑郁功效导向的开心散功效组分配伍研究

通过整体动物实验,我们评价了开心散基于脑-肠轴调控抗抑郁的作用机制,并且采用 了抗生素水溶液改变肠道菌群的构成的方式,验证了开心散基于脑-肠轴调控抗抑郁的功效。

接着,我们以此为导向,建立了基于肠道炎症、压力应激系统、中枢神经炎症系统的细 胞模型用以功效物质的筛选。从全方、部位到单体,得到了不同层次的筛选结果。最终在 单体层面上,我们分别从四味药材中选取了一种在细胞学筛选中效用最强的单体,也就是 人参中的人参皂苷Rgi、远志中的远志口山酮III、石菖蒲中的a-细辛醚以及茯苓中的茯苓 酸,我们参考原方配比,将其进行组合。并参考了目前抗抑郁药物在小鼠中作用的剂量(如 氟西汀的7.2mg/kg),确定剂量,并设计正交试验,以常用的抗抑郁药物筛选的方式悬尾游 泳实验优选最佳配比。之后,再通过抑郁症研究的公认度最高的CUMS动物模型,通过行 为学评价,确证其抗抑郁的效用。

第一节开心散功效组分配比研究

为了筛选出开心散功效组分的最优配比。我们基于前期的实验研究细胞学水平的筛选, 选择开心散中分别来自于四味药材中作用趋势最强的四个单体,人参阜苷Rgi、远志口山 酮III、a-细辛醚、茯苓酸,参考原方物质的含量及配伍比例,采用四因素三水平的正交设 计给药剂量,采用FST和TST实验考察其作用趋势强弱。实验结果表明,通过正交试验,

我们发现最优配比为人参阜昔Rgi(3mg/kg)、远志口山酮III(0.3mg/kg)、a-细辛醚(3mg/kg)、 茯苓酸(O.lmg/kg)。于是我们从开心散中得到了一种组分配伍,可能具有进一步的开发价 值。

L仪器和实验材料 1.1仪器

ANY-MAZE行为分析系统(美国ANY-MAZE公司)、动物行为分析系统(上海吉量公 司)等。

1.2试药和试剂

开心散D_652、氟西汀与第二章第一节所用相同。人参皂苷Rgl、远志口山酮III、a-细 辛醚、茯苓酸购自四川维克奇公司。

  1. 实验方法 1正交试验设计

表5-1-1为本次正交试验的设计方法。

表5-1-1四因素三水平正交试验的设计方法 Table 5-1-1 Design method of L9 (43) orthogonal experiments

其中因素A、B、C、D分别为人参皂苷Rgl、远志口山酮III、a_细辛醚、茯苓酸。其 中A、B、C三个因素的三个水平分别为,0.3mg/kg/day,lmg/kg/day,3mg/kg/day。由于 茯苓酸含量相对于另外三种在原方中差异较大,所以因素D的三个水平分别为,0.1 mg/kg/day,0.3mg/kg/day,lmg/kg/day。

因此本次动物实验的给药方案如表5-1_2

表5-1-2.动物实验分组和给药剂量 Table 4-1-2. Animal experimental grouping and dosageTST动物实验方法

悬尾实验:将小鼠尾部远端夹起,垂直悬吊,使其失去支持物,悬吊6min,采用ANY- MAZE软件记录小鼠在此6min内的不动时间及首次出现不动状态的时间点。

在实验前,应先筛选出不动时间正负偏差在20秒内的动物进行后续给药实验。

  • FST动物实验方法

将小鼠放置于圆柱形透明水缸之中,使小鼠脚部不能接触地面,强迫小鼠游泳6min, 采用ANY-MAZE软件记录小鼠在此6min内的不动时间及首次出现不动状态的时间点。

在实验前,应先筛选出不动时间正负偏差在20秒内的动物进行后续给药实验。

  1. 实验结果

3.1给药后各组动物悬尾不动时间

表5-1-3为各组动物的悬尾不动时间,相对于空白组均有显著性差异(与空白组相比, P<0.05)。

表5-1-3动物悬尾不动时间 Table 5-1-3 Animal tail-hanging fixed tim

3,2给药后各组动物强迫游泳不动时间

表5-1-4为各组动物的强迫游泳不动时间,相对于空白组均有显著性差异(与空白组相 比,P<0.05)。

表5_ 1-4动物强迫游泳不动时间

3.3正交试验结果及最优剂量的确定 3.3.1正交试验极差分析。

表5-1-5动物正交试验分析的极差分析表

为各组动物的综合不动时间,将悬尾实验和强迫游泳实验的结果各按照50%加权计算, 最终得到综合不动时间。通过正交试验的结果分析,我们得到最优的剂量组合为人参皂苷 Rgl (3mg/kg/d)、远志口山酮 III(3nig/kg/d)、a-细辛醚(0.3mg/kg/d)、茯苓酸(0.1mg/kg/d)〇

表5-1_5正交试验分析表-极差分析表 Table 5-1-5 Orthogonal test analysis table- Range analysis table

3.3.2正交试验方差分析

本次实验中釆用了方差分析法,分析表见表5-1-6到表5-1-8。虽然极差分析法简单明 了,通俗易懂,计算工作量少便于推广普及。但这种方法不能将试验中由于试验条件改变 引起的数据波动同试验误差引起的数据波动区分开来,因此,本次实验的分析考虑相对复 杂一些的方差分析法。由于茯苓酸的含量在原方比例中较低,因此可以将其考虑为误差列。 从初步进行剂量筛选的考虑,本次分析忽略了各个因素之间的相互作用。把四个单体按影 响性排列,得到人参皂苷Rgl、(X-细辛醚、远志口山酮III、茯苓酸。综合方差分析和极差 分析。得到的最优剂量为人参阜苷Rgl (3mg/kg/d)、远志口山嗣III (3mg/kg/d)、a-细辛醚 (0.3mg/kg/d)、茯等酸(O.lmg/kg/d)。

表5-1-6正交试验分析表•极差分析表
Table 5-1-6 Orthogonal test analysis table- ANOVA table

结果与讨论

从中药复方中获取功效物质组,并验证其功效是中药复方研究的思路之一,也是我们 从中药宝库中挖掘财富的过程之一。我们选择一种动物模型进行研究,并通过细胞模型 来筛选其功效物质,最终在动物模型上再加以验证。幸运的是,我们发现了中药复方中 部分的功效物质所能产生的作用,并优选了其比例,形成的组分配伍是有进一步去开发 的价值的。

第二节开心散功效配伍调控抗抑郁效用评价

为了评价开心散功效配伍抗抑郁的效用,我们建立CUMS模型,以第四章第一节中的 开心散功效组分为试验药物,据正交试验的结果获取最优给药剂量后,以此剂量为中剂量, 以两倍作为梯度,在CUMS模型上进行药效的验证。釆用SPT、FST、TST以进行行为学 评价,最终选择出最优配比。我们发现开心散功效配伍在CUMS模型能够上调模型小鼠的 糖水偏嗜率,减少模型小鼠的悬尾不动时间和游泳不动时间,且具有剂量关系。我们组合 出的开心散功效配伍在CUMS模型上具有抗抑郁效用,具有进一步的开发价值。

L仪器和实验材料 1.1仪器

ANY-MAZE行为分析系统(美国ANY-MAZE公司)、动物行为分析系统(上海吉量公 司)等。

1.2试药和试剂

开心散D-652、氟西汀与第二章第一节所用相同。人参皂苷Rgl、远志口山酮III、a-细 辛醚、茯苓酸购自四川维克奇公司。此外蔗糖与第二章第一节所用相同。

  1. 实验方法

2.1 CUMS模型的建立

将动物安置于培养室,静养7d后,测试动物基础饮水量和基础糖水消耗量,剔除数值 异常的动物。获取糖水水平均一正常的动物后,每天对小鼠进行随机不可预测的轻度刺激, 包括禁食24h,禁水24h,湿笼,强迫游泳5min,夹尾5min,束缚4h,昼夜颠倒,持续 56d,以糖水偏嗜实验确认模型是否成功。

2.2动物给药方法

表5-2-1.动物实验分组和给药剂量 Table 5-2-1. Animal experimental grouping and dosag2.3糖水偏嗜实验

安置7d后,进行小鼠糖水偏好实验。具体方法为,测试时小鼠单笼饲养,测试前72h, 为小鼠同时提供两瓶1%的糖水(100ml),使之适应;测试前48h,将其中一瓶1%的糖水 替换为纯水(100ml),使之适应;测试前24h,禁食禁水。测试时,分别提供lOOmLl%的 糖水与纯水,4h后,测定每组小鼠的糖水消耗量,计算糖水偏嗜指数。糖水偏嗜率=糖水 消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)*100%。在确认模型成功时和给药后同法进行。

2.4悬尾实验

悬尾实验:将小鼠尾部远端夹起,垂直悬吊,使其失去支持物,悬吊6min,釆用ANY- MAZE软件记录小鼠在此6min内的不动时间及首次出现不动状态的时间点。

在实验前,应先筛选出不动时间正负偏差在20秒内的动物进行后续给药实验。

2.5强迫游泳实验

将小鼠放置于圆柱形透明水缸之中,使小鼠脚部不能接触地面,强迫小鼠游泳6min, 采用ANY-MAZE软件记录小鼠在此6min内的不动时间及首次出现不动状态的时间点。

在实验前,应先筛选出不动时间正负偏差在20秒内的动物进行后续给药实验

  1. 实验结果

3.1开心散功效配伍对于CUMS模型小鼠糖水偏嗜率的影响

动物适应一周后的基础糖水测试情况,动物随机分组后,各组之间并未出现显著的糖 水偏嗜率差异,提示这批动物可以用于后续实验。图5-2-1为药物作用后动物的糖水偏嗜 率情况,通过为期60日的CUMS模型建立以及为期10日的药物作用后,我们发现模型组 动物的糖水偏嗜率显著低于空白组(P<〇.〇5),药物作用后,各给药组均表现出上调模型小 鼠糖水偏嗜率降低的作用趋势,其中,D-652 (10g/kg/day)显著的上调了动物的糖水偏嗜 率(P<0.05),而MIX-L组并未能显著上调模型小鼠糖水偏嗜率降低的趋势,而MDC-M和 MIX-H组作用均与D-652相当,且趋势显著(P<0.05)。提示开心散组分配伍具有改善CUMS 模型小鼠低糖水偏嗜率的作用趋势,具有改善模型小鼠快感缺失的行为状态。

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图5-2-1药物作用后动物的糖水偏嗜率的变化
Figure 5-2-1 Changes in sugarwater preference in animals after drug treatment

3.2开心散功效配伍对于CUMS模型小鼠悬尾实验中不动时间的为动物在经过药物作用10日后,在悬尾实验中的不动时间的情况。数据以相 对于空白组的百分比来呈现。可以发现,模型组动物在强迫游泳实验中的不动时间显著升 高(P<0.01),而经过氟西汀、D-652、开心散功效配伍作用后,模型小鼠悬尾实验中的不 动时间与模型组相比显著下调(P<〇.〇5),D_652 (10g/kg/day)显著的下调了动物的不动时 间(P<0.05),而MIX-L组并未能显著下调模型小鼠不动时间上调的趋势,而MIX-M和 MIX-H组作用均与D-652相当,且趋势显著(P<0.05)。提示开心散组分配伍具有改善CUMS 模型小鼠改善小鼠行为绝望的状态。开心散功效配伍对于CUMS模型小鼠强迫游泳实验中不动时间的影响为动物在经过药物作用10日后,在强迫游泳实验中的不动时间的情况。数据 以相对于空白组的百分比来呈现。可以发现,模型组动物在强迫游泳实验中的不动时间显 著升高(P<0.01),而经过氟西汀、D-652、开心散功效配伍作用后,模型小鼠强迫游泳实 验中的不动时间与模型组相比显著下调(P<〇.〇5),D-652 (10g/kg/day)显著的下调了动物 的不动时间(P<〇.〇5),而MIX-L组并未能显著下调模型小鼠不动时间上调的趋势,而MIX- M和MIX-H组作用均与D-652相当,且趋势显著(P<0.05)。

5-2-3药物作用后动物的强迫游泳不动时间的变化
Figure 5-2-3 Changes in immobility time of forced swimming in animals after drug treatment

  1. 结果与讨论

悬尾和强迫游泳模型常用于抗抑郁药物的大规模筛选。而CUMS模型则是目前公认 的最适合用作研究药物抗抑郁功效的动物模型。在本次的CUMS实验中,我们发现开心 散功效组合具有显著的减轻动物抑郁样行为的作用,其高、中剂量的作用效果与D-652 相当,没有显著性的强弱之分。这说明开心散功效组分具有开发的价值。且因为其成分 明确、质量可控,是一次中药方剂开发应用的成功实践。

【参考文献】

  • Aydemir 0, Deveci A,Taneli R The effect of chronic antidepressant treatment on serum brain_derived neurotrophic factor levels in depressed patients: a preliminary study. Prog Neuropsyckopkarmaco! Bio! Psychiatry 2005(29):261-265,
  • 0kamoto Ts Yoshimura Ikenouchi-Sugita A, et, al. Efficacy of electroconvulsive therapy is associated with changing blood levels of homovanillic acid and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in refractory depressed patients: a pilot study. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2008(32): 1185—1190,.

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结语

【研究总结】

课题以中药复方开心散作为研究目标,以肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统为线 索,成功的解决了以下几个问题。首先证明了肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统是 CUMS模型小鼠产生抑郁样行为的效应环节,其次证明了中药复方开心散能够调节肠道微 生态-压力应激-中枢神经炎症系统改善动物抑郁样行为。最后了从开心散中筛选出了功效 物质并优化组合验证了抗抑郁的功效。我们阐释了中药复方开心散的机制,发现功效物质 基础、寻找到全新的化合物组合,这种组合可以成为抗抑郁新药研究的来源,进一步的开 发和使用。

本文从五个章节,递进的阐明了开心散调控肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统抗 抑郁的功效物质基础,得出了如下几个结论,可作为进一步研究的依据。

  1. 开心散的不同配比具有抗抑郁作用,开心散的不同配比具有调控这三大系统以实现 抗抑郁的作用。以D-652的作用趋势最强。肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统是抑 郁症发病的关键环节,且开心散可以通过调控该系统来实现其抗抑郁的效用。
  2. 通过体外细胞模型的筛选,在肠道炎症模型上得到了人参皂苷1181和茯苓酸、远志 口山酮III;在中枢神经炎症模型上得到了人参皂苷Rgl、远志口山酮III和cx-细辛醚;在 压力应激模型上得到了 a-细辛醚。综合各药材,将四个单体化合物人参皂苷Rgl、远志口 山酮III、a-细辛醚、茯苓酸进行组合,发现其可能是开心散抗抑郁功效物质基础,可进一 步进行开发和利用。
  3. 由上述的四个化合物组成的开心散功效配伍具有抗抑郁作用。与原方作用相当。

【研究创新点】

  1. 首次从肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统的相互作用来探索开心散抗抑郁的 作用机制。
  2. 首次从体外细胞模型系统的筛选了开心散中的功效物质。
  3. 首次从开心散中发现了全新的抗抑郁功效物质组合。

【研究展望】

本研究只是对开心散调控从肠道微生态-压力应激-中枢神经炎症系统抗抑郁的作用机 制和物质基础进行较为初步的研宂,具体深入的机制和物质基础研宂还可以进一步展幵:

  1. 基于中医理论的整体观和幵心散中各味中药的功效,结合现代的组学技术进一步阐 释开心散抗抑郁的作用机制。
  2. 依据开心散调整肠道微生态的变化,探索基于肠道微生态的抑郁症新型生物标志物。
  3. 结合神经营养系统调控、神经递质系统调控、脑賜轴系统调控,综合探索开心散抗 抑郁功效物质的整合机制。

攻读硕士期间发表的成果

  1. Cao C. Xiao J, Liu M, Ge Z5Huang R, Qi M, Zhu H, Duan JA, Zhu Y. Active components, derived from Kai-xin-san? a herbal formula, increase the expressions of neurotrophic factor NGF and BDNF on mouse astrocyte primary cultures via cAMP-dependent signaling pathway. J Ethnopharmacol. 2018 Jun 8.
  2. Shi Y, Cao C, Zhu Y, Gao T?Yang W, Liu M, Qi M, Huang R, Qian D? Duan JA. Comparative pharmacokinetic study of the components of Jia-Wei-Kai-Xin-San in normal and vascular dementia rats by ultra-fast liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 2018 Mar 25.
  3. Zhu Y, Cao CsDuan X, Cheng X; Liu P, Su S, Duan J5 Dong TT, Tsim KW. Kai-Xin-San series formulae alleviate depressive-like behaviors on chronic mild stressed mice via regulating neurotrophic factor system on hippocampus. Sci Rep. 2017, 7: 1467.
  4. 曹程,肖钧元,刘梦秋,黄人杰,戚明珠,朱梓强,王之康,陈绖淳,郑嘉妮,刘培,段金 廒,朱悦.中药复方开心散调控神经营养因子抗抑郁物质基础与作用机制研宄[J].世界科 学技术■中医药现代化,2018, 20(06): 847-855.